CH659480A5 - Verfahren zur effektivierung der erzeugung von proteinen und rekombinantes dns-molekuel. - Google Patents

Verfahren zur effektivierung der erzeugung von proteinen und rekombinantes dns-molekuel. Download PDF

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Effektivierung der Erzeugung von Proteinen gemäss dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und ein rekombinantes DNS-Molekül zur Ausführung des Verfahrens.
Die jüngste Entwicklung in der Molekularbiologie hat neue Möglichkeiten für die Erzeugung von Proteinen in Bakterien unter Benutzung der Kombinations-DNS-Technik eröffnet. Ausserdem, dass mittels der Kombinations-DNS-Technik Proteine einer Eukaryotzelle in Bakterien erzeugt werden können, kann auch die Synthese der eigenen Proteine von Bakterien dadurch bedeutend effektiviert werden, dass die Menge der Kopien des erwünschten Gens in der Zelle erhöht wird. Die Zahl der Genkopien in einer Bakterienzelle kann dadurch erhöht werden, dass das Gen an ein solches
Plasmid- oder Virus-DNS-Molekül gefügt wird, das in der Zelle als mehrere, im allgemeinen als 10 bis 100 Kopien auftritt. Wenn die Zahl der Kopien eines gewissen Gens in einer Zelle höher wird, folgt daraus im allgemeinen auch eine ent-50 sprechende Steigerung der Synthese des vom Gen zum Ausdruck gebrachten Proteins.
Obwohl mehrere Versuche von diesem Typ vorgenommen worden sind unter Benutzung von E. coli als Wirtbakterium und von sich darin vermehrenden Plasmid- oder Virus-DNS-55 Molekülen, ist die Bedeutung der Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt erst nur in ihrem Anfang [Cryczan et al., Molecular General Genet 177,459-467 (1979); Keggins et al., Proc. Nati. Acad. Sei (US) 75,1423-1427 (1978)]. Keines von den bisher veröffentlichten Verfahren bezieht sich aber auf 60 eine Erhöhung der Erzeugung des Exoenzyms eines Bakteriums der Gattung Bacillus in Bakterien der Gattung Bacillus in einer Weise, wo das das Exoenzym kodierende Gen dadurch vervielfältigt worden ist, dass das Gen an ein in einem Bakterium der Gattung Bacillus als mehrere Kopien 65 auftretendes Plasmid gefügt worden ist (I. Teil der Erfindung), und keines der veröffentlichten Verfahren bezieht sich auf eine Weise der Erzeugung von Protein, in der die Rege-lungs- und Absonderungssignale des Gens eines sich abson
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derndem Enzyms der Gattung Bacillus ans Gen des Proteins gefügt worden sind, dessen Erzeugung erwünscht ist (II. Teil der Erfindung). Als Beispiel für den I. Teil der Erfindung, mit dem die Erzeugung vom Exoenzym eines Bakteriums der Gattung Bacillus effektiviert werden kann, indem die Zahl des Gens des erwünschten Exoenzyms in der Zelle erhöht wird, wird die Übertragung eines Bacillus-a-Amylasegens beschrieben.
Figur 1 stellt schematisch ein Ausführungsbeispiel dieses I. Teils der Erfindung dar. Aus einen a-Amylase erzeugenden Bakterium der Gattung Bacillus wird das ganze Genom des Bakteriums isoliert, welches Genom mittels eines Restriktionsenzyms gespaltet wird. Die DNS-Abschnitte von erwünschter Grösse werden mit einem mittels eines Restriktionsenzyms geöffneten Plasmidmolekül zusammengefügt. Als Plasmid kann das Plasmid pUB 110 verwendet werden. Dieser kann durch Spalten des Genoms des Bakteriums mit dem Restriktionsenzym Mbo I erhalten und mit dem Restriktionsenzym BamH I geöffnet werden. Es ist zu beachten, dass ein entsprechendes rekombinantes DNS-Molekül auch unter Benutzung von anderen Restriktionsenzymen oder Plasmiden erzeugt werden kann, und ein mit diesem Gebiet vertrauter Fachmann kann verschiedene Restriktionsenzym-Plasmid-Kombinationen wählen, ohne den Bereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die nach der Zusammenfügung der DNS-Abschnitte und der Plasmidmoleküle entstandenen rekombinanten DNS-Moleküle werden zum Wirtbakterium übertragen, und unter diesen werden die Bakterienzellen gesiebt, die das ans Plasmid gefügte, a-Amylase kodierende Gen erhalten haben. Das Sieben gründet sich auf die von der transformierten Zelle erhaltene Fähigkeit a-Amylase zu erzeugen.
Als Wirtbakterium wird vorzugsweise ein E. subtilis-Stamm verwendet. Nachdem zum Stamm das oben genannte Kombinations-DNS-Molekül übertragen worden ist, tritt das a-Amylase kodierende Gen im Stamm als etwa 50 Kopien auf. Dies macht die a-Amylasenerzeugung des Stammes etwa 500fach im Vergleich zu einem normalen B. subtilis-Stamm. Die Erhöhung der a-Amylasenerzeugung aufs 500fache kommt teils aus dem Regelungsteil des a-Amylasegens des B. amyloliquefaciens-Stammes, der etwa lOmal effektiver ist als der Regelungsteil des B. subtilis a-Amylasegens, und teils aus der Zunahme der Anzahl des a-Amylasegens aufs 50fache. Unter Laborverhältnissen erzeugt ein B. subtilis-Stamm, der ein Kombinations-DNS-Molekül enthält, etwa 3- bis 5mal mehr a-Amylase als der für die Isolierung des Gens benutzte B. amyloliquefaciens-Stamm.
Dàs Kombinations-DNS-Molekül wird aus dem B. subtilis-Stamm isoliert und mittels der Ermittlung der Restriktionsenzyme und der Basenordnung charakterisiert. In der Figur 2 werden die im a-Amylasegen des erhaltenen Kombinations-DNS-Moleküls pKTHlO oder im Regelungsteil desselben gelegenen einmaligen Schnittstellen der Restriktionsenzyme und die allgemeine Struktur des Kombinations-DNS-Moleküls dargestellt. In der Figur 3 wird ein Teil der Basenordnung des a-Amylasegens mit Beginn vom Schnittpunkt des Restriktionsenzyms EcoR I dargestellt.
Das rekombinante DNS-Molekül zur Ausführung des Verfahrens besteht aus einem in Bakterien der Gattung Bacillus als mehrere Kopien auftretenden Plasmidmolekül, an welches das Gen des a-Amylases des Bacillus amyloliquefaciens angefügt ist. An das Plasmidmolekül kann das Gen jedes beliebigen Proteins nach dem Absonderungssignal des a-Amylasegens gefügt werden, wobei das erwünschte Protein in Bakterien der Gattung Bacillus erzeugt werden kann. Die Erzeugung des rekombinanten DNS-Moleküls ist beispielhaft in der Figur 4 dargestellt.
Aus dem rekombinanten DNS-Molekül, welches das a-Amylasegen enthält, wird zunächst der grösste Teil des Strukturgens von a-Amylase durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym EcoR I entfernt. Das somit erhaltene DNS-Molekül wird mit dem Restriktionsenzym geöffnet, und zur Entfernung des restlichen Strukturteils des a-Amylase-gens wird das Molekül mit Exonuklease III und Sl-Nuklease abgekürzt, wonach die Zweifaserigkeit der Molekülenden mit Inverttranskriptasenzym sichergestellt wird. Hiernach wird zum geöffneten und abgekürzten Molekül ein die Schnittstelle EcoR I enthaltendes Fugenmolekül (DNA-linker) gefügt. Die Lage des Fugenmoleküls im Kombinations-DNS-Molekül wird dadurch ermittelt, dass die DNS-Basenordnung der Fugenstelle untersucht wird. Die letzten Nukleotide im Strukturgen der a-Amylase werden durch DNS-Polymerase-I-Behandlung entfernt, und das neue Fugenmolekül wird zum Schlusspunkt des Absonderungssignals des a-Amylasegens gefügt. Zu diesem Fugenmolekül vorkommenden Öffnungspunkt des Restriktionsenzyms kann das Strukturgen jedes beliebigen anderen Proteins gefügt werden, z.B. das ß-Lakta-masegen von E-coli, oder eine die Aminosäuren von jedem beliebigen a-, ß- oder y-Interferon kodierende DNS-Sektion oder deren Teil. Das vom gefügten Gen kodierte Protein entsteht jetzt in Bakterien der Gattung Bacillus mittels der Rege-lungs- und Absonderungssignale des a-Amylasegens.
Eingehende Beschreibung eines Beispiels der Ausführung der Erfindung
Isolierung, Reinigung und Spaltung des Genoms aus Bakterien der Gattung Bacillus
Als Bakterienstamm wurde ein B. amyloliquefaciens-Stamm verwendet. Der Stamm wurde über Nacht in einer reichen Nahrungsflüssigkeit kultiviert, die Zellen wurden gesammelt und mit einem 0,0015 M Natriumzitrat-0,015 M Na-Cl-Puffer gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden suspendiert (2-10" Zellen, d.h. eine Kulturmenge von 200 ml) in 2 ml von 20-% w/v Saccharose-50mM Tris-HCl-Lösung bei Ph 8,0). Hierzu wurden 20 mg Lysozym, 20 mg Pronase und 2 ml 1% w/v Sarkosyl®-0,l M EDTA-Lösung (pH 8,0) hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei 15 h bei 37 °C inkubiert. Zum erhaltenen Lysat wurden hinzugesetzt 6,5 ml H20 sowie eine solche Menge vom festen CsCI, dass der Refraktionsindex des Lysats 1,4100 wurde, wonach das Lysat zentrifugiert wurde; Beckmann Ti 50-Rotor, 36 000 U/min 48 h 10 °C. Das zentrifugierte Lysat wurde in Fraktionen eingeteilt, und die Fraktionen, in denen das Genom der Bakterien, nach Bewertung aufgrund der Viskosität, gelegen war, wurden gewonnen und 30 Stunden lang gegen einen 10 mM Tris-HCl-lmM EDTA-0,1 M NaCl-Puffer (pH 8,0) bei 4 °C dialysiert.
Das somit erhaltene Genompräparat wurde dreimal mit Phenol extrahiert, und das Phenol wurde mittels Ätherextraktion entfernt. Die DNS wurde durch Zentrifugierung in einem linearen 15 -► 30% w/v Saccarose-0,1 M NaCl-50mM Tris-HCl-lmM EDTA, 0,1% Natriumlaurylsulfat (pH 8,0)-Gra-dienten gereinigt; Beckmann SW27-Rotor, 22 000 U/min 16 h bei 22 °C, wonach der Gradient fraktioniert wurde, und die Fraktionen, in denen die Grösse der DNS-Abschnitte > 15-106 Dalton betrug, gewonnen wurden, und die DNS wurde mit Äthanol gefällt.
Das somit isolierte B. amyloliquefaciens-Genompräparat wurde unvollständig mit dem Restriktionsenzym Mbo I gespaltet, und die gespalteten DNS-Abschnitte wurden je nach ihrer Grösse im oben beschriebenen Saccharose-Gradienten separiert, Beckmann SW27-Rotor 22 000 U/min, 16 h bei 22 °C. Die Fraktionen, in denen die Grösse der DNS-Abschnitte 1,5 bis 5 -106 Dalton betrug, wurden gewonnen, und die DNS wurde mit Äthanol gefällt.
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Isolierung des Übertragungsvektors und dessen Spaltung mit Restriktionsenzym
Als Übertragungsvektor wurde das Plasmid pUBl 10 verwendet. Das Plasmid wurde aus dem Bacillus subtilis-Stamm SB202 in der früher beschriebenen Weise isoliert und gereinigt (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134 318-329,1978). Das gereinigte Plasmidpräparat wurde mit dem Restriktionsenzym BamH I gespaltet, das nur eine Schnittstelle im Plasmidmolekül aufweist. Die Linearität des Plasmidmoleküls wurde mittels Gelelektrophorese überprüft.
Fügung der Abschnitte des B.amyloliquefaciens-Genoms an den Übertragungsvektor
Die mit dem Mbo I-Enzym gespalteten und je nach der Grösse ausgewählten Abschnitte des B. amyloliquefaciens-Genoms wurden mit dem durch das BamH I-Enzym geöffneten pUBllO-Plasmid an einem lOmM Tris HCl-lmM EDTA-Puffer (pH 8,0) beim DNS-Konzentrationsverhältnis 1:3 zusammengemischt, indem das Gesamtvolumen 120 u.1 und die Gesamtkonzentration der DNS 180 |o.g/ml betrugen. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 65 °C geheizt, und zur gekühlten Mischung wurden 13 (xl vom 66mM Tris HC1-6,6mM MgCk-lOOmM Dithiotreithol-lOmM ATP-Puffer (pH 7,8) und 5 iil von Tt-DNS-Ligase (20 Weiss-Einheiten) hinzugesetzt. Die Ligationsmischung wurde 3 Stunden bei 23 °C inkubiert, und das Ergebnis des Ligationsvorganges wurde mittels Gelelektrophorese überprüft.
Übertragung des rekombinanten DNS-Moleküls ans Wirtbakterium
Als Wirtbakterium wurde der B. subtilis 1 A197-Stamm verwendet, dessen Genotyp sacA321, metB5, aroI1907, amy~ war. Der Stamm wurde aus dem Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University, USA) bezogen, und der darin vorkommende Ausdruck Amy- wurde durch bakteriogenetische Verfahren als Mutation im Strukturgen des a-Amylase kodierenden Enzyms erforscht. Der Stamm wurde durch ein früher beschriebenes Verfahren (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81 741-746,1961) dazu kompetent bzw. fähig gemacht, DNS in sich aufzunehmen. Die im vorigen Absatz durch Ligation erzeugten rekombinanten DNS-Moleküle wurden mit den kompetent gemachten Wirtbakterien zusammengemischt, und die Mischung wurde 30 min bei 37 0 C gehalten. Hiernach wurde die Mischung auf Bakterienschalen angebracht, wo das Kanamycin-Antibiotikum dazu verwendet wurde, das Wachstum aller der Bakterien zu verhindern, die Plasmid in sich nicht erhielten. Die Schalen wurden 30 h bei 30 °C gehalten, wobei die Wirtbakterien, die ein Plasmid oder einen damit verbundenen Abschnitt von B.amyloliquefaciens-5 Genoms erhalten hatten, zu kleinen Kolonien wuchsen.
Entdeckung von solchen Wirtbakterien, die ein B.amylolique-faciens-a-Amylase kodierendes Gen als mit dem Plasmid pUBl 10 verbunden aufweisen io Die im vorigen Absatz beschriebenen Bakterienkolonien wurden auf neuen Nährstoffschalen repliziert, die 30 h bei 37 °C kultiviert wurden. Die erhaltenen Bakterienkulturen wurden gemäss einem früher beschriebenen Verfahren (J. Bacteriol. 119,416-424,1974) mit I-KI-Lösung behandelt, 15 wobei um solche Bakterienkolonien, die ein a-Amylase kodierendes Gen enthaltendes rekombinantes DNS-Molekül erhalten hatten, ein weisser Ring gebildet wurde. Die einer solchen Kolonie entsprechende Kolonie wurde aus der ursprünglichen Bakterienschale entnommen, und mit den 20 darin gelegenen Bakterien wurden mehrere aufeinander folgende Reinigungskulturen ausgeführt.
Isolierung und Charakterisierung des rekombinanten DNS-Moleküls
25 Das rekombinante DNS-Molekül wurde durch ein früher beschriebenes Verfahren (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134, 318-329, 1978) aus dem Wirtbakterium isoliert und gereinigt. Das Molekül wurde mit Hilfe von verschiedenen Restriktionsenzymen charakterisiert, und die Lage des a-Amylase 30 kodierenden Gens wurde provisorisch dadurch ermittelt, dass die Inaktivierung des Gens bei Fügung von überzähligen DNS-Abschnitten an verschiedene Stellen des rekombinanten DNS-Moleküls beobachtet wurde. Danach wurde die Basenordnung des a-Amylase kodierenden Gens durch ein früher 35 beschriebenes Verfahren ermittelt [Maxim, A und Gilbert, W, Proc. Nati. Acad. Sei (US) 74, 560-564 (1977)].
Bestimmung der a-Amylase-Aktivität
Das modifizierte Wirbekaterium B.subtilis IHO 6064 4o (sacA 321, metB5), das ein a-Amylase kodierendes Gen im Plasmid pUBl 10 aufweist, wurde in flüssigem Nährstoff (Luria-Fleischbrühe) unter Aération bei 37 °C kultiviert. Aus der Kulturflüssigkeit wurden Proben mit Zeitabständen mit 2 Stunden entnommen, und aus diesen wurde die a-Amylase-45 Aktivität unter Benutzung von Phadebas®-Tabletten ermittelt.
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2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

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  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid pUB 110 ist.
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    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Effektivierung der Erzeugung von Proteinen in Bakterien der Gattung Bacillus unter Anfügen des Gens für die Absonderung von Protein in einem Bakterium der Gattung Bacillus mittels der DNS-Rekombinations-Tech-nik an ein in Bakterien der Gattung Bacillus auftretendes Plasmidmolekül, Transformieren des Wirtsbakteriums der Gattung Bacillus mit dem erhaltenen rekombinanten DNS-Molekül und Kultivierung der transformierten Bakterien zur Proteinerzeugung, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen für die Absonderung von Protein, das an das Plasmid gebunden ist, das a-Amylasegen von Bacillus amyloliquefaciens ist und dass das Plasmid ein Plasmidmolekül ist, das in Bakterien der
    Gattung Bacillus in mehreren Kopien vorhanden ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn-5 zeichnet, dass das Wirtsbakterium Bacillus subtilis ist.
  4. 4. Rekombinantes DNS-Molekül zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Plasmid-Molekül, das in der Gattung Bacillus als mehrere Kopien auftritt, und an das das Gen des a-Amylases des Bacillus amylo-
    io liquefaciens angefügt ist.
  5. 5. Rekombinantes DNS-Molekül nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, dass es die folgende Basenordnung, oder einen Teil davon enthält.
    aaccccccca cataccaaaa gactggctga aaacattgag cctttgatga ctgatgatt? ttcggcgcgt gtatgctttt ctgaccgact ttigtaactc ggaaactact gactactaaä
    ggctgaagaa gtggatcgat tgtttgagaa aagaagaaga ccataaaaat accttgtctg ccgacttct? cacctagcta acaaactctt ttcttcttct gg7attttta 7ggaacagac tcatcagaca gggtattttt tatgctgtcc agactgtccg ctgtgtaaaa ataaggaaîa agtagtctgt cccataaaaa atacgacagg tctgacaggc gacacatctt ïattccttat aacgggggtt gttä7tattt tactgatatg 7aaaatataa t77g7ataag aaaatgagag ttccccccaa caataataaa a7gac7a7ac a77t7a7a7t aaaca7a7tc ttttactctc l
    ggagaggaaa ca7ga77caa aaacgaaagc ggac&gtttc gttcagactt gtgcttatgt cctctccttt gtactaagtt ïttgctttcg cctgtcaaag caagtctgaa cacgaataca gcacgctgtt atttgtcagt ttgccgatta caaaaaca7c acccg7aaat rnrtccnna cgtgcgacaa taaacag7ca aacggctaa7 gtttttgtag tcggcattta ccgtgcgact acgtcataaa acttaccata
    7gcggcttgc tgccggtcg7
    aacctttgct aacgtcttac.
    atgcgcaaca tttatcggat atcggaatca ctgccg7ctg gattcctccc gcatacaaag tacccc7tgt aaatacccta tagccttagt gacgccagac ctaaggaggg cgta7gtttc ga7tgagcca atccgataac ggatacggac cttatgattt gtatgattta ggagaattcc ctaactcgg7 taggc7attg cctatgcctg gaa7ac7aaa ca7ac7aaat cctcttaagg agcaaaaagg gacggtcagà acgaaatacg gcacaa tcgtttttcc ctgccagtct tgctt7atgc cgtg7t worin der Pfeil das Anfangskodon der Signalsequenz des a-Amylasegens zeigt, und wo die Sequenz, die dieses folgt und das a-Amylasegen kodiert, unterstrichen ist.
  6. 6. Rekombinantes DNS-Molekül nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, dass das Plasmid pUB 110 ist.
CH4425/85A 1980-12-31 1981-12-21 Verfahren zur effektivierung der erzeugung von proteinen und rekombinantes dns-molekuel. CH659480A5 (de)

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