CS195490A3 - Process for preparing oxetanocin g - Google Patents

Description

-1- - Λ» Předložený vynález se týká nového způsobu přípra-vy oxetanocinu G. Předložený vynález se také týká me-ziproduktů pro syntézu oxetanocinu G.

Oxetanocin G je sloučenina, která je považována zapoužitelnou jako-antivirální činidlo atd., a je popsá-na v ϋΡ-Α-Ο292ý17 spolu se způsobem jeho přípravy· lentoznámý způsob zahrnuje bud provedeni mikrobiální konverzeve stupních od oxetanocinu A do získání oxetanocinu Xa pak provedení chemické syntézy až do 2-amino-oxetano-cinu A, nebo použití chemické syntézy pro všechny stupněaž do 2-amino-oxetanocinu A a závěrečné provedení enzy- matické konverze pro získáni oxetanocinu G. xenco. známý způsob je však spojen s problémy v pří- pade mikrobiologické konverze, kterými jsou potřebné vel-ké množství mikrobiálních buněk, prodloužená reakční do-ba atd. Naopak chemická syntéza se setkává s problé-mem, že výtěžek takového procesu není vhodný7 pro prů-myslovou výrobu. Předložený vynález byl proto zaměřen na nalezení způ-sobu přípravy oxetanocinu G vhodného pro průmyslovou vý- robu, dosažené výsledky výzkumu jsou předmětem předlo-ženého vynálezu. Cílem vynálezu je poskytnutí způsobu výroby oxeta-nocinu G /dále častěji označovaného jaxo QXT-G/, kterýje vhodný pro průmyslovou výrobu. 2- Předložený vynález poskytuje způsob přípravy OXT-G,který zahrnuje hydrogenolýzu alkoxylovaného 2-amino-oxe-tanocinu A (označovaného jako 2-anino-OXT-A) obecného vzorce I za vzniku' 2-anino-oxetanocinu A (označovaného jako 2-rasino-GXr-A) a pak převedení v poroze t> na skupinu /0=0- Předložený vynález se (včetně jeho solí), sterý 2-auino-0XT-A (včetně jeho týká způsobu psí pravý OXT-Gshrnuje hydrogenolyzu alkoxy-solí) obecného vzorce 1

kde R,j znamená nižší alkylovou skupinu, pro odstraněníalkoxylové skupiny Za vzniku 2-amino-OXT-A (včetně jehosolí) následujícího vzorce

HO

-OH -3- a pak převedení ^C-NI^ v poloze 6 této sloučeniny naskupinu ^G=0,

Předložený vynález se také týká oxetanocinovýchderivátů obecného vzorce II

Y

kde R^ znamená nižší alkylovou skupinu, ' které jsou vhodnými meziprodukty pro syntézu OXT-G.

Hydrogenolýza alkoxy-2-amino-0XT-A obecného vzorce I může o t provedena katalytickou redukcí v rozpouštědle» Může být použito jakékoli rozpouštědlo pokud nein-hibuje reakci, obecně jsou používána polární rozpouš-tědla například polární organická rozpouštědla, voda nebo směs vody a polárního organického rozpouštědla» Jako po- lární rozpouštědlo je výhodné použít nižší alkohol jako je methanol ethanol atd.

Jako katalyzátor morou být pou. ity katalyzátory pouvane pro běsnou katalytickou redukci, například Kataly-zátory platinového, palladiového, niklového, kobaltové- 21- ho typu atd. Běžně se používá katalyzátorů palladiového -4- typu jako je Pd-G atd.

Peakce se obvykle provádí za přítomnosti vodíku přiasi 0 °C až asi 150 °G za normálního tlaku až za tlakunapř. od asi 0,1 do asi 2 mFa.

Keakční doba se bude měnit podle použitého katalyzá-toru nebo reakční teploty a není omezena na určité období,pro reakci je vsak vhodná doba od asi 1 hodiny do asi 10hodin.

Pro přípravu 2-amino-OXT-A solí se použije následu-jící postup, 2-Amino-OXí-Á se suspenduje ve vodě a přidá se kyse-lina k suspenzi pro rozpuštění 2-anino~QXT-A. Pak se k roz-toku přidá vhodné rozpouštědlo pro krystalizaci soli. Propřípravu solí múze být použita jakákoli kyselina pokud jeto farmakologicky přijatelná kyselina. Výhodnými příkla-dy jsou kyselina,chlorovodíková, sírová, fosforečná atd* Příklady nižší alkylové skupiny v obecném vzorci Inebo II zahrnují alkylovou skupinu mající 1 až ó atomůuhlíku, výhodně 1 až 4 atomy uhlíku jako je methyl, ethyl,propyl a outyl atd.

Pro převedení skupiny ^G-hiH^ v poloze 6 na skupinu\C=0 může být použita bu3 chemická metoda nebo metoda en- zymatická, obvykle-se používá enzymatická metoda. Jako en-zym mohou oýt použit,yadenosin-deamináza, adenylová kyseli-na-deaminézy a poobnJ. -yto enzymy mohou být obchodnědostupné, například PG 3.o.4.4 vyrobený Sigma Go., jakoadenosin-deemináza a aaenylová kysezina-deaninaza, o -ade-nylová kyselina-deaminázy /katalogové číslo A-1'$Jí'/ vyro- -5- p bená také Sigma Goe, nebo JEAmlZYkE (obchodní označení)vyrobený Amano Pharmacetical Co., Ltd., atd. íyto enzy-my nemusí oýt čisté, ale mohou být také použity kulturamikroorganismů a jí zpracované latmy nebo produkty oddě-lené z živočišné tkáně pokud tyto léčky obsahují potřebnéenzymy.

Pro přípravu Okl-z z 2-amino-QXl-A zs. použití těchtoenzymu se 2-amino-CXr-A a tyto enzymy nechají vzájemněreagovat ve vodném rozpouštědle, napřikxad vodě nebo roz-pouýtedlové směsi vody a polárního rozpouštědla ^nižšíhoalzonolu a podobně) pri pn od asi 5 do asi 9, výhodně odasi 6 do asi 8, při teplotě od asi 10 °C do asi 70 °0, vý-hodně od asi 20 °C do asi 50 °C, výhodněji od asi 20 ,°0do asi 40 °C. Jako rozpouštědlo je výhodné použít tlumi-vý roztok, výhodně fosfátový tlumivý roztok pro stabili-zaci pH. Obecně může být použito od asi 0,05 do asi '2,5 Mvýhodně asi 0,1 as asi 2,0 iů fosfátového pufru /pH od asi5 do asi 8/.

Je obtížné stanovit obecné rozmezí množství enzymu,které má oýt použito, protože množství se bude měnit podlečistoty’enzymu atd,, ale je výhodné například použít A-1907(adenylová kyselina-deamináza) vyrobenét^Sigmou Co. v množ-ství od asi 10000 do asi 50000 jednotek na 1 mol 2-amino-OXT-A. Optimální množství, které je vhodné použit je asi2 0000 až 30000 jednotek.' V případě EG 3.5.4.4 (adenosin-desminéza) vyrobenéSigmou Co., je výhodné použít 2000 až 2000C0 jednotek na1 mol C-amino-OXl-A. Cptimifm pou<.irého množství je asi 4 ..•'J·.·'.-·?*??./.ÍS*’Ve ·- «.'.Z'.’. '..'.•.'hř.ť.ÚjOzAe i'· li· ·?!'.. 'i' L-... -6- 25000 až 50000 jednotek. V tomto případě může být enzyma-tická metoda provedena způsobem popsaným v EP-A-0292917«

Pro izolování produktu, z reakoního roztoku může býtpoužita nekteré z běžných metod. Izolace múze být prove-dena nt rodeu využívající rozdílnou rozpustnost ve vodě'nebo v organickém rozpouštědle, adsorpčně-desorpení me-todu využívající aktivního unií, absorpční pryskyřice ne-bo iontovýmenné pryskyřice a podobně, tyto metody mohoubýt použity ve vhodné kombinaci.

Například bezbarvý krystalický ΟΧΐ-G múze být získánreakcí 2-amino-OXT-A s enzymem, průchodem reakčního roz-toku kolonou naplněnou porézní pryskyřicí pro adsorpciproduktu na tuto pryskyřici, pak bučí. elucí produktu vodou,zahuštěním a odpařením co sucha, nebo elucí rozpouštědlo-vou směsí voda-nižší alkohol /methanol, ethanoi nebo po-dobně/, zahuštěním požadované frakce a odpařením do sucha.

Je-li to nezbytné a žádoucí, může být získaný OXT-G dáleR čištěn za použití Sephadexuř a poddbně.

Alkoxy-2-amino-OXT-A obecného vzorce I, který se po-užije jako surová sloučenina v předloženém vynálezu můžebýt připraven následujícími stupni. 1) Způsob přípravy alkoxy-2-amino-0XT-A:

®

I stupeň 5O τ' -—> HO—l/ /

O H°-ť_

OH

OH ® © -8· ϊο znamená, že po převedení oxetanocinu A (OXT-A)naN-oxid., se substituuje kyanoskupina na aminoskupinu přesoxadiazolový kruh. 'výsledná K-oxidová sloučenina se aikylu-je a pak se provede otevření kruhu, nové uspořádání a 'uzavření kruhu, získá se alxoxy-2-&amp;mino-0Xl-A (sloučenina5).Stupně jsou detailněji popsány dále·

Stupeň i:

Oxetanocin A (OXl-Aj se N-oxiduje vhodným .oxidačním činidlem. Příklady oxidačního činidla zahrnuji m-chlor-peroxid vodíku perbenzoovou kyselinu, peroctovou kyselinu/atd. Oxidačníčinidlo muže být použito v asi 0,> do asi 5 ekvimolárníchmnožstvích vztaseno na OX1-A. Peakce může cýt provedena přiteplotě v rozsahu od asi 0 °C do asi 100 °C. ^eakce popsaná výše se obvykle provádí ve vhodnémrozpouštědle. Jako rea.kční rozpouštědlo mrfže být použitopolární organické rozpouštědlo jako je kyselina octová,aceton, dioxan, methanol, ethanol a podobně, může být pří-tomna i voda. reakce může být také provedena ve dvojvrst-vov&amp;m rozpouštědlovém systému obsahujícím nepolární orga-nické rozpouštědlo jako je chloroform, ethylacetát atd·a vodu. ÍM-Oxid ΟΧΪ-Α /sloučenina 1/ múze být puriřikovánodstr&amp;.ně-ním reagencií extrakcí ethylacetétem s následují-cí slcupcowu chromatograřií.

Stupeň 2: V tomto stupni se nechá reagovat hálogenkyan se sloučeninou 1 za vzniku oxadiazolového kruhu. Pří-klady kyanohalcgenidů zahrnují bromicyan, jodkys.n atd.myanohslogeniay mohou nýt použity přibližně v asi. 0,5 až1 O ekvimolérních množstvích, heakční teplota je oovyklemezi asi O °C a asi 100 °0„

Stupeň 3: V tomto stupni se hyarochiorid odstraní z hydrochlo-ridové soli sloučeniny 2 alnoholem nasyceným amoniakem,usko rozpouštědlo je výhoané pom.ít organické rozpouštěd-lo jako je methanol, ethanol atd. Heakce se provádí přiteplotě v rozmezí od asi O °J do asi 60 °C.

Stupen 4:

Sloučenina 3 se alkyluje ve vhoaném rozpouštědle při

normálního tlaku, ale může být provedena i za tlaku. Ja-ko rozpouštědlo je výhodné organické polární rozpouštědlojako je Ν,Ν-dimethylřormamid, aceton, pyridin atd. Pří-klady báze zahrnují mono, di nebo tri-nižší alkyl-sminyjako jsou triethylamih, diisopropylamin a td. Jako alky-lační činidlo může být pou. it alkylhalo genia jako je methyl-j od id, e thy 1 j od id s td. >< ( P *í',\ 1 1 'i ' t / , V U. < J» -1 o-

Stupeň 5; V tomto stupni se bázická skupina sloučeniny 4podrobí otevření kruhu bází, přeskupení a pak uzavřeníkruhu zahříváním- v polárnín rozpouštědle. Jako báze jemožno použít hydroxid alkalického kovu, například hydro-xid sodný, hydroxid draselný a hydroxid kovů alkalickýchženin atd. bále je také možno použít organické báze jakoje triethylamin neoo podobně. Jako polárnírozpouštědloje preferováno rozpouštědlo obsahující alrohol jako jevodný methane1, voduý ethanoi sad. Zahřívání se provádív rozmezí od asi 30 °C do asi 150 °C, ale obvykle v rozme-zí od asi 50 °C do asi 60 °0.

Ve stupních 1 až 5, nemusí být produkt izolován vkaždém stupni, ledaže by došlo k obtížím. Alternativněmohou oýt tyto stupně prováděny kontinuálně v jedné vsázce.Například stupně 2 až 4 mohou být také prováděny v jedné·vsázce za použití polárního rozpouštědla jako je dimethyl-íormamid atd. z Příklad 1 1) Syntéza 2-amino-OXT-A: X roztoku 53,6 g alkoxy-2-amino-0XT-A (sloučenina5)(R^= ethyl) v 50% vodném ethar.oiu se přidá 16 g 10% Pd-Ca provádí se hydrogenolýzy po dobu 4 hodin za přítomnostivodíku při 95 až i 05 °0 za tlaku 1,2 až 1,4 JPa. Po odfil-trov ní katalyzátoru se rozpouštědlo zahustí, zbytek sekrystaluje z 500 ml horké vody, získá se 34,4 g surového2-arino-OXP-A. Promytím sur-ového produktu 1 5Oni horké vo-dy se získá 32,7 £ 2-anino-OXr-A.1/2H?0. -11- 2-Amino-OXT-A.1/2Η20: FE-MS m/zj 266 (M) + UV:AH2° nmj 256,278max NMH (200 MHz, EMS0-dč, TMS) ppm: 8,30(1 H, s, 8-H), 6,SO(2H, šir.s, KH^), 6,23 (1H, d, J=5,84Hz, 1*-H),5,88(2H, šir.s, NH^·), 5,39 <1H, t, OH), 5,0 (1H, t,OH), 4,48 (1H, m, 3'-H), 3,50-3,6O(3H, m)

Elementární analýza:

Vypočteno: 43,94 % 0, 5,49 % H, 30,yt % N nalezeno: 43,o3 % 2) Syntéza soli 2-amino-0HT-A (hydrochlorid):

Ve 33 ml vody se suspenduje 5,0 g 2-aaino-OXT-A.1/2H90 a k suspenzi se přidá 3,42 ml kyseliny chlorovodíkové /chlo-rovodík 20 pro rozpuštění soli a pak se k roztoku při-dá 33 mi ethanolu. Směs se nechá při 5 °0 usadit po dobu20 hodin. Vysrážené krystaly se odfiltrují a promyjí ma-lým množstvím 50% vodného ethanolu a pak malými množstvím ethanolu.Fo vysušení za sníženého tlaku se získá 29,3 2-amino-0XT-A.HO1. 2-Amino-0XT-A„HO1: h 0H 1 4iN6°3riGl Elementární analýza: vypočteno: 40,04 % G, 5 ,02 % H, 28 ,46 % N, 10,31 % 01 nalezeno: 39,68 % G, 5 ,00 % H, 27 ,76 % K, 1 1 ,71 % 01 NMR /200 MHz, 11,0/ ppm} 8,30 (1H, s, í ?-H), 6,29 (1H, « J=4,8 Hz, 1*-H), 4,65 (1H, m, 3*-H), 3,60-3,95 (5H, m). • 'i·. · '. h· -12* 3) Syntéza-1 OXT-G:

Po rozpuštění 2,0 g 2-amino-OXT-A ve 300 mi 1/10 Mfosfátového pufru (pH 6,5), se k roztoku přidá 200 jed-notek deaminázy 5 '-adenylové kyseliny (vyrobená Sigma Co.,A-1 907) a míchá se pak při 37 °C po dobu'50 hodin* Pniprůchodu reakčního rosičku sloupcem s náplní kOI^ GBLCHP 20 (300 mi) a nsadsoroování reakčních produktů na tu-to náplň se produkxy izolují elúcí vodou. Frakce vykazu-jící hodnotu Př asi 0,42 na tenké vrstvě·silikagelu (eluč-ní činidlo: n-ouuanol-kyselina octové-voda/4:1:2/) se spo-jí a zahustí se do sucha za sníženého tlaku, získá se 1,8.g 0X1-0 ve formě bezbarvých krystalů (výtěžek 90 n). fj-nS: 266 (n+H)+a pH 6,0 UV: A (log k ) 253,5 nm (4,09) »*£ (400 iuhz, J90) $ pprn: 3,69-3,67 (5H, m), 4,66-4,69 (1H,m), o,29 (1H, d), 8,17 (1H, s) 4) Syntéza-2 OXT-G:

Po rozpuštění 2,0 g 2-amino-OXT-A ve 300 ml 1/10fosfátového pufru (pH 6,5), se přidá 8,0 g deaminézy 5adenylové kyseliny (vyrobena Amano Pharmaceutical Co., Ltd.,

P Q DEAklZYkFT)k roztoku a míchá se při 37 C po dobu 70 ho-din. ro -odfiltrování nerozpustných látek z reakčního roz-toku se filtrát nechá projít sloupcem naplněným 50 mlpráškového aktivního unií (vyrobeno Wauo zuře Chemical ln-.dustry K.X., pro chromátografii). Po promytí vodou se pro-věje eluce 50/ vodným mezhanolem. Po zahuštění požadova-né frakce do sucha se získá surový OXT-G. Surový prášek -13- se rozpustí v 50 ml vody a roztok OXT-G se adsorbuje naMCI^ GEL GHP 20 (300 ml) s následující elucí vodou» doža-dovaná frakce se zahustí a odpaří do sucha za sníženéhotlaku, získá se 1,5 g OXT-G ve formě bezbarvých krystalů(výtěžek 75 2).

Alkoxy-2-am.ino-OXT-A použitý jako výchozí látka sesyntetizuje následujícím způsobem»

Syntéza alkoxy-2-amino-0XT-A (sloučenina 5) z OXT-A a) Syntéza sloučeniny 1:

Po rozpuštění 150 g OXT-A ve směsi 2,2 litrů vody a1 litru methanolu se k roztoku přidá 0,75 litrů roztoku139 g m-chlorperbenzoové kyseliny v methanolu. Za nepří-stupu světla se směs míchá při teplotě místnosti po dobu18 hodin a k reakcní směsi se pak přidá 0,15 litru rozto-ku 26 g m-chlorperbenzoové kyseliny v methanolu» V míchá-ní se pokračuje po dobu dalších 5 hodin.

Po odfiltrování nerozpustného'materiálu.se filtrát za-hustí na objem 2,0 litru a koncentrát se extrahuje dvakrát1,5 litry ethylacetétu. Po zahuštění vodné fáze na 1,5 litruse ke zbytku přidá 0,5 litru vody. Směs se mechá projítsloupcem naplněným 2,0 litry MGl ' GEL CEP 20» Kapalina,která prošla sloupcem a promývací kapalina (8,2 litru) sespojí a zahustí do sucha, získá se 146,4 g sloučeniny 1 (vý-těžek 91 ,7 %).

Sloučenina 1: FA3-1ÚS m/z; 266 (K.+H)+

NuE (602Hz, D20) ppm;.8,87 (1H, s), 8,73 (1H, s), 6,71 (1H, d), 4,70 (1H, m), 3,95-4T3O (5h, m), 4,6c(1H, m, '4 ÍÍgiííí".’·:''*/,, y -14- b) Syntéza sloučeniny 2:

Po rozpuštění 129,3 g sloučeniny 1 v 5,7 litrechmethanolu se přidá k roztoku 0,45 litrů roztoku 55,5. gbromkyanu v mexhanolu. Směs se míchá 2 hodiny při teplotěmístnosti.

Sloučenina 2 se vysrazí, ale před dalším vysrážením.sloučeniny se k roztoku přidají 3,0 litru ethvlacetátu snásledujícím 20 minutovým mícháním· Vysrážené krystalyse odfiltrují a promyjí ežhylscetáten. Po sušení za sní-ženého tlaku se získá ve formě bezbarvých krystalů 146,48g (výtěžek 81 ,1 p) sloučeniny 2. Patečný louh se zahustía krystaluje z 1 litx*u methanolu a 1 litru ethylacetátu.Provedením stejného postupu se získá 13,26 g (výtěžek 7,3 %)sloučeniny 2 ve formě bezbarvých krystalů·

Sloučenina 2: PD-PS m/z; 294 (I\i+H-3r)+, 13 (KBr); 1720 cm"' (0=NH)

NmR (200 mHz, DitSO-d. TMS) ppmj.' 10,70(1H, šir,s,KH), 10,13(1H, s, 8-H), 9,35 OH, s, 2-H), 6,61 (1H, d, J=4,84Hz,l'-H), 4,70(13, m), 2,$O(3H,m)

Jl?0 UVA“max nm: 223,283. c) Syntéza sloučeniny 3:

Po suspendování 159,6 g sloučeniny 2 v 6 litrechpřidá methanolu se k suspenzi/1,6 1 amoniakem nasyceného metha-nolu (sloučenina 2 se rozpustí). Roztok se míchá při tep-lotě ‘místnosti po oobu 1,5 hociny. Peakcní roztok se za-hustí na polovinu objemu a odfilmrují se vysrážené bezbar-vé krystaly, ro probytí malým množstvím, mezhanozu se krys- -15- 38Ε »>' taly vysuší za sníženého tlaku, získá se 118,1 g (výtě-žek 94,6 %) sloučeniny 3.

Sloučenina 3: FD-iviS m/zj 293 (M+H)+, IR (KBr)j 2170 cm"1 (N-G=N), 1220 cm"1 (h-0) UV Λ max 247> 293

KmR (200 mHz, G-C) ppm: 8,55 (1H, s, 8-H), 8,42(1H, s, 2-H),6,46 (1H, i, J=5,49Hz) 1 ”-H), 4,70 (1H, m, 3'-H),3,72-4,00 (5H, m). d) Sloučenina 4: lo suspendování 109,06 g sloučeniny 3 v 1,1 litru1,K—dimethylí'or-mamidu, se k této suspenzi přidá 85,2 mltriethylsminu a 60,6 ml ethvljcdidu. Snes se míchá přiteplotě místnosti 2 hodiny. Rozpouštědlo se zahustí zasníženého tlaku. Po rozpuštění zbytku v 1 ,4 litru horkévody se roztok nechá stát při teplotě místnosti a výslednágelovitá sraženina se odfiltruje, získá se 1 1.8,47 g(výtě-žek 99,2 surové sloučeniny 4«

Sloučenina 4: FD-lS m/z; 320 (m)+ IR (K3r)j 2180 cm"1 (0 K)

x IdeOH UVj\ nm: 2..Ό, 285 v max ’ 68 K1 IR (200 kRz, GG^OG, IkS) ppm: 8,84 (1H,s,8-H), 8,6 Í1H, s, 2-H), 6,52 (1H, J=5,76Hz, 1 '-H) (1H, m, 3'-H) , 4,43 (2H, q, o=7,01 Hz, -CH2- 3,97 (3H, m) , 1 , ě4 (3H, t, 1=7,01 Hz, -GH,,- 41 -16- e) Syntéza sloučeniny í‘. řo rozpuštění 107,6 g sloučeniny 4 ve 2,3 litrů vo-dy se k suspenzi přidá 86 ml 5N hydroxidu sodného, Směs se míchá při teplotě místnosti 2,5 hodiny. pH reakčnísměsi se upraví na hodnotu 7,3 Dowem* 50 (H+) a prys-ky rice se odfiltruje. K filtrátu se p.·. idá 2,3 litru eths.·nolu. Směs se zahřívá na teplotu zpětného toku po dobu30 minut a výsledný reakční roztok se použije v násle- dujícím stupni jak je popsánoSloučenina 5: fD-mS m/z; 310 . 11,0 nn; 280 tiax ’

inh (200 hHz, jlďSO-d^, Ths) ppmj· 9,70(1(1H, s, 8-H), 6,oC(2H, šir.s, řH?), , šir.s, NH), 8,076,11 (1H, d, J= 3 1

Cj í--! ΓΛ 1 „."f 3 \ j- O A Z Π + AU \ 1 ) j 9 j — V \ í li y v j U„ i ) j 4,96 (1H, π, 3*-H) 98(2H, 9, J=7,04Kz, OCEj-OH-p, 3,40-3,70 (5H,m), 05(3H, u=7,C4Hz, -0CH,.-CH-J 7 J e

J

-16a- -....... ·····" "

I

iest antivirální účinnosti vůči HBT

Test. byl proveden za použiti buněčné linie, HB611, kte-rá byla získána transfekcí a kontinuálně produkuje HBT-podob-né částice /Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 444-448, 1987/»

HB611 buňky byly udržovány v Dulbecco. modifikovaném Eagle me-diu /Gibco/ doplněném 10 % fetálního hovězího sera /GeneralScientific Laboratories/, 100 y ug/ml střeptomycinu, 100 IU ml benzylpenicilinu /Gibco/ a 200 /ug/ml geneticinu /Gibco/při 37 °C ve směBl 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu.

Buňky byly naočkovány do CORNING jamek o průměru 35 nimpři hustotě 1 x 10 5 buněk/jamka, za použití 1,2. ml media.

Po 2 dnech gx inkubacit bylo medium: nahrazeno stejným mediem*obsahujícím testovanou sloučeninu» Buňky byly inkuboványdalších 15 dnů, během kterých bylo medium, obsahující léčivovyměňováno každé tři dny. Buňky byly pak odděleny a byla při-pravena buněčná DNA /Virology, 169, 213-216, 1989/ a štěpe-na restrikčním enzymem Hind lil /lakara Shuzo Co., Ltd./.Podíl /3 yug/ byl zpracován elektroforézou v 1,5% agarozovémgelu, následovanou blottingem na nylonové membráně GeneScreenPlus podle Southerna /j.Mol.Biol», 98, 503-517, 1975/. Piltrbyl hydridizován k náhodně, zvolené 52p značené HBV DNA sonděa promyt dvakrát 2 x standardním salinickým citrátem, obsa-hujícím 1 % SDS při 65 °C po 30 min. Byl zpracován autoradio-graficky a výsledky byly analyzovány za použití analyzátoruhustoty /Shimadzu, Chromatoscana S95O/»

Pro kvantitativní, hodnocení inhibiční účinnosti slouče-nin, byly měřeny plochy prohů S, D1, D2 /S, D1 a D2 předsta-vují intracelulární volnou HBV DNA odvozenou z replika tiv-ních. meziproduktů/ a I /představuje chromozomálně integrujícíHBV DNA/ analyzátorem hustoty a procenta inhibice byla vypoč·*tena následovně: /^léčivo * ^léčivo +~^2-léčivo^ obs.+D1 obs.+D2 obs^obs . léčivoi inhibice /%/ x100 -16b-

Anti-HBV aktivita ID,50» vyjádřená jako koncentrace lé-čiva p otřehná pro 50% inhlbici syntézy virové DNA, byla získá-na vynesením, Inhiblce /%/ proti koncentraci léčiva. Výsledkyjsou shrnuty v tabulce 1. Tabulka 1 také zahrnuje minimálnícytotoxické dávky /MTD/ léčiva získané mikroskopickým počítá-ním životaschopných, buněk právě před extrakcí buněčné DNA. T-a bulka 1

Anti-HBV účinnost £lgh£sg;Laa-ΕΗΏ/ _H>50//ag/ml/ referenční OXT-A 20 „0 9,1 podle vynálezu OXT-G 100,0 0,72 2-amino-0XT-A 50,0 0,52 MTD představuje minimální cytotoxickou dávku. Antivirováúčinnost Je reprezentována 50% inhibičních dávek /ID^q/ ppyDNA syntézy. Tyto hodnoty byly získány vynesením logaritmukoncentrace sloučeniny proti procentům inhiblce syntézy viro-vé DNA v ošetřených buňkách.

Claims (8)

1. -u- PATENTOVÍ NÁROK! 1. Způsob přípravy oxetanocinu G, vzorce

   HO-, Ο- 7 i/

   ?· ί ΑΛ3Γ90νλΖ3ΐν.\ΑΛ Ohd avgn Ι 6 ΙΙΙΛ P 0 «asQQ Γ, 0 6 9 c 0 ( Líl~J -- OK vyznačující se tím,, že zahrnuje 1/ hydrogenolýzu alkoxylovaného 2-amlno-oxetanocinu Aobecného vzorce I

   HO

   kde R^ znamená alkylovou skupinu s 1 až < atomy uhlíku,na 2-amIno-oxetanocin A vzorce

   a pak převedení skupiny v poloze 6 této sloučeniny na skupinu C=0.
2. 2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u i í c í set £ m, že konverze skupiny z C-NHg v poloze 6 na skupinu /c-0 se provede působením, adenosin-deaminázy nebo deaminázyadenylové kyseliny.
3. 3. Způsob, podle nároku 1, v y zn a č u . Jí c £ s e t £ m„ že hydrogenolýza alkoxylovaného 2-amino-oxetanocinuA se provede, katalytickou redukcí v polárním, rozpouštědle.
4. 4. Způsob podle nároku 1 , v y z n a č u j í cí s e t í ntr že hydrogenolýza se provádí při teplotě od G °c do150 °G.
5. 5. Způsob podle nároku 2,. v y z n a č u j í c í set £ m, že konverze se provádí ve vodném rozpouštědle přihodnotě pH od 5 do 9 při reakční. teplotě od 10 °C do 70 °c.
6. 6. Způsob podle nároku 5ř v y a n a č u j íc í s et £ m, že konverze se provádí při. hodnotě pH od 6 do 8při reakční teplotě od 20 °C do 50 QC.

   19-

   $ $ .3
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se fe £ bl, že se jako alkoxylovaný 2-amino- oxetanocin A obecné- ho vzorce Γ

   /1/ použije alkoxylovaný-2-amino-oxetanocin A připravený alky-lací kyanovanébo K-oxidu oxetanocinu A vzorce NH.CU

   H°--/ 1 í- OK za vzniku kyano-N-a lkoxy oxetanocinu A vzorce

   1_,οη: kde R-j znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,vzniklá sloučenina se pak zpracuje s alkálií,neutralizuje a zahřívá ♦
8. 8. Oxetanocinové deriváty pro přípravu, oxetanocinu Gpodle nároku li, mající obecný vzorec. HO oh: kde Ϊ znamená skupinu vybranou ze souboru, který tvoří

   -2.11-

   EHGR.!

   nebo;

   •i