CZ2002403A3 - Vakcína - Google Patents

Vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ2002403A3
CZ2002403A3 CZ2002403A CZ2002403A CZ2002403A3 CZ 2002403 A3 CZ2002403 A3 CZ 2002403A3 CZ 2002403 A CZ2002403 A CZ 2002403A CZ 2002403 A CZ2002403 A CZ 2002403A CZ 2002403 A3 CZ2002403 A3 CZ 2002403A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
vesicle
gene
strain
based composition
expression
Prior art date
Application number
CZ2002403A
Other languages
English (en)
Inventor
Francois-Xavier Jacques Berthet
Wilfried L. J. Dalemans
Philippe Denoel
Guy Dequesne
Christiane Feron
Yves Lobet
Jan Poolman
Georges Thiry
Joelle Thonnard
Pierre Voet
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10858521&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ2002403(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S. A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Publication of CZ2002403A3 publication Critical patent/CZ2002403A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká vakcín proti gramnegativním bakteriím, způsobu jejich výroby a jejich použití v lékařství. Vynález se zvláště týká nových vakcín založených na váčcích vnější membrány (neboli blebs) a výhodných způsobů přeměny těchto vakcín do účinnější a bezpečnější formy.
Dosavadní stav techniky
Gramnegativní bakterie jsou od vnějšího prostředí odděleny dvěma za sebou následujícími vrstvami membránových struktur. Tyto struktury, které se označují jako cytoplasmatická membrána a vnější membrána (OM, outer membrane) se liší jak svou strukturou, tak svou funkcí. Vnější membrána má důležitou úlohu při interakci patogenních bakterií s případnými hostiteli. Z toho vyplývá, že bakteriální molekuly vystavené (exponované) na povrchu představují důležité cíle pro imunitní odpověď hostitele, což způsobuje vhodnost složek vnější membrány jako kandidátů při poskytování vakcín, diagnostických a terapeutických prostředků.
Vakcíny založené na celých buňkách (usmrcených nebo oslabených) mají výhodu v tom, že poskytují větší počet antigenů v jejich přirozeném mikroprostředí. Nevýhody spočívají ve vedlejších účincích indukovaných bakteriálními složkami, jako jsou endotoxiny a fragmenty peptidoglykanů. Na druhé straně, bezbuněčné podjednotkové vakcíny obsahující vyčištěné složky vnější membrány, mohou poskytnout pouze omezenou ochranu a nemusí antigeny vhodným způsobem předkládat imunitnímu systému hostitele.
• · · · • · · · ·· · · · ·
-2 Proteiny, fosfolipidy a lipopolysacharidy jsou tří hlavní složky, které se nacházejí ve vnější membráně všech gramnegativních bakterií. Tyto molekuly jsou distribuovány asymetricky: membránové fosfolipidy (většinou ve vnitřním povrchu), lipopolysacharidy (výlučně ve vnějším povrchu) a proteiny (lipoproteiny vnitřního a vnějšího povrchu, integrální nebo polytopické membránové proteiny). U mnoha bakteriálních patogenů s dopadem na lidské zdraví bylo zjištěno, že lipopolysacharidy a proteiny vnější membrány jsou imunogenní a mohou poskytovat ochranu proti odpovídajícímu onemocnění prostřednictvím imunizace.
Vnější membrána gramnegativních bakterií představuje dynamický systém a v závislosti na podmínkách vnějšího prostředí může podléhat drastickým morfologickým přeměnám. Mezi těmito projevy byla studována a dokumentována u mnoha gramnegativních bakterií tvorba váčků nebo puchýřků („blebs“) vnější membrány (Zhou,
L. a další, 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163: 223 - 228).
Nevyčerpávající seznam bakterií batogenů, u kterých byla tvorba takových váčků hlášena, zahrnuje: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa a Yersinia enterocolitica.
I když biochemický mechanismus odpovědný za tvorbu váčků vnější membrány není dosud zcela jasný, tyto váčky vnější membrány byly intenzivně studovány, protože představují účinnou metodologii pro izolaci proteinových preparátů vnější membrány ve svých nativních konformacích. V této souvislosti je využití preparátů založených na vnější membráně zvláště zajímavé pro vývoj vakcín proti bakteriím Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa a Chlamydia. Navíc kombinují váčky vnější membrány větší počet proteinových a neproteinových antigenů,
- 3 u kterých je pravděpodobné, že poskytnou zvýšenou ochranu proti mezidruhovým variantám.
Ve srovnání s jinými, více používanými typy bakteriálních vakcín •I(vakcíny založené na úplných bakteriálních buňkách a Čištěné podjednotkové vakcíny) autoři vynálezu ukázali, že vakcíny založené na membránových váčcích (při určitém způsobu modifikace) mohou představovat ideální kompromis.
Široké použití bakteriálních podjednotkových vakcín bylo způsobeno intenzivním studiem proteinů bakteriálního povrchu, u kterých bylo zjištěno, že jsou využitelné ve vakcínách (například pertaktin B. pertussis). Tyto proteiny jsou volně asociované s vnější bakteriální membránou a mohou být čištěny z kultivačního supernatantu nebo snadno extrahovány z bakteriálních buněk. Bylo však také ukázáno, že ochranné antigeny jsou také integrální proteiny vnější membrány. Příklady jsou PorA N. meningitidis séroskupiny B; D15 H. influenzae; OMP CD M. catarrhalis; OMP F P. aeruginosa. Tyto proteiny však mají spíše specifické strukturní vlastnosti, zvláště vícečetné amfipatické β-listy, které komplikují jejich přímé použití ve formě purifikovaných (rekombinantních) subjednotkových vakcín.
Navíc je nyní zřejmé, že pro vytvoření vhodné míry ochrany je zapotřebí vícesložkových vakcín (z hlediska proteinů bakteriálního povrchu a integrálních membránových proteinů). Například v případě
6. pertussis jsou podjednotkové vícesložkové vakcíny výhodnější než jedno- nebo dvou složkové produkty.
Aby bylo možno zahrnout integrální proteiny vnější membrány do takového podjednotkového produktu, musí docházet u produktu k nativnímu (nebo téměř nativnímu) konformačnímu uspořádání (folding) proteinů, aby bylo dosaženo použitelného imunologického účinku. Použití vylučovaných váčků (bleb) vnější membrány může být elegantní řešení problému zahrnutí ochranných integrálních • · ·· ·* ·· ·· • 9 · · · · · ····
- 4 • ······ · · · · · · • · 9 4 9 4 9 4
494 4 44 4944 49 4999 membránových proteinů do podjednotkové vakcíny při zajištění uspořádání do příslušné konformace.
N. meningitidis séroskupiny B (menB) vylučuje váčky vnější membrány v dostatečných množstvích, aby to umožnilo jejich výrobu v průmyslovém měřítku. Bylo zjištěno, že tyto vícesložkové vakcíny založené na proteinech vnější membrány z kmenů menB vyskytujících se v přírodě, jsou účinné při ochraně mladistvých před onemocněním menB, a byly již registrovány v Latinské Americe. Alternativní metoda přípravy váčků vnější membrány je založena na extrakci bakteriálních buněk detergentem (EP 11243).
Příklady bakteriálních druhů, ze kterých je možno připravit vakcíny založené na váčcích, jsou následující.
Neisseria meningitidis
Neisseria meningitidis (meningokok) je gramnegativní bakterie často izolovaná z horního respiračního traktu člověka. Příležitostně způsobuje invazivní bakteriální onemocnění, jako je bakteremie a meningitida. výskyt meningokokového onemocnění vykazuje zeměpisné, sezónní a meziroční rozdíly (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (doplněk), S 18-S24, 1989). Většina onemocnění v zemích mírného pásma je způsobena kmeny séroskupiny B a jejich výskyt kolísá od 1 do 10/100 000/na rok celkové populace, přičemž někdy se vyskytuje častěji (Kaczmarski, E. B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. a další, Clin. Infect. Dis. 16: 237 - 246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., a další, Epidemiol. Infect. 105: 119 - 126, 1990).
Výskyt závislý na věku ve dvou vysoce rizikových skupinách, u dětí a u mladistvých, dosahuje vyšších hodnot.
······· · · · · · · • · ♦ · · ··· _ ··· · ······ ······
- 5 Epidemie s převažujícími meningokoky séroskupiny A se vyskytují převážně v centrální Africe, přičemž někdy se vyskytují s počtem případů až do 1000/100 OOO/rok (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (doplněk), S18-S24, 1989). Téměř všechny případy meningokokového onemocnění jako celek jsou způsobeny séroskupinami A, B, C, W-135 a Y meningokoků. Je dostupná tetravalentní vakcína založená na kapsulárních polysacharidech proti séroskupinám A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335 - 339, 1982).
Polysacharidové vakcíny se v současnosti zlepšují metodou chemické konjugace s nosnými proteiny (Líeberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K., a další, JAMA 275: 1499 - 1503, 1996). Vakcína proti séroskupině B není dostupná, protože kapsulární polysacharid B není imunogenní, nejpravděpodobněji proto, že sdílí strukturní podobnost se složkami hostitelských buněk (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L. a další, J. Infect. Dis. 126: 514 - 522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Makela, P. M. Lancet ii.: 355 - 357, 1983).
Již mnoho let se úsilí soustředilo na vývoj vakcín založených na vnějších membránách meningokoků (de Moraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M. C. a další, Lancet 340: 1074 - 1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby, J. K. a další, 338: 1093 - 1096, 1991). Tyto vakcíny měly účinnosti od 57 % do 85 % u starších dětí (>4 roky) a dospívajících. Většina těchto studií účinnosti byla prováděna na vakcínách OMV (outer membrane vesicles, váčky vnější membrány, odvozené odstraněním LPS z váčků) odvozených od kmenů N. meningitidis B standardního typu.
Ve vakcínách je přítomno mnoho složek bakteriální vnější membrány, jako je PorA, PorB, Rmp, Ope, Opa, FrpB, a příspěvek těchto složek k pozorované ochraně stále ještě potřebuje dalšího upřesnění. Byly definovány další složky vnější membrány bakterií • ······ · · ·· · • · · · « · · • · · · · · · · · · · ·
- 6 • · · · (použitím zvířecích nebo lidských protilátek), protože by mohly potenciálně přispívat k indukci ochranné imunity, jako je TbpB, NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B. R., J. Exp. Med. 185: 1173 - 1183, 1997; Lissolo, L., Maitre-Wilmotte, C., Dumas, P. a další, Inf. Immun. 63: 884 - 890, 1995). Mechanismus ochranné imunity bude zahrnovat baktericidní aktivitu zprostředkovanou protilátkami a opsonofagocytózu.
Četnost výskytu infekcí Neisseria meningitidis v posledních několika desetiletích podstatně stoupla. To bylo připisováno vytvoření kmenů odolných vůči většímu počtu antibiotik, a zvýšené expozici v důsledku zvýšení společenských aktivit (například plovárny nebo divadla). Již není neobvyklé izolovat kmeny Neisseria meningitidis, které jsou rezistentní na některá nebo všechna standardní antibiotika. Tento jev vyvolal nutnost potřeby nových antimikrobiálních prostředků, vakcín, metod pro screening léčiv a diagnostických testů na tento organismus.
Moraxella catarrhalis
Moraxella catarrhalis (nazývaná také Branhamella catarrhalis) je gramnegativní bakterie často izolovaná z horního respiračního traktu člověka. Je odpovědná za několik patologických stavů, z nichž hlavní jsou zánět středního ucha u kojenců a dětí, a pneumonie u starších osob. Je také odpovědná za zánět dutin, a méně často za invazivní onemocnění.
Baktericidní protilátky byly identifikovány u většiny testovaných dospělých (Chapman, A. J. a další (1985), J. Infect. Dis. 151: 878). U kmenů M. catarrhalis existují rozdíly ve schopnosti odolávat baktericidní aktivitě v séru: obecně jsou izoláty od nemocných jedinců odolnější než izolátky, které jsou jednoduše kolonizovány (Hol, C. a další (1993), Lancet 341: 1281, Jordán, K. L. a další, (1990), Am. J. Med. 88 (doplněk 5A): 28S). Odolnost proti séru by tedy mohla být
považována jako faktor virulence této bakterie. V sérech dětí, které se zotavily ze zánětu středního ucha, byla v séru pozorována opsonizační aktivita.
Antigeny specifické pro tyto různé imunitní odpovědi u lidí dosud nebyly identifikovány s výjimkou OMP B1, proteinu 84 kDa, jehož exprese je regulována železem, a který je rozpoznáván séry pacientů s pneumonií (Sethi, S., a další, (1995) Infect. Immun. 63: 1516), a UspA1 a UspA2 (Chen D. a další, (1999), Infect. Immun. 67: 1310).
Použitím biochemických metod bylo charakterizováno několik dalších membránových proteinů přítomných na povrchu M. catarrhalis, které by byly použitelné při indukci ochranné imunity (přehledný článek viz Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). V modelu pneumonie u myší urychluje přítomnost protilátek proti některým z nich (UspA, CopB) odeznění plicní infekce. Další polypeptid (OMP CD) je u kmenů M. catarrhalis vysoce konzervovaný a obsahuje homologní oblasti s porinem Pseudomonas aeruginosa, u ktrerého bylo ukázáno, že je účinný u zvířecích modelů proti této bakterii.
M. catarrhalis vytváří váčky na vnější membráně (blebs). Tyto váčky byly izolovány nebo extrahovány různými způsoby (Murphy T.
F. , Loeb M. R. 1989. Microb. Pathog. 6: 159 - 174; Unhanand M., Maciver, I., Ramillo O., Arencibia-Mireles O., Argyle J. C., McCracken
G. H. Jr., Hansen E. J. 1992, J. Infect. Dis. 165: 644 - 650). Ochranná schopnost těchto preparátů váčků byla testována na myším modelu pro vylučování z plic M. catarrhalis. Bylo ukázáno, že aktivní imunizace vakcínou založenou na váčcích nebo pasivní přenos protilátky proti váčkům indukuje v tomto modelu významnou ochranu (Maciver I., Unhanand M., McCracken G. H. Jr., Hansen, E. J. 1993. J. Infect. Dis. 168: 469 - 472).
- 8 Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae je nepohyblivá gramnegativní bakterie. Jejím jediným přirozeným hostitelem je člověk. Izoláty H. influenzae se obvykle klasifikují na základě jejich polysacharidového obalu. Bylo identifikováno šest různých typů obalů označených „a“ až „f“. Izoláty, které nevyvolávají aglutinaci s antisérem proti některému z těchto šesti sérotypů, se zařazují jako netypovatelné, a neexprimují obal.
H. influenzae typu b (Hib) je jasně odlišná od dalších typů v tom, že je hlavní příčinou bakteriální meningitidy a systémových onemocnění. Netypovatelné kmeny H. influenzae (NTHi) se izolují z krve pacientů se systémových onemocněním pouze příležitostně. NTHi je běžná příčina pneumonie, vypuknutí chronické bronchitidy, zánětu dutin a zánětu středního ucha. U kmenů NTHi dochází k velké variabilitě, jak bylo identifikováno analýzou klonů, zatímco kmeny Hib jako celek jsou homogennější.
Bylo ukázáno, že různé proteiny H. influenzae se účastní patogeneze nebo po vakcínaci vyvolávají ve zvířecích modelech ochranu.
Byla ukázána adherence NTHi k lidským epiteliáiním buňkám nosohltanu (Read R. C. a další, 1991. J. Infect. Dis. 163: 549). Kromě fimbrií a pilusů bylo v NTHi identifikováno mnoho adhesinů (Brinton C. C. a další, 1989, Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S54; Kar S. a další, 1990, Infect. Immun. 58: 903; Gildorf J. R. a další, 1992, Infect. Immun. 60: 374; St. Geme J. W. a další, 1991, Infect. Immun. 59: 3366; St. Geme
J. W. a další, 1993, Infect. Immun. 61: 2233). Mezi těmito kmeny bylo ukázáno, že adhesi NTHi k epiteliáiním buňkám zprostředkují dva vysokomolekulární proteiny exponované na povrchu označené HMW1 and HMW2 (St. Geme J. W. a další, 1993, Proč. Natí. Acad. Sci. USA 90: 2875). U kmenů NTHi byla identifikována další skupina vysokomolekulárních proteinů, přičemž tyto kmeny postrádají proteiny ze skupiny HMW1/HMW2. NTHi protein Hia 115 kDa (Barenkamp S.
- 9 • · ·· ·♦ ·· ·· • 9« · · · · «*9·
999 9 9 9 99 *
99999*9 9 9 *9 9 9
9 999 999
999 9 99 9999 9* 9999
J., St Geme S. W. 1996, Mol. Microbiol, v tisku) má vysokou podobnost s adhesinem Hsf exprimovaným kmeny H. influenzae typu b (St. Geme J. W. a další, 1996, J. Bact. 178: 6281). Další protein, protein Hap, je podobný se serinovými proteázami lgA1, a bylo ukázáno, že se účastní jak adheze, tak i vstupu do buněk (St. Geme J. W. a další, 1994, Mol. Microbiol. 14: 217).
Identifikováno a očíslováno bylo pět hlavních proteinů vnější membrány (OMP). Originální studie používající kmeny H. influenzae typu b ukázaly, že protilátky specifické pro OMP P1 a P2 chránily mláďata krys před následným testovacím podáním bakterie (Loeb M. R. a další, 1987, Infect. Immun. 55: 2612; Musson R. S. Jr. a další, 1983, J. Clin. Invest. 72: 677). Bylo zjištěno, že P2 je schopen indukovat baktericidní a opsonické protilátky, které jsou zaměřeny proti různým oblastem přítomným u struktur smyček exponovaných na povrchu tohoto integrálního OMP (Haase Ε. M. a další, 1994, Infect. Immun. 62: 3712; Troelstra A. a další, 1994, Infect. Immun. 62: 779). Lipoprotein P4 může také indukovat baktericidní protilátky (Green B.
A. a další, 1991, Infect. Immun. 59: 3191).
OMP P6 je konzervovaný lipoprotein asociovaný s peptidoglykanem, který tvoří až 1 až 5 % vnější membrány (Nelson M.
B. a další, 1991, Infect. Immun. 59: 2658). Později byl rozpoznán lipoprotein s přibližně stejnou molekulovou hmotností nazvaný POP (P6 crossreactive protein) (Deich R. M. a další, 1990, Infect. Immun. 58: 3388). Směs konzervovaných lipoproteinů P4, P6 a PCP neumožnila vyvinutí ochrany při měření na modelu zánětu středního ucha u činčily (Green B. A. a další, 1993, Infect. immun. 61: 1950). Samotný P6 pravděpodobně indukuje ochranu u modelu činčily (Demaria T. F. a další, 1996, Infect. Immun. 64: 5187).
Byl také popsán fimbrinový protein (Miyamoto N., Bakaletz, L. O.
1996, Microb. Pathog. 21: 343) s homologii s OMP P5, který má sám sekvenční homologii s integrálním OmpA Escherichia coli (Miyamoto *
• 4 • 4
- 10 N., Bakaletz, L. O. 1996. Microb. Paíhog. 21: 343; Munson R. S. Jr. a další, 1993, Infect. Immun. 61: 1017). Zdá se, že NTHi adheruje ke sliznici prostřednictvím fimbrií.
V souladu s pozorováními u gonokoků a meníngokoků exprimuje NTHi dvojí lidský transferinový receptor složený z TbpA a TbpB, jestliže se kultivuje při limitaci železem. Protilátka anti-TbpB chrání krysí mláďata (Loosmore S. M. a další, 1996, Mol. Microbiol. 19: 575). Pro NTHi byl také popsán receptor hemoglobin/haptoglobin (Maciver I. a další, 1996, Infect. Immun. 64: 3703). Byl také identifikován receptor pro Haem:Hemopexin (Cope L. D. a další, 1994, Mol. Microbiol. 13: 868). U kmenů NTHi je také přítomný receptor pro laktoferin, který však nebyl dosud charakterizován (Schryvers A. B. a další, 1989, J. Med. Microbiol. 29: 121). U kmenů NTHi dosud nebyl popsán protein podobný proteinu FrpB neisserií.
OMP s molekulovou hmotností 80kDa, povrchový antigen D15, poskytuje ochranu proti NTHi v modelu testovacího podání myším (Flack F. S. a další, 1995, Gene 156: 97). Vnější membránový lipoprotein 42kDa, LPD je u různých kmenů Haemophilus influenzae konzervován a indukuje baktericidní protilátky (Akkoyunlu M. a další, 1996. Infect. Immun. 64: 4586). Menší, 98kDa OMP (Kimura A. a další, 1985, Infect. Immun. 47: 253), je podle zjištění ochranný antigen, přičemž tento OMP by mohl být jeden z OMP indukovatelných limitací železem, nebo adhesinů s vyšší molekulovou hmotností, které byly charakterizovány později. H. influenzae poskytuje lgA1proteázovou aktivitu (Mulks Μ. H., Shoberg R. J. 1994. Meth. Enzymol. 235: 543). Proteázy lgA1 bakterie NTHi mají vysoký stupeň antigenní variability (Lomholt H., van Alphen L., Kilián, M. 1993, Infect. Immun. 61:4575).
Bylo ukázáno, že další OMP bakterie NTHi, OMP26, který má molekulovou hmotnost 26 kDa, zvyšuje u krysího modelu vylučování z plic (Kyd, J. M., Cripps, A. W. 1998, Infect. Immun. 66: 2272). Bylo
- 11 • · ·· flfl *fl ·· ·· ♦ · · · · « · · · • ···· fl·· ···· · • · ··· ··· ··· fl flfl flflfl· ·♦ ···· také ukázáno, že protein NTHi HtrA je ochranný antigen. Tento protein samozřejmě chránil činčilu před zánětem středního ucha a chránil krysí mláďata proti bakteremii H. influenzae typu b (Loosmore S. M. a další, 1998, Infect. Immun. 66: 899).
Váčky vnější membrány (neboli blebs) byly izolovány z H. influenzae (Loeb M. R., Zachary A. L., Smith D. H. 1981, J. Bacteriol. 145: 569 - 604; Stulí T. L., Mack K., Haas J. E., Smit J., Smith A. L. 1985, Anal. Biochem. 150: 471 - 480). Tyto váčky byly spojovány s indukcí permeability bariéry mezi krví a mozkem (Wiwpelwey B., Hansen E. J., Scheld W. M. 1989, Infect. Immun. 57: 2559 - 2560), indukcí meningeálního zánětu (Mustafa Μ. M., Ramilo O., Syrogiannopoulos G. A., Olsen K. D,, McCraken G. H. Jr., Hansen, E. J. 1989, J. Infect. Dis. 159: 917 - 922) a příjmem DNA (Concino M. F., Goodgal S. H, 1982, J. Bacteriol. 152: 441 - 450).
Tyto váčky jsou schopny vázat se a být absorbovány epitelem nosní sliznice (Harada T., Shimuzu T., Nishimoto K., Sakakura Y. 1989, Acta Otorhinolarygol. 246: 218 - 221), což ukazuje, že ve váčcích by mohly být přítomny adhesiny a/nebo kolonizační faktory. Imunitní odpověď proti proteinům přítomným ve váčcích vnější membrány byla pozorována u pacientů s různými onemocněními H. influenzae (Sakakura Y., Harada T., Hamaguchi Y., Jin C. S. 1988, Acta Otorhinolarygol. doplněk (Stockh.) 454: 222 - 226; Harada T., Sakakura Y., Miyoshi Y, 1986, Rhinology 24: 61 - 66).
Pseudomonas aeruginosa
Rod Pseudomonas se skládá z gramnegativních, přímých a mírně zakřivených tyčinek s polárními bičíky, které nevytvářejí spory. Z důvodů omezených metabolických požadavků jsou Pseudomonas spp. všudypřítomné, a jsou široce rozšířeny v půdě, vzduchu, odpadní vodě a v rostlinách. Bylo také ukázáno, že četné druhy Pseudomonas, jako je P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia a P.
- 12 0 0 0 0 ·♦ 00 0 · · 0 0
0 0 0 0 · • 000000 0 · • · 0 0 0
000 0 00 0 000 cepacia, jsou patogenní pro člověka. V tomto seznamu je za důležitý lidský patogen považována P. aeruginosa, protože je spojená s příležitostnou infekci hostitelů s oslabenou imunitou, a je odpovědná za vysokou úmrtnost u hospitalizovaných pacientů. Nosokominální infekce P. aeruginosa postihuje primárně pacienty léčené dlouhodobě, kteří dostávají imunosupresivní látky, kortikosteroidy, antimetabolická antibiotika, nebojsou léčeni ozářením.
Pseudomonas, a zvláště P. aeruginosa, produkují řadu toxinů (jako jsou hemolysiny, fibrinolysiny, esterázy, koagulázy, fosfolipázy, endo- a exotoxiny), které přispívají k patogenicitě této bakterie. Navíc mají tyto organismy vlastní vysokou rezistenci na antibiotika v důsledku přítomnosti pump vytlačujících většinu léčiv. Tato vlastnost často komplikuje průběh onemocnění.
V důsledku nekontrolovaného použití antibakteriálních chemoterapeutik během posledních třiceti let podstatně vzrostla frekvence nosokominálních infekcí způsobených P. aeruginosa. V USA je například ekonomický dopad nosokominálních infekcí P. aeruginosa odhadován ročně na 4,5 miliard dolarů. Proto je velmi nutný vývoj vakcíny pro aktivní nebo pasivní imunizaci proti P. aeruginosa (pro přehled viz Stanislavsky a další, 1997, FEMS Microbiol. Lett. 21: 243 277).
Předmětem vývoje vakcín byly různé další s buňkami asociované a sekrenované antigeny P. aeruginosa. Mezi antigeny Pseudomonas bylo zjištěno, že slizovitá látka, která je ve formě extracelulárního hlenu složena převážně z alginátu, je heterogenní z hlediska velikosti a imunogenicity. Alginátové složky s vysokou molekulovou hmotností (30 až 300 kDa) se jeví jako obsahující konzervované epitopy, zatímco alginátové složky s nižší molekulovou hmotností (10 až 30 kDa) obsahují konzervované epitopy navíc k jedinečným epitopům. Mezi proteiny asociovanými s povrchem, PcrV, které jsou součástí sekrečně-translačního aparátu typu III, je také • ·
- 13 44 ·· 44 • · 4 4 · 4 4 4 4
4 · · ·«« 4
444444 4 4 44 · 4
4 4 4 4 4 4
4 44 4444 44 4444 podle zjištění možnost nalézt zajímavý cíl pro vakcinaci (Sawa a další, 1999, Nátuře Medicine 5: 392 - 398).
Antigeny exponované na povrchu včetně O-antigenů (Ospecifický polysacharid LPS) nebo H-antigenů (antigeny bičíků) byly používány pro zjištění sérotypů kvůli jejich vysoce imunogenní povaze. Byly objasněny chemické struktury opakujících se jednotek 0specifických polysacharidů, a tyto údaje dovolily identifikaci 31 chemotypu P. aeruginosa. Konzervované epitopy v rámci všech sérotypů P. aeruginosa jsou umístěny v oligosacharidu jádra a oblasti lipidu A LPS a imunogeny obsahující tyto epitopy indukují u myší zkříženou ochrannou imunitu proti různým imunotypů P. aeruginosa. Vnější jádro LPS je považováno za ligand pro vazbu P. aeruginosa na dýchací cesty a buňky očního epiteiu zvířat. Mezi různými sérotypy však existuje heterogenita v uvedené oblasti vnějšího jádra. Epitopy ve vnitřním jádře jsou vysoce konzervované a bylo ukázáno, že jsou přístupné na povrchu, a nejsou maskovány O-specifickým polysacharidem.
Pro vyšetření ochranných vlastností proteinů OM byla použita vakcína obsahující proteiny OM P. aeruginosa s molekulovými hmotnostmi v rozmezí od 20 do 100 kDa při předklinických a klinických experimentech. Tato vakcína byla ve zvířecích modelech účinná proti testovacímu podání P. aeruginosa a indukovala vysoké hladiny specifických protilátek u lidských dobrovolníků. Plasma lidských dobrovolníků obsahující protilátky proti P. aeruginosa poskytovala pasivní ochranu a napomáhala při zotavení 87 % pacientů s vážnými formami infekce P. aeruginosa. Nedávno bylo ukázáno, že hybridní protein obsahující části proteinů vnější membrány OprF (aminokyseliny 190-342) a Opři (aminokyseliny 21-83) Pseudomonas aeruginosa fúzovaný s glutathion-S-transferázou chrání myši proti 975násobku 50% letální dávky P. aeruginosa (Knapp a další, 1999, Vaccine, 17: 1663 - 1669).
- 14 • · φφ φφ Φ· φφ • · · φ · · · φφφφ • φφφφ φ · φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φφφ φ φφ φφφφ φφ φφφφ
Autoři předkládaného vynálezu zjistili řadu nevýhod v souvislosti s výše uvedenými vakcínami založenými na váčcích standardního typu (buď přirozených nebo chemicky vyrobených).
Jako příklady těchto problémů lze uvést:
přítomnost imunodominantních, ale variabilních proteinů na váčku (blebu) (PorA; TbpB, Opa [/V. meningitidis B]; P2, P5 [netypovatelná H. influenzae]) - tyto váčky jsou účinné pouze proti omezenému výběru bakteriálních druhů. Typová specificita baktericidní odpovědi protilátek může předpokládat použití takových vakcín u dětí;
přítomnost neprotektivních (nerelevantních) antigenů (Rmp, H8,...) na váčku - antigeny, které jsou neužitečnou zátěží pro imunitní systém;
nepřítomnost nebo přítomnost důležitých molekul, které jsou produkovány podmínečně (například proteinů vnější membrány redukovaných železem, IROMP, in vivo regulovaných expresních mechanismů) - tyto podmínky je při produkci váčků obtížné řídit a je tedy obtížné optimalizovat množství antigenu na povrchu;
nízká hladina exprese ochranných (zvláště konzervovaných) antigenů (NspA, P6);
toxicita LPS zbývajících na povrchu váčků;
potenciální indukce autoimunitní odpovědi mezi strukturami identickými s hostitelem (například kapsulární polysacharid u Neisseria meningitidis séroskupiny B, lakto-N-neotetraóza u lipopolysacharidů Neisseria, sacharidová struktura uvnitř LPS NTHi, sacharidové struktury u pilusů).
Tyto problémy mohou zabránit použití vakcín založených na váčcích jako vakcínačních prostředků pro humánní použití. Je tomu tak zvláště při pediatrickém použití (<4 roky), kde je zvláště důležitá « · ·· ·· 4· >4 • 14 ···· · · · ·
- 15 • 4444 · · 4 · 4 · · 4 • · 4 · · · 4 · »·· · ·· ···· ·· 4··· reaktogenicita proti vakcínám založeným na váčcích, a kde vakcíny založené na váčcích (například dříve uváděná vakcína založená na váčcích MenB dodávaná na trh) se ukázaly jako neúčinné při poskytování imunitní ochrany. Předkládaný vynález tedy poskytuje způsoby odstranění výše uvedených problémů použitím bakteriálních kmenů získaných pomocí genetického inženýrství, které vedou ke zlepšeným vakcínám založeným na váčcích (bleb vaccines). Tyto metody budou zvláště použitelné při vytváření nových vakcín proti bakteriálním patogenům, jako je Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, a další.
Vakcíny podle vynálezu, založené na váčcích, jsou navrženy tak, aby se imunitní odpověď soustředila na několik protektivních (s výhodou konzervovaných) antigenů nebo epitopů - formulovaných ve vícesložkové vakcíně. Jestliže jsou tyto antigeny integrální proteiny OMP, jejich správné uspořádání do patřičné konformace zajistí váčky vnější membrány vakcín založených na váčcích. Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro optimalizaci složení vakcín založených na OMV (váčcích) z hlediska OMP a LPS delecí imunodominantní proměnné stejně jako neprotektivních OMP, vytvořením konzervovaných OMP a delecí různých oblastí, regulací ochranných OMP ke zvýšení exprese , a odstraněním řídících mechanismů exprese (jako je omezení způsobené železem) ochranných OMP. Navíc poskytuje vynález snížení toxicity lipidu A modifikací lipidové části, nebo změnou fosforoylového složení při zachování adjuvantní aktivity nebo jejím maskováním. Každá z těchto nových metod a vylepšení sama o sobě zlepšuje vakcínu založenou na váčcích, avšak kombinace jedné nebo více těchto metod působí společně tak, že se získá optimalizovaná uměle vytvořená vakcína založená na váčcích, která má imunologické ochranné vlastnosti a která je netoxická, a tím zvláště vhodná pro pediatrické použití.
- 16 Φ Φ Φ» Φ» ΦΦ »· • · · ΦΦΦΦ φφφφ
ΦΦΦ Φ » Φφφ Φ
ΦΦΦΦΦΦΦ Φ Φ · Φ φ ·
Φ Φ φφφ φφφ
ΦΦΦ Φ ΦΦ *Φ»Φ ΦΦ ΦΦΦΦ
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje prostředek založený na váčcích získaný metodami genetického inženýrství z gramnegativního bakteriálního kmene, který se vyznačuje tím, že uvedený prostředek je získatelný použitím jednoho nebo více způsobů zvolených z následující skupiny:
a) způsob snížení imunodominantních proměnných nebo neprotektivních antigenů u prostředku založeného na váčcích, který zahrnuje kroky zjištění identity takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene pro produkci menšího množství nebo žádného uvedeného antigenu, a vytvoření váčků z tohoto kmene;
b) způsob regulace ke zvýšení exprese (upregulation) ochranných, endogenních (a s výhodou konzervovaných) antigenů OMP v rámci prostředku založeného na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene zavedením silnější promotorové sekvence proti směru transkripce vzhledem ke genu kódujícímu uvedený antigen tak, že tento gen se exprimuje ve vyšší míře, než nemodifikovaný váček, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
c) způsob regulace ke zvýšení exprese podmínečně exprimovaných, ochranných (a s výhodou konzervovaných) antigenů OMP v rámci prostředku zalloženého na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene pro odstranění represivních řídících mechanismů jeho exprese (jako je omezení působením železa) a vytvoření váčků z uvedeného řetězce;
- 17 Φ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ »· • •β φ φ φ φ ···· φ φ φ φ φ · · · * • φφφφ ♦ · φ φφφφ « • φ · φ · φ φ φ «ΦΦ · ΦΦ φφφφ ΦΦ φ·«·
d) způsob modifikace části lipidu A bakteriálního LPS v rámci prostředku založeného na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace genu, které se účastní procesu, který učiní část lipidu A LPS toxickou, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby byla snížena nebo vypnuta exprese uvedeného genu, a vytvoření váčku z uvedeného kmene;
e) způsob modifikace části lipidu A bakteriálního LPS v rámci prostředku založeného na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace genu, který se účastní procesu, který učiní část lipidu A LPS méně toxickou, zkonstruování bakteriálního kmene zavedením silnější promotorové sekvence proti směru transkripce uvedeného genu tak, že tento gen je exprimován s vyšší hladinou než u nemodifikovaného váčku, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
f) způsob snížení toxicity lipidu A v rámci prostředku založeného na váčcích a zvýšení hladin ochranných antigenů, který zahrnuje kroky zkonstruování chromosomu bakteriálního kmene tak, aby obsahoval gen kódující peptid polymyxinu A nebo jeho derivát nebo analog fúzovaný s ochranným antigenem, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
g) způsob vytvoření konzervovaných antigenů OMP na prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenů, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby byly vypuštěny variabilní oblasti genu kódujícího uvedený antigen, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
h) způsob snížení exprese v rámci prostředku založeného na váčcích, antigenů, který sdílí strukturní podobnost s lidskou strukturou a může být schopen indukovat autoimunitní odpověď u lidí (jako je kapsulární polysacharid N.
• 0
0 • 0 meningitidis B), který zahrnuje kroky identifikace genu, který se účastní biosyntézy antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se snížila nebo vypnula exprese uvedeného genu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene; nebo
i) způsob regulace exprese ve smyslu jejího zvýšení ochranných, endogenních (s výhodou konzervovaných) antigenů OMP v rámci prostředku založeného na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby byla do chromosomu zavedena jedna nebo více dalších kopií genu kódujícího uvedený antigen, řízená heterologní, silnější promotorovou sekvencí, a vytvoření váčků z uvedeného kmene.
Další provedení vynálezu zahrnují výhodné způsoby pro získání výše uvedeného prostředku založeného na váčcích, včetně optimálního umístění silných promotorů pro regulaci exprese ve smyslu jejího zvýšení u antigenů v rámci váčků, preferenčních antigenů pro regulaci ve smyslu zvýšení nebo snížení exprese u různých bakteriálních kmenů pro získání prostředků založených na váčcích, které jsou zvláště vhodné pro použití ve vakcínách. Poskytují se také výhodné prostředky obsahují váčky podle vynálezu, které jsou zvláště vhodné pro globální vakcíny proti některým stavům onemocnění. Jako další provedení vynálezu se poskytují vektory pro přípravu váčků podle vynálezu a modifikované bakteriální kmeny, ze kterých se váčky podle vynálezu produkují.
Předkládaný vynález poprvé poskytuje vakcínu založenou na váčcích, která je imunoprotektivní a netoxické při použití u dětí do čtyř let věku.
- 19 Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Reaktivita monoklonální protilátky 735 mAb na různých koloniích
Obr. 2: Reaktivity specifických monoklonálních protilátek zjišťovaná metodou ELISA celých buněk
Obr. 3: Schematické znázornění vektorů pCMK používaných pro dodávání genů, operonů a/nebo expresních kazet do genomu Neisseria meningitidis
Obr. 4: Analýza exprese PorA v celkových proteinových extraktech rekombinantní N. meningitidis séroskupiny B (deriváty H44/76). Celkové proteiny byly izolovány z kmenů cps- (dráhy 3 a 4), cps- porA::pCMK+ (dráhy 2 a 5) a cps- porA::nspA (dráhy 1 a 6) rekombinantní N. meningitidis séroskupiny B a byly analyzovány za podmínek SDS PAGE v 12% polyakrylamidovém gelu. Gely byly barveny Coomassie blue (dráhy 1 až 3) nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a imunologicky barveny monoklonální protilátkou anti-PorA.
Obr. 5: Analýza exprese NspA v proteinových extraktech rekombinantních kmenů N. meningitidis séroskupiny B (deriváty H44/76). Proteiny byly extrahovány z úplných bakterií (dráhy 1 až 3) nebo preparátech váčků vnější membrány (dráhy 4 až 6), odděleny SDS-PAGE na 12% akrylamidovém gelu a analyzovány imunologickým přenosem s použitím polyklonálního séra anti-NspA. Vzorky odpovídající cps- (dráhy 1 a 6), cps- porA::pCMK+ (dráhy 3 a 4) a cpsporA::nspA (dráhy 2 a 5) byly analyzovány. Byly detekovány dvě formy NspA: zralá forma (18 kDa), která migruje spolu s rekombinantním čištěným NspA, a kratší forma (15 kDa).
Obr. 6: Analýza exprese D15/omp85 v proteinových extraktech rekombinantních kmenů N. meningitidis séroskupiny B (deriváty
H44/76). Proteiny byly extrahovány z preparátů váčků vnější
- 20 ·· «· ·· ·· • ·· · · ·· · membrány a byly děleny SDS-PAGE na 12% akrylamidovém gelu a analyzovány imunologickým přenosem použitím polyklonálního séra anti-omp85. Byly analyzovány vzorky odpovídající cps- (dráha 2), a cps-, PorA+, pCMK+Omp85/D15 (dráha 1) rekombinantních kmenů N. meningitidis séroskupiny B.
Obr. 7: Obecná stragtegie pro modulaci genové exprese dodáním promotoru (RS znamená restrikční místo).
Obr. 8: Analýza váčků vnější membrány vytvořených rekombinantními kmeny N. meningitidis séroskupiny B cps- (deriváty H44/76). Proteiny byly extrahovány z preparátů váčků vnější membrány a byly děleny SDS-PAGE za redukčních podmínek na 4 až 20% gradientovém polyakrylamidovém gelu. Gel byl barven Coomassie brilliant blue R250. Dráhy 2, 4, 6 odpovídají 5 pg celkových proteinů, zatáímco na dráhy 3, 5 a 7 bylo naneseno 10 pg proteinů.
Obr. 9: Konstrukce plasmidu s nahraženým promotorem použitého pro regulaci exprese/produkce ke zvýšení exprese Omp85/D15 v Neisseria meningitidis H44/76.
Obr. 10: Analýza exprese OMP85 v úplných proteinových extraktech rekombinantního NmB (deriváty H44/76). Gely byly barveny Coomassie blue (A) nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a imunologicky barveny králičí monoklonální protilátkou anti-OMP85 (N. gono) (B).
Obr. 11: Analýza exprese OMP85 v preparátech OMV rekombinantní NmB (deriváty H44/76). Gely byly barveny Coomassie blue (A) nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a imunologicky barveny králičí polyklonální protilátkou anti-OMP85 (B).
Obr. 12: Schematické znázornění rekombinantní strategie PCR použité pro deleci lacO v chimérním promotoru porA/lacO.
Obr. 13: Analýza exprese Hsf v úplných proteinových extraktech rekombinantní N. meningitidis séroskupiny B (deriváty H44/76).
9· ·· • ♦ · ·
- 21 Celkové proteiny byly izolovány z Cps-PorA+ (dráha 1), a CpsPorA+/Hsf (dráha 2) rekombinantních kmenů N. meningitidis séroskupiny B a byly analyzovány za podmínek SDS-PAGE ve 12% polyakrylamidovém gelu. Gely byly barveny Coomassie blue.
Obr. 14: Analýza exprese GFP v úplných proteinových extraktech rekombinantní N. meningitidis (derivát H44/76). Celkový protein byl izolován z rekombinantních kmenů Cps-, PorA+ (dráha 1), Cps-, PorA- GFP+ (dráhy 2 a 3). Proteiny byly děleny PAGE-SDS na 12% polyakrylamidovém gelu a potom barveny Coomassie blue.
Obr. 15: Znázornění rozložení hlavních proteinů na povrchu různých rekombinantních preparátů váčků při analýze SDS-PAGE (barvení Coomassie).
Obr. 16: Specifická odpověď anti-Hsf pro různé preparáty váčků a rekombinantních váčků použitím čištěného rekombinantního proteinu Hsf.
Obr. 17: Analýza exprese NspA v úplných proteinových extraktech rekombinantní NrriB (deriváty séroskupiny B). Gely byly barveny Coomassie blue (A) nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a imunologicky barveny myší monoklonální protilátkou antiPorA (B) nebo myší polyklonální protilátkou anti-NspA (C).
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález se týká obecného souboru nástrojů a metod schopných využití pro výrobu zlepšených, geneticky zkonstruovaných váčků z gramnegativních bakteriálních kmenů. Vynález zahrnuje způsoby použití pro výrobu rekombinantních váčků, které jsou více imunogenní, méně toxické a bezpečnější pro použití v humánní a/nebo veterinární vakcíně. Předkládaný vynález navíc také popisuje specifické metody nezbytné pro konstrukci, výrobu, získávání a využívání rekombinantních, zkonstruovaných váčků z různých • · • 0 · · 0 0 • · · · · · • · 0 · · 0 · · 0 0 · · • 0 0 · · · «
0 0« 0 000 0 0 00·· terapeutické a/nebo je možno manipulovat působením na expresi
- 22 gramnegativních bakterií, pro vakcínační, diagnostické účely. Způsoby podle vynálezu s biochemickým složením bakteriálních váčků nebo změnu exprese bakteriálních genů kódujících produkty přítomné v nebo asociované s váčky vnější membrány bakterií (proteiny vnější mebrány neboli OMP). Produkce váčků s použitím metody genetické modifikace pro zvýšení, snížení nebo zajištění podmínečnosti exprese jednoho nebo více genů kódujících složky vnější membrány je také zahrnuto v rámci tohoto vynálezu.
Pro jasnost, termín „expresní kazeta“ zde bude označovat všechny genetické prvky nezbytné pro expresi genu nebo operonu a pro produkci a směrování odpovídajícího sledovaného proteinu nebo proteinů do váčků vnější membrány, odvozených z daného bakteriálního hostitele. Nevyčerpávající seznam těchto vlastností zahrnuje řídící prvky (transkripční a/nebo translační), oblasti kódující proteiny a směrovací signály, včetně vhodných mezer mezi nimi. Odkaz na vložení promotorových sekvencí znamená pro účely vynálezu vložení sekvence s alespoň jednou promotorovou funkcí, s výhodou jednou nebo více dalšími genetickými regulačními prvky obsaženými v rámci expresní kazety. Navíc bude termín „integřativní kazeta“ označovat všechny genetické prvky, nezbytné pro integraci segmentu DNA dodaného bakteriálního hostitele. Nevyčerpávající seznam těchto znaků zahrnuje dodávací vehikulum (nebo vektor) s oblastmi poskytujícími rekombinace a markéry umožňující selekci nebo negativní selekci.
Pro účely vyjasnění označují termíny „zkonstruování bakteriálního kmene pro produkci menšího množství uvedeného antigenu“ jakýkoli prostředek pro snížení exprese sledovaného antigenu vzhledem k nemodifikovanému (tj. v přírodě se vyskytujícímu) váčku tak, že exprese je alespoň o 10 % nižší než exprese v nemodifikovaném váčku. S výhodou je exprese alespoň o 50 % nižší. Termín „silnější promotorové sekvence“ označuje regulační řídící
- 23 ··· · »····· « · · « · · prvek, který zvyšuje transkripci genu kódujícího sledovaný antigen. Termín „regulace exprese ke zvýšení exprese“ (upregulation) označuje jakýkoli prostředek pro zvýšení exprese sledovaného antigenu vzhledem k nemodifikovanému (tj. v přírodě se vyskytujícímu) váčku. Je třeba rozumět, že míra „regulace ke zvýšení exprese “ se bude lišit v závislosti na konkrétním sledovaném antigenu, ale nepřevýší míru, která rozbije integritu membrány váčku. Regulace ke zvýšení exprese antigenu označuje expresi, která je alespoň o 10 % vyšší než exprese nemodifikovaného váčku. S výhodou je tato exprese vyšší o alespoň 50 %, výhodněji je alespoň o 100 % (dvojnásobně) vyšší.
Provedení vynálezu se týkají jednotlivých způsobů výroby zlepšených zkonstruovaných váčků, kombinace těchto způsobů a prostředků s obsahem váčků vyrobených jako výsledek těchto způsobů. Další provedení vynálezu se týká genetických nástrojů použitých s cílem geneticky modifikovat zvolený bakteriální kmen, aby bylo možno z tohoto kmene extrahovat zlepšené zkonstruované váčky.
Konstrukční kroky způsobu podle vynálezu mohou být prováděny řadou způsobů známých odborníkům v oboru. Například sekvence (například promotory nebo otevřené čtecí rámce) mohou být vloženy, a promotory/geny mohou být přerušeny technikou vložení transposonu. Například regulace exprese genu ke zvýšení exprese může být dosaženo vložením silného promotoru přes transposon o velikosti až 2 kb proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu genu (výhodněji 200 až 600 bp proti směru transkripce, nejvýhodněji přibližně 400 bp proti směru transkripce (upstream)). Může být také použita bodová mutace a/nebo delece (zvláště pro expresi genu se sníženou intenzitou).
Tyto metody však mohou být poměrně nestabilní nebo nejisté, a proto je výhodné, jestliže se konstrukční krok (zejména pro způsoby
a), b), c), d), e), h) a i) popsané výše) provádí přes homologní rekombinaci. S výhodou probíhá tento děj mezi sekvencí • 0
- 24 00 00 00 0 0000 0000 00 00 000 0 00000« 0 · · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 00 0000 0· 0000 (rekombinogenní oblast) alespoň 30 nukleotidů na bakteriálním chromosomu a sekvencí (druhá rekombinogenní oblast) alespoň 30 nukleotidů na vektoru transformovaném do tohoto řetězce. Oblasti mají s výhodou velikost 40 až 1000 nukleotidů, výhodněji 100 až 800 nukleotidů, nejvýhodněji 500 nukleotidů. Tyto rekombinogenní oblasti by měly být dostatečně podobné v tom, že jsou schopny vzájemně hybridizovat za vysoce stringentních podmínek (jak bude definováno později).
Rekombinační děje mohou probíhat použitím jediné rekombinogenní oblasti na chromosomu a vektoru, nebo přes dvojitý děj typu crossing-over (s dvěma oblastmi na chromosomu a vektorem). Pro provedení dvojitého rekombinančního děje by měla být vektorem kruhová nebo přímá molekula DNA (viz obr. 7). Výhodné je, jestliže se používá dvojitý rekombinační děj a použitý vektor je přímý, protože takto modifikovaná bakterie bude stabilnější z hlediska reverzních dějů. S výhodou mají dvě rekombinogenní oblasti na chromosomu (a jedna na vektoru) podobnou (nejvýhodněji stejnou) délku, aby byl podporován dvojitý proces crossing-over. Dvojitý crossing-over funguje tak, že rekombinují dvě rekombinogenní oblasti na chromosomu (oddělené nukleotidovou sekvencí „X“) a dvě rekombinogenní oblasti na vektoru (oddělené nukleotidovou sekvencí „Y“) za získání nezměněného chromosomu s tím rozdílem, že byly zaměněny oblasti X a Y. Poloha rekombinogenních oblastí může být umístěna jak proti směru transkripce, tak i po směru transkripce, nebo může obklopovat sledovaný otevřený čtecí rámec. Tyto oblasti se mohou skládat z kódujících, nekódujících, nebo směsi kódujících a nekódujících sekvencí. Identita X a Y bude záviset na požadovaném účinku. X může být celý nebo část otevřeného čtecího rámce a Y nemusí obsahovat žádné nukleotidy, což by vedlo k deleci sekvence X z chromosomu. Alternativně Y může být oblast silného promotoru pro vložení proti směru transkripce otevřeného čtecího rámce, a proto oblast X nemusí obsahovat žádné nukleotidy.
• · * ·
- 25 • 1 • · • · • · « ♦ ·
Vhodné vektory se budou lišit svým složením v závislosti na tom, jaký rekombinantní děj se má provádět, a jaký je konečný účel rekombinačního děje. Integrativní vektory používané pro dodávání oblasti Y mohou být podmínečně replikativní nebo „suicide“ plasmidy, bakteriofágy, transposony nebo přímé fragmenty DNA získané restrikční hydrolýzou nebo amplifikací PCR. Selekce rekombinantního děje se provádí pomocí selektovatelného genetického markéru, jako jsou geny propůjčující rezistenci na antibiotika (například kanamycin, erythromycín, chloramfenikol nebo gentamycin), geny propůjčující rezistenci na těžké kovy a/nebo toxické sloučeniny nebo geny kompenzující auxotrofní mutace (například pur, leu, met, aro).
Způsob a) a f) - Regulace snižující expresi/odstranění variabilních a neprotektivních imunodominantních antigenů
Mnoho povrchových antigenů je mezi bakteriálními kmeny variabilních a jako důsledek poskytují ochranu proti pouze omezenému souboru blízce příbuzných kmenů. Jedno provedení tohoto vynálezu zahrnuje snížení exprese, nebo s výhodou odstranění genu nebo genů kódujících variabilní povrchový protein nebo proteiny, což vede k vytvoření bakteriálního kmene produkujícího váčky, které při podání ve vakcíně mají silnější schopnost zkřížené reaktivity proti různým kmenům v důsledku vyššího vlivu konzervovaných proteinů (které se na vnějších membránách zachovaly) na imunitní systém vakcínovaného pacienta. Příklady těchto variabilních antigenů zahrnují: pro Neisseria - pilusy (PilC), které podléhají antigenním variacím, PorA, Opa, TbpB, FrpB; pro H. influenzae - P2, P5, pilin, lgA1-proteáza; a pro Moraxella - CopB, OMP106.
Další typy genů, které by mohly být regulovány ke snížení exprese nebo vyphnuty, jsou geny, které může bakterie in vivo snadno zapnout (exprimovat) nebo vypnout. Protože proteiny vnější membrány kódované těmito geny nejsou vždy na bakterii přítomny, přítomnost
44 44
4 4 4 4 4 4
- 26 • 4 • 4 4
4 4
4 4 4 4 * 4
4 4 4
4 · 4 4 4
4 4 4 4
4444 44 4444 těchto proteinů v prostředcích založených na váčcích může být také škodlivá pro účinnost vakcíny z výše uvedených důvodů. Výhodný příklad pro regulaci ke snížení exprese nebo deleci je protein Neisseria Ope. Imunita anti-Opc indukovaná vakcínou založenou na váčcích obsahující Ope by měla pouze omezenou ochrannou schopnost, protože infekční organismus by se snadno stal Ope'. Další příklady takových proteinů jsou proteiny H. influenzae HgpA a HgpB.
Při procesu a) se reguluje exprese neprotektivních genů ve smyslu snížení exprese, nebo se tyto geny nakonec vypnou. To má výše uvedenou překvapivou výhodu v tom, že se imunitní systém soustředí na lepší antigeny, které jsou přítomny na vnějším povrchu váčků v nižších množstvích.
Kmen může být zkonstruován tímto způsobem pomocí celé řady strategií včetně vložení transposonu nebo rozbití kódující oblasti promotorové oblasti genu, nebo bodovými mutacemi nebo delecemi pro dosažení podobného výsledku. Pro odstraněni (deleci) genu z chromosomu může být také použita homologní rekombinace (kde sekvence X obsahuje část (s výhodou veškerou) kódující sekvenci sledovaného genu). Homologní rekombinace může být navíc použita pro změnu silnějšího promotoru genu za slabší (nebo žádný) promotor (jestliže nukleotidová sekvence X obsahuje část (s výhodou veškerou) promotorovou oblast genu, a nukleotidová sekvence Y obsahuje buď slabší promotorovou oblast (což vede ke snížení exprese sledovaného genu nebo genů/operonu nebo operonů) nebo žádnou promotorovou oblast). V tomto případě je výhodné, aby se rekombinační děj prováděl uvnitř oblasti chromosomu 1000 bp proti směru transkripce sledovaného genu.
Y může alternativně propůjčit podmínečnou transkripční aktivitu, která vede k podmínečné expresi sledovaného genu nebo genů/operonu nebo operonů (regulace ve smyslu snížení exprese).
- 27 • 9 ·· 44 44 ♦· ··· 4 4·· «···
4444 »44 · 44 4 4
4 «44 444
444 4 ·· ···· ·* 4444
Tohoto způsobu se využívá při expresi molekul, které jsou toxické pro bakteriálního hostitele nebo jím nejsou dobře podporovány.
Většina z výše uvedených proteinů jsou integrální OMP a jejich variabilita může být omezena pouze na několik jejich smyček exponovaných na povrchu. Další provedení vynálezu (způsob g)) pokrývá deleci oblastí DNA kódujících tyto smyčky exponované na povrchu, což vede k expresi integrálního OMP obsahujícího konzervované smyčky exponované na povrchu. Smyčky exponované na povrchu bakterií H. influenzae P2 a P5 jsou výhodnými příklady proteinů, které by mohly být touto metodou transformovány do křížově reaktivních antigenů.
I zde platí, že výhodným způsobem provádění tohoto konstrukčního procesu je homologní rekombinace.
Způsob b) - Dodání promotoru a modulace
Další provedení vynálezu se týká modifikace prostředku založeného na váčcích změnou regulační oblasti in šitu řídící expresi genu nebo genů a/nebo operonu nebo operonů, o které jde. Tato změna může zahrnovat částečnou nebo úplnou náhradu endogenního promotoru řídícího expresi sledovaného genu za promotor poskytující určitou transkripční aktivitu. Tato odlišná transkripční aktivita může být propůjčena variantami (bodovými mutacemi, delecemi a/nebo inzercemi) endogenních řídících oblastí, přirozeně se vyskytujícími nebo modifikovanými heterologními promotory nebo kombinací obou. Tyto změny obvykle poskytnou silnější transkripční aktivitu než je endogenní aktivita (zavedení silného promotoru), což vede ke zvýšené expresi genu nebo genů/operonu nebo operonů, které jsou sledovány (regulace ke zvýšení exprese ). Takový způsob je zvláště použitelný pro zvýšení produkce imunologicky relevantních složek váčků, jako jsou proteiny vnější membrány a lipoproteiny (často konzervované proteiny OMP, obvykle přítomné ve váčcích v nižších koncentracích).
• fc fcfc • ·
- 28 fc · • fc · • fcfcfcfc « · • fcfc fc • fcfc • fcfc • · fcfcfcfc fcfcfc • fcfc fcfc fcfcfc
Typické silné promotory, které mohou být integrovány do bakterie Neissería, jsou porA [SEQ ID NO: 24], porB [SEQ ID NO: 26], IgtF, Opa, p110, Ist, a hpuAB. Jako konstitutivní, silné promotory jsou výhodné PorA a PorB. Bylo zjištěno (příklad 9), že aktivita promotoru PorB je obsažena ve fragmentu odpovídajícím nukleotidům -1 až -250 proti směru transkripce iniciačního kodonu porB. V bakteriích Moraxella je výhodné používat promotory ompH, ompG, ompE, OmpB1, ompB2, ompA, OMPCD a Omp106, a v H. influenzae je výhodné integrovat promotory P2, P4, P1, P5 a P6.
S použitím výhodné technologie homologních rekombinací typu dvojitý crossing-over pro zavedení promotoru do oblasti 1000 bp proti směru transkripce mohou být promotory vloženy pro dosažení řízení ke zvýšení exprese kamkoli proti směru transkripce od 30 až 970 bp vzhledem k iniciačnímu kodonu genu. Ačkoli se běžně uvádí, že promotorově oblast by měla být relativně blízko k otevřenému čtecímu rámci pro dosažení optimální exprese genu, autoři předkládaného vynálezu překvapivě zjistili, že umístění promotoru dále od iniciačního kodonu vede k velkému zvýšení úrovně exprese. Je tedy výhodné, jestliže je promotor vložen do vzdálenosti 200 až 600 bp od iniciačního kodonu genu, výhodněji 300 až 500 bp, a nejvýhodněji přibližně 400 bp od iniciačního kodonu ATG.
Způsob c) - Složky váčků produkované podmínečně
Exprese některých genů kódujících určité složky váčků je pečlivě řízena. Produkce těchto složek je podmínečně modulována a závisí na různých metabolických signálech a/nebo signálech okolního prostředí. Mezi tyto signály patří například limitace železem, modulace redoxního potenciálu, změny pH a teploty a změny výživy. Některé příklady složek váčků, o kterých je známo, že jsou produkovány podmínečně, zahrnují proteiny vnější membrány regulované železem, bakterií Neissería a Moraxella (například TbpB, LbpB), a substrátem φ φ φ φ
-29 • φ φ φ φ φ φ
ΦΦΦ 9 ΦΦΦ
ΦΦ ΦΦΦΦ
ΦΦ ♦ Φ « Φ
Φ ♦ ·
ΦΦΦ • Φ Φ
Φ Φ ΦΦΦΦ indukovatelné poriny vnější membrány. Předkládaný vynález zahrnuje použití genetických metod popisovaných výše (způsob a) nebo b)), pro zajištění konstitutivní exprese těchto molekul. V tomto případě je možno předejít vlivu signálů okolního prostředí na expresi sledovaného genu nebo genů modifikací/náhradou odpovídající řídící oblasti genu tak, že se stane aktivní konstitutivně (například deleci části (s výhodou veškeré) sekvence odpovídající za represivní kontrolu - například oblasti operátoru), nebo vložením konstitutivního silného promotoru. Pro geny regulované železem může být odstraněn operátor fur. Alternativně může být použit způsob i) pro dodání další kopie sledovaného genu/operonu do chromosomu, který je uměle vložen do oblasti spadající pod řízení konstitutivního promotoru.
Způsoby d) a e) - Detoxifikace LPS
Toxicita vakcín založených na váčcích představuje jeden z největších problémů při použití váčků ve vakcínách. Další provedení vynálezu se týká způsobů genetické detoxifikace LPS přítomných ve váčcích. Primární složkou LPS, odpovědnou za aktivaci buněk, je lipid A. Mnoho mutací v genech, které se účastní této biochemické cesty, vedlo k esenciálním fenotypům. Mutace genů odpovědných za konečné kroky modifikace však vedly k teplotně senzitivním (htrB) nebo permisivním (msbB) fenotypům. Mutace vedoucí ke snížené (nebo žádné) expresi těchto genů vedou ke změněné toxické aktivitě lipidu A. Nelauroylovaný (mutant htrB) nebo nemyristoylovaný (mutant msbB) lipid A jsou ovšem méně toxické než lipid A standardního typu. Mutace kódující gen lipid A 4’-kinázy (IpxK) rovněž snižuje toxickou aktivitu lipidu A.
Způsob d) tedy zahrnuje bud deleci části (nebo s výhodou veškerého) jednoho nebo více z výše uvedených čtecích rámců nebo promotorů. Alternativně by mohly být promotory nahrazeny slabšími promotory. Pro provádění těchto postupů se s výhodou používají výše • 0 00 00 00 00
0 0 · ♦ * · *000 000 00 · 00 ·
000000· 0 · 00 · 0
- · * 000 00· OU “ 000 0 00 000· ·? 0000 popsané techniky homologní rekombinace. K tomuto účelu se navíc poskytují sekvence htrB a msbB genů Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis a Haemophilus influenzae.
Toxická aktivita LPS by mohla být také změněna zavedením mutací v genech/místech, které se účastní rezistence na polymyxin B (bylo zjištěno, že tato rezistence koreluje s přidáním aminoarabinózy na 4’-fosfát lipidu A). Tyto geny/místa by mohly být pmrE, který kóduje UDP-glukózadehydrogenázu, nebo oblast genů pro rezistenci na antibakteriální peptidy společná mnoha enterobakteriím, které by se mohly účastnit při syntéze a přenosu aminoarabinózy. Gen pmrF, který je v této oblasti přítomen, kóduje dolikol-fosfátmanosyltransferázu (Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998, Mol. Microbiol. 27: 1171 - 1182).
Mutace v regulačním systému PhoP-PhoQ, což je dvojsložkový regulační systém s přenosem fosforu (konstitutivní fenotyp PhoP, PhoPc), nebo kultivační podmínky s nízkým obsahem iontů Mg++ (které aktivují regulační systém PhoP-PhoQ) vedly k přidání aminoarabinózy na 4’-fosfát a náhradě myristátu 2-hydroxymyristátem (hydroxylace myristátu). Takto modifikovaný lipid A má sníženou schopnost stimulovat expresi E-selektinu lidskými endoteliálními buňkami a sekreci TNF-α lidskými monocyty.
Způsob e) zahrnuje regulaci těchto genů ke zvýšení exprese s využitím výše popsané strategie (zahrnují silných promotorů, s výhodou se postup provádí s použitím technik homologní rekombinace).
Alternativně by mohl být namísto provádění takovýchto mutací jako kmen pro produkci vakcín použit kmen rezistentní na polymyxin B (spolu s jedním nebo více dalšími způsoby podle vynálezu), protože váčky z těchto kmenů mají rovněž sníženou toxicitu LPS (například jak je ukázáno pro menigokok - van der Ley, P., Hamstra, H. J., Kramer,
M., Steeghs, L., Petrov, A. a Poolman, J. T. 1994, v: Proceedings of
44
4 4 4
4 4 • 44 4
4 4
4444
- 31 • · ···
4* ·4 • 4 4 ·
4 4
4 4
4 4 ·· 4444 the ninth International pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, England).
Jako další alternativa (a další provedení vynálezu) poskytují autoři vynálezu způsob detoxifikace gramnegativního bakteriálního kmene, který zahrnuje krok kultivace kmene v růstovém médiu obsahujícím 0,1 mg až 100 g aminoarabinózy na litr média.
Jako ještě další alternativa mohou být přidány k prostředku založenému na váčcích syntetické peptidy, které napodobují vazebnou aktivitu polymyxinu B (popsáno níže), aby se dosáhlo snížení toxické aktivity LPS (Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. a Porro M., 1993, Science 259: 361 - 365; Velucchi, M., Rustici, A., Meazza, C., Vilia, P., Ghezzi, P. a Porro, M., 1997, J. Endotox. Res. 4:).
Způsob f) - Zakotvení homologních nebo heterologních proteinů do váčků vnější membrány při snížení toxicity LPS
Další provedení předkládaného vynálezu zahrnuje použití genetických sekvencí kódujících peptidy polymyxinu B (nebo jeho analogy) jako prostředky pro směrování fúzních proteinů k vnější membráně. Polymyxin B je cyklický peptid složený z aminokyselin nekódovaných tRNA (produkovaný grampozitivními aktinomycetami), který se velmi silně váže na část lipidu A LPS přítomného ve vnější membráně. Tato vazba snižuje vlastní toxicitu LPS (endotoxinová aktivita). Peptidy napodobující strukturu polymyxinu B a složené z kanonických (kódovaných tRNA) aminokyselin byly vyvinuty a vážou se také se silnou aktivitou na lipid A. Tyto peptidy se používají pro detoxifikaci LPS. Bylo zjištěno, že jeden z těchto peptidů známý jako SAEP-2 (N-konec-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-Ckonec) je z tohoto hlediska velmi slibný (Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site by synthetic peptides, 1993), φ φ φ* Φφ φφ φφ φφφ φφφφ φφφφ φφφ φφ φφφ · φ φφφφ φφφ φ'φφ φ οη · ♦ φφφ φφφ
Rustici, A., Velucchi, Μ., Faggioni, R., Sironi, Μ., Ghezzi, Ρ., Quataert,
S., Green, B. a M. Porro, Science 259, 361 - 365).
Způsob f) podle vynálezu poskytuje zlepšení tohoto použití. Bylo zjištěno, že použití sekvencí DNA kódujících peptid SEAP-2 (nebo jeho deriváty), fúzovaný geneticky ke sledovanému genu (kódující například T-buněčný antigen nebo ochranný antigen, který je obvykle sekrenován jako je toxin, nebo cytosolový nebo periplasmatický protein) je prostředek pro směrování odpovídajícího rekombinantního proteinu do vnější membrány výhodného bakteriálního hostitele (přičemž současně snižuje toxicitu LPS).
Tento systém je vhodný pro labilní proteiny, které by nebyly přímo vystaveny na vnější straně váčků. Váček by proto sloužil jako dodávací vehikulum, které by vystavilo protein imunitnímu systému, jakmile by váčky byly obklopeny T-buňkami. Alternativně by genetická fúze měla také obsahovat signální peptid nebo transmembránovou doménu tak, že rekombinantní protein by mohl procházet vnější membránou pro expozici imunitnímu systému hostitele.
Tato strategie směrování (targeting) by mohla být zvláště zajímavá v případě genů kódujících proteiny, které jsou normálně směrovány do vnější membrány. Tato metodologie také umožňuje izolaci rekombinantních váčků obohacených na sledovaný protein.
S výhodou takový signál směrující peptid umožňuje obohacení váčků vnější membrány na jeden nebo několik zajímavých proteinů, které se obvykle v dané subcelulární lokalizaci nenalézají. Nevyčerpávající seznam bakterií, které mohou být použity jako příjemci - hostitelé takovéto produkce rekombinantních váčků zahrnují Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis a Chlamydia pneumoniae.
I když je výhodné, aby byl gen konstruktu konstrukčně zahrnut do chromosomu bakterie (použitím způsobu i), v alternativním «0 00 ·♦ *· 00
0 0 0 0 0 0 0 00 000 00 0 00 0
0000000 0 * «0 0 0 οο 0«·00 «00
- jo - 000 0 00 0000 00 0000 výhodném provedení je možno vyrábět rekombinantní proteiny označené SAEP-2 nezávisle a navázat je k prostředku založenému na váčcích v pozdějším stupni.
Další provedení je použití těchto konstruktů při způsobu čištění proteinu. Tento systém by mohl být použit jako součást expresního systému pro produkci rekombinantních proteinů obecně. Peptidová značka SAEP-2 může být použita pro afinitní čištění proteinu, na kterém je navázána, použitím kolony obsahující imobilizované molekuly lipidu A.
Způsob h) - Polysacharidy s křížovou reaktivitou
Izolace váčků bakteriální vnější membrány ze zapouzdřených gramnegativních bakterií často vede ke společnému čištění polysacharidu obalu. V některých případech může být tento „kontaminující“ materiál užitečný, protože polysacharid může zesilovat imunitní odpověď vyvolanou jinými složkami váčku. V jiných případech však může být přítomnost kontaminujícího polysacharidového materiálu v prostředcích založených na váčcích škodlivá pro použití váčků ve vakcíně. Bylo například ukázáno v alespoň jednom případě
N. meningitidis, že polysacharid pouzdra séroskupiny B neposkytuje ochrannou imunitu a má sklon indukovat nepříznivou autoimunitní odpověď u lidí. Způsob h) podle vynálezu tedy provádí konstrukci bakteriálního kmene pro produkci váčků tak, že neobsahuje polysacharid pouzdra. Váčky potom budou vhodné pro použití u lidí. Zvláště výhodný příklad takového prostředku založeného na váčcích je prostředek z N. meningitidis séroskupiny B zbavený polysacharidu pouzdra.
Toho je možno dosáhnout použitím modifikovaných kmenů produkujících váčky, ve kterých byly vyřazeny geny nezbytné pro biosyntézu a/nebo export obalu. Inaktivace genu kódujícího biosyntézu nebo export obalového polysacharidu může být dosažena mutací • φ ····
- 34 ΦΦ ·Φ φ · φ · φ φ φ
ΦΦΦ · ΦΦΦ
ΦΦ φφφφ «φ ΦΦ * φ φ φ φ « ·
ΦΦΦ ΦΦΦ
ΦΦ φφφφ (bodová mutace, delece nebo inzerce) buď kontrolní oblasti, kódující oblasti nebo obou (s výhodou použitím výše popsaných technik homologní rekombinace). Navíc může být inaktivace genů pro biosyntézu obalu dosažena také nadměrnou expresí antikódující molekuly nebo transposonovou mutagenezí. Výhodný způsob je vyjmutí některého nebo všech genů cps a Neisseria meningitidis nezbytných pro biosyntézu a export polysacharidu. K tomuto účelu může být použit náhradní plasmid pMF121 (popsaný ve Frosh a další, 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215 - 1218) pro dodání mutace, která způsobí delecí shluku genů cpsCAD (+ galE). Alternativně by mohl být vypuštěn gen siaD, nebo by mohla být snížena jeho exprese (meningokokový gen siaD kóduje alfa-2,3-sialyltransferázu, což je enzym nutný pro syntézu obalového polysacharidu a LOS). Tyto mutace mohou také odstranit struktury podobné hostitelským na sacharidové části LPS bakterie.
Způsob i) - dodání jedné nebo více dalších kopií genu a/nebo operonu do hostitelského chromosomu, nebo dodání heterologního genu a/nebo operonu do hostitelského chromosomu
Účinná strategie pro modulaci složení prostředku založeného na váčcích je dodání jedné nebo více kopií segmentu DNA obsahujícího expresní kazetu do genomu gramnegativní bakterie. Nevyčerpávající seznam výhodných druhů bakterií, které by mohly být použity jako příjemci takové kazety, zahrnuje Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Gen nebo geny obsažené v expresní kážete mohou být homologní (nebo endogenní) (tj. existují přirozeně v genomu manipulované bakterie) nebo heterologní (tj. přirozeně se v genomu manipulované bakterie nevyskytují). Znovu zavedená expresní kazeta se může skládat z nemodifikovaných, „přírodních“ sekvencí
• 4 4 4 ·* • • 94 4 4 49 4 • 4 4 4 4
4 9 444 • 4 • 4 4 9 • •
• 4 • • • • • 4
44 · ♦ * 4444 ·· • 444
promotor/gen/operon, nebo zkonstruovaných expresních kazet, ve kterých byla změněna promotorové oblast a/nebo kódující oblast nebo obě tyto oblasti. Nevyčerpávající seznam výhodných promotorů, které by mohly být použity pro expresi, zahrnuje promotory porA, porB, IbpB, tbpB, p110, Ist, hpuAB z N. meningitidis nebo N. gonorroheae, promotory p2, p5, p4, ompF, pl, ompH, p6, hin47 z H. influenzae, promotory ompH, ompG, ompCD, ompE, ompB1, ompB2, ompA z M. catarrhalis, promotor λρΙ_, lac, tac, araB z Escherichia coli nebo promotory specificky rozpoznávané RNA polymerázou bakteriofágů, jako je bakteriofát T7 E. coli. Nevyčerpávající seznam výhodných genů, které by mohly být v takovém systému exprimovány, zahrnuje Neisseria NspA, Omp85, PilQ, TbpA/B komplex, Hsf, PldA, HasR; Chlamydia MOMP, HMWP; Moraxella OMP106, HasR, PilQ, OMP85, PldA; Bordetella pertussis FHA, PRN, PT.
Ve výhodném provedení vynalezu je expresní kazeta dodaná a integrovaná do bakteriálního chromosomu pomocí homologní a/nebo místně specifické rekombinace. Integrační vektory použité pro dodání těchto genů a/nebo operonů mohou být podmínečně replikativní nebo „suicide“ plasmidy, bakteriofágy, transposony nebo fragmenty přímé DNA získané restrikční hydrolýzou nebo amplifikací PCR. Integrace se s výhodou směruje do chromosomálních oblastí postradatelných pro růst in vitro. Nevyčerpávající seznam výhodných míst, která mohou být použita pro směrování integrace DNA, zahrnují geny porA, porB, opa, ope, rmp, omp26, lecA, eps, IgtB Neisseria meningitidis a Neisseria gonorrhoeae, geny P1, P5, hmw1/2, IgA protézy, fimE z NTHi; geny lecA1, lecA2, omp106, uspA1, uspA2 Moraxella catarrhalis. Expresní kazeta použitá pro modulaci exprese složky nebo složek váčků může být alternativně do zvolené bakterie dodána pomocí episomálních vektorů, jako jsou kruhové/přímé replikativní plasmidy, kosmidy, fágmidy, lysogenní bakteriofágy nebo bakteriální umělé chromosomy. Selekce rekombinační události může být provedena pomocí genetického markéru umožňujícího selekci, jako jsou geny propůjčující
- 36 • « ·· Afl ♦· flfl • fl fl · A Α · * A « · • AflAA · · · A A A · · • fl flflfl flflfl • flfl · ·· flfl·· flfl ···· rezistenci na antibiotika (například kanamycin, erythromycin, chloramfenikol nebo gentamycin), geny propůjčující rezistenci na těžké kovy a/nebo toxické sloučeniny, nebo geny kompenzující auxotrofní mutace (například pur, leu, met, aró).
Heterologní geny - exprese cizích proteinů ve váčcích vnější membrány
Váčky vnější membrány bakterií představují velmi přitažlivý systém pro produkci, izolaci a dodávání rekombinantních proteinů pro vakcíny, terapeutická a/nebo diagnostická použití. Další provedení tohoto vynálezu se týká exprese, produkce a směrování cizích, heterologních proteinů do vnější membrány, a použití bakterií pro produkci rekombinantních váčků.
Výhodný způsob pro dosažení tohoto cíle je způsob zahrnující následující kroky: zahrnutí heterologního genu, popřípadě řízeného silnou promotorovou sekvencí, do chromosomu gramnegativního kmene homologní rekombinací. Z výsledného modifikovaného kmene mohou být vyrobeny váčky.
Nevyčerpávající seznam bakterií, které mohou být použity jako příjemci - hostitelé pro produkci rekombinantních váčků, zahrnuje Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Gen exprimovaný v takovém systému může být virového, bakteriálního, houbového nebo parazitického původu, nebo může pocházet z eukaryotického organismu.
Výhodné použití vynálezu zahrnuje způsob exprese proteinů vnější membrány Moraxella, Haemophilus a/nebo Pseudomonas (integrálních, polytopických a/nebo lipoproteinů) v rekombinantních váčcích Neisseria meningitidis. Výhodná místa integrace jsou uvedena
- 37 9 9 99 ·· *· «9
9 9999 9 9 9 9
9999 999 9 · 9 9 9
9 999 999 • 99 9 99 9999 99 9999 výše a geny, které mohou být s výhodou zaváděny, jsou geny poskytující ochranu proti bakterii, ze které byly izolovány. Výhodné ochranné geny pro každou bakterii se popisují dále.
Další výhodná použití jsou: váčky vyrobené z modifikovaného kmene Haemophilus influenzae, kde heterologní kmen je ochranný OMP z Moraxella catarrhalis', a váčky vyrobené z modifikovaného kmene Moraxella catarrhalis, kde heterologní gen je ochranný OMP z Haemophilus influenzae (výhodná místa pro vložení genu jsou uvedena výše a výhodné ochranné antigeny se popisují dále).
Zvláště výhodné použití tohoto provedení je v oblasti prevence nebo léčení sexuálně přenášených nemocí (STDs, sexuallytransmitted diseases). Pro praktické lékaře je často obtížné zjistit, zda je hlavní příčinou STD infekce gonokokem nebo Chlamydia trachomatis. Tyto dva organismy jsou hlavní příčinou salpingitidy onemocnění, které může vést ke sterilitě hostitele. Bylo by proto vhodné, pokud by mohla být prováděna vakcínace nebo léčení STD kombinovanou vakcínou účinnou proti onemocnění způsobenému oběma organismy. Bylo ukázáno, že cílem ochranných protilátek je hlavní protein vnější membrány (major outer membrane protein, MOMP) C. trachomatis. Pro indukci těchto protilátek je však důležitá strukturní integrita tohoto integrálního membránového proteinu. Navíc jsou epitopy rozpoznávané těmito protilátkami variabilní a definují více než deset sérologických variant. Výše popsané provedení předkládaného vynálezu umožňuje uspořádání jednoho nebo více membránových proteinů v rámci prostředku založeného na váčcích vnější membrány do správné konformace. Zkonstruování gonokokového kmene exprimujícího větší počet sérologických variant MOMP C. trachomatis ve vnější membráně a produkce váčků tímto kmenem poskytne jediné řešení pro více problémů se správným uspořádáním membránových proteinů, předkládání dostatečného počtu sérologických variant MOMP pro ochranu proti širokému spektru sérologických variant a současnou prevencí/léčením gonokokové
- 38 • 0 «0 0» *· ·· • 00 0 00« .0000
0000000 0 0 00 0 ·
0 *00 000 000 0 00 0000 00 0000 infekce (důsledkem je, že ošetřující lékař nemusí na počátku rozhodnout, který organismus je příčinou konkrétních klinických příznaků - proti oběma organismům se může vakcínovat současně, což umožňuje léčení STD ve velmi časném stadiu). Výhodná místa pro vložení genů do gonokokového chromosomu se uvádějí výše. Další výhodné geny s ochrannými účinky proti C. trachomatis, které by mohly být rovněž zahrnuty, jsou HMWP, PmpG a proteiny OMP popisované ve WO 99/28475.
Směrování heterologních proteinů
Exprese některých heterologních proteinů v bakteriálních váčcích může vyžadovat přídavek směrovacího signálu nebo signálů vnější membrány. Výhodný způsob pro vyřešení tohoto problému je vytvoření genetické fúze mezi heterologním genem a genem kódujícím přítomný OMP, jako specifický přístup ke směrování rekombinantních proteinů do váčků. Nejvýhodnější je, pokud je heterologní gen fúzován k signálním peptidovým sekvencím, jako je OMP.
Prostředky založené na váčcích neisserií
Pro regulaci ke zvýšení exprese prostřednictvím způsobů b) a/nebo i) je výhodný jeden nebo více následujících genů (kódujících ochranné antigeny), jestliže se způsoby provádějí na kmenu neisserií, včetně gonokoku a meningokoku (zvláště N. meningitidis B): NspA (WO 96/29412), Hsf-like (WO 99/31132), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA (US 5,912,336), TbpB, FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP98/05117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), Iipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2 (WO 99/57280), MltA (WO 99/57280), a ctrA
a · • 4 0« 0 9 ·» • 0 • 0 • 0 0 0
0
0 ··»· 0 0 0 0 0 • • 0
« · • 0 0 0 00 • 0 ·«·· • 00 0 0 0 0 0 0
(PCT/EPOO/00135). Ty jsou také výhodné jako geny, které mohou být heterologně zavedeny do jiných gramnegativních bakterií.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem a) je vhodný jeden nebo více následujících genů: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa a Ope.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem d) je výhodný jeden nebo více z následujících genů: htrB, msbB a IpxK.
Pro regulaci ke zvýšení exprese způsobem e) je výhodný jeden nebo více z následujících genů: pmrA, pmrB, pmrE a pmrF.
Výhodné represivní kontrolní sekvence pro způsob c) jsou: operátorová oblast fur (konkrétně pro jeden nebo oba geny TbpB nebo LbpB); a operátorová oblast DtxR.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem h) je výhodný jeden nebo více z následujících genů: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC a ctrD.
Prostředky založené na váčcích Pseudomonas aeruginosa
Pro regulaci ke zvýšení exprese způsobem b) a/nebo i) je výhodný jeden nebo více z následujících genů (kódujících ochranné antigeny): PcrV, OprF, Oprl. Ty jsou také výhodné jako geny, které mohou být heterologně zaváděny do jiných gramnegativních bakterií.
Prostředky založené na váčcích Moraxella catarrhalis
Pro regulaci ke zvýšení exprese způsobem b) a/nebo i) je vhodný jeden nebo více z následujících genů (kódujících ochranné antigeny): OMP106 (WO 97/41731 a WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), Iipo06 (GB 9917977.2), Iipo10 (GB 9918208.1), Iipo11 (GB 9918302.2), Iipo18 (GB 9918038.2), P6
«« ·· to*
• * • • • « · • • ·
• ···· * · • • * » • •
• · • Φ · • • • · ·*·· • • ····
(PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen Μ. E., a další (1993) Infect. Immun. 61: 2003 - 2010), D15 (PCT/EP99/03822), OmplAI (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA a LbpB (WO 98/55606), TbpA a TbpB (WO 97/13785 a WO 97/32980), OmpE, UspA1 a UspA2 (WO 93/03761), a Omp21. Tyto geny jsou také výhodné jako geny, které mohou být heterologně zavedeny do jiných gramnegativních bakterií.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem a) je vhodný jeden nebo více z následujících genů: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA a LbpB.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem d) je vhodný jeden nebo více z následujících genů: htrB, msbB a IpxK.
Pro regulaci ke zvýšení exprese způsobem e) je výhodný jeden nebo více z následujících genů: pmrA, pmrB, pmrE a pmrF.
Prostředky založené na váčcích Haemophilus influenzae
Pro regulací ke zvýšení exprese způsobem b) a/nebo i) je vhodný jeden nebo více z následujících genů (kódujících ochranné antigeny): D15 (WO 94/12641), P6 (EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, a Hif (všechny geny v tomto operonu mohou být regulovány směrem ke zvýšení exprese pro dosažení zvýšené exprese pilinu). Tyto geny jsou také výhodné jako geny, které mohou být heterologně zavedeny do jiných gramnegativních bakterií.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem a) je výhodný jeden nebo více z následujících genů: P2, P5, Hif, lgA1-proteáza, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA, a TbpB.
Pro regulaci ke snížení exprese způsobem d) je vhodný jeden nebo více z následujících genů: htrB, msbB a IpxK.
-41 • « <* ·· ·· ·· ♦ ···· ····
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 999 9999 9 · ··· ···
999 9 99 9999 99 9999
Pro regulaci ke zvýšení exprese způsobem e) je výhodný jeden nebo více z následujících genů : pmrA, pmrB, pmrE a pmrF.
Vakcíny
Výhodné provedení vynálezu je formulace prostředků založených na váčcích podle vynálezu do vakcíny, která může také obsahovat farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.
Výroba prostředků založených na váčcích z jakéhokoli z výše uvedených modifikovaných kmenů může být dosažena jakýmkoli způsobem známým odborníkům v oboru. S výhodou se používají způsoby popisované v EP 301992, US 5,597,572, EP 11243 nebo US 4,271,147. nejvýhodněji se popisuje způsob popsaný v příkladu 8.
Vakcína se obecně popisuje v publikaci Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach! (ed. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenům Press New York).
Prostředky založené na váčcích podle předkládaného vynálezu mohou být smíseny s adjuvans ve vakcíně podle vynálezu. Mezi vhodná adjuvans patří sůl hliníku jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý, ale může být také použita sůl vápníku (zvláště uhličitan vápenatý, železa nebo zinku, nebo se může použít nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu nebo acylovaných cukrů, kationtové nebo aniontové derivatizovaných polysacharidů nebo polyfosfazenů.
Vhodný adjuvantní systém pro Th1 může být například monofosforyllipid A, zvláště 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A, a kombinace monofosforyllipidu A, s výhodou 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL) spolu se solí hliníku. Vylepšený systém zahrnuje kombinaci monofosforyllipidu A a saponinového derivátu, zvláště v kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní směs, kde QS21 se blokuje • · • ·
-42 cholesterolem, jak se popisuje ve WO 96/33739. Zvláště silný adjuvantní prostředek obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě, se popisuje ve WO 95/17210 a jde o výhodnou formulaci.
Vakcína může obsahovat saponin, výhodněji QS21. Může také obsahovat emulzi typu olej ve vodě a tokoferol. Výhodnými induktory odpovědi TH1 jsou také nemethylované oligonukleotidy obsahující CpG (WO 96/02555), které jsou vhodné pro použití v rámci předkládaného vynálezu.
Vakcína podle předkládaného vynálezu může být použita pro ochranu nebo léčení savce vnímavého k infekci podáváním uvedené vakcíny systémově nebo přes sliznice. Podání může například probíhat injekcí intramuskulární, intraperitoneální, intradermální nebo subkutánní cestou; nebo přes sliznice orálně/alimentárního, respiračního nebo urogenitálního traktu. Jedno provedení předkládaného vynálezu je tedy způsob imunizace hostitele proti onemocnění způsobenému gramnegativní bakterií, kde tento způsob zahrnuje podávání imunoprotektivní dávky prostředku založeného na váčcích podle předkládaného vynálezu hostiteli.
Množství antigenu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které indukuje v typických vakcínách imunoprotektivní odpověď bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude lišit v závislosti na tom, jaký konkrétní imunogen se použije a jakým způsobem se předkládá. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 100 pg proteinového antigenu, s výhodou 5 až 50 pg, a nejtypičtěji v rozmezí 5 až 25 pg.
Optimální množství určité vakcíny může být zjištěno standardními studiemi, které zahrnují pozorování příslušných imunitních odpovědí u pacientů. Po počáteční vakcinaci mohou pacienti dostat ve vhodných intervalech jednu nebo více zesilujících imunizací.
• ·
Vakcíny z prázdných buněk nebo vakcíny z usmrcených celých buněk
Autoři vynálezu ukazují, že výše popsaná zlepšení prostředků a vakcín založených na váčcích mohou být snadno rozšířena na preparáty z prázdných buněk (typu „ghost“) nebo prostředky obsahující usmrcené celé buňky (se stejnými výhodami). Modifikované gramnegativní kmeny podle vynálezu, ze kterých se prostředky založené na váčcích připravují, mohou být také použity pro vyrobení prostředků typu „ghost“ a prostředků obsahujících usmrcené celé buňky. Způsoby výroby prostředků typu „ghost“ (prázdné buňky s intaktními obaly) z gramnegativních kmenů jsou v oboru dobře známé (viz například WO 92/01791). Způsoby usmrcování úplných buněk pro výrobu inaktivovaných buněčných prostředků pro použití ve vakcínách jsou také dobře známé. Termíny „prostředky založené na váčcích“ a „vakcíny založené na váčcích“, stejně jako způsoby popisované v předkládaném dokumentu, jsou proto použitelné pro účely tohoto vynálezu na termíny „prostředek typu ghost“ a „vakcína typu ghost“ a „prostředek založený na usmrcených úplných buňkách“ a „vakcína založená na usmrcených úplných buňkách“.
Kombinace způsobů a) až i)
Může být vhodné, jestliže se pro přípravu modifikovaného kmenu, ze kterého se připravují zlepšené prostředky založené na váčcích podle vynálezu, používá jeden nebo více z výše uvedených způsobů. S výhodou se používá jeden takový způsob, výhodněji dva nebo více (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9) způsobů, pro výrobu vakcíny založené na váčcích. Protože se při výrobě vakcíny založené na váčcích používá každý další způsob, každé zlepšení spolupracuje s dalšími způsoby použitými pro přípravu optimalizovaných zkonstruovaných prostředků založených na váčcích.
- 44 ·· ·· ·· ·· * · · · ♦ · · • · · · * • · · · · · • · · · · ·· ···· · · · · · ·
Výhodný prostředek založený na váčcích meningokoků (zvláště N. meningitidis B) zahrnuje použití způsobů a), b), d) a/nebo e), a h). Tyto prostředky založené na váčcích jsou bezpečné (neobsahují struktury podobné strukturám hostitele), netoxické a strukturované tak, že imunitní odpověď hostitele se bude soustředit na vysoké hladiny ochranných (a s výhodou konzervovaných) antigenů. Všechny výše uvedené prvky spolupracují pro poskytnutí optimalizované vakcíny založené na váčcích.
Podobně pro M. catarrhalis a netypovatelný H. influenzae, zahrnují výhodné prostředky založené na váčcích použití způsobů a),
b), a d) a/nebo e).
Další provedení vynálezu je tedy imunoprotektivní a netoxická vakcína založená na gramnegativních váčcích, prázdné buňce (ghost) nebo usmrcené celé buňce, vhodná pro pediatrické použití.
Pod pediatrickým použitím se míní použití u dětí mladších než čtyři roky.
Imunoprotektivním účinkem se míní, že u alespoň 40 % (a s výhodou 50, 60, 70, 80, 90 a 100 %) dětí dojde k sérokonverzi (čtyřnásobné zvýšení baktericídní aktivity, tj. ředění antiséra, při kterém zahyne 50 % bakterií - viz například PCT/EP98/05117) proti souboru heterologních kmenů zvolených z hlavních známých skupin klonů. Pro meningokoky B by měly mít tyto kmeny odlišný typ PorA, než má kmen produkující váčky, a měly by s výhodou zahrnovat 2, 3, 4 nebo nejvýhodněji všech pět kmenů H44/76, M97/252078, BZ10, NGP165 a CU385. Pro netypovatelný H. influenzae, by měly tyto kmeny zahrnovat s výhodou 2, 3, 4 nebo nejvýhodněji všech pět kmenů 3224A, 3219C, 3241A, 640645, a A840177. V případě M. catarrhalis by měly tyto kmeny s výhodou zahrnovat 2, 3, 4 nebo nejvýhodněji všech pět imenů ATCG 43617, 14, 358, 216 a 2926.
- 45 Pod pojmem netoxický se míní, že dojde k podstatnému (dvou až čtyřnásobnému, s výhodou desetinásobnému) snížení aktivity endotoxinů, měřeno známými testy LAL a pyrogenicity.
Kombinace vakcín
Další provedení vynálezu jsou kombinace vakcín obsahující prostředky založené na váčcích podle vynálezu s jinými antigeny, které se s výhodou používají proti určitým stavům onemocnění. Bylo zjištěno, že váčky jsou zvláště vhodné pro formulaci s jinými antigeny, protože mají s výhodou adjuvantní účinek na antigeny, se kterými se mísí.
V jednom výhodném provedení se prostředky založené na váčcích meningokoku B podle vynálezu formulují s 1, 2, 3 nebo s výhodou všemi čtyřmi z následujících meningokokových kapsulárních polysacharidů, které mohou být samotné nebo konjugované k proteinovému nosiči: A, C, Y nebo W. Taková vakcína může být s výhodou použita jako globální vakcína proti meningokokům. Spíše než použití prostředků založených na váčcích meningokoka B podle vynálezu je také zřejmé, že formulace by mohla alternativně obsahovat prostředky založené na váčcích meningokoka B standardního typu dvou nebo více (s výhodou několika) kmenů náležejících k několika subtypům/sérotypům (například zvolené z P1.15, P1.7.16, P1.4 a P1.2).
V dalším výhodném provedení se prostředky založené na váčcích meningokoka B podle vynálezu (nebo výše uvedená směs dvou nebo více prostředků založených na váčcích meningokoka B standardního typu) s výhodou formulované s 1, 2, 3 nebo všemi čtyřmi prostými nebo konjugovanými polysacharidy obalu meningokoka A, C, Y nebo W, formulují s konjugovaným polysacharidem obalu H. influenzae b a jedním nebo více prostými nebo konjugovanými obalovými polysacharidy pneumokoků. Vakcína může také popřípadě ♦ ·
-46 • φ • φ φφφφ obsahovat jeden nebo více proteinových antigenu, které chrání hostitele proti infekci Streptococcus pneumoniae. Taková vakcína může být s výhodou používána jako globální vakcína proti meningitidě.
Antigeny obalových polysacharidů pneumokoků se s výhodou volí ze sérotypů 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F (nejvýhodněji ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F).
Výhodné proteinové antigeny pneumokoků jsou takové proteiny pneumokoků, které jsou vystaveny na vnějším povrchu pneumokoků (schopné být rozpoznávány imunitním systémem hostitele během alespoň části životního cyklu pneumokoka), nebo jde o proteiny, které jsou vylučovány nebo uvolňovány pneumokokem. Nejvýhodněji je proteinem toxin, adhesin, dvousložkový přenašeč signálu nebo lipoprotein Streptococcus pneumoniae, nebo jeho fragmenty. Mezi zvláště výhodné proteiny patří bez omezení: pneumolysin (s výhodou detoxifikovaný chemickým působením nebo mutací) (Mitchell a další, Nucieic Acids Res. 11. červenec 1990, 18 (13): 4010 „Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2“, Mitchell a další, Biochim. Biophys. Acta, 23. ledna 1989, 1007 (1):67 - 72, „Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties“, WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton a další), WO 99/03884 (NAVA); PspA a jeho transmembránové deleční varianty (US 5804193 - Briles a další); PspC a jeho transmembránové deleční varianty (WO 97/09994 - Briles a další); PsaA a jeho transmembránové deleční varianty (Berry & Paton, Infect. Immun. prosinec 1996; 64 (12): 5255 62, „Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae“)·, pneumokokové proteiny vázající se na cholin a jejich transmembránové deleční varianty; CbpA a jeho transmembránové deleční varianty (WO 97/41151; WO 99/51266); glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (Infect. Immun. 1996, 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA • «
- 47 φ φ · • · · • · · φ · φφφφ (Sanchez-Beato a další, FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207 - 14); protein podobný M, SB patentová přihláška No. EP 0837130; a adhesin 18627, SB patentová přihláška No. EP 0834568. Další výhodné proteinové antigeny pneumokoků jsou antigeny popisované ve WO 98/18931, zvláště ty, které jsou vybrány ve WO 98/18930 a PCT/US 99/30390.
V dalším výhodném provedení se prostředky založené na váčcích Moraxella catarrhalis podle vynálezu formulují s jedním nebo více prostými nebo konjugovanými polysacharidy pouzdra pneumokoků a jedním nebo více antigeny, které mohou hostitele chránit proti infekci netypovatelným H. influenzae. Vakcína může také popřípadě obsahovat jeden nebo více proteinových antigenů, které mohou hostitele chránit proti infekci Streptococcus pneumoniae. Tato vakcína může také popřípadě obsahovat jeden nebo více antigenů, které mohou chránit hostitele proti RSV a/nebo jednen nebo více antigenů, které mohou chránit hostitele proti viru chřipky. Taková vakcína se může s výhodou používat jako globální vakcína proti zánětu středního ucha.
Výhodné proteinové antigeny netypovatelného H. influenzae obsahují fimbrinový protein (US 5766608) a fúze obsahující jeho peptidy (např. fúze LB1) (US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, protein D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2,
Hap, a D15.
Mezi výhodné antigeny proti viru chřipky patří úplný, živý nebo inaktivovaný virus, štěpený virus chřipky, pěstovaný ve vejcích nebo buňkách MDCK, nebo buňkách Věro, nebo úplné virosomy chřipky (popisované v R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 - 920) nebo jejich čištěné nebo rekombinantní proteiny, jako jsou proteiny HA, NP, NA, nebo M nebo jejich kombinace.
0
0 0
0 0
0 0 0
0
- 48 Výhodné antigeny RSV (Respirátory Syncytiai Virus, virus respiračního syncytia) zahrnují glykoprotein F, glykoprotein G, protein NH nebo jejich deriváty.
V ještě dalším výhodném profedení se formulují prostředky založené na váčcích netypovatelného /7. influenzae podle vynálezu s jedním nebo více prostými nebo konjugovanými pneumokokovými obalovými polysacharidy a jedním nebo více antigeny, které mohou hostitele chránit proti infekci M. catarrhalis. Vakcina může také obsahovat jeden nebo více proteinových antigenů, které mohou hostitele chránit proti infekci Streptococcus pneumonie. Tato vakcina může také popřípadě obsahovat jeden nebo více antigenů, které chrání hostitele proti RSV a/nebo jeden nebo více antigenů, které mohou chránit hostitele proti viru chřipky. Taková vakcina by se s výhodou používala jako globální vakcina proti zánětu středního ucha.
Nukleotidové sekvence podle vynálezu
Další provedení vynálezu se týká poskytnutí nových nukleotidových sekvencí, které mohou být použity při způsobech podle vynálezu. Poskytují se specifické oblasti proti směru transkripce z různých genů z různých kmenů, které mohou být například použity při způsobech a), b), d) a h). Navíc se poskytují kódující oblasti pro provádění způsobu d).
Obecný způsob pro analýzu nekódující okolní oblasti bakteriálního genu a její využití pro modulovanou expresi genu ve váčcích
Nekódující oblasti obklopující specifický gen (flanking regions) obsahují regulační prvky důležité při expresi genu. Tato regulace probíhá jak na úrovni transkripce, tak na úrovni translace. Sekvence z těchto oblastí, buď proti směru transkripce nebo ve směru transkripce vzhledem k otevřenému čtecímu rámci genu, mohou být fcfc · fcfc ♦· fcfc fcfc fcfcfc· fcfcfcfc fcfc fcfcfc fc • · fcfcfcfc · • fcfc fcfcfc fcfc fcfc·· fcfc fcfcfcfc získány sekvenováním DNA. Tato sekvenční informace dovolí zjištění potenciálních regulačních motivů, jako jsou různé prvky promotorů, terminační sekvence, indukovatelné prvky sekvence, represory, prvky odpovědné za změnu fáze, Shine-Dalgarnovy sekvence, oblasti s potenciální sekundární strukturou účastnící se regulace, stejně jako další typy regulačních motivů nebo sekvencí.
Tato informace o sekvenci umožní modulaci přirozené exprese sledovaného genu. Regulace exprese genu ke zvýšení exprese může být uskutečněna změnou promotoru, Shine-Dalgarnovy sekvence, potenciálních represerových nebo operátorových prvků, nebo jakýchkoli dalších zúčastněných prvků. Podobně může být dosaženo regulace ke snížení exprese podobnými typy modifikací. Alternativně je možno změnou sekvencí pro variaci fáze zahrnout expresi genu pod řízení variací fáze, nebo může být gen z této regulace vyjmut. V dalším přístupu může být exprese genu vložena pod řízení jednoho nebo více indukovatelných prvků, což umožňuje řízenou expresi. Příklady této regulace zahrnují bez omezení indukci posunem teploty, přídavkem indukujících substrátů jako jsou určité uhlohydráty nebo jejich deriváty, stopové prvky, vitaminy, kofaktory, kovové ionty atd.
Modifikace tak jak se popisují výše mohou být zaváděny několika různými způsoby. Modifikace sekvencí, které se účastní exprese genu, může být prováděna in vivo náhodnou mutagenezi následovanou selekcí na požadovaný fenotyp. Další přístup spočívá v izolaci příslušné oblasti a její modifikaci náhodnou mutagenezi, nebo místně specifickou mutagenezi s náhradou, inzercí nebo deleci. Modifikovaná oblast může být potom znovu zavedena do bakteriálního genomu homologní rekombinací a může být zjišťován vliv na expresi genu. Při dalším přístupu může být použita znalost sekvence sledované oblasti pro náhradu nebo vyjmutí všech nebo části přirozených regulačních sekvencí. V takovém případě je regulační oblast izolovaná a modifikovaná tak, aby obsahovala regulační prvky z jiného genu, kombinaci regulačních prvků z jiných genů, syntetickou «
- 50 • · · • · · ·
regulační oblast nebo jakoukoli jinou regulační oblast, nebo pro delecí vybraných částí regulačních sekvencí standardního typu. Tyto modifikované sekvence mohou být potom vloženy zpět do bakterie prostřednictvím homologní rekombinace do genomu.
Při způsobu b) může být například modulována exprese genu záměnou jeho promotoru za silnější promotor (pomocí izolace sekvence proti směru transkripce vzhledem k tomuto genu, modifikace této sekvence in vitro a zpětné zavedení do genomu homologní rekombinací). Zvýšená exprese může být získána jak v bakteriích, tak ve váčcích vnější membrány vylučovaných (nebo vytvářených) bakterií.
V dalších výhodných příkladech mohou být popsané přístupy použity pro tvorbu rekombinantních bakteriálních kmenů se zlepšenými vlastnostmi pro použití ve vakcínách, jak bylo popsáno výše. Tyto varianty mohou být bez omezení oslabené kmeny, kmeny se zvýšenou expresí vybraných antigenů, kmeny se sníženou expresí (knock-out) genů interferujících s imunitní odpovědí a kmeny s modulovanou expresí imunodominantních proteinů
SEQ ID NO: 2-23, 25, 27-38 jsou všechny sekvence neisserií uložené proti směru transkripce (upstream) (proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu různých výhodných genů) obsahující vždy přibližně 1000 bp. SEQ ID NO: 39-62 jsou všechny sekvence M. catarrhalis uložené proti směru transkripce (proti směru transkripce iniciačního kodonu různých výhodných genů) obsahující přibližně vždy 1000 bp. SEQ ID NO: 63-75 jsou všechny sekvence H. influenzae uložené proti směru transkripce (proti směru transkripce iniciačního kodonu různých výhodných genů) obsahující přibližně vždy 1000 bp. Všechny tyto sekvence mohou být použity při genetických metodách, zvláště homologní rekombinací pro regulaci ke zvýšení nebo snížení exprese otevřených čtecích rámců, se kterými jsou asociovány (jak bylo popsáno výše). SEQ ID NO: 76-81 jsou kódující oblasti pro geny HtrB a MsbB Neisseria, M. catarrhalis a Haemophilus influenzae.
99
9 9 ·
9 ·
9 9
9 9
9· 9999
9
- 51 9'9 9·9 • 9 · ·
Mohou být použity při genetických metodách (zvláště homologní rekombinaci) pro regulaci ke snížení exprese (zvláště deleci) části (s výhodou všech) těchto genů (způsob d)).
Další provedení vynálezu je tedy izolovaná polynukleotidová sekvence, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s částí o délce alespoň 30 nukleotidů, která je součástí nukleotidů SEQ ID NO: 2-23, 25, 27-81, nebo jejich komplementárních řetězců. Izolovaná sekvence by měla být s výhodou dostatečně dlouhá pro provedení homologní rekombinace s chromosomální sekvencí, jestliže je částí vhodného vektoru - totiž alespoň 30 nukleotidů (s výhodou alespoň 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 nebo 500 nukleotidů). Izolovaný polynukleotid by měl výhodněji obsahovat alespoň 30 nukleotidů (s výhodou alespoň 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 nebo 500 nukleotidů) SEQ ID NO: 2-23, 25, 27-81 nebo jejich komplementárních řetězců.
Jak se zde používá, hybridizace za vysoce stringentních podmínek probíhá například v roztoku 6 x SSC, 5 x Denhardtův roztok, 0,5% SDS, a 100 pg/ml fragmentované a denaturované DNA lososího spermatu při hybridizaci přes noc při 65 °C s promytím 2 x SSC, 0,1% SDS jedenkrát při laboratorní teplotě po dobu přibližně 10 min a potom jedenkrát při 65 °C přibližně 15 min a potom alespoň jedenkrát v 0,2 x SCC, 0,1% SDS při laboratorní teplotě alespoň 3 až 5 minut.
Další provedení je použití izolovaných nukleotidových sekvencí podle vynálezu při provádění postupů genetického inženýrství (jako je vložení transposonu nebo místně specifická mutace nebo delece, ale s výhodou homologní rekombinace) v oblasti 1000 bp proti směru transkripce chromosomálního genu gramnegativní bakterie buď pro zvýšení nebo snížení exprese genu. Kmen, ve kterém má rekombinace probíhat, je s výhodou stejný jako kmen, ze kterého byly získány sekvence v oblasti proti směru transkripce podle vynálezu. Genomy meningokoků A, B, C, Y a W a gonokoků jsou však dostatečně
- 52 44 ·4 44 «9
9* * 4 >9 · • 4 « 4 4 · 4 • 4 4 4 «4 ·· 4449 44 4444 podobné, aby sekvence umístěná proti směru transkripce z jakéhokoli z těchto kmenů mohla být vhodná pro navrhování vektorů pro provádění těchto kroků v jiných kmenech. Tak tomu může být také v případě Haemophilus influenzae a netypovateiného Haemophilus influenzae.
Příklady provedení vynálezu
Dále uvedené příklady se provádějí s použitím standardních technik, které jsou dobře známé a pro odborníky v oboru rutinní, kromě případů, které se podrobně popisují. Příklady jsou uvedeny pro ilustraci a nemají vynález omezovat.
Příklad 1
Konstrukce kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího polysacharidy obalu
Plasmid pMF121 (Frosch a další, 1990) byl použit pro konstrukci kmene Neisseria meningitidis B postrádajícího obalový polysacharid. Plasmid obsahuje obklopující oblasti místa genu kódujícího biosyntetickou cestu polysacharidů skupiny Β (B PS), a genu rezistence na erythromycin. Delece B PS vedla ke ztrátě exprese obalového polysacharidů skupiny B stejně jako delece v aktivní kopii galE vedoucí k syntéze LPS deficientního na galaktózu.
Transformace kmene
Pro transformaci byl zvolen kmen Neisseria meningitidis B H44/76 (B:15:P1.7, 16; Los 3,7,9). Po inkubaci v přítomnosti CO2 na plotně MH (bez erythromycinu) byly buňky odebrány do kapalného média MH obsahujícího 10mM MgCI2 (na jednu plotnu MH byly použity 2 ml) a suspenze byly zředěny na OD 0,1 (550 nm). K těmto 2 ml
- 53 • 9
9999
99 99 99 • 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 • 99 9 9 9 9 9
9> 9 9 9 9 ·· 99 9 9 9 9 9999 roztoku byly přidány 4 pl zásobního roztoku plasmidu pMF121 (0,5 pg/ml) na 6 hod inkubaci při 37 °C (bez třepání). Kontrolní skupina byla připravena se stejným množstvím bakterie Neisseria meningitidis B, ale bez přidání plasmidu. Po inkubační době bylo 100 μΙ kultury bez ředění, při ředění 1/10, 1/100 a 1/1000 vyseto na plotny MH obsahující 5, 10, 20, 40 nebo 80 pg erythromycinu/ml před inkubací 48 hod při 37 °C.
Otiskování kolonií
Po inkubaci na plotnách bylo pěstováno 20 kolonií a byla provedena selekce z ploten MH obsahujících 10 a 20 pg erythromycinu/ml, přičemž v kontrolní skupině bez transformace plasmidem nebyl pozorován žádný růst kolonií. Kmen H44/76 standardního typu nebyl schopen růst na selekčních erythromycinových plotnách (10 až 80 pg erythromycinu/ml). O jeden den později byly všechny viditelné kolonie vysety na nové plotny MH bez erythromycinu, aby byl umožněn jejich nárůst. Potom byly převedeny na nitrocelulózové listy (otiskování kolonií, coiony blotting) pro testování přítomnosti polysacharidu B. Ve stručnosti, kolonie byly otisknuty na list nitrocelulózy a byly přímo opláchnuty v pufru PBS 0,05 % Tween 20, před inaktivaci buněk 1 hod při 56 °C v PBS 0,05% Tween 20 (ředicí pufr). Potom byla membrána převrstvena na 1 hod ředicím pufrem při laboratorní teplotě. Listy byly potom opět promyty 3x5 min v ředicím pufru před inkubací s monoklonální protilátkou anti-B PS 735 (Boerhinger) v ředění 1/3000 v ředicím pufru po dobu 2 hod při laboratorní teplotě. Po dalším kroku praní (3x5 min) byla monoklonální protilátka detekována biotinylovanou protilátkou proti myšímu Ig firmy Amersham (RPN 1001) ředěnou 500 x v ředicím pufru (1 hod při laboratorní teplotě), před provedením dalšího promývacího kroku (jak bylo popsáno výše). Potom byly listy inkubovány 1 hod při laboratorní teplotě roztokem komplexu
- 54 streptavidin-peroxidáza zředěným 1/1000 v ředicím pufru. Po posledních třech krocích praní použitím stejného způsobu byly nitrocelulózové listy inkubovány 15 min temnu s vyvíjecím roztokem (30 mg 4chlor-1-naftolu v 10 ml methanolu plus 40 ml PBS a 30 μΙ H2O2 37% firmy Merck). Reakce byla zastavena krokem promytí destilovanou vodou.
Metody ELISA na celých buňkách
Metoda ELISA na celých buňkách byla prováděna s použitím dvou transformovaných kolonií („D“ a „R“) s kmene standardního typu (H44/76) jako potahovací bakterie (20 pg proteinu/ml), a pro charakterizaci kmenů Neisseria meningitidis byl použit soubor různých monoklonálních protilátek. Byly testovány následující monoklonální protilátky: anti-B PS (735 firmy Dr Frosch), a jiné monoklonální protilátky firmy NIBSC: anti-B PS (Ref 95/750) anti-P1.7 (A-PorA, Ref 4025), anti-P1.16 (A PorA, Ref 95/720), anti-Los 3,7,9 (A-LPS, Ref 4047), anti-Los 8 (A-LPS, Ref 4048), a anti-P1.2 (A-PorA Ref 95/696).
Mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy 100 μΙ roztoku rekombinantních buněk meningokoka B přes noc při 37 °C a koncentraci přibližně 20 pg/ml v PBS. Potom byly destičky 3 x promyty 300 μΙ 150mM NaCI - 0,05 % Tween 20, a byly převrstveny 100 μΙ PBS - 0,3% kasein a inkubovány 30 min při laboratorní teplotě za třepání. Plotny byly znovu promyty stejným postupem jako výše při inkubaci s antibiotiky. Monoklonální protilátky (100 μΙ) byly použity při rozdílných ředěních (jak je ukázáno na obr. 2) v PBS - 0,3 % kasein, 0,05% Tween 20 a vloženy na mikrodestičky před inkubací při laboratorní teplotě 30 min za třepání, před dalším identickým krokem praní. Do jamek bylo přidáno 100 μΙ protilátky proti myšímu Ig (králičí, Dakopatts E0413) konjugované s biotinem a zředěné 1/2000 v PBS 0,3% kasein - 0,05% Tween 20 pro detekci vazby monoklonálních protilátek. Po promývacím kroku (jak bylo popsáno výše) byly destičky
- 55 • 04 0« 00 ·· • 0400 0 0 · J
0000 00· 0··· 9
0 0 0 0 9 4 • ·· ···« 00 0040 inkubovány s roztokem komplexu streptavidin-peroxidáza (100 μΙ the Amersham RPN 1051) v ředění 1/4000 ve stejném pracovním roztoku po dobu 30 min při laboratorní teplotě za třepání. Po této inkubaci a posledním kroku praní se destičky inkubují se 100 μΙ roztoku chromogenu (4 mg orthofenylendiaminu, OPD) v 10 ml 0,1M citrátového pufru pH 4,5 s 5 μΙ Η2Ο2) 15 min v temnu. Destičky se potom odečítají při 490/620 nm na spektrofotometru.
Výsledky
Obr. 1 ukazuje, že z 20 izolovaných kolonií, které byly schopné růst na selekčním médiu s erythromycinem, se pouze dvě kolonie („D“ a „R“) ukázaly jako negativní na přítomnost polysacharidu B. Mezi dalšími bylo 16 jasně pozitivních na B PS a stále ještě rezistentních na erythromycin. To ukázalo, že plasmid byl sice do jejich genomu integrován, ale se špatnou orientací, což udrželo intaktní gen B PS a LPS (nedošlo k dvojitému crossing-over). Pozitivní a negativní kontroly byly také testovány na plotnách, a ukázalo se, že kmen NmB H44/76 standardního typu byl jasně pozitivní na polysacharid β, zatímco kmeny meningokoka A (A1) a meningokoka C (C11) byly s touto monoklonální protilátkou anti-B PS 735 jasně negativní. Tyto výsledky ukazují, že přibližně 10 % vybraných kolonií mělo správně integrovaný plasmid do svých genomů provedením crossing-over, při udržení genů B PS a LPS intaktních a exprimovaných.
Výsledky s použitím ELISA s celými buňkami (obr. 2 a tabulka níže) jasně ukazují, že dva transformanty „D“ a „R“ (odvozené z kolonií D a R) nemohou být již rozpoznány monoklonálními protilátkami anti-B PS (735 a 95/750), ani monoklonálními protilátkami anti-Los 3,7,9 a anti-Los 8. Při použití specifických monoklonálních protilátek anti-PorA však je jasná reakce s monoklonálními protilátkami anti-P1.7 a antiP1.16 na buňkách, jak se také pozoruje u kmene standardního typu. U nespecifických monoklonálních protilátek anti-PorA (anti-P1.2 mab) • fl flfl flfl fl fl fl « 9 flflfl •fl ····
- 56 ♦ fl • · ···· · fl fl fl • fl flfl fl fl •
• flflfl nebyla žádná reakce pozorována. Tyto výsledky potvrzují, že protein PorA, a zvláště epitopy P1.7 a P1.16 jsou po transformaci stále přítomné, zatímco polysacharid B a epitopy Los 3.7, 9 a Los 8 (LPS) přítomné nebyly.
Taulka: Specificity testovaných monoklonálních protilátek
Testované monoklonální protilátky Zaměřené proti Výsledek
Anti-B PS 735 Polysacharid B ++ na kmenu standardního typu (-) na mutantech „D“ a „R“
Anti-B PS 95/750 z NIBSC B PS ++ na kmenu standardního typu (-) na mutantech „D“ a „R“
Anti-P1.7 (NIBSC) Smyčka 1 porinu A ++ na všech typech standardního typu a mutantních řetězcích
Anti-P1.16 (NIBSC) Smyčka 4 porinu A ++ na všech typech standardního typu a mutantních řetězcích
Anti-Los 3,7,9 LPS ++ na kmenu standardního typu (-) na mutantech „D“ a „R“
Anti-Los 8 (NIBSC) LPS +/- na kmenu standardního typu (-) na mutantech „D“ a „R“
Anti-P1.2 (NIBSC) Anti-porin A Sérosubtyp 1.2 (-) na všech typech standardního typu a mutantních řetězcích
Konstrukce univerzálních vektorů pro dodávání genů (série pCMK) směrující integraci do místa porA Neisseria meningitidis
Byl zkonstruován plasmid umožňující homologní rekombinaci a stabilní integraci cizí DNA do místa porA Neisseria meningitidis. Tento dodávací vektor (geny, operony a/nebo expresní kazety) je využitelný pro konstrukci kmenů Neisseria meningitidis produkujících rekombinantní, zlepšené váčky. Typicky obsahuje takový vektor alespoň: (1) plasmidovou kostru replikující se v E. coli, ale ne
- 57 v Neisseria meningitidis (suicide plasmid), (2) alespoň jednu, ale s výhodou dvě oblasti homologie pro směrování integrace do místa chromosomu jako je porA, (3) účinné transkripční (promotor, regulační oblast a terminátor) a translační (optimalizované vazebné místo ribosomu a iniciační kodon) signály fungující v Neisseria meningitidis, (4) vícečetné klonovací místo a (5) selektovatelný gen nebo geny umožňující udržení plasmidu v E. coli a selekci integrovaných genomů v Neisseria meningitidis. Mezi další prvky patří například přijímací sekvence (uptake sequences) pro umožnění vstupu cizí DNA do Neisseria meningitidis, a markéry s negativní selekcí (counter selectable markers), jako je sacB, rpsL, gltS pro zvýšení frekvence dějů dvojitého crossing-overu.
Schematické znázornění vektoru zkonstruovaného v tomto příkladu a označeného pCMK je znázorněno v obr. 3. Jeho odpovídající úplná nukleotidová sekvence je ukázána v SEQ. ID NO:
1. pCMK se odvozuje od kostry pSL1180 (PharmaciaBiotech, Švédsko), což je plasmid s vysokým počtem kopií, který se replikuje v E. coli, nesoucí gen bia (a tím propůjčující rezistenci na ampicilin). Navíc obsahuje pCMK dvě obklopující oblasti porA (porA5’ a porA3’ obsahující terminátor transkripce) nutné pro homologní rekombinaci, a selektovatelný markér propůjčující rezistenci na kanamycin, dvě příjmové sekvence, chimérní promotor porA/lacO reprimovaný v hostitelské E. coli exprimující laclq, ale transkripčně aktivní v Neisseria meningitidis, a vícečetné klonovací místo (obsahující pět štěpicích míst: Nde\, Kpn\, Nhe\, PinA\ a Spňl) nezbytné pro vkládání cizí DNA do pCMK.
pCMK byl zkonstruován následujícím způsobem. Oblasti umožňující rekombinace porA5’ a porA3’ a promotor porA/lacO byly amplifikovány PCR použitím oligonukleotidů uvedených v následující tabulce, klonovány v pTOPO a sekvenovány. Tyto fragmenty DNA byly postupně vyříznuty z pTOPO a znovu klonovány do pSL1180. Kazeta rezistence na kanamycin byla vyříznuta z plasmidu pUC4K
- 58 (PharmaciaBiotech, Švédsko) a abyla vložena mezi obklopující oblast porA5’ a promotorovou oblast porA/lacO.
• 4 4 » • 4 * · ♦ · 4 ♦ ·
4444
Tabulka: Oligonukleotidy používané při PCR
Oligonukleotidy Sekvence Poznámky
PorA5’ Fwd 5'-CCC AAG CTT GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC ATT CCT CA-3' Klonovací místo HindMl příjmová sekvence (_)
PorA5' Rev 5'-CGA TGC TCG CGA CTC CAG AGA CCT CGT GCG GGC C-3' Klonovací místo Nru\
PorA3' Fwd 5'-GGA AGA TCT GAT TAA ATA GGC GAA AAT ACC AGC TAC GA3' Klonovací místo 6g/ll stopkodony (_)
PorA3' Rev 5'-GCC GAA TTC TTC AGA CGG C GC AGC AGG AAT TTA TCG G-3' Klonovací místo EcoRI příjmová sekvence (_)
PoLa Rev1 5'-GAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TCC GGG CAA ACA CCC GAT AC-3'
PoLa Rev2 5'-GAA TTC CAT ATG ATC GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA TAA AAA CCT AAA AAC ATC GAA TTG TTA TCC GCT C-3' Klonovací místo Ndei
PorAlacO Fwd 5'-AAG CTC TGC AGG AGG TCT GCG CTT GAA TTG-3' Klonovací místo Psřl
PorAlacO Rev 5'-CTT AAG GCA TAT GGG CTT CCT TTT GTA A-3’ Klonovací místo Ndei
PPA1 5'-GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3'
PPA2 5'-GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3'
N-full-01: 5'-GGG AAT TCC ATA TGA AAA AAG CAC TTG CCA CAC-3’ Klonovací místo Ndei
• 4 99 • · · ·
- 59 1111 1
Tabulka - pokračování
Oligonukleotidy Sekvence Poznámky
Nde-NspA-3: 5'-GGA ATT CCA TAT GTC AGA ATT TGA CGC GCA C-3' Klonovací místo Ndel
PNS1 5'-CCG CGA ATT CGG AAC CGA ACA CGC CGT TCG-3' Klonovací místo EcoRI
PNS1 5'-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3' Klonovací místo Xbal
PromD15-51X 5'-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC CGT TG3' Klonovací místa EcoRI a Λ/ořl
PromD15-S2 5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3’ Klonovací místo Xbal
PNS4 5'-AGC TTT ATT TAA ATC CTT AAT TAA CGC GTC CGG AAA ATA TGC TTA TC_34 Klonovací místa Swal a PacI
PNS5 5'-AGC TTT GTT TAA ACC CTG TTC CGC TGC TTC GGC-3' Klonovací místo Pmel
D15-S4 5'-GTC CGC ATT TAA ATC CTT AAT TAA GCA GCC GGA CAG GGC GTG G-3' Klonovací místa Swal a PacI
D15-S5 5'-AGC TTT GTT TAA AGG ATC AGG GTG TGG TCG GGC-3' Klonovací místo Pmel
Příklad 3
Konstrukce kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího jak obalové polysacharidy, tak hlavní imunodominantní antigen PorA
Modulace obsahu antigenů váčků vnější membrány může být výhodná při zlepšování jejich bezpečnosti a účinnosti při použití ve vakcínách, nebo při diagnostických nebo terapeutických použitích. Složky jako jsou obalové polysacharidy Neisseria meningitidis
- 60 • « ·» «· ·· »· ·« » . · · · · »· « • ·<»· » ♦ * · · * · * • » «·· ··· ··· « ·» ··». «· ···· séroskupiny Β by měly být odstraněny, aby se vyloučilo riziko vyvolání autoimunitních reakcí (viz příklad 1). Podobně je prospěšné potlačit imunodominanci hlavních antigenů vnější membrány, jako je PorA, které indukují baktericidní protilátky specifické pro kmen, ale neposkytují zkříženou ochranu. Pro ilustraci takového přístupu použili autoři vynálezu vektor pCMK(+) pro konstrukci kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího jak obalové polysacharidy, tak imunodominantní proteinový antigen vnější membrány PorA. K tomuto účelu byla zavedena delece genu porA do kmene H44/76 cps- popisovaného v příkladu 1 metodou homologní rekombinace.
Kmen H44/76 cps- byl připraven v kompetentním stavu a transformován 2 pg DNA plasmidu pCMK(+) v nadšroubovicovém stavu, jak bylo popsáno výše. Alikvotní frakce transformační směsi (100 pl) byly vysety na Mueller-Hintonovy plotny doplněné kanamycinem (200 pg/ml) a inkubovány při 37 °C 24 až 48 hod. Byly vybrány kolonie rezistentní na kanamycin, rozetřeny na MH-Kn a pěstovány dalších 24 hod při 37 °C. V tomto stupni byla polovina bakteriální kultury použita pro přípravu glycerolových zásobních suspenzí (15 % obj.) a tyto suspenze byly udržovány v zamraženém stavu při -70 °C. Další frakce (odhadem 108 bakterií) byla resuspendována v 15 pl destilované vody, vařena 10 min a použita jako templát pro PCR screening. Byly syntetizovány dva vnitřní primery porA nazvané PPA1 a PPA2, které byly použity pro amplifikaci PCR u vařených bakteriálních lyzátů za podmínek popsaných výrobcem (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Bylo použito následujících teplotních cyklů: 25 x (94 °C 1 min, 52 °C 1 min, 72 °C 3 min) a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Protože proces crossing-over mezi DNA pCMK a místem chromosomu porA odstraní oblast vyžadovanou pro teplotní hybridizaci #1 a #2, klony postrádající amplifikační fragment 1170 bp z PCR byly selektovány jako deleční mutanty porA. Tyto výsledky PCR byly dále potvrzeny paralelní analýzou přítomnosti PorA v odpovídajících extraktech bakteriálních
4* ···· ···· ·· ·· • · · · • · 9 · · · • · · · ··· · proteinů. Pro tento účel byl další alikvot bakterií (odhadem 5x108 bacterií) resuspendován v 50 pl pufru PAGE-SDS (SDS 5%, glycerol 30%, beta-merkaptoethanol 15%, bromofenolová modř 0,3 mg/ml, trisHCI 250 mM pH 6,8), vařen (100 °C), zmrazen (-20 °C)/vařen (100 °C) třikrát, a byl dělen elektroforézou PAGE-SDS na 12,5 % gelu. Gely byly potom barveny barvivém Coomassie Brilliant blue R250 nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a testovány monoklonální protilátkou anti-PorA, jak se popisuje v Maniatis a další. Jak je uvedeno na obr. 4, jak barvení Coomassie, tak i barvení imunologického přenosu potvrdily, že porA PCR negativní klony neprodukují detekovatelně hladiny PorA. Tento výsledek potvrzuje, že vektor pCMK je funkční, a může být úspěšně použit pro směrování vkládání DNA do genu porA, přičemž současně se potlačí produkce proteinového antigenu vnější membrány PorA.
Příklad 4
Regulace ke zvýšení exprese proteinu vnější membrány NspA ve váčcích odvozených z rekombinantního kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího funkční geny porA a cps
Obohacování váčků ochrannými antigeny je výhodné pro zlepšování účinnosti a rozsahu pokrytí vakcín založených na proteinu vnější membrány. V této souvislosti byly zkonstruovány rekombinantní kmeny Neisseria meningitidis postrádající funkční geny cps a porA tak, že byla zvýšena míra exprese vnějšího membránového proteinu NspA. K tomuto účelu byl pomocí PCR amplifikován gen kódující NspA s použitím oligonukleotidových primerů N01 -full-A/del a Nde\-3’ (viz tabulka v příkladu 2). Pro amplifikaci PCR byly použity podmínky popsané dodavatelem (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Cyklování teploty bylo prováděno následovně: 25 x (94 °C 1 min, 52 °C 1 min, 72 °C 3 min), a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Odpovídající amplikon byl štěpen Ndel a vložen do • 0 000· < © 0 0 · ·
0·· 0 0 0 · ·
0 0 00 000
Q2 ··· · *· ·*·· ·· ···· restrikčního místa Nde\ dodávacího vektoru pCMK(+). Byla zkontrolována orientace inzertu a rekombinantní plasmidy označené pCMK(+)-NspA byly čištěny ve velkém měřítku s použitím soupravy QIAGEN maxiprep kit a 2 pg tohoto materiálu byly použity pro transformaci Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího funkčnígeny cps (kmen popsaný v příkladu 1). Integrace prostřednictvím děje crossing-over mezi vektorem pCMK(+)-NspA a místem chromosomu porA byly selektovány kombinací screeningu PCR a westernovým přenosem použitím postupů uvedených v příkladu 3,
Bakterie (v množství odpovídajícím přibližně 5 x 108 bakterií) byly resuspendovány v 50 pl pufru PAGE-SDS, zmrazený (-20 °C)/vařeny (100 °C) třikrát a potom byly děleny elektroforézou PAGE-SDS na 12,5% gelu. Gely byly potom barveny Coomassie Brilliant blue R250 nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a testovány polyklonálním sérem anti-NspA. Jak barvení Coomassie (údaje nejsou ukázány), tak i barvení imunologického přenosu (viz obr.
4) potvrdily, že porA PCR negativní klony neprodukují detekovatelné hladiny PorA. Exprese NspA byla testována vlyzátech celých bakterií (WCBL) nebo prostředků s váčky vnější membrány odvozenými od NmB (cps-, porA-) nebo NmB (cps-, porA-, Nspa+). Ačkoli při barvení Coomassie nebyl pozorovatelný žádný rozdíl, imunologický přenos s polyklonálním sérem anti-NspA detekoval tři až pětinásobné zvýšení exprese NspA (vzhledem k hladině endogenního NspA), jak v lyzátech celých bakterií, tak i v prostředcích s váčky vnější membrány (viz obr.
5) . Tento výsledek potvrzuje, že vektor pCMK(+)-NspA je funkční a může být úspěšně použit pro zvýšení exprese proteinů vnější membrány, jako je NspA, při současném snížení produkce antigenního proteinu vnější membrány PorA.
- 63 ·· ·· ·· ·· • · · · * «· ·
Příklad 5
Regulace proteinového antigenu vnější membrány D15/Omp85 ke zvýšení exprese ve váčcích odvozených z rekombinantního kmene
Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího funkční geny cps, ale exprimujícího PorA
Některé geograficky izolované lidské populace (jako například Kuba) jsou infikovány omezeným počtem izolátů Neisseria meningitidis, které z velké míry náleží k jednomu nebo několika sérotypům proteinů vnější membrány. Protože PorA je hlavní proteinový antigen vnější membrány indukující ochranné a pro kmen specifické baktericidní protilátky, je potom možné dosáhnout vakcínační ochrany použitím omezeného počtu sérotypů PorA ve vakcíně. V této souvislosti může být výhodná přítomnost PorA ve váčcích vnější membrány, protože zesiluje účinnost vakcíny těchto rekombinantně vylepšených váčků. Tyto vakcíny s obsahem PorA mohou být však ještě dále zlepšovány zvýšením hladiny jiných zkříženě reaktivních OMP, jako je omp85/D15.
V následujícím příkladu byl použit vektor pCMK(+) pro regulaci ke zvýšení exprese antigenního proteinu vnější membrány Omp85/D15 v kmeni postrádajícím funkční geny cps, ale exprimujícím porA. K tomuto účelu byl metodou PCR amplifikován gen kódující Omp85/D15 použitím oligonukleotidových primerů D15-A/del a D15Not\. Pro amplifikaci PCR byly použity stejné podmínky jako byly popsány dodavatelem (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Cyklování teploty bylo následující: 25 x (94 °C 1 min, 52 °C 1 min, 72 °C 3 min) a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Odpovídající amplikon byl vložen do klonovacího vektoru pTOPO podle specifikací výrobce a pro potvrzení bylo provedeno sekvenování. Tento fragment DNA Omp85/D15 byl vyříznut z pTOPO restrikční hydrolýzou použitím Nde\/Nsi\ a následně klonován do odpovídajících restrikčních míst dodávacího vektoru pCMK(+). Rekombinantní
plasmidy označené pCMK(+)-D15 byly čištěny ve velkém měřítku použitím soupravy QIAGEN maxiprep kit a 2 pg tohoto materiálu byly použity pro transformaci kmene Neissería meningitidis séroskupiny B postrádajícího funkční geny cps (kmen popsaný v příkladu 1). Pro zachování exprese porA, byla provedena selekce na integraci v důsledku jednoduchého crossing-overu (buď v Omp85/D15 nebo v porA) kombinací screeningových postupů PCR a westernového přenosu. Klony rezistentní na kanamycin, které byly pozitivně testovány porA-specifickou PCR a westernovým přenosem byly uchovávány při -70 °C jako zásobní roztoky v glycerolu a použity pro další studie.
Bakterie (odpovídající přibližně 5 x 108 bacteriím) byly resuspendovány v 50 μΙ pufru PAGE-SDS, zmrazený (-20 °C)/vařeny (100 °C) třikrát a potom byly odděleny elektroforézou PAGE-SDS na
12,5 % gelu. Gely byly potom obarveny Coomassie Brilliant blue R250 nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a testovány monoklonální protilátkou anti-porA. Jak je ukázáno na obr. 6, jak barvení Coomassie, tak i barvení imunologického přenosu ukázaly, že porA PCR positivní klony produkují PorA.
Exprese D15 byla testována použitím prostředků obsahujících váčky vnější membrány odvozené od NmB (cps-, porA-) nebo NmB (cps-, porA+, D15+). Barvení Coomassie detekovalo podstatné zvýšení exprese D15 (vzhledem k hladině endogenního D15), v prostředcích (viz obr. 6). Tento výsledek potvrdil, že vektor pCMK(+)-D15 je funkční a může být úspěšně použit pro regulaci ke zvýšení exprese proteinů vnější membrány jako je D15, aniž by se utlumila produkce hlavního proteinového antigenu vnější membrány PorA.
• ·
- 65 Příklad 6
Konstrukce univerzálních vektorů pro dodání promotorů
Princip: Princip tohoto přístupu je ukázán na obr. 7 a může být shrnut do sedmi nezbytných kroků. Některé z těchto kroků jsou ilustrovány dále na konstrukci vektoru pro regulaci ke zvýšení exprese NspA a D15/Omp85.
Vektor pro regulaci ke zvýšení exprese genu NspA
Krok 1: Oblast DNA (997 bp) umístěná proti směru transkripce vzhledem ke genu kódujícímu NspA byla objevena (SEQ. ID NO: 2) v privátní databázi Incyte PathoSeq obsahující nedokončené genomové sekvence DNA z Neisseria meningitidis kmen ATCC 13090. Byly navrženy dva oligonukleotidové primery označené jako PNS1 a PNS2 (viz tabulku v příkladu 2) s použitím této sekvence a byly syntetizovány. Tyto primery byly použity pro amplifikaci PCR použitím genomické DNA extrahované z kmene H44/76.
Krok 2: Odpovídající amplikony byly vyčištěny použitím soupravy Wizard PCR kit (Promega, USA) a štěpeny restrikčními enzymy EcoRI/Xbal 24 hod za podmínek popsaných dodavatelem (Boehrínger Mannheim, Německo). Odpovídající fragmenty DNA byly čištěny na gelu a vloženy do odpovídajících míst klonovacího vektoru pUC18.
Krok 3: Rekombinantní plasmidy byly připraveny ve velkém měřítku a alikvot byl použit jako templát pro inverzní amplifikaci PCR. Inverzní PCR byla prováděna použitím oligonukleotidů PNS4 a PNS5 a následujících podmínek teplotních cyklů: 25 x (94 °C 1 min, 50 °C 1 min, 72 °C 3 min) a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Byly získány linearizované vektory pUC18 nesoucí delecí v oblasti proti směru transkripce vzhledem k NspA.
• · · · ·· • · · · · · ·
Vektor pro řízení .exprese pro její zvýšení genu D15/omp85
Krok 1: Oblast DNA (1000 bp) umístěná proti směru transkripce vzhledem ke genu kódujícímu D15/omp85 (SEQ. ID NO: 3) byla objevena v soukromé databázi Incyte PathoSeq obsahující nedokončené sekvence genomové DNA kmene Neisseria meningitidis ATCC 13090. Byly navrženy a syntetizovány dva oligonukleotidové primery označené jako PromD15-51X a PromD15-S2 (viz tabulka v příkladu 2) na základě této sekvence. Tyto primery byly použity pro amplifikaci PCR použitím genomické DNA extrahované z kmene H44/76.
Krok 2: Odpovídající amplikony byly vyčištěny použitím soupravy Wizard PCR kit (Promega, USA) a vystaveny štěpení restrikčními enzymy EcoRA/Xbai 24 hod za podmínek popsaných dodavatelem (Boehringer Mannheim, Německo). Odpovídající fragmenty DNA byly čištěny na gelu a vloženy do odpovídajících míst klonovacího vektoru pUC18.
Krok 3: Rekombinantní plasmidy byly připraveny ve velkém měřítku a alikvot byl použit jako templát pro inverzní amplifikaci PCR. Inverzní PCR byla prováděna použitím oligonukleotidů D15-S4 a D15S5 za následujících podmínek cyklování teploty: 25 x (94 °C 1 min, 50 °C 1 min, 72 °C 3 min) a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Byly získány linearizované vektory pUC18 nesoucí deleci v inzertu proti směru transkripce, D15/omp85.
Příklad 7
Postupy fermentace pro přípravu rekombinantních váčků
Příklady uvedené dále popisují způsoby výroby rekombinantních váčků postrádajích buď obalové polysacharidy nebo obalové polysacharidy a PorA. Tento postup může být použit pro široké rozmezí rekombinantních kmenů Neisseria meningitidis a může být upraven pro provádění ve větším měřítku.
Kultivační média: Neisseria meningitidis séroskupiny B byla pomnožena v pevných (FNE 004 AA, FNE 010 AA) nebo kapalných (FNE 008 AA) kultivačních médiích. Tato nová média pro pěstování meningokoků jsou s výhodou prostá živočišných produktů, a jsou považována za další provedení vynálezu.
Složky FNE 004 AA FNE 008 AA FNE 010 AA
Agar 18 g/l - 18 g/l
NaCl 6 g/l 6 g/l 6 g/l
Glutaman sodný - 1,52 g/l -
NaH2PO4.2H2O 2,2 g/l 2,2 g/l 2,2 g/l
KCI 0,09 g/l 0,09 g/l 0,09 g/l
NH4CI 1,25 g/l 1,25 g/l 1,25 g/l
Glukóza 5 g/l 20 g/l 5 g/l
Kvasničný extrakt UF - 2,5 g/l -
Sojový pepton 5 g/l 30 g/l 5 g/l
CaCI2.2H2O 0,015 g/l - 0,015 g/l
MgSO4.7H2O 0,6 g/l 0,6 g/l 0,6 g/l
Erythromycin 0,015 g/l - -
Kanamycin - - 0,2 g/l
Kultivace rekombinantních váčků Neisseria meningitidis séroskupiny B cpsMetoda byla prováděna ve dvou stupních zahrnujících předkultivaci na pevném médiu a následnou kultivaci v kapalném médiu. Při předkultivaci na pevném médiu byla baňka očkovací kultury odstraněna z mrazicího boxu (-80 °C), ponechána roztát na laboratorní • · · · · · • ·
- 68 teplotu a 0,1 ml bylo rozetřeno na Petriho misku obsahující 15 ml média FNE004AA (viz výše). Petriho miska byla inkubována při 37 °C 18 ± 2 hod. Nárůst na povrchu byl resuspendován v 8 ml FNE008AA (viz výše) doplněném 15 mg/l erythromycinu. Při kultivaci v baňkách byly 2 ml resuspendované předkultury na pevném médiu přidány do dvoulitrové baňky obsahující 400 ml média FNE008AA doplněného 15 mg/l erythromycinu. Baňka byla umístěna na třepací desku (200 ot/min) a inkubována při 37 °C 16 ± 2 hod. Buňky byly z kultivačního média odděleny centrifugací při 5000 g při 4 °C 15 min.
Vsádková kultivace rekombinantních váčků Neisseria meningitidis séroskupiny B cpsTento postup byl prováděn ve třech stupních zahrnujících předkultivaci na pevném médiu, kultivaci v kapalném médiu a vsádkovou kultivaci. Při provádění předkultivace na pevné půdě byla lahvička s očkovacím materiálem vyjmuta z mrazicího boxu (-80 °C), ponechána roztát na laboratorní teplotu a 0,1 ml bylo rozetřeno na Petriho misku obsahující 15 ml FNE004AA (viz výše). Petriho miska byla inkubována při 37 °C 18 ± 2 hod. Nárůst na povrchu byl resuspendován v 8 ml média FNE008AA (viz výše) doplněného 15 mg/l erythromycinu. Při předkultivaci v kapalném médiu bylo přidáno 2 ml resuspendované předkultivce na pevné půdě do jedné dvoulitrové baňky obsahující 400 ml FNE008AA doplněného 15 mg/l erythromycinu. Baňka byla umístěna na třepací desku (200 ot/min) a inkubována při 37 °C 16 ± 2 hod. Obsah baňky byl použit pro zaočkování 20 litrového fermentoru. Při vsádkové kultivaci ve fermentoru bylo inokulum (400 ml) přidáno do předem vysterilizovaného fermentoru s celkovým objemem 20 I obsahujícího 10 I média FNE008AA doplněného 15 mg/l erythromycinu. pH bylo nastaveno na 7,0 a udržováno na této hodnotě automatickým přidáváním NaOH (25% hmotn./obj.) a H3PO4 (25% obj.). Teplota byla
······ · · ·♦ · * • · · · · · · • ·· ···· ·♦ · ·♦ · regulována na 37 °C. Rychlost vzdušnění byla udržována na 20 I vzduchu/minuta a koncentrace rozpuštěného kyslíku byla udržována na 20 % saturace řízením rychlosti míchání. Přetlak ve fermentoru byl udržován na 300 g/cm2 (30 kPa). Po 9 ± 1 hod byla kultura ve stacionární fázi. Buňky byly z kultivačního média odděleny centrifugací při 5000 g při 4 °C 15 min.
Kultivace rekombinantních váčků Neisseria meningitidis séroskupiny B cps-, PorATato kultivace byla prováděna ve dvou stupních zahrnujících předkultivaci na pevném médiu a potom kultivaci v kapalném médiu. Při kultivaci na pevném médiu byla lahvička s očkovací kulturou vyjmuta z mrazicího boxu (-80 °C), ponechána roztát na laboratorní teplotu a 0,1 ml bylo rozetřeno na Petriho misku obsahující 15 ml FNE010AA (viz výše). Petriho miska byla inkubována při 37 °C 18 ± 2 hod. Nárůst na povrchu byl resuspendován v 8 ml FNE008AA (viz výše) doplněného 200 mg/l kanamycinu. Při kultivaci v baňkách byly přidány 2 ml resuspendované předkultivace na pevném médiu do dvoulitrové baňky obsahující 400 ml média FNE008AA doplněného 200 mg/l kanamycinu. Baňka byla umístěna na třepací desku (200 ot/min) a inkubována při 37 °C 16 ± 2 hod. Buňky byly z kultivačního média odděleny centrifugací při 5000 g při 4 °C 15 min.
Příklad 8: Izolace a čištění váčků z meningokoků zbavených obalového polysacharidů
Rekombinantní váčky byly čištěny následujícím způsobem. Buněčná pasta (42 g) byla suspendována ve 211 ml pufru 0,1M Tris-CI pH 8,6 obsahujícího 10mM EDTA a 0,5% deoxycholát sodný (DOC). Poměr pufru k biomase byl 5/1 (obj./hmotn.). Biomasa byla extrahována magnetickým mícháním 30 min při laboratorní teplotě.
0 090 009
- 70 - 9 9 · · 09 0000 09 0000
Celkový extrakt byl potom centrifugován při 20 000 g 30 min při 4 °C (13 000 ot/min v rotoru JA-20, centrifuga Beckman J2-HS). Usazené buňky byly převedeny do odpadu. Supernatant byl ultracentrifugován při 125 000 g 2 hod při 4 °C (40 000 od/min v rotoru 50.2TÍ, ultracentrifuga Beckman L8-70M), aby se dosáhlo zakoncentrování váčků. Supernatant byl odlit. Usazenina byla opatrně resuspendována ve 25 ml 50mM pufru Tris-CI pH 8,6 s obsahem 2mM EDTA, 1,2% DOC a 20% sacharózy. Po druhé ultracentrifugaci při 125 000 g 2 hod při 4 °C byly váčky opatrně resuspendovány ve 44 ml 3% sacharózy a uchovávány při 4 °C. Všechny roztoky používané pro extrakci a čištění váčků obsahovaly 0,01 % thiomersalu. Jak je ukázáno na obr. 8, tento postup poskytne proteinové preparáty, které jsou vysoce obohacené na proteiny vnější membrány, jako je PorA a PorB.
Příklad 9
Identifikace bakteriálních promotorů vhodných pro regulaci genů kódujících antigeny pro zvýšení exprese
Použití prvků silných bakteriálních promotorů je nezbytné pro dosažení řízení exprese pro její zvýšení u genů kódujících proteiny vnější membrány. V této souvislosti autoři vynálezu již dříve ukázali, že regulace ke zvýšení exprese genů Neisseria meningitidis nspA, hsf, a omp85 s použitím promotoru porA umožnil izolovat rekombinantní váčky obohacené na odpovídající proteiny NspA, Hsf a Omp85. Alternativně k promotoru porA může být užitečné získat rozdílné úrovně zvýšení exprese, aby se předešlo potenciální změně fáze porA a/nebo aby se dosáhlo podmínečné exprese genu (promotory regulované železem). Na tomto místě popisují autoři vynálezu způsob umožňující identifikaci přesného místa počátku transkripce silných promotorových prvků, které pravděpodobně poskytnou vysokou míru exprese u bakterií. Protože regulační prvky promotoru jsou klasicky obsaženy v oblasti 200 bp proti směru transkripce a 50 bp ve směru
- 71 • · · · · · · · 9 • » · · r ♦ * · · ·· ·· · 9 · · • · · · r · · 9 * · · · • · · · · 9 · • · · 9999 99 9999 transkripce vzhledem k místu +1 (Collado-Vides J., Magasanik B., Gralla J. D., 1991, Microbiol. Rev. 55 (3): 371 - 94), důsledkem takového experimentu je možná identifikace fragmentů DNA o délce přibližně 250 bp nesoucích silné promotorové aktivity. Hlavní proteiny vnější membrány, jako jsou u Neisseria meningitidis PorA, PorB a Rmp, u Haemophilus influenzae P1, P2, P5 a P6, u Moraxella catarrhalis OmpCD, OmpE, stejně jako některé cytoplasmatické a/nebo železem regulované proteiny těchto bakterií, obsahují silné promotorové prvky. Pro ověření této obecné metodologie mapovali autoři vynálezu místo počátku transkripce silných promotorů Neisseria meningitidis porA a porB použitím metody rychlé amplifikace prvků cDNA (5’RACE).
Podstata metody 5’RACE je následující: 1) Extrakce celkové RNA s použitím soupravy QIAGEN „RNeasy“ Kit. Odstranění genomické DNA působením DNázy s následným čištěním podle postupu QIAGEN; 2) reverzní transkripce mRNA s primerem pro 3’konec specifickým pro porA (nazvaným porA3). Očekávaná velikost cDNA: 307 nukleotidů. Odstranění RNA alkalickou hydrolýzou;
3) Vložení jednořetězcové DNA oligonuleotidové ukotvovací sekvence (označené DT88) do 3’-konce cDNA použitím T4 RNAligázy. Očekávaná velikost produktu: 335 nukleotidů. Amplifikace cDNA s vloženou kotevní sekvencí použitím kombinace „hemi-nested“ PCR;
4) amplifikace PCR cDNA s vloženou ukotvovací sekvencí použitím ukotvovacího primeru s komplementární sekvencí jako primeru 5’konce (nazvaného DT89) a primeru 3’-konce (nazvaného p1-2), který je vnitřní vzhledem ke 3’-konci RT primeru porA3. Očekávaná velikost produktu: 292 bp; 5) amplifikace PCR předešlých produktů PCR s použitím DT89 jako primeru 5’-konce a p1 -1 jako primeru 3’-konce (vnitřní vzhledem k p1-2). Očekávaná velikost produktu: 211 bp; a
6) Sekvenování s primerem p1 -1 (očekávanou velikost produktu je možno vypočíst, protože je známo místo zahájení transkripce porA: 59 nukleotidů před místem zahájení translace „ATG“).
- 72 4 4 44 44 44 44 «44 4 *44 4 4 4 4
4444 4 · · 4 ·· · 4
4 444 444
444 4 44 4444 44 4444
Experimentální postup
Z přibližně 109 buněk Neisseria meningitidis séroskupiny B cpsporA+ byla extrahována celková RNA. Extrakce 1 ml kapalné kultury vhodné optické density (OD6oo = 1) byla provedena soupravou QIAGEN „RNAeasy“ kit podle doporučení výrobce. Chromosomální DNA byla odstraněna přidáním 10 U bezRNázové DNázy (Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) k 30 pl eluované RNA s inkubací 37 °C 15 min. RNA zbavená DNA byla čištěna stejnou soupravou QIAGEN podle doporučení výrobce.
Reakce reverzní transkripce byly prováděny použitím primeru porA3 a 200 U reverzní transkriptázy SUPERSCRIPT II (Life Technologies). Reakce RT byly prováděny v 50 pl objemu obsahujícím následující složky: 5 μΙ 2mM dNTP, 20 pmol primeru porA3, 5 μΙ 10 x pufru SUPERSCRIPT II, 9 μΙ 25mM MgCI2, 4 μΙ 0,1 M DTT, 40 U rekombinantního inhibitoru ribonukleáry a 1 μg celkové RNA. Primer porA3 byl teplotně hybridizován postupně (70 °C 2 min, 65 °C 1 min, 60 °C 1 min, 55 °C 1 min, 50 °C 1 min, a 45 °C 1 min) před přidáním SUPERSCRIPT II. Reakce RT byla prováděna při 42 °C 30 min, a byla následována 5 cykly (50 °C 1 min, 53 °C 1 min a 56 °C 1 min) pro destabilizaci sekundární struktury RNA. Byly prováděny dvě paralelní reakce, přičemž v jedné byla vynechána reverzní transkriptáza pro získání negativní kontroly.
RNA byla odstraněna štěpením alkalickou hydrolýzou s přídavkem 1 μΙ 0,5M EDTA a následně 12,5 μΙ 0,2M NaOH, před inkubací při 68 °C 5 min. Reakce byla neutralizována přidáním 12,5 μΙ 1M Tris-HCI (pH 7,4) a vysrážena přidáním 20 pg glykogenu (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Německo), 5 μΙ 3M octanu sodného a 60 μΙ isopropanolu. Oba vzorky byly resuspendovány ve 20 μΙ pufru TE 10 : 1 (10mM Tris-HCI, pH 7,4; 1mM EDTA, pH 8).
- 73 • φ • «•Φ φφ φφ φφ φφ • φ φ φ ♦ φφ · φ φ φφφ · • · · φ φ · φ φ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφφφ
Pro ukotvení kotevního oligonukleotidu DT88 (viz tabulka níže), který byl fosforylován na 5’-konci a blokován ddCTP na 3’-konci byla použita T4-RNAIigáza. Byly provedeny dvě paralelní ligace přes noc při laboratorní teplotě, přičemž každá reakce obsahovala: 1,3 μΙ pufru 10 x pro RNAligázu (Roche Molecular Biochemicals), 0,4 μΜ DT88, 10 μΙ buď cDNA nebo RT kontrolního vzorku a 3 U T4 RNAligázy. Jako negativní kontroly byla provedena druhá sada ligačních reakcí s vynecháním T4 RNAligázy. Získané ligační reakční směsi směsi byly použity přímo bez čištění při následné PCR.
cDNA s navázanou ukotvovací oblastí byla amplifikována použitím kombinace PCR typů „hemi-nested“ a „hot-started“ pro zvýšení specificity a výtěžku produktu. Na reakčních směsích RT/ligáza byly provedeny Čtyři oddělené PCR prvního stupně a kontroly v objemu 30 μΙ, vždy s obsahem: 3 μΙ pufru 10 x Taq Platinium, 3 μΙ 25mM MgCI2, 1 μΙ 10mM dNTP, 10 pmol každého z primerů a 1 μΙ odpovídající ligační reakční směsi RNA. PCR byla zahájena za horka použitím DNA polymerázy Taq Platinium (Life Technologies) (přidány 2 U). První ligačně ukotvená PCR (ligationanchored PCR, LA-PCR) byla provedena použitím 10 pmol jak primeru DT89 specifického pro ukotvovací oblast, tak i primeru p1-2 specifického pro transkript (viz tabulka níže), který je vnitřní vzhledem k 3’-konci RT primeru porA3. PCR byla prováděna použitím počátečního kroku 95 °C 5 min (pro aktivaci DNA polymerázy) s následnými 10 cykly při 90 °C 10 s a 70 °C 1 min (snižováno 1 stupeň na cyki), 15 cyklů při 90 °C 10 s a 60 °C 1 min. Druhá „heminested“ LA-PCR byla provedena za stejných podmínek s použitím primeru DT89 a vnitřního primeru p1-2, spolu s 10 pmol p1-1 (viz tabulka níže) a 1 μΙ PCR prvního stupně. Amplifikační produkty byly vyčištěny použitím soupravy QIAGEN „QIAquick PCR purification“ kit podle instrukcí výrobce před provedením sekvenování.
Pro sekvenování produktů RACE PCR byl použit kit CEQ™ Dye
Terminátor Cycle Sequencing kit (Beckman, Francie) s použitím
- 74 • · ·· ·· ·· ·· «· · · · * ♦ ♦ ♦ · 9 ····♦♦» · · * · · · • · » · · ·9· • · · · »· · · · · · * · · 9 · pmol primeru p1-1. Sekvenační reakce byly prováděny podle poskytnutých instrukcí a sekvenační produkty byly analyzovány na analytickém systému Ceq2000 DNA Analysis System (BeckmanCoulter).
DT88 5'GAAGAGAAGGTGGAAATGGCGTTTTGGC3'
DT89 5'CCAAAACGCCATTTCCACCTTCTCTTC3'
porA3 5'CCAAATCCTCGCTCCCCTTAAAGCC3'
p1 -2 5'CGCTGATTTTCGTCCTGATGCGGC3'
p1-1 5'GGTCAATTGCGCCTGGATGTTCCTG3'
Výsledky pro promotor porA Neisseria meningitidis
Počátek transkripce porA-mRNA pro Neisseria meningitidis séroskupiny B (kmen H44/76) byl mapován do místa 59 bp proti směru transkripce vzhledem k startovacímu kodonu ATG použitím popsaného postupu 5’-RACE. Výsledek potvrzuje mapování provedené prodloužením primeru a publikované van der Endem a dalšími (1995). Tento výsledek podporuje myšlenku, že fragment DNA obsahující nukleotidy -9 až -259 vzhledem k porA ATG je vhodný pro dosažení silné exprese genu v Neisseria meningitidis a pravděpodobně i v dalších druzích bakterií, jako je Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
Výsledky pro promotor porB Neisseria meningitidis
Stejná experimentální strategie byla použita pro mapování místa zahájení transkripce porB u Neisseria meningitidis séroskupiny B (kmen H44/76). Primery uvedené v následující tabulce odpovídají 3’konci primeru RT (porB3), primeru specifickému pro transkript, který je vnitřní vzhledem k porB3 (porB2) a vnitřní vzhledem k porB2 (porB1).
- 75 porB3, porB2 a porB1 jsou umístěny 265 bp, 195 bp, popřípadě
150 bpve směru transkripce vzhledem ke startovacímu kodonu ATG.
• · ·♦ ·♦ ·· ·· fl·· * · · fl «flflfl
A · · · ♦ fl · · * fl ···· fl · · * * · · φ • A A·· Aflfl • AA · A· flfl·· ·« ···♦
porBI 5'GGTAGCGGTTGTAACTTCAGTAACTT3'
porB2 5'GTCTTCTTGGCCTTTGAAGCCGATT3'
porB3 5'GGAGTCAGTACCGGCGATAGATGCT3'
Použitím primerů porB1 a DT89 byl získán amplikon PCR o délce přibližně 200 bp provedením mapování 5’-RACE. Protože porB1 je umístěn 150 bp od startovacího kodonu ATG porB tento výsledek podporuje myšlenku, že místo zahájení transkripce porB je umístěno přibližně 50 bp (± 30 bp) proti směru transkripce vzhledem k porB ATG.
Přesný nukleotid odpovídající počátku transkripce se v současnosti zjišťuje sekvenováním DNA. Výše uvedený výsledek PCR podporuje domněnku, že fragment DNA obsahující nukleotidy -1 až -250 vzhledem ke startovacímu kodonu ATG porB je vhodný pro řízení silné genové exprese v Neisseria meningitidis a pravděpodobně i v jiných bakteriálních druzích, jako je Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
Příklad 10
Regulace pro zvýšení exprese genu Omp85 N. meningitidis séroskupiny B náhradou promotoru
Cílem tohoto experimentu bylo nahradit endogenní promotorovou oblast genu D15/Omp85 silným promotorem porA s cílem řídit produkci antigenu D15/Omp85 ke zvýšení exprese . Pro tento účel byl zkonstruován plasmid pro náhradu promotoru s použitím metod pro klonování E. coli. Oblast DNA (1000 bp) umístěná proti
- 76 44 4
4444
44 44 44
44 4 4 44 4
4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4
4· 4444 4· 4444 směru transkripce vzhledem ke kódujícímu genu D15/omp85 byla objevena (SEQ ID NO: 3) v soukromé databázi Incyte PathoSeq obsahující neukončené sekvence genomových DNA kmene Neisseria meningitidis ATCC 13090. Hlavní kroky tohoto postupu jsou znázorněny v obr. 9. Ve stručnosti, fragment DNA (1000 bp) pokrývající nukleotidy -48 až -983 vzhledem ke startovacímu kodonu (ATG) genu D15/Omp85 byl amplifikován PCR použitím oligonukleotidů ProD15-51X (5'-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC GTT G-3') a ProD15-52 (5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3') obsahujících restrikční místa EcoRI, popřípadě Xba\ (podtržená). Tento fragment byl restrikčně štěpen a vložen do plasmidu pUC18 štěpeného stejnými enzymy. Získaný konstrukt byl vystaven mutagenezí in vitro použitím soupravy Genome Priming systém (s použitím donorového plasmidu pGPS2), komerčně dodávané firmou New England Biolabs (MA, USA). Byla provedena selekce kmenů s vloženým minitransposonem (odvozeným od Tn7 a nesoucím gen rezistence na chloramfenikol). Byl izolován a pro další studie použit jeden klon obsahující vložený minitransposon umístěný v 5’obklopující oblasti d15/Omp85, 401 bp ve směru transkripce vzhledem k místu EcoRI. Tento plasmid byl vystaven kruhové PCR mutagenezí (Jones & Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528 - 534) s cílem (i) odstranit opakující se sekvenci DNA (Tn7R) vytvořenou transkripčním procesem, (ii) vložit sekvence pro příjem meningokoků nutné pro transformaci, a (iii) vložit vhodná restrikční místa umožňující klonování cizího materiálu DNA, jako jsou promotory. Kruhová PCR byla prováděna použitím TnRD15-Kpnl/Xbal+US (5'-CGC CGG TAC CTC TAG AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACA ACC C-3') a TnR03Cam(Kpnl) (5'-CGC CGG TAC CGC CGC TAA CTA TAA CGG TC-3') oligonukleotidů obsahujících příjmové sekvence a vhodná restrikční místa (Kpn\ a Xba\, podtrženo). Výsledný fragment PCR byl čištěn na gelu, štěpen Asp718 (isoschizomer KpnV) a vložen do fragmentu 184 bp DNA obsahujícího promotor porA a vytvořeného
- 77 • 4 44 44 ·4 44
4 4444 444 • 4 · 44 4 4 4 • 44·· 4 4 · 444» « · ··· · 4 4
444 4 44 4444 4« ···
PCR s použitím oligonukleotidů PorA-01 (5'-CGC CGG TAC CGA GGT CTG CGC TTG AAT TGT G-3') a PorA02 (5'-CGC CGG TAC CTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') obsahujících restrikční místa Kpn\. Byla provedena selekce rekombinantních klonů nesoucích promotor porA ve správné orientaci (transkripce probíhá ve směru od EcoRI k Xbal), které byly použity pro transformaci kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího obalový polysacharid (cps-) a jeden z hlavních proteinů vnější membrány PorA (porA-). Rekombinantní klony Neisseria meningitidis vzniklé dvojitým crossingoverem (screening PCR použitím oligonukleotidů Cam-05 (5'-GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3') a proD15-52) byly selektovány na médiu GC obsahujícím 5 pg/ml chloramfenikolu a byly analyzovány na expresi D15/Omp85. Jak je ukázáno na obr. 10, produkce D15/Omp85 byla podstatně zvýšena v celkových proteinových extraktech kmenů Nm pocházejících z náhrady promotoru ve srovnání s rodičovským kmenem (cps-). Tento výsledek byl také pozorován při analýze váčků vnější membrány připravených ze stejných kmenů (viz obr. 17). Tyto výsledky je možno připisovat náhradě endogenního promotoru D15 silným promotorem porA. Navíc bylo překvapivě zjištěno, že exprese byla v případě, kdy byl promotor porA vložen přibližně 400 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu, přibližně 50 x vyšší než v případě, kdy byl promotor umístěn do vzdálenosti přibližně 100 bp proti směru transkripce. Tyto experimenty také podporují přesvědčení, že strategie náhrady promotoru funguje a umožní řízení pro zvýšení syntézy vnějších integrálních membránových proteinů ve váčcích vnější membrány.
Některé geograficky izolované lidské populace (jako například Kuba) jsou infikovány omezeným počtem izolátů Neisseria meningitidis náležejících z větší části k jednomu nebo několika typům proteinů vnější membrány. Protože PorA je hlavním proteinovým antigenem vnější membrány, který může indukovat ochranné a pro kmen specifické baktericidní protilátky, může být možné propůjčit vakcíně
• 0 • 0 0 0 0 0 00 0 · • 0 0 0 00 0 0
0 ···· 0 · 0 0 0 0 • 0
• · 00 0 0 0 0« 0 • 000 • 0 0 0 0 00 00
schopnost ochrany v takových populacích použitím omezeného počtu sérotypů PorA. Navíc může PorA interagovat s nebo stabilizovat některé další proteiny vnější membrány. V této souvislosti může být výhodná přítomnost PorA ve váčcích vnější membrány, protože zvyšuje vakcínační účinnost těchto rekombinantním způsobem zlepšených váčků.
Z tohoto důvodu může být žádoucí regulovat expresi vnějšího membránového proteinu D15/Omp85 směrem ke zvýšení exprese v kmenu Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícím funkční geny cps, ale exprimujícím PorA. Genomická DNA byla extrahována z rekombinantního kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B cps-, porA-, D15/Omp85+ s použitím soupravy QIAGEN Genomic Tips 100G kit. 10 pg tohoto materiálu bylo linearizováno a použito pro transformaci Neisseria meningitidis séroskupiny B cps- podle klasického protokolu transformace. Rekombinantní Neisseria byla získána na agarových plotnách GC obsahujících 5 pg/ml chloramfenikolu.
Integrace pocházející z dvojitého crossing-overu proti směru transkripce genu D15 byla testována PCR, jak bylo popsáno dříve. Protože homologní rekombinace se mohou vyskytnout kdekoli v chromosomu, byl proveden druhý screening PCR pro kontrolu integrity místa porA v rekombinantním kmenu. K tomu účelu byly použity vnitřní primery porA PPA1 (5-GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3') a PpA2 (5-GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3') při experimentu PCR screeningu. Amplifikace fragmentu 1170 bp potvrzuje přítomnost genu porA v rekombinantní bakterii.
Rekombinantní bakterie (množství odpovídající přibližně 5 x 108 bakterií) mohou být resuspendovány v 50 μΙ pufru PAGE-SDS, zmrazený (-20 °C)/vařeny (100 °C) třikrát a potom děleny elektroforézou PAGE-SDS na 12,5% gelu. Gely potom mohou být barveny Coomassie Brilliant blue R250 nebo převedeny na »4 44 44 4«
44 4 4 44 4
- 79 4 4 4 4 · 4 4
4 4 4 4 4
4· 4444 44 4444 nitrocelulózovou membránu a testovány buď monoklonální protilátkou anti-porA nebo králičí polyklonální protilátkou anti-D15/Omp85. Může být také provedena analýza váčků vnější membrány připravených ze stejných kmenů.
Příklad 11
Regulace pro zvýšení exprese proteinového antigenu Hsf v rekombinantním kmenu Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícím funkční geny cps, ale exprimujícím PorA
Jak je uvedeno výše, v některých zemích může být přítomnost PorA ve váčcích vnější membrány výhodná a může zesilovat účinnost vakcíny založené na zlepšených rekombinantních váčcích.
V následujícím příkladu používali autoři vynálezu modifikovaný vektor pCMK(+) pro regulaci pro zvýšení exprese proteinového antigenu Hsf v kmenu postrádajícím funkční geny cps, ale exprimujícím PorA. Původní vektor pCMK(+) obsahuje chimérní promotor porA/lacO reprimovaný v hostitelské E. coli exprimující laclq, ale transkripčně aktivní v Neisseria meningitidis. V modifikovaném pCMK(+) byl použit nativní promotor porA pro řízení transkripce genu hsf. Gen kódující Hsf byl amplifikován PCR použitím oligonukleotidových primerů HSF01Λ/ďel a HSFOŽ-A/ňel, které jsou uvedeny v následující tabulce.
V důsledku sekvence primeru HSF01-A/del bude exprimovaný protein Hsf obsahovat dva methioninové zbytky na 5’-konci. Pro amplifikaci PCR byly použity podmínky popsané dodavatelem (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Teplotní cyklování bylo následující: 25 x (94 °C 1 min, 48 °C 1 min, 72 °C 3 min) a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Odpovídající amplikon byl potom klonován do odpovídajících restrikčních míst dodávacího vektoru pCMK(+).
V tomto rekombinantním plasmidu označeném pCMK(+)-Hsf byl vypuštěn lacO přítomný v chimérním promotoru porA/lacO strategií • · fcft ·· ·· 19 • · « ···· · ·
- 80 1 1111 111 1111 · • · · · 9 119
111 1 11 1991 19 119 rekombinantní PCR (viz obr. 12). Plasmid pCMK(+)-Hsf byl použit jako templát pro amplifikací dvou oddělených fragmentů DNA PCR:
-fragment 1 obsahuje 5’rekombinogenní oblast porA, gen rezistence na kanamycin a promotor porA. Použité oligonukleotidové primery, RP1 (Sacll) a RP2, jsou ukázány v následující tabulce. Primer RP1 je homologni se sekvencí právě proti směru transkripce vzhledem k operátoru lac.
-fragment 2 obsahuje Shine-Dalgarnovu sekvenci genu porA, gen hsf a 3’rekombinogenní oblast porA. Použité oligonukleotidové primery, RP3 a RP4 (Apal), jsou uvedeny v následující tabulce. Primer RP3 je homologni sekvenci právě ve směru transkripce vzhledem k operátoru lac. 3’-konec fragmentu 1 a 5’-konec fragmentu 2 obsahují 48 překrývajících se bází. Pro konečnou reakci PCR použitím primerů RP1 a RP4 bylo použito 500 ng z každé PCR (1 a 2). Konečný získaný amplikon byl subklonován do vektoru pSL1180 štěpeného enzymy Sacll a Apal. Modifikovaný plasmid pCMK(+)-Hsf byl ve velkém měřítku čištěn pomocí soupravy QIAGEN maxiprep kit a 2 pg tohoto materiálu byly použity pro transformaci kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího funkční geny cps (kmen popsaný v příkladu 1). Pro uchování exprese porA byla provedena selekce integrace pocházející z jediného děje crossing-over kombinací postupů PCR a westernového přenosu. Klony rezistentní na kanamycin testované pozitivně PCR specifickou pro porA a westernovými přenosy byly uchovávány při -70 °C ve formě zásobních roztoků v glycerolu a použity pro další studie. Bakterie (množství odpovídající přibližně 5 x 108 bakterií) byly resuspendovány v 50 pl pufru PAGE-SDS, zmrazený (-20 °C)/vařeny (100 °C) třikrát a potom byly odděleny elektroforézou PAGE-SDS na 12,5% gelu. Exprese Hsf byla vyšetřována v lyzátech úplných bakteriálních buněk (WCBL) odvozených z NmB (Cps-, PorA+) nebo NmB (Cps-, PorA+, Hsf+). Barvení Coomassie detekovalo podstatné zvýšení exprese Hsf (vzhledem k endogenní hladině Hsf) (viz obr. 13). Tento výsledek potvrzuje, že modifikovaný vektor
- 81 • 0 0000 «0 00 ·· »· • 00 0 · 0 0 ·
0 0 0 0 ·
000 0000 0 • 0 000 000
000 0 00 0000 00 0000 pCMK(+)-Hsf je funkční a může být úspěšně použit pro regulaci ke zvýšení exprese proteinů vnější membrány, aniž by se zastavila produkce hlavního proteinového antigenu vnější membrány PorA.
Oligonukleotidy používané při těchto experimentech
Oligonukleotidy Sekvence Poznámky
Hsf01-Nde 5'-GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAA AAT ATA CCG C-3' Klonovací místo Ndei
Hsf02-Nhe 5'-GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACT GAT AAC CGA C-3' Klonovací místo Nhei
GFP-mut-Asn 5'-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3' Klonovací místo Asnl kompatibilní s Ndei
GFP-Spe 5'-GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG-3' Klonovací místo Spěl kompatibilní s Nhei
RP1 (Sacll) 5'-TCC CCG CGG GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC-3' Klonovcí místo Sacll
RP2 5'-CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA GGG CAA ACA CCC GAT ACG TCT TCA-3'
RP3 5'-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG-3'
RP4 (Apal) 5'-GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGA CGG CGC AGC AGG-3' Klonovcí místo Apal
Příklad 12
Exprese zeleně fluoreskujícího proteinu Green Fluorescent Protein v rekombinantním kmenu Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícím funkční geny cps, ale exprimujícím PorA
V následujícím příkladu byl použit vektor pCMK pro testování exprese cytoplasmatického heterologního proteinu v Neisseria
• fc ·· fc • ·· • •fc • fc • fc a • ·· • · •
• fcfcfc* · • • • • · • •
• * • • a • • •
··· · ·· «•fcfc • · • · a ·
meningitidis. Zeleně fluoreskující protein (Green Fluorescent Protein) byl amplifikován z plasmidu pKen-Gfpmut2 s použitím primerů GFPAsnmut2 a GFP-Spe (viz tabulka v příkladu 11). Asnl poskytuje kohesivní konce kompatibilní s Ndei, Spei poskytuje kohesivní konce kompatibilní s Nhei. Pro amplifikaci PCR byly použity podmínky popsané dodavatelem (HiFi DNA polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH). Cyklování teploty bylo následující: 25 x (94 °C 1 min, 48 °C 1 min, 72 °C 3 min) a 1 x (72 °C 10 min, 4 °C až do izolace). Odpovídající amplikon byl následně klonován do dodávacího vektoru pCMK(+) štěpeného restrikčními enzymy Ndei a Nhe\. V tomto rekombinantním plasmidu označeném pCMK(+)-GFP byl vypuštěn lacO přítomný v chimérním promotoru porA/lacO strategií rekombinantní PCR. Plasmid pCMK(+)-GFP byl použit jako templát pro PCR amplifikaci dvou oddělených fragmentů DNA:
-fragment 1 obsahoval 5’ rekombinogenní oblast porA, gen rezistence na kanamycin a promotor porA. Jako oligonukleotidové primery byly použity RP1 (Sacll) a RP2 (viz tabulka v příkladu 11). Primer RP1 je homologní se sekvencí právě proti směru transkripce vzhledem k lac operátoru.
-fragment 2 obsahuje PorA Shine-Dalgarnovu sekvenci, gen gfp a 3’ rekombinogenní oblast porA. Použité oligonukleotidové primery RP3 a RP4 (Apal) jsou přítomny v tabulce v příkladu 11. Primer RP3 je homologní se sekvencí právě ve směru transkripce vzhledem k lac operátoru.
3’-konec fragmentu 1 a 5’-konec fragmentu 2 mají 48 překrývajících se bází. 500 ng z každé PCR (1 a 2) bylo použito pro konečnou reakci PCR s použitím primerů RP1 a RP4. 20 pg tohoto fragmentu PCR bylo použito pro transformaci kmene Neissería meningitidis séroskupiny B postrádajícího funkční geny cps.
Transformace lineární DNA je méně účinná než transformace kruhovou plasmidovou DNA, ale u všech získaných rekombinantů
• · ··
• · • • • · 9 • •
• ···· • · • • · • •
• · 4 • • « • •
«· · ·· «··· ·· ·♦·
došlo ke dvojitému crossing-overu (potvrzeno kombinací screeningových postupů PCR a westernového přenosu). Klony rezistentní na kanamycin byly uchovávány při -70 °C jako glycerolové zásobní roztoky a byly používány pro další studie. Bakterie (množství odpovídající přibližně 5 χ 108 bakterií) byly resuspendovány v 50 pl pufru PAGE-SDS, zmraženy (-20 °C)/vařeny (100 °C) třikrát a potom byly děleny elektroforézou PAGE-SDS na 12,5% gelu.
Exprese GFP byla testována v lyzátech úplných bakteriálních buněk (WCBL) odvozených od NmB (Cps-, PorA+) nebo NmB (Cps-, PorA-, GFP+). Barvení Coomassie detekovalo expresi GFP, která nebyla přítomná v recipientním kmenu Neisseria meningitidis (viz obr. 14).
Příklad 13
Regulace ke zvýšení exprese genu NspA N. meningitidis séroskupiny
B náhradou promotoru
Cílem tohoto experimentu bylo nahradit endogenní promotorovou oblaast genu NspA silným promotorem porA, aby bylo možno regulovat produkci antigenu NspA směrem ke zvýšení exprese. K tomuto účelu byl zkonstruován plasmid pro náhradu promotoru s použitím metod klonování E. coli. Byla objevena oblast DNA (924 bp) umístěná proti směru transkripce vzhledem ke kódujícímu genu NspA (SEQ ID NO: 7) v soukromé databázi Incyte PathoSeq obsahující nedokončené genomové sekvence DNA kmene Neisseria meningitidis ATCC 13090. Fragment DNA (675 bp) pokrývající nukleotidy -115 až -790 vzhledem ke startovacímu kodonu genu NspA (ATG) byl amplifikován PCR použitím oligonukleotidů PNS1’ (5’-CCG CGA ATT CGA CGA AGC CGC CCT CGA C-3’) a PNS2 (5’-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3’) obsahujících štěpící místa EcoRI a Xba\ (podtržená). Fragment PCR byl štěpen EcoRI a Xba\ a vložen do pUC18. Tento plasmid byl vystaven kruhové mutagenezi PCR (Jones & Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528 - 534) s cílem vložit příjmové meningokokové sekvence nutné pro transformaci a vhodná restrikční místa umožňující klonování promotorové kazety CmR/PorA. Kruhová PCR byla provedena použitím oligonukleotidů BAD01-2 (5’GGC GCC CGG GCT CGA GCT TAT CGA TGG AAA ACG CAG C-3’) a BAD02-2 (5 -GGC GCC CGG GCT CGA GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT AGT GGA TTA AC-3’) obsahujících příjmové sekvence a vhodná restrikční místa (Xmal a Xhol), která jsou podtržena. Získaný fragment PCR byl čištěn na gelu a štěpen Xhol. Promotorová kazeta CmR/PorA byla amplifikována z dříve popsaného plasmidu pUC D15/Omp85 s použitím primerů BAD 15-2 (5’-GGC GCC CGG GCT CGA GTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’) a BAD 03-2 (5’GGC GCC CGG GCT CGA GCA CTA GTA TTA CCC TGT TAT CCC3’) obsahujících vhodná restrikční místa (Xmal, Xbal, Spěl a Xhol), která jsou podtržena. Získaný fragment PCR byl štěpen a vložen do kruhového plasmidu PCR rozštěpeného odpovídajícími enzymy. 10 pg rekombinantního plasmidu bylo linearizováno a použito pro transformaci kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícího kapsulární polysacharid (cps-) a jeden z hlavních proteinů vnější membrány - PorA (porA-). Rekombinantní klony Neisseria meningitidis pocházející z události dvojitého crossing-overu (PCR screening použitím oligonukleotidů BAD 25 (5’-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3’) a BAD08 (5’-CTT AAG CGT CGG ACA TTT CC3’)) byly selektovány na agarových plotnách GC obsahujících 5 pg/ml chloramfenikolu a byly analyzovány na expresi NspA. Rekombinantní bakterie (odpovídající přibližně 5 χ 108 bakterií) byly resuspendovány v 50 pl pufru PAGE-SDS, zmraženy (-20 °C)/vařeny (100 °C) třikrát a potom byly děleny elektroforézou PAGE SDS na 12,5% gelu. Gely byly potom barveny Coomassie Brilliant blue R250 nebo převedeny na nitrocelulózovou membránu a testovány buď monoklonální protilátkou anti-PorA nebo polyklonální protilátkou anti-NspA (obr. 17). Jako v případě Omp85 bylo překvapivě ukázáno, že vložení promotoru • · • · přibližně 400 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu NspA poskytne větší expresi proteinu, než při umístění do vzdálenosti přibližně 100 bp proti směru transkripce.
Stejný rekombinantní plasmid pUC může být použit pro regulaci ke zvýšení exprese NspA v kmenu Neisseria meningitidis séroskupiny B postrádajícím funkční gen cps, ale stále ještě exprimující PorA.
Příklad 14
Regulace pro zvýšení exprese genu pldA (omplA} N. meningitidis séroskupiny B náhradou promotoru
Účelem tohoto experimentu bylo nahradit endogenní promotorovou oblaast genu pldA (omplA) silným promotorem porA s cílem dosáhnout zvýšení produkce antigenu PldA (OmplAI). K tomuto účelu byl zkonstruován plasmid pro náhradu promotoru s použitím metod klonování E. coli. Byla objevena oblast DNA (373 bp) umístěná proti směru transkripce vzhledem ke kódující sekvenci pldA (SEQ ID NO: 18) v soukromé databázi Incyte PathoSeq kmene Neisseria meningitidis ATCC 13090. Tato DNA obsahuje sekvenci kódující domnělý gen rpsT. Stop kodon rpsT je umístěn 169 bp proti směru transkripce vzhledem k ATG pldA. Pro zabránění poškození tohoto potenciálně důležitého genu se autoři vynálezu rozhodli vložit promotorovou kazetu CmR/PorA právě proti směru transkripce vzhledem k ATG genu pldA. K tomuto účelu byl amplifikován fragment DNA o délce 992 bp odpovídající genu rpsT, intergenní sekvence 169 bp a prvních 499 nukleotidů genu pldA amplifikován PCR z genomové DNA Neisseria meningitidis séroskupiny B použitím oligonukleotidů PLA1 Amo5 (5’-GCC GTC TGA ATT TAA AAT TGC GCG TTT ACA G-3’) a PLA1 Amo3 (5’-GTA GTC TAG ATT CAG ACG GCG CAA TTT GGT TTC CGC AC-3’) obsahujících příjmové sekvence (podtrženy). PLA1 Amo3 obsahuje také restrikční místo Xba\. Tento fragment PCR byl vyčištěn soupravou High Pure Kit (Roche,
Mannheim, Německo) a přímo klonován do vektoru pGemT (Promega, USA). Tento plasmid byl vystaven mutagenezi kruhovou PCR (Jones & Winistofer, 1992) s cílem vložit vhodná restrikční místa umožňující klonování promotorové kazety CmR/PorA. Kruhová PCR byla provedena použitím oligonukleotidů CIRC1-Bgl (5’CCT AGA TCT CTC CGC CCC CCA TTG TCG-3’) a buď CIRC1-XH-RBS/2 (5’-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G3’) nebo CIRC2-XHO/2 (5’-CCG CTC GAG ATG AAT ATA CGG AAT3’) obsahujících vhodná restrikční místa (Sg/ll a Xhol), která jsou podtržena. Promotorové kazeta CmR/PorA byla amplifikována z dříve popsaného plasmidu pUC D15/Omp85 s použitím primerů BAD20 (5’TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’) a CM-PORA-3 (5’-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GC-3’) obsahujících vhodná restrikční místa (Bg/ll a Xhol) (podtržená). Tento fragment PCR byl klonován do kruhového plasmidu PCR získaného použitím primerů CIRC1-Bgl a CIRC1-XH-RBS/2. Tento plasmid může být použit pro transformaci kmenů Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-) a (cps- porA-). Integrace procesem dvojitého crossing-overu v oblasti proti směru transkripce vzhledem k pldA směruje vložení promotoru porA přímo proti směru transkripce vzhledem ke kodonu ATG pldA. Další kazeta byla amplifikována z genomické DNA rekombinantní bakterie Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-, porA-, D15/Omp85+) s nadměrnou expresí D15/Omp85 náhradou promotoru. Tato kazeta obsahuje gen cmR, promotor porA a 400 bp odpovídajících 5’ obklopující oblasti genu D15/Omp85. Ukázalo se, že tato sekvence je účinná pro regulaci ke zvýšení exprese D15/Omp85 v bakterii Neisseria a bude provedeno testování na regulaci ke zvýšení exprese dalších antigenů Neisseria. Pro amplifikaci byly použity primery BAD 20 a CM-PORA-D15/3 (5’CGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3’) obsahující restrikční místa Xhol (podtrženo). Tento fragment PCR byl klonován do kruhového plasmidu PCR získaného použitím primerů CIRC1-Bgl a
CIRC2-XHO/2. Tento plasmid byl použit pro transformaci kmenů Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-) a (cps-, porA-). Integrace pomocí dvojitého crossing-overu v oblasti proti směru transkripce vzhledem k pldA nasměruje vložení promotoru porA do oblasti 400 bp proti směru transkripce vzhledem k ATG pldA.
Příklad 15
Regulace ke zvýšení exprese genu tbpA N. meningitidis séroskupiny B náhradou promotoru
Cílem tohoto experimentu bylo nahradit endogenní promotorovou oblast genu tbpA silným promotorem porA s cílem dosáhnout regulaci ke zvýšení produkce antigenu TbpA. Pro tento účel byl zkonstruován plasmid pro náhradu promotoru použitím metod klonování E. coli. Oblast DNA (731 bp) umístěná proti směru transkripce vzhledem ke kódující sekvenci tbpA byla objevena (SEQ ID NO: 17) v soukromé databázi Incyte PathoSeq kmene Neisseria meningitidis ATCC 13090. Tato DNA obsahuje sekvenci kódující antigen TbpB. Geny jsou organizovány v operonu. Gen tbpB bude odstraněn a nahrazen promotorovou kazetou CmR/porA. K tomuto účelu byla nejprve provedena amplifikace PCR fragmentu DNA 3218 bp odpovídajícího 5’ obklopující sekvenci 509 bp genu tbpB, kódující sekvence 2139 bp genu tbpB, intergenní sekvence 87 bp a 483 prvních nukleotidů kódující sekvence tbpA z genomické DNA Neisseria meningitidis séroskupiny B použitím oligonukleotidů BAD16 (5’-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3’) a BAD17 (5’-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3’) obsahujících příjmové sekvence a restrikční místa Nhel a Hind\\\ (podtržená). Tento fragment PCR byi čištěn soupravou High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Německo) a přímo klonován do vektoru pGemT (Promega, USA). Tento plasmid byl vystaven mutagenezi cirkulárhí PCR (Jones a Winistofer (1992) s cílem (i) vložit vhodná restrikční místa umožňující klonování
- 88 promotorové kazety CmR/PorA, a (ii) odstranit 209 bp 5’ obklopující oblasti tbpB a kódující sekvenci tbpB. Byla provedena kruhová PCR s použitím oligonukleotidů BAD 18 (5’-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3’) a BAD 19 (5’-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3’) obsahujících vhodná restrikční místa Xmal, Sg/ll a Xho\ (podtržená). Promotorové kazeta CmR/PorA byla amplifikována z výše popsaného plasmidu pUC D15/Omp85 s použitím primerů BAD21 (5’-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’) a BAD20 (5’-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’) obsahujících vhodná restrikční místa Xma\, Spe\, BglW a Xho\ (podtržená). Tento fragment PCR byl klonován do plasmidu získaného kruhovou PCR. Tento plasmid se bude používat pro transformaci kmenů Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-) a (cps- porA-). Integrace procesem dvojitého crossing-overu v oblasti proti směru transkripce vzhledem ke genu tbpA bude směrovat vložení promotoru porA přímo proti směru transkripce vzhledem ke kodonu ATG tbpA.
Příklad 16
Regulace ke zvýšení exprese genu pilQ N. meningitidis séroskupiny B náhradou promotoru
Cílem tohoto experimentu bylo nahradit endogenní promotorovou oblast genu pilQ silným promotorem porA pro dosažení zvýšení produkce antigenu PilQ. K tomuto účelu byl zkonstruován plasmid pro náhradu promotoru s použitím metod klonování E. coli. Byla objevena oblast DNA (772 bp) umístěná proti směru transkripce vzhledem ke genu kódujícímu pilQ (SEQ ID NO: 12) v soukromé databázi Incyte PathoSeq kmene Neisseria meningitidis ATCC 13090. Tato DNA obsahuje sekvenci kódující antigen PilP. Gen pilQ je částí operonu, který si autoři vynálezu nepřáli poškodit, protože piliny jsou
nezbytné prvky bakterií. Promotorové kazeta CmR/porA byla vložena proti směru transkripce vzhledem ke genu pilQ pomocí stejné strategie, jako byla popsána pro zvýšení exprese genu pldA. K tomu účelu byl pomocí PCR amplifikován fragment DNA 866 bp odpovídající 3’-části kódující sekvence pilP, intergenní sekvence 18 bp a 392 prvních nukleotidů genu pilQ, z genomické DNA Neisseria séroskupiny B, s použitím oligonukleotidů PQ-rec5-Nhe (5’-CTA GCT AGC GCC GTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3’) a PQ-rec3-Hin (GCC AAG CTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3’) obsahujících příjmové sekvence a restrikční místa Nhe\ a HindWl (podtržená). Tento fragment PCR byl přímo klonován do vektoru pGemT (Promega, USA). Tento plasmid byl vystaven mutagenezi kruhovou PCR (Jones & Winistofer, 1992) s cílem vložit vhodná restrikční místa umožňující klonování promotorové kazety CmR/PorA. Kruhová PCR byla prováděna použitím oligonukleotidů CIRC1-PQ-Bgl (5’-GGA AGA TCT AAT GGA GTA ATC CTC TTC TTA-3’) a buď CIRC1-PQ-XH0 (5’-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA TTA CCA AAC TGA CAA AAA TC-3’), nebo CIRC2-PQ-X (5’-CCG CTC GAG ATG AAT ACC AAA CTG ACA AAA ATC-3’) obsahujících vhodná restrikční místa BglW a Xho\ (podtržená). Promotorova kazeta CmR/PorA byla amplifikována z dříve popsaného plasmidů pUC D15/Omp85 s použitím prímerů BAD20 (5’-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’) a CM-PORA-3 (5’-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3’) obsahujících vhodná místa štěpení BglW a Xho\ (podtržená). Tento fragment PCR byl klonován do plasmidů získaného kruhovou PCR pomocí primerů CIRC1-PQ-Bgl a CIRC1-PQ-XHO. Tento plasmid může být použit pro transformaci kmenů Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-) a (cps-, porA-). Integrace procesem dvojitého crossing-overu v oblasti proti směru transkripce vzhledem k pilQ bude směrovat vložení promotoru porA přímo proti směru transkripce vzhledem k ATG pilQ.
Další kazeta byla amplifikována z genomické DNA rekombinantní Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-, porA-, D15/Omp85+) s nadměrnou expresí D15/Omp náhrdou promotoru. Tato kazeta obsahuje gen cmR, promotor porA a 400 bp odpovídajících 5’ obklopující oblasti genu D15/Omp85. Ukázalo se, že tato sekvence je účinná pro regulaci ke zvýšení exprese D15/Omp85 v Neisseria meningitidis a bude provedeno testování na zvýšení exprese dalších antigenu Neisseria. Primery použité pro amplifikaci byly BAD 20 a CM-PORA-D153 (5’-GGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3’) obsahující restrikční místa Xho\ (podtržena). Tento fragment PCR byl klonován do plasmidu získaného kruhovou PCR pomocí primerů CIRC1-PQ-Bgl a CIRC2-PQ-X. Tento plasmid může být použit pro transformaci kmenů Neisseria meningitidis séroskupiny B (cps-) a (cps-, porA-). Integrace metodou dvojitého crossing-overu do oblasti proti směru transkripce vzhledem k pilQ bude směrovat vložení promotoru porA do oblasti 400 bp proti směru transkripce vzhledem ke kodonu ATG pilQ.
Příklad 17
Konstrukce kazety kanR/sacB pro zavedení „čistých“, neoznačených mutací do chromosomu N. meningitidis
Cílem tohoto experimentu je zkonstruovat univerzální kazetu DNA obsahující markér umožňující selekci pro pozitivní screening rekombinace do chromosomu Neisseria meningitidis (tj. gen kanR), a markér umožňující negativní selekci pro vypuštění kazety z chromosomu po rekombinaci (tj. gen sacB). Tímto způsobem se odstraní z chromosomu Neisseria jakákoli heterologní DNA zavedená v průběhu homologní rekombinace.
Fragment DNA obsahující gen neoR a sacB exprimovaný pod řízením svého vlastního promotoru byl získán štěpením plasmidu plB279 (Blomfield I. C., Vaughn V., Rest R. F., Eisenstein Β. I. (1991), » · • 4 • · ······ 4 · ·· · · • · · · · · · • «· · ♦ · · · · «Μ·
Mol. Microbiol 5: 1447 - 57) restrikčním enzymem BamH\. Vektor pro příjem byl odvozen z výše popsaného plasmidu pCMK. Gen kanR plasmidu pCMK byl odstraněn štěpením enzymy Nru\ a EcoRV. Tento plasmid byl nazván pCMKs. Kazeta neoR/sacB byla vložena do plasmidu pCMKs v místě štěpení BglW kompatibilním s konci SamHl.
E. coli nesoucí tento plasmid není schopna růst v přítomnosti 2% sacharózy v kultivačním médiu, což potvrzuje funkčnost promotoru sacB. Plasmid obsahující rekombinogenní sekvence umožňující vložení kazety v místě porA ve chromosomu Neisseria meningitidis séroskupiny B. Rekombinantní Neisseria byla získána z agarových píet«n7GC obsahujících 200 pg/ml kanamycinu. Promotor sacB však bohužel nebyl v Neisseria meningitidis funkční; na agarových plotnách GC s obsahem 2% sacharózy nebyl pozorován žádný rozdíl v růstu.
Byla zkonstruována nová kazeta obsahující gen sacB pod řízením promotoru kanR. Byla provedena kruhová PCR použitím plasmidu pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, USA) jako templátu s oligonukleotidy CIRC-Kan-Nco (5’-CAT GCC ATG GTT AGA AAA ACT CAT CGA GCA TC-3’) a CIRC-Kan-Xba (5’-CTA GTC TAG ATC AGA ATT GGT TAA TTG GTT G-3’) obsahujícími restrikční místa Nco\ a Xba\ (podtržena). Výsledný fragment PCR byl čištěn na gelu, štěpen Λ/col a vložen do genu sacB vytvořeného pomocí PCR z plasmidu plB279 s oligonukleotidem SAC/NCO/NEW5 (5’-CAT GCC ATG GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3’) obsahujícím restrikční místo Λ/col (podtrženo) a RBS (tučně) a oligonukleotidem SAC/NCO/NEW3 (5’-GAT CCC ATG GTT ATT TGT TAA CTG TTA ATT GTC-3’) obsahujícím restrikční místo Λ/col (podtrženo). Rekombinantní klony E. coli mohou být testovány na svou citlivost na agarových plotnách obsahujících 2% sacharózu. Nová kazeta kanR/sacB může být subklonována do pCMKs a použita pro transformaci kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B cps-. Získaná citlivost na sacharózu bude u Neisseria potvrzena. Plasmid φ φ
Φ φ φφ φφφφ pCMKs bude použit pro transformaci rekombinantní bakterie kanR/SacB Neisseria pro vypuštění celé kazety vložené do chromosomu v místě porA. Čistá rekombinantní Neisseria bude získána na plotnách s agarem GC obsahujících 2% sacharózu.
Příklad 18
Použití malých rekombinantních sekvencí (43 bp) pro umožnění homologní rekombinace ve chromosomu Neisseria meningitidis
Cílem tohoto experimentu je použití malých rekombinogenních sekvencí (43 bp) pro provádění inzercí, modifikací nebo delecí ve chromosomu Neisseria. Provedení tohoto experimentu značně usnadní další práci tím, že je možno se vyhnout subklonovacím krokům homologních sekvencí v E. coli (rekombinogenní sekvence 43 bp mohou být snadno přidány do primeru pro amplifikaci PCR). Gen kanR byl amplifikován PCR z plasmidu pl)C4K pomocí následujících oligonukleotidů: Kan-PorA-5 (5’-GCC GTC TGA ACC CGT CAT TCC CGC GCA GGC GGG AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CCA CGT TGT GTC-3’) obsahujícího 43 bp homologních s 5’obklopující sekvencí genu porA NmB a příjmovou sekvenci (podtržena) a Kan-PorA-3 (5’-TTC AGA CGG CGC AGC AGG AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTG AGG TCT GCC TCG3’) obsahujícího 43 bp homologních s 3’-obklopující sekvencí genu porA NmB (tučně) a příjmovou sekvenci (podtrženo). Fragment DNA 1300 bp získaný tímto způsobem byl klonován do vektoru pGemT (Promega, USA). Tento plasmid může být použit pro transformaci kmene Neisseria meningitidis séroskupiny B cps-. Rekombinantní kmen Neisseria se získá na plotnách GC obsahujících 200 pg/ml kanamycinu. Integrace procesem dvojitého crossing-overu v místě porA bude testována screeningem metodou PCR s primery PPA1 a PPA2 tak jak bylo popsáno výše.
I • « * · • · · · »9 9
99 ϊ .
9 «· 9999
Příklad 19
Aktivní ochrana myší imunizovaných váčky Neisseria meningitidis standardního typu a rekombinantními
Zvířata byla třikrát imunizována (IP) 5 pg různých OMV adsorbovaných na AI(OH)3 ve dnech 0, 14 a 28. Vzorky krve byly odebírány ve dnech 28 (14. den po II imunizaci) a 35 (7. den po III imunizaci), a testovací dávky byly podány v den 35 (IP). Testovací dávka byla 20 x LD50 (~107 CFU/myš). Sedm dnů po testovacím podání byla monitorována míra úmrtnosti.
Injekcemi byly podány následující OMV:
Skupina 1: váčky Cps-, Skupina 2: váčky Cps-, Skupina 3: váčky Cps-, Skupina 4: váčky Cps-, Skupina 5: váčky Cps-,
PorA+
PorAPorA-, NspA+ PorA-, Omp85+ PorA-, Hsf+
Na obr. 15 jsou ukázány analýzy těchto OMV pomocí SDS PAGE (barvení Coomassie).
hod po testovacím podání byla pozorována u negativní skupiny 100% úmrtnost (8/8) (imunizace samotným AI(OH)3)), zatímco myši imunizované pěti různými preparáty OMV byly stále na živu (přežilo 7 až 8/8). V průběhu sedmi dnů bylo také monitorováno onemocnění, přičemž se myši imunizované váčky s nadměrnou expresí NSPA jevily jako méně nemocné než myši v jiných skupinách. Je pravděpodobné, že PorA přítomný ve váčcích PorA+ poskytuje velkou míru ochrany proti infekci homologním kmenem. Ochrana indukovaná váčky se zesílenou přítomností PorA- je však pravděpodobně způsobena alespoň do určité míry přítomností zvýšeného množství NspA, Omp85 nebo Hsf.
- 94 • 9 * * · »
99 · ·
Příklad 20
Imunogenicita rekombinantních váčků měřená metodami ELISA s celými buňkami a specifickou ELISA
Pro měření schopnosti protilátek rozpoznávat antigeny přítomné na povrchu buněk MenB byla testována spojená myší séra (příklad 19) metodou ELISA s celými buňkami (s použitím buněk inaktivovaných tetracyklinem), a titry byly vyjádřeny jako střední titry.
Všechny typy protilátek z váčků indukovaly vysoké titry protilátek celých buněk, zatímco negativní kontrolní skupina měla jasně negativní výsledky.
Váčky WCE (H44/76) střední titr
14P2 14P3
CPS(-) PorA(+) 23849 65539
CPS(-) PorA(-) 20130 40150
CPS(-) PorA(-) NSPA(+) 8435 23846
CPS(-) PorA(-) OMP85(+) 4747 16116
CPS(-) PorA(-) HSF(+) 6964 22504
(-) 51 82
Byla sledována specifická protilátková odpověď na dostupný rekombinantní protein HSF. Mikrotitrační destičky byly potaženy úplnou molekulou HSF v množství 1 pg/ml.
Výsledky ukázané na obr. 16 ukazují, že byla získána dobrá odpověď specifická pro HSF, jestliže byly pro imunizaci myší použity OMV se zvýšenou expresí HSF (použitím čištěného rekombinantního HSF na destičkách). Váčky se zvýšenou expresí HSF indukují dobré úrovně specifických protilátek.
SEQ. ID NO: 1
Nukleotidová sekvence vektoru pCMK(+)
TCTrCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCrGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCrCACrCAAAGGCGGT
AATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA
AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCrGACGAGCkTCACAAAAATCGACGCrCAAGTCAGAGG
TGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTrTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCrCTCCTGTrCCGACCCT
GCCGCXTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCITCGGGAAGCGTGGCGCriTCTCATAGCTCAGGCTGTAGGTATCTCA
GTTCGGrGTAGCTCGrrCGCTCCAAGCTGGGCrGTGTGCACGAACCCCCCGrrCAGCCCGACCGCrGCGCCTTArCCGGT
AACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAXjACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGXAACAGGATTAGCAGAGC
GAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGrGGCCTAACIACGGCXACACIAGAAGAACAGTATTTGGTATCT
GCGCrCrGCTGAAGCCAGTTACCITCGGAAAAAGAGTrGGrAGCTCrrGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGT
GGTTmTTGmGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCrnTCTACGGGGTC
TGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGAnTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCITT
TAAATTAAAAATGAAGmTAAATCAATCTAAAGZATATAIGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGT
GGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCrGCAATGArACCGCGAGACCCACGCrCACCGGCTCCAGATrEATCAGCAAXAA
ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACmATCCGCCTCCAICCAGxCTATTAATTGTTGCCGG
GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGrrTGCGCAřICGITGrrGCCArrGCrACAGGCATCGTGGTGTCACGCTC
CGGTTAGCrCCrTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTÁAGTTGGCCGCAGTGTTATCACrCArGGTIATGGCAGCACTG
CATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCOTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATA
GTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCrTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACAIAGCAGAACTTTAAAAGTGC
TCATCATTGGAAAACGTTCTrCGGGGCGAAAACrCTCAAGGAXCrTACCGCTGTTGAGArCCAGTTCGAXGTAACCCACT
CGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCnTTACnTCACCAGCGnTCTGGGTGAGCAAAAAjCAGGAAGGCAAAATGCCGC
AAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTITrCAAIATIATTGAAGCArrTAICAGG
GTTATTGTCTCATGAGCGGAIACATATrTGAATGTATXTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATITCCCCGA
AAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCAITACTAICATGACATrAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTrCG
^GACACATGCAGCTGCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGG
ATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGrCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACIATGCGGCATCA
GAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAAITGTAAACGTTAATATTTTGTIAAAATTCGCGTTAAAITmGTTAAAT
CAGCTCATrTrTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAAIAGCCCGAGAXAGGGTIGAGTG
TrGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATIAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCrATCAGGGC
GATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGnmTGGGGTCGAGGTGCCGrAAAGCACTAAATCGGAACCCTAA
AGGGAGCCCCCGA1TTAGAGCrTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGG
GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCrrAATGCGCCGCTACAGGGC
GCGTACrATGGTrGCTTrGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAAIACCGCATCAGGCGCCAT
TCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATIACGCCAGCXGGCGAAAGGGGG
ATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGrAACGCCAGGGnTTCCCAGTCACGACGXTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGC
TTGCCGTCTGAATACATCCCGTCATTCCTCAAAAACAGAAAACCAAAATCAGAAACCTAAAATCCCGŤCATTCCCGCGCA
GGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTnTTCCGATAAArTCTTGAGGCATTOAAATTCTAGATTCCCGCCTGCGCGGGAA
TGACGGCTGTAGATGCCCGATGGTCrrTATAGCGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAG
TTGTTnTGTTAATCCACTATAAAGTGCCGOGTGTGTTTTTnATGGCGTTTTAAAAAGCCGAGACTGCATCCGGGCAGC
AGCGCATCGGCCCGCACGAGGTCTCIGGAGTCGCGAGCATCAAGGGCGAATrCTGCAGGGGGGGGGGGGAAAGCCACGTT
6XGTCTCAAAATCTCTGATGTTACA3TGCACAAGATAAAAATATATCATCA.TGAACAAIAAAACTGTCXGCTTACAIAAA
CAGTAATACAAGGGGTGTTAIGAGCCAIAItCAAGGGGAAAOGrCITGCrCGAGGCCGOGAHAAATTCCAACAIGGATG
CTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTČGCGATAATGTCGGGCftATCftGSTGCGACAATCTATCGATTGTArGGGAAGCCC
GATGCGCCAGAGTTGTTrCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAA.TGATďTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTG
GCTQACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATITTAICCGTACrCCTGATGATGCATGGTrACTOlCCACrGCGA
TCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGOTATrAGAAGAATATCCIGATTCaGGTQAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTC
ACGAATGAArAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAG
AAATGCATAA3CTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAX7rCGTCACTCA.TGGTQATTTCTCACTTGATAACCTTATTITTGAC
GAGGG3AAATTAATAGGTTGTATTGKIGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCA.TCCTATGGAA
CTGCCTCGGTGAGTTITCTCCTTCATTACflGAAACGGCTmTCAAftAATAXGGTATTGATAAXCCTGATATGAATAAAT
ACrrGACGGGACGGCGGCITTGTKjAATAAATCGAACrmGCrGAGTTGAAGGATCAGAICACGCATCTrCCCGACAAC
GCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGrCCACCTACAACAAAGCrCTCATCAACCCrrGGCrc
CCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACXCCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGC
GCCCCCCCCCCCCTGCAGGACGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCrATTGTTr
TAXATCAAAATATAATCATrTTTAAAATAAAKZrrGCtSGCATTTATCAGAIATrrGTTCTGAAAAATGGTTTTrrGCGGC
GGGGGGGGTATAATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGGAATTCTGAGCGGATAACAA.TTCGAIGTTnTAGGTT7TTA
TCAAATTTACAAAAGGAAGCCCATATGCATCCTAGGCCTATTAATATTCCGGAGTATACGTAGCCGGdAACGTTAACAA
CCGGTACCTCTAGAACIAIAGCTAGCATGCGCAAAlTIAAAGOSCrGATAXCGKTCGCGCGCAGArCrGACTAAATAGGC
GAAAATACCAGCTACGAICAAATCATCGCCGGCCjTTGATIATGArrrTTCCAAACGCACrrCCGCCATCSTOTCTGGCGC
TTGGCrGAAACGCAATACCGGCAXCGGCAR.CTACACTCAAATTAAIGCCGCCTCCSTCGGXTrGCaCCACARATTCCAAA
T7CAGCCCCAAACAAAAACCCGGATACGGAAGAAAAACGGCAA.TAAAGACACCAAft.TACCGTCTGkAAGATTTTCASACG GTAnTCGCAirmGGCITC3GT1TGCACATArAGTGAGACCTTGGCkAftAAIAG7CrGITAACGAAA.TTTGACGCATAA AAATGCGCCAAAAAATmCAATTGCCTAAAACCTTCCIAATATTGAGCAAA&AGTAGGAAAAATCAGAAAAGrmGCA TITIGAAAAXGASATTGAGCATAAAArmAtJTAACCTATGnATTGCAAAGGTCTCSAMTCTCATTCCCACGCAGGČG GGAA.TCTACTCTGTTCGGTTTCAGTTATITCCGArAAATTCCTCCTGCGCCGTCTGAAGKA.TTCGTAATCATGGTCAIAG CTGTOCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAAITCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAftGTGTAAAGCCTGGGG TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAA'i'iXjCb I rCCUUTCACTOCCCGCfTfCCAGTCGGGAAACCrGTCGTGCCAGC TCCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGC
SEQ. ID NO: 2
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (997 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu NspA Neisseria meningitidis séroskupina A kmen Z2491
CSGAACCGkACACaCCGrrCGCTCATACGCCGCCGAAAGGTTrGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGG
AATirGAAClACTGGCAGTTCGCCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCGCACGGCAAAArrrCCTATCCCGACCGCAT CGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACIACCICGCCrTAATGCAAAACCGACCGAGCSAAGCCGTCGAACGCA AAA.CCGTCGCCGCCGAAGA1TTGCCGTrCSAATTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGGCGTACCCACC3CGAXG TTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCÁAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCICGAAAC CGACCCCGCCGrATTGgGCCCGACCgAÍVAAAGgACGCTmrrm'AAACGATTHJumCAU,lVi 1TI' XI 1'ATAGTGGAITA ACAAAAACCAGTACGGCGrrGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATrCTCTAAGGTGCTGAAGCACCKAGTGAiTCGGT TCCCTACTATCTGTACTGTCKCGGCrreCTCGCCTTOTCCTGATTmGTTAATCCACIATATAAGCGCAAACAAATCG GCGGCCGCCCGGGAAAACCCCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGG GCGTTTCAGACGGCACAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAAAACCGTATGCCTGCAC CTtX^UV^TCCCaCACAXACCGCnjmTrCCCAWUXGTTTOCAACnTrCACCCATCCGCraCGTaATCCCGCCACCA CCATTTAAAGGCAACGCGCtaSGTTAACGGCrTTGCCG
SEQ. ID NO: 3
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu D15/Omp85 Neisseria meningitidis séroskupina B kmen ATCC13090
ACCATTGCCGCCCGCGCCGGCTTCCAAAGCGGCGACAAAATACAATCCGTCAACGGCACACCCGTTGCAGAITGGGGCAG
CGCGCAAACCGAAATCGXCCTCAACCTCGAAGCCGGCAAAGTCGCCG7CGGGTTCAGACGGCATCAGGCGCGCAAACCGT
CCGCACCATCGATGCCGCAGGCACGCCGGAAGCCGGTAAAATCGCAAAAAACCAAGGCTACATCGGACIGATGCCCmA.
AAATCACAACCGTTGCCGGTGGCGTGGAAAAAGGCAGCCCCGCCGAAAAAGCAGGCCTGAAACCGGGCGACAGGCTGACT
GCCGCCGACGGCftAACCCATTACCTCATGGCAAGAATGGGCAAACGTGACCCGCCAAAGCCCCGGCAAAAAAATCACCCT·
GAACTACGAACGCGCCGGACAAACCCATACCGCCGACATCCGCCCGGATACTGTCGAACAGCCCGACCACACCCTGATCG
GGCGCGTCGGCCTCCGTCCGCAGCCGGACAGGGCGTGGGACGCGCAAAICCGCCGCAGCIACCGTCCGTCTGTTATCCGC
GCATTCGGCkTGGGCTGGGAAAAAACCGTTTCCCACTCGTGGACAACCCTCAAATTnTCGGCAAACTAArCAGCGGCAA
CGCCTCCGTCAGCCATAITTCCGGGCCGCTGACCATTGCCGACAGTGCCGGACAGTCCGCCGAACTCGGCrrGCAAAGrT
ATTTGGAATTTr
^TTTSGGCZAACGCGTCCAAAACATCGGTrTGCGCrrCGGGCr
TGCCCTCATGATGCTGATGATGGCGGTCGCCTTCTTCAACGACG—ACCČGGCXGCTCGGTTAGATTTTACGTTTCGGAA TGCCGTCTGAAACCGCATTCCGCACCACAAGGAACTGACA
SEQ. ID NO: 4
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu podobnému Hsf Neisseria meningitidis
ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACGCAACGCAACAGGAATTTAXCGGAAAAAACAGAAACCTCACCGCCGTCATTC
CCGCAAAAGCGGGAATCTAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCAGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATTCCCGC
AAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGATTCCACGTCCTAGATTCCCG
CTTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAGATTATGGGAATTTATCAGGAATGATTGAATCCATAGAAAAACCACAGGAATCTA
TCAGAAAAAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGG
AAAAAACCGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGTTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAA
AAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAAC
AGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGCAACCGAAAAACCACAGGAATCTATCAGCAAAAACAG aaacccccaccgaccgtcattcccgcgcaggcgggaatccagaaacacaacgcggcaggactttatcggaaaaaacagaa
ACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACC
CCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGGACGGAAACTrACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGAT
TCCACGTCCCAGATTCCCGCCTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAAGTTGGGGGAATTTATCAGAAAACCCCCAACCCCCA
AAAACCGGGCGGATGCCGCACCATCCGCCCCCAAACCCCGATTTAACCATTCAAACAAACCAAAAGAAAAAACAAA
SEQ. ID NO: 5
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (772 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu PilQ Neisseria meningitidis
GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAAT
CATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACTTACCAAGCAÁAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGC
AGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCT
GGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAA
TCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGAC
TrCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAG
TTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCT
ACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAAC
GAGCTGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGA
ACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATT
- 98 4*4 · • 4 *4 * · · • * ♦ • » · * · · «4 ·**»
SEQ. ID NO: 6
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Hap Neisseria meningitidis
GTGCGGCAAAAAACAGCAAAAGCCCGCTGTCGATTGCCTGACCGTCCGCGTCCGTAAAATCAGCATAGGTTGCCACGCGC
GGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGATATGCGTATCACGCCCACGCCGCC
GCGCCCGGGTGC6GTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCG
ATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCGCAAAAATGCTTGATAAATCCGTC
CGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAÁACACATACGCCTTCCTGCTCGGTATAGGCTCGCTGCrGGGTCTGTT
CCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAACATCGGCGGCGArrrTCAACGCGCCATAG agaaagcgcgaaaatgaccgaaaacgcacaggacaaggcgcggcaggctgtcgaaaccgtcgtcaaatccccggagcttg
TCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATTCGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCC
GACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCG
GCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTTCATCAGCGTCATCCTGATACTGC
TTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCC7CCCTTGCCGGCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCG
GGTGCmCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTAGGGCGTGCrrCATATCCGCCCGA
ACGCCGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCTCCCAAACAAACCCGAATCCCG
TCAGATAAGGAAAAATA
SEQ. ID NO: 7
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (924 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu NspA Neisseria meningitidis (séroskupina B) (ATCC13090)
GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGG
TACACGGCGGGCTGGAAGGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCAC
AATTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCTCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCAT
CGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAGCCAACCGAGTGAAGCCGTCGAACGCA
AAACCGTTGCCGCCGAAGATTTGCCGTTTGAGTTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGCGTACCCGCCGCGATGT
TGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAACC
GACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGACGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTAA
CAAAAACCAGTACGGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTT
CCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTT7GTTAATCCACTATATAAGCGCAAACAAATCGG
CGGCCGCCCGGGAAAACCCGCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGG gcgtttcagacggcacagccgccgccggaaatgtccgacgcttaaggcacagacgcacacaaaaccgtatgcctgcacct
GCAACAATCCGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCA
SEQ. ID NO: 8
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu FrpB Neisseria meningitidis (séroskupina B)
AAGTGGGAATCTAAAAATGAAAAGCAACAGGAATTTATCGGAAATGACCGAAACTGAACGGACTGGATTCCCGCTTTCGC
GGGAATGACGGCGACAGGGTTGCTGTTATAGTGGATGAACAAAAACCAGTACGTCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGA
ACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTCCTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCT
GATTTCTGTTCGTTTTCGGTTATTCCCGATAAATTACCGCCGTTTCTCGTCATTTCTTTAACCCTTCGTCATTCCCGCGC
AGGCGGGAATCTAGTTTTTTTGAGTTCCAGTTGTTTCTGATAAATTCTTGCAGCTTTGAGTTCCTAGATTCCCACTTTCG
TGGGAATGACGGTGGAAAAGTTGCCGTGATTTCGGATAAATTTTCGTAACGCATAATTTCCGTTTTACCCGATAAATGCC
CGCAATCTCAAATCCCGTCATTCCCCAAAAACAAAAAATCAAAAACAGAAATATCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCT
AGACCTTAGAACAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGAA
TTTTAGGTTTCTGTTTTTGGTTTTCTGTCCTTGCGGGAATGATGAAATTTTAAGTTTTAGGAATTTATCGGAAAAAACAG
AAACCGCTCCGCCGTCATŤCCCGCACAGGCTTCGTCATTCCCGCGCAGGCTTCGTCATTCCCGCATTTGTTAATCCACTA
TATTCCCGCCGTTTTTTACATTTCCGACAAAACCTGTCAACAAAAAACAACACTTCGCAAATAAAAACGATAATGAGCTT
TGCAAAAATCCCCCCCCCCTGTTAATATAAATAAAAATAATTAATTAATTATTTTTCTTATCCTGCCAAATCTTAACGGT
TTGGATTTACTTCCCTTCATACACTCAAGAGGACGATTGA
SEQ. ID NO: 9
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu FrpA Neisseria meningitidis (séroskupina B)
CTATAAAGATGTAAATAAAAATCTCGGTAACGGTAACACTTTGGCTCAGCAAGGCAGČŤÁCAČCAAAACAGACGGTÁCAA
CCGCAAAAATGGGGGATTTACTTTTAGCAGCCGACAATCTGCACAGCCGCTTCACGAACAAAATGCTATCCATTAGCCAT
GTTCGGGAAAACACGATTTCCCCGTTTGTTTTAGGCTGTCTAAACAAATAACCATAAATGTATATCATTATTTAAAATAA
ATAAAAGTATTTAACTATTATTGACGAAATTTTAGAGAAAGAGTAGACTGTCGATTAAATGACAAACAATAGTGAGAAAG
GAAATATTTACTATCCGAGCACAGAGCATATTTTAGGTAGCCTGTAACTGTTCCTGCTGGCGGAAGAGGATGAAGGTGGA
CTTACCC6AGAATAAATGTCCTGTTGTGTGATATGGATGCCATGCCGCGAAGCAATTGATGCAATCACGGCAGTCCTACT
TGAATGAAACCTGTCGTTGCAGAATTTGAAAACGCTATTTTTAAGAAAGGATAAAGGGAGAAAGAATTTTTGGTTTTTAA
TATGATTGCTAAAAGTTTATTTTTTAGATGCCAAAAAATATATTTTATATACTTCATATTGTTTATATGTCnTATTTGA. ATATATCTTACGATGGGGAAATATTTATATATTTTATAATAAATTTTACTCATTTGČTAATATGTCATGGAATATTACTT GTATTTTGTAGAATmTCCATATGAAAATATTCCATTTACTATI IlÍCTGAACTTTAITAGTirATJIXTTAATAITTTr' ACCTCTTATATTTACCATAAGAGAGCTAATTGATTCATATTATATTGAGTCGATAATTAATTTATTCTTAATTTTAATrC CTCACGTTATTT í rTTAATTTAUii'l»AAAGGAAAGCAGAT φ
* φ φ
- 99 • φ φφφφ ♦-Φ φφφφ «φ • Φ φ φ φ ♦ « φ φ φ φ φφφφ
SEQ. ID ΝΟ: 10
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu FrpC Neisseria meningitidis (séroskupina B)
GGAAACAGAGAAAAAAGTTTCTCŤTCTATCTTGGATAAATÁTATTTACCCTCAGTTrAGTTAAGTATTGSAATTTATACČ
TAAGTAGTAAAAGTTAGTAAATTATTTTTAACTAAAGAGTTAGTATCTACCATAATATATTCTTTAACTAATTTCTAGGC
TTGAAATTATGAGACCATATGCTACTACCATTTATCAACTTTTTATTTTGTTTATTGGGAGTGTTTTTACTATGACCTCA
TGTGAACCTGTGAATGAAAAGACAGATCAAAAAGCAGTAAGTGCGCAACAGGCTAAAGAACAAACCAGTTTCAACAATCC
CGAGCCAATGACAGGATTTGAACATACGGTTACATTTGATTTTCAGGGCACCAAAATGGTTATCCCCTATGGCTATCTTG
CACGGTATACGCAAGACAATGCCACAAAATGGCrrrCCGACACGCCCGGGCAGGATGCrTACTCCATTAATTTGATAGAG
ATTAGCGTCTATTACAAAAAAACCGACCAAGGCtGGGTTCTTGAGCCATACAACCAGCAAAACAAAGCACACTTTATCCA
AťrrCTACGCGACGGTTTGGATAGCGTGGACGATATTGTTATCCGAAAAGATGCGTGTAGTTTAAGTACGACTATGGGAG
AAAGATTGCTTACTTACGGGGTTAAAAAAATGCCATCTGCCTATCCTGAATACGAGGCTTATGAAGATAAAAGACATATT
CCTGAAAATCCATATTTTCATGAATTTTACTATATTAAAAAAGGAGAAAATCCGGCGATTATTACTCATCGGAATAATCG
AATAAACCAAACTGAAGAAGATAGTTATAGCACTAGCGTAGGTTCCXTGTATTAACGGTTTCACGGTACAGTATTACCCGT
TTATTCGGGAAAAGCAGCAGCTCACACAGCAGGAGTTGGTAGGTTATCACCAACAAGTAGAGCAATTGGTACAGAGTTTT gtaaacaattcaaataaaaaataatttaaaggatcttatt
SEQ. ID NO: 11
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Omp85 Neisseria meningitidis (séroskupina B)
ACGTCCGAACCGTGATTCCGCAACGCCGCGCCCAAAACCAAAGCCCAAGCCAAAATGCCGATATAGTTGGCATTGGCAAT
CGCGTTAATCGGGTTGGCGACCAGGTTCATCAGCAGCGATTTCAACACTTCCACAATGCCGGAAGGCGGCGCGGCGGACA
CATCGCCCGCGCCCGCCAAAACAATGTGCGTCGGGAAAACCATACCGGCGATGACGGCGGTCAGGGCTGCGGAAAACGTA
CCAATGAGGTAAAGGATGATAATCGGCCTGATATGCGCCTTGTTGCCTTTTTGGTGCTGCGCGATTGTGGCCGCCACCAA
AATAAATACCAAAACCGGCGCGACCGCTTrGAGCGCGCCGACAAACAGGCTGCCGAACAAGCCTGCCGCCAAGCCCAGTT
GCGGGGAAACCGAACCGATTACGATGCCCAACGCCAAACCGGCGGCAATCTGCCTGACCAGGCTGACGCGGCCGATCGCA
TGAAATAAGGATTTGCCGAACGCCATAATTCrrCCTTATGTrGTGATATGTTAAAAAATGrrGTATTTTAAAAGAAAACT
CArrcTCTGTGrrrrrrrrATTrrTCGGCTGTGrrrrAAGG-rrGCGTTGATrrGcccTATGCAGTGccGGACAGGcrrrG
CTTTATCATTCGGCGCAACGGTTTAATTTATTGAACGAAAATAAATTTATTTAATCCTGCCTATTTrCCGGCACT '.TTCC
GAAACGCAGCCTGTTTTCCATATGCGGATTGGAAACAAAATACCTTAAAACAAGCAGATACATTTCCGGCGGGCCGCAAC .
CTCCGAAATACCGGCGGCAGTATGCCGTCTGAAGTGTCCCGCCCCGTCCGAACAACACAAAAACAGCCGTTCGAAACCCT
GTCCGAACAGTGTTAGAATCGAAATCTGCCACACCGATGCACGACACCCGTACCATGATGATCAAACCGACCGCCCTGCT
SEQ. ID NO: 12
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (772 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu PiíQ Neisseria meningitidis (séroskupina B) (ATCC13090)
GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAAT
CATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCAeCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGC
AGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACŤTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCT
GGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAA
TCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGrrGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATrCGAC rrCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAG
TTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATT7TGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCT
ACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAAC
GAGC7GATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGA
ACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTAC7CCATT
SEQ. ID NO: 13
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu podobnému Hsf Neisseria meningitidis (séroskupina B)
TTTGTTTTTTCTTTTGGTTTGTTTGAATGGT7AAATCGGGGTTTGGGGGCGGATGG7GCGGCATCCGCCCGGTTTTTGGG GGTTGGGGGTTTTCTGATAAATTCCCCCAAC77AAAATCTCGTCATTCCCGCGAAGGCGGGAATCTGGGACGTGGAATCT AAGGAAACTGTTTTATCCGG7AAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGAT7CCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGGGGTT TCTGmTrTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATrCCAGCTTTrGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCT GTTTTTTCCGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGGTTTCTGT TTTTGCTGATAGATTCCTGTGGTrTrrCGGTEGCTGGATrCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTT TTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGTGTTrCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTmTTC CGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTmTGGArrCCAACTTrrGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCGGTrrrrTCCGA TAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTTTTrTCTGATAGA TTCCTGTGGTTrrrCTATGGArrCAATCATTCCTGATAAATTCCCATAATCTAAAATCrCGTCATTCCCGCGAAAGCGGG AATCTAGGACGTGGAATCTAAGGAAACTGTTTrATCCGGTAAGTTrCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCrmGCGG GAATGACGGCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCTGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTAGATTCCCGCTTTTGCGGGAAT GACGGCGCrGAGGTTTCTGrrTTTrCCGATAAAtTCCTGT ___ . _ _
SEQ. ID NO: 14
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Hap Neisseria meningitidis (séroskupina B)
100 ···♦♦
AATCAGCATAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCAxCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGAT
ATGCGTATCACGCCCACGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGXXGGAACGTTATCCGACATAAAACC
CCCGAAAATrCAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGXCCGACGGTXXGGCTTTCAGAGGGCATAAAACCG
CAAAAATGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCTTCCTGCTCGGT
ATAGGCTCGCTGCrGGGTCTGTTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAÁCATCGG
CGGCGATTTTCAACGCGCCATAGAGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAAC-.
CGTCGTCAAATCCCCGGAGCTrGTCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAAIAATGATAGCCCGGCGTTTCCArr
CGGGATCGTEGCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATG
GCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGGCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTT
CATCAGCGTCATCCTGATACTGCTTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCG
GCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCGGGTGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTA
GGGCGTGCTTCATATCCGCCCGAACGCCGAAČCGCACATATAGGCACATCCCGCGCKCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCC
C7CCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATA
SEQ. ID NO: 15
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu LbpA Neisseriajrieningitidis (séroskupina B)
GArrTTGGTCATCCCGACAAGCTrCTTGTCGAAGGGCGTGAAATTCCTTrGGTTAGCCAAGAGAAAACCATCAAGCTTGC
CGATGGCAGGGAAATGACCGTCCGTGCTTGTTGCGACTTTTTGACCTATGTGAAACTCGGACGGATAAAAACCGAKCGCC
CGGCAAGTAAACCAAAGGCGGAAGATAAAAGGGAGGATGAAGAGAGXGCAGGCGTTGGTAACGTCGAAGAAGGCGAAGGC
GAAGTrrCCGAAGATGAAGGCGAAGAAGCCGAAGAAATCGTCGAAGAAGAACCCGAAGAAGAAGCTGAAGAGGAAGAAGC
TGAACCCAAAGAAGTTGAAGAAACCGAAGAAAAATCGCCGACAGAAGAAAGCGGCAGCGGTTCAAACGCCATCCTGCCTG
CCTCGGAAGCCTCTAAAGGCAGGGACATCGACCTTTTCCTGAAAGGTATCCGCACGGCGGAAGCCGACATTCCAAGAACC
GGAAAAGCACACTATACCGGCACTTGGGAAGCGCGTATCGGCACACCCATTCAATGGGACAATCAGGCGGATAAAGAAGC
GGCAAAAGCAGAATTTACCGTTAATTTCGGCGAGAAATCGATTrcCGGAACGCTGACGGAGAAAAACGGTGTACAACCTG
CTTTCTATATTGAAAACGGCAAGATTGAGGGCAACGGTTTCCACGCAACAGCACGCACTCGTGAGAACGGCATCAATCTT
TCGGGAAATGGTTCGACCAACCCCAGAACCTTCCAAGCTAGTGATCTTCGTGTAGJAGGAGGATTTTACGGCCCGCAGCG
GAGGAATTGGGCGGTATTATTTTCAATAAGGATGGGAAATCTCTTGGTATAACTGAAGGTACTGAAAATAAAGTTGAAGT
TGAAGCTGAAGTTGAAGTTGAAGCTGAAACTGGTGTTGTCGAACAGTTAGAACCTGAXGAAGTTAAACCCCAATTCGGCG
TGGTATTCGGTGCGAAGAAAGATAATAAAGAGGTGGAAAA
SEQ. IDNO: 16
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu LbpB Neisseria meningitidis (séroskupina A)
CGGCGTTAGAGTTrAGGGCAGTAAGGGCGCGTČCGCČCETAGATCTGTAAGTTACGATTCCGTTAAATAACTTTTACTGA
CTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTrACTGCTTAAAGTCCAACGACAAAAACCAAAAGACAAAAACACTr.
TTATTACCCTAAAATCGAACACCCATAAATGACCTTTTTTGTCTTTGGCGAGGCGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAG
ATCTGTAAGTTATGATTCCGTTAAATAGCCTTTACTGACTTTGAGrTrrTTGACCTAAGGGCGGACGCGCCCrrACTGCT
TCACCTTGAATGGGCTTTGAATTTTGTTCGCTTTGGCTTGCTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCGCCTCGCC
AAAGACGAAAAGGGTTATXTACGGGGGTTGGATTTTAGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCTGTAAGTTATGATT
CCGTTAAATAGCCrrERCTGACTTTGAGrrrrrTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCrrCACCTTCAATGGGCTT
TGAATrrTGTTCGCTrTGGCrrGCTrGATCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCGTCrCGCCGAÁGACAACGAGGGCTA
TTTAČGGCGrrAGAGTTTAGGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCCAGACAGrCACGCCTTTGAATAGTCCATTTT
GCCAAAGAACTCTAAAACGCAGGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACXGCCTrACATCCAAGCACCCTTACTGCACCACG
TCCACGCACCCTTACTGCCCTACGTCCACGCACCCTTACTGCCCTACATCCAAGCACCCTTACTGCCTTACATAGACATG
ACAGACGCCGAGCAGCGGAACAGGACTAAAAACAATTAAGTGATATTTTTGCCCAftCTATAATAGACATGTATAATTATA
TTACTATTAATAATAATTAGTTTATCCTCCTTTTCATCCC
SEQ. ID NO: 17
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (731 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu TbpA Neisseria meningitidis (séroskupina B) (ATCC13090)
TATGAAGTCGAAGTCTGCTGTTCCACCTTCAATTATCTGAATTACGGAATGTTGACGCGC AAAAACAGCAAGTCCGCGATGCAGGCAGGAGAAAGCAGTAGTCAAGCTGATGCTAAAACG GAACAAGTTGGACAAAG7ATGTTCCTCCAAGGCGAGCGCACCGA7GAAAAAGAGATTCCA AACGACCAAAACGTCGTTTATCGGGGGTCTTGGTACGGGCATATTGCCAACGGCACAAGC TGGAGCGGCAATGCTTCCGATAAAGAGGGCGGCAACAGGGCGGACTTTACTGTGAATTTC GGTACGAAAAAAATTAACGGCACGTTAACCGCTGACAACAGGCAGGCGGCAACC-rTACC ATTGTGGGCGATATTGAGGGCAACGGTTTTTCCGGTACGGCGAAAACTGCTGACTCAGGT TTTGATCTCGATCAAAGCAATAACACCCGCACGCCTAAGGCATATATCACAAACGCGAAG GTGCAGGGCGGTTTTTACGGGCCCAAAGCCGAAGAGTTGGGCGGATGGTTTGCGXATTCG GACGATAAACAAACGAAAAATGCAACAGATGCATCCGGCAATGGAAATTCAGCAAGCAGT GCAACTGTCGTATTCGGTGCGAAACGCCAAAAGCCTGTGCAATAAGCACGGTTGCCGAAC AATCAAGAATAAGGCCTCAGACGGCACCGCTCCTTCCGAXACCGXCTGAAAGCGAAGAGT AGGGAAACACT __
CGTACČeCArrCCGCAČŤGCAGTGAAAAAAGTAXTGAAAGCAGTCGAAGCAGGáGASAAAGCTGCCGCjlCAAGCGGTTTA.Í CCAAGAGTCCGTCAAAGXCAXCGACCGCAXCGCCGACAAGGGCGXGXXCCATAAASACAAAGCGGCXCGCCACAAAACCC j ; GXTtGTCTCAAAAAGTAAAACCXXGGCTTGAXTTXXGCAAAACCTGCAAXCCGGXXXXCAXCGXCGAXXCCGAAAACCCC |
AATCCGCTATAAAAXGCCGXCTGAAAACCAATAXGCCGACAATGGGGGXGGAG
SEQ. ID NO: 18 ------------Nukleotidová sekvence oblasti DNA (373 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Omp1A Neisseria meningitidis (séroskupina B) (ATCC 13090) _____________________________ ____________ _ _ : -. CM.
,. ί
101 SEQ. ID ΝΟ: 19 I
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce » 4 ·
4444 vzhledem ke genu Pla1 Neisseria meningitidis (séroskupina B)
CTOTTTAAAGTCITCGACCGTACKTCATCAACKrAGTTCGACCAGTTGTAGATCTTCA
GAGTATCGGTGGCAGCGGCTTCGGCATTGGCAGCAGACGCAGCGTCIGCrrGAGGTrGCA
CGGATTTrrTCATACGGGCAGATTCCTGATGAAAGAGGTTGGAAAAAAAGAAATCCCCGC
GCCCCATCGTTACCCCGGCGCAAGGTTTGGGCATTGTAAAGTAAATrrGTGCAAACTCAA
AGCGATATTGGACTGATTTTCCTAAAAAATrATCCTGTTrCCAAAAGGGGAGAAAAACGT
AGGCTTGCATATAATGTAAACCCCCTTTAAAATTGCGCGTTEACAGAATTEArmTCTT
CCAGGAGATrCCAATATGGCAAACAGCGCACAAGCACGCAAACGIGCCCGCCAGTCCGTC
AAACAACGCGCCCACAATGCTAGCCTOCGtACCGCRlťCCGCACCGCAGroAAAAAAGTA
TTCAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTACCAAGAGTCCGTC
AAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCACAAAAACAAAGCGGCACGCCAC
AAAAGCCGTCTGTCTGCAAAAGTAAAAGCCTTGGCTTGATTrriGCAAAACCGCCAAGGC
GGTTGATACGCGATAAGCGGAAAACCCTGAAGCCCGACGGrTTCGGGGCTTTCTGTATTG
CGGGGGCAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGGGTGCGATTTTOATCCGAATCCGCXAIAAA atgccgtttgaaaaccaatatgccgacaaxgggggcggag
SEQ. ID NO: 20
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu FhaB Neisseria meningitidis (séroskupina B)
TACGGAAACTGCAAGCGGATCCAGAAGTrACAGCGTGCATŤATTCGGTGCCCGTAAAAAAATGGCrGTTrrCTTTTAATC ACAATGGACATCGTTACCACGAAGCAACCGAAGGCTATTCCGTCAATTACGATTACAACGGCAAACAATATCAGAGCAGC CTGGCCGCCGAGCGCATGCTTTGGCGTAACAGACTTCATAAAACrrCAGTCGGAATGAAATTATGGACACGCCAAACCTA TAAATACATCGACGATGCCGAAATCGAAGTGCAACGCCGCCGCTCTGCAGGCTGGGAAGCCGAATTGCGCCACCGTGCTT ACCTCAACCGTTGGCAGCTTGACGGCAAGTTGTCT7ACAAACGCGGGACCGGCATGCGCCAAAGTATGCCTGCACCGGAA gaaaacggcggcgatattcttccaggtacatctcgtatgaaaatcattactgccggtttggacgcagccgccccatttat TTTAGGCAAACAGCAGTTTTTCTACGCAACCGCCATTCAAGCTCAATGGAACAAAACGCCGTTGGTTGCCCAAGATAAAT TGTCAATCGGCAGCCGCTACACCGTrCGCGGATTrGAXGeGGAGCAGAGTCTTrrCGGAGAGCGAGGTOCTACTGGCAG AATACTTTAACTTGGTATTTTCATCCGAACCArCAGTrCTATCrCGGTGCGGACTATGGCCGCGTATTrGGCGAAAGTGC ACAATATGTATCGGGCAAGCAGCTGATGGGTGCAGTGGTCGGCTTCAGAGGAGGGCATAAAGTAGGCGGTATGTTTGCTT ATGATCTGTTTGCCGGCAAGCCGCrrCATAAACCCAAAGGCTrrCAGACGACCAACACCGTTTACGGCTTCAACTTGAAT TACAGTrTCTAACCTCTGAATTTTrrACTGATATrTAGACGGTCTTTCCTTATCCTCAGÁCCGTCAAACTTTACCTACGT acttggcgcgcagtacgttcatcttcaaaAtggaatagac .
SEQ. ID NO: 21
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Lipo02 Neisseria meningitidis (séroskupina B)
TTATCrrGGTGCAAAACTTTGTCGGGGTCGGACTGGCTACGGCTTTGGGTTTGGACCCGCTCATCGGTCTGATTACCGGT
TCGGTGTCGCTGACGGGCGGACACGGTACGTCAGGTGCGTGGGGACCTAATTTtGAAACGCAATACGGCTTGGTCGSCGC
AACCGGTTrGGGTATTGCATCGGCTACTTTCGGGCTGGTGrrCGGCGGCCTGATCGGCGGGCCGGTTGCGCGCCGCCTGA
TCAACAAAATGGGCCGCAAACCGGTTGAAAACAAAAAACAGGATCAGGACGACAACGCGGACGACGTGTrCGAGCAGGCA
AAACGCACCCGCCTGATTACGGCGGAATCTGCCGTTGAAACGCTTGCCATGTTTGCCGCGTGTTTGGCGTTTGCCGAGAT
TATGGACGGCTTCGACAAAGAATATCTGTTCGACCTGCCCAAATTCGTGTGGTGTCTGTTTGGCGGCGTGGTCAŤCCGCA
ACATCCTCACTGCCGCATTCAAGGTCAATATGTTCGACCGCGCCATCGATGTGTTCGGCAATGCTrCGCTTTCGCTTTTC
TTGGCAATGGCGTTGCTGAATTTGAAACTGTGGGAGCTGACCGGTTTGGCGGGGCGTGTAACCGTGATTCTTGCCGTACA
AACCGTGGTGATGGTTTTGTACGCGACTTnGTTACCTATGTCTTTATGCGGCGCGACTATGATGCGGCAGTATTGGCTG
CCGGCCATTGCGGTTTCGGCTTGGGTGCAACGCCGACGGCGGTGGCAAATATGCAGTCCGTCACGCATACTTTCGGCGCG
TCGCATAAGGCGTmTGATTGTGCCTATGGTCGGCGCGTTCTTCGTCGATTTGATTAATGCCGCGATTCTCACCGGTTT
TGTGAATrTCTTTAAAGGCTGATTrTCCGCCTTTCCGACAAAGCACCTGCAAGGTTTACCGCCTGCAGGTGCmTGCTA
TGATAGCCGCTATCGGTCTGCACCGTTTGGAAGGAACATC
SEQ. ID NO: 22
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Tbp2 Neisseria meningitidis (séroskupina B)
CCTACTCCACCGATTČCAATATGCTCGGCGCGACCCACGAAGCCAAAGACTTGGAATTTTTGAACTCGGGCATCAAAATC
GTCAAACCCATTATGGGCGTrGCCTTTTGGGACGAAAACGTTGAAGTCAGCCCCGAAGAAGTCAGCGTGCGCTTTGAAGA aggcgtgccggttgcactgaacggcaaagaatacgccgaccccgtcgaactcttcctcgaaggcaaccgcatcggcggcc
GCCACGGCTTGGGTATGAGCGACCAAATCGAAAACCGCATCATCGAAGCCAAATCGCGCGGCATCTACGAAGCCCCGGGT
ATGGCGTTGTTCCACATCGCCTACGAACGCTTGGTGACCGGCATCCACAACGAAGACACCATCGAACAATACCGCATCAA
CGGCCTGCGCCTCGGCCGTTTGCTCTACCAAGGCCGCTGGTTCGACAGCCAAGCCTTGATGTTGCGCGAAACCGCCCAAC gctgggtcgccaaagccgttaccggcgaagttaccctcgaactgcggcgcggcaacgactactcgattctgaacaccgaa
TCGCCCAACCTGACCTACCAACCCGAACGCCTGAGTAXGGAAAAAGTCGAAGGTGCGGCGTTTACCCCGCTCGACCGCAT'
CGGACAGCTCACGATGCGCAACCTCGACATCACCGACACCCGCGCCAAACTGGGCATCTACTCGCAAAGCGGrrTGCTGr
GGTCGTCTGAAAAGATGATCCCTrATGTTAAAAGGAATCCTATGAAAGAATACAAAGTCGTCATrrATCAGGAAAGCCAG
GCTGGCGGGTCGAGACCTrTGCAATAACATAGGrrACTAA
44
4 4
4 • 4
4444
4 4 • 4 4
4444
SEQ. ID NO: 23
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce.
vzhledem ke genu PorA Neisseria meningitidis (séroskupina B) gaatgacaattcataagtttcccgaaattccaacataaccgaaacctgacaataaccgtagcaactgaaccgtcattccc
GCAAAAGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATGCCIGíTGCTTTTCATTTCTAGATTCCCACTT
TCGTGGGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTrTCCGATAAATTCTTGAGGCAZTGAAATTCCAAATTCCCGCCTGCGC gggaatgacggctgcagatgcccgacggtctttatagtggattaacaaaaatcaggacaaggcgacgagctgcagacágt
ACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTAGTGCTTCAGTATCTTAGAGAATCGTrCTCTTTGAGCTAAGGCGAGGCAACGTC
GXACTGGTITTrGTTCAŤCCACTATATATGACACGGAAAACGCCGCCGXCCAAACCATGCCGTCTGAAGAAAACTACACA
GATACCGCCGCTTATATTACAATCGCCGCCCCGTGGTTCGAAAACC7CCCACACXAAAAAACTAAGGAAACCCTATGTCC
CGCAACAACGAAGAGCTGCAAGGTATCTCGCTTrrGGGTAATCAAAAAACCCAATATCCGGCCGAATACGCGCCCGAAAT rrTGGAAGCGTTCGACAACAAACATCCCGACAACGACTATTrCGTCAAATTCGTCTGCCCAGAGTrCACCAGCCTCTGCC
CCATGACCGGGCAGCCCGACTTCGCCACCATCGTCATCCGCTACATTCCGCACAICAAAATGGTGGAAAGCAAATCCCTG
AAACTCTACCTCTTCAGCTTCCGCAACCACGGCGATTTTCATGAAGACXGCGTCAACATCATCATGAAAGACCTCATTGC
CCTGATGGATCCGAAATACATCGAAGTATTCGGCGAGTTCACACCGCGCGGCGGCATCGCCATTCATCCTTTCGCCAATT
ACGGCAAAGCAGGCACCGAGTTTGAAGCATTGGCGCGTAA
SEQ. ID NO: 24
Promotorová oblast PorA Neisseria meningitidis (séroskupina B)
GATATCGAGGTCTGCGCŤTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTmGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATA
TAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGCGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATA
ATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTAXCAAATTTACAAAAGGAAGCCCAT
SEQ. ID NO: 25
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu PorB Neisseria meningitidis (séroskupina A) gťcttctgtctttgagggaatgacgggacgtaggttcgtaagaacgacgggataíaggttcccg-cgcggatggatccgcc attcccgcgcaggcgggaacctagaacgtggaatccaagaaaccgtctcacccgataagtttccgzgcggacaagtttgg acccccgcccgcgcgggaatgacggga-ctttaggťc-cccaatttcggtttcctgcstttgagggaacgacgggacgcagg ttcgtaggaatgacgggatacaggtttecgrgcggatggattcgtcatzcccgcgcaggcgggaatctagaccctagaac aacagcaacaCtcaaagatcatctgaaagtccgagatcctagattcccgccsgagcgggaatgacgaaaagtggcgggaa cgacggttagcgttgectcgcctcagctcaaagagaacgattc-ectaaggegctgaagcaccaagtgaatcggtcccgta ccacttg-cactgtctgcggcctcgtcgccctgtcctgattcttgttaatccactacctcctgccgcaggggcgggctccg .
čacccgcccgccccgaaagaaaccgcgtgcgcgttttccgccgtcccsacaacscccggcccgcaasgccccccaatacc cccccgagtaagtgttgtaaaaatgcaaaccttaaaaaacttaaacaaccatatgttataaaacaaaaaacacccacaat atctctatccg-cccttcaaaacgcacatcgaactccacacaaaaacaggcagaagčfcgttctttcagacaggaacaccc atagttccagacatgtaaccgccgagccccccggcgg-caaatgcaaagczaagcggcctggaaagcccggcctgcccaaa ťctctCaaccaaaaaaggaatacagcaatgaaaaaatcectgattgccc-gactxcggcagceccccctgtcgcagcaae ggctgacgttaccctgcacggeaccatcaaaaccggegta
SEQ. ID NO: 26
Promotorová oblast PorB Neisseria meningitidis (séroskupina B)
GTTrTCTGTTTTTGAGGGAATGACGGGATGTAGGTTCGTAAGAATGACGGGATAXAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGTC
ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGAACGTGGAATCTAAGAAACCGTTTTATCCGATAAGTTTTCCGTGCGGACAAGT7TG
GATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGGATTTTAGGTTTCTAATnTGGTTTTCXGTTCTGAGGGAATGACGGGATGTAG
GTTCGTAGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCG7CATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCTTAGAA
CAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTC7AGATTCCCGCCTGAGCGGGAATGACGAAAAGTGGCGGGA
ATGACGGTTAGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACTAAGTGAATCGGTTCCGT
ACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTrGTCCTGATTTTTGTTAAXCCACTAT
SEQ. ID NO : 27
Nukleotidová sekvence Oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu siaABC Neisseria meningitidis (séroskupina B)
ATACGGCCAATGGCTTCAGAAAGCGATAAGCCTCTGGCTGAAAAACCGATTTCTTGTGTTCTCCCCACCGCACCCATAGA CGTAAAGGTATAGGGATIGGTAATCATGGTAACCACATCACCGCGACGCAGCAAAATATrrTGTCGCGGATrrGCAACTA AATCTTCCAAGGCAACAGTTCGTACTACATTGCCACGTGTCAGCTGCACATXCGTATCCTGCACATTTGCCSTTCAACCA CCTACCGCAGCCACCGCATCCAACACACGCTCACCGGCTGCCGTCAGCGGCATACGCACACTATTCCCAGCACGAATCAC CGACACATTCGCCGCATTATrCTGCACCAAACGCACCATCACTTGTGGCTGATTGGCCATTTTTTTCAGGCGGCCTTrAA TAATTTCCTGAACCTGACCAGGCGTTrrACCGACCACCGAAATATCGCCAACAAACGGCACAGAAACCGTACCACGXGCC GTGACCAACTGCTCTGGCAACTTAGTTTGATGCGCACTACCCGAGCCCATCGAAGAAAGGCCACCACCAAACAATACTGC CGGCGGCGCTTCCCAAATCATAATATCCAATACATCACCAATA-mAGCGTACCAGCCGAAGCATAACCATCGCCAAACr GAGTGAATGACTGATTTATCTGAGCCTTATATAATAACTGAGCAACCGTATGATrCACATCAATCAGCTCCACTTCAGGA ATTTGAACTTCAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAATTTTTTTTGCGC7 ggggcctGATGAAGGAATCGCAGAGCATCCTAC AATTAAACTTCCACACAATAATAATACTGCGTGACGAATATAAAATTTCACTTTAAACACAAGCCAAATCCTAATATAAT TATAAATGGCCTAATTATAGCACTTAATCGAAATAAATTTATGAGTACGTAGAGTATAATTAGTATTCTTCTTTCCAACT TCCTTATACTTATATATATATACTTATAGATTCTAAAATC
SEQ. ID NO: 28 ________ _____ ________________________________________________________ · ·
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Igt Neisseria meningitidis (séroskupina B) fcfc fcfc fcfc fcfc • fcfc « · fc· ·
- 103 • fc fcfc · • fcfcfcfc fcfcfc fcfc·· · • · fcfcfc fcfcfc ♦ fcfc · ·· ··»· fcfc fcfcfcfc ^^G«rc^GCGC^TGrcKCGCTCCC^CKGCCKGCGTCTTGCCAAAGCCGACTT<OT«lCCGAAATCCT
Sc^ST^A^SCTASS^^ASSS,3H^I3^GACt:GGC«CAAA2ACCCCTACGCCCTGCGGCG AACGATTATCCGCAACACATCGTTGCCGCCP^S^fB^ Ct»C7TTArGCAGGCGCGCCTTGCCGTGTTGCTGCAA GGcSS^CKSÍc^ACMCTKCC^^S^™^GCCGCSCCGTTrGGACGATTTGACCGCCAAACTGCA' AAGCCGATGC^STT^GCGCGGTTScGS^rSSS^ZCGCCGCCGC!:AACJlAACSCGTGCAAAAC!:TGC'rGAAAA : ^^Sp^S^^S^S^^^??SiyaGgaCtaAgAA*AAGCCCTCTrfGCCGCCGCGCAA sssssssr”“^“^^^
SEQ. ID NO: 29
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu TbpB Neissería meningitidis (kmen MC58)
GAACGAACCGGATTCCCACX ITCGTGoGAATGACGAATTTCAGGTTACrGrl· lÍl'Gt;r'i,'ri'PTr;'ii,T'i' ri'.'i'r:aaiaTaaT
GGGATTrCAGCTTGTGGGTATTTACCGGAAAAAACAGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGGTC
TGTCGGTGCGGAAACTTATCGGATAAAACGGTTTCTTGAGATmTCGTCCTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATlScGCG ^^.G^^f^C?,G5^,C^rl-ÍrfSCg?AG5CGGGaATCTaGaCArrCaATgCTaAGScaAT’rTArgSgGRA'I'SACT
GAAACTCAAAAAACTGGATTCCCACTTTCGTGvGAATGACGTGGTGCAGGTTTCCSTATGGATGGATTCGTCATTCCCGC '
GCAGGCGGGAATCTAGACCTTCAATACTAAGGCAATTTATCGGAAATGACTGAAACTCGAAAAACTGGATTCCCACmT
GTGGGAATGACGCGATTAGAGTTTCAAAATTTATTCTAAATAGC7GAAACTCAACACACTGGATTCCCGCCTGCGCGGGA
ATGACGAAGTGGAAGTTACCCGAAACTTAAAACAAGCGAAACCGAACGAACTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGA ATGTAGGTTCGTGGGAATGACGGCGGAGCGGTrTCTGCTTTTrCCAATAAATGACCCCAACTTAAAATCCCGTCATTCCC
GCGCAGGCGGGAATCTAGGTCTGTCGGTGCGGAAACTTATCGGGTAAAACGGTTTCTTGAGATTTTGCGTCCTGGATTCC
CACTTTCGTGGGAATGACGGAATGTAGGTTCGTGGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGACGCGTTCGGATTCATG ^?gG?g^*^rcGA^^CTAnC^AAAAAAATAAAAAAGTArrTGCAAArrT6TTAAAAATAAATAAA.
ATAATAATCCTTATCATTCTTTAATTGAATTGGATTTATT
SEQ. ID NO: 30 >
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu ope Neissería meningitidis (séroskupina A) caaaggctacgacagtgcggaaaaccggcaacatctggaagaacaicagttgttggacggcattatgcgcaaagcctgcc
GCAACCGTCCGCTGTCGGAAACGCAAACCAAACGCAACCGGTATTTGTCGAAGACCCGTTATAGTGGATTAAATTTAAAT
CAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACACTACAAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACTGGTTTAAATTTAATCC actatatgtggtcgaacagagcttcggtacgctgcaccgtaaattccgctatgcgcgggcagcctatttcggactgatta
GCCTAAAAGGAGACCGwATGCCTGATTATCGuGiATCCGGGGAGGGrrAAGGGGGTATTTGGGTAAAATTAGGAGGTATT tggggcgaaaatagacgaaaacctgtgtttgggtttcggctgtcgggagggaaaggaattttgcaaagatctcatcgtgt
GCGGuAGGAATCTATCGGAAATAACCaAAACCGGACGAACCTAGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGGCAGAGTGGTTT
CAGrrGCTCCCGATAAATGCCGCCATCTCAAGTCTCGTCATTCCCTTAAAACAGAAAACCGAAAT^GAAACCTAAAAXT tcgtcattcccataaaaaacagaaaaccaagtgagaataacaactcgttgtaaÁcaaatS^tS^^kto??
SZ^SZ^E^^^S^^^GAATATAATTGTAAGCGTAACGASI^GTaSGÍi
ACCATATCCGACTACAATCCAAATTrTGGAGATTTTAACT
SEQ. ID NO: 31
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu siaD Neissería meningitidis (séroskupina B)
ATAATGCAGGCGCTGAAGTTGTTAAACATČAAACACACATCGTTGAAGACGAAATGTCTGATGAGGCCAAACAAGTCATr ccaggcaatgcagatgtctctatttatgaaattatggaacgttgcgccgtgaatgaagaagatgagattaaattaaaaga ATACGTAGAGAGTAAGGGTATGATTrrrATCAGTACTCCrrTCTCTCGTGCAGCTGCTTTACGATTACAACGTATGGATA TTCCAGCATATAAAATCGGCTCTGGCGAATGTAATAACTACCCATTAATTAAACTGGTGGCCTCTTTTGGTAAGCCTATT ATTCTCTCTACCGGCATGAATTCTATÍGAAAGCATCAAAAAGTCGGTAGAAATTATT.CGAGAAGCAGGGGTACCTTATGC TTTGCTTCACTGTACCAACATCTACCCAACCCCTTACGAAGATG7TCGATTG0GTGGTATGAACGATTTATCTGAAGCCT TTCCAGACGCAATCATTGGCCTGTGTGACCATACCTTAGATAACTATGCTTGCTTAGGAGCAGTAGCTTTAGGCGGnCG ATTTrAGAGCGTCACTTTACTGACCGCATGGATCGCCCAGGTCCGGATArrGTATGCTCTATGAATCCGGATACTTrTAA AGAGCTCAAGCAAGGCGCTCATGCnTAAAATTGGCACGCGGCGGCAAAAAAGACACGATTATCGCGGGAGAAAAGCCAA CTAAAGATTTCGCCTTTGCATCTGTCGTAGCAGATAAAGACATTAAAAAAGGAGAACTGTTGTCCGGAGATAACCTATGG gttaaacgcccaggcaatggagactí cagcgtcaacgaatatgaaacattatttggtaaggtcgctgcttgcaatattcg CAAAGGTGCTCAAATCAAAAAAACTGATATTGAATAATGCTTATTAACTTAGTTACTTTATTAACAGAGGATTGGCTATT ACATATAGCTAATTCTCATTAATTTTTAAGAGATACAATA
SEQ. ID NO: 32 -----------------Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu ctrA Neissería meningitidis (séroskupina B)
ATACCTgČaCTTGAGTTGČČGACCATAAATTTAGCATGTTTČAATAAGACTAAAAAATATTCAAATCGAATGGAAGGAAA | • ·» · • * ·
104
TGCAATAAATTrATCAGATTGATATTTTAATAATTCTTGCAGAATACTTTCAGTGCCAGTGTCATTATTAGGGTAGATGC
TAATGATATTTTGGCCACCTAATTCTAATGCTTTGAAATATTGGGCCGCATATrG7GGCATTAAATGTGCTTCTGTAGTC
ACGGGGTGAAACATAGAAATACCATAATTTTCGTATGGTAAACCGTAATATTCTTrGACTTCTTCTAAGGATGGGAGGGT
GGAAGAGGCCATAAGAXCTAAATCGGGGGAGCCGATGATGTGAASATGCTTTCTTTTTTCTCCCATTTGCACTAGGCGAG 'TGACAGCTTGTTCATTTGCTACCAAGTGGATATGAGAAAGTTTACTXATAGAATGACGAATGGAGTCATCTACTGTACCA
GATAGTTCACCACCTTCGATATGGCAAACTAAACGGCTGCTTAATGCACCTACAGCTGCGCCTGCTAGTGCT7CTAAACG
GTCGCCGTGAATCATGACCATATCAGGTTCAATTTCATCAGATAGACGAGAGATAAACGTAATGGTATTGCCTAAAACGG
CACCCATTGGTTCACCTTGGATTTGATTrGAAAACAGAIATGTATGTTGATAGTTTTCTCGAGTTACTTCCTTGTAGGTr
CTGCCATATGTTTTCATCATATGCATACCAGTTACAATCAAA7GCAATTCAAGGTCTGGGTGAT?TTCAATATAGGCTAA
TAAAGGTTTrAGCTTGCCGAAGTCGGCTCTGGTACCTGTAATGCAAAGAATTCTrrrCKTGATTrTAGAATCTATAAGTA
TATATATATAAGTATAAGGAAGTTGGAAAGAAGAATACTAATTATACTCTACGTACTCATAAArTTATTTCGATTAAGTG
CTATAATTAGGCCATTTATAATrATATTAGGATTTGGCTT
SEQ. ID NO: 33
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu IgtFNeisseria meningitidis (séroskupina A)
TCTTTTTCGGACTGAAAGGACGCATCATCCCGACATCGAGCGCGTGTTCGTCCGGCAGCCAAGGCATAGGTTATGCCTAC
GAAGCCATCAAATACGGTCTGACCGATATGATGCTGGCGGGCGGAGGCGAAGAATTrTrCCCGTCCGAAGTGTATGTTrT
CGACTCGCTTTATGCCGCCAGCCGCCGCAACGGCGAACCGGAAAAAACCCCGCGCCCATACGACGCGAACCGCGACGGGC
TGGTCATCGGCGAAGGCGCGGGGArrTTCGTGCTGGAAGAAÍTGSAACACGCCAAACGGCGCGGTGCGATAATTTACGCC
GAACTCGTCGGCTACGGAGCCAACAGCGATGCCTACCATATTTCCACGCCCCGCCCCGACGCGCAAGGCGCAATCCTTGC
CTTTCAGACGGCATTGCAACACGCAGACCTTGCGCCCGAAGACATCGGCTGGATTAATCTGCACGGCACCGGGACGCACC
ACAACGACAGTAIGGAAAGCCGCGCCGTTGCAGCGGTTTTCGGCAACAATACGCCCTGCACGTCCACCAAGCCGCAAACC
GGACACACGCTGGGCGCGGCGGGCGCAATCGAAGCCGCGTTCGCGTGGGGCATTGCTGACCGGAAAAGCAATCCCGAAGG
GAAACTTCCGCCCCAGCTTTGGGACGGGCAGAACGATCCCGACCTTCCCGCCATCAACCTGACCGGCAGCGGCAGCCGCT
GGGAAACCGAAAAACGCATTGCCGCCAGCTCGTCGTTTGCCTTCGGAGGAAGCAACTGCGTrrrACTCATCGGATGAAAT
AAGTTTGTCAATCCCACCGCTATGCTATACAATACGCGCCTACTCTTGATGGGTCTGTAGCTCAGGGGTTAGAGCAGGGG
ACTCATAATCCCTTGGTCGTGGGrrCGAGCCCCACCGGACCCACCAArrCCCAAGCCCGGACGTATGTTTGGGCTTTTTT
GCCGCCCTGTGAAACCAAAATGCTTTGAGAAACCTTGATA
SEQ. ID NO: 34
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu IgtB Neisseria meningitidis (séroskupina B)
TAGAAAAATATTTCGCCCAATCATTAGCCGCCGTCGTGAATCAGACTTGGCGCAACrrGGAGATTTTGATTGTCGATGAC
GGCrCGACAGACGGTACGCTTGCCATTGCCAAGGArrTTCAAAAGCGGGACAGCCGtATCAAAATCCTTGCÁCAAGCTCA
AAATrCCGGCCTGATTCCCTCTTTAAACATCGGGCTGGACGAATTGGCAAAGTCAGGAATGGGGGAATATATTGCACGCA .
ccgatgccgacgatattgccgcccccgactggattgagaaaatcgtgggcgagatggaaaaagaccgcagcagcatcgcg
ATGGGCGCGTGGCTGGAAGTTTTGTCGGAAGAAAAGGACGGCAACCGGCTGGCGCGGCATCACAGGCACGGCAAAATTTG gaaaaagccgacccggcacgaagatattgccgactttttccctttcggcaaccccatacacaacaacacgatgattatga
GGCGCAGCGTCATTGACGGCGGTTrGCGTrACAACACCGAGCGGGATTGGGCGGAAGATTACCAATTrrGGTACGATGTC ,
AGCAAATTGGGCAGGCTGGCTTATTATCCCGAAGCCTTGGTCAAATACCGCCTTCACGCCAATCAGGTrTCATCCAAATA
CAGCATCCGCCAACACGAAATCGCGCAAGGCATCCAAAAAACCGCCAGAAACGArrTrrTGCAGTCTATGGGrrrTAAAA'
CCCGGTTCGACAGCCTTGAATACCGCCAAATAAAAGCAGTAGCGTATGAATTGCrGGAGAAACATTrGCCGGAAGAAGAT
TTrGAACGCGCCCGCCGGrrrrrGTACCAATGCTTCAAACGGACGGACACGCTGCCCGCCGGCGCGTGGCTGGATmGC
GGCAGACGGCAGGATGCGGCGGCTGTTTACCTTGAGGCAATACTrCGGCATTTTGCACCGATTGCTGAAAAACCGrrGAA
AAACGCCGCTTTATCCAACAGACAAAAAACAGGATAAATT
SEQ. ID NO: 35
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Ist Neisseria meningitidis (séroskupina B)
GCGCACGGCTrTrrcrrCATCGGTrTGAGGGTCGGCAGGATAATCGGGGACGGCAAAGCCTrTAGACTGCAATrCrrrÁA’ TCGCGGCGGTCAGTTGAGGTACGGATGCGCTGATGTTCGGCAGTrTGATTACGTTTGCATCGGGCTGTTTCACCAGTTCG CCCAATTCGGCAAGCGCGTCGGGTACGCGCTGCGCTTCGGTCAGATATTCGGGGAATGCCGCCAAAATACGGCCGGACAG GGAAATGTCGGCAGTTTTGACATCAATATCGGCGTGGCGGGCAAACGCCTGCACAATCGGCAGCAGCGATTGGGTCGCCA GCGCGGGGGCTTCGTCGGTATGGGTATAAACAATGGTGGArrrrTGAGTCATAGGATTATTCTCTTGTAGGTTGGTrrrr TCTTTTGGAACACATTGCGCGGGGAATGTGCGCGGCTATTATGGCATATTTTGGCGGCTTTGTTCGCGCTTTGTTCGATC TTGGCGTGTTTGAACGCGGCAGCGTGAAAGGAAGGGGGAAATGGTTTTCCCGCGTTTGGCGGCGGTGTCGGAGGTGCTGT GCCTGATGTGCGGCGGCATATTTTCGGTGAAATTGATTTTATAGTGGTTTAAATTTAAACCAGTACAGCGTTGCCTCGCC TrGTCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTTGCCTTGTCCTGAríTAAATTTAAACCACTATAATATTCGGTAACTG TCGGAATATCTGCTAAAATTCCGCATTTTICCGCCTCGGGACACTCGGGGCGTATGTTTAATTTGTCGGAATGGAGTTTr AGGGAT _
SEQ. ID NO: 36
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu msbB Neisseria meningitidis (séroskupina B) _
GCCCGACGGCGAACAGACACGTCGTGAAATCAACCGCTTGGACAGTACGGCGGCGCAATÁCGACATGCTTGCAGGTrATC TTGAAAGACTTGCCGGAAAAACCGACCGTTGGGCGTGCGCCTACCGCCAAAATGCCGTCTGAACACCCGATTATCCTTTT GAAAGCGCGACTATGCCCCATACCCTTGCCGATATTTCCCAATGTATCAGACAAAATrrGGAACAATATTTCAAAGACCT GAACGGTACCGAACCTTGCGGCGTGTACGATATGGTCTTGCATCAGGTGGAAAAACCGCTGCTGGTGTGCGTGATGGAAC ; AATGCGGCGGCAACCAGTCCAAAGCCTCCGTCATGTTGGGACTGAACCGCAATACTTTGCGTAAAAAACTGATTCAACAC i . GGTTTGCTGTGAATATGTCGGCAACCGTCCGTATCTTGGGTATTGACCCGGGCAGTCGCGTAACGGGTTTCGGTGTCATC ' GATGTCAGGGGGCGCGATCATTTTTACGTCGCCTCCGGCTGCATCAAAACGCCTGCCGATGCGCCTCTGGCAGACAGeAT' i TGCCGTGATTGTGCGGCATATCGGCGAAGTCGTTACCGTTTACAAGCCTCAACAGGCGGCAGTGGAACAGGTGTrCGTCA φ ·* ·· φ · · * ·
- 105 911119 · 9
111
11 9191 ·· ·· • · · » • · * • · · «« ··*·
ACGTCAATCCGGCATCSACGCTGATGCTCGSTCAGGCTAGGGSCSCGGCATTgfignfyftTT|jJ~’rCAGCCS.TAAGCTGCCC GT^CGGAATACACG6CCT?GCAGGTCAAACAGGCGGTAGTCGGCAAGGGCAAGGCGGCAAAAGAACAGGTGCAGCM71T GGTGGTGCAGATGCTGGGGCTTTCGMAACGCCGCAGGAMTGGCGGCGGACGGTCTTCCCGTKCgS^^^OT acgcaaccacgggcttgcckcaaac-caatccttcggggatgcaggtcaagcIcIÉcagStt^tag-tcaScS CATTTGTATTTTGCCGTCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAG ^^-^A&tiTTrCAATAGTTTCAGACGG SEQ. ID NO: 37
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu htrB Neisseria meningitidis (séroskupina B)
CCGCCAAGCGTTTCCCCCTTTGTCGGGCTTAACATTTGCTTTGTACGGCAGACTTTTTCCCTTCATAACGCCGCCTTTCC ~
CCCGTCTCTAAGGTTTCACGGTAAGTTTACCCTTATAAAGAGTTGACTTACCATACTTATCCCTTTAAAACGATA—AAAG ggcgacagctgtaatacaagtatgttgtacggcagacctcttctaccaaacaaaaagttcctSagagttS^a
ATGGTGGTGGCGGGTTCACCTGATGTAGTTrCAGCGrGCGCrrrGOTAGTTT«GTMCCCTTCTTGAGGAGGCTCahr*
CGAAACTACGGTTGCCGACGCGCCAGCCGCACATGArGCTGGTCGTTAGAGGCCTCTAGrSnrrrrS^^-r·:
CTTCCGTAACTGAACTTGGTTCCGCGACCGCTGGTTCCAAACTACAAGCCGATACGGACGCTGCTTTGGGGCTGGGACTA
CGGCAAACGGTAGATAATGTCGGTGGCGGACTACGTCGCAGTTTCGCTTAATGCGTTTCTGCCGGAGGACGGAACCGACG cagggctgcgttttcgggttgactggcaccaaatgctatcgcttaggccgtttcattttgcgtaactatggcagcaggag
AGATACGTTGTGCTGGGCCTrTAGCCAATACTTCTCAACT i^i«AUiAi«^AfaCAWiA&
SEQ. ID NO: 38
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu MltA Neisseria meningitidis (séroskupina B)
TGCAAATATmGATGAGTCGAACACAATGTCCTGAAGCGCGITCCAAATGCCTGCTTCG
TGCAGCGCACGCAGCGAACCGGCAAGCAGACCAGCGGCAACGATAATCAGAAACGCCCCT
GTCCAACGGAAAAACTTCGCCAGATTCAGGCGCATCCCACCCIGATAAAICAACGCGCCA
ATCACGGCGGCAGCCAAAACCCCCGCTACCGCACCGGCCGGCATCIGCCACGTCGGGCTC
TGTTTGAATACGGCAAGCAGGAAAAAAACGCTCTCCAAACCITCGCGČGCCACGGCAAGA
AACGCCATACCGACCAAGGCCCATCCTTGACCGCTGGCACGGTTCAAAGCCGCCTGCACA
GTCAGCAlCeCGACAGCAACCAAACCGATAATGCCGACGACGAACTCCTGCTGCITCTGG
GGAATCTCGCCCGTrGCCGAATGGATTCCGTACCCCAGCCCCAAACACATCAAAGAAGCA
AGAACAACCCCSAACCAGACCTEAGGCATCAGTTTGGAATGTCCGGACTOrTXCAGAAAA
CCGGCAACGATGCCGACGATGAGCGCGGCTTCGAIACCCTCGCGCAACATAATEAAAAAA
GCGACCAGCAXAAACGCGAACGAACAAGGATGATGAATAAlAIATEATCGGAATArrrrC
CGCAGCTGCAGCTGCGCCCTGTGTIAAAATCCCCTCTCCACGGCrGCCGCAACGCCGCCC
GAAACCATCTrTCTEAXTACIGCCGGCAACATTGTCCATT
SEQ. ID NO: 39
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu ompCD Moraxella catarrhalis
GCTGATTTGTGAGCAAGCGGGCGCATCAGGGATTACCTrGCATTTGCGAGAAGATCGTCG
ACATATrCAAGATGAAGATGrrrAXGAATTGArrGGGCAATrGACAACACGCATGAATCT tgagatggcagtcactgatgagatgctaaatattgccctaaaggtacgaccagcatgggt
GTGTTTAGTACCAGAAAAACGCCAAGAGCTGACTACAGAAGGTGGGCTTGATATCGCCAA
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledemjcegenu copB Moraxella catarrhalis
GATGCTGTTAAAGTGGGTATrGGTCCrGGrrCTAXTTGTACAACCCSTArrCrrGCAGGC
ATTGGCGTCCCSCAGAXAAGTGCCATTGATAGTGTGGCAAGTGCGTTAAAAGATCGCATT • ·
Φ· ·
- 106 ·· ♦» » « 4 ·· ·· » · « ««« * »»· «
CCTTTGATTGCCGATGGCGGTATTCGTTTTTCGGGTGATATCGCCAAAGCCArCGCAGCA GGCGCTTCATGTATTATGGTGGGTAGCTTCTTGGCAGGrACCGAAGAAGCACCTGGT^ GTGGAArTATTCCAAGGTCGTTArTArAAGGCTTArCGrGSTATGGGCAGCTTGSSSSCA ATGTCTGGTCAAAATGGCTCATCGGATCGTTATTTrCAAGATGCCAAAGATGGTGTTGAA i AAACTGGTTCCAGAGGGTATCGAAGGCCGTGTTČCTTATAAAGGCCCTGTGGCAGGCATC i ATCGGTCAATTGGCAGGTGGTCTAAGATCATCCATGGGTTATACAGGrrGCCAGACCATC GAACAGATGCGTAAGAATACCAGCTTTGTCAAAGTGACTTCCGCAGGCATGAAGGAATCG CATGTACACGATGTACAGATTACCAAAGAAGCACCCAATTATCGCCAAAArrAACTCTAT
ACTGACACATGACTTATTGTCATATTTTTAAAATGCTTTTAATTTAGATTTTTAATTTAG ATAATGGCTAAAAATAACAGAATATTAATTTAAAGTrTTCAAAATCAAGCGATTAGATGA AATTATGAAAATAAATAACAATAATTCTGATTTATTTTAACCAATAATATCAATTATCAT TTACAAGAAAAATTTTTTTrGAyAAAATTCTTACrTGTACCTTGCTATTTTTTCTTATTJ ATCATTTTTGGCGGTATTTTCGTTGATTTTAGTAAGTAGATGAGCAAGGGATAATTTGAC AAAAACAAATTTGATTTCAAGCCTCATAATCGGAGTTATT
SEQ. ID NO: 41
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu D15 Moraxella catarrhalis
AAAACTGGTGATGTCTTCACTGCTATTCATGGTGAACCAATCAATGATTGGCTÁAGTGCC
ACCAAGATTATTCAGGCAAATCCAGAAACCATGCTTGATGTGACAGTCATGCGTCAAGGT
AAGCAGGTTGATTTAAAATTAATGCCCCGTGGTGTAAAGACACAAAACGGCGTAGTCGGT
CAACTGGGTATTCGCCCCCAGATTGATATCGATACGCTCATTCCTGATGAATATCGTATG
ACGATTCAATATGATGTCGGTGAGGCATTTACTCAAGCCATCCGACGAACTTATGATTTA
TCAATAATGACCTTAGATGCGATGGGTAAGATGATTACAGGATTGATTGGCATTGAAAAT
CTATCAGGTCCCATTGCCATTGCCGArGTTTCTAAGSCCAGTTTTGAGTTGGGATTTCAA gaagtgttatcgacagccgcáatcatcagtttaagcttggcagtactgaatcttttaccc
ATTCCAGTGTTAGATGGCGGGCATTTGGTATTTTATACTTATGAATGGATTATGGGCAAA
TCTATGAATGAAGCGGTGCAGATGGCAGCATTTAAAGCGGGTGCGTTATTGCTTTTTTGT
TTCATGTTACTTGCAATCAGTAACGATATCATGCGATTTTTTGGCTAAGTTCTGATTTAT
CGTACCATTAACAAAATTTTTGGCTTTTTTAAGCTGAAATACTTGCCAAATTTAACTTTT
TGGCTTACCTTTACACAATATAAATTTGGGTGTAGAAAATTTTGGATACATTTTTATACC '
TTATTTTTAGAAATTTTAAAAATTAAGTTTGGATAGACTTATGCGTAATTCATATTTTAA
AGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACA
AGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTGCCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGA
AAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG
SEQ. ID NO: 42
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu omp1A Moraxella catarrhalis acttggcgaaaataccatttatatcgattgtgatgttatacaggcagatggcggtacacg
CACAGCCAGTATCAGTGGTGCTGCGGTGGCACTTATíGATGCTTTAGAACACTTGCAGCG
TCGTAAAAAGGTTACCCAAGATCCGCTTTTGGGCTTGGTGGCAGCGGTTTCTGTGGGTGT
TAATCAAGGCCGTGTATTGCTTGATTTGGATTATGCTGAAGATTCAACTTGTGATACCGA
TTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGT7TATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGA
AAAGCCATTTACTCGTGCTGAAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAATTGG gcagattatcgaagcccaaaagcaagtattaggctggtgacatgctaatcgttcaagata
ATGGCGTGATCATCACATTAÁATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGG7GGTCGATGA
TATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTTGATTGCACCCGTTTTTTATG
CAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTGCAGT7GTGGTAT7TGTGTTTAATATTCAAAGGCAAA
AAGCCAAAACTTGTCATATGTTTTCACAAGGTCGCTTGAAGATTACGTCCAAACGCTTTG
AGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACA
AAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGxTTTGCTGATGACCGTG
AAATTAATATAGCCAAACAGGTACmTGGGAAAGTCAATCAAAACCAATGCGGTGGCGG
TAACATTGGCTAAGTAGTTGTTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCmAACTCCACCCA
CCTAACTTTTTCTTTGTTTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGATTTTATTTTAA
GTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAG7AGCCG7TC
SEQ. ID NO: 43
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu hly3 Moraxella catarrhalis
GTGATCGGCAACACCCCACCATTCAGGAGCAACCAAAATTGCCCGTGCCTTGCCTGTCTT
GGTGGTATCATTTGGCAGGGCAATGTGGCTAAGTAGTGGTCTGCCATCAGGTGCGGTGGT
GGTGAGTGTACGATTCGTTATTGTCATAAAATTATCCTTTTGGGTTGGATGATATCAATG
AAATACCCTACGGTTGTATGGAATTTTATCCATTGTACCACGGTATTGGTCTTTTTAAAT
TAACAAGCAGCTTCTAGCAAGTCAAAGTTTTTATGCCTATTTTTTCAGATTTTAAGGTAC
AATAAAGCCAATTGTTAATAATATGGTATTGTCATGATTTATGATGAATTGCGACCAAAA
TTTTGGGAAAATTATCCCTTAGATGCGTTAACAGATGCTGAATGGGAAGCATTATG7GAC.
GGATGTGGCGCGTGTTGTTTGGTGAAATTTCTTGATGATGACAATGTTAAATTGACCGAA
TATACCGATGTTGCCTGCCAGCTATTGGATTGCTCAACAGGATTTTGCCAAAACTATGCC
AAGCGTCAAACGATTGTGCCAGATTGTATTCGCTTAACACCTGATATGCTGCCTGATATG
CTGTGGTTGCCACGCCATTGTGCTTATAAGCGGTTGTATCTGGGCAAAATCTGCCAGCA . TGGCACAGGCTCATTAAACATAGCCAAAACCATGGTGCAGGATTTGCGAAAGTTTCAACr
GCTGGGCGATGTGTGAGTGAGCCTGGrATGAGTGATGAAGACATAGAAAGGCGAGTGGTG
AAATGGGTTAAACCTTGACATGATTGTTGACATGATTGACAGACAATAAAAATTGGCAAA
TTTGATAAAATTGGTGTATGTGTGTGATTTTATCAAAAGCACTTGAATAAAACCGAGTGA >
TACGCTAAATTGTAGCAAACCAATCAATTCATCATAATTTTAATGAACACGAGGTTAAAT ’
TATACTGTCTATGTCTGATGACAATTCAAGCACTTGGTCG
- 107 V»
9 9 4
91 • 19 9
SEQ. ID NO: 44 • ···* • 9
9 9
9 9 9
9 9
9 9 119
11 1
9 9
9919
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu IbpA Moraxella catarrhalis
TAACAAAGGCAACCCAACACGCAGTTATTTTGTGCAAGGCGGTCAAGCGGATGTCAGTAC
TCAGCTGCCCAGTGCAGGTAAATTCACCTATAATGGTCTTTGGGCaGGCTACCTGACCCA
GAAAAAAGACAAAGGTTATAGCAAAGATGAGGATACCATCAAGCAAAAAGGTCTTAAAGA
TTATATATTGACCAAAGACTTTATCCCACAAGATGACGATGACGATGACGATGACGATAG .
TTTGACCGCATCTGATGATTCACAAGATGATAATACACATGGCGATGATGAITTGATTGC
ATCTGATGATTCACAAGATGATGACGCAGATGGCGATGACGATtCAGATGATTTGGGTGA .
TGGTGCAGATGATGACGCCGCAGGCAAAGTGrATCATGCAGGTAATATTCGCCCTGAATT :
TGAAAACAAATACTTGCCCATTAATGAGCCTACTCATGAAAAAACCmGCCCTAGATGG
TAAAAATAAGGCTAAGTTTGATGTAAACTTTGACACCAACAGCCTAACTGGTAAATXAAA
CGATGAGAGAGGTGATATCGTCTTTGATATCAAAAATGGCAAAATTGATGGCACAGGATT
TACCGCCAAAGCCGATGTGCCAAACTATCGTGAAGAAGTGGGTAACAACCAAGGTGGCGG
TTTCTTATACAACATCAAAGATATTGATGTTAAGGGGCAATTmTGGCACAAATGGCGA agagttggcaggacggttacatcatgacaaaggcgatggcatcactgacaccgccgaaaa
AGCAGGGGCTGTCTTTGGGGCTGTTAAAGATAAATAAAGCCCCCCTCATCATCGTTTAGT
CGCTTGACCGACAGTTGATGACGCCCTTGGCAAXGTCTTAAAACAGCACTTTGAAACAGT
GCCTTGGGCGAATTCTTGGATAAATGCACCAGATTTGCCTCGGGCTAATATCTTGATAAA.
ACATCGCCATAAAATAGAAAATAAAGTTTAGGATTTTTTT
SEQ. ID NO: 45
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu IbpB Moraxella catarrhalis CAGUTGIACCATTTGijIGAATATATACCATTTGGTGGTTTGiTGGATAmTACCAGGG CTTGAGGGTGTCGCTAGCCTAAGCCGTGGCGATGATAAGCAACCACCGCTCAAATTGGGC GGCGGCGTGGGCGATACGATTGGTGCGGCAATTTGTTATGAGGTGGCATATCCTGAGACG ACGCGTAAAAATGCACTTGGCAGTAATTTTTTATTAACCGTCTCAAACGATGCTTGGTTT ' GGTACAACAGCAGGTCCTTTGCAGCATTTACAAATGGTGCAAATGCGAAGCITGGAGACG GGGCGATGGTTTGTGCGTGCAACAAÁCAACGGAGTGACTGCATTAAXTGACCATCAAGGA CGGATTATCAAGCAGATACCGCAGTTTCAGCGAGATATTTTGCGAGGTGATGTACCCAGT TÁTGTTGGACACACGCCTTATATGGTTTGGGGGCATTATCCCATGTTGGGGTTTTCTTTG AAATTTTATACCGCTGATGGTGTGGTAGACCGCTGAATTGTGCCAC7T7GGGCGTTAGAG CATGAGCAAGATTAGGCGTTGGGTGAGCTTTGGTTGTATTACTCATCAGCCTACCCGAAA CCTGCCAAACATCACCGCCCAAAACCTAAACATACAATGGCTAAAAArArCAGAAAATAA CTTGCTGTATTGTAAATTCTTATGTTATCATGXGATAATAATTATCATTAGTACCAAGAT AXCCATTACTAAACTTCArCCCCCATCTTAACAGTTACCAAGCGGrGAGCGGATTATCCG ATTGACAGCAAGCTTAGCATGATGGCATCGGCTGATTGTCTTTTTGCCTrGTTGTGTGTT TGTGGGAGTTGATTGTACTTACCTTAGTGGTGGATGCTTGGGCTGATTTAATTAAATTTG ATCAAAGCGGTCTTCACAACACACCAAACGAGATATCACC
SEQ. ID NO: 46
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu tbpB Moraxella catarrhalis
AGTTTGCCCTGATTTTGAGAGCCACTGCCATCATGAArTTGTTGGCGTAftACACCACTCG
GCGGCGGCGTGGTCTTGGGTGCTAAAAATATTGCATGATGTCCAGCGAACTTCTGCACCC
AAGGCAACCAAAGTCXCAATCAGCACCGCTGTTTGAATGGTCATGTGGATACAGCCTAGG'
ATTrrAGCACCCTrAAGTGGTTGCTGGXCTTGATAGCG7XTTCTTAACCCCATCAGGGCT ggcatctcagcttctgccaaggcaatctcacggcgaccataatcggctaaacggatatca gcgactttataatcggtgaagttttgggtggtacttggattgattgaggtaggcatatct
TTATTCCXAAGCTATTTrAAAGTATTTTTAACAATAATTTTGATGAATTTGAGArAATTG
ATGCTAAAAGGTTGAATGACCAAACCATCGCTAACAATCAAGAAAAGACATT7TAAGCAT
AAAAAGCAAATGTGXCTTGATGGCTTATTATAACAGTTAlTATGATAAArTTGGGTAGAA agttaaatggatcgttgggtaagtttgttggctatccttaattaattataattttttaat
AATGCTXTTACTTTATTTTAAAAATAGAGTAAAAAATGGTTGGCTTTGGGTTTTTATCTC
ACTATGGTAGATAAAATTGATACAAAATGGTTTGTATTATCACTTGTATTTGTATTATAA
TTTTACTTATTTTTACAAACXATACACTAAAATCAAAAATTAATCACTTTGGTTGGGTGG
TTTTAGCAAGCAAATGGrrATTTTGGTAAACAATTAAGTTCTXAAAAACGATACACGCTC
ATAAACAGATGGTTTTTGGCATCTGCAATTTGATGCCTGCCTTGTGnTTGGTTGGGGXGT
ATCGGTGTATCAAAGTGCAAAAGCCAACAGGTGGTCAT7G
SEQ. ID NO: 47
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu tbpA Moraxella catarrhalis • * β
108 • · ·· · · • # ····
9 9 • · • · • · ♦· ·· • « * rTGGGGGCGGATAAAAAGTGGTCTTTGCCCAAAGGGGCATATGTGGGAGCGAACACCCAA atctatggcaaacatcatcaaaatcacaaaaaatacaacgaccattggggcagactgggg gcaaatttgggctttgctgatgccaaaaaagaccttagcattgagacctatggtgaaaaa
AGATTTTATGGGCATGAGCGTTATACCGACACCATCGGCATACGCATGTCGGTTGATTAT
AGAATCAACCCAAAATTTCAAAGCCTAAACGCCATAGACATATCACGCCTAACCAACCAT
CGGACGCCCAGGGCTGACAGTAATAACACTTTATACAGCACATCATTGAtTTATTACCCA
AATGCCACACGCTATTATCTTTTGGGGGCAGACTTTTATGATGAAAAAGTGCCACAAGAC
CCATCTGACAGCTATGAGCGTCGTGGCATACGCACAGCGTGGGGGCAAGAATGGGCGGGT
GGTCTTTCAAGCCGTGCCCAAATCAGCATCAACAAACGCCATTACCAAGGGGCAAACCTA accagtggcggacaaattcgccatgataaacagatgcaagcgtctttatcgctttggcac
AGAGACATTCACAAATGGGGCATCACGCCACGGCTGACCATCAGTACAAACATCAATAAA
AGCAAŤGACATCAAGGCAAATTATCACAAAAATCAAATGTTTGTTGAGTTTAGTCGCATT
TTrTGATGGGATAAGCACGCCCTACTTTTGTTTTTGTAAAAAAATGTGCCATCATAGACA atatcaagaaaaaatcaagaaaaaaagattacaaatttaatgataattgttattgtttat
GTTATTATTTATCAATGTAAATTTGCCGTATTTTGTCCATCACAAACGCATTTATCATCA
ATGCCCAGACAAATACGCCAAATGCACATTGTCAACATGCCAAAATAGGCATTAACAGAC
TTTTTTAGATAATACCATCAACCCATCAGAGGATTATTTT
SEQ. ID NO: 48
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu ompE Moraxella catarrhalis
AAAGACATTACACATCATCATTCAAACGCCCAACCATGTACCTCTGCCCCGTGGTCGCAC
GCCAACGCTTTTTGATGCGGTGCG7TGGGTTCAGATGGCTTGT0AATCAT7TGGTTTTAT
TAAAATTCATACCTTTGGTAGTTTGGCTTTACCTGATATGTCATTTGATTATCGAAACAA
TACGCAGTTGACCAAACATCAATTTTTAGCCATTTGCCAAGCACTCAATATTACCGCTCA
TACGACCATGCTTGGTATTAAATCATCACATAAAGATACTTTACATCCATTTGAATTGAC
ATTACCCAAATACGGCCATGCCTCAAATTATGATGATGAATTGGTGCAAAACAATCCATT
GGCTTATTTTCATCAACTGTCTGCCGTCTGCCGATATTTTTATACCCAAACGGTTTGTAT
TGTTGGCGGTGAAAGCTCAGGGAAAACTACCTTGGTGCAAAAACTTGCCAATTATTATGG
TGCCAGCATCGCACCTGAAATGGGTCGATTATACACACACTCCCATCTCGGCGGTAGCGA
ACTTGCCCTTCAATACAGCGACTACGCATCCATTGCCATCAATCACGCCAACGCTATCGA
AACCGCTCGTACCAC7GCCAGCTCTGCTGTTACACTGATTGATACTGATTTTGCGACAAC
GCAAGCATTTTGTGAAATTTATGAÁGGGCGAACGCATCCGCTTGTCGCAGAATTTGCTAA
ACAAATGCGATTGGA~rrTACGATTTATTTAGATAATAATGTTGCTTGGGTCGCTGATGG
CATGCGTAGGCTTGGTGATGATCATCAACGCAGTTTGTTCGCCAATAAATTGCTTGAGAT
TTTGGCACGATATGATATTAGTTATCATATCATTAATGACACCGACTACCACAAACGCTA tctacaagcattaagcttgatagacaatcatatttttaatcattttacaaaaattcatga
CAATTAATTAGGGAAAATCTGATGAAAATTGATATTTTAG
SEQ. ID NO: 49
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu uspal Moraxella catarrhalis
GGATGTGGCATATCTGCCCATCGACCCAA7ACACATCGG7CGAGGCTATCAAGATGTGGT
ACGAATTAATAGCCAGTCAGGTAAGGGCGGTGCTGCGTATATCTTGCAGCGGCATTTTGG
TTTTAATTTACCACGCTGGACACAGATTGATTTTGCTCGTGTGGTACAGGCTTATGCAGA
AAGTATGGCGCGTGAACTAAAAACTGATGAGCTGCTTGAAATTTTTACCCAAGCGTATCT
TAAGCAAGATAAATTCCGCCTAAG7GACTATACCATCAGCAATAAAGGCGATGCTGTCAG
CTTCCAAGGCCAAGTAGCGACACCCAAAGCGGTGTTTGAGGTGATTGGTCAAGGCAATGG
TGCGTTATCTGCGTTCATTGATGGC7TGG7GAAATCCACAGGCAGACAGATTCATGTCAC
CAATTACGCCGAACACGCCA7CGA7AACAAAACCCATCAAAAAACCGATACGGATAACCA
AACCGATGCCGCCGTGCCGCTTA7ATCCAGCTGTCGGTAGAGGGGCAGATTTATTCAGGC
ATCGCCAC7TGCCATAGCACCG7ATCCGCCA7GCTAAAAGGTGCATTATCCGCT7TGGCA
CAGGCGTGGTAATCTGACCCAA7CAAAATCCTGCATGATGGCAGGATTTTATTA7TTAGT
GGGC7GCCCAACAATGATGATCA7CAGCA7GTGAGCAAA7GACTGGCGTAAATGACTGAT
GAGTGTCTATTTAATGAAAGATATCAATATATAAAAGTTGACTATAGCGATGCAATACAG
TAAAATTTGTTACGGCTAAACATAACGACGGTCCAAGATGGCGGATATCGCCATTTACCA
ACC7GA7AATCAG7T7GA7AGCCA7TAGCGATGGCAICAAG7TGTGTTGTTGTATTGTCA
TATAAACGGTAAAT77GG7T7GG7GGATGCCCCA7CTGA7T7ACCGTCCCCCTAA7AAGT
GAGGGGGGGGGAGACCCCAGTCA77TATTAGGAGACTAAG
SEQ. ID NO: 50
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu uspa2 Moraxella catarrhalis
CCCCAAGCTTTCCGi TťGrGTGCCTGCTijijrijíCGGGCGGTCATACCATGd kal. ÍGC GTG
CCGATGGTGTGGGCGTGTATCAGATATTGGGCGAGTCTATCGATGATGCGGTGGGTGAATGCTTTGATAAAACGGCAAAAATSCTCAAACTGCCCTATCCTGGTGGCCCAAATATCGAAA
AA77AGCCAAAAACGGCAACCCACACGCC7ATGAGC7GCCAAGACCCA7GCAGCA7AAAG
GGC7GGATTTTTCGT7CAG7GGCA7GAAAACCGCCAT7CATAA7CrCATCAAAGACACAC
CAAACGCCCAAAGCGACCCCGCCACACGAGCAGACATCGCCGCAAGCTTTGAGTATGCGG.'
TGG7GGATACTTTGGTCAAAAAAXGCACCAAAGCAC7ACAGA7GACAGGCATTCGCCAGC
- 109 -
• · ·· · ·· • Φ ·» • · ·· *· «
• •
• ···· • · · • • · • •
• · • · * • • •
··· · ·· ···· ···
TGGTGGTCGCAGGGGGCGTCTCTGCCAATCAGATGCTACGCCGCACCCTGACCSAGACGC
TCCGCCAAATCGATGCGTCGGTGTACTATGCCCCGACCGAGCTATGCAeSí;aTna>rftříTÍ·
CGATGATCGCCTATGCTGGCTTETGTCGGCTCAGCTGTGGACAGTCGGATGACTTGGCGG '
TTCGCTGTATTCCCCGATGGGATATGACGACGCTTGGCGTATCGGCTCATAGATAGCCAC
AGTAGGGTTTGGGTATTATTTATGTAACTTATATCTAATTTGGTGTTGATACTTTGATAA
AGCCTrGCTATACTGTAACCTAAATGGATATGATAGAGATTmcCATTTATCecA^aa
AAGAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAACTCTGTCTTTTATCTGTCCGCTeATW^TT
TCTGCCTGCCACCGATGATATCATTTATCTGCTTTTrAGGCATCAGTTATTTCACCGTGA
TGACTGATGTGATGACTTAACCACCAAAAGAGAGTGCTAA
SEQ. ID NO: 51
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (10G0 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu omp21 Moraxella catarrhalis gagtgaactttattgtaaaatatgattcattaaagtatcaaaatcatcaaacgcagcatc
AGGGTTTGCTAAATCAATTTTTTCACCATAATTATAGCCAXAACGCACAGCAAGCGTAGT
TATGCCAGCGGCTTGCCCTGATAAAATATCATTTTTGGAATCACCAACCATAATGGCATC agtcggtgcgatgcccagtgattgacacaggtataataaaggcgttgggtcgggcttttt
GACGCTGAGCGTAXCACCGCCAATCACTTGGTCAAACAGTGTCAGCCATCCAAAATGTGA
TAAAATTTTAGGCAAATAACGCTCAGGCTTATTGGTACAAArTGCCAAATAAAACCCCGC
TGCTTTTAATCGTTCAAGCCCTTGTATAACCCCTGCATAGCTTTGCG7ATTTTCAATTGT
TTTATGGGCATATTCTGCCAAAAATAACTCATGGGCATGGTGAATCATAGTCGTATCATA '
GAXATGATGTGCTTGCATTGCTCGCTCAACCAATTTTAGCGAACCATTGCCCACCCAGCT :
TTTGATGATATCAATTGGCATAGGCGGTAAGTTAAGCTTGGCATACATGCCATTGACCGC
CGCCGCCAAATCAGGGGCACTATCGATAAGCGTACCATCCAAAXCAAATATAATCAGTTT
XGGXAXXTXXXAAAXCAGTCAAXX^rTXACCAXXXGXCAXAXAAXGACAAAG^CAAAXXX
AGCAAXAXTTTAGTGCATTTTXTGGCGAAGXTTTAXGAAAACXGGTCAXXGGXTGCAAAA
CTXTACACAGXACCTATAAAACTTGCACAGXTAAXAAGAAATATXTTGTTACTAXAGGGG
CGTCAXTXGGAACAAGACAGXTAXTTGTAAAXAGTXAXTTGCAAAAGACGGCXAAAAGAC
AGAACAGCGXTXGXXXCAGXGAXXAACXAGGAGAAAAACA
SEQ. ID NO: 52
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu omp106 Moraxella catarrhalis
TTGATCGGrrTTGCCCUCTGTTTCATGAITrACTCAAAACAGGCGGCTrGATCGTGCTG
GCAGGTCTGACCCAAAACCAAACCCAAGCGGTCATCGATGCCTACTCGCCTTATGTTACG
CTTGATACGCCAimGTTATGCAGATeCCCAAGACTGCCArrGGCAACGCCTAAGCGGC
ATCAAACCTACCAACCCATAAGCGATATGCCATGAGCCACAAACCTAAGCCAACACCGCT
ATATCAACAAGTTGAGCAGACCGCCAAGCeCTATTCTGAGACATTGGGCGATGCTCATAC
TCATGATCTCTATGCCACTTTTTTGGCCGAATTTGAAAAACCGCTGCTCATCGCCGCACT cmtcacacgcacggcaatcagtcaaaaaccgcccaaatccttggtatcaatcgtggcac
ATTACGCACCAAAATGAAAACCCATCACTTACTTTAGACCGCCAGTTATCGCCATGGATA
TGGGCAGGTGTGCTCGCCTGCCGTATGATGGCGATGACACCCCATTIGCCCCATATCTGC
ACGATTTGACATGATTTAACATGTGATATGATTTAACATGTGACATGATTTAACATTGTT
TAAXACXGTTGCCATCATTACCAXAAXXTAGTAACGCAXTXGTAAAAATCAXXGCCCCCT
TTnTTATGTGTATCATATGAATAGAATATTATGATTGTATCTGATTArtGTATCAGAAT
GGTGATGCCTACGAGTTGATTTGGGTTAATCACTCTATTATTTGATATGTTTTGAAACTA
ATCTATTGACTTkAATCACCATATGGTTATAATTrAGCATAATGGTAGGCTTTTTGTAAA aaxcacaxggcaaxaxtgxxcxactgtxaccaccaxgcxtgaaxgacgaxccaaaxcacc agattcattcaagtgatgtgtttgtatacgcaccatttacccxaarasttcaatcaaat
GCCTATGTCAGCATGTATCATmTTTAAGGTAAACCACC TCAAAT
SEQ. ID NO: 53
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu HtrB Moraxella catarrhalis
ACTATrCTGCTTmGTrTrTCACGAATGCGAATGCCCAACTCACGCAACTGGCGATrAT
CAACT i'CAGCA6GTGCTTCGGTCAATGGGCAATCTGCCGTCrTGGTT rTTGGGAAGGCGA
TCACATCACGGATTGAGCTGGCACCAACCATCAGCArAATCAGGCGATCTAGACCAAATG ccaaaccaccgtgcggcggtgcaccaaaacgcaatgcatccatcaaaaacttaaacttaa
GCTCTGCTTCTTCTTTAGAAATACCCAAGGCATCAAATACCGCCTCTTGCATGTCAACCG tattaatacgcagcgaaccgccaccaatttctgtgccatttagtaccatgtcataggcaa
TGGATAGGGCGGTTTCGGGACrrrGTÍTGAGTTCCTCAACCGAGCCTTTTGGGCGTGTAA aaggatgatgaactgatgtccacttaccatcatcagtttcctcaaacattggaaaatcaa
CGACCCAAAGCGGTGCCCATTCACAGGTAAATAAATTTAAATCAG7ACCGATTTTAACAC gcaatgcacccatagcktcattgacgattttggctttatcggcaccaaagaaaatgatat
CGCCAGTTTGGGCATCGGTACGCTCAATCAGCTCAATCAAAACCTCATCGGTCATATTTT
TAATGATGGGTGArrGTAATCCTGArrCTTrrrCAACGCCATTArreATATTGCTrGCGT
CATTGACCTTAATATATGCCAATCCACGAGCGCCATAAATACCAACAAATtTGGTGTACT
CATCAATCTGCTTGCeACTCATGTTACCGCCATTTGGAATGCGTAAGGCAACAACACGGC
CTTTAGGATCTTGGGCGGGCCCTGAAAATACTTTAAATTCAACArGTTGCATGATGTCAG
CAACATCAATAAGTTrrAAG«AWGCG»AAT?»GGCTTATCTGAGGCATAATCACGCA tggcaťctgcgtaagtcatgcgggggaaggtatcaaactca
-110 SEQ. ID NO: 54
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu MsbB Moraxella catarrhalis
TGGATCATATrCTrTATTAATGGTACTGTTTAAACCTGTATTTTAAAGTTTATTGGGTCA
TATTTTCAAGCTCATCCCATCGCTCAAGCTTCATCATCAAAAGCTCATCAAiCTCTACCA
ATCGCTCACCAGCCTTCGTTGCTGCCGCCAAATCGGTATTAAACCAT3AACCATCTTCAA
TCm-rTGGCAAGCrGTGCCTGCTCrrGTTCAAGTGCAGCAATTTCArrAGGCAAATCTr
CAAGTtCACGCTGCTCTTTATAGCTGAGTTTGCGTTTTTGGGCAACGCCTGATTGAGGTG
GTTTGATTTGGATGGGTrCAGCGGGTTTTGTCGCCTTAGGTTiATTGTCTGTGGCGTGAT
GAGCAAGCCATCmCATGCTGTTGTACATAGTCTTCATAACCGCCAACATArrCCAAAA
CGATACCGTCGCCGTACTTATCAGTATCAAATACCCAAGTTrGGGTAACAACATTATCCA
TAAAAGCACGGTCATGGCTGATGAGTAATACCGTGCCTTTAAAATTGACCACAAAAICTT
CTAAAAGCTCAAGTGTTGCCATATCCAAATCATTGGTAGGCTCATCAAGCACCAAAACAT
TGGCAGGTTTTAGCAATAATTTGGCCAATAAAACSCGTGCTTTTTCACCGCCTGATAGTG
CTTTAACAGGTGTGCGAGCACGATTTGGCGTGAATAAAAAATCTTGCAAATAGCTTAAAA
TGTGCGTAGTTTTTCCACCAACATCGACATGCTCAGAGCCrrCTGAAACATTATCTGCGA
TAGATmTCAGGGTCTAGGTCGTCTTrSAGTrGGTCAAAAAAAGCAATA?TTAGATTGG
TGCCAAGCTTAACTGAACCTGACTGAATCGCTGAATCATCCAAACCGAAAATGCTTTTAA
TTAAGGTTGTTTTACCAACGCCATTTrTGCCAATGATACCAACTTíAXCACCACGAACAA
GCAGCGTTGAAAAATCCTTAACTAAGGTTTTATTGTCGTAT
SEQ. ID NO: 55
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu PilQ Moraxella catarrhalis
CAACTTGAAAATCAGCTCAATGCTCTGCCACGCACAGCACCGASGAGCGAGATTATCGGA
ATGATAAATACCAAAGCACAAGCGGrrAATGTGCAGGTGGTGAGTGCAÍCAGTTCAAGCA
GGTCGTGAACAGGATTATTATACCGAACGCCCTATCGCAGTGAGTGCGACAGGGGATTAT
CAIGCTTTGGGTCGATGGTTACTTGAGTTGTCAGAGGCTAACCATTTGCTGACAGTGCAT
GATTTTGATCTGAAGGCTGGTTTGAACCATCAGCXGATGATGATTGTTCAGATGAAAACT
TATCAAGCGAACAAACGCCCAAAACCAGTTGCTCAGCAGG7GCCTGATGTTCAATGAATA
TTATCGGTGGGGCATTTrGGGTGCTTGGATTrGGerrGGGArrGGATGTGCTGATAGCAC
CAGTCAAGTTGTTGATGATAAGCTTGCACATATTAČCCATGAAGAGCGTA“GGCGATCAG
TGAGCCTGTGCCGATACCCTTATCrGTGCCGATGATATATCAGCAAGGCAAAGArCCrrT
TATCAATCCTTATAGAAATGTTGAGGTTCTTGATACCAATCATGCCGCTGATCAGCAAGA
TGAGCCAAAAACCGAATCTACCAAAGCTTGGCCTATGGCAGACACTATGCCATCrCAGCC
ATCTGATACŤCATCAGTCTGCCAAGGCTCAGGCACAAGTCrrCAAAGGCGATCCGATAGT
CATTGATACCAACCGTGTTCGAGAGCCmAGAAAGCTATGAGTÍA?CAAGCCTACGCTA
TCATGGTCGTATTTTTGATGATGTTAGACTTGTGGCACTCATTASGAGTCCTGATGGCAT
CGTTCATCGTGTGAGTACTGGACAATATCTTGGTAAAAATCACGGAAAAATTACCCATAT tgacagtcgtacgatacatctgattgaagcggtcgctgatacacaaggtggctattatcg
CCGTGATGTAAACATTCATTTTATTCATAAGCAATGACAC
SEQ. ID NO: 56
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu lipol8 Moraxella catarrhalis
TTCATGCAACAAGCGACCATCTTGGCCGATGATACCATCCTGCXACCTAAGAAAATCAG
TTTATCAGCTTGCAGGGCAATGGCTGTGGTCAGTGCTACATCTTCTGCCAATAGATTAAA
AATTrCGCCCGTAACCGAAAAACCTGTCGGTCCTAGTAGGACAAXATGGTCATTATCCAA
ATTATGGCGAATGGCATCGACATCAATTGAGCGTACCTCACCTGTGArCTGATAATCCAT
ACCATCTCTGATGCCGTAAGGGCGAGCGGTGACAAAATTACCCGAAATGGCATCAATACG
AGATCCGTACATTGGGGAGTTAGCAAGCCCCATCGACAGCCGAGCTTCGATTTGTAGACG
AATTGAGCCGACTGCCTCCAAGATGGCAGGCATAGATTCATACGGTGTTACACGCACATT
CTCATGTAGGrrTGATATCAGCTrGCGATTrTGTAAATrrrrrrCGACTrGTGGGCGTAC accatgcacaagcaccaatttgatgcccaagctgtgtagcagtgcaaaatcatgaatcag
CGTACTAAAATTGTCACGAGCGACCGCCTCATCACCAAACATAACCACAAAGGTTTTGCC
ACGATGGGTGTTAATGTACGGGGCAGAATTACGAAACCAATGCACAGGTGTGAGTGCAGG
AGTGTTCTGATAGGTGCTGACAGAArrCATGAATGCTCCAAAGAGTCAATGGCTGGTAAA
ATAAGAATGGCGAACAATATATGGCGAGAGCGTCTGATGTÍGGTCAAATGTCCCATTAAT
AACTATCAAGATACCATCATACCATAGCAAAGTTTTGGGCAGAXGCCAAGCGAATTTATC
AGCTTGATAAGG7TGGCATATGATAAAATCTACCATCATCGTC3GCAGTTTTGAGCATGT
GTAAGTAGTTACCATAATTAAACAGTCAAGAAATTCACACCGTGAATCAGCTGTGCTATG
CT7ATGGGCACATAAAACTTGACCAACACAGGATAAATTTA
SEQ. ID NO: 57
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu lipol 1 Moraxella catarrhalis
GGCAT ACTTTrGCČATGCTTTATTTrGGCATAACTGCTATAAGCCCACTGCTACTTTTrA ~
TCATTTATCCATATGTCCAATAATGTGCTTTAIGTAATTTAGGCACACIArrAACTCGTG
CCACTGTTAACATtCAGCATAAAAATCTTAACAATGAATCAAAGCAICGTATTGGCTGTT
AAATGATAAGCrEATATrrATTTAAAITCAGACrAAATGATTGSAAIATGGACATATCAA • · · · ·· · · · · • · · · · · · · « · «
GGTTGAAATCAAAAATTTTGGAGAGTTATGTACGATAATGATAAAAAATTGACr-arra>rř>
GTAGGGGTGTTGTATACGGTGTCTTATATTGCCATATGGTTGGTCAGTGSCTM«a‘irT>!'a
TGGGGCTGGATTGGTGTGACAGGATTTACTCGTGCGATACTTTGGCTGATCGCTTGGATG
ATTGTGGGTACGATTGCTGATAGAATTCTGATACCGATrATTTTGACCGTCGTn«TTriAR
TTATTTTCTATCTTTTTTGAAAAMGGCGATAATTTGGITATTTrrrCACAAAAAATST
GATTTrrTTTGTAAACTAICTAAAATATCAATrATGTTATATTATGTGATAAAAGATGGG
CATGCTTAAGTTTTGGATTGCAAAAATCCTAATATCATCACTGACCAAAGCTGTGATGAT
ATCAAAACTTTATCAAAGTTCTTAGGGTATTATCAAGATATCATACCAAATGAATACTTA
CCCAACTTACTATAAAAATCAAATGATATGACTCTGATTTTATTATCATAGATACAAAAA
TCAAAACGCATGAGCCAAAGGTATGATGAATGAATACAAAATTTCGCACACATTATGACA atctaaatgtcgccagaaacgctgacattgcggtgatttggtgggataggggtcaagcca
GTGCGATTAAGCTAAATTTTTATGTGGGCAATCGCTGACTTTArTTTATTTGTGCCAGTT
GGAACAATTCGTGGTCTAATGTATTTATTTTAAGGAGATAA
SEQ. ID NO: 58
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu lipolC[Moraxella catarrhalis
TCTGGTCTACATCCCAAACTATTTACACAAGAAACACTAAAGACAGTGGAGCAGATGACG
CTCAAAAAGGCATCTTATAGTAATTTGACAGrrAATTTTCGTCAAGTGCTrGTACAAAAA
TACACCATCGTGCAAGAAGTTTGTACCAATTTAAGCACAATCATTTTGGCACACACTGTC
AAGCAATGCTTCAGGCAAATTAGCTGCTGGTAAAGATACTrGGGTCATCATGCAATCGCA
TCAACCCTTCTTGCTGCGTTGAAGCGATAAGTTTGCCATCTrGCCAAAAÍTGACCATGGT
TTAGACCCTTGGCGTGGCTTGTGGTATCGCTCCACATGTCGTAGAGTAGATATTCGGTCA
TATCAAAAGGGCGATGGAAATOTATGGAATGGTCAATACTAGCCATTTGTAGACCTTGTG
TCATCAGGCTrAGCCCATGACTCATTAAACCTGTGCTGACCAAATAATAATCAGACACAA
ACGCAAGTAGTGCTTGATGAArGGCAACrGGCTGCTCCCCAArATCAGCGATACGCACCC
AATTGGCTTGGCGTGGACGCTCAGGCTTGGGTGTCACAGGGTCTCGTGGTGTGACGGGGC ggatttcgacatgacgctgacgcataaatcttgctttgagtggttcgggaattttatgta
AATAATCCGCmGAGTTCTrGCTCGGTTTTTAGGCTTTCAGGGGGTGGATAATGAGGCA
TGGTTTCTTGGTAATCAAGCCCGCCTTCCATGGGTGAAAATGAGGCAATCATCGAAAAAA tgacctgttcattggtcgtatgattaccgtttttgtcggtggttggcXcatattgcaccg
CAATGACTTCTCGAGCTGATAAACTGCGTCCATCACGTAAGCGGCGTACTTGATAGATGA
CTGGTAGACGAATATCGCCACCTCGTAAAAAATAACCATGTAGGCTATGACAAGGTTTAT
CAATCGTTAATGTGTTAGCACCAGCAAGCAGCGCTTGGGCA
SEQ. ID NO: 59.
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Iipo2 Moraxella catarrhalis
TAAAATGACCTTACAAAATAAAATTATATGTTCAAAAATCGCTraaGTftTrGAAAAAAGC
TATAAAAACTTATCTATTAAAGCATAAAAGATATTAAAGCATAAAAGACGAGAAAAGAGC
AAGCGTCAATGATGATAtrrCATATAAAAACrrATGAAATTmCAArrrrTTATCGATr
GArrCAGCTrGGCTATCGGTGGTCAACTTTGGCrGCCAAGACATCGCCGGCTTtTrGAAA
AATCATCACAATGGCAACAATGATGATGGTTGAAATCCACrTGACATATACCArGTTGCG '
ATGCTCACCATAGTTAATCGCAAGGCTTCCCAAGCCACCACCGCCAACCACACCTGCCAT
TGCAGAATAACCAATCAAAGACACCAAGGTCAATGTGACCGCATTAATCAAAATGGGCAG
GCTTTCAGCAAAATAG7ATTTGCTGACAACCTGCCAATGCGTTGCACCCATAGATTTGGC
AGCTTCGGTCAGTCCTGTGGGTACTTCTAATAAAGCATTGGCACTCAAGCGTGCAAAAAA
TGGAATTGCTGCCACACTCAAAGGGACGATGGCGGCTGTTG7GCCAAGGGTTGTTCCCAC
CAAAAATCGTGTGACTGGCATGAGAATAATGAGCAAAATAATAAAAGGAACGGAGCGACC
AATATTAATAATAACATCCAAAATTACAAATACACTGCGATTTTCAAGGATACGCCCTTT
ATGGGTTAAAAArGCCAAAAACCCTArCGGTAGCCCAACCAAAACAGCGATGGCAGTGGC
AGCAAGCCCCATATAGATGGTrrCCCAAGTGGATTGGGCAACCATCTCCCACATTCTTCG
GTGCATTTCACTGACAAATTTTGTGACGATrTCATTCCACATAGCCGATAATCTCAATAT tgacccgaigggtggttaaaaattctattgcttgcatgaccgaggtgccttcaccgataa
GCTCAGCAATGGTAAAGCCAAATTTTATATCACCTGCATAA
SEQ. ID NO: 60
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Iipo7 Moraxella catarrhalis
AGTAAACAATGGTAACAAATACAGCAGTGTCGCACAGTCCTCAGTACGATGATTCTGAAT
TTGAATATGCAGGATTTTGGATACGATTTGTGGCATGTCTTGTCGATAATTTAATTGTTA
TGATTATAATTGCACCCTATTGGTTTTATAArTATCAGCAAATGATGGCCATGCCTGCrG
ACCAAATACCGTTTTATAGTGTTGGGGAXGCCATCCTTTATAGTGCTGGGGATGCTA7CG.
taaacttagtgatggcggcggcggttgtttggttttgggtaaaaaaaggtgcaacaccag
GTAAAATGCTC7TTGGGCTGCAAGTCCGTGATGCCAAAACAGGGCAATTTATCAGTGTGC
CAAGGGCATTATTGCGATAŤXTTAGl· TATCTGATTTCAXCCGTGATTCX TIGVXI 1'GGGAC
TTATTTGGGTOGTTTrGATAAGAAAAAACAAGGCTGGCATGATAAAATTGCCAAAACTG
TTGTGGTAAAACGCATTCGCTGATGGGTCGCCAGTTAAACAATAAAAKATCAAACGCAA
GCAGGGCGATGTGTTTGAGCAGTTGGCGGTAGATAAGCTAAAACAAGCAGGCTATGAAAT
TATTTTAACCAACTT7ACCACCCCATTTGTTCGGTGAGATTGATATTATCGCCAGACAGCCTTTGGAGCAATCGCACCGTTTGGTGCAGCCAAGATTTTGTACGGTATTTGTTGAAGTGCCr tagccgaacaagttctgtgtatggtacagcgcttgagagtgttaccxcaaaaaagcaggc
AAAAATCTACCGAACAtXAGAACGATTTTTAATCAATTATCCCAAMaiRTTGATGATGC
AXACCGmTGATGTCATGGTTTrTGATTTGGTTGATGGATTGATTGAACATGAATGGAT aaaaaatgcgttttgattggctcaatggtcgtgaaxtaaaatcaatcaagcaatccgtj^' '
CTTTAČTÁTÁAGArATArCCCAGTAATATGCaAACArMCA’'
-112 SEQ. ID NO: 61
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Iipo6 Moraxelja catarrhalis
CGTTTAGCTTCATACGCAGACCTTGTGCACCTTCGGGCAACCGAAGCATCACGCCAGCAT
CACGCATCCGCACAAAACCCATCATGCCATCAATTTCGCTGCTGATATGATATACCCCCA
CCAAAGTAAACCGCTTAAATCGTGGAATAACGCCTGCTGCTGAGGGTGAGGCTTCAGSCA
AAACCAAGGTAACCTTATCCCCCAACTTkAGTCCCATGTCAGAGACAATGGACTCACCTA
ATATAATACCAAACTCGCCGATATGTAAATCATCCAAATTGCCTGCGGTCATATGCTCAT
CAATGATAGAAACTTGCTTTTCGTAATCAGGCTCAATGCCAGAAACCACGATTCCAGTCA
CCrGACCTTCAGCGGTTAACATACCTTGTAGTTGAATATAAGGGGCAACTGCTTGCACrr
CTGGATTrTGCATTTTGATTrrTTCGGCAAGTTCTTGCCAATTTC?CAAAATTTCTGTTG
AGGTAACTGAAGCTTGAGGCACCATGCCAAGAATGCGTGATTTAATTTCACGGTCAAAGC
CATTCATGACCGACAAAACCGTGATAAGCACTGCAACCCCAAGCGTAAGCCCAATGGTTG
AGATAAAAGAAATAAAGGAAATAAAGCCATTTTTACGCTTAGCTTTGGTATATCTAAGCC
CAATAAATAACGCCAAGGGACGAAACATAAGCTGTGTTCCAAACGACCCAACCGIGCTAG
TTrAGCACrrrrTTGGACAAATACCAAACATCACATAACAAATGAATCATCAGGTTGGTT
TTGTrGCGCnGTGTATCTGTATGATAAGTWCTTGCTAAAACAGCTTmTATGTCAGA
ATACAGAAAAGGTATATACTTATATTTTTAACmAAATAGATCTGCTTTTTTATACCGA
TGATTTGGCATGAAGTTTATCGGTCTGATATGCTGGATATAAGTTTAICGGCTTGATATA
AATTTTAATTAATCATCAAATTTTTAAGGAATTTATCATTA
SEQ. ID NO: 62
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu P6 Moraxella catarrhalis
TAAGGATACCAGATTTTGGCTTGTCAATCGTTGTGTTAATCATTGTAACGGTTTATAGTG
ATTGTCAATTAATAAGGGTAAAAAAGTATTTATCAAGTAATAATCTTTCTTATATGTGAA lATAATGACAAATTTATCACATTmACAAGGATTTmATCAAGATTAGGATATGTTCC
AGCTTAATTATTAGTGATGAGCGTGrGATTATTTGGCATCGTTAAATTTATGAGTGCTAA
AATTGCCAAATGATTAAAATTTTGCTAACATGATAGCCCCTTTGGTAGGCTTTATTTGGT attgatgagcaataataatataccgagttaaatggattaacttaacatacgccaaaaact
TAACAACGAAAAGTAGATGATTATGACAGATACAGTACAAAAAGATACAGCACAGTCCCC
CAAAAAAGTTTATCTAAAAGACTACACGCCGCCAGTATATGCAGTTAATAAAGTGGATTT
GGATATCCGCTTGTTTGATGATCATGCTGTCGTTGGTGCCAAACTTAAAATGACACGAGC
ACACGCAGGCGAGCrrCGGCTTCTTGGGCGAGATTrAAAGCrrAAAAGCATrCACCTAAA
TGGTCAGGAATTAGAGTCGCAGGCGTATCAICTTGATAAGGAAGGCrr'AACAATtTTAGA
TGCACCAGATGTCGCAGTGATTGAGACATTGGTTGAGATTTCACCACAAACCAACACAAC
ACrTGAAGGGCTATATCAAGCAGGAACAGGTGATGATAAGAIGTTTGTGACACAATGCGA
ACCTGAGGGTTTTCGCAAAATCACCTTTTTCCCTGACCGCCCTGATGTOTGACAGAATA
CACCACACGCCTAGAAGCACCAAAGCATTTTAAAACCTTGCTtGCCAATGGTAATTTGGT
TGAGTCAGGAGATGTGGATGAAAATCGCCAITATACCATTTGGCASGATCCTACCAAAAA
ACCCAGC7ATCTATTCGCCGCTGTCATTGCCAATCTAGAAG
SEQ. ID NO: 63
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu MsbB Haemophilus influenzae (HiRd)
AAATCAAGCGCCTGTGCCTGCTGGTGATGGTTGTGGAGACGAAGTATATTCTTGGTTTGA .
ACCGCCAAAACCAGGCACTTCAGTGAGCAAACCTAAAGTTACACCGCCTGAGCCGTTTTT
GTGCCAACAGArrTTGAACTCACCGAATCGGAGAGAATGGTTAGAATAGCATTGAGGTAA
ATCAATATGGATATCGGCATTGATCTmAGCAATATTGTTTTGTGTTGGTTTTGTCGCA
TCArrTATCGATGCAATTGCTGGCGGTGGTGGATTAATCACCATXGAGCGTTACTCATG
ACAGGTATGCCACCAGCAATGGCGTTAGGCACCAACAAATTGCAAGC7ATGGGCGGTGCA ttaiccgcaagcctttatttcttgcgaaaaagagcggtcaatttacgcgatatttggttt
ATTTrGATTTGGGTTTTCTTAGGTTCTGCCCTAGGTACATTATCAATTCAATCAATTGAC
GTGGCGATTrTCAAAAAAATGCTTCCTTTmGATTTTAGCCATTGGTCTATATTmTA
TTTACTCCTAAATTAGGTGATGAAGATCGAAAACAACGATTAAGTrATCTGTTATTTGGT
CTTTTAG7TAGCCCATTTTTAGGTTTTTATGATGGC7TCTTTGG5CCAGGGACTGGCTCA
ATCATGAGTTTAGCCTGTGTTACTTTGCTAGGATTTAATCTCCCGAAAGCGGCAGCACAT
GCAAAAGTGATGAACTTCACTTCGAACCTTGCTTCTTTTGCACTTTrCTTATTGGGCGGA
CAAATTCmGGAAAGTGGGTTTCGTGATGATGGCTGGGAGCATTTTAGGTGCAAATTTA
G3TGCCAAAATGGTGATGACGAAAGG7AAAACCTTGATTCGACC3ATGGTTGTTATCATG
TCTTTTATGATGACGGCTAAAATGGTTTACGATCAGGGTTGGTrrCATTTTTAATTČGGA
AAGCGCGCAAAAGTGCGGTTAAAATTAATTACATTTTATTA
SEQ. ID NO: 64
Nukleotidové sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu HtrB Haemophilus influenzae (HiRd)
TTGAAGTCCCCAArřŤACCCACCAČAATTČČTGCGGCAACATTGGCIAGGTAACAAGATT
CTTCGAAAGAACGTCCATCTGCTAATGTGGTTGCTAATACACTAATGACAGTGTCACCGG
CICCCGTCACATCAAACACTTCTTTTGCAACGGTTGGCAAATGATAAGGCTCTTGATtTG
GGCGTAATAATGTCATGCCTTTTTCAGAACGCGrCACCAAAAGTGCGGTTAATTCAATAT'
CAGAAATTAATTTTAAACCmCTTAATAATCTCndTCIGTAITACATTTACCrACAA
-113 • 4 44 4· 44 • · · · « «
CGGCrTCAAATTCAGACATATTGGGTGTCAATAATGTAGCCCCACGATAACGTTCAAAAT
CAGTrCCCTTTGGATCGATCAACACAGGCACATTCGCTTTGCGTGCAATTTGAATCATTT
TCTGAACATCTrTAACC&rGCCrrrGCCGTAATCAGAAAGAATCAAACCACÚGTAATm· tcaccgcactttctaacttcgctaataaatccttgcaatctacattattgaaatcttctt
CAAAATCAAGGCGGAGeAGCTGTTGATGACGAGATAAAATACGTAATTrAGTAAIGGTTG
GATGGGTTTCTAATGCAACAAAATTACAATCAArCTTT IGt 11ΠCTAATAAGTCGGAAA GTGCAGAACCTGTCTCATCTTGTCCAATCAATCCCATTAACTGAACGGGTACATTGAGTG AAGCAATATrCATCGCCACATTTGCAGCACCGCCCGCGCGTTCTrCATTTtCTTGTACGC GAACTACTGGCACTGGTGCTTCXGGTGAAATACGGTTGGTTGCACCGAACCAATAACGAT CAAGCATCACATCGCCTAATACAAGTACTTTTGCTTGCTTAAATTCTGCTGAATATTGAG ccattttaaaatctctctatttgaataaccaaaattgtggcgattttaccacaactcaaa mACGATAAACTACGCCCCTAACTTACGTGGAAAGAACAA
SEQ. ID NO: 65
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu proteinu D Haemophilus influenzae (HiRd)
AGCAATAATrATAGCTGGAATATTCTTTAAAGATGAAAGAGATCGTATAAGACAAAAAGA
ATTrTATArrGGAGAATTAT7AGCAATTATTGGTTCGCTAATATTCGTAATAAATAGrrC
AAATAATGATGGAAATACAGACTTTTTTCTTGGSGCAATATTTCTrTTTACSGCTATTTT
TAT?CAATGTGTACAGAATTTAATTGTAAAAAAAGTAGGCAAAAAGATAAATGCTGTTGT
AATAAGTGCATCGACAGCAACAATTTCAGGAGTATTATTTTTATGTTTAGCTTTTAATAC
TAAACAAATATATTTATTACAAGATGTTGGCATTGGAATGTTGATAGGTTTAGTTTGCGC
AATCACTGTTTTTAACATTTTGCAATTATTAATTCCTCTTTCAACTGCGAXAATAGGTTA
CTTAACATTAGATGAAAGAATAAATATCTATCAGGGAATTAGCGGTATTATTGTAATTAT
TGGTTGTGTATTGGCATTAAAAAGAAAAAACAAGGAGTGTTGATATATAAAGTAGATGAT
GTTGGTGGAATAGGTATAGTTAAATATCTGGTrCAArtGGTrrrATTAAGGGCGTTAGCA
ATTCTCCATTTAAGTTrATGTTTGAATTAGATATTTTGGGAAAAGATGGAAGAATAAAGC
TGTTAAATAATGCTGAAACATATGAACTATACCAATACTCAAATAAAAATAATTCTGCrG
GAAATGATTATAAATCTCTAATTCTAACTTGTAGAGAGGATAATGACTATCAATCAGAAA
GAAIGATTAAAGCCATTAAAAATATTATTCATTGTATGACTAATAATCATCAACCTATTT
CAAGTGCTGAAACATCTTTAGAAACTATTAAAATTATTCACGGAATAATTAATTCTGTTA
AAATAGGTAATGATCCTAACAATATATAAGGAGAATAAGT
SEQ. ID NO: 66
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Hin47 Haemophilus influenzae (HiRd)
TAAATACTCCAAAATAAATrrCAGATAACGTGGTCTGTAAGACAAAAAAATAAAAAAAAT
GTTCAATAAGAGGAGAGCAAATTATCTTGTTTAAAAGGAAATCGGAGCAGTACAAAAACG
GTCTTACAAGTAGCAAATTCTATAAATTTATGTTCTAATAGGCGCAATTTTCTAGTCAAT
AAAAAGGTCAAAAAATGAGCTGGATTAACCGAATTTTTAGTAAAAGTCCTTCTTCTTCCA
CTCGAAAAGCCAATGTGCCAGAAGGCGTATGGACAAAATGTACTGCTTGTGAACAAGTAC
TTTATAGTGAAGAACTCAAACGTAATCTGTATGTTTGCCCGAAATGTGGTCATCATATGC
GTATTGATGCTCGTGAGCGTTTATrAAATTTATTGGACGAAGATTCAAGCCAAGAAATTG
CGGCAGATTTAGAACCAAAAGATATTTTAAAATTCAAAGArTTAAAGAAATATAAAGATC
GTATCAATGCGGCGCAAAAAGAAACGGGCGAGAAAGATGCGCTAATTACTATGACAGGTA
CACTTTATAArATGCCAATCGTTGTGGCTGCATCGAACTrTGCTTTTATGGGCGGTTCAA
TGGGTTCTGTAGTTGGTGCAAAATTTGTTAAAGCGGCTGAAAAAGCGATGGAAATGAATT
GTCCArrTGTGTGTTTCTCTGCGAGTGGTGGTGCTCGTATGCAGGAAGCATTATTCTCTT
TAATGCAAATGGCAAAAACTAGTGCGGTACTTGCTCAAATGCGTGAAAAGGGTGTGCCAT
TTATTTCAGTATTAACGGATCCGACTTTAGGCSGCGTATCAGCCAGTTTTGCGATGTrAG
GGGATTTAAATATTGCCGAGCCAAAř ZCTTAATTGGTTTTGCAGGGCCACGCGTTATTG
AACAAACTGTGCGTGAAAAATTGCCXÍAAGGTTTCCAACGTAGTGAGJTTCTACTTGAGA
AAGGGGCAATTGATATGATCGTGAAACGTrCAGAAATGCGT
SEQ. ID NO: 67
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu P5 Haemophilus influenzae (HiRd)
TCACTTAATTCAAGCGCATCAATGTTTTCTAAAACATCAACAGAATTGACCGCACTTGTA
TCTAAAATTTCGCCATTTArrAAGACTGCGCGTAArGCCAAAACATGATTAGAGGTrrrA ccatattgcaatgagccttgcccagaggcatcggtgttaatcattccacctaaagtcgct
CGATTG-. ΙλΑ» x GGACAG í f ς. TGGGGCAAAGAACAAACCATGTGG- Γ ΧΓ AAAAATTGATTA
AGTTGATCmTACTACGCCTGCTTGTACTCGAACCCAACGTTCTTTTACATTGAGTTCT
AAGATGGCTGTCATATGACGAGAAAGí. -CCACTATTATATTGTTATTGATGGATTGCCCA
TTTGTGCCAGTGCCTCCACCGCGAGGCGTAAAGCTGATTGATTGATATTCAGGTAAATTT
GCCAATTTTGTTATCCGCACTATAICAGCAACCGTTTTCGGAAAAAGAATTGCTTGTGGA
AGTTGTTGGTAAACGCTGTTATCCGTAGCCAGACTTAATCTATCTGCATAGTrTGTCGCA i
ATATCCCCCTCAAAATGTTGGCAXTGAAGATCATCAAGATAATCAAGTACATATTGTTCA ,
ACTTGAGGAATGCGAi' £ I'AGATTiuGCAACATAG“ATTTGACCCATTTAAACATATCAGA
TGGAGGCTTTGAJAATAXCCTAAGGCTAGAATAAIGTCGATTAGGAAAGAGAGAGGAGAA
AGTAAAAAGTCTGTTTAAGAAAGTGTTATTTTGGATAAAAACTAAACAAAAAATTCAAAA
CCTAGrrAAGTGACTGTrrATAATGTAGCmAArrAAAAGrrCAGTATAAACAAGGACA i CTTrrrATTACTATTCGAXCACTAAATAGAGGACAICAAAA ...... , • · ·· 00
-114 • ·· • 0
SEQ. ID NO: 68
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu D15 HaemophHus influenzae (HiRd)
TCGArrCTATCCTATATAAATTATAGACGTAAAAAAŤCATTÁAAraÁrGí^rirrnrtn. ?
AAGCTTAATAACAGTGCTGCGCCAATTCGArAACAGATGCTTTGCACC^TCA^ACA
G5TTTTCCTTrAACAGC7TCGArTGTTAAAAAAACTAAATGACCGCCATCTAATACTGGT
AATGGAAATAAATTCATAATCCCTAAATTTACACTAATCAATGCCATAAAACTTLAAAAA
TACACCAATCCAATATTTGCTGATGCGCCAGCACCTTTTGCAATAGAAATTGGCCCACTT
AAATTATTTAATGACAAATCGCCAGTAAGTAATTTCCCTAATATTTTCAAGGTTAAAAGr
GAAAGCTGTCCTGTTTTTTCAATGCCTTTTTGTAAAGATTCAAGAATACCATATTtAAT
TCAGTACGGTATTCATCCGCTAATTTTGTTAAGGCTGGGCTAACCCCAACAAACCAT'T('
CCATTTTGATTACGCACTGGAGTTAGGACTrTGTCAAATGTTTCTCCATTACGTTCAACT
TTAATAGAAAAAGATTCGCCTTGTTCGACCTGTTTTATAAAATCTTGCCAAGGAAG-Grr
GTTAAATTTTCTTTTAAAATTTTATCACCGAITTGTAAACCAGCTrrCTCAGCGGGAGAA
TTTTGAACAACTTTAGAAAGCACCATTTCAArmAGGACGCATAGGCATAAKCrTAAT
SCCTCAAAAGCACTrTCTmTCAGGATCSAATGTCCAATTTGTAAGATTTAňAGTCCGT
TGTTGTTCAATATTAGAATTGAAAGGAGAAAGGCTAATCTCAACAXTAGGC7CCCCCATT tttgtggcaagtagcatattgatggtttcccaatcttgagtttcttcgccatcaattgta
AGAATTrGCGTATTGGGTrCAATGTGGGCTTGTGCTGCGACTGAGTrřGGTGTTAÍTGAT
TCAATCACTGGTTTAACCGTTGGCATTCCATKAAGG7AAAT *
SEQ. ID NO: 69
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu Omp26 HaemophHus influenzae (HiRd)
G<_AGAGAACGTTGmT7GAGTTCTGATGAAGAAAAAAGTTCAATTTATrAGAAAGAACC
TCCAATACTAAATTGGA.\CTGTrCGACATCATCATTTTCATATT—TTAATTGGTTTGGC
ATAAGAGAATACCAATGGCCCAATAGGAGArTGCCATTGGAA-CCGACACCTGTAGAGGC
GCGAATACGGCTT GA“. GCCATAATCGGGTAAGCTTTTTAATACATTGTTATCTAACCC
ACTCTTATCCGA·-“ “ACTTAGTATTCCAAACACTTGCCGCATCAACAAArAGGGAGGT
TCGGACTGTATTT-GGCTTTrATCACTCACAAACGCTGTTGGTACAATAAGTrCTGCACT
CGCAGTTGTGATTGCATrACCACCAATCACATCAGAACTTATCTTCTTAAAAGTACCATT
ACCATTACCATGTTGTGCATAAATTGCGTTAGGTCCAATACTACCArAAGCAAAACCACG
TAATGAACCGATSCCAíXCGCTGTATAAGTTTGATAGAACGGTAAACSCTTGSTTCCAAA
ACCATTTGCA“ AT ~-TGCAGATGCTTTTGCAGATACAACCCAGAGGTGATCTCTGTCTAA
TGGGTAGAAACGw. '~ACGTCTGCACTTAGTTTGTAGTATTTGTrATCAGAACCTGGAAT
AGTAACTCGTCCA·—.t.AGACTTGCTTTAACCCCTTTAGTTGGGAAATAGCCTCrACTAAG
GCTGTTATAGTTC AGCAAAAGAAAAATCAAAGTCATTTGTTTTAAXGCCATTACCTTT
AAATTTCATTGAT76AATATATAAATTACGGTTATATTCTAGAGCAAAGTTACrAA'rTTT
ATTATAGGTATGG>-’..í:TAATCCTACATAATAGGAGTTATTT7CAíT3ÍACAGGGAAACCTAA agtaacattactt·:. ;ataagtcgtacgcttatagttagagg
SEQ. ID NO: 70
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu P6 HaemophHus influenzae (HiRd)
TTAGATTTCTCCTAAATGAGrrTmATTrAGTrAAGTATGGAGACCAAGCTGGAAArrr
AACTTGACCATCACTTCCTGGAAGGCTCGCCTTAAAGCGACCATCTSCGGAAACCAATTG
TAGCACCTTTCCTAAGCCCTGTGTAGAACrATAAATAATCATAA?TCCAWGGAGAGAG
GCTTGGGCTTTCGCCTAGAAAAGATGTACTAAGTACCTCTGAAACGCCCGTTGTGAGATC
TTGTTTAACTACATrATTGTTACCArrAATCATCACAAGTGTTTTTCCATCTGCACTAAT
TTGTGGGCTACCGCGACCACCCACTGCTGrrGCACTACCACCGCTTGCATCCATrCGATA
AACTTGTGGCGAACCACTTCTATCGGATCTAAATAAAATrGAATTTCCGTCTGGCGACCA
CGCTGGTTCAGTATTATTACCCGCACCACTCGTCAATTGAGTAGGTGTACCGCCATrCGC
TCCCATAACGTAAATATTCAGAACACCATCACGAGAAGAAGCAAAAGCTAAACGAGAACC
ATCTGGCGAAAAGGCTGGTGCGCCArrATGCCCTTGAAftAGATGCCACTACTTTACGTGC
GCCAGAATTTAAATCCTGTACAACAAGTTGTGATTTTTTAnTTCAAACGATACATAAGC
CAAACGCTGGCCGTCTGGAGACCAAGCTGGAGACATAATTGGTTGGGCACTACGATTGAC
GATAAATTGATTATAGCCATCATAATCTGCTACACGAACrrCATAAGGTTGCGAACCGCC
ATTrrrTTGCACAACATAAGCGATACGAGTTCTAAAGGCACGACGGATCGCAGrrAATTr
TTCAAAAACTTCATCGCTCACAGTATGCGCGCCATAGCGTAACCATTTATTTGTTACTGT
ATAGCTATTTTGCATTAATACAGTCCCTGGCGTACCTGATGCACCAACCGTArCAATTAA
TTGATAAGTAATACTATAACCATTACCCGATGGAACCACrr
SEQ. ID NO: 71
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu TbpA HaemophHus influenzae (netypovatelný)
GGCGATAACCGAGTTTTTGGGGTATTTAGTGCCAAAGAAGACCGACAAAACCCAAAATTA
TCCAGAGAAACCTTAATTGATGGCAAGCTAACTACTTTTAAAAGAACTGATGCAAAAACC
AATACAACAGCCGATACAACAACCAATAAAACAACCAATGCAATAACCGATGAAAAAAAC
TrrAAGACGGAAGATATACIAAGTmGGTGAAGCTGATTAICrrrrAATrGAC&ATCAG·
CCTGTTCCGCTTTTACCTGAAAAAAATACTGATGATTTCAIAAGTAGTAGGCATCATACT
GTAGGAAATAAACGCTATAAAGTGGAAGCATGTTGCAAGAAICtAAGCrATGTAAAATTr
- 115 GGTATGTATTATGAAGACCCACTTAAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAC
CAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAACAAACGACGACAACATCTATCGAGACTTATTATCAA
TTCTTATTAGGTCACCGTACTGCCAAGGCCGACATACCTGCAACGGGAAACGTGAAATAT
CGCGGTAATTGGTTTGGTTATATTGGTGATGACACGACATCTTACTCCACTACTGGAGAT
AAAAATGCTCTCGCCGAGTTTGATGTAAArTTTGCCGATAAAAAGCTAACAGGCGAATTA
AAACGACACGATAATGGAAATACCGTATTTAAAATTACTGCAGACCTTCAAAGTGGTAAG aatgacttcactggtacagcaaccgcaacaaattttgtaatagatggtaacaatagtcaa
ACTGGAAATACCCAAATTAATATTAAAACTGAAGTAAATGGGGCATTTrATGGACCTAAG
GCTACAGAATTAGGCGGTTATTTCACCTATAACGGAAATTCTACAGCTAAAAATTCCTCA accgtaccttcaccacccaattcaccaaatgcaagagctgcagttgtgtttggagctaaa aaacaacaagtagaaacaaccaagtaatggaatactaaaaa
SEQ. ID NO: 72
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu TbpB Haemophilus influenzae (HiRd)
AATGTCAACTTATAATrTTTTAAGTTCATGGATAAAATATGAAAAATGGCGTAAAACAAC
TTTTTCTCTTATCATTAATAGGCTTATCATTAACGAATGTAGCTTGGGCAGAAGTTGCAC
GTCCTAAAAATGATACATTGACAAATACGATTCAAAGTGCGGAATTAAAAACCTCCTCTT
TTrCCTCTATGCCTAAGAAAGAAATACCAAATAGGCATArrATTTCTCTTTCCAAAAGCC
AATTAGCGCACCATCCAAGGCTTGTTTTGCGTGGGTTAATTCCTGCOTATATCAAAATA
ACACTCAGGCAGTTCAACTGTTATTACCACTATATAAACAATTTCCTCAACAAGATAATT
TCTTACTAACTTGGGCAAAGGCTATTGAAGCTCGTGAACAAGGTGATTrAACTCAATCTA
TTGCTTATTATCGTGAATTATTCGCTCGAGACGCATCTTTACTACCTTTACGTTATTAAT
TAGCTCAAGCTCTATTTTTTAACTATGAAAATGAAGCTGCCAASArTCAATTTGAAAAAT i
TACGTACAGAGGTAGATGATGAAAAATTTTTAGGTGTTATTGATCAGTATCTTTTAACAC '
TAAATCAGCGGAATCAATGGATATGGCAAGTAGGATTAAATTTTTrAAATGATGATAATT
TGAATAACGCTCCAAAAAGTGGCACAAAAATTGGTAGTTGGACCGCTTGGGAAAAAGAAA
GTGGGCAGGGGGTAGGGTATTCTTTATCAGTAGAAAAAAAATGGCCATGGGCAGATCATT
TTTTTAGTAAAACrATGTTTAATGGGAATGGAAAATATTACTGGGATAATAAAAAATACA
ATGAGGCTACTGTGCGTATAGGTGGTGGTTTAGGCTATCAAACTGCCTCAGTTGAAGTCT
CGTTGTTrcCTTTTCAAGAAAAACGCTGGTATGCAGGCGGT
SEQ. ID NO: 73
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu HifA (pilin) Haemophilus influenzae (genom LKP sérotypu 1) taataaattgctccataaagaggtttgtgccttataaataaggcaataaagattaatata
AACCGTTTATTAAAATGCCAAAGGCTTAATAAACAGCAAACTrTGTTTTCCCAAAAAAAG
TAAAAAACTCTTCCATTATATATATATATATATATAATTAAAGCCCTTTTTGAAAAATTT
CATATTmTTGAATTAATTCGCTGTAGGTTGGGTTTTTGCCCACArGGAGACATATAAA
AAAGATTTGTAGGGTGGGCGTAAGCCCACGCGGAACATCATCAAACAACTGTAATGTTGT ATTAGGCACGGTGGGCTTATGCCTCGCCTACGGGGAAATGAATAAGGATAAATATGGGCT TAGCCCAGTTTATGGATTTAATTATGTTGAAATGGGGAAAACAATGTTTAAAAAAACACT rrrATTrTTTACCGCACTATTrrrrGCCGCACTTrGTGCATmCAGCCAATGCAGATGT GATTATCACTGGCACCAGAGTGATTTATCCCGCTGGGCAAAAAAATGTTATCGTGAAGTT AGAAAACAATGATGATTCGGCAGCATTGGTGCAAGCCTGGATTGATAATGGCAATCCAAA TGCCGATCCAAAATACACCAAAACCCCTTTTGTGATTACCCCGCCTGTTGCTCGAGTGGA AGCGAAATCAGGGCAAAGTTTGCGGATTACG7TCACAGGCAGCGAGCCTTTACCTGATGA TCGCGAAAGCCTCTTTTATTTTASrrTGTTAGATATTCCGCCGAAACCTGATGCGGCAn
TCGCCCTGCGAAACTCTCGATGGATTCTCGTGATGCAATGAAAAAAGTAGTGTTTAAAGC
CACACCTGAAGGGGTGTrGGTGGATAATCAAACCCCTTATTATATGAACTACATTGGTTT
GTTACATCAAAATAAACCTGCGAAAAATGTCAAAATGGTIG
SEQ. ID NO: 74
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu HifE (tip pilin) Haemophilus influenzae (genom LKP sérotypu 1)
TAGTA6ATTTCCGCACGGGCAAAAATACAATGGTGTTATTTAACCTCACTTTGCCAAATG
GCGAGCCAGTGCCAATGGCATCCACCGCACAAGATAGCGAAGGGGCATTTGTGGGCGATG
TGGTGCAAGGTGGTGTGCTTTTCGCTAATAAACTtACCCAGCCAAAAGGCGAGTTAATCG
TCAAATGGGGTGAGCGAGAAAGCGAACAATGCCGTTTCCAATATCAAGTTGATTTGGATA
ACGCACAAATACAAAGTCACGATATTCAATGCAAAACCGCAAAATAAATAATTGAAGAGG
ATTTATGCAAAAAACACCCAAAAAATTAACCGCGCTTTTCCATCAAAAATCCACTGCTAC :
TTGTAGTGGAGCAAArEATAGTGGAGCAAATTATAGTGGCTCAAAATGCTTTAGGTTTCA tcgtctggctctgcttgcttgcgtggctctgcttgattgcattgtggcactgcctgctta TGCrrACGATGGCAGAGTGACCTTTCAAGGGGAGATTTTAAGTGATGGCACTTGTAAAAT TGAAACAGACAGCCAAAATCGCACGGTTACCCTGCCAACAGTGGGAAAAGCTAATTTAAG CCACGCAGGGCAAACCGCCGCCCCTGTGCCCTTTTCCATCACGrrAAAAGAATGCAATGC . AGATGATGCTATGAAAGCTAATCTGCTATTTAAAGGGGGAGACAACACAACAGGGCAAtC TTATCTrrCCAATAAGGCAGGCAACGGCAAAGCCACCAACGTGGGCATTCAAATTGTCAA AGCCGATGGCATAGGCACGCCTATCAAGGTGGACGGCACCGAAGCCAACAGCGAAAAAGC CCCCGACACAGGTAAAGCGCAAAACGGCACAGTTATTCAACCCCGTTTTGGCTACTTTGG CTCGTTATTACGCCACAGGTGAAGCCACCGCAGGCGACGTTGAAGCCACTGCAACTTTTG a S r-GCAGTATAACTAAAATATTTATTATCCAGTGAAAAAA • ♦ • · • · • · · · • fl
-116
SEQ. ID NO: 75
Nukleotidová sekvence oblasti DNA (1000 bp) proti směru transkripce vzhledem ke genu P2 Haemophilus influenzae (HiRd)
XXATCCGCXA ACATXTCAXC AGXAATTCCA XGAACXXXAA XCGCAXCAGG 51 AICANCGGGG CGATCTGGCT TAATATAAAT ATGATAATTA TTACCTGTGT 101 AACGACGATT TATTAATTCA ACTGCACCAA TTTCAATAAT GCAGTGTCCT 151 TCATAATGCG CGCCAAGCTG ATTCATACCT GTAGTTTCAG TATCTAATAC 201 AATTTGGCGA TTGGGATTAA TCATTTGTTC AACCTATCTC TTTCCATTAA
251 AATACTTGCC ATTCTACACA ACAACCTTTT TGTTATGCCX AAACAGATTG i 301 AAATTTTTAC TGATGGATCT TGCTTAGGTA ATCCAGGGGC GGGCGGAATT 351 GGTGCCGTAT TGCGTTATAA ACAACATGAA AAAACACTCT CCAAAGGCTA 401 TTTCCAAACC ACCAATAATC GAATGGAATT ACGCGCTGTC ATTGAAGCAT 451 TAAATACATT AAAAGAACCT TGCTTGATCA CGCTTTATAG TGATAGCCAA 501 TATATGAAAA ATGGCATAAC. CAAATGGATC'TTTAACTGGA AAAAAAATAA 551 TTGGAAAGCA AGTTCTGGAA AGCCTGTAAA AAACCAAGAT TTATGGATAG SOI CCTTAGATGA ATCCATCCAA CGTCATAAAA TTAATTGGCA ATGGGTAAAA 651 GGCCATGCTG GACACAGAGA AAATGAAATT TGCGATGAA7 TAGCAAAAAA 701 AGGGGCAGAA AATCCGACAT TGGAAGATAT GGGGTACATA GAAGAATAAT 751 ACAACTGATA TAACGTCATA TTTTTCGATA CCTAAAAATA TTTAATACTT 801 AAACCTAAAA CAGAATAAAA AATAATCAAA TTCATTTAAA AAATGTGATC 851 TCGATCAGAT TTCAAGAAAA TTAAAATTTT GGAGTATTGA CATCAAAAAT 901 TTTTTTTGTA AAGATGCAGC tcgtccgttt tggcgattgg acaattctat 951 TGGAGAAAAG TTCAATCATA GATAGTAAAC AACCATAAGG AATACAAATT 1001 A
SEQ. ID NO: 76
Nukleotidová sekvence kódující oblasti DNA (částečná) genu HtrB Moraxella catarrhalis
TCAGTGCTTG GTTTTTTAAG ATATGTACCG CTGTCAG7CC TGCATGGATT
GGCGGCGTGT GCGTCTTATA TTTCCTATCA TTGCAGGCTT AGTATTTATC
101 GCAGCATCCA AGCCAATTTA ATCTTGGTTC ACCCCAAGAT GCCAGACGCA
151 CAGCGGCAAA AACTCGCCAA ACAAATCCTA AAAAATCAGC TCATCAGTGC
201 AGTCGACAGT CTTAAAACTT GGGCAATGCC ACCAAAATGG TCTATCGCAC
251 AAATTAAAAC GGTTCATCAT GAAGATATCC TAATCAAAGC ACTTGCCAAT
301 CCAAGTGGTA TGCTTGCCAT TGTGCCTCAT ATCGGCACTT GGGAGATGAT
351 GAATGCTTGG CTCAATACCT TTGGCTCCCC TACTATCATG TATAAGCCCA
401 TCAAAAATGC GGCGGTAGAT CGCITTSTTT TACAGGGGCG TGAAAGACTA
451 AATGCCAGCC TTGTACCCAC AGATGCTAGT GGTGTTAAGG CAATTTTTAA
501 AACACTCAAA GCAGGXGGAX TTAGTATCAT ACXGCCCGAC CATGXACCXG
551 ATCCATCAGG XGGXGAGAXX GCXCCXXXXX XXGGXAXXAA AACCCTAACC
601 AGXACGCXGG CGTCAAAGCT TGCTGCAAAA ACXGGTTGXG CXCXXGXXGG
651 CTTAAGCTGT ATXCGGCGXG AAGATGGCGA XGGXXXXGAA ATXXXXXGXX
701 ATGAATTAAA XGAXGAACAA CXXXAXXCAA AAAATACCAA AATTGCAACC
751 ACTGCTTTAA ATGGTGCGAT GGAACAAATG AXXXATCCAC AXXXXXXGCA
801 XTATATGXGG AGCXAXCGXC GGXXCAAGCA XACACCACXA TTAAATAATC
851 CTTATTTACT TAATGAAAAT GAGCTAAAAA AAATAGCCAT AAAGCTTCAA
901 GCCATGTCAA AGGATAGXTA XGAG
Proteinová sekvence: 25% identita a 35% podobnost s HtrB E. coli
SVLGFLRYVP LSVLHGLAAC ASYISYHCRL SIYRSIQAHL ILVHPKMPOA
QRQKIAKQIL KNQLISAVDS LKTHAMPPKW SIAQIKTVHH EDILIKALAN
101 PSGMLAIVPH XGXWEMMNAW LHTFGSPTIM YKPIKNAAVO RFVLQGRERL
151 NASLVPXDAS GVKAIFKTLK AGGFSIILPD HVPDPSGGSI APFFGIKTLT
201 STLASKLAAK TGCALVGLSC IRREDGDGFE IFCYELNDEQ LYSKNTKIAT
251 XAXJÍGAMEQM IYPHFLHYMW SYRRFKHTPL LNNPYLLNEN ELKKIAXKLQ
301 AMSKDSYE
SEQ. ID NO: 77 .... .........
Nukleotidová sekvence kódující oblasti DNA genu HtrB Neisseria (meningokok B)
ATGTTTCGTT TACAATTCGG GCTGTTTCCC CCXTTGCGAA CCGCCATGCA 51 CATCCTGTTG ACCGCCCTGC XCAAATGCCX CTCCCTGCTG CCACTTTCCT 101 GTCTGCACAC GCTGGGAAAC CGGCXCGGAC ATCXGGCGXX XXACCXXXXA 151 AAGGAAGACC GCGCGCGCAT CGXCGCCAAX ATGCGXCAGG CAGGCATGAA'
201 TCCCGACCCC AAAACAGXCA AAGCCGXXXX XGOGGAAACG GCAAAAGGCG 2S1 GXXXGGAACX TGCCCCCGCG XXXXXCAGAA AACCGGAAGA CATAGAAACA 301 AXGXXCAAAG CGGXACACGG CTGGGAACAT GTGCAGCAGG CXXXGGACAA 351 ACACGAAGGG CTGCTATTCA TCACGCCGCA CATCGGCAGC TACGATTTGG
401. GCGGACGCTA CAXCAGCCAG CAGCTTCCGT XCCCGCXGAC CGCCATGTAC'
451 AAACCGCCGA AAATCAAAGC GATAGACAAA ATCATGCAGG CGGGCAGGGX 501 TCGCGGCAAA. GGAAAAACCG CGCCTACCAG CATACAAGGG GTCAAACAAA 551 TCATCAAAGC CCTGCGTTCG GGCGAAGCAA CCATCGTCCT GCCCGACCAC
- 117 ·♦ . «· ·· ·· • · * ♦ «« * • · « · · • · · · · · • · · · · ·· · · · · ·· ····
601 GTCCCCTCCC CTCAAGAAGG CGGGGAAGGC GTATGGGTGG ATTTCTTCGG
651 CAAACCTGCC TATACCATGA CGCTGGCGGC AAAATTGGCA CACGTCAAAG
701 GCGTGAAAAC CCTGTTTTTC TGCTGCGAAC GCCTGCCTGG CGGACAAGGT
751 TTCGATTTGC ACATCCGCCC CGTCCAAGGG GAATTGAACG GCGACAAAGC
801 CCATGATGCC GCCGTGTTCA ACCGCAATGC CGAATATTGG ATÁCGCCGTT
851 TTCCGACGCA GTATCTGTTT ATGTACAACC GCTACAAAAT GCCG
Proteinová sekvence 30% identita a 38% podobnost s Htrb E. coli
MFRLQFGLFP PXRTAMHIU. TAÍLKCLSX.L PLSCLHTXGN RLGHLAFn.1. '
KEORARIVAN MRQAQfflPDP KTVXAVFAET AKGGLELAPA FFSKPEDIET
101 MFKAVHGWEH VQQAU3KHEG LLFITPHIGS YDLGGRYISQ QLPFPIiTAllY
151 KPPKIXAIOK IMQAGRVRGK GKTAPTSIQG VKQIIKALRS GEATIVX.PDH :
201 VPSPQEGGEG VWVDFFGKPA WíTLAAKIA HVXGVKTLFF CCERLPGGQG
251 FDLHIRPVQG ELHGDKAHDA AVFNRNAEYW IRRFPTQYLF MYNRYKMP
SEQ. ID NO: 78
Nukleotidová sekvence kódující oblasti
DNA genu HtrB Haemophilus influenzae (netypovatelný)
ATGAAAAACG AAAAACTCCC 51 ATACTGGCTT TTTTGGCTAG 101 TTCCCTATCC TATTTTGCGC 151 TCACATTTAA AAGTGGGTAA 201 TGAACTTTGT TTCCCTGATA 251 AAGAAAATCT TCGTTCAGTA 301 TGGTTTTGGT CGGATTCACG 351 ACATTATCTA AAAGAAAATC 401 ATTTCTTAAC GCTAGAACTT 451 GGCATTGGTG TTTATCGTCC 501 AACACAAGGC CGTTTACGCT 551 TACGCGGAAT GATCAAAGCT -601 CCTGATCACG ATTACGGCAG S51 AGTACCTGAC ACTTGCACTA 701 CGCAAAACAG CAAAGTGATT 751 TCAGGCTATA CCGTGAGTAT 801 AGATGAAACG GCGATTGCTG 8S1 TCATGAAGGG CATATCACAA 301 CGTCCAGATG AAAATACGCC
TCAATTTCAA CCGCACTTTT TAGCCCCAAA GCGTGGCAAT TTGGCGAAGT ATTTTATGTC CATATTGGTC ATGGTTTCGG TTGGCTGTTT ACGTCGAGCT GCCATTGCAC GCCGTAATCT TGCCTGAAAA CGAACGTGAG ACGATTTTGC GGCATGGCAA TTATCGAAAC TGGCATGGCT TATCAAAAAA TGGTCGAAAG TTGAAGGCTT AAAAAGATGG AATTGTTCTC GTCGGTGTTC GGCGCACGCA TCATTGGTTT ACATCATCCT AAATGATAAT CCTTTGCTTG ATTGGCTACA CCAATAAAGA TATGCTTGAT CGTAAAGATT TTACGCCACG AAGAAACCAT TTGGTATGCG AAAAAATGCC GTTTTTGTTC CTTTTTTTGC CTACTGGTAG TTATTATTTA TTGAAATCCT CCATTTGCGC CATTACGCAA TAAAGATGGT TTCAGCGCCT GTTGATTTTA CGGATTTACA CGCGAATGAA TCAAATCGTA GAAAAGGAAA TATATGTGGC TÁCATCGCCG TTTTAAAACA TAGTTTATAC GATTAA
Proteinová sekvence 57% identita a 66% podobnost s HtrB E. coli
MKNEKLPQFQ PHFLAPKYWL FWLGVAXWRS ILCLPYPILR HIGHGFGMX.F 51 SHLKVGKRRA AXARHNLELC FPOKPENERE TILQENLRSV OíAIXETGMA 101 WFWSOSRIKK WSKVEGLHYL KENQKDGIVL VGVHFLTLEL GARIIGLHHP 151 GIGVYRPNDN PLLDWLQTQG RLRSNKDMLD RKDLRGKIKA LRHEETIWYA 201 PDHDYGRKNA VFVPFFAVPD TCTTTGSYYL LKSSQNSKVI PFAPLHNKEG 251 SGYTVSISAP VDFTDLQDET AIAARKNQIV EKEIMKGISQ YMWLHRRFKT
301 RPOENTPSLY D*
SEQ. ID NO: 79
Nukleotidová sekvence kódující oblasti DNA genu MsbB Haemophilus influenzae (netypovatelný)
ATGTCGGATA ATCAACAAAA 51 AGCGCACTTT TCATGGTCGT 101 TTGGTATTTT CTTTTTATTG 151 GATAAATTGA CGGGAAAATT 201 ACAGCGTACG CGTGCACAAA 251 CTGAACAACA ACGTGAGCAA 301 CAGGTTATGT TTGGTATTGG 351 GCAAAAACGC AGCGAATTTA 401 CTGAAGGAAA GAATATTATT 451 GCGTCTGGCA TTATTTTGCA 501 TAATCCACAC CGTAATCCAT 551 AACGTTTCGG CGGAAAAATG 601 TTAAGTCATG TTCGTAAAGG 651 TTTTGGGGCG GAACAAAGCG 701 CGACATTACC AGGGTTAAAT 751 ATTCCAATGT TTCCTCGTTA '801 AATTCATCCTGCAATGAATT 851 CAATGAACGA AGAAATAGAA 901 GTTTGGATTT TGCAATTATT
951 TGATTAA
TTTACGTTTG ACGGCGAGAG TGGGCTATGA ATTTAAAGCC TCAATATTGG GGGATTTGGC TTGTTAGCAT TTGTGCCTTT TCGTCTGCGC AGGTATTTGG ATTGGGCATA AAGCAAAGAA CTAACTTGCA ATATTGTTTC CCTCATTGGA GTGATTGATA AAATGTTTGC GGTTGTCGCT TGAGATTGCC ATCCGTTCAA AGAAACATTT TCGGTCTTGA ACATATCGAA CAGGCAAAAG CTTATGGTGC CACATGGCTG GGCGATTGAT CACTCAAGGC ATGCCAATGA CTTCTATGTA TGGTGGATTG GCTTTGGACG ATTACACGCC CATGCACGCC AAAATGGTAT TAAACCTTTT CGAAATGGGT TATTACTTAC CCGATGAAGA TATTTGTTGA TTTCTTTGGG ACTTATAAAG AAAATGGCAA AACTTTCTAA AGCCGTTGTT TAACGCTGAA ACGGGCAAAT ATGAAATGGA TAAGTGATGA TCCTGAACAA TCAGCCCGAG TCTTTTGTTA CGCCAGCGCC AGAGCAATAT GCGTACAAGG AAAGATGGCG AAGATCTTTA
Proteinová sekvence 45% identita a 56% podobnost s MsbB E. coli
MSDNQQNLRL. TARVGYEAHF SHSYLKPQW GIWLGIFFLL LLAFVBFRLR.
DKLTGKLGIW IGHKAKKQRť RAQTO1QYCF PHSrTEQQREQ: VXDKMFAWA 101 QVHFGIGEIA XRSXXHLQXR SEFIGLEHIE. QAXAEGXNIX mVPHGWAID 15 L ASGXIUTXQG. MSMISMXNPH. RHPLVDHLSrr ITRQRFGGXM HARQNGIKPF • ·
0 00 0 0
-118 • · 00 ··
000 0000 0
0 0 0 0 0 0 0 000000 0 0 00 0 0 0 0 0 0 000 0 000000
201 LSHVRKGEMG YYLPDEDFGA EQSVFVDFFG TYKATLPGLM KMAKLSKAW
251 IPMFPRYNAE TGKYEMEIHP AMNLSODPEQ SARAMNEEXE SFVTPAPEQY
301 VWILQLLRTR KDGEDLYD*
SEQ. ID NO: 80
Nukleotidová sekvence kódující oblasti DNA genu MsbB Moraxella catarrhalis
ATGAGXTGCC ATCATCAGCA TAAGCAGACA CCCAAACACG CCATATCCAT
TAAGCATATG CCAAGCTTGA CAGATACTCA TAAACAAAGT AGCCAAGCTG 101 AGCCAAAATC GTTTGAATGG GCGTTTTTAC ATCCCAAATA TTGGGGAGTT 151 TGGCTGGCTT TTGCGTTGAT TTTACCGCTG ATTTTTCTAC CGCTGCGTTG 201 GCAGTTTTGG ATCGGCAAGC GTCTTGGCAT TTTGG7ACAT TACTTAGCTA 251 AAAGCCGAGT TCAAGACACT CTAACCAACC TGCAGCTTAC CTTCCCAAAT 301 CAACCAAAAT CAAAACACAA GGCCACCGCA CGGCAAGTAT TTATTAATCA 351 AGGTATTGGT ATTTTTGAAA GTTTATGTGC ATGGTTTCGC CCTAATGTCT 401 TTAAACGCAC TTTTAGCATT TCTGGTTTAC AGCATTTGAT TGATGCCCAA 451 AAACAAAATA AAGCGGTGAT TTTACTTGGT GGACATCGCA CGACGCTTGA 501 TTTGGGCGGT CGGTTATGTA CACAGTTTTT TGCGGCGGAC TGCGTGTATC 551 GCCCACAAAA CAACCCTTTG CTTGAATGGT TTATCTATAA TGCACGCCGC SOI TGTATCTTTG ATGAGCAAAT CTCAAATCGT GATATGAAAA AACTCATCAC S51 TCGGCTCAAA CAAGGTCGGA TAATTTGGTA TTCACCTGAT CAAGATTTTG 701 GTCTTGAGCA TGGCGTGATG GCGACCTTTT TTGGTGTGCC TGCAGCAACG 751 ATTACCGCTC AGCGTCGTCT TATTAAGCTG GGTGATAAAG CCAATCCTCC 801 TGTCATCATC ATGATGGATA TGCTCAGACA AACGCCCGAT TATATCGCAA '
851 AAGGTCACCG TCCACATTAT CACATCAGCC TAAGCGCTGT GTTAAAAAAT 901 TATCCCAGCG ATGACGAAAC CGCCGATGCT GAACGCATCA ATCGACTGAT 951 TGAGCAAAAT ATTCAAAAAG ATTTAACCCA GTGGATGTGG TTTCATCGCC
1001 GCTTTAAAAC TCAAGCCGAT GACACCAATT ACTATCAACA TTAATG
Proteinová sekvence 28% identita a 37% podobnost s MsbB E. coli
MSCHHQHKQT PKKAXSXKHM PSX.TDTHKQS SQAEBKSFEM AF1HPKYHGV
HLAFALILPL IFLPLRWCFH IGKRLGILVH Y1AKSRVQDT LTStQtTFPH 101 QPKSKHKATA RQVFINQGIG IFESLCAWFR PNVFKRTFSI SGLQHLIDAQ 151 KQNKAVILLG GHRTTLDLGG RLCTQFFAAD CVYRPCUSPL LEWFITOARR 201 CXFDEQISNR DMKK1ITR1K QGRXIWYSPD Q0FGLEEG7M ATFFGVPAAT 251 ITAQRKX.IKL GDKANPPVII MMDMLRQTPD YIAKGHRPHY HISLSAVLKN 301 YPSOOETAOA ERINRLIEQN IQKDLTQWMM FHSRFKIQAO OTNYYQH*
SEQ. ID NO: 81
Nukleotidová sekvence kódující oblasti DNA genu MsbB Neisseria (meningokok B)
ATGAAATTTA TATTTTTTGT ACTGTATGTT TTGCAGITTC TGCCGTTTGC
GCTGCTGCAC AAACTTGCCG ACCTGACGGG TTTGCTCGCC TACCITTTGG 101 TCAAACCCCG CCGCCGTATC GGCGAAATCA ATTTGGCAAA ATGCTTTCCC 151 GAGTGGGACG GAAAAAAGCG CGAAACCGTA TTGAAGCAGC ATTTCAAACA 201 TATGGCGAAA CTGATGCTTG AATACGGCTT ATATTGGTAC GCGCCTGCCG 251 GGCGTTTGAA ATCGCTGGTG CGTTACCGCA ATAAGCATTA TTTGGACGAC 301 GCGCTGGCGG CGGGGGAAAA AGTCATCATT CTGTACCCGC ACTTCACCGC 351 GTTCGAGATG GCGGTGTACG CGCTTAATCA GGATG7ACCG CTGATCAGTA 401 TGTATTCCCA CCAAAAAAAC AAGATATTGG ACGCACAGAT TTTGAAAGGC 451 CGCAACCGCT ACGACAATGT CTTCCTTATC GGGCGCACCG AAGGCGTGCG 501 CGCCCTCGTC AAACAGTTCC GCAAAAGCAG CGCGCCGTTT CTGTATCTGC 551 CCGATCAGGA TTTCGGACGC AACGATTCGG TTTTTGTGGA TTTTTTCGGT SOI ATTCAGACGG CAACGATTAC CGGCTTGAGC CGCATTGCCG CGCTTGCAAA 551 TGCAAAAGTG. ATACCCGCCA TCCCCGTCCG CGAGGCGGAC AATACGGTTA 701 CATTGCATTT CTACCCGGCT TGGGAATCCT TTCC3AGTGA AGATGCGCAG 751 GCCGACGCGC AGCGCATGAA CCGTTTTATC GAGGAACCGT GCGCGAACAT 801 CCCGAGCAGT ATTTTTGGCT GCACAAGCGT TTCAAAACCC GTCCGGAAGG 851 CAGCCCCGAT TTTTACTGAT ACGXAA
Proteinová sekvence 25% identita a 36% podobnost s MsbB E. coli
MKFIíTVLYV LQFLPFRLLH KLADLTGLLA YLLVKPSRRI GSINLAKCFP
EWDGKKRETV LKQHFKHMAK LMLEYGLYWY APAGRLXSLV RYRNKHYLDO
101 ALAAGEKVII LYPHFTAFEM AVYALNQOVP LISMYSHQKN KILOAQILKG
151 RHRYDNVFLI GRTEGVSALV KQFRKSSAPF LYLPOQOFGR NDSVFVDFFG
201 IQTATITGLS RIAALANAKV IPAIPVREAO NTVTLHFYPA WESFPSEOAQ - 251 ADAQRMNRFI EEPCANIPSS IFGCTSVSKP VRKAAPIFTD T*
Zastupuje:
- 119 -

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Prostředek založený na geneticky zkonstruovaných váčcích z kmene gramnegativních bakterií, vyznačující se tím, že tento prostředek je získatelný použitím jednoho nebo více způsobů zvolených z následující skupiny:
    a) způsob omezení imunodominantních variabilních nebo neprotektivních antigenů v prostředku založeném na váčcích, kde tento způsob zahrnuje kroky zjištění identity takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene pro produkci menšího množství nebo žádného uvedeného antigenu a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    b) způsob regulace ke zvýšení exprese ochranných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene pro zavedení silnější promotorové sekvence proti směru transkripce vzhledem ke genu kódujícímu uvedený antigen tak, že tento gen je exprimován ve vyšší míře než v nemodifikovaném váčku, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    c) způsob regulace ke zvýšení exprese podmínečně exprimovaných, ochranných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se odstranily represivní řídicí mechanismy jeho exprese, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    d) způsob modifikace podílu lipidu A v bakteriálním LPS v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace genu, který má účast při učinění části lipidu A
    44
    4 4
    4
    - 120 • 4
    44·· ·
    4 4 4 ·· ·*··
    4 4
    4« 4444
    LPS toxickou, zkonstruování bakteriálního kmene pro snížení nebo vypnutí exprese tohoto genu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    e) způsob modifikace podílu lipidu A v bakteriálním LPS v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace genu, který má účast při učinění části lipidu A LPS méně toxickou, zkonstruování bakteriálního kmene pro zavedení silnější promotorové sekvence proti směru transkripce uvedeného genu tak, že tento gen je exprimován s vyšší mírou než v nemodifikovaných váčcích, a vytvoření váčků z tohoto kmene;
    f) způsob snížení toxicity lipidu A v prostředku založeném na váčcích a zvýšení hladin ochranných antigenů, který zahrnuje kroky zkonstruování chromosomu bakteriálního kmene pro zavedení genu kódujícího peptid polymyxin A, nebo jeho derivát nebo analog, fúzovaného k ochrannému antigenu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene; nebo
    g) způsob vytvoření konzervovaných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby byly odstraněny variabilní oblasti genu kódujícího uvedený antigen, a vytvoření váčků z uvedeného kmene.
    2. Prostředek založený na geneticky zkonstruovaných váčcích podle nároku 1, vyznačující se tím, že tento prostředek je získatelný použitím jednoho nebo více dalších způsobů zvolených z následující skupiny:
    h) způsob snížení exprese antigenu v prostředku založeném na váčcích, kde tento antigen sdílí strukturní podobnost s
    - 121 «9 99 9* ·» *·
    9 ···· * « · · • 99 99 9 19 9 «··«··· 9 9 · 9 · · • 9 ··· «99 ·9β « «· 99·· 99 ···· lidskou strukturou a může být schopný indukovat autoimunitní odpověď u lidí, který zahrnuje kroky identifikace genu, který se účastní biosyntézy antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se snížila nebo vypnula exprese uvedeného kmenu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene; nebo
    i) způsob regulace ke zvýšení exprese ochranných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se do chromosomu zavedla jedna nebo více dalších kopií genu kódujícího uvedený antigen, řízeného heterologní, silnější promotorovou sekvencí, a vytvoření váčků z uvedeného kmene.
    3. Prostředek založený na váčcích podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že konstrukční kroky způsobů a), b), c), d), e), h) a i) se provádějí homologní rekombinaci mezi sekvencí o délce alespoň 30 nukleotidů na bakteriálním chromosomu a sekvencí o délce alespoň 30 nukleotidů na vektoru transformovaném do kmene.
    4. Prostředek založený na váčcích podle nároku 3, vyznačující se tím, že konstrukční kroky se provádějí homologními rekombinacemi typu dvojitého crossingoveru mezi dvěma sekvencemi o délce alespoň 30 nukleotidů na bakteriálním chromosomu oddělenými nukleotidovou sekvencí „X“, a dvěma sekvencemi o délce alespoň 30 nukleotidů na vektoru transformovaném do kmene oddělenými nukleotidovou sekvencí „Y“, kde při rekombinaci se zamění sekvence X a Y.
    ·» *· • ♦ · · · · » 4 4 4 4 4 4 · • · · · · · · • 4 · 4 4 · «· ««·· ·· ··*· nároku 4, nukleotidové
    4 «· 4
    4 4
    4444 4
    -122- ·:· ί
    5. Prostředek založený na váčcích podle vyznačující se tím, že dvě sekvence mají přibližně stejnou délku, a kde vektorem je lineární molekula DNA.
    6. Prostředek založený na váčcích podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že rekombinace ve způsobech a), b), c), d), e) a h) se provádějí v oblasti chromosomu ve vzdálenosti 1000 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu sledovaného genu.
    7. Prostředek založený na váčcích podle nároku 6, vyznačující se tím, že u způsobů a), d) nebo h) obsahuje nukleotidová sekvence X část promotorové oblasti genu a nukleotidová sekvence Y obsahuje buď oblast slabého promotoru nebo promotorovou oblast neobsahuje.
    8. Prostředek založený na váčcích podle nároku 6, vyznačující se tím, že u způsobů b) nebo e) obsahuje nukleotidová sekvence Y oblast silného promotoru pro bakterii.
    9. Prostředek založený na váčcích podle nároku 8, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence Y je vložena ve vzdálenosti 200 až 600 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu sledovaného genu.
    10. Prostředek založený na váčcích podle nároku 9, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence Y • · je vložena ve vzdálenosti přibližně 400 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu sledovaného genu.
    11. Prostředek založený na váčcích podle nároku 6, kde u způsobu c) obsahuje sekvence X část represivní řídící sekvence promotoru, a nukleotidové sekvence Y takovou sekvenci neobsahuje.
    12. Prostředek založený na váčcích podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že rekombinace u způsobů
    a), d) a h) se provádějí tak, že nukleotidové sekvence X obsahuje část kódující sekvence sledovaného genu.
    13. Prostředek založený na váčcích podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že rekombinace u způsobu i) se provádějí tak, že nukleotidové sekvence Y obsahuje další kopii genu uvnitř expresní kazety.
    14. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 1 až 13, izolovaný z modifikovaného kmene Neisseria meningitidis B.
    15. Prostředek založený na váčcích podle nároku 14, získatelný použitím alespoň způsobu b) a/nebo i), kde regulace k zesílení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny zahrnující NspA, gen podobný Hsf, Hap, PorA, PorB, OMP85, PilQ, PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, Iipo02, Tbp2 (Iipo28), MltA (iipo 30) a ctrA.
    16. Prostředek založený na váčcích podle nároku 14 nebo 15, získatelný použitím alespoň způsobu a), kde regulace ke snížení
    - 124 exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa a Ope.
    17. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 14 až
    16, získatelný použitím alespoň způsobu d), kde regulace ke snížení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny: htrB, msbB a IpxK.
    18. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 14 až
    17, získatelný použitím alespoň způsobu e), kde regulace ke zvýšení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny: pmrA, pmrB, pmrE a pmrF.
    19. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 14 až
    18, získatelný použitím alespoň způsobu c), kde represivní řídící sekvence promotoru je operátorová oblast fur jednoho nebo obou genů TbpB nebo LbpB.
    20. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 14 až
    19, získatelný použitím alespoň způsobu h), kde regulace ke snížení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, strB, ctrC a ctrD.
    21. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 1 až 13, izolovaný z modifikovaného kmene Moraxella catarrhalis.
    22. Prostředek založený na váčcích podle nároku 21, získatelný použitím alespoň způsobu b) a/nebo i), kde regulace ke zvýšení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny
    - 125 zahrnující: OMP106, HasR, PilQ, OMP85, Iipo06, lipolO, lipol 1, Iipo18, P6, ompCD, CopB, D15, 0mp1A1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2 a 0mp21.
    23. Prostředek založený na váčcích podle nároku 21 nebo 22, získatelný použitím alespoň způsobu a), kde regulace ke snížení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny: CopB, OMP106, 0mpB1, TbpA, TbpB, LbpA a LbpB.
    24. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 21 až
    23, získatelný použitím alespoň způsobu d), kde regulace ke snížení exprese probíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny: htrB, msbB a IpxK.
    25. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 21 až
    24, získatelný použitím alespoň způsobu e), kde regulace ke zvýšení exprese prohbíhá u jednoho nebo více genů zvolených ze skupiny pmrA, pmrB, pmrE a pmrF.
    26. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 1 až 13, izolovaný z modifikovaného kmene Haemophilus influenzae.
    27. Prostředek založený na váčcích podle nároku 26, získatelný použitím alespoň jednoho způsobu b) a/nebo i), kde je ke zvýšení exprese regulován jeden nebo více genů ze skupiny D15, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, His, Hsf, Hap, Hin47 a Hif.
    • ·
    - 126 28. Prostředek založený na váčcích podle nároku 26 nebo 27, získatelný použitím alespoň způsobu a), kde ke snížení exprese je regulován jeden nebo více genů ze skupiny P2, P5, Hif, lgA1 proteáza, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA a TbpB.
    29. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 26 až 28, získatelný použitím alespoň způsobu d), kde ke snížení exprese je regulován jeden nebo více genů ze skupiny htrB, msbB a IpxK.
    30. Prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 26 až 29, získatelný použitím alespoň způsobu e), kde ke zvýšení exprese je regulován jeden nebo více genů ze skupiny pmrA, pmrB, pmrE a pmrF.
    31. Prostředek založený na geneticky zkonstruovaných váčcích ze kmene gramnegativních bakterií, vyznačující se tím, že tento prostředek je získatelný použitím způsobu zahrnujícího následující kroky: zavedení heterologního genu popřípadě řízeného silnou promotorovou sekvencí do chromosomu homologní rekombinací a vytvoření váčků z uvedeného kmene.
    32. Prostředek založený na váčcích podle nároku 31, vyznačující se tím, že gramnegativní kmen je Neisseria gonorrhoeae a heterologní gen je ochranný OMP z C. trachomatis.
    33. Prostředek založený na váčcích podle nároku 31, vyznačující se tím, že gramnegativní kmen je Haemophilus influenzae a heterologní gen je ochranný OMP z Moraxella catarrhalis.
    34. Prostředek založený na váčcích podle nároku 31, vyznačující se tím, že gramnegativní kmen je Moraxella catarrhalis a heterologní gen je ochranný OMP z Haemophilus influenzae.
    35. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 1 až 34, a farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.
    36. Vakcína proti meningokokům, vyznačující se tím, ž e obsahuje prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 14 až 20, a jeden nebo více prostých nebo konjugovaných obalových polysacharidů meningokoku, zvolených ze sérotypů A, C, Y nebo W.
    37. Vakcína proti meningitidě, vyznačující se tím, ž e obsahuje prostředek podle některého z nároků 14 až 20, nebo prostředek založený na váčcích podle nároku 32, konjugovaný obalový polysacharid H. influenzae b a jeden nebo více prostých nebo konjugovaných obalových polysacharidů pneumokoků.
    38. Vakcína proti zánětu středního ucha, vyznačující se tím, že obsahuje prostředek založený na váčcích podle
    - 128 • 9 «9 • 9 9 · · •· 9999 některého z nároků 21 až 25, a jeden nebo více prostých nebo konjugovaných obalových polysacharidů pneumokoků, a jeden nebo více antigenů, které mohou hostitele chránit proti infekci netypovatelným H. influenzae.
    39. Vakcína proti zánětu středního ucha, vyznačující se tím, že obsahuje prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 26 až 30, a jeden nebo více prostých nebo konjugovaných obalových polysacharidů pneumokoků, a jeden nebo více antigenů, které mohou chránit hostitele proti infekci Moraxella catarrhalis.
    40. Vakcína proti zánětu středního ucha podle nároku 38 nebo 39, vyznačující se tím, že vakcína navíc obsahuje jeden nebo více proteinových antigenů, které mohou hostitele chránit proti Streptococcus pneumoniae, a/nebo jeden nebo více antigenů, které mohou hostitele chránit proti RSV, a/nebo jeden nebo více antigenů, které mohou hostitele chránit proti viru chřipky.
    41. Vektor vhodný pro provádění rekombinaci popsaných v nárocích 3 až 34.
    42. Modifikovaný kmen gramnegativní bakterie, ze kterého se připravuje prostředek založený na váčcích podle některého z nároků 1 až 34.
    - 129 43. Imunoprotektivní a netoxická vakcína založená na gramnegativních váčcích, prázdných buňkách nebo usmrcených celých buňkách, vhodná pro pediatrické použití.
    44. Izolovaná polynukleotidová sekvence, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s částí nukleotidů, uvedených v SEQ ID No. 2 až 23, 25, 27 až 81, o délce alespoň 30 nukleotidů, nebo jejím komplementárním řetězcem.
    45. Izolovaná polynukleotidová sekvence podle nároku 44, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 30 nukleotidů.
    46. Izolovaná polynukleotidová sekvence podle nároku 45, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 30 nukleotidů SEQ ID No. 2 až 23, 25, 27 až 81, nebo její komplementární řetězec.
    47. Použití izolované polynukleotidové sekvence podle některého z nároků 44 až 46 při provádění homologni rekombinace ve vzdálenosti do 1000 bp proti směru transkripce chromosomálního genu gramnegativní bakterie buď pro zvýšení nebo snížení exprese uvedeného genu.
    48. Způsob genetické regulace ke zvýšení exprese genu ve kmeni gramnegativních bakterií, vyznačující se tím, ž e zahrnuje následující kroky: připraví se vektor obsahující sekvenci silného promotoru a nukleotidovou sekvenci o délce alespoň 30 nukleotidů, která je schopná rekombinace se sekvencí o délce alespoň 30 nukleotidů ve vzdálenosti 1000 bp proti směru transkripce genu, bakteriální kmen se transformuje tímto vektorem a provede se homologní rekombinace mezi chromosomem a vektorem pro zavedení promotoru ve vzdálenosti do 1000 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu genu.
    49. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tím, ž e promotor se zavádí do vzdálenosti 200 až 600 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu genu.
    50. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, ž e promotor se zavádí přibližně 400 bp proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu genu.
    51. Způsob podle některého z nároků 48 až 50, vyznačující se tím, že homologní rekombinace se provádí pomocí procesu dvojitého crossing-overu mezi dvěma sekvencemi o délce alespoň 30 nukleotidů na bakteriálním chromosomu, oddělenými nukleotidovou sekvencí „X“, a dvěma sekvencemi o délce alespoň 30 nukleotidů na vektoru, oddělenými nukleotidovou sekvencí „Y“, která obsahuje sekvenci silného promotoru, kde vektorem je lineární nukleotidová sekvence, a kde v průběhu rekombinace se zamění X a Y.
    52. Způsob podle nároku 51, vyznačující se tím, ž e dvě nukleotidové sekvence mají přibližně stejnou délku.
    • 9 9* 99 ··
    9·· 9999 9
    9 9 9 9 9 9
    9999 999 9999 9
    9 9 99 999
    999 9 99 9999 9* 9999
    - 131 53. Modifikovaný bakteriální kmen získatelný způsobem podle některého z nároků 48 až 52.
    54. Způsob výroby prostředku založeného na geneticky zkonstruovaných váčcích z kmene gramnegativních bakterií, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více způsobů zvolených z následující skupiny:
    a) způsob omezení imunodominantních variabilních nebo neprotektivních antigenů v prostředku založeném na váčcích, kde tento způsob zahrnuje kroky zjištění identity takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene pro produkci menšího množství nebo žádného uvedeného antigenu a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    b) způsob regulace ke zvýšení exprese ochranných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene pro zavedení silnější promotorové sekvence proti směru transkripce vzhledem ke genu kódujícímu uvedený antigen tak, že tento gen je exprimován ve vyšší míře než v nemodifikovaném váčku, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    c) způsob regulace ke zvýšení exprese podmínečně exprimovaných, ochranných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se odstranily represivní řídicí mechanismy jeho exprese, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    d) způsob modifikace podílu lipidu A v bakteriálním LPS v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace genu, který má účast při učinění části lipidu A
    - 132 -
    • · • · ·· • · • • • » • · • • • · · · · · • • • • · • • • · •« · • • · • • • « · · • • • * • ·»»·
    LPS toxickou, zkonstruování bakteriálního kmene pro snížení nebo vypnutí exprese tohoto genu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    e) způsob modifikace podílu lipidu A v bakteriálním LPS v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace genu, který má účast při učinění části lipidu A LPS méně toxickou, zkonstruování bakteriálního kmene pro zavedení silnější promotorové sekvence proti směru transkripce uvedeného genu tak, že tento gen je exprimován s vyšší mírou než v nemodifikovaných váčcích, a vytvoření váčků z tohoto kmene;
    f) způsob snížení toxicity lipidu A v prostředku založeném na váčcích a zvýšení hladin ochranných antigenů, který zahrnuje kroky zkonstruování chromosomu bakteriálního kmene pro zavedení genu kódujícího peptid polymyxin A, nebo jeho derivát nebo analog, fúzovaného k ochrannému antigenu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    g) způsob vytvoření konzervovaných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby byly odstraněny variabilní oblasti genu kódujícího uvedený antigen, a vytvoření váčků z uvedeného kmene;
    h) způsob snížení exprese antigenu v prostředku založeném na váčcích, kde tento antigen sdílí strukturní podobnost s lidskou strukturou a může být schopný indukovat autoimunitní odpověď u lidí, který zahrnuje kroky identifikace genu, který se účastní biosyntézy antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se snížila nebo vypnula exprese uvedeného kmenu, a vytvoření váčků z uvedeného kmene; nebo
    - 133 -
    • 4 • 4 44 4 4 4 44 • «4 4 4 4 4 • 4 44 4 4 • 4 4 4 4 4 4 • · • · · 4 4 4 • • 4 4 ·· • 4 4»·
    i) způsob regulace ke zvýšení exprese ochranných antigenů OMP v prostředku založeném na váčcích, který zahrnuje kroky identifikace takového antigenu, zkonstruování bakteriálního kmene tak, aby se do chromosomu zavedla jedna nebo více dalších kopií genu kódujícího uvedený antigen, řízeného heterologní, silnější promotorovou sekvencí, a vytvoření váčků z uvedeného kmene.
    55. Způsob imunizace lidského hostitele proti onemocnění způsobenému infekcí jedním nebo více druhy zvolenými z následující skupiny: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chiamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia, kde tento způsob zahrnuje podávání imunoprotektivní dávky prostředku založeného na váčcích podle některého z nároků 1 až 34 hostiteli.
    56. Použití prostředku založeného na váčcích podle některého z nároků 1 až 34 při výrobě farmaceutického prostředku pro imunizaci lidského hostitele proti onemocnění způsobenému infekcí jedním nebo více z následujících druhů: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia.
    Zastupuje:
    O O ••>3 0
    O 3 O Ί .1 .1-)1 Ί
    ie
CZ2002403A 1999-08-03 2000-07-31 Vakcína CZ2002403A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9918319.6A GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-08-03 Vaccine composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2002403A3 true CZ2002403A3 (cs) 2002-05-15

Family

ID=10858521

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002403A CZ2002403A3 (cs) 1999-08-03 2000-07-31 Vakcína

Country Status (31)

Country Link
US (4) US20060216307A1 (cs)
EP (6) EP1787655A3 (cs)
JP (3) JP5524437B2 (cs)
KR (2) KR20020027514A (cs)
CN (1) CN1377415B (cs)
AR (1) AR025218A1 (cs)
AT (2) ATE345392T1 (cs)
AU (1) AU770360C (cs)
BR (1) BR0012974A (cs)
CA (3) CA2380840C (cs)
CO (1) CO5280150A1 (cs)
CY (1) CY1107553T1 (cs)
CZ (1) CZ2002403A3 (cs)
DE (2) DE60045324D1 (cs)
DK (1) DK1208214T3 (cs)
ES (3) ES2355517T3 (cs)
GB (1) GB9918319D0 (cs)
GC (1) GC0000258A (cs)
HK (1) HK1048493B (cs)
HU (1) HUP0203056A3 (cs)
IL (2) IL147647A0 (cs)
MX (1) MXPA02001205A (cs)
MY (1) MY129006A (cs)
NO (1) NO332230B1 (cs)
NZ (3) NZ516802A (cs)
PL (2) PL211037B1 (cs)
PT (1) PT1208214E (cs)
SI (1) SI1208214T1 (cs)
TR (2) TR200202448T2 (cs)
WO (1) WO2001009350A2 (cs)
ZA (1) ZA200200824B (cs)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9823978D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Microbiological Res Authority Multicomponent meningococcal vaccine
US10967045B2 (en) 1998-11-02 2021-04-06 Secretary of State for Health and Social Care Multicomponent meningococcal vaccine
NO20002828D0 (no) * 2000-06-02 2000-06-02 Statens Inst For Folkehelse Proteinholdig vaksine mot Neisseria meningtidis serogruppe samt fremgangsmÕte ved fremstilling derav
ES2519440T3 (es) 2000-07-27 2014-11-07 Children's Hospital & Research Center At Oakland Vacunas para la protección de amplio espectro contra enfermedades causadas por Neisseria meningitidis
GB0103170D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0025169D0 (en) 2000-10-13 2000-11-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
SI21352A (sl) 2001-01-23 2004-06-30 Aventis Pasteur Multivalentno meningokokno cepivo iz konjugata polisaharida-proteina
GB0103169D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0103171D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
DK1395648T3 (da) 2001-06-11 2009-08-03 Applied Nanosystems Bv Fremgangsmåder til binding af AcmA-type proteinankerfusioner til cellevægsmateriale af mikroorganismer
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
MX339524B (es) * 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0130123D0 (en) * 2001-12-17 2002-02-06 Microbiological Res Agency Outer membrane vesicle vaccine and its preparation
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
CN102552895B (zh) * 2002-08-02 2014-07-23 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗组合物
RU2364418C2 (ru) * 2002-08-02 2009-08-20 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ ИММУНОТИПА L2 И/ИЛИ L3, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ШТАММА NEISSERIA MENINGITIDIS IgtB-
BR0313100A (pt) * 2002-08-02 2005-06-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Composição imunogênica, composição imunogênica isolada, vacina, método de tratamento ou prevenção de doença bacteriana gram-negativa, uso da vacina, cepa bacteriana gram-negativa geneticamente manipulada, método para preparar a composição imunogênica, método para preparar a vacina, método de preparar uma imunoglobulina para uso na prevenção ou tratamento de infecção neisserial, preparação de imunoglobulina, preparação farmacêutica, e, uso da preparação farmacêutica
US20060057160A1 (en) * 2002-08-02 2006-03-16 Ralph Biemans Vaccine composition
GB0220197D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Univ Utrecht Refolding method
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
US7438918B2 (en) 2002-08-30 2008-10-21 University Of Iowa Research Foundation Lipid A deficient mutants of Neisseria meningitidis
HUE031886T2 (en) 2002-10-11 2017-08-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polypeptide vaccines for extensive protection against hypervirulent meningococcal lines
EP1562982B1 (en) * 2002-11-15 2010-05-05 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
CU23313A1 (es) 2002-11-27 2008-09-25 Inst Finlay Ct De Investigacia Mã0/00todo de obtenciã"n de estructuras cocleares. composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios
EP2172213B1 (en) 2003-01-30 2013-04-03 Novartis AG Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
GB0308691D0 (en) * 2003-04-07 2003-05-21 Xenova Res Ltd Vaccine preparations
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
CU23377A1 (es) * 2003-11-04 2009-05-28 Ct De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Metodo para la incorporacion de antigenos en vesiculas de membrana externa de bacterias y formulaciones resultantes
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0416120D0 (en) 2004-07-19 2004-08-18 Health Prot Agency Stable compositions containing OMV's
AU2005203202C1 (en) * 2004-07-30 2009-02-19 Intervet International B.V. Novel bacterium and vaccine
GB0419408D0 (en) * 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
GB0419627D0 (en) * 2004-09-03 2004-10-06 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
WO2006081259A2 (en) 2005-01-27 2006-08-03 Children's Hospital & Research Center At Oakland Gna1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
SI1858920T1 (sl) 2005-02-18 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteini in nukleinske kisline iz escherichia coli, povezane z meningitisom/sepso
PE20110072A1 (es) 2005-06-27 2011-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
MY150105A (en) 2006-01-17 2013-11-29 Forsgren Arne A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein e; pe)
CA2654706A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Nathalie Devos Neisseria meningitidis lipooligosaccharide vaccine
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
JP5814507B2 (ja) 2006-09-07 2015-11-17 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
WO2008147816A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for the display of proteins on the surface of bacteria and their derived vesicles and uses thereof
CA2695467A1 (en) * 2007-08-02 2009-03-26 Children's Hospital & Research Center At Oakland Fhbp- and lpxl1-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
BR122016015627A2 (pt) 2007-10-19 2018-10-30 Novartis Ag kit, composição antigênica liofilizada e método para preparação de uma composição imunogênica
CN102356089B (zh) 2008-02-21 2014-02-19 诺华股份有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽
CN102015651B (zh) 2008-03-03 2014-12-31 Irm责任有限公司 作为tlr活性调节剂的化合物和组合物
UA99659C2 (uk) 2008-05-30 2012-09-10 Дзе Ю.Ес.Ей., Ес Репрезентед Бай Дзе Секретарі Оф Дзе Армі, Он Бехаф Оф Уолтер Рід Армі Мультивалентна вакцина з нативних везикул зовнішньої мембрани менінгококів, способи її застосування
KR101042541B1 (ko) * 2008-07-25 2011-06-17 한국생명공학연구원 외막소체를 생산하는 재조합 ｇ（－） 박테리아 및 이를이용한 다가항원이 실린 외막소체의 제조방법
GB0816447D0 (en) 2008-09-08 2008-10-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
TWI548746B (zh) * 2009-08-06 2016-09-11 英特威特國際股份有限公司 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法
CN102596240B (zh) 2009-08-27 2015-02-04 诺华股份有限公司 包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽
EP2470205A1 (en) 2009-08-27 2012-07-04 Novartis AG Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation
WO2011027971A2 (ko) 2009-09-01 2011-03-10 주식회사이언메딕스 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체, 및 이를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법
WO2011027956A2 (ko) 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 박테리아에서 유래한 세포밖 소포체 및 이를 이용한 질병 모델
WO2011027222A2 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Novartis Ag Immunogenic compositions including tlr activity modulators
CN102724988B (zh) 2009-09-30 2014-09-10 诺华股份有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽的表达
CA2779816A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Novartis Ag Modified meningococcal fhbp polypeptides
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
BR112012014624A8 (pt) 2009-12-15 2017-12-26 Novartis Ag suspensão homogênea de compostos de imunopotenciação e usos dos destes
CA2792687A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
AU2011288203A1 (en) 2010-03-18 2012-08-23 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for serogroup B meningococcus
SG187201A1 (en) * 2010-07-26 2013-02-28 Qu Biolog Inc Immunogenic anti-inflammatory compositions
US9259462B2 (en) 2010-09-10 2016-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Developments in meningococcal outer membrane vesicles
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
JP5957443B2 (ja) * 2011-03-28 2016-07-27 長瀬産業株式会社 フェリチンの製造方法
EP2505208A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-03 University of Graz Vaccine against Pasteurellaceae
US20150147356A1 (en) 2011-05-12 2015-05-28 Alan Kimura Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines
GB201110980D0 (en) 2011-06-28 2011-08-10 Health Prot Agency Neisserial compositions and expression constructs
EP3299467B1 (en) 2012-02-02 2021-08-11 GlaxoSmithKline Biologicals SA Promoters for increased protein expression in meningococcus
EP3693010A1 (en) * 2012-04-06 2020-08-12 Cornell University Subunit vaccine delivery platform for robust humoral and cellular immune responses
JP6324961B2 (ja) 2012-09-06 2018-05-16 ノバルティス アーゲー 血清群ｂ髄膜炎菌とｄ／ｔ／ｐとの組み合わせワクチン
CN103656631B (zh) * 2012-09-24 2015-08-19 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物及其制备方法
CN111249455A (zh) * 2012-11-30 2020-06-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 假单胞菌抗原和抗原组合
KR20160127104A (ko) 2014-02-28 2016-11-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드
EP3242883A4 (en) 2015-01-06 2018-10-17 ImmunoVaccine Technologies Inc. Lipid a mimics, methods of preparation, and uses thereof
WO2019018744A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS
EP3607967A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Modified meningococcal fhbp polypeptides
WO2020043874A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugated haemophilus influenzae vaccine using bordetella outer membrane vesicle
US20220378902A1 (en) * 2019-08-22 2022-12-01 Sichuan University Bacterial membrane vesicles, and separation and preparation system and method therefor
WO2021113433A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 University Of Connecticut Mycoplasma vaccine composition and methods
CA3194346A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Outer membrane vesicles
CN114681601B (zh) * 2020-12-31 2025-08-19 基础治疗有限公司 脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗及其应用
CN115976088B (zh) * 2022-07-21 2023-09-19 深圳蓝晶生物科技有限公司 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2848965A1 (de) 1978-11-11 1980-05-22 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung von membranproteinen aus neisseria meningitidis und diese enthaltende vaccine
JPS55161029U (cs) 1979-05-08 1980-11-19
US4271147A (en) 1980-01-10 1981-06-02 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same
US4666836A (en) * 1981-01-02 1987-05-19 The Research Foundation Of State University Of New York Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
US5098997A (en) * 1987-12-11 1992-03-24 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for Haemophilus influenzae
RU2023448C1 (ru) 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
WO1990006951A1 (en) 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
EP0449958B9 (en) * 1988-12-19 2003-05-28 American Cyanamid Company Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
CA2087160A1 (en) 1990-07-16 1992-01-17 P. Frederick Sparling Antigenic iron repressible proteins from n. meningitidis related to the hemolysin family of toxins
DE4023721A1 (de) 1990-07-26 1992-01-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von vakzinen und ihre verwendung
US5912336A (en) 1990-08-23 1999-06-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
CA2138997C (en) 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
JP3429313B2 (ja) 1993-05-18 2003-07-22 オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション 中耳炎ワクチン
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
US6265567B1 (en) 1995-04-07 2001-07-24 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated FrpB nucleic acid molecule
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6180111B1 (en) * 1995-05-18 2001-01-30 University Of Maryland Vaccine delivery system
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
EA199800046A1 (ru) 1995-06-07 1998-06-25 Байокем Вэксинс Инк. Полипептид, последовательность днк, вакцинная композиция (варианты), антитело или его фрагмент, вакцина, применения указанных полипептида, последовательности днк и антитела или его фрагмента
BR9609882A (pt) * 1995-08-04 1999-07-27 Univ Guelph Vacina processos para preparar a mesma para tratar uma doença infecciosa para inserir uma molécula de ácido nucleico em uma célula de marcaç o para administrar um agente terapêutico a um hospedeiro e para triar um antígeno imunogênico de um patógeno uso de uma vesícula de membrana composição farmacêutica sistema de liberação de drogas e vesícula de membrana
US6887483B2 (en) * 1995-12-01 2005-05-03 University Of Iowa Research Foundation Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
ES2262177T3 (es) 1996-05-01 2006-11-16 The Rockefeller University Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.
FR2751000B1 (fr) 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
JP4469026B2 (ja) 1996-10-31 2010-05-26 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原およびワクチン
FR2755446B1 (fr) * 1996-11-04 1999-01-08 Inst Curie Lignees cellulaires stables exprimant la proteine cftr ou un mutant de cette proteine, outil de selection de molecules ayant un effet sur le transport intracellulaire de ces proteines
US6685943B1 (en) * 1997-01-21 2004-02-03 The Texas A&M University System Fibronectin binding protein compositions and methods of use
WO1998033923A1 (en) * 1997-01-30 1998-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT msbB or htrB GENES
GB9711964D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Medical Res Council Live attenuated vaccines
EP0998557A2 (en) 1997-07-21 2000-05-10 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
ES2301181T3 (es) * 1997-08-21 2008-06-16 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Mutantes nuevos de bacterias mucosas gram negativas y su aplicacion en vacunas.
EP2218731A1 (en) 1997-11-28 2010-08-18 Merck Serono Biodevelopment Chlamydia trachomatis genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection
GB9726398D0 (en) 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
DE69942176D1 (de) 1998-04-07 2010-05-06 Medimmune Llc Choline-bindende proteine derivate aus pneumokoken als impfstoff
EP2261338A3 (en) 1998-05-01 2012-01-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
WO2000023595A1 (en) 1998-10-22 2000-04-27 The University Of Montana Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof
AU762369B2 (en) * 1998-11-03 2003-06-26 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur LPS with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
US20060057160A1 (en) * 2002-08-02 2006-03-16 Ralph Biemans Vaccine composition
US9473463B2 (en) 2014-07-29 2016-10-18 Combined Conditional Access Development & Support, LLC Control word and associated entitlement control message caching and reuse

Also Published As

Publication number Publication date
US20140294935A1 (en) 2014-10-02
BR0012974A (pt) 2002-05-07
HK1048493A1 (en) 2003-04-04
CA2380840A1 (en) 2001-02-08
TR200200275T2 (tr) 2002-05-21
US20080233154A1 (en) 2008-09-25
GC0000258A (en) 2006-11-01
HK1105581A1 (en) 2008-02-22
HUP0203056A1 (hu) 2002-12-28
WO2001009350A2 (en) 2001-02-08
EP1787655A2 (en) 2007-05-23
PL211017B1 (pl) 2012-03-30
US20160175423A1 (en) 2016-06-23
IL147647A0 (en) 2002-08-14
CY1107553T1 (el) 2013-03-13
NO20020506L (no) 2002-04-02
ES2399057T3 (es) 2013-03-25
EP1792994A2 (en) 2007-06-06
ATE345392T1 (de) 2006-12-15
JP2009284914A (ja) 2009-12-10
EP1808490A2 (en) 2007-07-18
JP2013017487A (ja) 2013-01-31
EP1774977A2 (en) 2007-04-18
KR20130083491A (ko) 2013-07-22
HK1048493B (en) 2007-06-22
PT1208214E (pt) 2007-02-28
DE60045324D1 (de) 2011-01-13
ES2275539T3 (es) 2007-06-16
HUP0203056A3 (en) 2008-04-28
JP5524437B2 (ja) 2014-06-18
DK1208214T3 (da) 2007-03-19
MY129006A (en) 2007-03-30
JP2003506049A (ja) 2003-02-18
EP1792994A3 (en) 2007-10-10
EP1808490A3 (en) 2007-10-24
JP5744813B2 (ja) 2015-07-08
EP1208214B1 (en) 2006-11-15
EP1208214A2 (en) 2002-05-29
EP1797894B1 (en) 2010-12-01
PL211037B1 (pl) 2012-04-30
DE60031859D1 (de) 2006-12-28
EP1797894A2 (en) 2007-06-20
ATE490327T1 (de) 2010-12-15
PL392363A1 (pl) 2010-11-22
US20060216307A1 (en) 2006-09-28
AU770360B2 (en) 2004-02-19
DE60031859T2 (de) 2007-05-10
NZ530336A (en) 2005-08-26
MXPA02001205A (es) 2002-07-02
CA2380840C (en) 2014-04-08
TR200202448T2 (tr) 2003-01-21
WO2001009350A3 (en) 2001-08-30
SI1208214T1 (sl) 2007-04-30
AU6833600A (en) 2001-02-19
GB9918319D0 (en) 1999-10-06
IL147647A (en) 2012-08-30
CA2820314C (en) 2016-04-26
NO332230B1 (no) 2012-08-06
ES2355517T3 (es) 2011-03-28
AR025218A1 (es) 2002-11-13
CA2820271A1 (en) 2001-02-08
EP1797894A3 (en) 2007-11-14
NZ530335A (en) 2005-07-29
KR20020027514A (ko) 2002-04-13
CO5280150A1 (es) 2003-05-30
EP1774977A3 (en) 2007-07-04
NZ516802A (en) 2005-09-30
EP1808490B1 (en) 2012-11-14
NO20020506D0 (no) 2002-01-31
AU770360C (en) 2005-04-07
CN1377415A (zh) 2002-10-30
ZA200200824B (en) 2003-11-26
CN1377415B (zh) 2011-05-18
CA2820314A1 (en) 2001-02-08
PL353891A1 (en) 2003-12-15
EP1787655A3 (en) 2008-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU770360B2 (en) Vaccine composition
US20090117147A1 (en) Vaccines comprising outer membrane vesicles from gram negative bacteria
AU2003271337B2 (en) Vaccine composition
HK1105427A (en) Vaccines of bacterial outer membrane vesicles
HK1105576A (en) Genetically engineered bleb vaccine
HK1108004A (en) Genetically engineered bleb vaccine
HK1105575A (en) Meningococcal vaccine composition
HK1105581B (en) Vaccine composition