PL211037B1 - Kompozycja szczepionki - Google Patents

Kompozycja szczepionki

Info

Publication number
PL211037B1
PL211037B1 PL392363A PL39236300A PL211037B1 PL 211037 B1 PL211037 B1 PL 211037B1 PL 392363 A PL392363 A PL 392363A PL 39236300 A PL39236300 A PL 39236300A PL 211037 B1 PL211037 B1 PL 211037B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
strain
vesicle
expression
pora
Prior art date
Application number
PL392363A
Other languages
English (en)
Other versions
PL392363A1 (pl
Inventor
François-Xavier Jacques Berthet
Wilfried L.J. Dalemans
Philippe Denoel
Guy Dequesne
Christiane Feron
Yves Lobet
Jan Poolman
Georges Thiry
Joelle Thonnard
Pierre Voet
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10858521&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL211037(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL392363A1 publication Critical patent/PL392363A1/pl
Publication of PL211037B1 publication Critical patent/PL211037B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211037 (21) Numer zgłoszenia: 392363 (13) B1 (22) Data zgłoszenia: 31.07.2000 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:
353891 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
31.07.2000, PCT/EP00/007424 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
08.02.2001, WO01/09350 (51) Int.Cl.
C12N 15/74 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) C12N 15/67 (2006.01) A61K 39/02 (2006.01) A61K 39/09 (2006.01) C07K 14/195 (2006.01)
Kompozycja szczepionki (30) Pierwszeństwo:
03.08.1999, GB, 9918319.6 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
22.11.2010 BUP 24/00 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12 (73) Uprawniony z patentu:
SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku:
FRANęOIS-XAVIER JACQUES BERTHET,
Rixensart, BE
WILFRIED L.J. DALEMANS, Rixensart, BE PHILIPPE DENOEL, Rixensart, BE
GUY DEQUESNE, Rixensart, BE
CHRISTIANE FERON, Rixensart, BE
YVES LOBET, Rixensart, BE
JAN POOLMAN, Rixensart, BE
GEORGES THIRY, Rixensart, BE
JOELLE THONNARD, Rixensart, BE PIERRE VOET, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Magdalena Tagowska
PL 211 037 B1
Opis wynalazku
Zakres wynalazku
Przedmiotem wynalazku są kompozycje szczepionek bakteryjnych Gram-ujemnych, ich wytwarzanie oraz zastosowanie takich kompozycji w medycynie. Ściślej, przedmiotem wynalazku są nowe szczepionki pęcherzyków błony zewnętrznej i korzystne sposoby uzyskiwania tych szczepionek jako skuteczniejszych i bezpieczniejszych.
Tło wynalazku
Bakterie Gram-ujemne są oddzielone od środowiska zewnętrznego dwiema kolejnymi warstwami o strukturze błony. Te struktury, określane jako błona cytoplazmatyczna i błona zewnętrzna (OM, ang. outer membrane), różnią się zarówno strukturalnie jak i funkcjonalnie. Błona zewnętrzna odgrywa ważną rolę w oddziaływaniu bakterii patogennych z ich odpowiednimi gospodarzami. Wskutek tego, eksponowane na powierzchni cząsteczki bakteryjne stanowią ważne cele dla odpowiedzi immunologicznej gospodarza, co czyni składniki błony zewnętrznej atrakcyjnymi kandydatami do uzyskiwania szczepionek, odczynników diagnostycznych i terapeutycznych.
Szczepionki bakteryjne z całych komórek (zabitych lub atenuowanych) mają tę zaletę, że dostarczają wielu antygenów w ich naturalnym mikrootoczeniu. Wadami tego podejścia są efekty uboczne indukowane przez składniki bakteryjne, takie jak fragmenty endotoksyn i peptydoglikanów. Z drugiej strony, szczepionki z podjednostek niekomórkowych zawierające oczyszczone składniki błony zewnętrznej mogą zapewnić tylko ograniczoną ochronę i nie mogą właściwie prezentować antygenów układowi immunologicznemu gospodarza.
Białka, fosfolipidy i lipopolisacharydy stanowią trzy główne składniki znajdowane w błonie zewnętrznej wszystkich bakterii Gram-ujemnych. Te cząsteczki są rozmieszczone asymetrycznie: fosfolipidy błonowe (głównie w warstwie wewnętrznej), lipooligosacharydy (wyłącznie w warstwie zewnętrznej) i białka (lipoproteiny warstwy wewnętrznej i zewnętrznej, integralne lub politopowe białka błonowe). W przypadku wielu patogenów bakteryjnych, które wpływają na ludzkie zdrowie, wykazano, że lipopolisacharydy i białka błony zewnętrznej są immunogenne i przydatne do nadawania ochrony przed odpowiednią chorobą na drodze immunizacji.
Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych jest dynamiczna i, zależnie od warunków otoczenia, może ulegać drastycznym przekształceniom morfologicznym. Wśród tych objawów badano tworzenie pęcherzyków błony zewnętrznej {ang. vesicles lub blebs] i udokumentowano dla wielu bakterii Gramujemnych (Zhou, L i in. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228). Wśród patogenów bakteryjnych, które opisano jako wytwarzające pęcherzyki, nie wyczerpująca lista obejmuje: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa i Yersinia enterocolitica. Chociaż mechanizm biochemiczny odpowiedzialny za wytwarzanie pęcherzyków OM nie jest w pełni zrozumiany, to te pęcherzyki błony zewnętrznej były rozlegle badane, ponieważ reprezentują potężną metodologie izolowania preparatów białek błony zewnętrznej w ich konformacji natywnej. W tym kontekście, zastosowanie preparatów błony zewnętrznej ma szczególne znaczenie dla opracowania szczepionek przeciw Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa i Chlamydia. Ponadto, pęcherzyki błony zewnętrznej łączą wiele antygenów białkowych i niebiałkowych, które prawdopodobnie nadają rozległą ochronę przeciwko wariantom wewnątrzgatunkowym.
Twórcy wykażą, że w porównaniu z innymi, szerzej stosowanymi, typami szczepionki bakteryjnej (szczepionki bakteryjne z całych komórek i z oczyszczonych podjednostek), szczepionki z pęcherzyków błony zewnętrznej (jeżeli są zmodyfikowane w pewien sposób) mogą stanowić idealny kompromis.
Rozpowszechnione zastosowanie szczepionek z podjednostek bakteryjnych nastąpiło dzięki intensywnym badaniom białek powierzchniowych bakterii, które okazały się przydatne w zastosowaniach do szczepionek [na przykład pertaktyny z B. pertussis]. Te białka są luźno związane z bakteryjna błoną zewnętrzną i mogą być oczyszczone z supernatantu hodowli albo łatwo ekstrahowane z komórek bakteryjnych. Jednak wykazano także, że strukturalne, integralne białka błony zewnętrznej także stanowią antygeny ochronne. Przykłady to PorA dla grupy surowiczej B N. meningitidis B; D15 dla H. influenzae; OMP (białko błony zewnętrznej) CD dla M. catarrhalis; OMP F dla P. aeruginosa. Takie białka mają jednak dość specyficzne cechy strukturalne, szczególnie wiele amfipatycznych
PL 211 037 B1 arkuszy β, co komplikuje ich bezpośrednie zastosowanie jako szczepionek z podjednostek oczyszczonych (rekombinacyjnych).
Ponadto stało się jasne, że potrzebne są szczepionki wieloskładnikowe (w kategoriach białek powierzchniowych bakterii i integralnych białek błonowych) dla zapewnienia sensownego poziomu ochrony. Na przykład, w przypadku szczepionek z podjednostek B. pertussis szczepionki wieloskładnikowe górują nad produktami jedno- lub dwuskładnikowymi.
W celu włączenia integralnych białek błony zewnętrznej do takiego produktu podjednostki, w produkcie musi być obecne natywne (lub niemal natywne) fałdowanie konformacyjne białek, żeby miał przydatne działanie immunologiczne. Zastosowanie wydzielonych pęcherzyków błony zewnętrznej może być eleganckim rozwiązaniem problemu zawarcia integralnych białek błony ochronnej w szczepionce zawierającej podjednostkę, przy zapewnieniu, że dalej składają się właściwie.
N. meningitidis grupy surowiczej B (menB) wydziela pęcherzyki błony zewnętrznej w ilościach dostatecznych, aby umożliwić wytwarzanie ich na skalę przemysłową. Stwierdzono, że takie wieloskładnikowe szczepionki białek błony zewnętrznej z występujących w przyrodzie szczepów menB są skuteczne do ochrony nastolatków przed chorobą menB i zostały zarejestrowane w Ameryce Łacińskiej. Alternatywny sposób wytwarzania pęcherzyków błony zewnętrznej polega na ekstrakcji detergentowej komórek bakteryjnych (EP 11243).
Przykłady gatunków bakterii, z których można wytworzyć szczepionki pęcherzykowe, są następujące.
Neisseria meningitidis:
Neisseria meningitidis (meningokok) to bakteria Gram-ujemna często izolowana z ludzkich górnych dróg oddechowych. Sporadycznie wywołuje inwazyjne choroby bakteryjne, takie jak bakteriemia i zapalenie opon. Zachorowalność na chorobę meningokokowa wykazuje różnice geograficzne, związane z porą roku oraz rokiem (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Większość przypadków choroby w krajach umiarkowanych jest skutkiem szczepów grupy surowiczej B, zaś zachorowalność zmienia się od 1-10/100000/rok populacji całkowitej, czasami osiągając wyższe wartości (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. i in. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C, Pavez, G., Aguilar, E., i in. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990). Zachorowalności swoiste dla wieku w dwóch grupach wysokiego ryzyka, u dzieci młodszych i nastolatków, osiągają wyższe poziomy.
Epidemie zdominowane przez grupę surowiczą A meningokoków występują głównie w Afryce Środkowej, czasami osiągając poziomy do 1000/100000/rok (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Niemal wszystkie przypadki choroby meningokokowej w całości są powodowane przez meningokoki grupy surowiczej A, B, C, W-135 i Y. Dostępna jest czterowalentna szczepionka z polisacharydów otoczki A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982).
Szczepionki polisacharydowe są obecnie ulepszane przez chemiczne sprzęganie ich z białkami nośnikowymi (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., i in. JAMA 275 : 1499-1503, 1996). Szczepionka grupy surowiczej B nie jest dostępna, gdyż polisacharyd otoczki B jest nieimmunogenny, najprawdopodobniej dlatego, że wykazuje podobieństwo strukturalne ze składnikami gospodarza (Wyle,
F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. i in. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M.,
Makela, P.M. Lancet ii.: 355-357, 1983).
Przez wiele lat skupiano wysiłki na opracowywaniu szczepionek opartych na meningokokowej błonie zewnętrznej (de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C. i in. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. i in. 338: 1093-1096, 1991). Takie szczepionki wykazały skuteczność od 57% - 85% u dzieci starszych (>4 lata) i młodzieży. Większość tych prób skuteczności przeprowadzono ze szczepionkami OMV (pęcherzyków błony zewnętrznej, uzyskanymi przez pozbawienie pęcherzyków LPS) pochodzącymi od szczepów N. meningitidis B typu dzikiego.
W tych szczepionkach obecnych jest wiele składników bakteryjnej błony zewnętrznej, takich jak PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB i wkład tych składników w obserwowaną ochronę wciąż wymaga dalszego określenia. Inne składniki bakteryjnej błony zewnętrznej określono (stosując przeciwciała zwierzęce lub ludzkie) jako potencjalnie nadające się do indukcji odporności ochronnej, takie jak TbpB, NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maitre-Wilmott, C., Dumas, p. i in., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). Mechanizm odporności ochronnej obejmuje aktywność bakteriobójczą za pośrednictwem przeciwciał i opsonofagocytozę.
PL 211 037 B1
W minionych kilku dziesięcioleciach częstość infekcji Neisseria meningitidis dramatycznie wzrosła. Przypisuje się to pojawieniu się szczepów opornych na wiele antybiotyków oraz zwiększonej ekspozycji wskutek wzrostu aktywności społecznej (np. baseny lub teatry). Nie jest już niczym nadzwyczajnym wyizolowanie szczepów Neisseria meningitidis opornych na niektóre lub wszystkie ze standardowych antybiotyków. To zjawisko stworzyło niezaspokojone medyczne zapotrzebowanie i popyt na nowe środki mikrobójcze, szczepionki, sposoby badania przesiewowego leków, i testy diagnostyczne na ten organizm.
Moraxella catarrhalis
Moraxella catarrhalis (zwana także Branhamella catarrhalis) to bakteria Gram-ujemna często izolowana z ludzkich górnych dróg oddechowych. Jest odpowiedzialna za kilka patologii, przy czym główne to zapalenie ucha środkowego u dzieci młodszych i dzieci, oraz zapalenie płuc u starszych. Jest odpowiedzialna także za zapalenie zatok, zakażenia szpitalne i, mniej często, za choroby inwazyjne.
U większości testowanych dorosłych zidentyfikowano przeciwciała bakteriobójcze (Chapman, AJ i in. (1985) J. Infect.Dis. 151:878). Szczepy M. catarrhalis wykazują zmienność swojej oporności na aktywność bakteriobójczą surowicy: w ogólności, izolaty od osób chorych są bardziej oporne niż od tych, które są po prostu skolonizowane (Hol, C i in. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL i in. (1990) Am. J. Med. 88 (suppl. 5A):28S). Oporność na surowicę można przeto uznawać za czynnik zjadliwości bakterii. Aktywność opsonizującą zaobserwowano w surowicach dzieci wracających do zdrowia po zapaleniu ucha środkowego.
U ludzi nie zidentyfikowano antygenów będących celem tych różnych odpowiedzi immunologicznych, z wyjątkiem OMP B1, białka 84 kDa, którego ekspresję reguluje żelazo, i które jest rozpoznawane przez surowice pacjentów z zapaleniem płuc (Sethi, S, i in. (1995) Infect. Immun. 63:1516), i z wyjątkiem UspA1 i UspA2 (Chen D. i in. (1999), Infect. Immun. 67:1310).
Stosując sposoby biochemiczne scharakteryzowano kilka innych białek błonowych obecnych na powierzchni M. catarrhalis ze względu na ich potencjalne znaczenie w indukcji odporności ochronnej (przegląd - patrz Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). W modelu myszy zapalenia płuc, obecność przeciwciał powstałych przeciwko niektórym z nich (UspA, CopB) sprzyja szybszej likwidacji infekcji płucnej. Inny polipeptyd (OMP CD) jest wysoce zachowany wśród szczepów M. catarrhalis, i wykazuje homologie z poryną Pseudomonas aeruginosa, która, jak wykazano, jest skuteczna przeciwko tej baterii w modelach zwierzęcych.
M. catarrhalis wytwarza pęcherzyki błony zewnętrznej. Te pęcherzyki wydzielono lub ekstrahowano stosując różne sposoby (Murphy T.F., Loeb M.R. 1989. Microb. Pathog. 6: 159-174; Unhanand M., Maciver, I., Ramillo O., Arencibia-Mireles O., Argyle J.C., McCracken G.H. Jr., Hansen E.J. 1992. J. Infect. Dis. 165:644-650). Zdolność ochronną takich preparatów pęcherzyków przetestowano na modelu mysim badając usuwanie M. catarrhalis z płuc. W tym modelu wykazano, że aktywna immunizacja przy użyciu szczepionki pęcherzykowej lub pasywne przeniesienie przeciwciała antypęcherzykowego indukuje znaczącą ochronę (Maciver I., Unhanand M., McCracken G.H. Jr., Hansen, E.J. 1993. J. Infect. Dis. 168: 469-472).
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae to nieruchliwa bakteria Gram-ujemna. Człowiek jest jej jedynym naturalnym gospodarzem. Izolaty H. influenzae zazwyczaj klasyfikuje się zgodnie z ich otoczką polisacharydową. Zidentyfikowano sześć różnych typów otoczkowych oznaczanych 'a' do 'f'. Izolaty, które nie aglutynują z surowicami odpornościowymi uzyskanymi przeciwko jednemu z tych sześciu serotypów są klasyfikowane jako atypowe, i nie wyrażają otoczki.
H. influenzae typu b (Hib) odróżnia się wyraźnie od innych typów tym, że stanowi główną przyczynę bakteryjnego zapalenia opon i chorób ogólnoustrojowych. Atypowe szczepy H. influenzae (NTHi) są tylko sporadycznie wydzielane z krwi pacjentów mających chorobę ogólnoustrojową. NTHi stanowi pospolitą przyczynę zapalenia płuc, pogorszenia przewlekłego zapalenia oskrzeli, zapalenia zatok i zapalenia ucha środkowego. Szczepy NTHi wykazują dużą zmienność identyfikowaną metodą analizy klonalnej, podczas gdy szczepy Hib jako całość są bardziej homogenne.
Wykazano, że rozmaite białka H. influenzae są zaangażowane w patogenezę albo nadają ochronę przy szczepieniu w modelach zwierzęcych.
Opisano przylegania NTHi do ludzkich komórek nabłonkowych nosogardzieli (Read RC. i in. 1991. J. Infect. Dis. 163:549). Oprócz fimbrii i rzęsek (Brinton CC. i in. 1989. Pediatr. Infect. Dis. J. 8:S54; Kar S. i in. 1990. Infect. Immun. 58:903; Gildorf JR. i in. 1992. Infect. Immun. 60:374;
PL 211 037 B1
St. Gerne JW i in. 1991. Infect. Immun. 59:3366; St. Gerne JW i in. 1993. Infect. Immun. 61: 2233) w NHTi zidentyfikowano wiele adhezyn. Wykazano, że wśród nich dwa eksponowane na powierzchni białka o wysokiej masie cząsteczkowej oznaczane HMW1 i HMW2 pośredniczą w adhezji NTHi do komórek nabłonkowych (St. Geme JW. i in. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2875). Inną rodzinę białek o wysokiej masie cząsteczkowej zidentyfikowano w szczepach NHTi, które nie mają białek należących do rodziny HMW1/HMW2. Hia, białko NTHi 115 kDa (Barenkamp SJ., St Gerne S.W. 1996. Mol. Microbiol., w druku) jest wysoce podobne do adhezyny Hsf wyrażanej przez szczepy H. influenzae typu b (St. Geme JW. i in. 1996. J. Bact. 178:6281). Inne białko, Hap, wykazuje podobieństwo do proteaz serynowych IgA1 i wykazano, że jest zaangażowane w adhezję i wnikanie do komórki (St. Geme JW. i in. 1994. Mol. Microbiol. 14:217).
Zidentyfikowano i ponumerowano pięć głównych białek błony zewnętrznej (OMP). Pierwotne badania przy użyciu szczepów H. influenzae typu b wykazały, że przeciwciała specyficzne dla P1 i P2 OMP chroniły nowonarodzone szczury przed późniejszą prowokacją (Loeb MR. i in. 1987. Infect. Immun. 55:2612; Musson RS. Jr. i in. 1983. J. Clin. Invest. 72:677). Stwierdzono, że P2 może indukować przeciwciała bakteriobójcze i opsonizujące, które są skierowane przeciwko zmiennym regionom obecnym w eksponowanych na powierzchni strukturach pętli tego integralnego OMP (Haase EM. i in. 1994 Infect. Immun. 62:3712; Troelstra A. i in. 1994 Infect. Immun. 62:779). Lipoproteina P4 także może indukować przeciwciała bakteriobójcze (Green BA. i in. 1991. Infect. Immun. 59:3191).
OMP P6 to konserwatywna lipoproteina związana z peptydoglikanem stanowiąca 1-5% błony zewnętrznej (Nelson MB. i in. 1991. Infect. Immun. 59:2658). Później rozpoznano lipoproteinę o w przybliżeniu tej samej masie cząsteczkowej nazywaną PCP (P6 cross-reactive protein, białko reaktywne krzyżowo z P6) (Deich RM. i in. 1990. Infect. Immun. 58:3388). Mieszanina konserwatywnych lipoprotein P4, P6 i PCP nie zapewniała ochrony, jak wykazano na modelu zapalenia ucha środkowego szynszyli (Green BA. i in. 1993. Infect. Immun. 61:1950). Sama P6 wydaje się indukować ochronę w modelu szynszyli (Demaria TF. i in. 1996. Infect. Immun. 64:5187).
Opisano także białko fibrynę (Miyamoto N., Bakaletz, LO. 1996. Microb. Pathog. 21:343) mające homologię z OMP P5, która sama ma homologię sekwencji z integralnym OmpA Escherichia coli (Miyamoto N., Bakaletz, LO. 1996. Microb. Pathog. 21:343; Munson RS. Jr. i in. 1993. Infect. Immun. 61:1017). Wydaje się, że NTHi przywiera do śluzu przy pomocy fimbrii.
Zgodnie z obserwacjami poczynionymi dla gonokoków i meningokoków, NTHi wyraża dwuskładnikowy receptor transferyny ludzkiej złożony z TbpA i TbpB, gdy rośnie w warunkach ograniczenia żelaza. Przeciwciało anty-TbpB chroniło nowonarodzone szczury (Loosmore SM. i in. 1996. Mol. Microbiol. 19:575). Dla NTHi opisano także receptor hemoglobiny/haptoglobiny (Maciver I. i in. 1996. Infect. Immun. 64:3703). Zidentyfikowano także receptor dla Haem:hemopeksyny (Cope LD. i in. 1994. Mol. Microbiol. 13:868). Wśród NHTi obecny jest także receptor laktoferryny, ale dotąd nie został scharakteryzowany (Schryvers AB. i in. 1989. J. Med. Microbiol. 29:121). Wśród NHTi nie opisano dotąd białka podobnego do dwoinkowego białka FrpB.
OMP 80 kDa, antygen powierzchniowy D15, nadaje ochronę przeciwko NTHi w modelu prowokacji myszy. (Flack FS. i in. 1995. Gene 156:97). Lipoproteina błony zewnętrznej 42 kDa, LPD jest konserwatywna wśród Haemophilus influenzae i indukuje przeciwciała bakteriobójcze (Akkoyunlu M. i in. 1996. Infect. Immun. 64:4586). Stwierdzono, że podrzędne OMP 98 kDa (Kimura A. i in. 1985. Infect. Immun. 47:253) jest antygenem ochronnym, przy czym to OMP może być jednym z OMP indukowanych przez ograniczenie Fe lub jedną z adhezyn o wysokiej masie cząsteczkowej, które scharakteryzowano dalej. H. influenzae wytwarza aktywność proteazy IgA1 (Mulks MH., Shoberg RJ. 1994. Meth. Enzymol. 235:543). Proteazy IgA1 z NTHi mają wysoki stopień zmienności antygenowej (Lomholt H., van Alphen L., Kilian, M. 1993. Infect. Immun. 61:4575).
Wykazano, że inne OMP z NTHi, OMP26, białko 26 kDa, wzmaga usuwanie z płuc w modelu szczura (Kyd, J.M., Cripps, A.W. 1998. Infect. Immun. 66:2272). Wykazano także, że białko HtrA NTHi stanowi antygen ochronny. W istocie, to białko chroniło Chinchilla przed zapaleniem ucha środkowego i chroniło nowonarodzone szczury przeciwko bakteriemii H. influenzae typu b (Loosmore S.M. i in. 1998. Infect. Immun. 66:899).
Pęcherzyki błony zewnętrznej zostały wydzielone z H. influenzae (Loeb M.R., Zachary A.L., Smith D.H. 1981. J. Bacteriol. 145:569-604; Stuli T.L., Mack K., Haas J.E., Smit J., Smith A.L. 1985. Anal. Biochem. 150: 471-480). Pęcherzyki skojarzono z indukcją przepuszczalności bariery krew-mózg (Wiwpelwey B., Hansen E.J., Scheid W.M. 1989 Infect. Immun. 57: 2559-2560), indukcja zapalenia opon (Mustafa M.M., Ramilo O., Syrogiannopoulos G.A., Olsen K.D., McCraken G.H. Jr.,
PL 211 037 B1
Hansen, E.J. 1989. J. Infect. Dis. 159: 917-922) i wychwytem DNA (Concino M.F., Goodgal S.H. 1982 J. Bacteriol. 152: 441-450). Te pęcherzyki są zdolne do wiązania się i absorbowania przez nabłonek śluzówki nosa (Harada T., Shimuzu T., Nishimoto K., Sakakura Y. 1989. Acta Otorhinolarygol. 246: 218-221), co pokazuje, że w pęcherzykach obecne mogą być adhezyny i /lub czynniki kolonizacji. Odpowiedź immunologiczna na białka obecne w pęcherzykach błony zewnętrznej zaobserwowano u pacjentów mających rozmaite choroby związane z H. influenzae (Sakakura Y., Harada T., Hamaguchi Y., Jin CS. 1988. Acta Otorhinolarygol. Suppl. (Stockh.) 454: 222-226; Harada T., Sakakura Y., Miyoshi Y. 1986. Rhinology 24: 61-66).
Pseudomonas aeruginosa:
Rodzaj Pseudomonas składa się z Gram-ujemnych, obdarzonych biegunową wicią pałeczek, prostych oraz nieco zakrzywionych, które rosną aerobowo i nie tworzą przetrwalników. Ze względu na ich ograniczone wymagania metaboliczne, gatunki Pseudomonas są wszechobecne i są szeroko rozpowszechnione w glebie, powietrzu, ściekach i w roślinach. Wykazano także, że liczne gatunki Pseudomonas takie jak P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia i P. cepacia są patogenne dla ludzi. Spośród tej listy, P. aeruginosa uważa się za ważny patogen ludzki, gdyż jest związany z infekcją oportunistyczną gospodarza o pogorszonej odporności i jest odpowiedzialny za wysoką chorobowość u pacjentów hospitalizowanych. Zakażenie szpitalne P. aeruginosa dotyka przede wszystkim pacjentów poddanych długotrwałemu leczeniu i otrzymujących środki tłumiące odporność, kortykosteroidy, antymetabolity, antybiotyki lub naświetlanie.
Pseudomonas, a zwłaszcza P. aeruginosa, wytwarza rozmaite toksyny (takie jak hemolizyny, fibrynolizyny, esterazy, koagulazy, fosfolipazy, endo- i egzotoksyny), które przyczyniają się do patogenności tych bakterii. Ponadto, te organizmy mają wysoką swoistą oporność na antybiotyki wskutek obecności pomp usuwających wiele leków. Ta ostatnia cecha często komplikuje rezultat leczenia choroby.
Wskutek niekontrolowanego stosowania chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych częstość zakażenia szpitalnego powodowanego przez P. aeruginosa znacznie wzrosła w ciągu ostatnich 30 lat. Na przykład w USA obciążenie ekonomiczne wskutek zakażeń szpitalnych P. aeruginosa szacuje się na 4,5 miliarda dolarów USA rocznie. Zatem aktywnie potrzebne jest opracowanie szczepionki do czynnej lub biernej immunizacji przeciwko P. aeruginosa (przegląd - patrz Stanislavsky i in. 1997. FEMS Microbiol. Lett. 21: 243-277).
Rozmaite związane z komórką i wydzielane antygeny P. aeruginosa były przedmiotem opracowywanych szczepionek. Stwierdzono, że wśród antygenów Pseudomonas, śluzowata substancja, która stanowi pozakomórkowy szlam złożony głównie z alginianu, jest heterogenna w kategoriach wielkości i immunogenności. Wydaje się, że składniki alginianowe o wysokiej masie cząsteczkowej (30-300 kDa) zawierają epitopy konserwatywne, zaś składniki alginianowe o niskiej masie cząsteczkowej (10-30 kDa) oprócz epitopów unikalnych posiadają epitopy konserwatywne. Wykazano, że wśród białek związanych z powierzchnią, PcrV, które jest częścią aparatu wydzielania-translokacji typu III, jest interesującym celem dla szczepienia (Sawa i in. 1999. Nature Medicine 5:392-398).
Antygeny eksponowane na powierzchni, w tym O-antygeny (polisacharyd O-specyficzny LPS) lub H-antygeny (antygeny witki) stosowano do serotypowania dzięki ich wysoce immunogennej naturze. Struktury chemiczne powtarzających się jednostek O-specyficznych polisacharydów zostały wyjaśnione i te dane umożliwiły identyfikację 31 chemotypów P. aeruginosa. Epitopy konserwatywne wśród wszystkich serotypów P. aeruginosa są zlokalizowane w oligosacharydzie rdzenia i regionie lipidu A LPS, a immunogeny zawierające te epitopy indukują u myszy krzyżową odporność ochronną przeciwko różnym immunotypom P. aeruginosa. Wynikało z tego, że zewnętrzny rdzeń LPS jest ligandem do wiązania P. aeruginosa do komórek nabłonkowych dróg oddechowych i oczu. Jednak, w tym zewnętrznym regionie rdzenia istnieje heterogeniczność wśród różnych serotypów. Epitopy w rdzeniu wewnętrznym są wysoce konserwatywne, i wykazano, że są dostępne na powierzchni, i nie zamaskowane przez polisacharyd O-specyficzny.
W celu sprawdzenia właściwości ochronnych białek OM, szczepionkę zawierającą białka OM z P. aeruginosa z o masach cząsteczkowych w zakresie od 20 do 100 kDa zastosowano w próbach przedklinicznych i klinicznych. Ta szczepionka była skuteczna w modelach zwierzęcych przeciwko prowokacji P. aeruginosa i indukowała wysokie poziomy specyficznych przeciwciał u ochotników. Osocze od ochotników zawierające przeciwciała przeciw P. aeruginosa zapewniło ochronę bierną i pomogło w wyzdrowieniu 87% pacjentów mających ciężkie postaci infekcji P. aeruginosa. Niedawno wykazano, że białko hybrydowe zawierające części białek błony zewnętrznej OprF (aminokwasy
PL 211 037 B1
190-342) i OprI (aminokwasy 21-83) z Pseudomonas aeruginosa połączone z S-transferazą glutationową chroni myszy przeciwko 975-krotności 50% dawki letalnej P. aeruginosa (Knapp i in. 1999. Vaccine. 17:1663-1669).
Niniejsi twórcy zdawali sobie sprawę z szeregu wad związanych z powyższymi szczepionkami pęcherzykowymi typu dzikiego (albo występującymi w przyrodzie albo wytworzonymi chemicznie).
Przykłady takich problemów są następujące:
- obecność immunodominujących, lecz zmiennych białek na pęcherzyku (PorA; TbpB, Opa [N. meningitidis B]; P2, P5 [atypowe H. influenzae]) - przy czym takie pęcherzyki są skuteczne tylko przeciwko ograniczonemu wyborowi gatunków bakterii. Swoistość odpowiedzi przeciwciała bakteriobójczego względem typu może wykluczyć stosowanie takich szczepionek u małych dzieci.
- obecność niechroniących (nieistotnych) antygenów (Rmp, H8, ...) na pęcherzyku - antygenów, które są dla układu odpornościowego atrapami
- brak obecności ważnych cząsteczek, które są wytwarzane warunkowo (na przykład białka błony zewnętrznej regulowane przez żelazo, IROMP, mechanizmy ekspresji regulowane in vivo) - takie warunki trudno regulować przy wytwarzaniu pęcherzyków w celu zoptymalizowania ilości antygenu na powierzchni
- niski poziom ekspresji antygenów ochronnych, (szczególnie konserwatywnych) (NspA, P6)
- toksyczność LPS pozostałego na powierzchni pęcherzyka
- potencjalna indukcja odpowiedzi autoimmunologicznej ze względu na struktury identyczne z gospodarzem (na przykład polisacharyd otoczkowy w grupie surowiczej B Neisseria meningitidis, lakto-N-neotetraoza w LPS Neisseria, struktura sacharydowa w LPS ntHi, struktury sacharydowe w rzęskach).
Takie problemy mogą uniemożliwić zastosowanie szczepionek pęcherzykowych jako odczynników szczepiących u ludzi. Jest tak szczególnie w przypadku zastosowań pediatrycznych (<4 lata), gdzie zdolność wywoływania odczynu przeciwko szczepionkom pęcherzykowym jest szczególnie ważna, i gdzie wykazano, że szczepionki pęcherzykowe (na przykład wspomniana poprzednio sprzedawana szczepionka pęcherzykowa MenB) są nieskuteczne przy ochronie immunologicznej. Odpowiednio, przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby łagodzenia powyższych problemów przy użyciu zmodyfikowanych genetycznie szczepów bakteryjnych, co daje ulepszone szczepionki pęcherzykowe. Takie sposoby będą przydatne zwłaszcza przy wytwarzaniu nowych szczepionek przeciwko patogenom bakteryjnym takim jak Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, i innym.
Szczepionki pęcherzykowe według wynalazku są skonstruowane tak, aby skupić odpowiedź immunologiczną na kilku ochronnych antygenach lub epitopach (korzystnie konserwatywnych) - zestawionych w postaci szczepionki wieloskładnikowej. Kiedy takie antygeny stanowią integralne OMP, to pęcherzyki błony zewnętrznej szczepionek pęcherzykowych zapewniają ich właściwe fałdowanie. Przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby optymalizowania składu OMP i LPS szczepionek OMV (pęcherzykowych) przez usuwanie immunodominujących zmiennych OMP, jak również nieochronnych OMP, przez tworzenie konserwatywnych OMP metodą delecji regionów zmiennych, przez regulację w górę ekspresji ochronnych OMP, i przez eliminowanie mechanizmów kontrolnych (takich jak ograniczenie przez żelazo) ekspresji ochronnych OMP. Ponadto przedmiotem wynalazku jest zmniejszenie toksyczności lipidu A przez modyfikację porcji lipidowej lub przez zmianę składu fosforylowego przy zachowaniu aktywności adiuwanta lub zamaskowaniu jej. Każdy z tych sposobów ulepszania osobno ulepsza szczepionkę pęcherzykową, jednak kombinacja jednego lub więcej z tych sposobów prowadzi do wytworzenia zoptymalizowanej zmodyfikowanej genetycznie szczepionki pęcherzykowej, która jest immunoochronna i nietoksyczna - szczególnie przydatna do zastosowań pediatrycznych.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków z Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego, cechujący się tym, że ów preparat można otrzymać wykorzystując jeden lub więcej sposobów wybranych z następującej grupy:
a) sposób redukowania immunodominujących zmiennych lub nie-ochronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy określania tożsamości takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wytwarzania mniej lub wcale wspomnianego antygenu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
PL 211 037 B1
b) sposób regulacji w górę ekspresji ochronnych, endogennych (i korzystnie konserwatywnych) antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia sekwencji silniejszego promotora przed genem kodującym wspomniany antygen, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
c) sposób regulacji w górę ekspresji wyrażanych warunkowo, ochronnych (i korzystnie konserwatywnych) antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla usunięcia represywnych mechanizmów kontrolnych jego ekspresji (takie jak ograniczenie przez żelazo), i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
d) sposób modyfikowania porcji A lipidu bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w wytwarzaniu porcji A lipidu toksycznego LPS, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla zredukowania lub wyłączenia ekspresji wspomnianego genu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
e) sposób modyfikowania porcji A lipidu bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w wytwarzaniu porcji A lipidu mniej toksycznego LPS, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia sekwencji silniejszego promotora przed wspomnianym genem, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
f) sposób zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmujący etapy modyfikowania chromosomu szczepu bakteryjnego dla zawarcia genu kodującego peptyd polimyksynę A, lub jego pochodną lub analog, połączonego z antygenem ochronnym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
g) sposób wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pęcherzyków obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla usunięcia zmiennych regionów genu kodującego wspomniany antygen, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
h) sposób zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi (takiego jak polisacharyd otoczki N. meningitidis B), obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla zredukowania lub wyłączenia ekspresji wspomnianego genu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu; lub
i) sposób regulacji w górę ekspresji ochronnych, endogennych (i korzystnie konserwatywnych) antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia do chromosomu jednej lub więcej dalszych kopii genu kodującego wspomniany antygen kontrolowanych przez heterologiczną silniejszą sekwencje promotorową, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu.
Dalsze aspekty wynalazku obejmują preferencyjne sposoby otrzymywania powyższego preparatu pęcherzyków, w tym optymalne ulokowanie silnych promotorów do regulacji w górę ekspresji antygenów w pęcherzykach, preferencyjne antygeny do regulacji w górę i regulacji w dół dla różnych szczepów bakteryjnych w celu wytwarzania preparatów pęcherzyków szczególnie przydatnych do zastosowania do szczepienia. Podano także preferencyjne preparaty zawierające pęcherzyki według wynalazku, które są szczególnie przydatne do globalnych szczepionek przeciwko pewnym stanom chorobowym. Jeszcze dalsze aspekty wynalazku stanowią wektory do wytwarzania pęcherzyków według wynalazku, i zmodyfikowane szczepy bakteryjne, z których wytwarza się pęcherzyki według wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest po raz pierwszy szczepionka pęcherzykowa, która jest immunoochronna i nietoksyczna, gdy jest stosowana u dzieci w wieku poniżej 4 lat.
Zwięzły opis rysunków
Figura 1: Reaktywność przeciwciała monoklonalnego 735 mAb na różnych koloniach.
Figura 2: Reaktywności specyficznych przeciwciał monoklonalnych zmierzone metodą ELISA dla całych komórek.
Figura 3: Schematyczne przedstawienie wektorów pCMK stosowanych do dostarczania genów, operonów i/lub kaset ekspresyjnych w genomie Neisseria meningitidis.
PL 211 037 B1
Figura 4: Analiza ekspresji PorA w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnego szczepu N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka całkowite uzyskano ze szczepów rekombinacyjnych cps- (ścieżki 3 i 4), cps-porA::pCMK+ (ścieżki 2 i 5) i cps- porA::nspA (ścieżki 1 i 6) N. meningitidis grupy surowiczej B i analizowano w warunkach SDS-PAGE w 12% żelu poliakryloamidowym. Żele zabarwiono błękitem Coomassie (ścieżki 1 do 3) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie, stosując przeciwciało monoklonalne anty-PorA.
Figura 5: Analiza ekspresji NspA w ekstraktach białka rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka ekstrahowano z całych bakterii (ścieżki 1 do 3) lub z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej (ścieżki 4 do 6) oddzielonych metodą SDS-PAGE w 12% żelu akryloamidowym i analizowano metodą immunoblottingu, stosując surowice poliklonalną anty-NspA. Analizowano próbki odpowiadające cps- (ścieżki 1 i 6), cps- pora::pCMK+ (ścieżki 3 i 4) i cps- porA::nspA (ścieżki 2 i 5). Wykryto dwie postacie NspA: postać dojrzałą (18 kDa) migrującą wspólnie z rekombinacyjnym oczyszczonym NspA, i postać krótszą (15 kDa).
Figura 6: Analiza ekspresji D15/omp85 w ekstraktach białka rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka ekstrahowano z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej i oddzielono metoda SDS-PAGE w 12% żelu akryloamidowym i analizowano metodą immunoblottingu stosując surowicę poliklonalną anty-omp85. Analizowano próbki odpowiadające rekombinacyjnym szczepom cps- (ścieżka 2), i cps-, PorA+, pCMK+Omp85/D15 (ścieżka 1) N. meningitidis grupy surowiczej B.
Figura 7: Ogólna strategia modulowania ekspresji genu przez wprowadzanie promotora (RS oznacza miejsce restrykcyjne).
Figura 8: Analiza pęcherzyków błony zewnętrznej wytwarzanych przez rekombinacyjne szczepy cps- N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka ekstrahowano z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej i oddzielono metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących na gradiencie 4-20% żelu poliakryloamidowego. Żel barwiono błękitem brylantowym Coomassie R250.
Ścieżki 2, 4, 6 odpowiadały 5 μg białek całkowitych, zaś na ścieżki 3, 5 i 7 wprowadzono 10 μg białek.
Figura 9: Konstrukcja plazmidu zastępującego promotor stosowanego do regulacji w górę ekspresji/wytwarzania Omp85/D15 u H44/76 Neisseria meningitidis.
Figura 10: Analiza ekspresji OMP85 w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych szczepów NmB (pochodne H44/76). Żele zabarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie przy użyciu króliczego przeciwciała monoklonalnego anty-OMP85 (N.gono) (B).
Figura 11: Analiza ekspresji OMP85 w preparatach OMV z rekombinacyjnych szczepów NmB (pochodne H44/76). Żele zabarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-OMP85 (B).
Figura 12: Schematyczne przedstawienie rekombinacyjnej strategii PCR stosowanej do usunięcia lacO w chimerycznym promotorze porA/lacO.
Figura 13: Analiza ekspresji Hsf w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka całkowite uzyskano z Cps-PorA+ (ścieżki 1), i Cps-PorA+/Hsf (ścieżki 2) rekombinacyjnej N. meningitidis szczepów grupy surowiczej B i analizowano w warunkach SDS-PAGE w 12% żelu poliakryloamidowym. Żele zabarwiono błękitem Coomassie.
Figura 14: Analiza ekspresji GFP w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis (pochodna H44/76). Białka całkowite uzyskano ze szczepów rekombinacyjnych Cps-, PorA+ (ścieżka 1), Cps-, PorA-GFP+ (ścieżka 2 i 3). Białka rozdzielono metodą PAGE-SDS w 12% żelu poliakryloamidowym, a następnie zabarwiono błękitem Coomassie.
Figura 15: Ilustracja wzoru głównych białek na powierzchni rozmaitych preparatów rekombinacyjnych pęcherzyków według analizy metoda. SDS-PAGE (barwienie Coomassie).
Figura 16: Specyficzna odpowiedź anty-Hsf na rozmaite preparaty pęcherzyków i pęcherzyków rekombinacyjnych przy użyciu oczyszczonego rekombinacyjnego białka Hsf.
Figura 17: Analiza ekspresji NspA w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych NmB (pochodne grupy surowiczej B). Żele zabarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-PorA (B) lub mysiego przeciwciała poliklonalnego anty-NspA (C).
PL 211 037 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ogólny zestaw narzędzi i sposobów nadających się do stosowania do wytwarzania ulepszonych, genetycznie zmodyfikowanych pęcherzyków ze szczepów bakteryjnych Gram-ujemnych. Wynalazek obejmuje sposoby stosowane, żeby uzyskiwać pęcherzyki rekombinacyjne bardziej immunogenne, mniej toksyczne i bezpieczniejsze dla ich stosowania w szczepionce dla ludzi i/lub zwierząt. Ponadto, obecny wynalazek opisuje także specyficzne procesy niezbędne do konstruowania, wytwarzania, otrzymywania i stosowania rekombinacyjnych, zmodyfikowanych pęcherzyków z rozmaitych bakterii Gram-ujemnych do celów szczepienia, oraz celów terapeutycznych i/lub diagnostycznych. Stosując sposoby według wynalazku, można manipulować składem biochemicznym pęcherzyków bakteryjnych przez działanie na/zmienianie ekspresji genów bakteryjnych kodujących produkty obecne w lub związane z bakteryjnymi pęcherzykami błony zewnętrznej (białka błony zewnętrznej czyli OMP). W zakresie niniejszego wynalazku leży także wytwarzanie pęcherzyków przy użyciu sposobu modyfikacji genetycznej w celu zwiększania, zmniejszania lub uzyskiwania warunkowej ekspresji jednego lub więcej genów kodujących składniki błony zewnętrznej.
Dla przejrzystości, określenie „kaseta ekspresyjna będzie odnosić się niniejszym do wszystkich elementów genetycznych niezbędnych do wyrażania genu lub operonu oraz do wytwarzania i kierowania odpowiedniego białka(ek), będącego przedmiotem zainteresowania, do pęcherzyków błony zewnętrznej, pochodzących od danego gospodarza bakteryjnego. Niewyczerpująca lista tych cech obejmuje elementy kontrolne (transkrypcyjne i/lub translacyjne), regiony kodujące białko i sygnały kierujące, z właściwymi odstępami między nimi. Odniesienie do insercji sekwencji promotorowych oznacza, dla celów niniejszego wynalazku, insercję sekwencji mającej co najmniej funkcję promotorową, i korzystnie jeden lub więcej innych genetycznych elementów regulatorowych zawartych w kasecie ekspresyjnej. Ponadto, określenie „kaseta integracyjna będzie odnosić się niniejszym do wszystkich elementów genetycznych wymaganych do integracji segmentu DNA w danym gospodarzu bakteryjnym. Nie wyczerpująca lista tych cech obejmuje nośnik wprowadzający (lub wektor), z regionami rekombinogennymi, oraz znacznikami wybieralnymi i przeciwwybieralnymi.
Ponownie dla przejrzystości, określenie modyfikowanie szczepu bakteryjnego w celu wytwarzania mniej wspomnianego antygenu odnosi się do dowolnego środka służącego do zmniejszania ekspresji antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, w odniesieniu do ekspresji antygenu z niezmodyfikowanego (tj., występującego w naturze) pęcherzyka, tak że ekspresja jest niższa o co najmniej 10% niż dla pęcherzyka niezmodyfikowanego. Korzystnie jest ona niższa o co najmniej 50%. „Silniejsza sekwencja promotorowa odnosi się do regulatorowego elementu kontrolnego, który zwiększa transkrypcję dla genu kodującego antygen, będący przedmiotem zainteresowania. „Regulacja w górę ekspresji odnosi się do dowolnego środka służącego do zwiększania ekspresji antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, w odniesieniu do ekspresji antygenu z niezmodyfikowanego (tj., występującego w naturze) pęcherzyka. Należy rozumieć, że stopień 'regulacji w górę' będzie zmieniać się zależnie od poszczególnego antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, ale nie przekroczy ilości, która przerwie całość błony pęcherzyka. Regulacja w górę antygenu odnosi się do ekspresji, która jest wyższa o co najmniej 10% niż ekspresja dla pęcherzyka niezmodyfikowanego. Korzystnie jest ona wyższa o co najmniej 50%. Korzystniej jest ona wyższa o co najmniej 100% (dwukrotnie).
Aspekty wynalazku odnoszą się do osobnych sposobów wytwarzania ulepszonych zmodyfikowanych pęcherzyków, do kombinacji takich sposobów, i do kompozycji pęcherzyków wytworzonych w wyniku tych sposobów. W innym aspekcie przedmiotem wynalazku są narzędzia genetyczne stosowane w celu genetycznego zmodyfikowania wybranego szczepu bakteryjnego w celu ekstrahowania ze wspomnianego szczepu ulepszonych zmodyfikowanych pęcherzyków.
Etapy modyfikowania w sposobach według wynalazku można prowadzić rozmaitymi sposobami znanymi specjaliście. Na przykład, techniką insercji transpozonu można wstawić sekwencje (np. promotory lub otwarte ramki odczytu), a promotory/geny można przerwać. Na przykład, dla regulacji w górę ekspresji genu, silny promotor można wstawić przez transpozon do 2 kb przed kodonem inicjacji genu (korzystniej 200-600 bp {par zasad, ang. base pairs} przed kodonem, najkorzystniej w przybliżeniu 400 bp przed kodonem). Można także zastosować mutację lub delecję punktową (szczególnie do regulacji w dół ekspresji genu).
Takie sposoby mogą jednak być dość nietrwałe lub niepewne, a zatem korzystne jest, żeby etap modyfikowania [szczególnie dla sposobów a), b), c), d), e), h) i i) jak opisano poniżej] prowadzić przez rekombinację homologiczną. Korzystnie, rekombinacja ma miejsce między sekwencją (regionem
PL 211 037 B1 rekombinogennym) o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym, i sekwencją (drugim regionem rekombinogennym) o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym w obrębie szczepu. Korzystnie regiony mają 40-1000 nukleotydów, korzystniej 100-800 nukleotydów, najkorzystniej 500 nukleotydów). Te regiony rekombinogenne powinny być dostatecznie podobne, żeby były one zdolne do hybrydyzowania z innymi w warunkach wysoce ostrych (jak określono później).
Rekombinacje mogą zachodzić przy użyciu pojedynczego regionu rekombinogennego na chromosomie i wektora, lub na drodze podwójnego crossing-over (dla 2 regionów na chromosomie i wektora). W celu przeprowadzenia pojedynczej rekombinacji, wektor powinien być kołową cząsteczką DNA. W celu przeprowadzenia podwójnej rekombinacji, wektor może być kołową lub liniową cząsteczką DNA (patrz Figura 7). Korzystne jest wykorzystywanie podwójnej rekombinacji i stosowanie wektora liniowego, gdyż tak wytworzona zmodyfikowana bakteria będzie bardziej trwała w kategoriach procesów odwrotnych. Korzystnie dwa regiony rekombinogenne na chromosomie (i na wektorze) mają podobną (najkorzystniej taką samą) długość, żeby ułatwiać podwójne crossing-over. Podwójne crossing-over działa tak, że dwa regiony rekombinogenne na chromosomie (oddzielone przez sekwencję nukleotydową 'X') i dwa regiony rekombinogenne na wektorze (oddzielone przez sekwencję nukleotydową 'Y') rekombinują pozostawiając niezmieniony chromosom, z tym wyjątkiem, że X i Y zostały zamienione. Położenie regionów rekombinogennych może znajdować się zarówno przed jak i za, albo może oskrzydlać, otwarta, ramkę odczytu, będącą przedmiotem zainteresowania. Te regiony mogą składać się z sekwencji kodującej, niekodującej, lub mieszaniny sekwencji kodującej i niekodującej. Tożsamość of X i Y będzie zależeć od pożądanego skutku. X może stanowić całość lub część otwartej ramki odczytu, zaś Y wcale nie mieć nukleotydów, co może spowodować usunięcie sekwencji X z chromosomu. Alternatywnie Y może stanowić region silnego promotora dla insercji przed otwartą ramką, odczytu, a zatem X może wcale nie mieć nukleotydów.
Przydatne wektory będą mieć zmieniający się skład, zależnie od tego, jaki typ rekombinacji ma być przeprowadzony, i jaki jest ostateczny cel rekombinacji. Wektorami integracyjnymi stosowanymi do wprowadzenia regionu Y mogą być plazmidy warunkowo replikatywne lub samobójcze, bakteriofagi, transpozony lub liniowe fragmenty DNA otrzymane metodą hydrolizy restrykcyjnej lub amplifikacji PCR. Rekombinację wybiera się przy użyciu wybieralnego markera genetycznego takiego jak geny nadające oporność na antybiotyki (na przykład kanamycynę, erytromycynę, chloramfenikol, lub gentamycynę), geny nadające oporność na metale ciężkie i/lub związki toksyczne albo geny uzupełniające mutacje auksotrofowe (na przykład pur, leu, met, aro).
Sposób a) i f) - Regulacja w dół/usuwanie zmiennych i nieochronnych antygenów immunodominujących
Wśród szczepów bakteryjnych wiele antygenów powierzchniowych zmienia się i wskutek tego chronią one tylko przed ograniczonym zbiorem blisko spokrewnionych szczepów. Aspekt niniejszego wynalazku obejmuje zmniejszenie ekspresji, lub, korzystnie, delecję genu(ów) kodującego zmienne białko(a) powierzchniowe, które daje szczep bakteryjny wytwarzający pęcherzyki, które, gdy są podawane w szczepionce, mają silniejszy potencjał reaktywności krzyżowej przeciwko rozmaitym szczepom dzięki wyższemu wpływowi wywieranemu przez zachowane białka (zatrzymane na błonach zewnętrznych) na układ immunologiczny szczepionego. Przykłady takich antygenów zmiennych obejmują: dla Neisseria - PilC rzęski bakteryjnej, który ulega zmienności antygenowej, PorA, Opa, TbpB, FrpB; dla H. influenzae - P2, P5, pilina, proteaza IgA1; i dla Moraxella - CopB, OMP106.
Inne typy genów, które można regulować w dół lub wyłączyć, to geny, które in vivo mogą zostać łatwo włączone (wyrażone) lub wyłączone przez bakterie. Skoro białka błony zewnętrznej kodowane przez takie geny nie są zawsze obecne na bakterii, to obecność takich białek w preparatach pęcherzyków może także być szkodliwa dla skuteczności szczepionki z przyczyn podanych wyżej. Korzystny przykład dla regulacji w dół lub usunięcia stanowi białko Opc z Neisseria. Odporność przeciw Opc indukowana przez szczepionkę pęcherzykową zawierającą Opc mogłaby mieć tylko ograniczoną zdolność ochronną, jako że organizm zakażający mógłby łatwo stać się Opc-. HgpA i HgpB z H. influenzae stanowią inne przykłady takich białek.
W sposobie a), ekspresja tych zmiennych lub nieochronnych genów jest regulowana w dół lub ostatecznie wyłączana. Daje to wspomniana wyżej nieoczekiwaną korzyść ze skupiania układu odpornościowego na lepszych antygenach, które są obecne w niskich ilościach na powierzchni zewnętrznej pęcherzyków.
PL 211 037 B1
Szczep można zmodyfikować w ten sposób stosując szereg strategii obejmujących insercję transpozonu dla przerwania regionu kodującego lub regionu promotora genu, lub mutacje lub delecje punktowe dla osiągnięcia podobnego wyniku. Rekombinację homologiczną można także zastosować do usunięcia genu z chromosomu (gdzie sekwencja X zawiera część (korzystnie całość) sekwencji kodującej genu, będącego przedmiotem zainteresowania). Można ją dodatkowo zastosować do zmiany jego silnego promotora na słabszy (albo żaden) promotor (gdzie sekwencja nukleotydowa X obejmuje część (korzystnie całość) regionu promotorowego genu, i sekwencja nukleotydowa Y zawiera albo region słabszego promotora [powodujący zmniejszoną ekspresję genu (ów)/operonu (ów), będącego przedmiotem zainteresowania], albo nie zawiera regionu promotora). W tym przypadku korzystne jest, żeby rekombinacja wystąpiła w regionie chromosomu 1000 bp przed genem, będącym przedmiotem zainteresowania.
Alternatywnie, Y może nadawać warunkową aktywność transkrypcyjną, powodującą warunkową ekspresję genu (ów)/ operonu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania (regulacja w dół). Jest to przydatne w ekspresji cząsteczek, które są toksyczne lub źle znoszone przez gospodarza bakteryjnego.
Większość z białek przedstawionych wyżej stanowią integralne OMP i ich zmienność może być ograniczona tylko do jednej lub paru z ich pętli eksponowanych na powierzchni. Inny aspekt niniejszego wynalazku [sposób g)] obejmuje delecję regionów DNA kodujących te pętle eksponowane na powierzchni, co prowadzi do ekspresji integralnego OMP zawierającego pętle zachowawcze eksponowane na powierzchni. Pętle eksponowane na powierzchni H. influenzae P2 i P5 stanowią korzystne przykłady białek, które można transformować w antygeny reaktywne krzyżowo, stosując taki sposób. Ponownie, rekombinacja homologiczna stanowi korzystny sposób wykonania tego procesu modyfikowania.
Sposób b) - Wprowadzanie i modulacja promotorów:
W dalszym aspekcie przedmiotem wynalazku jest modyfikowanie składu pęcherzyków metodą zmieniania in situ regionu regulatorowego kontrolującego ekspresję genu(ów) i/lub operonu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania. Ta zmiana może obejmować częściowe lub całkowite zastąpienie promotora endogennego kontrolującego ekspresję genu, będącego przedmiotem wynalazku, przez gen nadający odmienną aktywność transkrypcyjną. Ta odmienna aktywność transkrypcyjna może być nadawana przez warianty (mutacje punktowe, delecje i/lub insercje) endogennych regionów kontrolnych, przez występujące w naturze lub zmodyfikowane promotory heterologiczne lub przez kombinacje obu z nich. Takie zmiany korzystnie nadadzą aktywność transkrypcyjną silniejszą niż aktywność endogenna (wprowadzenie silnego promotora), powodując zwiększoną ekspresję genu (ów)/operonu(ów), będących przedmiotem zainteresowania (regulacje w górę). Taki sposób jest szczególnie przydatny dla wzmagania wytwarzania immunologicznie odpowiednich składników pęcherzyków takich jak białka i lipoproteiny błony zewnętrznej (korzystnie konserwatywnych OMP, zazwyczaj obecnych w pęcherzykach w niskich stężeniach).
Typowe silne promotory, które można wbudować do Neisseria to porA [SEKW. ID. NR: 24], porB [SEKW. ID. NR: 26], lgtF, Opa, pl10, 1st, i hpuAB. PorA i PorB są korzystne jako konstytutywne, silne promotory. Ustalono (Przykład 9), że aktywność promotora PorB jest zawarta we fragmencie odpowiadającym nukleotydom -1 do -250 przed kodonem inicjacji genu porB. W Moraxella korzystne jest stosowanie promotorów ompH, ompG, ompE, OmpB1, ompB2, ompA, OMPCD i Omp106, zaś w H. influenzae korzystne jest wbudowanie promotorów P2, P4, P1, P5 i P6.
Stosując korzystną technologię rekombinacji homologicznej z podwójnym crossing-over do wprowadzenia promotora w regionie 1000 bp przed genem, promotory można umieszczać gdziekolwiek od 30-970 bp przed kodonem inicjacji genu, którego ekspresja ma być regulowana w górę. Chociaż zwyczajowo sądzi się, że dla uzyskania optymalnej ekspresji genu region promotora powinien być względnie blisko otwartej ramki odczytu, twórcy niespodziewanie stwierdzili, że umieszczenie promotora dalej od kodonu inicjacji powoduje duże wzrosty poziomów ekspresji. Tak więc korzystne jest, jeżeli promotor wstawia się 200-600 bp od kodonu inicjacji genu, korzystniej 300-500 bp, a najkorzystniej w przybliżeniu 400 bp od ATG inicjacji.
Sposób c) - Składniki pęcherzyków wytwarzane warunkowo
Ekspresja niektórych genów kodujących pewne składniki pęcherzyków jest starannie regulowana. Wytwarzanie składników jest modulowane warunkowo i zależy od różnych sygnałów metabolicznych i/lub otoczenia. Takie sygnały obejmują, na przykład, ograniczenie przez żelazo, modulację potencjału redox, zmiany pH i temperatury, zmiany substancji odżywczych. Niektóre przykłady składniPL 211 037 B1 ków pęcherzyków, które są wytwarzane warunkowo, obejmują regulowane przez żelazo białka błony zewnętrznej z Neisseria i Moraxella (na przykład TbpB, LbpB), i indukowalne przez substrat poryny błony zewnętrznej. Obecny wynalazek obejmuje zastosowanie opisanych poprzednio sposobów genetycznych (sposób a) lub b)) do uzyskiwania konstytutywnej ekspresji takich cząsteczek. W ten sposób, wpływ sygnału otoczenia na ekspresję genu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania, można przezwyciężyć przez modyfikowanie/zastąpienie odpowiedniego regionu kontrolnego genu, tak że staje się konstytutywnie aktywny (na przykład przez usunięcie części [korzystnie całości] lub represywnej sekwencji kontrolnej - np. regionu operatorowego), lub wstawienie silnego promotora konstytutywnego. Dla genów regulowanych przez żelazo można usunąć operator fur. Alternatywnie, sposób i) można zastosować do wprowadzenia w chromosomie dodatkowej kopii genu/operonu, będącego przedmiotem zainteresowania, który umieszcza się sztucznie pod kontrolą promotora konstytutywnego.
Sposoby d) i e) - Detoksykacja LPS
Toksyczność szczepionek pęcherzykowych stanowi jeden z największych problemów przy zastosowaniu pęcherzyków w szczepionkach. W dalszym aspekcie przedmiotem wynalazku są sposoby genetycznej detoksykacji LPS obecnego w pęcherzykach. Lipid A stanowi główny składnik LPS odpowiedzialny za aktywację komórkową. Wiele mutacji w genach uczestniczących w tym szlaku przemian prowadzi do istotnych fenotypów. Jednak, mutacje w genach odpowiedzialnych za końcowe etapy modyfikacji prowadzą do fenotypów wrażliwych na temperaturę (htrB) lub tolerancyjnych (msbB). Mutacje powodujące zmniejszoną (albo brak) ekspresję tych genów powodują zmienioną aktywność toksyczną lipidu A. Zaiste, lipid A nielauroilowany (mutant htrB) oraz non-mirystylowany (mutant msbB) są mniej toksyczne niż lipid A typu dzikiego. Mutacje w genie kodującym 4'-kinazę lipidu A (IpxK) także zmniejszają aktywność toksyczną lipidu A.
Zatem sposób d) obejmuje albo usunięcie części (albo korzystnie całości) jednego lub więcej z powyższych promotorów lub otwartych ramek odczytu. Alternatywnie, promotory można zastąpić słabszymi promotorami. Korzystnie do wykonania sposobu stosuje się opisane wyżej techniki rekombinacji homologicznej.
W tym celu dodatkowo podano sekwencje htrB i msbB genów z Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis, i Haemophilus influenzae.
Aktywność toksyczna LPS może także zostać zmieniona przez wprowadzenie mutacji w genach/loci zaangażowanych w oporności na polimyksynę B (taką oporność skorelowano z addycją aminoarabinozy na 4' fosforanie lipidu A). Tymi genami/loci mógłby być pmrE, który koduje dehydrogenazę UDP-glukozową, lub region genów odporności na peptydy mikrobójcze wspólny dla wielu pałeczek jelitowych, który może być zaangażowany w syntezę i przenoszenie aminoarabinozy. Gen pmrF, który jest obecny w tym regionie koduje transferazę dolikolo-fosforanowo-mannozylową (Gunn J.S., Kheng, B.L., Krueger J., Kim K.,Guo L., Hackett M., Miller S.I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).
Mutacje w układzie regulacyjnym PhoP-PhoQ, który stanowi fosfo-przekaźnikowy dwuskładnikowy układ regulacyjny (f.i. fenotyp konstytutywny PhoP, PhoPc), albo warunki niskiej zawartości Mg++ w otoczeniu lub hodowli (które aktywują układ regulacyjny PhoP-PhoQ) prowadzą do addycji aminoarabinozy na 4'-fosforanie i zastąpienia 2-hydroksymirystynianem mirystynianu (hydroksylacji mirystynianu). Ten zmodyfikowany lipid A wykazuje zmniejszona, zdolność stymulowania ekspresji E-selektyny przez ludzkie endoteliocyty i wydzielania TNF-α z ludzkich monocytów.
Sposób e) obejmuje regulację w górę tych genów przy użyciu strategii jak opisano wyżej (przy czym włącza się silne promotory, do wykonania sposobu korzystnie stosując techniki rekombinacji homologicznej).
Alternatywnie, zamiast przeprowadzania dowolnej takiej mutacji, jako szczep do wytwarzania szczepionki można zastosować szczep oporny na polimyksynę B (w połączeniu z jednym lub więcej z innych sposobów według wynalazku), gdyż pęcherzyki z takich szczepów także mają zredukowaną toksyczność LPS (na przykład jak pokazano dla meningokoka -van der Ley, P, Hamstra, HJ, Kramer, M, Steeghs, L, Petrov, A i Poolman, JT. 1994. W: Proceedings of ninth international pathogenic Neisseria conference. Guildhall, Winchester, Anglia).
Jako dalszą alternatywę (i dalszy aspekt wynalazku) twórcy podają sposób detoksykacji Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego obejmujący etap hodowania szczepu w pożywce wzrostowej zawierającej 0,1 mg - 100 g aminoarabinozy na litr pożywki.
Dla zmniejszenia aktywności toksycznej LPS, w jeszcze dalszej alternatywie, do preparatu pęcherzyków można dodać peptydy syntetyczne, które naśladują aktywność wiązania polimyksyny B
PL 211 037 B1 (opisana, poniżej) (Rustici, A, Velucchi, M, Faggioni, R, Sironi, M, Ghezzi, P, Quataert, S, Green,
B i Porro M 1993. Science 259: 361-365; Velucchi, M, Rustici, A, Meazza, C, Villa, P, Ghezzi,
P i Porro, M. 1997. J. Endotox. Res. 4:).
Sposób f) - Kotwiczenie białek homologicznych lub heterologicznych do pęcherzyków błony zewnętrznej przy zmniejszeniu toksyczności LPS
Dalszy aspekt niniejszego wynalazku obejmuje zastosowanie sekwencji genetycznych kodujących peptydy polimyksyny B (lub ich analogi) jako środka do kierowania białek fuzyjnych do błony zewnętrznej. Polimyksyna B stanowi cykliczny peptyd złożony z aminokwasów nie kodowanych przez tRNA (wytwarzany przez Gram-dodatnie bakterie promieniowate), który wiąże się bardzo mocno do części lipidu A lipopolisacharydu (LPS) obecnego w błonie zewnętrznej. To wiązanie zmniejsza toksyczność własną LPS (aktywność endotoksyny). Opracowano peptydy naśladujące strukturę polimyksyny B i złożone z aminokwasów kanonicznych (kodowanych przez tRNA), które także wiążą lipid A z silnym powinowactwem. Te peptydy zastosowano do detoksykacji LPS. Jeden z tych peptydów znany jako SAEP-2 (N-koniec-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-C-koniec) okazał się bardzo obiecujący pod tym względem (Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site by syntetyczny peptides (1993). Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. i M. Porro. Science 259, 361-365).
Obecny sposób f) według wynalazku stanowi ulepszenie tego zastosowania. Stwierdzono, że zastosowanie sekwencji DNA kodującej peptyd SEAP-2 (lub jego pochodne), połączonej genetycznie z genem, będącym przedmiotem zainteresowania (kodującym na przykład antygen limfocytu T lub antygen ochronny, który zazwyczaj wydzielany jest jako toksyna, albo białko cytosolowe lub okołoplazmatyczne) stanowi środek do kierowania odpowiedniego białka rekombinacyjnego do błony zewnętrznej korzystnego gospodarza bakteryjnego (przy jednoczesnym zmniejszeniu toksyczności LPS).
Ten układ jest przydatny dla białek labilnych, które nie mogłyby być eksponowane bezpośrednio na zewnątrz pęcherzyka. Pęcherzyki mogłyby więc działać jako nośnik do dostarczania, który mógłby wystawiać białko układowi odpornościowemu po otoczeniu pęcherzyków przez limfocyty T. Alternatywnie, fuzja genetyczna powinna także obejmować peptyd sygnałowy lub domenę przezbłonową, tak żeby białko rekombinacyjne mogło przebyć błonę zewnętrzną dla wystawienia układowi odpornościowemu gospodarza.
Ta strategia kierowania mogłaby być szczególnie interesująca w przypadku genów kodujących białka, które normalnie nie są kierowane do błony zewnętrznej. Ta metodologia umożliwia także wyizolowanie pęcherzyków rekombinacyjnych wzbogaconych w białko, będące przedmiotem zainteresowania. Korzystnie, taki peptydowy sygnał kierujący umożliwia wzbogacenie pęcherzyków błony zewnętrznej w jedno lub kilka białek, będących przedmiotem zainteresowania, które w naturze nie są spotykane w takiej danej lokalizacji subkomórkowej. Nie wyczerpująca lista bakterii, które można zastosować jako biorcę takich preparatów pęcherzyków rekombinacyjnych, obejmuje Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis i Chlamydia pneumoniae.
Chociaż korzystnie gen dla konstruktu jest zmodyfikowany w chromosomie bakterii [przy użyciu sposobu i)], to w alternatywnym korzystnym wykonaniu białka rekombinacyjne znaczone SAEP-2 wytwarza się niezależnie, i przyłącza do preparatu pęcherzyków na etapie późniejszym.
Dalsze wykonanie wynalazku to zastosowanie takich konstruktów w sposobie oczyszczania białka. W ogólności, układ mógłby zostać użyty jako część układu ekspresyjnego do wytwarzania białek rekombinacyjnych. Etykietę peptydową SAEP-2 można zastosować do opartego na powinowactwie oczyszczania białka, do którego jest ona przyłączona, stosując kolumnę zawierającą unieruchomione cząsteczki lipidu A.
Sposób h) - Polisacharydy reaktywne krzyżowo
Izolowanie bakteryjnych pęcherzyków błony zewnętrznej z zamkniętych w otoczce bakterii Gram-ujemnych często powoduje współoczyszczanie polisacharydu otoczki. W niektórych przypadkach ten materiał „zanieczyszczający może okazać się przydatny, gdyż polisacharyd może zwiększać odpowiedź odpornościową wywoływaną przez inne składniki pęcherzyków. Jednak w innych przypadkach obecność zanieczyszczającego materiału polisacharydowego w preparatach pęcherzyków bakteryjnych może okazać się szkodliwa dla stosowania pęcherzyków w szczepionce. Na przykład, co najmniej w przypadku N. meningitidis wykazano, że polisacharyd otoczki grupy surowiczej B nie nadaje odporności ochronnej i jest skłonny do indukowania u ludzi szkodliwej odpowiedzi autoimmunoloPL 211 037 B1 gicznej. Wskutek tego, sposób h) według wynalazku stanowi modyfikowanie szczepu bakteryjnego do wytwarzania pęcherzyków taki, żeby był wolny od polisacharydu otoczki. Wtedy pęcherzyki będą przydatne do stosowania u ludzi. Szczególnie korzystny przykład takiego preparatu pęcherzyków stanowi preparat z N. meningitidis grupy surowiczej B pozbawionej polisacharydu otoczki.
Można to osiągnąć stosując zmodyfikowane szczepy wytwarzające pęcherzyki, w których geny niezbędne dla biosyntezy i/lub eksportu otoczki zostały uszkodzone. Inaktywację genu kodującego biosyntezę lub eksport polisacharydów otoczki można osiągnąć przez mutowanie (mutację punktową, delecję lub insercję) regionu kontrolnego, regionu kodującego lub obu z nich (korzystnie stosując opisane wyżej techniki rekombinacji homologicznej). Ponadto, inaktywację genów biosyntezy otoczki można także osiągnąć przez nadekspresję antysensowną lub mutagenezę transpozonową. Korzystny sposób stanowi delecja niektórych lub wszystkich spośród genów cps z Neisseria meningitidis wymaganych dla biosyntezy i eksportu polisacharydu. W tym celu, można zastosować plazmid zastępczy pMF121 (opisany przez Frosha i in., 1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218) do uzyskania mutacji delecyjnej grupy genów cpsCAD (+ galE). Alternatywnie można usunąć gen siaD, lub jego ekspresję regulować w dół (meningokokowy gen siaD koduje alfa-2,3-sialilotransferazę, enzym wymagany do syntezy polisacharydów otoczki i LOS). Takie mutacje mogą także usuwać podobne do gospodarza struktury części sacharydowej LPS bakterii.
Sposób i) - Wprowadzanie jednej lub więcej dalszych kopii genu i/lub operonu do chromosomu gospodarza, lub wprowadzanie genu i/lub operonu heterologicznego do chromosomu gospodarza.
Skuteczną strategię modulowania składu preparatu pęcherzyków stanowi wprowadzenie jednej lub więcej kopii segmentu DNA zawierającego kasetę ekspresyjną do genomu bakterii Gram-ujemnej. Nie wyczerpująca lista korzystnych gatunków bakteryjnych, które można zastosować jako biorcę dla takiej kasety obejmuje Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Gen(y) zawarty w kasecie ekspresyjnej może być homologiczny (lub endogenny) (tj. w naturze istnieje w genomie bakterii, która się manipuluje) lub heterologiczny (tj. w naturze nie istnieje w genomie bakterii, która, się manipuluje). Ponownie wprowadzona kaseta ekspresyjna może składać się z niezmodyfikowanych, „naturalnych” sekwencji promotorów/genów/operonów lub ze zmodyfikowanych kaset ekspresyjnych, w których region promotora i/lub region kodujący lub oba z nich zostały zmienione. Nie wyczerpująca lista korzystnych promotorów, które można stosować do ekspresji, obejmuje promotory porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB z N. meningitidis lub N. gonorroheae, promotory p2, p5, p4, ompF, p1, ompH, p6, hin47 z H. influenzae, promotory ompH, ompG, ompCD, ompE, ompB1, ompB2, ompA z M. catarrhalis, promotor ż.pL. lac, tac, araB z Escherichia coli lub promotory rozpoznawane swoiście przez polimerazę RNA bakteriofaga, takiego jak bakteriofag T7 E. coli. Nie wyczerpująca lista korzystnych genów, które mogą być wyrażane w takim układzie, obejmuje NspA, Omp85, PilQ, kompleks TbpA/B, Hsf, PldA, HasR z Neisseria; MOMP, HMWP; Moraxella OMP106, HasR, PilQ, OMP85, PldA z Chlamydia; FHA, PRN, PT z Bordetella pertussis.
W korzystnym wykonaniu wynalazku kasetę ekspresyjna wprowadza się i wbudowuje w chromosom bakteryjny przy pomocy rekombinacji homologicznej i/lub specyficznej dla miejsca. Wektorami integracyjnymi stosowanymi do wprowadzania takich genów i/lub operonów mogą być warunkowo reaktywne lub samobójcze plazmidy, bakteriofagi, transpozony lub liniowe fragmenty DNA otrzymane metodą hydrolizy restrykcyjnej lub amplifikacji PCR. Integracja jest korzystnie ukierunkowana na regiony chromosomu zbędne dla wzrostu in vitro. Nie wyczerpująca lista korzystnych loci, które można zastosować do ukierunkowania integracji DNA, obejmuje geny porA, porB, opa, opc, rmp, omp26, lecA, cps, Igtp z Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae, geny P1, P5, hmw1/2, IgA-proteaza, fimE z NTHi; geny lecA1, lecA2, omp106, uspA1, uspA2 z Moraxella catarrhalis. Alternatywnie, kasetę ekspresyjną stosowaną do modulowania ekspresji składników pęcherzyków można dostarczyć do wybranej bakterii przy pomocy wektorów episomalnych takich jak kołowe/liniowe plazmidy replikatywne, kosmidy, phasmidy, bakteriofagi lizogeniczne lub sztuczne chromosomy bakteryjne. Rekombinację można wybrać przy pomocy wybieralnego markera genetycznego takiego jak geny nadające oporność na antybiotyki (na przykład kanamycynę, erytromycynę, chloramfenikol, lub gentamycynę), geny nadające oporność na metale ciężkie i/lub związki toksyczne lub geny uzupełniające mutacje auksotrofowe (na przykład pur, leu, met, aro).
Geny heterologiczne - Ekspresja obcych białek w pęcherzykach błony zewnętrznej
Pęcherzyki bakteryjne błony zewnętrznej stanowią bardzo atrakcyjny układ do wytwarzania, izolowania i dostarczania białek rekombinacyjnych do zastosowań do szczepienia, terapeutycznego i/lub
PL 211 037 B1 diagnostycznego. Dalszy aspekt niniejszego wynalazku odnosi się do ekspresji, wytwarzania i kierowania obcych białek heterologicznych do błony zewnętrznej, oraz zastosowania bakterii do wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych.
Korzystny sposób osiągnięcia tego obejmuje etapy: wprowadzenia genu heterologicznego, ewentualnie kontrolowanego przez sekwencję silnego promotora, do chromosomu szczepu Gram-ujemnego metodą rekombinacji homologicznej. Z otrzymanego zmodyfikowanego szczepu mogą być wytworzone pęcherzyki.
Niewyczerpujaca lista bakterii, które można zastosować jako biorcę do wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych, obejmuje Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae Moraxella catarrhalis,
Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Gen wyrażany w takim układzie może być pochodzenia wirusowego, bakteryjnego, grzybowego, pasożytowego lub wyższego eukariotycznego.
Korzystne zastosowanie wynalazku obejmuje sposób ekspresji białek błony zewnętrznej Moraxella, Haemophilus i/lub Pseudomonas (integralnych, politopowych i/lub lipoprotein) w pęcherzykach rekombinacyjnych Neisseria meningitidis. Korzystne miejsca integracji są podane wyżej, a korzystnie wprowadzane geny to te, które dają ochronę przeciwko bakterii, z której zostały wydzielone. Korzystne geny ochronne dla każdej bakterii są opisane poniżej.
Dalsze korzystne zastosowania to: pęcherzyki wytworzone ze zmodyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae, gdzie gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z Moraxella catarrhalis; oraz pęcherzyki wytworzone ze zmodyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis, gdzie gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z Haemophilus influenzae (korzystne miejsca wstawienia genów są podane wyżej, a korzystne antygeny ochronne są opisane poniżej).
Szczególnie korzystne jest zastosowanie tego aspektu w dziedzinie profilaktyki lub leczenia chorób przenoszonych drogą płciową (STD, sexually-transmitted diseaseses). Lekarzom praktykującym często trudno jest określić, czy główną przyczyną STD jest infekcja gonokokiem czy Chlamydia trachomatis. Te dwa organizmy stanowią główne przyczyny zapalenia jajowodu - choroby, która może doprowadzić do bezpłodności nosiciela. Byłoby więc przydatne, gdyby można było szczepić przeciwko STD lub leczyć szczepionką kombinacyjną skuteczną przeciwko chorobie powodowanej przez oba organizmy. Wykazano, że główne białko błony zewnętrznej (MOMP, Major Outer Membrane Protein) z C. trachomatis jest celem przeciwciał ochronnych. Jednak dla indukowania takich przeciwciał ważna jest integralność strukturalna tego integralnego białka błonowego. Ponadto, epitopy rozpoznawane przez te przeciwciała są zmienne i określają ponad 10 odmian serologicznych. Poprzednio opisany aspekt niniejszego wynalazku umożliwia właściwe fałdowanie jednego lub więcej białek błonowych w preparacie pęcherzyków błony zewnętrznej. Zmodyfikowanie szczepu gonokokowego wyrażającego wiele MOMP odmian serologicznych C. trachomatis w błonie zewnętrznej, i wytwarzanie z niego pęcherzyków, daje pojedyncze rozwiązanie wielu problemów prawidłowego składania białek błonowych, prezentacji dostatecznej ilości MOMP odmian serologicznych dla ochrony przeciwko szerokiemu spektrum odmian serologicznych, i równoczesnej profilaktyki/leczenia infekcji gonokokowej (a dzięki temu na początku brak wymagania od lekarzy prowadzących decyzji, który organizm powoduje poszczególne objawy kliniczne - można szczepić równocześnie przeciwko obu organizmom, umożliwiając tak leczenie STD na bardzo wczesnym etapie). Korzystne miejsca wstawienia genów w chromosomie gonokokowym są podane wyżej. Inne korzystne, ochronne geny C. trachomatis, które można wcielić, to HMWP, PmpG oraz OMP ujawnione w WO 99/28475.
Kierowanie białek heterologicznych do pęcherzyków błony zewnętrznej:
Ekspresja niektórych białek heterologicznych w pęcherzykach bakteryjnych może wymagać dodania sygnału(ów) kierującego do błony zewnętrznej. Korzystny sposób rozwiązania tego problemu polega na stworzeniu połączenia genetycznego między genem heterologicznym i genem kodującym rezydentne OMP, jako specyficznego podejścia do kierowania białek rekombinacyjnych do pęcherzyków. Najkorzystniej, gen heterologiczny jest połączony z sekwencjami peptydów sygnałowych takiego OMP.
Preparaty pęcherzyków dwoinkowych
Jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne) jest korzystny dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) wykonywanymi na szczepie dwoinkowym, włącznie z gonokokiem i meningokokiem (szczególnie N. meningitidis B) : NspA (WO 96/29412), podobny do Hsf (WO 99/31132), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA (US 5912336), TbpB, FrpA/FrpC (WO
PL 211 037 B1
92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP98/05117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2 (WO 99/57280), MltA (WO 99/57280), i ctrA (PCT/EP00/00135). Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gramujemnych.
Dla regulacji w dół sposobem a) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa, i Opc.
Dla regulacji w dół sposobem d) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: htrB, msbB i lpxK.
Dla regulacji w górę sposobem e) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Korzystne sekwencje kontrolne represyjne dla sposobu c) to: region operatora fur (szczególnie dla jednego lub obu z genów TbpB i LbpB); i region operatora DtxR.
Dla regulacji w dół sposobem h) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC, i ctrD.
Preparaty pęcherzyków Pseudomonas aeruginosa
Dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne): PcrV, OprF, OprI. Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Preparaty pęcherzyków Moraxella catarrhalis
Dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne): OMP106 (WO 97/41731 i WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824),
PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), lipo06 (GB 9917977,2), lipo10 (GB 9918208,1), lipo11 (GB 9918302,2), lipo18 (GB 9918038,2), P6 (PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, i in. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010), D15 (PCT/EP99/03822), OmplA1 (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA i LbpB (WO 98/55606), TbpA i TbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980), OmpE, UspA1 i UspA2 (WO 93/03761), i Omp21. Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Dla regulacji w dół sposobem a) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: CopB,
OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA, i LbpB.
Dla regulacji w dół sposobem d) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: htrB, msbB i lpxK.
Dla regulacji w górę sposobem e) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Preparaty pęcherzyków Haemophilus influenzae
Dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne): D15 (WO 94/12641), P6 (EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO
94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, i Hif (regulacji w górę powinny zostać poddane wszystkie geny w tym operonie, w celu regulacji w górę piliny). Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Dla regulacji w dół sposobem a) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: P2, P5, Hif, proteaza IgA1, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA, i TbpB.
Dla regulacji w dół sposobem d) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: htrB, msbB i lpxK.
Dla regulacji w górę sposobem e) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Preparaty szczepionek
Korzystne wykonanie wynalazku stanowi przygotowanie preparatów pęcherzyków według wynalazku w szczepionce, która może także zawierać farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
Wytwarzanie preparatów pęcherzyków z dowolnych spośród wyżej wymienionych zmodyfikowanych szczepów można osiągnąć dowolnym ze sposobów znanych specjaliście. Korzystnie stosuje się sposoby ujawnione w EP 301992, US 5597572, EP 11243 lub US 4271147. Najkorzystniej, stosuje się sposób opisany w Przykładzie 8.
Wytwarzanie szczepionek jest ogólnie opisane w Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (red. Powell M.F. i Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).
PL 211 037 B1
Preparaty pęcherzyków według niniejszego wynalazku można uzupełnić adiuwantami w preparacie szczepionki według wynalazku. Przydatnym adiuwantem może być sól glinu taka jak żel wodorotlenku glinu (alun) lub fosforan glinu, ale może także być sól wapnia (szczególnie węglan wapnia), żelaza lub cynku, albo może być nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny lub acylowanych cukrów, kationowo lub anionowo upochodnionych polisacharydów, lub polifosfazenów.
Przydatne układy adiuwantów Th1, które mogą być stosowane, obejmują monofosforylo-lipid A, szczególnie 3-de-O-acylowany monofosforylo-lipid A, oraz kombinację monofosforylo-lipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylo-lipidu A (3D-MPL) razem z solą glinu. Układ ulepszony obejmuje połączenie monofosforylo-lipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza kombinację QS21 i 3D-MPL, jak ujawniono w WO 94/00153, lub wywołującą mniejszy odczyn kompozycję, gdzie QS21 jest stłumiony cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie mocny preparat adiuwantu obejmujący QS21 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w-wodzie jest opisany w WO95/17210, i stanowi preparat korzystny.
Szczepionka może zawierać saponinę, korzystniej QS21. Może ona także zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol. Oligonukleotydy zawierające niezmetylowaną CpG (WO 96/02555) stanowią także preferencyjne induktory odpowiedzi TH1 i są przydatne do stosowania w niniejszym wynalazku.
Preparat szczepionki według niniejszego wynalazku może być stosowany do ochrony lub leczenia ssaka podatnego na infekcję, przy pomocy podawania wspomnianej szczepionki drogą układową systemic lub śluzową. Podawanie może obejmować wstrzyknięcie droga domięśniową, dootrzewnową, śródskórną lub podskórną; albo drogą podawania śluzowego do układu pokarmowego, oddechowego, moczowo-płciowego. Zatem w jednym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób immunizowania człowieka jako gospodarza przeciwko chorobie wywołanej przez infekcje bakteriami Gram-ujemnymi, który obejmuje podawanie gospodarzowi immunoochronnej dawki preparatu pęcherzyków według niniejszego wynalazku.
Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana jako ilość, która indukuje odpowiedź immunoochronną bez znaczących, szkodliwych efektów ubocznych u typowych osób szczepionych. Taka ilość będzie zmieniać się zależnie od tego, który konkretny immunogen jest wykorzystywany i jak jest prezentowany. Ogólnie, oczekuje się, że każda dawka będzie obejmować 1-100 gg antygenu białkowego, korzystnie 5-50 gg, a najbardziej typowo w zakresie 5-25 gg.
Optymalną ilość poszczególnej szczepionki można ustalić przez normalne badania obejmujące obserwację u leczonych właściwych odpowiedzi odpornościowych. Po początkowym szczepieniu, leczenie w odpowiednich odstępach mogą otrzymywać jedna lub kilka immunizacji przyspieszających.
Szczepionki z otoczek bakteryjnych lub z zabitych całych komórek
Twórcy przewidują, że powyższe ulepszenia preparatów i szczepionek pęcherzykowych można łatwo rozciągnąć na preparaty i szczepionki z otoczek bakteryjnych (tzw. komórek duchów) lub z zabitych całych komórek (przy identycznych korzyściach). Zmodyfikowane szczepy Gram-ujemne według wynalazku, z których wytwarza się preparaty pęcherzyków, można także stosować do wytwarzania preparatów z otoczek bakteryjnych i zabitych całych komórek. Sposoby wytwarzania preparatów z otoczek bakteryjnych (pustych komórek z nietkniętymi otoczkami) ze szczepów Gram-ujemnych są znane w stanie techniki (patrz na przykład WO 92/01791). Sposoby zabijania całych komórek dla wytworzenia inaktywowanych preparatów komórkowych do stosowania w szczepionkach są także znane. Określenia 'preparaty pęcherzyków' i 'szczepionki pęcherzykowe' jak również sposoby opisane w niniejszym dokumencie można zatem dla celów niniejszego wynalazku odnosić do określeń, odpowiednio, 'preparat z otoczek bakteryjnych' i 'szczepionka z otoczek bakteryjnych', oraz 'preparat z zabitych całych komórek' i 'szczepionka z zabitych całych komórek'.
Kombinacje sposobów a) - i)
Można docenić, że jeden lub więcej z powyższych sposobów można zastosować do wytworzenia szczepu zmodyfikowanego, z którego wytwarza się ulepszone preparaty pęcherzyków według wynalazku. W celu wytworzenia szczepionki pęcherzykowej korzystnie stosuje się jeden taki sposób, a korzystniej stosuje się dwa lub więcej (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9) sposobów. W miarę, jak do wytwarzania szczepionki pęcherzykowej stosuje się każdy dodatkowy sposób, każde ulepszenie działa w połączeniu z innymi stosowanymi sposobami dla uzyskania zoptymalizowanego zmodyfikowanego preparatu pęcherzyków.
Korzystny sposób wytwarzania pęcherzyków meningokokowych (szczególnie N. meningitidis B) obejmuje zastosowanie sposobów a), b), d) i/lub e), i h). Takie preparaty pęcherzyków są bezpieczne (nie mają struktur podobnych do struktur gospodarza), nietoksyczne, i mają taką strukturę, że odpoPL 211 037 B1 wiedź odpornościowa gospodarza będzie skupiona na wysokich poziomach antygenów ochronnych (i korzystnie konserwatywnych). Wszystkie powyższe elementy działają razem dla wytworzenia zoptymalizowanej szczepionki pęcherzykowej.
Podobnie dla M. catarrhalis i atypowych H. influenzae, korzystne sposoby wytwarzania pęcherzyków obejmują zastosowanie sposobów a), b), i d) i/lub e).
Dalszy aspekt wynalazku stanowi wiec immunoochronna i nietoksyczna Gram-ujemna szczepionka pęcherzykowa, z otoczek bakteryjnych, lub z zabitych całych komórek, przydatna do zastosowań pediatrycznych.
Przez zastosowanie pediatryczne rozumie się zastosowanie u dzieci młodszych niż czteroletnie.
Przez działanie immunoochronne rozumie się, że co najmniej 40% (a korzystnie 50, 60, 70, 80, 90 i 100%) dzieci młodszych przechodzi serokonwersje (4-krotny wzrost aktywności bakteriobójczej [rozcieńczenia surowic odpornościowych, przy którym 50% bakterii umiera - patrz na przykład PCT/EP98/05117]) przeciwko zbiorowi szczepów heterologicznych do wybrania z głównych znanych grup klonalnych. Dla meningokoka B te szczepy powinny mieć PorA typu różnego od szczepu wytwarzającego pęcherzyki, i powinny korzystnie stanowić 2, 3, 4, albo najkorzystniej wszystkie 5 spośród szczepów H44/76, M97/252078, BZ10, NGP165 i CU385. Dla atypowych H. influenzae, szczepami powinny korzystnie być 2, 3, 4, albo najkorzystniej wszystkie 5 spośród szczepów 3224A, 3219C, 3241A, 640645, i A840177. Dla M. catarrhalis, szczepami powinny korzystnie być 2, 3, 4, albo najkorzystniej wszystkie 5 spośród szczepów ATCC 43617, 14, 358, 216 i 2926.
Przez określenie nietoksyczny rozumie się, że istnieje znaczący (2-4 krotny, korzystnie 10 krotny) spadek aktywności endotoksyny zmierzonej znanymi testami LAL i pirogenności.
Kombinacje szczepionek
Dalszy aspekt wynalazku stanowią kombinacje szczepionek zawierające preparaty pęcherzyków według wynalazku z innymi antygenami, które korzystnie stosuje się przeciwko pewnym stanom chorobowym. Stwierdzono, że pęcherzyki są szczególnie przydatne do tworzenia preparatów z innymi antygenami, jako że korzystnie mają działanie adiuwantu na antygeny, z którymi są zmieszane.
W jednej z korzystnych kombinacji, preparaty pęcherzyków meningokoka B według wynalazku przygotowuje się z 1, 2, 3 lub korzystnie wszystkimi 4 z następujących meningokokowych polisacharydów otoczki, które mogą być zwykłe lub sprzężone z nośnikiem białkowym: A, C, Y lub W. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę meningokokową. Zamiast stosowania preparatów pęcherzyków meningokoka B według wynalazku, przewiduje się także, że preparat powinien alternatywnie zawierać preparaty pęcherzyków meningokoka B typu dzikiego wraz z 2 lub więcej (korzystnie kilkoma) szczepami należącymi do kilku podtypów/serotypów (na przykład wybranymi spośród P1.15, P1.7,16, P1.4, i P1.2).
W dalszym korzystnym wykonaniu, preparaty pęcherzyków meningokoka B według wynalazku [lub wspomnianą wyżej mieszankę 2 lub więcej preparatów pęcherzyków meningokoka B typu dzikiego], korzystnie przygotowanych z 1, 2, 3 lub wszystkimi 4 spośród zwykłych lub sprzężonych polisacharydów otoczki meningokokowej A, C, Y lub W, przygotowuje się ze sprzężonym polisacharydem otoczki H. influenzae b, oraz jednym lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub więcej antygenów białek, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Streptococcus pneumoniae. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę meningokokowa.
Pneumokokowe antygeny polisacharydów otoczki są korzystnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F).
Korzystnymi antygenami białek pneumokokowych są te białka pneumokokowe, które są eksponowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (możliwe do rozpoznania przez układ odpornościowy gospodarza podczas co najmniej części cyklu życiowego pneumokoka), albo białka, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoka. Najkorzystniej, białko stanowi toksyna, adhezyna, 2-składnikowy przekaźnik sygnału, lub lipoproteina Streptococcus pneumoniae, albo ich fragmenty. Szczególnie korzystne białka obejmują, ale bez ograniczania do tego: pneumolizynę (korzystnie detoksykowaną przez działanie chemiczne lub mutację) [Mitchell i in. Nucleic Acids Res. 11 lipca 1990; 18(13): 4010 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2, Mitchell i in. Biochim Biophys Acta, 23 stycznia 1989; 1007(1): 67-72 Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties, WO 96/05859 (A. Cyanamid) , WO 90/06951 (Paton i in.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA i jego przezbłonowe
PL 211 037 B1 warianty delecyjne (US 5804193 - Briles i in.); PspC i jego przezbłonowe warianty delecyjne (WO 97/09994 - Briles i in.); PsaA i jego przezbłonowe warianty delecyjne (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12) : 5255-62 Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae); białka pneumokokowe wiążące cholinę i ich przezbłonowe warianty delecyjne; CbpA i jego przezbłonowe warianty delecyjne (WO 97/41151; WO 99/51266); dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanowa (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i in. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); białko podobne do M, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0837130; oraz adhezynę 18627, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0834568. Dalsze korzystne białkowe antygeny pneumokokowe to te, które ujawniono w WO 98/18931, zwłaszcza wybrane w WO 98/18930 i PCT/US99/30390.
W dalszym korzystnym wykonaniu, preparaty pęcherzyków Moraxella catarrhalis według wynalazku przygotowuje się z jednego lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki, oraz jednego lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją atypowymi H. influenzae. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Streptococcus pneumoniae. Szczepionka może także ewentualnie zawierać jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę zapalenia ucha środkowego.
Korzystne atypowe antygeny białkowe H. influenzae obejmują białko fimbrynę (US 5766608) i białka fuzyjne obejmujące ich peptydy (np. LB1 Fusion) (US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, białko D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap, i D15.
Korzystne antygeny wirusa grypy obejmują całego, żywego lub inaktywowanego wirusa, rozciętego wirusa grypy, hodowanego w jajkach lub komórkach MDCK, albo komórkach Vero lub całe wirosomy grypy (jak opisani R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) albo ich białka oczyszczone lub rekombinacyjne, takie jak białka HA, NP, NA, lub M, lub ich kombinacje.
Korzystne antygeny RSV (wirusa oskrzelowego, Respiratory Syncytial Virus) obejmują glikoproteinę F, glikoproteinę G, białko HN, lub ich pochodne.
W jeszcze dalszym korzystnym wykonaniu, preparaty pęcherzyków atypowych H. influenzae według wynalazku przygotowuje się z jednego lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki, i jednego lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją M. catarrhalis. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Streptococcus pneumoniae. Szczepionka może także ewentualnie zawierać jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę zapalenia ucha środkowego.
Sekwencje nukleotydów według wynalazku
W dalszym aspekcie przedmiotem wynalazku są nowe sekwencje nukleotydów, które można stosować w sposobach według wynalazku. Podano specyficzne regiony przed rozmaitymi genami z rozmaitych szczepów, które można stosować, na przykład, w sposobach a), b), d) i h). Ponadto, podano regiony kodujące dla wykonania sposobu d).
Ogólny sposób analizy niekodujacego regionu oskrzydlającego gen bakteryjny i jej wyzyskanie do modulowanej ekspresji genu w pęcherzykach
Niekodujące regiony oskrzydlające konkretny gen zawierają elementy regulatorowe ważne przy ekspresji genu. Ta regulacja ma miejsce zarówno na poziomie transkrypcyjnym jak i translacyjnym. Sekwencję tych regionów, albo przed albo za otwartą ramką odczytu genu, można otrzymać przez sekwencjonowanie DNA. Te informacje o sekwencji umożliwiają określenie potencjalnych motywów regulatorowych takich jak różne elementy promotorowe, sekwencje terminatorowe, elementy sekwencji indukowalnych, represory, elementy odpowiedzialne za zmianę fazy, sekwencja Shine-Dalgarno, regiony o potencjalnej strukturze drugorzędowej zaangażowanej w regulację, jak również inne typy motywów lub sekwencji regulatorowych.
Te informacje o sekwencji umożliwiają modulację naturalnej ekspresji genu, będącego przedmiotem zainteresowania. Regulację w górę ekspresji genu można zrealizować przez zmianę promotora, sekwencji Shine-Dalgarno, potencjalnych elementów represorowych lub operatorowych, lub dowolnych innych zaangażowanych elementów. Podobnie, regulację w dół ekspresji można osiągnąć przez podobne typy modyfikacji. Alternatywnie, zmieniając sekwencje ze zmianą fazy, ekspresję genu można umieścić pod kontrolą zmiany fazy, albo można odsprzęgnąć od tej regulacji. W innym podejPL 211 037 B1 ściu, ekspresję genu można umieścić pod kontrolą jednego lub więcej indukowalnych elementów umożliwiających regulowaną ekspresję. Przykłady takiej regulacji obejmują, ale bez ograniczania do tego, indukcję przez przesunięcie temperaturowe, dodanie substratów induktorowych, jak wybrane węglowodany lub ich pochodne, pierwiastki śladowe, witaminy, kofaktory, jony metali, itp.
Takie modyfikacje, jak opisano wyżej, można wprowadzić kilkoma różnymi sposobami. Modyfikację sekwencji zaangażowanych w ekspresji genów można wykonać in vivo przez mutagenezę losową, a następnie wybór pożądanego fenotypu. Inne podejście polega na izolowaniu regionu, będącego przedmiotem zainteresowania, i modyfikowaniu go przez mutagenezę losową lub ukierunkowaną na dane miejsce mutagenezę zastąpienia, insercji lub delecji. Zmodyfikowany region można następnie ponownie wprowadzić do genomu bakteryjnego metodą rekombinacji homologicznej, i ocenić wpływ na ekspresję genu. W innym podejściu, znajomość sekwencji regionu, będącego przedmiotem zainteresowania, można wykorzystać do zastąpienia lub delecji całości lub części naturalnych sekwencji regulatorowych. W tym przypadku, docelowy region regulatorowy wydziela się i modyfikuje, żeby zawierał elementy regulatorowe z innego genu, kombinację elementów regulatorowych z różnych genów, syntetyczny region regulatorowy, lub dowolny inny region regulatorowy, lub żeby usunąć wybrane części sekwencji regulatorowych typu dzikiego. Te sekwencje zmodyfikowane można następnie wprowadzić ponownie do genomu bakterii na drodze rekombinacji homologicznej.
W sposobie b), na przykład, ekspresję genu można modulować przez wymianę jego promotora na promotor silniejszy (przez wyizolowanie sekwencji poprzedzającej gen, modyfikacje in vitro tej sekwencji, i ponowne wprowadzenie do genomu metodą rekombinacji homologicznej). Ekspresje regulowaną w górę można otrzymać zarówno w bakterii jak i w pęcherzykach błony zewnętrznej odrzuconych (lub wytworzonych) z bakterii.
W innych korzystnych przykładach, opisane podejścia można zastosować do wytwarzania rekombinacyjnych szczepów bakteryjnych o ulepszonej charakterystyce do zastosowań do szczepienia, jak opisano wyżej. Mogą to być, ale bez ograniczania do tego, szczepy atenuowane, szczepy o zwiększonej ekspresji wybranych antygenów, szczepy ze znokautowanymi genami (lub o zmniejszonej ekspresji genów), które zakłócają odpowiedź immunologiczną, i szczepy o zmodulowanej ekspresji białek immunodominujących.
SEKW. ID. NR: 2-23, 25, 27-38 to wszystko dwoinkowe sekwencje poprzedzające (przed kodonem inicjacji rozmaitych korzystnych genów) zawierające w przybliżeniu po 1000 bp. SEKW. ID. NR: 39-62 to wszystko sekwencje poprzedzające M. catarrhalis (przed kodonem inicjacji rozmaitych korzystnych genów) zawierające w przybliżeniu po 1000 bp. SEKW. ID. NR: 63-75 to wszystko sekwencje poprzedzające H. influenzae (przed kodonem inicjacji rozmaitych korzystnych genów) zawierające w przybliżeniu po 1000 bp. Wszystkie z nich można zastosować w sposobach genetycznych (szczególnie rekombinacji homologicznej) dla regulacji w górę lub regulacji w dół otwartych ramek odczytu, z którymi są one związane (jak opisano przedtem). SEKW. ID. NR: 76-81 są regiony kodujące dla genów HtrB i MsbB z Neisseria, M. catarrhalis, i Haemophilus influenzae. Można je zastosować w sposobach genetycznych (szczególnie rekombinacji homologicznej) dla regulacji w dół (w szczególności usunięcia) części (korzystnie wszystkich) tych genów [sposób d)].
W innym aspekcie przedmiotem wynalazku jest więc wydzielona sekwencja polinukleotydowa, która hybrydyzuje w warunkach wysoce ostrych z co najmniej 30 nukleotydową porcją nukleotydów w SEKW. ID. NR: 2-23, 25, 27-81, albo nić komplementarna do niej. Korzystnie wydzielona sekwencja powinna być dostatecznie długa dla przeprowadzenia rekombinacji homologicznej z sekwencją chromosomową, jeżeli stanowi ona część przydatnego wektora - mianowicie co najmniej 30 nukleotydów (korzystnie co najmniej 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, lub 500 nukleotydów). Korzystniej wydzielony polinukleotyd powinien zawierać co najmniej 30 nukleotydów (korzystnie co najmniej 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, lub 500 nukleotydów) z SEKW. ID. NR: 2-23, 25, 27-81, albo nici komplementarnej do niej.
Stosowane niniejszym wysoce ostre warunki hybrydyzacji obejmują, na przykład, 6X SSC, 5X Denhardt, 0,5% SDS, i 100 ng/mL fragmentowanego i zdenaturowanego DNA z nasienia pstrąga hybrydyzowanego przez noc w temperaturze 65°C i przemytego w 2X SSC, 0,1% SDS jeden raz w temperaturze pokojowej przez około 10 minut, a następnie jeden raz w temperaturze 65°C przez około 15 minut, a następnie przemytego co najmniej raz w 0,2X SCC, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3-5 minut.
Dalszy aspekt stanowi zastosowanie wydzielonych sekwencji polinukleotydów według wynalazku do przeprowadzenia modyfikacji genetycznej (takiej jak insercja transpozonu, lub specyficzna dla
PL 211 037 B1 miejsca mutacja lub delecja, ale korzystnie rekombinacja homologiczna) w obrębie 1000 bp przed genem chromosomalnym bakterii Gram-ujemnej w celu albo zwiększenia albo zmniejszenia ekspresji genu. Korzystnie szczep, w którym ma mieć miejsce rekombinacja, jest taki sam jak szczep, z którego otrzymano sekwencje poprzedzające według wynalazku. Jednak genomy meningokoków A, B, C, Y i W i gonokoka są dostatecznie podobne, żeby sekwencja poprzedzająca z dowolnego z tych szczepów mogła być przydatna do projektowania wektorów do prowadzenia takich operacji w innych szczepach. Może być tak również dla Haemophilus influenzae i atypowego Haemophilus influenzae.
Przykłady
Poniższe przykłady wykonuje się przy użyciu normalnych technik, które są znane i rutynowe dla specjalistów, z wyjątkiem, kiedy opisano szczegółowo inaczej. Przykłady są obrazowe, ale nie ograniczają wynalazku.
Przykład 1: Konstruowanie szczepu grupy surowiczej B Neisseria meningitidis bez polisacharydów otoczki.
Plazmid pMF121 (Frosch i in., 1990) zastosowano do skonstruowania szczepu Neisseria meningitidis B bez polisacharydu otoczki. Ten plazmid zawiera regiony oskrzydlające miejsce genu kodującego szlak przemian biosyntetycznych polisacharydu grupy B (B PS), oraz genu oporności na erytromycynę. Delecja B PS spowodowała utratę ekspresji polisacharydu otoczki grupy B jak również delecję aktywnej kopii galE prowadząc do syntezy LPS z niedoborem galaktozy.
Transformacja szczepu:
Do transformacji wybrano szczep H44/76 Neisseria meningitidis B (B:15:P1.7, 16; Los 3,7,9). Po inkubacji CO2 przez noc na płytce MH (bez erytromycyny) , komórki zebrano w ciekłej MH zawierającej 10 mM MgCl2 (2 ml stosowano na płytkę MH) i rozcieńczono do gęstości optycznej 0,1 (550 nm). Do tych 2 ml roztworu dodano 4 gl roztworu podstawowego plazmidu pMF121 (0,5 gg/ml) na 6 godzin okresu inkubacji w temperaturze 37°C (z wytrząsaniem). Grupę kontrolną zrobiono z taką samą ilością bakterii Neisseria meningitidis B, ale bez dodatku plazmidu. Po okresie inkubacji 100 gl hodowli jako takiej w rozcieńczeniach 1/10, 1/100 i 1/1000 umieszczono na płytkach MH zawierających 5, 10, 20, 40 lub 80 gg erytromycyny/ml przed inkubacją przez 48 godzin w temperaturze 37°C.
Blotting kolonii:
Po inkubacji płytek wyhodowano 20 kolonii i poddano selekcji na płytkach MH zawierających 10 i 20 gg erytromycyny/ml, podczas gdy w grupie kontrolnej bez transformacji plazmidem nie było wzrostu kolonii. Szczep H44/76 typu dzikiego był niezdolny do wzrostu na płytkach selekcyjnych z erytromycyną (10 do 80 gg erytromycyny/ml). Nazajutrz, wszystkie widoczne kolonie umieszczono na nowych płytkach MH bez erytromycyny, żeby umożliwić im wzrost. Następnie przeniesiono je na arkusze nitrocelulozy (blotting kolonii) w celu testowania obecności polisacharydu B. W skrócie, kolonie odbito na arkuszu nitrocelulozowym i bezpośrednio wypłukano w PBS-0,05% Tween 20 przed inaktywacją komórek przez 1 godzinę w temperaturze 56°C w PBS-0,05% Tween 20 (bufor rozcieńczający). Następnie, błonę pokryto na godzinę buforem rozcieńczającym w temperaturze pokojowej (RT). Następnie ponownie przemyto arkusze trzy razy po 5 minut w buforze rozcieńczającym przed inkubacją przeciwciałem monoklonalnym anty-B PS 735 Mab (Boerhinger) rozcieńczonym 1/3000 w buforze rozcieńczającym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po nowym etapie przemywania (3 razy po 5 minut), przeciwciało monoklonalne wykrywano stosując biotynylowaną Ig anty-mysią z firmy Amersham (RPN 1001) rozcieńczona 500 razy w buforze rozcieńczającym (jedna godzina w temperaturze pokojowej) przed następnym etapem przemywania (jak opisano wyżej). Następnie, arkusze inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem kompleksu streptawidyny-peroksydazy rozcieńczonym 1/1000 w buforze rozcieńczającym. Po ostatnich trzech etapach przemywania przy użyciu tego samego sposobu, arkusze nitrocelulozowe inkubowano przez 15 min w ciemności stosując roztwór wywoływacza (roztwór 30 mg 4-chloro-1-naftolu w 10 ml metanolu plus 40 ml PBS i 30 gl H2O2 37% z firmy Merck). Reakcję zatrzymano stosując etap przemywania wodą destylowaną.
Testy ELISA dla całych komórek:
Wykonano także testy ELISA dla całych komórek, stosując dwie kolonie transformowane („D i „R) i szczep typu dzikiego (H44/76) jako bakterie w otoczkach (20 gg białka/ml), oraz zestaw różnych przeciwciał monoklonalnych (Mabs) stosowanych do scharakteryzowania szczepów Neisseria meningitidis. Testowano następujące Mabs: anty-B PS (735 od dr Froscha), i inne Mabs z NIBSC: anty-B PS (Ref 95/750) anty-P1.7 (A-PorA, Ref 4025), anty-P1.16 (A-PorA, Ref 95/720), anty-Los 3,7,9 (A-LPS, Ref 4047), anty-Los 8 (A-LPS, Ref 4048), i anty-P1.2 (A-PorA Ref 95/696).
PL 211 037 B1
Płytki mikrotitracyjne (Maxisorp, Nunc) powleczono 100 ąl roztworu rekombinacyjnych meningokokowych komórek B przez noc (ON) w temperaturze 37°C przy około 20 ąg/ml w PBS. Następnie, płytki przemyto trzy razy po 300 ąl 150 mM NaCl - 0,05% Tween 20, i pokryto 100 ąl PBS-0,3% kazeiny i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Płytki przemyto ponownie stosując samą procedurę przed inkubacją z przeciwciałami. Przeciwciała monoklonalne (100 ąl) zastosowano przy różnych rozcieńczeniach (jak pokazano na Figurze 2) w PBS-0,3% kazeiny 0,05% Tween 20 i umieszczono na mikropłytkach przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 min z wytrząsaniem, przed następnym identycznym etapem przemywania. 100 ąl anty-mysiej Ig (z królika, Dakopatts E0413) sprzężonej z biotyną i rozcieńczonej 1/2000 w PBS-0,3% kazeiny - 0,05% Tween 20 dodano do studzienek w celu wykrycia związanych przeciwciał monoklonalnych. Po etapie przemywania (as before), płytki inkubowano z roztworem kompleksu streptawidyny-peroksydazy (100 ąl Amersham RPN 1051) rozcieńczonym 1/4000 w tym samym roztworze roboczym przez 30 min w temperaturze pokojowej w warunkach wytrząsania. Po tej inkubacji i ostatnim etapie przemywania płytki inkubuje się przez 15 min w ciemności z roztworem 100 ąl chromogenu (4 mg orto-fenylenodiaminy (OPD) w 10 ml 0,1 M buforu cytrynianowego o pH 4,5 z 5 ąl H2O2). Następnie płytki odczytuje się przy 490/620 nm stosując spektrofotometer.
Wyniki:
Figura 1 pokazuje, że wśród 20 wydzielonych kolonii, które były zdolne do wzrostu na pożywce selekcyjnej z erytromycyną tylko dwie kolonie („D” i „R”) dały ujemny wynik testu na obecność polisacharydu B. Wśród pozostałych, 16 było wyraźnie dodatnich w teście na B PS i wciąż opornych na erytromycynę. Wskazuje to, że zintegrowały plazmid ze swoim genomem, ale w złej orientacji, i zachowały nietknięty gen B PS i LPS (bez podwójnego crossing-over). Na płytkach były testowane także dodatnie i ujemne próby kontrolne, i wykazały, że szczep H44/76 typu dzikiego NmB był wyraźnie dodatni w teście na polisacharyd B, zaś szczepy meningokoka A (A1) i meningokoka C (C11) były wyraźnie ujemne przy tym przeciwciele anty-B PS 735 Mab. Te wyniki wskazują, że około 10% poddanych selekcji kolonii prawidłowo zintegrowało plazmid w swoim genomie przez wytworzenie podwójnego crossing-over, zaś inne szczepy/kolonie otrzymano po prostym crossing-over, przy zachowaniu genów B PS i LPS nietkniętych i wyrażanych.
Przy użyciu testów ELISA dla całych komórek, wyniki (Figura 2 i Tabela poniżej) wyraźnie wskazują, że dwie transformanty „D i „R (pochodzące z kolonii D i R) nie mogą być już rozpoznawane przez Mabs anty-B PS (735 i 95/750), ani przez anty-Los 3,7,9 i Mabs anty-Los 8. Jednak, przy użyciu swoistych Mabs anty-PorA istnieje wyraźna reakcja dla Mabs anty-P1.7 i anty-P1.16 w komórkach, jak zaobserwowano także u szczepu typu dzikiego. Nie zaobserwowano reakcji z niespecyficznym anty-PorA Mab (anty-P1.2 mab). Te wyniki potwierdzają, że białko PorA, a konkretnie epitopy P1.7 i P1.16 są wciąż obecne po transformacji, zaś polisacharyd B i epitopy Los 3,7,9 i Los 8 (LPS) nie są.
Tabela: Specyficzności testowanych przeciwciał monoklonalnych
Testowane przeciwciała monoklonalne Skierowane przeciw Wynik
Anty-B PS 735 Polisacharyd B ++ na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D i „R
Anty-B PS 95/750 z NIBSC B PS ++ na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D i „R
Anty-P1.7 (NIBSC) ++ na wszystkich szczepach typu dzikiego i mutantach
Anty-P1.16 (NIBSC) Pętla 4 poryny A ++ na wszystkich szczepach typu dzikiego i mutantach
Anty-Los 3,7,9 LPS ++ na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D i „R
Anty-Los 8 (NIBSC) LPS +/- na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D i „R
Anty-P1.2 (NIBSC) Anty-Poryna A Sero-podtyp 1.2 (-) na wszystkich szczepach typu dzikiego i mutantach
Przykład 2: Konstrukcja wszechstronnych wektorów dostarczających geny (seria pCMK) kierujących integracją w miejscu porA Neisseria meningitidis.
Skonstruowano plazmid umożliwiający rekombinację homologiczna i trwałą integrację obcego DNA w miejscu porA Neisseria meningitidis. Ten wektor dostarczający (geny, operony i/lub kasety ekspresyjne) jest przydatny do konstruowania szczepów Neisseria meningitidis wytwarzających pęcherzyki ulepszone rekombinacyjne. Typowo, taki wektor zawiera co najmniej: (1) szkielet plazmidu
PL 211 037 B1 mogący mnożyć się w E. coli, ale nie w Neisseria meningitidis (plazmid samobójczy), (2) co najmniej jeden, ale korzystnie dwa regiony o homologii do kierowania integracją w miejscu chromosomowym takim jak porA, (3) wydajne sygnały transkrypcyjne (promotor, region regulatorowy i terminator) i translacyjne (zoptymalizowane miejsce wiązania rybosomu i kodon inicjacji) funkcjonalne w Neisseria meningitidis, (4) miejsce wielokrotnego klonowania i (5) wybieralny gen(y) umożliwiający utrzymanie plazmidu w E. coli i wybór integrantów w Neisseria meningitidis. Elementy dodatkowe obejmują, na przykład, sekwencje wychwytu dla ułatwienia wejścia obcego DNA do Neisseria meningitidis, i markery wybierane nawzajem takie jak sacB, rpsL, gltS dla zwiększenia częstości zdarzeń podwójnego crossing-over.
Schematyczny rysunek wektora skonstruowanego w tym przykładzie i oznaczonego pCMK przedstawiono na Figurze 3. Jego odpowiednią zupełną sekwencję nukleotydową pokazano na
SEKW. ID. NR: 1. pCMK pochodzi od szkieletu pSL1180 (PharmaciaBiotech, Szwecja), plazmidu o wysokiej liczbie kopii zdolnego do replikacji w E. coli, który zawiera gen bla (i przez to nadaje oporność na ampicylinę). Oprócz tego, pCMK funkcjonalnie zawiera dwa regiony oskrzydlające porA (porA5' i porA3' zawierające terminator transkrypcji) niezbędne dla rekombinacji homologicznej, marker wybieralny nadający oporność na kanamycynę, dwie sekwencje wychwytu, promotor chimeryczny porA/lacO ulegający represji w gospodarzu E. coli wyrażającym laclq, ale aktywny transkrypcyjnie w Neisseria meningitidis, i wielokrotne miejsce klonowania (5 obecnych miejsc: Ndel, KpnI, Nhel, PinAl i Sph1) niezbędne dla insercji obcego DNA do pCMK.
pCMK skonstruowano jak następuje. Regiony rekombinogenne porA5' i porA3', promotor porA/lacO poddano amplifikacji PCR, stosując oligonukleotydy podane w tabeli poniżej, sklonowano w pTOPO i zsekwencjonowano. Te fragmenty DNA kolejno wycinano z pTOPO i ponownie sklonowano w pSL1180. Kasetę oporności na kanamycynę wycięto z pUC4K (PharmaciaBiotech, Szwecja) i wprowadzono między region oskrzydlający porA5' i region promotora porA/lacO.
Tabela: Oligonukleotydy stosowane w tej pracy
Oligonukleotydy Sekwencja Uwaga(i)
1 2 3
PorA5' Fwd 5'-CCC AAG CTT GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC ATT CCT CA-3' miejsce klonowania HindIII Sekwencja wychwytu ( )
PorA5'Rev 5'-CGA TGC TCG CGA CTC CAG AGA CCT CGT GCG GGC C-3' miejsce klonowania NruI
PorA3' Fwd 5'-GGA AGA TCT GAT TAA ATA GGC GAA AAT ACC AGC TAC GA-3' miejsce klonowania BglII Kodony stop ( )
PorA3'Rev 5'-GCC GAA TTC TTC AGA CGG C GC AGC AGG AAT TTA TCG G-3' miejsce klonowania EcoRI Sekwencja wychwytu ( )
PoLa Rev1 5'-GAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TCC GGG CAA ACA CCC GAT AC-3'
PoLa Rev2 5'-GAA TTC CAT ATG ATC GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA TAA AAA CCT AAA AAC ATC GAA TTG TTA TCC GCT C-3' miejsce klonowania Ndel
PorAlacO Fwd 5'-AAG CTC TGC AGG AGG TCT GCG CTT GAA TTG-3' miejsce klonowania Pstl
PorAlacO Rev 5'-CTT AAG GCA TAT GGG CTT CCT TTT GTA A-3' miejsce klonowania Ndel
PPA1 5'-GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3'
PPA2 5'-GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3'
N-pełny-01: 5'-GGG AAT TCC ATA TGA AAA AAG CAC TTG CCA GAGS' miejsce klonowania Ndel
Nde-NspA-3: 5'-GGA ATT CCA TAT GTC AGA ATT TGA CGC GCA C-3' miejsce klonowania Ndel
PNS1 5'-CCG CGA ATT CGG AAC CGA ACA CGC CGT TCG-3' miejsce klonowania EcoRI
PNS1 5'-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3' miejsce klonowania Xbal
PL 211 037 B1 cd. tabeli
1 2 3
PorA5' Fwd 5'-CCC AAG CTT GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC ATT CCT CA-3' miejsce klonowania HindIII Sekwencja wychwytu ( )
PromD15-S2 5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3' miejsce klonowania Xbal
PNS4 5'-AGC TTT ATT TAA ATC CTT AAT TAA CGC GTC CGG AAA ATA TGC TTA TC 34 miejsca klonowania SwaI i PacI
PNS5 5'-AGC TTT GTT TAA ACC CTG TTC CGC TGC TTC Gees' miejsce klonowania Pmel
D15-S4 5'-GTC CGC ATT TAA ATC CTT AAT TAA GCA GCC GGA CAG GGC GTG G-3' miejsca klonowania SwaI i PacI
D15-S5 5'-AGC TTT GTT TAA AGG ATC AGG GTG TGG TCG GGC-3' miejsce klonowania Pmel
Przykład 3: Konstruowanie szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez zarówno polisacharydów otoczki jak i głównego immunodominującego antygenu PorA.
Modulowanie zawartości antygenowej pęcherzyków błony zewnętrznej może być korzystne przy polepszaniu ich bezpieczeństwa i skuteczności w ich zastosowaniu w szczepionkach, lub zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych. Składniki takie jak polisacharydy otoczki Neisseria meningitidis grupy surowiczej B powinny być usunięte dla wykluczenia ryzyka indukowania autoimmunizacji (patrz przykład 1). Podobnie, korzystne jest stłumienie immunodominacji głównych antygenów błony zewnętrznej takich jak PorA, który indukuje swoiste dla szczepu przeciwciała bakteriobójcze, ale nie może nadać ochrony krzyżowej. Dla zilustrowania takiego podejścia twórcy zastosowali wektor pCMK(+) do skonstruowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B pozbawionego zarówno polisacharydów otoczki jak i immunodominującego antygenu PorA błony zewnętrznej. W tym celu przy pomocy rekombinacji homologicznej wprowadzono delecję genu porA w szczepie H44/76 cps-, opisanym w Przykładzie 1.
Wytworzono kompetentny szczep H44/76 cps- i transformowano dwoma 2 ng super zwiniętego plazmidu DNA pCMK(+), jak opisano poprzednio. Porcje mieszaniny transformacyjnej (100 nl) naniesiono na płytki Muellera-Hintona uzupełnione kanamycyną (200 ng/ml) i inkubowane w temperaturze 37°C przez 24 do 48 godzin. Poddano selekcji kolonie oporne na kanamycynę, ponownie naniesiono na MH-Kn i hodowano przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37°C. Na tym etapie połowę hodowli bakteryjnej wykorzystano do wytworzenia roztworu podstawowego w glicerynie (15% obj.) i przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C. Inną frakcję (oszacowaną na 108 bakterii) ponownie zawieszono w 15 nl wody destylowanej, gotowano przez dziesięć minut i użyto jako szablon dla badań przesiewowych PCR. Zsyntetyzowano dwa porA startery wewnętrzne, nazwane PPA1 i PPA2, i zastosowano do przeprowadzenia amplifikacji PCR na gotowanych lizatach bakteryjnych w warunkach opisanych przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Stosowany cykl temperaturowy był następujący: 25 razy (94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Ponieważ podwójne crossing-over między pCMK DNA i chromosomowym miejscem porA usuwa region wymagany dla przyłączenia #1 i #2, to klony bez fragmentu 1170 bp amplifikowanego metodą PCR zostały poddane selekcji jako mutanty z delecją porA. Te wyniki PCR zostały dalej potwierdzone przez równoległą analizę obecności PorA w odpowiednich ekstraktach białka bakteryjnego. W tym celu, inną próbkę bakterii (oszacowaną na 5·108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 nl buforu PAGE-SDS (SDS 5%, gliceryna 30%, betamerkaptoetanol 15%, błękit bromofenolowy 0,3 mg/ml, Tris-HCl 250 mM pH 6,8), zagotowano (100°C), zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy i oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na żelu 12,5%. Następnie żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-PorA jak opisali Maniatis i in. Jak przedstawiono na Figurze 4, zarówno barwienie Coomassie jak i immunoodbitka potwierdziły, że klony porA PCR negatywne nie wytwarzają wykrywalnych poziomów PorA. Ten wynik potwierdza, że wektor pCMK jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do kierowania insercją DNA w genie porA, znosząc równocześnie wytwarzanie antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
PL 211 037 B1
Przykład 4: Regulacja w górę wytwarzania białka NspA błony zewnętrznej w pęcherzykach pochodzących z rekombinacyjnego szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów porA i cps.
Wzbogacanie pęcherzyków w antygeny ochronne jest korzystne dla polepszenia skuteczności i zakresu działania szczepionek opartych na białkach błony zewnętrznej. W tym kontekście, rekombinacyjne szczepy Neisseria meningitidis bez funkcjonalnych genów cps i porA zmodyfikowano tak, że regulowano w górę poziom ekspresji białka błony zewnętrznej NspA. W tym celu, gen kodujący NspA amplifikowano metodą PCR, stosując startery oligonukleotydowe N01-pełny-Ndel i Ndel-3' (patrz tabela w Przykładzie 2). Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Wykonywano następujący cykl termiczny: 25 razy (94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon strawiono Ndel i wstawiono w miejsce restrykcyjne Ndel wektora dostarczającego pCMK(+).
Sprawdzono orientację wstawki i rekombinacyjne plazmidy, oznaczone pCMK(+)-NspA, oczyszczono w dużej skali, stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 gg tego materiału zastosowano do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps (szczepu opisanego w Przykładzie 1). Integracje otrzymaną z podwójnego crossing-over między wektorem pCMK(+)-NspA i chromosomalnym miejscem porA poddano selekcji, stosując kombinację procedur przesiewowych PCR i Western blot przedstawiona w Przykładzie 3.
Porcję bakterii (odpowiadającą około 5·108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 gl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Następnie żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano przy użyciu surowicy poliklonalnej antyNspA. Zarówno barwienie Coomassie (danych nie pokazano) jak i immunoblotting (patrz Figura 4) potwierdziły, że klony PCR ujemne wobec porA nie wytwarzają wykrywalnych poziomów PorA. Ekspresje NspA sprawdzono w lizatach bakteryjnych z całych komórek (WCBL) lub w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej pochodzących z NmB [cps-, porA-] lub NmB [cps-, porA-, Nspa+]. Chociaż nie można było zaobserwować różnicy przy barwieniu Coomassie, to immunoblotting przy użyciu surowicy poliklonalnej anty-NspA wykrył 3-5 krotny wzrost ekspresji NspA (w odniesieniu do poziomu endogennego NspA), zarówno w WCBL jak i w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej (patrz Figura 5). Ten wynik potwierdza, że wektor pCMK(+)-NspA jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do regulacji w górę ekspresji białek błony zewnętrznej takich jak NspA, znosząc równocześnie wytwarzanie antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
Przykład 5: Regulacja w górę antygenu białkowego D15/Omp85 błony zewnętrznej w pęcherzykach pochodzących z rekombinacyjnego szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps ale wyrażającego PorA.
Pewne populacje ludzkie wydzielone geograficznie (takie jak Kuba) są zainfekowane przez ograniczoną liczbę izolatów Neisseria meningitidis należących w znacznym stopniu do jednego lub paru serotypów białek błony zewnętrznej. Ponieważ PorA stanowi główny antygen białkowy błony zewnętrznej indukujący ochronne i swoiste dla szczepu przeciwciała bakteriobójcze, to możliwe jest nadanie ochrony szczepionką przy użyciu ograniczonej liczby serotypów porA w szczepionce. W takim kontekście obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna, wzmacniając skuteczność szczepionki z takich ulepszonych rekombinacyjnie pęcherzyków. Takie szczepionki zawierające PorA, można jednak ulepszyć jeszcze dalej, zwiększając poziom innych reaktywnych krzyżowo OMP takich jak omp85/D15.
W następującym przykładzie, zastosowano wektor pCMK(+) do regulacji w górę ekspresji antygenu białkowego Omp85/D15 błony zewnętrznej w szczepie bez funkcjonalnych genów cps ale wyrażającego porA. W tym celu, gen kodujący Omp85/D15 amplifikowano metodą PCR, stosując startery oligonukleotydowe D15-Ndel i D15-NotI. Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Wykonywano następujący cykl termiczny: 25 razy (94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon wstawiono do wektora klonującego pTOPO zgodnie z instrukcją producenta i przeprowadzono sekwencjonowanie potwierdzające. Ten fragment DNA Omp85/D15 wycięto z pTOPO metodą hydrolizy restrykcyjnej, stosując Ndel/Nsil i z kolei sklonowano w odpowiednich miejscach restrykcyjnych wektora dostarczającego pCMK(+). Plazmidy rekombinacyjne, oznaczone pCMK( + )-D15, oczyszczono na dużą skalę, stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 gg tego materiału
PL 211 037 B1 zastosowano do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps (szczepu opisanego w Przykładzie 1). W celu zachowania ekspresji porA poddano selekcji integracje otrzymane z pojedynczego crossing-over (albo w Omp85/D15 albo w porA) przez połączenie procedur przesiewowych PCR i Western blot. Klony oporne na kanamycynę o dodatnim wyniku testu PCR specyficznego dla porA i Western blot przechowywano w temperaturze -70°C jako roztwór podstawowy w glicerynie i zastosowano do dalszych badań.
Próbkę bakterii (odpowiadającą około 5·108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 gl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Następnie żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-porA. Jak przedstawiono na Figurze 6, zarówno barwienie Coomassie i immunoblotting potwierdziły, że klony dodatnie w teście PCR porA wytwarzają PorA.
Ekspresję D15 sprawdzano przy użyciu preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej pochodzących z NmB [cps-, porA-] lub NmB [cps-, porA+, D15+]. Barwienie Coomassie wykryło znaczący wzrost ekspresji D15 (w odniesieniu do endogennego poziomu D15) preparatów (patrz Figura 6). Ten wynik potwierdził, że wektor pCMK(+)-D15 jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do regulacji w górę ekspresji białek błony zewnętrznej takich jak D15, bez zniesienia wytwarzania głównego antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
Przykład 6: Konstruowanie wszechstronnych wektorów dostarczających promotory
Uzasadnienie: Uzasadnienie tego podejścia jest przedstawione na Figurze 7 i może być streszczone w 7 zasadniczych etapach. Niektóre z tych etapów są zilustrowane poniżej przy konstruowaniu wektora dla regulacji w górę ekspresji NspA i D15/Omp85.
Wektor dla regulacji w górę ekspresji genu NspA.
Etap 1. Region DNA (997 bp) umiejscowiony przed genem kodującym NspA został odkryty (SEKW. ID. NR: 2) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Te startery oligonukleotydowe określane jako PNS1 i PNS2 (patrz tabela w Przykładzie 2) zostały zaprojektowane przy użyciu tej sekwencji i zsyntetyzowane. Te startery zastosowano do amplifikacji PCR, stosując genomowy DNA ekstrahowany ze szczepu H44/76. Etap 2. Odpowiednie amplikony oczyszczono stosując zestaw Wizard PCR (Promega, USA) i poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI/Xbal przez 24 godziny, stosując warunki opisane przez dostawcę (Boehringer Mannheim, Niemcy). Odpowiednie fragmenty DNA oczyszczono na żelu i wstawiono w odpowiednich miejscach wektora klonującego pUC18. Etap 3. Plazmidy rekombinacyjne wytworzono w dużej skali i próbkę frakcji zastosowano jako szablon dla odwróconej amplifikacji PCR. Odwrócona PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów PNS4 i PNS5, stosując następujące warunki cykli termicznych: 25 razy (94°C 1 min., 50°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Otrzymano zlinearyzowane wektory pUC18 mające delecję w regionie wstawki przed NspA.
Wektor dla regulacji w górę ekspresji genu D15/com85.
Etap 1. Region DNA (1000 bp) umiejscowiony przed genem kodującym D15/omp85 został odkryty (SEKW. ID. NR: 3) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Dwa startery oligonukleotydowe określane jako PromD15-51X i PromD15-S2 (patrz tabela w Przykładzie 2) zostały zaprojektowane przy użyciu tej sekwencji i zsyntetyzowane. Te startery zastosowano do amplifikacji PCR, stosując genomowy DNA ekstrahowany ze szczepu H44/76. Etap 2. Odpowiednie amplikony oczyszczono stosując zestaw Wizard PCR (Promega, USA) i poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI/Xbal przez 24 godziny w warunkach opisanych przez dostawcę (Boehringer Mannheim, Niemcy). Odpowiednie fragmenty DNA oczyszczono na żelu i wstawiono w odpowiednich miejscach wektora klonującego pUC18. Etap 3. Plazmidy rekombinacyjne wytworzono w dużej skali i próbkę frakcji użyto jako szablon dla odwróconej amplifikacji PCR. Odwróconą PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów D15-S4 i D15-S5, stosując następujące warunki cykli termicznych: 25 razy (94°C 1 min., 50°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Otrzymano zlinearyzowane wektory pUC18 mające delecję w regionie wstawki przed D15/omp85.
Przykład 7: Sposoby fermentacji do wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych.
Przykłady podane poniżej opisują sposoby wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych nie mających albo polisacharydów otoczki albo polisacharydów otoczki i PorA. Taką procedurę można
PL 211 037 B1 zastosować dla szerokiego zakresu szczepów rekombinacyjnych Neisseria meningitidis i można dostosować do rozszerzonego zakresu skali.
Pożywki do hodowli: szczepy Neisseria meningitidis grupy surowiczej B rozmnażano w stałej (FNE 004 AA, FNE 010 AA) lub ciekłej (FNE 008 AA) pożywce do hodowli. Te nowe pożywki do wzrostu meningokoków są korzystnie wolne od produktów zwierzęcych, i stanowią dalszy aspekt wynalazku.
Składniki FNE004 AA FNE 008 AA FNE 010 AA
Agar 18 g/L - 18 g/L
NaCl 6 g/L 6 g/L 6 g/L
Glutaminian Na - 1,52 g/L -
NaH2PO4^H2O 2,2 g/L 2,2 g/L 2,2 g/L
KCl 0,09 g/L 0,09 g/L 0,09 g/L
NH4CI 1,25 g/L 1,25 g/L 1,25 g/L
Glukoza 5 g/L 20 g/L 5 g/L
Ekstrakt drożdży UF - 2,5 g/L -
Pepton sojowy 5 g/L 30 g/L 5 g/L
CaC^2H2O 0,015 g/L - 0,015 g/L
MgSO47H2O 0,6 g/L 0,6 g/L 0,6 g/L
Erytromycyna 0,015 g/L - -
Kanamycyna - - 0,2 g/L
Hodowla w kolbie pęcherzyków rekombinacyjnych cps- Neisseria meningitidis grupy surowiczej B:
Przeprowadzono to w dwóch etapach obejmujących hodowlę wstępną na pożywce stałej, a następnie hodowle ciekłą. Stała hodowla wstępna. Fiolkę posiewanego materiału wyjęto z zamrażarki (-80°C), rozmrożono do temperatury pokojowej i 0,1 mL rozprowadzono na szalce Petriego zawierającej 15 mL FNE004AA (patrz wyżej). Szalkę Petriego inkubowano w temperaturze 37°C przez 18 ± 2 godziny. Materiał rosnący na powierzchni ponownie zawieszono w 8 mL FNE008AA (patrz wyżej) uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. Hodowla w kolbie. 2 mL ponownie zawieszonej stałej hodowli wstępnej dodano do 2-litrowej kolby zawierającej 400 mL FNE008AA uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. Kolbę umieszczono na wytrząsarce (200 obr/min) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 16 ± 2 godziny. Komórki oddzielono od bulionu hodowlanego przez odwirowanie przy 5000 g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
Hodowla okresowa pęcherzyków rekombinacyjnych cps-, Neisseria meningitidis grupy surowiczej B: Przeprowadzono ją w trzech etapach obejmujących hodowlę wstępną na pożywce stałej, hodowlę ciekłą i hodowlę okresową. Stała hodowla wstępna. Fiolkę posiewanego materiału wyjęto z zamrażarki (-80°C), rozmrożono do temperatury pokojowej i 0,1 mL rozprowadzono na szalce Petriego zawierającej 15 mL FNE004AA (patrz wyżej). Szalkę Petriego inkubowano w temperaturze 37°C przez 18 ± 2 godzin. Materiał rosnący na powierzchni ponownie zawieszono w 8 mL FNE008AA (patrz wyżej) uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. Ciekła hodowla wstępna. 2 mL ponownie zawieszonej stałej hodowli wstępnej dodano do jednej 2-litrowej kolby zawierającej 400 mL FNE008AA uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. Kolbę umieszczono na wytrząsarce (200 obr/min) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 16±2 godziny. Zawartość kolby zastosowano do inokulacji 20-litrowego fermentora. Hodowla okresowa w fermentorze. Inokulum (400 mL) dodano do wysterylizowanego 20-litrowego fermentora (objętość całkowita) zawierającego 10 L FNE008AA uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny pH doprowadzono do i utrzymywano przy 7,0 przez automatyczne dodawanie NaOH (25% wag./obj.) i H3PO4 (25% obj.). Temperaturę regulowano przy wartości 37°C. Szybkość napowietrzania utrzymywano przy 20 L powietrza/min i stężenie rozpuszczonego tlenu utrzymywano przy 20% nasycenia przez regulację szybkości mieszania. W fermentorze utrzymywano nadciśnienie 300 g/cm2.
PL 211 037 B1
Po upływie 9±1 godziny hodowla była w fazie stacjonarnej. Komórki oddzielono od bulionu hodowlanego przez odwirowanie przy 5000 g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
Hodowla w kolbie pęcherzyków rekombinacyjnych cps-, PorA- Neisseria meningitidis grupy surowiczej B:
Przeprowadzono to w dwóch etapach obejmujących hodowlę wstępną na pożywce stałej, a następnie hodowlę ciekłą. Stała hodowla wstępna. Fiolkę posiewanego materiału wyjęto z zamrażarki (-80°C), rozmrożono do temperatury pokojowej i 0,1 mL rozprowadzono na szalce Petriego zawierającej 15 mL FNE010AA (patrz wyżej). Szalkę Petriego inkubowano w temperaturze 37°C przez 18±2 godzin. Materiał rosnący na powierzchni ponownie zawieszono w 8 mL FNE008AA (patrz wyżej) uzupełnionej dodatkiem 200 mg/L kanamycyny. Hodowla w kolbie. 2 mL ponownie zawieszonej stałej hodowli wstępnej dodano do 2-litrowej kolby zawierającej 400 mL FNE008AA uzupełnionej dodatkiem 200 mg/L kanamycyny. Kolbę umieszczono na wytrząsarce (200 obr/min) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 16±2 godziny. Komórki oddzielono od bulionu hodowlanego przez odwirowanie przy 5000 g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
Przykład 8: Izolowanie i oczyszczanie pęcherzyków z meningokoków pozbawionych otoczki polisacharydowej
Pęcherzyki rekombinacyjne oczyszczano jak opisano poniżej. Pastę komórek (42 g) zawieszono w 211 ml buforu pH 8,6 0,1M Tris-Cl zawierającego 10 mM EDTA i 0,5% dezoksycholinianu sodu (DOC). Proporcja buforu do biomasy wynosiła 5/1 (wag./obj.). Biomasę ekstrahowano przez mieszanie magnetyczne przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ekstrakt całkowity odwirowano przy 20000 g przez 30 minut w temperaturze 4°C (13000 obr/min w rotorze JA-20, wirówka Beckman J2-HS). Pastylkę odrzucono. Supernatant ultrawirowano przy 125000 g przez 2 godziny w temperaturze 4°C (40000 obr/min w rotorze 50.2Ti, ultrawirówka Beckman L8-70M) w celu zatężenia pęcherzyków. Supernatant odrzucono. Pastylkę łagodnie zawieszono w 25 ml 50 mM Tris-Cl buforu pH 8,6 zawierającego 2 mM EDTA, 1,2% DOC i 20% sacharozy. Po drugim etapie ultrawirowania przy 125000 g przez 2 godziny w temperaturze 4°C, pęcherzyki łagodnie zawieszono w 44 ml 3% sacharozy i przechowywano w temperaturze 4°C. Wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji i oczyszczania pęcherzyków zawierały 0,01% tiomersalate. Jak zobrazowano na Figurze 8, ta procedura daje preparaty białkowe wysoce wzbogacone w białka błony zewnętrznej takie jak PorA i PorB.
Przykład 9: Identyfikacja promotorów bakteryjnych przydatnych do regulacji w górę genów kodujących antygeny
Zastosowanie silnych bakteryjnych promotorowych elementów jest zasadniczo ważne dla uzyskania regulacji w górę genów kodujących białka błony zewnętrznej. W tym kontekście, twórcy wykazali poprzednio, że regulacja w górę genów Neisseria meningitidis nspA, hsf, i omp85 przy użyciu promotora pora umożliwiła izolowanie pęcherzyków rekombinacyjnych wzbogaconych w odpowiednie białka NspA, Hsf i Omp85. Alternatywy dla promotora porA mogą być przydatne dla uzyskania różnych poziomów regulacji w górę, dla przezwyciężenia potencjalnej zmiany faz porA i/lub dla osiągnięcia warunkowej ekspresji genu (promotory regulowane przez żelazo). Opisany niniejszym sposób umożliwia identyfikację precyzyjnego transkrypcyjnego miejsca startu elementów będących silnymi promotorami prawdopodobnie nadających bakteriom wyższy poziom ekspresji. Skoro promotorowe elementy regulatorowe są klasycznie objęte zakresem 200 bp przed i 50 bp za miejscem +1 (Collado-Vides J, Magasanik B, Gralla JD, 1991, Microbiol Rev 55 (3) : 371-94), to wynik takiego doświadczenia umożliwia zidentyfikowanie fragmentów DNA mających około 250 bp niosących silne aktywności promotorów. Główne białka błony zewnętrznej takie jak PorA, PorB i Rmp z Neisseria meningitidis, P1, P2, P5 i P6 z Haemophilus influenzae, OmpCD i OmpE z Moraxella catarrhalis, jak również niektóre cytoplazmatyczne i/lub regulowane przez żelazo białka tych bakterii posiadają elementy będące silnymi promotorami. Dla sprawdzenia tej ogólnej metodologii twórcy zmapowali transkrypcyjne miejsce startu silnych promotorów porA i porB z Neisseria meningitidis, stosując szybką amplifikację elementów cDNA (5' RACE).
Zasady 5' RACE są następujące: 1) Całkowita ekstrakcja RNA przy użyciu zestawu QIAGEN „RNeazy. Usunięcie DNA genomowego przez działanie DNazą, a następnie oczyszczanie QTAGEN;
2) Odwrotna transkrypcja mRNA przy użyciu specyficznego dla porA startera 3'-końcowego (nazwanego porA3). Oczekiwana wielkość cDNA: 307 nt. Usunięcie RNA metodą hydrolizy alkalicznej;
3) Ligacja jednoniciowej kotwicy oligo DNA (nazwanej DT88) do 3' końca cDNA przy użyciu ligazy RNA T4. Oczekiwana wielkość produktu: 335 nt. Amplifikacja cDNA ligowanego z kotwicą stosując a combination of hemi-nested PCR; 4) Amplifikacja PCR cDNA ligowanego z kotwicą przy użyciu star30
PL 211 037 B1 tera kotwiczącego o sekwencji komplementarnej jako startera 5' końcowego (nazwanego DT89) i startera 3' końcowego (nazwanego p1-2), który leży wewnątrz 3' końca startera RT porA3. Oczekiwana wielkość produktu: 292 bp; 5) Amplifikacja PCR poprzednich produktów PCR przy użyciu DT89 jako startera 5' końcowego i p1-1 jako startera 3' końcowego (wewnątrz p1-2). Oczekiwana wielkość produktu: 211 bp; i 6) Sekwencjonowanie ze starterem p1-1 (oczekiwane wielkości produktów można obliczyć, ponieważ miejsce startu transkrypcji porA jest znane: 59 nt przed miejscem startu translacji „ATG).
Procedura doświadczalna
Całkowity RNA ekstrahowano w przybliżeniu z 109 komórek szczepu cps- porA+ Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Ekstrakcję 1 ml hodowli ciekłej o właściwej gęstości optycznej (OD600=1) przeprowadzono stosując zestaw QIAGEN „RNAeasy zgodnie z instrukcją producenta. DNA chromosomowe usunięto przez dodanie 10U DNazy wolnej od RNazy (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) do 30 gl eluowanego RNA i inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 min. RNA wolny od DNA oczyszczono stosując ten sam zestaw QIAGEN zgodnie z instrukcją.
Reakcje odwrotnej transkryptazy przeprowadzono stosując starter porA3 i 200U odwrotnej transkryptazy SUPERSCRIPT II (Life Technologies). Reakcje RT przeprowadzono w objętości 50 gl zawierającej: 5 gl 2mM dNTP, 20 pmol startera porA3, 5 gl buforu 10X SUPERSCRIPT II, 9 gl 25 mM MgCl2, 4 gl 0,1M DTT, 40U rekombinacyjnego inhibitora rybonukleazy i 1 gg całkowitego RNA. Starter PorA3 chłodzono etapami (70°C przez 2 min, 65°C przez 1 min, 60°C przez 1 min, 55°C przez 1 min, 50°C przez 1 min, i 45°C przez 1 min) przed dodaniem SUPERSCRIPT II. Reakcję RT przeprowadzono w temperaturze 42°C przez 30 min, a następnie wykonano 5 cykli (50°C przez 1 min, 53°C przez 1 min i 56°C przez 1 min) dla destabilizowania struktury drugorzędowej RNA. Przeprowadzono dwie równoległe reakcje, pomijając odwrotną transkryptazę w jednej z reakcji jako ujemnej próbce kontrolnej.
RNA usunięto przez alkaliczne rozszczepianie hydrolityczne z dodatkiem 1 gl 0,5M EDTA, a następnie 12,5 gl 0,2 M NaOH przed inkubacją w temperaturze 68°C przez 5 min. Reakcje zobojętniono dodając 12,5 gl 1 M Tris-HCl (pH 7,4) i strącano dodatkiem 20 gg glikogenu (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy), 5 gl 3M octanu sodu i 60 gl izopropanolu. Obie próbki ponownie zawieszono w 20 gl 10:1 TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8).
Ligazę RNA T4 stosowano do kotwiczenia 5'-fosforylowanego, zablokowanego na 3' końcu przez ddCTP kotwiczącego oligonukleotydu DT88 (patrz tabela poniżej). Dwie równoległe ligacje przeprowadzono przez noc w temperaturze pokojowej, przy czym każda zawierała: 1,3 gl 10X buforu ligazy RNA (Roche Molecular Biochemicals), 0,4 gM DT88, 10 gl cDNA albo próbki kontrolnej RT i 3U ligazy RNA T4. Jako ujemne próbki kontrolne, przeprowadzono drugi zestaw reakcji ligacji, pomijając ligazę RNA T4. Otrzymane mieszaniny po reakcji ligacji stosowano wprost bez oczyszczanie w następnej PCR.
cDNA ligowany z kotwicą amplifikowano stosując kombinację podejść pół-zagnieżdżonego i gorącego startu PCR dla zwiększenia specyficzności i wydajności produktu. Cztery osobne PCR pierwszej rundy przeprowadzono na reakcji RT/ligazy i próbach kontrolnych w objętości 30 gl, przy czym każda zawierała: 3 gl bufora 10X Taq Platinium, 3 gl 25 mM MgCl2, 1 gl 10 mM dNTP, 10 pmol każdego ze starterów i 1 gl odpowiedniej reakcji ligacji RNA. PCR startowano na gorąco przez zastosowanie polimerazy DNA Taq Platinium (Life Technologies) (dodano 2U). Pierwszą PCR na zakotwiczonej ligacji (LA-PCR) przeprowadzono stosując 10 pmol zarówno starter specyficzny dla kotwicy DT89 jak i starter specyficzny dla transkryptu p1-2 (patrz tabela poniżej), który znajduje się wewnątrz 3' końca startera RT porA3. PCR przeprowadzono stosując początkowo 95°C przez etap 5 min (dla aktywacji polimerazy DNA), a następnie 10 cykli w temperaturze 95°C przez 10 s i 70°C przez 1 min (zmniejszając o jeden stopień na cykl), 15 cykli w temperaturze 95°C przez 10 s i 60°C przez 1 min. Drugą pół-zagnieżdżoną LA-PCR przeprowadzono w tych samych warunkach, stosując starter DT89 i starter wewnętrzny p1-2, razem z 10 pmol p1-1 (patrz tabela poniżej) i 1 gl PCR z pierwszej rundy. Produkty amplifikacji przed poddaniem sekwencjonowaniu oczyszczono stosując zestaw QIAGEN „QIAquick PCR purification zgodnie z instrukcją producenta.
Do sekwencjonowania produktów RACE PCR użyto zestawu CEQ™ Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman, Francja), stosując 10 pmol startera p1-1. Reakcje sekwencjonujące przeprowadzono zgodnie z załączoną instrukcją, a produkty sekwencjonowania analizowano urządzeniem Ceq2000 DNA Analysis System (Beckman-Coulter).
PL 211 037 B1
DT88 5' GAAGAGAAGGTGGAAATGGCGTTTTGGC 3'
DT89 5' CCAAAACGCCATTTCCACCTTCTCTTC 3'
porA3 5' CCAAATCCTCGCTCCCCTTAAAGCC 3'
P1-2 5' CGCTGATTTTCGTCCTGATGCGGC 3'
P1-1 5' GGTCAATTGCGCCTGGATGTTCCTG 3'
Wyniki dla promotora porA Neisseria meningitidis
Start transkrypcji dla porA-mRNA z Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (szczep H44/76) zmapowano 59 bp przed kodonem startu ATG, stosując opisaną procedurę 5'-RACE. Ten wynik potwierdza mapowanie przeprowadzone metodą przedłużenia startera i opublikowane przez van der Ende i in. (1995). Ten wynik popiera tezę, że fragment DNA zawierający nukleotydy -9 do -259 w odniesieniu do ATG porA jest przydatny do kierowania silną ekspresją genu w Neisseria meningitidis i ewentualnie w innych gatunkach bakteryjnych, takich jak Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
Wyniki dla promotora porB Neisseria meningitidis
Tę samą strategię doświadczalna zastosowano do mapowania miejsca startu transkrypcji porB z Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (szczep H44/76). Startery podane w tabeli poniżej odpowiadają starterowi 3' końcowemu RT (porB3), starterowi specyficznemu dla transkrypcji, który jest wewnątrz porB3 (porB2) oraz wewnątrz porB2 (porB1). porB3, porB2 i porB1 są zlokalizowane odpowiednio 265 bp, 195 bp i 150 bp za kodonem startowym ATG.
porB1 5' GGTAGCGGTTGTAACTTCAGTAACTT 3'
porB2 5' GTCTTCTTGGCCTTTGAAGCCGATT 3*
porB3 5' GGAGTCAGTACCGGCGATAGATGCT 3'
Stosując startery porB1 i DT89 otrzymano amplikon PCR ~200 bp przez wykonanie mapowania 5'-RACE. Ponieważ porB1 znajduje się 150 bp od kodonu startowego ATG porB, ten wynik popiera tezę, że transkrypcyjne miejsce startu porB znajduje się około 50 bp (+/- 30 bp) przed ATG porB.
Dokładny nukleotyd odpowiadający inicjacji transkrypcji jest obecnie ustalany przez sekwencjonowanie DNA. Powyższy wynik PCR popiera tezę, że fragment DNA zawierający nukleotydy -1 do -250 w odniesieniu do kodonu startowego ATG porB jest przydatny do kierowania silną ekspresją genu w Neisseria meningitidis i ewentualnie w innych gatunkach bakteryjnych, takich jak Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
Przykład 10: Regulacja w górę genu Omp85 z N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora.
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu D15/com85 przez silny promotor porA w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu D15/Omp85. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (1000 bp) umiejscowiony przed genem kodującym D15/omp85 został odkryty (SEKW. ID. NR: 3) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Główne etapy tej procedury są przedstawione na Figurze 9. W skrócie, fragment DNA (1000 bp) obejmujący nukleotydy -48 do -983 w odniesieniu do kodonu startowego (ATG) genu D15/Omp85 amplifikowano metodą PCR, stosując oligonukleotydy ProD15-51X (5'-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC GTT G-3') i ProD15-52 (5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3') zawierające odpowiednio miejsca restrykcyjne EcoRI i Xbal (podkreślone). Ten fragment poddano restrykcji i wstawiono do plazmidu pUC18 poddanego restrykcji tymi samymi enzymami. Otrzymany konstrukt poddano mutagenezie in vitro, stosując układ Genome Priming (przy użyciu plazmidu donorowego pGPS2) sprzedawany przez New England Biolabs (MA, USA). Poddano selekcji klony mające wstawiony mini-transpozon (pochodzący z Tn7 i zawierający gen oporności na chloramfenikol). Wydzielono jeden klon zawierający wstawkę mini-transpozonu zlokalizowaną w regionie 5' oskrzydlającym D15/Omp85, 401 bp za miejscem EcoRI i zastosowano do dalszych badań. Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528-534) w celu (i) usunięcia powtórzonej sekwencji DNA (Tn7R) wytworzonej w procesie transpozycji, (ii) wstawienia meningokokowych sekwencji wychwytu wymaganych dla transformacji, i (iii) wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających
PL 211 037 B1 klonowanie obcego materiału DNA takiego jak promotory. Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy TnRD15-KpnI/XbaI + US (5'-CGC CGG TAC CTC TAG AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACA ACC C-3') i TnR03Cam(KpnI) (5'-CGC CGG TAC CGC CGC TAA CTA TAA CGG TC-3') zawierające sekwencje wychwytu i podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (KpnI i Xbal). Otrzymany fragment PCR oczyszczono na żelu, strawiono przy użyciu Asp718 (izoschizomeru KpnI) i ligowano do fragmentu DNA 184 bp zawierającego promotor porA i generowanego metodą PCR przy użyciu oligonukleotydów PorA-01 (5'-CGC CGG TAC CGA GGT CTG CGC TTG AAT TGT G-3') i PorA02 (5'-CGC CGG TAC CTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') zawierających miejsca restrykcyjne KpnI. Poddano selekcji rekombinacyjne klony mające promotor porA wstawiony w prawidłowym położeniu (transkrypcja zachodząca w kierunku EcoRI do Xbal) i zastosowano do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez polisacharydu otoczki (cps-) i jednego z głównych białek błony zewnętrznej - PorA (porA-). Rekombinacyjne klony Neisseria meningitidis otrzymane z podwójnego crossing-over (badanie przesiewowe PCR przy użyciu oligonukleotydów Cam-05 (5'-GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3') i proD15-52) poddano selekcji na pożywce GC zawierającej 5 ąg/ml chloramfenikolu i analizowano ekspresję D15/Omp85. Jak przedstawiono na Figurze 10, w porównaniu ze szczepem macierzystym (cps-), w ekstraktach białka całkowitego ze szczepów Nm otrzymanych przez zastąpienie promotora wytwarzanie D15/Omp85 było znacznie zwiększone. Ten wynik zaobserwowano także, gdy analizowano pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone z tych samych szczepów (patrz Figura 17). Te wyniki można przypisać zastąpieniu endogennego promotora D15 przez silny promotor porA. Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono, że, kiedy promotor porA wprowadzono w przybliżeniu 400 bp przed kodonem inicjatorowym, to ekspresja była w przybliżeniu 50 razy większa niż gdy promotor umieszczono w przybliżeniu 100 bp przed kodonem inicjatorowym. Ogółem, te doświadczenia popierają tezę, że strategia zastąpienia promotora działa i umożliwia regulację w górę syntezy integralnych białek błony zewnętrznej w pęcherzykach błony zewnętrznej.
Pewne populacje ludzkie wydzielone geograficznie (takie jak Kuba) są zainfekowane przez ograniczoną liczbę izolatów Neisseria meningitidis należących w znacznym stopniu do jednego lub kilku serotypów białek błony zewnętrznej. Jako że PorA stanowi główny antygen białkowy błony zewnętrznej, który może indukować ochronne i swoiste dla szczepu przeciwciała bakteriobójcze, to możliwe w takiej populacji może być uzyskanie ochrony szczepionką przy użyciu ograniczonej liczby serotypów porA. Ponadto, PorA może oddziaływać z, albo stabilizować niektóre inne białka błony zewnętrznej. W tym kontekście, obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna, wzmacniając skuteczność szczepionki z takich pęcherzyków ulepszonych rekombinacyjnie.
Z tej przyczyny, pożądane może być regulowanie w górę ekspresji białka D15/Omp85 błony zewnętrznej w szczepie Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającym PorA. Genomowy DNA ekstrahowano z rekombinacyjnego szczepu cps-, porA-, D15/Omp85+ Neisseria meningitidis grupy surowiczej B przy użyciu zestawu QIAGEN Genomie Tips 100-G. 10 ąg tego materiału zlinearyzowano i zastosowano do transformowania Neisseria meningitidis grupy surowiczej B cps- po klasycznej procedurze transformacji. Rekombinacyjne Neisseria otrzymano na płytkach agaru GC zawierających 5 ąg/ml chloramfenikolu.
Integracje otrzymane z podwójnego crossing-over przed genem D15 przesiano metodą PCR, jak opisano poprzednio. Skoro rekombinacje homologiczne mogą wystąpić w chromosomie gdziekolwiek, przeprowadzono drugie badanie przesiewowe PCR dla kontroli integralności miejsca porA w szczepie rekombinacyjnym. W tym celu, w doświadczeniu przesiewowym PCR zastosowano wewnętrzne startery porA PPA1 (5- GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C -3') i PpA2 ( 5- GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3'). Amplifikacja fragmentu 1170 bp potwierdza obecność genu porA w bakteriach rekombinacyjnych.
Próbkę bakterii rekombinacyjnych (odpowiadającą około 5·108 bakterii) można ponownie zawiesić w 50 ąl buforu PAGE-SDS, zamrozić (-20°C)/zagotować (100°C) trzy razy, a następnie oddzielić metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Żele można następnie zabarwić błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przenieść na błonę nitrocelulozową i sondować albo przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-porA albo przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego antyD15/Omp85. Można także przeprowadzić analizę pęcherzyków błony zewnętrznej wytworzonych z tych samych szczepów.
Przykład 11: Regulacja w górę antygenu białka Hsf w szczepie rekombinacyjnym Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps ale wyrażającym PorA.
PL 211 037 B1
Jak opisano wyżej, w pewnych krajach obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna, i może wzmocnić skuteczność szczepionki z pęcherzyków ulepszonych rekombinacyjnie. W następującym przykładzie, twórcy zastosowali zmodyfikowany wektor pCMK(+) do regulacji w górę ekspresji antygenu białka Hsf w szczepie bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającym PorA. Oryginalny wektor pCMK(+) zawiera chimeryczny promotor porA/lacO ulegający represji w gospodarzu E. coli wyrażającym lacIq, ale transkrypcyjnie aktywny w Neisseria meningitidis. W zmodyfikowanym pCMK(+), natywny promotor porA zastosowano do kierowania transkrypcją genu hsf. Gen kodujący Hsf amplifikowano metodą PCR, stosując startery oligonukleotydowe HSF 01-Ndel i HSF 02-NheI, przedstawione w tabeli poniżej. Ze względu na sekwencję startera HSF 01-NdeI wyrażane białko Hsf będzie zawierać dwie reszty metioniny na 5' końcu. Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Cykle temperaturowe były następujące: 25 razy (94°C 1 min., 48°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon z kolei sklonowano w odpowiednich miejscach restrykcyjnych wektora dostarczającego pCMK(+). W tym plazmidzie rekombinacyjnym, oznaczanym pCMK(+)-Hsf, lacO obecny w chimerycznym promotorze porA/lacO usunięto metodą rekombinacyjnej strategii PCR (patrz Figura 12). Plazmid PCMK(+)-Hsf stosowany jako szablon di PCR amplifikuje 2 oddzielne fragmenty DNA:
- fragment 1 zawiera region 5' rekombinogenny porA, gen oporności na kanamycynę i promotor porA. Stosowane startery oligonukleotydowe, RP1(SacII) i RP2, są przedstawione w tabeli poniżej. Starter RP1 jest homologiczny z sekwencją tuż przed operatorem lac.
- fragment 2 zawiera sekwencję Shine-Dalgarno z genu porA, gen hsf i region 3' rekombinogenny porA. Stosowane startery oligonukleotydowe, RP3 i RP4(ApaI), są przedstawione w tabeli poniżej. Starter RP3 jest homologiczny z sekwencją tuż za operatorem lac. 3' koniec fragmentu 1 i 5' koniec fragmentu 2 mają 48 nakładających się zasad. Po 500 ng każdej PCR (1 i 2) użyto do końcowej reakcji PCR, stosując startery RP1 i RP4. Końcowy otrzymany amplikon subklonowano w wektorze pSL1180 poddanym restrykcji przy użyciu SacII i Apal. Zmodyfikowany plazmid pCMK(+)-Hsf oczyszczono w dużej skali, stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 gg tego materiału zastosowano do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps (szczep opisany w Przykładzie 1). W celu zachowania ekspresji porA, integrację otrzymaną z pojedynczego crossing-over poddano selekcji przez połączenie procedur przesiewowych PCR i Western blot. Klony oporne na kanamycynę o dodatnich wynikach testów dla PCR specyficznej wobec porA i Western blot przechowywano w temperaturze -70°C jako roztwór podstawowy w glicerynie i zastosowano do dalszych badań. Próbkę bakterii (odpowiadająca około 5·108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 gl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Ekspresje Hsf sprawdzono w lizatach bakteryjnych z całych komórek (WCBL) pochodzących z NmB [Cps-, PorA+] lub NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. Barwienie Coomassie wykryło znaczący wzrost ekspresji Hsf (w odniesieniu do poziomu Hsf endogennego) (patrz na Figurze 13). Ten wynik potwierdza, że zmodyfikowany wektor pCMK(+)-Hsf jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do regulacji w górę ekspresji białek błony zewnętrznej, bez zniesienia wytwarzania głównego antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
Oligonukleotydy wykorzystane w tej pracy
Oligonukleotydy Sekwencja Uwaga(i)
1 2 3
Hsf 01-Nde 5'-GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAA AAT ATA CCG C-3' miejsce klonowania Ndel
Hsf 02-Nhe 5'-GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACT GAT AAC CGA C-3' miejsce klonowania NheI
GFP-mut-Asn 5'-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3' miejsce klonowania Asn I zgodne z Ndel
GFP-Spe 5'-GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG-3' miejsce klonowania Spel zgodne z Nhel
RP1 (SacII) 5'-TCC CCG CGG GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC-3' miejsce klonowania SacII
PL 211 037 B1 cd. tabeli
1 2 3
RP2 5'-CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA GGG CAA ACA CCC GAT ACG TCT TCA-3'
RP3 5'-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG-3'
RP4(Apal) 5'-GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGA CGG CGC AGC AGG-3' miejsce klonowania Apal
Przykład 12: Ekspresja białka fluoryzującego na zielono w szczepie rekombinacyjnym Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps ale wyrażającym PorA.
W następującym przykładzie, wektor pCMK zastosowano do testowania ekspresji cytopl azmatycznego białka heterologicznego w Neisseria meningitidis. Białko fluoryzujące na zielono (GFP) amplifikowano z plazmidu pKen-Gfpmut2 ze starterami GFP-Asn-mut2 i GFP-Spe (patrz tabela w Przykładzie 11). AsnI daje lepkie końce zgodne z Ndel, Spel daje lepkie końce zgodne z Nhel. Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Cykle temperaturowe były następujące: 25 razy (94°C 1 min, 48°C 1 min, 72°C 3 min) i 1 raz (72°C 10 min, 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon sklonowano w wektorze wprowadzającym pCMK(+) strawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Nhel. W tym plazmidzie rekombinacyjnym, oznaczonym pCMK(+)-GFP, metoda strategii rekombinacyjnej PCR usunięto lacO obecny w chimerycznym promotorze porA/lacO. Plazmid PCMK(+)-GFP stosowano jako szablon do amplifikacji PCR 2 oddzielnych fragmentów DNA:
- fragment 1 zawierał region 5' rekombinogenny porA, gen oporności na kanamycyne i promotor porA. Stosowano startery oligonukleotydowe, RPI(SacII) i RP2 (patrz tabela w Przykładzie 11). Starter RP1 jest homologiczny z sekwencją tuż przed operatorem lac.
- fragment 2 zawiera sekwencję Shine-Dalgarno PorA, gen gfp i region 3' rekombinogenny porA. Stosowane startery oligonukleotydowe, RP3 i RP4 (ApaI), są przedstawione w tabeli w Przykładzie 11. Starter RP3 jest homologiczny z sekwencją tuż za operatorem lac.
3' koniec fragmentu 1 i 5' koniec fragmentu 2 mają 48 nakładających się zasad. Po 500 ng każdej PCR (1 i 2) użyto do końcowej reakcji PCR, stosując startery RP1 i RP4. Dwadzieścia gg tego fragmentu PCR zastosowano do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps.
Transformacja liniowym DNA jest mniej skuteczna, niż kołowym plazmidem DNA, ale wszystkie otrzymane rekombinanty uległy podwójnemu crossing-over (co potwierdzono kombinacją procedur przesiewowych PCR i Western blot). Klony oporne na kanamycynę przechowywano w temperaturze -70°C jako roztwór podstawowy w glicerynie i zastosowano do dalszych badań. Próbkę bakterii (odpowiadającą około 5·108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 gl buforu PAGESDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu.
Ekspresję GFP sprawdzono w lizatach bakteryjnych z całych komórek (WCBL) pochodzących z NmB [Cps-, PorA+] lub NmB [Cps-, PorA-, GFP+]. Barwienie Coomassie wykryło ekspresję GFP nieobecnego w szczepie biorcy Neisseria meningitidis (patrz Figura 14).
Przykład 13: Regulacja w górę genu NspA z N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu NspA przez silny promotor porA, w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu NspA. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (924 bp) umiejscowiony przed genem kodującym NspA został odkryty (SEKW. ID. NR: 7) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Fragment DNA (675 bp) obejmujący nukleotydy -115 do -790 w odniesieniu do kodonu startowego (ATG) genu NspA amplifikowano metodą PCR, stosując oligonukleotydy PNS1' (5'-CCG CGA ATT CGA CGA AGC CGC CCT CGA C-3') i PNS2 (5'-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3') zawierające odpowiednio miejsca restrykcyjne EcoRI i Xbal (podkreślone). Fragment PCR poddano restrykcji przy użyciu EcoRI i Xbal, i wstawiono do pUC18. Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer
PL 211 037 B1 (1992), Biotechniques 12: 528-534) w celu wstawienia meningokokowych sekwencji wychwytu wymaganych dla transformacji, i odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA. Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy BAD01-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCT TAT CGA TGG AAA ACG CAG C-3') i BAD02-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT AGT GGA TTA AC-3') zawierające sekwencje wychwytu i podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Xmal i Xhol). Otrzymany fragment PCR oczyszczono na żelu i strawiono przy użyciu Xhol. Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery oligonukleotydowe BAD 15-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') i BAD 03-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCA CTA GTA TTA CCC TGT TAT CCC-3') zawierające podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Xmal, Xbal, SpeI i Xhol). Otrzymany fragment PCR poddano trawieniu i wstawiono do kołowego plazmidu PCR strawionego odpowiednimi enzymami. 10 ąg rekombinacyjnego plazmidu zlinearyzowano i użyto do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez polisacharydu otoczki (cps-) i jednego z głównych białek błony zewnętrznej - PorA (porA-). Rekombinacyjne klony Neisseria meningitidis otrzymane z podwójnego crossing-over (przesiewanie PCR przy użyciu oligonukleotydów BAD 25 (5'-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3') i BAD08 (5'-CTT AAG CGT CGG ACA TTT CC-3') poddano selekcji na płytkach agarowych GC zawierających 5 ąg/ml chloramfenikolu i analizowano ekspresję NspA. Próbkę bakterii rekombinacyjnych (odpowiadającą około 5·108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 ąl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Następnie żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano albo przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-PorA lub przy użyciu przeciwciała poliklonalnego antyNspA (Figura 17). Podobnie jak dla Omp85, uzyskano niespodziewane wskazanie, że insercja promotora w przybliżeniu 400 bp przed kodonem inicjatorowym NspA wyraża więcej białka niż w razie umieszczenia w przybliżeniu 100 bp przed kodonem inicjatorowym.
Ten sam rekombinacyjny plazmid pUC można zastosować do regulacji w górę ekspresji NspA w szczepie Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnego genu cps ale wciąż wyrażającym PorA.
Przykład 14: Regulacja w górę genu pldA (omplA) N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora.
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu pldA (omplA) przez silny promotor porA w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu PldA (OmplAl). W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (373 bp) umiejscowiony przed sekwencją kodującą pldA został odkryty (SEKW. ID. NR: 18) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą próbny gen rpsT. Kodon stop rpsT jest umiejscowiony 169 bp przed ATG pldA. Dla uniknięcia przerwania tego potencjalnie ważnego genu, twórcy zdecydowali, żeby wstawić kasetę promotorową CmR/PorA tuż przed ATG pldA. W tym celu, fragment DNA wielkości 992 bp odpowiadający genowi rpsT, sekwencji międzygenowej 169 bp i pierwszym 499 nukleotydom genu pldA amplifikowano metodą PCR z DNA genomowego Neisseria meningitidis grupy surowiczej B, stosując oligonukleotydy PLA1 Amo5 (5'-GCC GTC TGA ATT TAA AAT TGC GCG TTT ACA G-3') i PLA1 Amo3 (5'-GTA GTC TAG ATT CAG ACG GCG CAA TTT GGT TTC CGC AC-3') zawierające sekwencje wychwytu (podkreślone). PLA1 Amo3 zawiera także miejsce restrykcyjne Xbal. Ten fragment PCR oczyszczono stosując zestaw High Pure Kit (Roche, Mannheim, Niemcy) i sklonowano bezpośrednio do wektora pGemT (Promega, USA). Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992)) w celu wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA. Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy CIRC1-Bgl (5'CCT AGA TCT CTC CGC CCC CCA TTG TCG-3') i albo CIRC1-XH-RBS/2 (5'-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3') albo CIRC2-XHO/2 (5'-CCG CTC GAG ATG AAT ATA CGG AAT-3'), zawierające podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (BglII i Xhol). Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') i CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GC-3') zawierające podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Bglll i Xhol). Ten fragment PCR sklono36
PL 211 037 B1 wano w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRC1-Bgl i CIRC1-XHRBS/2. Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepów (cps-) i (cps- porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pldA skieruje wstawkę promotora porA bezpośrednio przed ATG pldA.
Inną kasetę amplifikowano z DNA genomowego rekombinacyjnej Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (cps-, porA-, D15/Omp85+) nadmiernie wyrażającej D15/Omp85 przez zastąpienie promotora. Ta kaseta zawiera gen cmR, promotor porA i 400 bp odpowiadających sekwencji oskrzydlającej 5' genu D15/Omp85. Ta sekwencja okazała się skuteczna do regulacji w górę ekspresji D15/Omp85 w Neisseria i zostanie przetestowana na możliwość regulacji w górę ekspresji innych antygenów Neisseria. Startery stosowane do amplifikacji to BAD 20 i CM-PORAD15/3 (5'-CGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3') zawierające miejsca restrykcyjne Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowano w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRC1-Bgl i CIRC2-XHO/2. Ten plazmid zostanie użyty do transformowania szczepów (cps-) i (cps-, porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pldA skieruje wstawkę promotora porA 400 bp przed ATG pldA.
Przykład 15: Regulacja w górę genu tbpA N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora.
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu pro motorowego genu tbpA przez silny promotor porA, w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu TbpA. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (731 bp) umiejscowiony przed sekwencją kodującą tbpA został odkryty (SEKW. ID. NR: 17) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą antygen TbpB. Geny są zorganizowane w operonie. Gen TbpB zostanie usunięty i zastąpiony przez kasetę promotorową CmR/porA. W tym celu, fragment DNA wielkości 3218 bp odpowiadający 509 bp regionu oskrzydlającego 5' genu tbpB, 2139 bp sekwencji kodującej tbpB, 87 bp sekwencji intergenowej i 483 pierwszym nukleotydom sekwencji kodującej tbpA amplifikowano metodą PCR z DNA genomowego Neisseria meningitidis grupy surowiczej B, stosując oligonukleotydy BAD16 (5'-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3') i BAD17 (5'-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') zawierające sekwencje wychwytu oraz miejsca restrykcyjne Nhel i Hindlll (podkreślone). Ten fragment PCR oczyszczono stosując zestaw High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Niemcy) i sklonowano bezpośrednio do wektora w pGemT (Promega, USA). Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992)) w celu (i) wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA i (ii) usunięcia 209 bp sekwencji oskrzydlającej 5' tbpB i sekwencji kodującej tbpB. Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3') i BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Xmal, Bglll i Xhol (podkreślone). Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery BAD21 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') i BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Xmal, SpeI, Bglll i Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowano w kołowym plazmidzie PCR. Ten plazmid zostanie użyty do transformowania szczepów (cps-) i (cps-porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed tbpA skieruje insercję promotora porA bezpośrednio przed ATG tbpA.
Przykład 16: Regulacja w górę genu pilQ z N. meningitidis grupy surowiczej B gene przez zastąpienie promotora.
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu pilQ przez silny promotor porA, w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu PilQ. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (772 bp) umiejscowiony przed genem kodującym pilQ został odkryty (SEKW. ID. NR: 12) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą antygen PilP. Gen pilQ stanowi część operonu, którego twórcy nie chcieli zaburzyć, gdyż piliny są zasadniczo ważnymi elementami bakterii. Kasetę promotorową
PL 211 037 B1
CmR/porA wprowadzono przed genem pilQ zgodnie z taką samą strategią, jak opisano dla regulacji w górę ekspresji genu pldA. W tym celu, fragment DNA wielkości 866 bp odpowiadający części 3' sekwencji kodującej pilP, 18 bp sekwencji intergenowej i 392 pierwszym nukleotydom genu pilQ amplifikowano metodą PCR z DNA genomowego Neisseria grupy surowiczej B, stosując oligonukleotydy PQ-rec5-Nhe (5'-CTA GCT AGC GCC GTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3') i PQ-rec3-Hin (GCC AAG CTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3') zawierające sekwencje wychwytu oraz miejsca restrykcyjne Nhel i Hindlll (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowano bezpośrednio w wektorze pGemT (Promega, USA). Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992)) w celu wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA. Kołową PCR przeprowadzono, stosując oligonukleotydy CIRC1-PQ-Bgl (5'-GGA AGA TCT AAT GGA GTA ATC CTC TTC TTA-3' ) i albo CIRC1-PQ-XHO (5'-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA TTA CCA AAC TGA CAA AAA TC-3' ) albo CIRC2-PQ-X (5'-CCG CTC GAG ATG AAT ACC AAA CTG ACA AAA ATC-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Bglll i Xhol (podkreślone). Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') i CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Bglll i Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowano w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CTRC1-PQ-Bgl i CIRC1-PQ-XHO. Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepów (cps-) i (cps-, porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pilQ skieruje wstawkę promotora porA bezpośrednio przed ATG pilQ.
Inną kasetę amplifikowano z genomowego DNA rekombinacyjnej Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (cps-, porA-, D15/Omp85+) nadmiernie wyrażającej D15/Omp85, przez zastąpienie promotora. Ta kaseta zawiera gen cmR, promotor porA i 400 bp odpowiadających sekwencji oskrzydlającej 5' gen D15/Omp85. Ta sekwencja okazała się skuteczna do regulacji w górę ekspresji D15/Omp85 w Neisseria meningitidis i zostanie przetestowana na okoliczność regulacji w górę ekspresji innych antygenów Neisseria. Starterami stosowanymi do amplifikacji były BAD 20 i CM-PORA-D153 (5'-GGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3') zawierające miejsca restrykcyjne Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowano w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRC1-PQ-Bgl i CIRC2-PQ-X. Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepów (cps-) i (cps-, porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pilQ skieruje wstawkę porA 400 bp przed ATG pilQ.
Przykład 17: Konstruowanie kasety kanR/sacB do wprowadzania „czystych”, nie znakowanych mutacji w chromosomie N. meningitidis.
Celem doświadczenia jest skonstruowanie wszechstronnej kasety DNA zawierającej marker wybieralny do dodatniego przesiania rekombinacji w chromosomie Neisseria meningitidis (tj.: gen kanR), i marker przeciw-wybieralny do usunięcia kasety z chromosomu po rekombinacji (tj.: gen sacB). Tym sposobem, jakikolwiek heterologiczny DNA wprowadzony podczas rekombinacji homologicznej zostanie usunięty z chromosomu Neisseria.
Fragment DNA zawierający gen neoR i gen sacB wyrażany pod kontrolą swojego własnego promotora otrzymano przez restrykcję plazmidu pIB 279 (Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI (1991), Mol Microbiol 5:1447-57) przy użyciu enzymu restrykcyjnego BamHI. Wektor biorca pochodził z plazmidu pCMK, opisanego poprzednio. Gen kanR został usunięty z pCMK metoda, restrykcji enzymami Nrul i EcoRV. Ten plazmid nazwano pCMKs. Kasetę neoR/sacB wstawiono do pCMKs w miejscu restrykcyjnym Bglll zgodnym z końcami BamHI.
E. coli zawierająca plazmid nie jest zdolna do wzrostu w obecności 2% sacharozy w pożywce, co potwierdza funkcjonalność promotora sacB.
Ten plazmid zawiera sekwencje rekombinogenne umożliwiające inercje kasety w miejscu porA w chromosomie Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Rekombinacyjne Neisseria otrzymano na płytkach agarowych GC zawierających 200 gg/ml kanamycyny. Niestety, promotor sacB nie był funkcjonalny w Neisseria meningitidis: nie zaobserwowano różnicy wzrostu na płytkach agarowych GC zawierających 2% sacharozy.
Skonstruowano nową kasetę zawierającą gen sacB pod kontrolą promotora kanR. Kołową PCR przeprowadzono stosując jako szablon plazmid pUC4K ((Amersham Pharmacia Biotech,
PL 211 037 B1
USA)) oraz oligonukleotydy CIRC-Kan-Nco (5'-CAT GCC ATG GTT AGA AAA ACT CAT CGA GCA TC-3') i CIRC-Kan-Xba (5'-CTA GTC TAG ATC AGA ATT GGT TAA TTG GTT G-3') zawierające Ncol i Xbal miejsca restrykcyjne (podkreślone). Otrzymany fragment PCR oczyszczono na żelu, strawiono przy użyciu Ncol i ligowano do genu sacB wytworzonego przez PCR z plazmidu pIB279 przy użyciu oligonukleotydu SAC/NCO/NEW5 (5'-CAT GCC ATG GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3') zawierającego miejsce restrykcyjne Ncol (podkreślone) i RBS (wytłuszczone) i oligonukleotydu SAC/NCO/NEW3 (5'-GAT CCC ATG GTT ATT TGT TAA CTG TTA ATT GTC-3') zawierającego miejsce restrykcyjne Ncol (podkreślone). Można testować czułość rekombinacyjnych klonów E. coli na płytkach agarowych zawierających 2% sacharozy. Nowa kasetę kanR/sacB można subklonować w pCMKs i zastosować do transformowania szczepu cps- Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Nabyta wrażliwość na sacharozę zostanie potwierdzona u Neisseria. Plazmid PCMKs będzie stosowany do transformowania rekombinacyjnej kanR/SacB Neisseria dla usunięcia całej kasety wprowadzonej w chromosomie w miejscu porA. Czysta rekombinacyjna Neisseria zostanie otrzymana na płytkach agarowych GC zawierających 2% sacharozy.
Przykład 18: Zastosowanie małych sekwencji rekombinogennych (43 bp) dla umożliwienia rekombinacji homologicznej w chromosomie Neisseria meningitidis.
Celem doświadczenia jest zastosowanie małych sekwencji rekombinogennych (43 bp) do sterowania insercjami, modyfikacjami lub delecjami w chromosomie Neisseria. Osiągniecie tego doświadczenia ogromnie ułatwi przyszłą pracę, w sensie uniknięcia etapów subklonowania sekwencji homologicznych w E. coli (sekwencje rekombinogenne wielkości 43 bp można łatwo dodać w starterze amplifikacji PCR). Gen kanR amplifikowano metodą PCR z plazmidu pUC4K z oligonukleotydem Kan-PorA-5 (5'-GCC GTC TGA ACC CGT CAT TCC CGC GCA GGC GGG AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CC A CGT TGT GTC-3') zawierającym 43 bp homologiczne do sekwencji oskrzydlającej 5' gen porA NmB (wytłuszczone) oraz sekwencje wychwytu (podkreślone) i Kan-PorA-3 (5'-TTC AGA CGG CGC AGC AGG AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTG AGG TCT GCC TCG-3') zawierającym 43 bp homologiczne do sekwencji oskrzydlającej 3' gen porA NmB (wytłuszczone) i sekwencję wychwytu (podkreślone). Otrzymany fragment DNA 1300 bp sklonowano w wektorze pGemT (Promega, USA). Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepu cps- Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Rekombinacyjne Neisseria zostaną otrzymane na płytkach GC zawierających 200 gg/ml kanamycyny. Integracje otrzymane z podwójnego crossing-over w miejscu porA będą badane przesiewowo PCR, przy użyciu starterów PPA1 i PPA2, jak opisano poprzednio.
Przykład 19: Czynna ochrona myszy immunizowanych WT i rekombinacyjnymi pęcherzykami Neisseria meningitidis
Zwierzęta immunizowano trzy razy (drogą śródotrzewnową) przy użyciu 5 gg rozmaitych OMV zaadsorbowanych na Al(OH)3 w dniach 0, 14 i 28. Krew pobierano dnia 28 (dzień 14 po II) i 35 (dzień 7 po III), i zwierzęta poddano prowokacji w dniu 35 (drogą śródotrzewnową). Dawka prowokująca wynosiła 20 x LD50 (~107 jednostek tworzenia kolonii/mysz). Śmiertelność monitorowano przez 7 dni po prowokacji.
Wstrzykiwanymi OMV były:
Grupa 1: pęcherzyki Cps-, PorA+
Grupa 2: pęcherzyki Cps-, PorAGrupa 3: pęcherzyki Cps -, PorA-, NspA+
Grupa 4: pęcherzyki Cps-, PorA-, Omp85+
Grupa 5: pęcherzyki Cps-, PorA-, Hsf+
Figura 15 ilustruje wzór tych OMV uzyskany metoda. SDS-PAGE.
Po 24 godzinach od prowokacji, śmiertelność wynosiła 100% (8/8) w ujemnej grupie kontrolnej (immunizowanej samym Al(OH)3), podczas gdy myszy immunizowane 5 różnymi preparatami OMV były wciąż żywe (przeżywało 7 do 8/8 myszy).
Przez 7 dni monitorowano także chorobę i myszy immunizowane pęcherzykami o nadmiernej ekspresji NspA wydawały się mniej chore niż inne grupy. PorA obecny w pęcherzykach PorA+ prawdopodobnie nadaje rozległą ochronę przeciwko infekcji przez szczep homologiczny. Jednak, ochrona indukowana przez pęcherzyki o regulowanej w górę ekspresji PorA jest prawdopodobnie, co najmniej w pewnym stopniu, skutkiem obecności zwiększonej ilości NspA, Omp85 lub Hsf.
PL 211 037 B1
Przykład 20: Immunogenność pęcherzyków rekombinacyjnych zmierzona testami ELISA dla całych komórek i specyficznymi
W celu zmierzenia zdolności przeciwciał do rozpoznawania antygenów obecnych na powierzchni komórek MenB, zebrane razem surowice myszy (z Przykładu 19) testowano metoda ELISA dla całych komórek (stosując komórki inaktywowane tetracykliną), i miana wyrażano jako miana punktów środkowych. Wszystkie typy przeciwciał pęcherzykowych indukowały wysokie miano przeciwciał, zaś ujemna próba kontrolna była wyraźnie ujemna.
Pęcherzyk WCE (H44/76) miano punktu środkowego
14P2 14P3
CPS (-) PorA (+) 23849 65539
CPS (-) PorA (-) 20130 40150
CPS (-) PorA (-) NSPA (+) 8435 23846
CPS (-) PorA (-) OMP85 (+) 4747 16116
CPS (-) porA (-) HSF (+) 6964 22504
(-) 51 82
Zbadano specyficzną odpowiedź przeciwciał na dostępne białko rekombinacyjne HSF. Mikropłytki pokryto cząsteczkami HSF o pełnej długości, 1 gg/ml.
Wyniki zobrazowane na Figurze 16 pokazują, że następowała dobra swoista odpowiedź HSF, gdy OMV nadmiernie wyrażające HSF zastosowano do immunizowania myszy (stosując oczyszczony rekombinacyjny HSF na płytkach). Pęcherzyki o nadmiernej ekspresji HSF indukują dobry poziom przeciwciał specyficznych.
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 1
Sekwencja nukleotydowa wektora pCMK(+)
TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTGCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGT
AATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGGAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA
AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAMTCGACGCTCAAGTCAGAGG
TGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCT
GCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCETGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCIGTAGGTATCTCA
GTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGSACCCCCCGTTCAGCCGGACCGCTGCGCCTTATCCGGT
AACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGC
GAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCT
GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCASACAAACCACCGCTGGTAGCGGT
GGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTC
TGACGCTCAGTGGAACGAAŁACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTT
TAAATTAAAAATGAAGITTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGT
GAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACG
GGAGGGCTTACCATCIGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATITATCAGCAATAA
ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCAICCAGTCTATIAATIGTTGCEGG
GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTC
GTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCtGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATCATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAG
CGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTG
CATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATCCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACICAACCAAGTCATTCTGAGAATA
GTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTIX3CCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGC
TCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGiAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATOGAGTTCGATGTAACCCACT
CGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGC
AAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTAITGAAGCATTTATCAGG
GTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA
AAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCG
TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTGTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGG
ATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCA
PL 211 037 B1
GAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAAT
CAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTG
TTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGC
GATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCA7\ATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAA
AGGGAGCCCCCGATTTAGA'3CTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGG
GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCA.CCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGC
GCGTACTATGGTIGCTITG.ACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCAT
TCGCCATTCAGGCTGCGCSACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGG
ATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGC
TTGCCGTCTGAATACATCCCGTCATIGCTCAAAAACAGAAAACCAAAATCAGAAACCTAAAATCCCGTCATTCCCGCGCA
GGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATTCCTGCTGCTTTTCATTTCTAGATTCCCACTTTCGTG
GGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTTTCCGATAAATTCTTGAGGCATTGAAATTCTAGATTCCCGCCTGCGCGGGAA
TGACGGCTGTAGATGCCCŁATGGTCTTTATAGCGGATTAACAA7\PATCAGGACAAGGCGACGAAGC0GCAGACAGTACAG
ATAGTACGGAACCGATICACTTGGTGCTICAGCACCTTAGAGAńTCGTTCTCTTTGńGCTAAGGCGAGGCAACGCCGTAC
TTGTTTTTGTTAATCCACTATAAAGTGCCGCGTGTGTTTTTTTATGGCGTTTTAAAAAGCCGAGACTGCATCCGGGCAGC
AGCGCATCGGOCCGCACGAGGTCTCTGGAGTCGCGAGCA.TCAAGGGCGAATTCTGCAGGGGGGGGGGGGAAAGCCACGTT
GTGTCTGAAAATCTCTGATGTTACATTGCAGAAGATAAAAATATATGATCAIGAAGAATAAAACTGTCTGCTTACATAAA
CAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATG
CTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCC
GATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCC.AATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTG
GCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGA
TCCCCGGGAAAAGAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTC
CTGCGCCGGTTCCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATC
ACGAATGAATAACGGTITGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAG
AAATGCATAAGCTTTTGCGATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGAC
GAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAA
CTGCCTCGGIGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAAT
TGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTG
ACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAAC
PL 211 037 B1
GCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTC
CCCCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGC
GCCCCCCCCCCCCTGCAGGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGrTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCTATTGTTT
TATATCAAAATATAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGCGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGTTTTTTGCGGG
GGGGGGGGTATAATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCGATGTITTTAGGTTTTTA
TCAAATTTACAAAAGCAAGCCCATATGCATCCTAGGCCTATTAATATTCCGGAGTATACGTAGCCGGCTAACGTTAACAA ccggtacctctagaactatagctagcatgcgcaaatttaaagcgctgatatcgatcgcgcgcagatctgattaaaiaggc
GAAAATACCflGCTACGAICAAATCATCGCCGGCGTTGATrATGATTTTTCCAAACGCACTTCCGCCATCGTGTCTGGCGC
TTGGCTGAAACGCAAIACCGGCATCGGCAACIACAGTCAAATTAATGCCGCCTCCGTCGGTTTGCGCCACAAAITCTAAA
TATCGGGGCGGTGAAGCGGATAGCTTTGTTTTTGACGGCrTCGCCTTCATTCTTTGATTGCAATCTGACTGCCAATCTGC
TTCAGCCCCAAACAAAAACCCGGATACGGAAGAAAAACGGCAATAAAGACAGCAAATACCGTCTGAAAGATTTTCAGACG
GTATTTCGCATTTTIGGCTTGGTTTGCACATATAGTGAGACCTTGGCAAAAATAGTCTGITAACGAAATTTGACGCATAA
AAATGCGCCAAAAAATTTTCAATTGCCTAAAACCTTCCTAATATTGAGCAAAAAGTAGGAAAAATCAGAAAAGTTITGCA
TTTTGAAAATGAGA.TTGAGCATAAAATTTTńGTAACCTArGTTATTGCAAAGGTCTCGAATTGTCATlCCCACGCAGGCG
GGAATCTAGTCTGTiCGGTTTCAGTTATTTCCGATAAATrCCTGCTGCGCCGTCTGAAGAATTCGTAATCATGGTCATAG
CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGG
TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTGACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGC
TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTIGCGTAITGGGCGC
SEKW. ID. NR: 2
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (997 bp) przed genem NspA w szczepie Z2491 Neisseria meningitidis grupy surowiczej A.
GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGG
TACACGGCGCGCTGGAAJGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCAC
AACTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCGCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCAT
CGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAACCGACCGAGCGAAGCCGTCGAACGCA
AAACCGTCGCCGCCGAAGATTTGCCGTTCGAATTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGGCGTACCCACCGCGATG
TTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAAC
CGACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGAOGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTA
PL 211 037 B1
ACAAAAACCAGTACCr^GTTGCCTCGCCITAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGT
TCCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCSCTATATAAGCGCAAACAAATCG
GCGGCCGCCCGGGAAAACCCCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGG
GCGTTTCAGACGGCACASCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAAAACCGTATGCCTGCAC
CTGCAACAATCCGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCAAGTTTCACCCATCCGCCGCGTGATGCCGCCACCA
CCATTTAAAGGCAACGCGCGGGTTAACGGCTTTGCCG
SEKW. ID. NR: 3
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem D15/OmpS5 w szczepie ATCC13090 Neisseria meningitidis grupy surowiczej B.
ACCATTGCCGCCCGCGCCGGCTTCCAAAGCiGGCGACAAAATACAATCCGTCAACGGCACACCCGTTGCAGATTGGGGCAG
CGCGCAAACCGAAATCGTCCTCAACCTCGAAGCCGGCAAAGTCGCCGTCGGGTTCAGACGGCATCAGGCGCGCAAACCGT
CCGCACCATCGATGCCGCAGGCACGCCGGAAGCCGGTAAAATCGCAAAAAACCAAGGCTACATCGGACTGATGCCCTTTA
AAATCACAACCGTIGCCGGTGGCGTGGAAAAAGGCAGCCCCGCCGAAAAAGCAGGCCTGAAACCGGGCGACAGGCTGACT
GCCGCCGACGGCAAACCCATTACCTCATGGCAAGAATGGGCAAACCTGACCCGCCAAAGCCCCGGCAAAAAAATCACCCT
GAACTACGAACGCGCCGGACAAACCCATACCGCCGACATCCGCCCCGATACTGTCGAACAGCCCGACCACACCCtGATCG
GGCGCGTCGGCCTCCGTOCGCHGCCGGACAGGGCGTOGGACGCGCAAATOCGCCGCAGCTACCGTCCGrCTGTTATCCGC
GCATTCGGCATGGGCTGGGAAAAAACCGTTTCCCACTCGTGGACAACCCTCAAATTTTTCGGCAAACTAATCAGCGGCAA
CGCCTCCGTCAGCCATATTTCCGGGCCGCTGACCATTGCCGACATTGCCGGACAGTCCGCCGiAACTCGGCTTGCAAAGTT
ATTTGGAATTITIGGCACTGGTCAGCATCAGCCTCGGCGIGCIGAACCIGClGCCCGTCCCCGTTtrGGACGGCGGCCAC
CTCGTGTTTTATACTGCCGAAIGGAIACGCGGCAAACCTTTGGGCGAACGCGTCCAAAACATCGGTTTGCGCTICGGGCT
TGCCCTCATGATGCTGATGATGGOGGTCGCCTTCTTCAACGACGTTACCCGGCTGCTCGGTTAGATTTTACGTTrCGGAA
TGCCGTCTGAAACCGCATTCCGCACCACAAGGAACTGACA
SEKW. ID. NR: 4
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem podobnym do Hsf z Neisseria meningitidis
ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACECAACGCAACAGGAAtTTATCGGAAAAAACAGAAACCTCACCGCCGtCATTC
CCGCAAAAGCGGGAATCTAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTAtCAGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATrCCCGC
PL 211 037 B1
AAASGCGGGAATCCAGACWGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGATTCCACGTCCTAGATTCCCG
CTTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAGATTATGGGAATTTATCAGGAATGATTGAATCCATAGAAAAACCACAGGAATCTA
TCAGAAAAAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGG
AAAAAACCGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGTTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAA
AAACAGAAACCCCCACCGCGTCATICCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAAC
A.GAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGCAACCGAAAAACCACAGGAATCTATCAGCAAAAACAG aaacx)cccaccgaccgtcattcccgcgcaggcgqgaatccagaaacacaacgcggcaggactttatcggaaaaaacagaa
ACCOCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACC
CCACTGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGAT
TCCACGTCCCAGATICCCGCCTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAAGTTGGGGGAATTTATCAGAAAACCCCCAACCCCCA
AAAACCGGGCGGATGCCGCACCATCCGCCCCCAAACCCCGATTTAACCATTCAAACAAACCAAAAGAAAAAACAAA
SEKW. ID. NR: 5
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (772 bp) przed genem PilQ z Neisseria meningitidis
GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAAT
CATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGC
AGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCT
GGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAA
TCATACCTTTCCAAGCACCTACCCIGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCeCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGAC
TTCGGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTAITAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAG
TTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGICTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCT
ACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAAC
GAGCTGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGA
ACAAGCGGCAGCACC TGCCGCAGAACAAAAT1'AAGAAGAGGATTACTCCATT
SEKW. ID. NR: 6
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Hap z Neisseria meningitidis
GTGCGGCAAAAAACAGCAAAAGCCCGCTGTCGATTGCC1GACCGTCCGCGTCCGTAAAATCAGCATAGGTTGCCACGCGC
PL 211 037 B1
GGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGATATGCGTATCACGCCCACGCCGCC
GCGCECGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCG
AITATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCGCAAAAATGCTIGATAAATCDGTC
CGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCTTCCTGCTCGGTATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTT
CCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAAGATCGGCGGCGATTTTCAACGCGCCArAG
AGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAACCGTCGTCAAATCCCCGGAGCTTG
TCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATTCGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCC
GACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAAC'GGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCGGTCCG
GCACGAAACCATAOGGCAAGACCAAACCITCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTTCATCAGCGTCATCCTGATACrGC
TUTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCGGCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCG
GGIGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTAGGGCGTGCTIGIATATCCGCCCGA
ACGCCGAACCGCACATATJtGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCICCCAAACAAACCCGAATCCCG
TCAGATAAGGAAAAATA
SEKW, ID. NR: 7
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (924 bp) przed genem NspA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090)
GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGAOGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGG
TACACGGCGCGCTGGAAGGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCAC
AATTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCTCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCAT
CGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAGCCAACCGAGTGAAGCCGTCGAAOGCA
AAACCGTTGGCGCCGAAGATTTGCCGTTTGAGTTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACOGACGCGTACCCGCCGCGATGT
TGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAAICGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAACC
GACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGACGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTAA
CAAAAACCAGTACGGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGAITCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTT
CCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATATAAGCGCAAACAAATCGG
CGGCCGCCCGGGAAAACCCGCCCCGAACGCGTCCGGAAAATAIGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGG
GCGTTTCAGACGGCACAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAACCGTATGCCTGCACCT
GCAACAATCGGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCA
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 8
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FrpB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
AAGTGGGAATCTAAAAATGAAAAGCAACAGGAATTTATCGGAAATGACCGAAACTGAACGGACTGGATTCCCGCTTTCGC gggaatgacggcgacagggttgctgttatagtggatgaacaaaaaccagtacgtcgttgcctcgccttagctcaaagaga
ACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTCCTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCT
GATTTCTGTTCGTTTTCGGTTAITCCCGATAAATTACCGCCGTTTCTCGTCATTTCTTTAACCCTTCGTCATIGCCGCGC
AGGCGGGAATCTAGTTTTTTTGAGTTCCAGTTGTTTCTGATAAATTCTTGCAGCTT7GAGTTCCTAGATICCCACTTTCG
TGGGAATGACGGTGGAAAAGTTGCCGTGATTTCGGATAAATTTTCGTAACGCATAATTTCCGTTTTACCCGATAAATGCC
CGCAATCTCAAATCCCGTCATTCCCCAAAAACAAAAAATCAAAAACAGAAATATCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCT
AGACTTTAGAACAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGAA
TTTTAGGTTTCTGTITTIGGTTTTCTGTCCTTGCGGGAATGATGAAATTTTAAGTTTTAGGAATTIATCGGAAAAAACAG
AAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCACAGGCTTCGTCATTCCCGCGCAGGCTTCGTCATTCCCGCATTTGTTAATCCACTA
TATTCCCGCCGTTTITIACATTTCCGACAAAACCTGTCAACAAAAAACAACACTICGCAAATAAAAACGATAATCAGCIT
TGCAAAAATCCCCCCCCCCTGTTAATATAAATAAAAATAATTAATTAATTATTTTTCTTATCCTGCCAAATCTTAACGGT
TTGGATTTACTTCCCTTCATACACTCAAGAGGACGATTGA
SEKW. ID. NR: 9
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FrpA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
CTATAAAGATGTAAATAAAAATCTCGGTAACGGTAACACITTGGCTCAGCAAOGCAGCTACACCAAAACAGAOGGTACAA
CCGCAAAAATGGGGGATTTACTTTTAGCAGCCGACAATCTGCACAGCEGCTltACGM.CAAAATGCTArCCATTAGCCAT
GTTCGGGAAAACACGATTTCCCCGTTTGTTT7AGGCTGTCTAAACAAATAACCATAAATGTATATCATTATTTAAAATAA
ATAAAAGTATTTAACTATTATTGACGAAATTTTAGAGAAAGAGTAGACTGTCGATTAAATGACAAAGAATAGTGAGAAAG
GAAATATTTACTATCCGAGCACAGAGCATATTTTAGGTAGCCTGTAACTGTTCCTGCTGGCGGAAGAGGATGAAGGTGGA
CTTACCCGAGAATAAATGTCCTGTTGTGTGATATGGATGCCATGCCGCGAAGCAATTGATGCAATCACGGCAGTCCTACT
TGAATGAAACCTGTCGTTGCAGAATITGAAAACGCTATTITTAAGAAAGGATAAAGGGAGAAAGAATTTTTGGTTTTTAA
GCTGCATGAAACCGIGTTGGAAIAAATGCACACCTACGATAATTAATAATTTTCGTTTTTrATICIACAAGCTATTTATA
TATGATTGCTAAAftGTTTATTTTTTAGATGCCAAAAAATATATTTTATATACTTCATATTGTTTATATGTCTTTATTTGA
PL 211 037 B1
ATATATCTTACGATGGGGAAATATTTATATATTTTATAATAAATTTTACTCATTTGCTAATATGTCATGGAATATTACTT
GTATTTTGTAGAATTTTTCCATATGAAAATATTCCATTTACTATTTTTGTGAACTTTATTAGTTTATTTTTAATATTITT
ACCTCTTATATTTACCATAAGAGAGCTAATTGATTCATATTATATTGAGTCGATAATTAATTTATTCTTAATTTTAATTC
CTCACGTTATTTTTTTAAT TTACTTGAAAGGAAAGCAGAT
SEKW. ID. NR: 10
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FrpC z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GGAAACAGAGAAAAAAGTTTCTCTTCTATCTTGGATAAATATATTTACCCTCAGTTTAGTTAAGTATTGGAATTTATACC rAAGTAGTAAAAGTTAGTAAATTATTTTTAACTAAAGAGTTAGTATCTACCATAATATATTCTTTAACTAATTTCTAGGC
TTGAAATTATGAGACCATATGCTACTACCATTTATCAACTTTTTATTTTGTTTATTGGGAGTGTTTTTACTATGACCTCA
TGTGAACCTGTGAATGAAAAGACAGATCAAAAAGCAGTAAGTGCGCAACAGGCTAAAGAACAAACCAGTTTCAACAATCC
CGSGCCAATCACAGGATTTGAACATACGGTTACATTTGATTTTCAGGGCACCAAAATGGTTATCCCCTATGGCTATCTTG
CACGGTATACGCAAGACAATGCCACAAAATGGCTTTCCGACACGCCCGGGCAGGATGCTTACTCCATTAATTIXS.TAGAG
ATTAGCGTCTATTACAAAAAAACCGACCAAGGCTGGGTTCTTGAGCCATACAACCAGCAAAACAAAGCACACTTTATCCA
ATTTCTACGCGACGGTTTGGATAGCGTGGACGATATTGTTATCCGAAAAGATGCGTGTAGTTTAAGTACGACTATGGGAG
AAAGATTGCTTACTTACGGGGTTAAAAAAATGCCATCTGCCTATCCTGAATACGAGGCTTATGAAGATAAAAGACATATT
CCTGAAAATCCATATTTTCATGAATTTTACTATATTAAAAAAGGAGAAAATCCGGCGATTAITACTCAICGGAATAATCG
AATAAACCAAACTGAAGARGATAGTTATAGCACTAGCGTAGGTTCCTGTATTAACGGTTTCACGGTACAGTATTACCCGT
TTATTCGGGAAAAGCAGCAGCTCACACAGCAGGAGTTGGTAGGTTATCACCAACAAGTAGAGCAATTGGTACAGAGTTTT
GTAAACAAT TCAAATAAAAAATAATTTAAAGGATCTTATT
SEKW. ID. NR: 11
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Omp85 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ACGTCCGAACCGTGATTCCGCAACGCCGCGCCCAAAACCAAAGCCCAAGCCAAAATGCCGATATAGTTGGCATTGGCAAT
CGCGTTAATOGGGTTGGCGACCAGGTTCATCAGCAGCGATTTCAAGACTTCGACAATGCCGGAAGGCGGCGCGGCGGACA
CATCGCCCGCGGCCGCCAAAACAATGTGCGTCGGGAAAACCATACCGGCGATGACGGCGGTCAGGGCTGCGGAAAACGTA
CCAATGAGGTAAAGGATGATAATCGGCCTGATATGCGCCTTGTTGCCTTTTTGGTGCTGCGCGATTGTGGCCGCCACCAA
AATAAATACCAAAACCGGCGCGACCGCTTTGAGCGCGCCGACAAACAGGCTGCCGAACAAGCCTGCCGCCAAGCCCAGTT
PL 211 037 B1
GCGGGGAAACCGAACOGATTACGATGCCCAACGCCAAACCGGCGGCAATCTGCCTGACCAGGCTGACGCGGCCGATCGCA
TGAAATAAGGATTTGCCGAACGCCATAATTCTTCCTTATGTTGTGATATGTTAAAAAATGTTGIATTTTAAAAGAAAACT
CATTCTCTGTGTTTTTTTTATTTTTCGGCTGTGTTTTAAGGTTGCGTTGATTTGCCCTATGCAGTGCCGGACAGGCTTTG
CTTTATCATTCGGCGCAACGGTTTAATTTATTGAACGAAAATAAATTTATTTAATCCTGCCTATTTTCCGGCACTATTCC
GAAACGCAGCCTGTTTTCCATATGCGGATTGGAAACAAAATACCTT7\AAACAAGCAGATACATTTCCGGCGGGCCGCAAC
CTCCGAAATACCGGCGGCAGTATGCCGTCTGAAGTGTCCCGCCCCGTCCGAACAACACAAAAACAGCCGITCGAAACCCT
GTCCGAACAGTGTTAG?ATCGAAATCTGCCACACCGATGCACGACACCCGTACCATGATGATCAAACCGACCGCCCTGCT
CCTGCCGGCTTTATTTTTCTTTCCGCACGCATACGCGCCT
SEKW. ID. NR: 12
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (772 bp) przed genem PilQ z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090)
GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCTGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAAT
CATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGC
AGAAGCGGCAGAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATGAGCTTTCT
GGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAA
TCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGrATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGAC
TTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCASGOGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAG
TTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCT
ACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAAC
GAGCIGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACIGCTGTTGAAITCTTCCGACAAAAACACCGA
ACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATT
SEKW. ID. NR: 13
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem podobnym do Hsf z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TTTGTTTTTTCTTTTGGTTTGTTTGAATGGTTAAATCGGGGTTTGGGGGCGGATGGTGCGGCATCCGCCCGGTTTTTGGG
GGTTGGGGGTTTTCTGi.TAAATTCKCCCAACTTAAAATCrCGTCATTCCCGCGAAGGCGGGAATCTGGGAaiTGGAATCT
AAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGGGGIT
TCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATTCCAGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCT
PL 211 037 B1
GTTTTTTCCGATAAAGTOCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGGITTCTGT
TTTTGCTGATAGATTCCTGTGGTTTTTCGGTTGCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTT
TTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGITTTTTC
CGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATTCCAACTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCGGTTTTTTCCGA
TAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTTCTGATAGA
TTCCTGTGGTTTTTCTATGGATTCAATCATTCCTGATTiAATTCCCATAATCTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAAGCGGG
AATCTAGGACGTGGAATCTAAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCTITTGCGG
GAATGACGGCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCTGAIAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTAGATTCCCGCTTTTGCGGGAAT
GACGGCGGTGAGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGT
SEKW. ID. NR: 14
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Hap z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
AATCAGCATAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCGATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGAT
ATGCGTATCACGCCCACGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACC
CCCGAAAATTCAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCG
CAATWtlGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAMCACATACGCCTTCCTGCTCGGT
ATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAACATCGG
CGGCGATTTTCAACGCGCCATAGAGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAAC
CGTCGTCAJtATCCCCGGAGCTTGTCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGIGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATT
CGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATG
GCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGGCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTT
CATCAGCGTCATCCTGATACTGCTTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCG
GCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCGGGTGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTA
GGGCGTGCTICATATCCGCCCGAACGCCGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCC
CTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATA
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 15
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem LbpA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GATTTTGGTCATCCCGACAAGCTTCTTGTCGAAGGGCGTGAAATTCCTTTGGTTAGCCAAGAGAAAACCATCAAGCTTGC
CGATGGCAGGGAAATGACCGTCCGTGGTTGTTGCGACTTTTTGACCTATGTGAAACTCGGACGGATAAAMCCGAACGCC
CGGCAAGTAAACCAAAGGCGGAAGATAAAAGGGAGGATGAAGAGAGTGCAGGCGTIGGTAACGTCGAAGAAGGCGAAGGC
GAAGTTTCCGAAGATGAAGGCGAAGAAGCCGAAGAAATCGTCGAAGAAGAACCCGAAGAAGAAGCTGAAGAGGAAGAAGC
TGAACCCAAAGAAGTTGAAGAAACCGAAGAAAAATCGCCGACAGAAGAAAGCGGCSfiCGGTTCAAACGCCATCCTGCCTG
CCTCGGAAGCCTCTAAAGGCAGGGACATCGACCTTTTCCTGAAAGGTATCCGCACGGCGGAAGCCGACATTCCAAGAACC
GGAAAAGCACACTATACCGGCACTTGGGAAGCGCGTATCGGCACACCCATTCAATGGGACAATCAGGCGGATAAAGAAGC
GGCAAAAGCAGAATTTACCGTTAATTTCGGCGAGAAATCGATTTCCGGAACGCTGACGGAGAAAAACGGTGTACAACCTG
CTTTCTATATTGAAAACGGCAAGATTGAGGGCAACGGTTTCCACGCAACAGCACGCACTCGTGAGAACGGCATCAATCTT
TCGGŁAAATGGTTCGACCAACCCCAGAACCTTCCAAGCTAGTGATCTTCGTGTAGAAGGAGGATTTTACGGCCCGCAGCG
GAGGAATTGGGCGGTATTATITTCAATASGGATGGGAAAlCTCTTGGTATAflCTGAAiGGrACTGAAAATAAAGTTGAAGT
TGAAGCTGAACTTGAAGTTGAAGCTGAAACTGGTGTTGTCGAACAGTTAGAACCTGATGAAGTTAAACCCCAATTCGGCG
TGGTATTCGC-TGCGAAGAAAGATAATAAAGAGGTGGAAAA
SEKW. ID. NR: 16
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem LbpB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A)
CGGCGTTAGAGTTTAGGOCAGTAAGGGOGCGlCCtSCCCTTAGATCTGTAAGTTACGATTCOGTTAAATAACTTTIACTGA
CTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGGTTAAAGTCCAACGACAAAAACCAAAAGACAAAAACACTT
TTATTACCCTAAAATCGAACACCCATAAATGACCTTTTTTGTCTTTGGCGAGGCGGCAGrAAGGGCGCGTCCGCCCTTAG
ATCTGTMGTTATGATTOCGTTAAATAGCCTTTACTGACTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGCGGACGCGCCCTTACTGCT
TCACCTTCAATGGGCTTT&AATTTTGTTCGCTTTGGCTTGCTTGACCTAAGGGTCAAAGCACCCTTACTGCCGCCTCGCC
AAAGACGAAAAGGGTTATTTACGGGGGTTGGATTTTAGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCTGTAAGTTATGATT
CCGTTAAATAGCCTTTACTGACTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCTTCACCTTCAATGGGCTT
TGAATTTTGTTiTJCTTTOGCTTGCTTSATCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCGTCTCGCCGAAGACAACGAGGGCTA
TTTACGGCGTTAGAGTTTAGGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCCAGACAGTCACGCCTTTGAATAGTCCATTTT
PL 211 037 B1
GCCAAAGAACTCTAAAA.CGCAGGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCTTACATCCAAGCACCCTTACTGCACCACG
TCCACGCACCCTTACTGCCCTACGTCCACGCACCCTTACTGCCCTACATCCAAGCB.CCCTTACTGCCTTACATAGACATG
ACAS^CGCCGAGCAGCGGAACAGGACTAAAAACAArTAAGTGATATTTTTGCCCAACTATAATAGACATGTATAATTATA
TTACTATTAATAATAATTAGTTTATCCTCCTTTTCATCCC
SEKW. ID. NR: 17
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (731 bp) przed genem TbpA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090)
TATGAAGTCGAAGTCTGCTGTTCCACCTTCAATTATCTGAATTACGGAATGTTGACGCGC
AAAAACAGCAAGTCCGCGATGCAGGCAGGAGAAAGCAGTAGTCAAGCTGATGCTAAAACG
GAACAAGTTGGACAAAGTATGTTCCTCCAAGGCGAGCGCACCGAlGAAAAAGAGATrCCA
AACGACCAAAACGTCGTTTATCGGGGGTCTTGGTACGGGCATATTGCCAACGGCACAAGC
TGGAGCGGCAATGCTTCCGATAAAGAGGGCGGCAACAGGGCGGACTTTACTGTGAATTTC
GGTACGAAAAAAATTAACGGCACGTTAACCGCTGACAACAGGCAGGCGGCAACCTTrACC
ATTGTGGGCGATATTGAGGGCAACGGTTTTTCCGGTACGGCGAAAACTGCTGACTCAGGT
TTTGATCTCGATCAAAGCAATAACACCCGCACGCCTAAGGCATATATCACAAACGCCAAG
GTGCAGGGCGGTTTTTACGGGCCCAAAGCCGAAGAGTTGGGCGGATGGTTTGCCTATTCG
GACGATAAACAAACGAAAAATGCAACAGATGCATCCGGCAATGGAAATTCAGCAAGCAGT
GCAACTGTCGTATTCGGTGCGAAACGCCAAAAGCCTGTGCAATAAGCACGGTTGCCGAAC
AATCAAGAATAAGGCCTCAGACGGCACCGCTCCTTCCGATACCGTCTGAAAGCGAAGAGT
AGGGAAACACT
SEKW. ID. NR: 18
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (373 bp) przed genem OmplA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090)
CGTACCGCATTCCGCACTGCAGTGAAAAAAGTATTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTA
CCAAGAGTCCGTCAAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCATAAAAACAAAGCX3GCTCGCCACAAAACCC
GTTTGTCTCAAAAAGTAAAACCTTGGCTTGATTTTTGCAAAACCTGCAATCCGGTTTTCATCGTCGATTCCGAAAACCCC
TGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTGCGGGGACAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGCaGTGCGGTTTTTTATCCG
AATCCGCTATAAAATGCCGrCTGńAAACCAATATGCCGACAATGGGGGTGGAG
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 19
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Plal z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TTTTGGCITCCAGCGTTTCATTGTTTTCGTACAAGTCGTAAGTCAGCrTCAGATTGTTGG
CTTTTTTAAAGTCTTCGACCGTACTCTCATCAACATAGTTCGACCAGrTGTAGATGTTCA
GAGTATCGGTGGCAGCGGCTTCGGCATTGGCAGCAGACGCAGCGTCTGCTTGAGGTTGCA
CGGCGTTTTTTTCGCTGCCGCCGCAGGCTGCCAGAGACAGCGCGGCCAAAACGGCTAATA
CGGATTTTTTCATACGGGCAGATTCCTGATGAAAGAGGTTGGAAAAAAAGAAATCCCCGC
GCCCCATCGTTACCCCGGCGCAAGGTTTGGGCATTGTAAAGTAAATTTGTGCAAACTCAA
AGCGATATTGGACTGATTTTCCTAAAAAATTATCCTGTTTCCAAAAGGGGAGAAAAACGT
CGGCCCGATTTTGCCGITTTTTTGCGCTGTCAGGGTGTCCGACGGGCGGATAGAGAGAAA
AGGCTTGCATATAATGTAAACCCCCTTTAAAATTGCGCGTTTACAGAATTTATTTTTCTT
CCAGGAGATTCCAATATGGCAAACAGCGCACAAGCACGCAAACGTGCCCGCCAGTCCGTC
AAACAACGCGCCCACAATGCIAGCCTGCGTACCGCATTCCGCACCGCAGTGAAAAAAGTA
TTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTACCAAGAGICCGTC
AAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCACAAAAACAAAGCGGCACGCCAC
AAAAGCCGTCTGTCTGCAAAAGTAAAAGCCTTGGCTTGATTTTTGCAAAACCGCCAAGGC
GGTTGATACGCGATAAGCGGAAAACCCTGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTG
CGGGGGCAAAATCCCGAAA1GGCGGAAAGGGTGCGATTTTTTATCCGAAICCGCTATAAA
ATGCCGTITGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGCGGAG
SEKW. ID. NR: 20
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FhaB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TACGGAAACTGCAAGCGGATCCAGAAGTTACAGCGTGCATTATTCGGTGCCCGTAAAAAAATGGCTGTTTTCTTTTAATC
ACAATGGACATCGTTACCACGAAGCAACCGAAG3CTATTCCGTCAATTACGATTACAACXA3CAAACAATATCAGAGCAGC
CTGGCCGCCGAGCGCATGCTTTGGCGTAACAGACTTCATAAAACTTCAGTCGGAATGAAATTATGGACACGCCAAACCTA
TAAATACATOGACGATGCCGAAATCGAAGTGCAACGCCGCCGCTCIGCAGGCTGGGfiAGCCGAATTGCGCCACCGTGCTT
ACCTCAACCGTTGGCAGCTTGACGGCAAGTTGTCTTACAAACGCGGGACCGGCATGCGOCAAftGTATGCCTGCACCGGAA
PL 211 037 B1
GAAAACGGCGGCGATATTCTTCCAGGTACATCTCGTATGAAAATCATTACTGCCGGTTTGGACGCAGCOGCCCCATTTAT
TTTAGGCAAACAGCAGTTTTTCTACGCAACCGCCATTCAAGCTCAATGGAACAAAACGCCGTTGGTTGCCCAAGATAAAT
TGTCAATCGGCAGCCGCTACACCGTTCGCGGATTTGATGGGGAGCAGAGTCTTTTCGGAGAGCGAGGTTTCTACTGGCAG
AATACTTTAACTTGGTATTTTCATCCGAACCATCAGTTCTATCTCGGTGCGGACTATGGCCGCGTATTTGGCGAAAGTGC
ACAATATGTATCGGGCAAGCAGCTGATGGGTGCAGTGGTCGGCTTCAGAGGAGGGCATAAAGTAGGCGGTATGTTTGCTT
ATGATCTGTTTGCCGGCAAGCCGCTTCATAAACCCAAAGGCTTTCAGACGACCAACACOGTTTACGGCTTCAACTTGAAT
TACAGTTTCTAACCTCTGAATtTTTTACTGATATTTAGACGGTCTTTCCTTATCCTCAGACCGTCAAACTTTACCTACGT
ACTTGGCGCGCAGTACGTTCATCITCAAAATGGAATAGAC
SEKW. ID. NR: 21
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Lipo02 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TTATCTTGGTGCAAAACTTTGTCGGGGTCGGACTGGCTACGGCTTTGGGTTTGGACCCGCTCATCGGTCTGATTACCGGT
TCGGTGTCGCTCACGGGCGGACACGGTACGTCAGGTGCGTGGGGACCTAATTTTGAAACGCAAIACGGCTTGGTCGGCGC
AACOGGTTTGGGTATTGCATCGGCTACTTTCGGGCTGGIGTTCGGGGGCCTGATCGGCGGGCCGGTTGCGCGCCGCCTGA
TCAACAAAATGGGCCGCAAACCGGTTGAAAACAAAAAACAGGATCAGGACGACAACGCGGACGACGTGTTCGAGCAGGCA
AAACGCACCEGCCTGATTACGGCGGAATCTGCCGTTGAAACGCTTGCCATGTTTGCCGCGTGTTTGGCGTTTGCCGAGAT
TATGGACGGCTTCGACAAAGAATATCTGTTCGACCTGCCCAAATTCGTGTGGTGTCTGTTTGGCGGCGTGGTCATCCGCA
ACATCCTCACTGCCGCATTCAAGGTCAATATGTTCGACCGCGCCATCGATGTGTTCGGCAATGCTTCGCTTTCGCTTTTC
TTGGCAATGGCGTTGCTGAATTTGAAACTGTGGGAGCIGACCGGTITGGCGGGGCCTGTAACCGTGATICnGCCGTACA
AACCGTGGTGATGGTTTTGTACGCGACTITTGTIACCTATGTCTTTATGGGGCGCGACTATGATGCGGCAGTATTGGCTG
CCGGCCATTGCGGTTTCGGCTtGGGTGCAACGCCGACGGCGGTGGCAAAIATGCAGTCOGTCACGCATńCTTTCGGCGCG
TCGCATAAGGCGTTTTTGATTGTGCCTATGGTCGGCGCGTTCTTCGTCGATTTGATTAATGCCGCGATTCTCACCGGTTT
TGTC^ATTTCTTTAiAGGCTGATTTTCCGCCTTTCCGACAAAGCACCTGCAAGGTTTACCGCCTGCAGGTGCTTTTGCTA
TGATAGCCGCTATCGGTCTGCACCGTTTGGAAGGAACATC
SEKW. ID. NR: 22
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Tbp2 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
CCTACTOTMGCGATTCCAATATGCTCGGCGCGACCCAOGAAGCCAAAGACTTGGAATTTTTGASCTCGGGCATCAAAATC
PL 211 037 B1
GTCAAACCCATTATGGGCGTTGCCTTTTGGGACGAAAACGTTGAAGTCAGCCCCGMGAAGTCAGCGTGCGCTTTGAAGA
AGGCGTGCOGGTTGCACTGAACGGCAAAGAATACGCCGACCCCGTCGAACTCTTCCTCGAAGOCAACCGCATCGGCGGCC
GCCACGGCTTGGGTATGAGCGACCAAATCGAAAACCGCATCATCGAAGCCAAATCGCGCGGCATCTACGAAGCCCCGGGT
ATGGCGTTGTTCCACATCGCCTACGAACGCTTGGTGACCGGCATCCACAACGAAGACACCATCGAACAATACCGCATCAA
CGGCCTGCQCCTCGGCCGTTTGCTCTACCAAGGCCGCTGGTTX2GACAGCCAAGCCTTGATGTTGCGCGAAACCGCCCAAC
GCTGGGTCGCCAAAGCCGTTACCGGCGAAGTTACCCTCGAACTGCGGCGCGGCAACGACTACTCGATTCTGAACACCGAA
TCGCCGAAOCTGACCTACCAACCOGAACGCCTGAGTATGGAAAAAGTCGAAGGTGCGGCGTTTACCCCGCTCGACCGCAT
CGGACAGCTCACGATGCGCAACCTCGACATCACCGACACCCGCGCCAAACTGGGCATCTACTOGCAAAGCGGTTTGCTGT
CGCTGGGCGAAGGCTCGGTATTACCGCAGTTGGGCAATAAGAAATAAGGTTTGCTGTTTTGCATCATTAGCAACTTAAGG
GGTCGTCTGAAAAGATGATCCCTTATGTTAAAAGGAATCCTATGAAAGAATACAAAGTCGTCATTTATCAGGAAAGCCAG
TTGTCCAGOCTGTTTTTCGGCGCGGCAAAGGTCAACCCCGTCAATITCAGCGCGTTCCTCAACAAACAAACCCCCCGAAG
GCTGGCGGGTCGAGACCTTTGCAATAACATAGGTTACIAA
SEKW. ID. NR: 23
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem PorA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GAATGACAATTCATAAGTTTCCCGAAATTCCAACATAACCGAAACCTGACAATAACCGTAGCAACTGAACCGTCATTCCC
GCAAAAGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATGCCTGTTGCTTTTCATTTCTAGAITCCCACTT
TCGTGGGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTTTCCGATAAATTCTTGAGGCATTGAAATTCCAAATTCCCGCCTGCGC
GGGAATGACSjGCTGCAGAlGCCCGACGGTCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAGCTGCAGACAGT
ACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTAGTGCTTCAGTATCTTAGAGAATCGTTCTCTTTGAGCTAAGGCGAGGCAACGTC
GTACTGGTTTTTGTTCATCCACTATATATGACACGGAAAACGCCGCCGTCCAAACCATGCCGTCTGAAGAAAACTACACA
GATACCGCOGCTTATATTACAATOGCCGCCCCGTGGTTCG5AAACCTCX:CACACTAAAAAACTAAGGAAACCCTATGTCC
CGCAACAACGAAGAGCTGCAAGGTATCTCGCTTTTGGGTAATCAAAAAACCCAATATCCGGCCGAATACGCGCCCGAAAT
TTTGGAAGCGTTCGACAACAAACATCCCGACAACGACTATTTCGTCAAATTCGTCTGCCCAGAGTTCACCAGCCTCTGCC
CCATGACCGGGCAGCCCGACTTCGCCACCATCGTCATCCGCTACArTCCGCACATCAAAATGGTGGAAAGCAAATCCCTG
AAACTCTACCTCTTCAGCITCCGCAACCACGGCGATTTTCATGAAGACTGCGTCAACATCATCATGAAAGACCICATI/GC
CCTGATGGATCCGAAATACATCGAAGTATTCGGCGAGITCACACCGCGCGGCGGCATCGCCATTCATtbTTTCGCCAATT
ACGGCAAAGCAGGCACCGAGTTTGAAGCATTGGCGCGrAA
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 24
Region promotora PorA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GATATCGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATA
TAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGOGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGITTTTIGCGGGGGGGGGGGTATA
ATTGAAGACGIAICGGGTGTTTGCOCGATGTTTTTAGGTTTTTA1CAAATTTACAAAAGGAAGCCCAT
SEKW. ID. NR: 25
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem PorB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A) gttttctgtttttgagggaatgacgggatgtaggttcgtaagaatgacgggatataggtttcogtgcggatggattcgtc attcccgcgcaggcgggaatctagaacgtggaatctaagaaaccgttttatccgataagtttccgtgcggacaagtttgg attcccgcctgcgcgggaatgacgggattttaggtttctaattttggttttctgtttttgagggaatgacgggatgtagg ttcgtaggaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtcattcccgcgcaggcgggaatctagaccttagaac aacagcaatattcaaagattatctgaaagtccgagattctagattcccgcctgagcgggaatgacgaaaagtggcgggaa tgacggttagcgtrgcctcgccttagcteaaagagaacgattctctaaggtgctgaagcaccaagtgaatcggttccgta ctatttgtactgtctgcggcttcgtcgccttgtcctgatttttgttaatccactatctcctgccgcaggggcgggttttg catccgcccgttccgaaagaaaccgcgtgtgcgttttttgccgtctttataacccccggtttgcaatgccctccaatacc ctcccgagtaagtgttgtaaaaatgcaaatcttaaaaaatttaaataaccatatgttataaaacaaaaaatacccataat atctctatccgtccttcaaaatgcacatcgaattccacacaaaaacaggcagaagtttgttttttcagacaggaacatct atagtttcagacargtaatcgccgagcccctcggcggtaaatgcaaagctaagcggcttggaaagcccggcctgcttaaa tttettaaceaaaaaaggaatacageaatgaaaaaatccctgattgccetgaetttggeagccctteetgttgcageaat ggctgacgttaccctgtacggcaccatcaaaaccggcgta
SEKW. ID. NR: 26
Region promotora PorB z Neisseria meningitidis (grupy surowicze^ B)
GTTTTCTGTTTTTGAGGGAATGADGGGATGTAGGTTCGTAAGAATGAOGGGATATAGGTTTCCGTGOGGATGGATTCGTC
ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGAACGTGGAATCIAAGAAACCGTTTTATCCGATAAGTTTTCCGTGCGGACAAGTTTG
GATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGGAITTTAGGTTTCTAATTTTGGTTTTCTGTTTTTGAGGGAAIGACGGGATGTAG
PL 211 037 B1
GTTCGTAGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCTTAGAA
CAACAGCAATATTCAAA.GATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCGCCTGAGCGGGAATGACGAAAAGTGGCGGGA
ATGACGGTTAGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACTAAGTGAATCGGTTCCGT
ACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTAT
SEKW. ID. NR: 27
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem siaABC z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ATACGGCCAATGGCTTCAGAAAGCGATAAGCCTCTGGCTGAAAAACCGATTTCTTGTGTTCTCCCCACCGCACCCATAGA
CGTAAAGGTATAGGGATTGGTAATCATGGTAACCACATCACCGCGACGCAGCAAAATATTTTGTCGCGGATTTGCAACTA
AATCTI'CCAAGGCAACAGITCGTACTACATTGCCACGTGTCAGCTGCACATICGTATCCTGCACATTTGCCGTIGAACCA
CCTACCGCAGCCACCGCATCCAACACACGCTCACCGGCTGCCGTCAGCGGCATACGCACACTATTCCCAGCACGAATCAC
CGACACATTCGCCGCATTATTCTGCACCAAACGCACCATCACTTGTGGCTGATTGGCCATTTTTTTCAGGCGGCCTTTAA.
TAATTTCCTGAACCTGA.CCAGGCGTTTTACCGACCACCGAAATATCGCCAACAAACGGCACAGAAACCGTACCACGTGCC
GTGACCAACTGCTCTGGCAACTTAGTTTGATGCGCACTACCOGAGCCCATCGAAGAAAGGCCACCACCAAACAATACTGC
CGGCGGCGCTTCCCAAATCATAATATCCAATACATCACCAATATTTAGCGTACCAGOCGAAGCATAACCATCGCCAAACT
GAGTGAATGACTGATTTATCTGAGCCTTATATAATAACTGAGCAACCGTATGATTCACATCAATCAGCTCCACITCAGGA
ATTTGAACTTCAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAATTTTTTTTGCGCTGGGGCCTGATGAAGGAATCGCAGAGCATCCTAC
AATTAAACTTOCACACAATAATAATACTGCGTGACGAATATAAAATTTCACTTTAAACACAAGCCAAATCCTAATATAAT
TATAAATGGCCTAATTA.TAGCACTTAATCGAAATAAATTTATGAGTACGTAGAGTATAATTAGTATTCTTCTTTCCAACT
TCCTTATACTTATATATATATACTTATAGATTCTAAAATC
SEKW. ID. NR: 28
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lgt z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GCCAAAGCATTGGGCGCGGATGCCGCCGCTGCCGAACGCGCCGCGCGTCTTGCCAAAGCCGACTTGGTAACCGAAATGGT
CGGCGAGTTCOCCGAACTGCAAGGCACGATGGGCAAATACTATGCCTGTTTGGACGGCGAAA.CCGAAGAAATTGCCGAAG
CCGTCGAGCAGCACTATCAGCCGCGTTTTGCCGGCGACAAGCTGCCCGAAAGCAAAATTGCCGCCGCCGTGGCACTGGCC
GACAAACTAGAAACCTTGGTCGGCATTTGGGGCATCGGTCTGATTCCGACCGGCGACAAAGACCCCTACGCCCTGCGCCG
CGCTGCCTTGGGTATTTltKGTATGCTGATGCAGTATGGTTTGGACGTGAACGAACTGATTCAGACGGCATTCGńCAGCT
PL 211 037 B1
TCCCCAAAGGTTTGCTCAACGAAAAAACGCCGTCTGAAACCGCCGACTTTATGCAGGCGCGCCTTGCCGTGTTGCTGCAA
AACGATTATCCGCAAGACATCGTTGCCGCCGTAimCGCCAMCAGCCGCGCCGTTTGGACGATTTGACCGCCAAACTGCA
GGOCGTTGCCGCGTTCAAACAACTGCCCGAAGCCGCCGCGCTGGC CGCCGCCAACAAACGCGTGCAAAACCTGCTGAAAA
AAGCCGATGCCGAGTTGGGCGCGGTTAACGAAAGCCTGTTGCAACAGGACC5AAGAAAAAGCCCTCTTTC5CCGCCGCGCAA
GGCTTGCAGCCGAAAAICGCCGCCGCCGTCGCCGAAGGCAATTTCCAAACCGCCTTGTCCGAACTGGCTTCCGTCAAACC
GCAAGTCGATGCATTCTTTGACGGCGTGATGGTAATGGCGGAAGATGCCGCCGTAAAACAAAACCGCCTGAACCTGCTGA fiCCGCTTGGCAGAGCAAATGSACGCGGTAGCCGACATCGCGCTTTTGGGCGftGTAACCGlTGTACAGTCCAAATGCCGTC
TGiAGCCTTCAGACGGCATCGTGCCTATCGGGAGAATAAA
SEKW. ID. NR: 29
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem TbpB z Neisseria meningitidis (szczep MC58>
GAAOGAACCGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGAATTTCAGGTTACTGTTTTTGGTTTTCTGTTTTTGTGAAAATAAT
GGGATTTCAGCTTGTGGG1ATTTACCGGAAAAAACAGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGGTC
TGTCGGTGCGGAAACTTATCGGATAAAACGGTTTCTTGAGATTTTTCGTCCTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGCG aacagaaaccgctccgccgtcattcccgogcaggcgggaatctagacattcaatgctaaggcaatttatcgggaatgact
GAAACTCAAAAAACTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGTGGTGCAGGTTTCCGTATGGATGGATTCGTCATTCCCGC
GCA.GGCGGGAATCTAGACCTTCAATACTAAGGCAATTTATCGGAAATGACTGAAACIGGAAAAACTHGATTCCCACTTTT
GTOGGAATGACGCGATTAGAGTTTCAAAATTTATTCTAAATAGCTGAAACTCAACACACTGGATTCCCGCCTGCGCGGGA
ATGACGAAGTGGAAGTTACCCGAAACTTAAAACAAGCGAAACCGAACGAACDjGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGA atgtaggticgtgggaatgacggcggagcggtttcigctttttccaataaatgaccccaacttaaaatcccgtcattccc gcgcaggcgggaatctaggtctgtcggtgcggaaacttatcgggtaaaacggtttcttgagattttgcgtcctggattcc cactttcgtgggaatgacggaatgtaggttcgtgggaatgacgggatataggtttccgtgcggacgcgttcggattcatg
ACTGCGCGGGAATGACGGGATTTTGGTGTATTCCCTAAAAAAATAAAAAAGTATTTGCAAATTTGTTAAAAATAAATAAA
ATAATAATCCTIATCATTCTTTAATTGAATTGGATTTATT
SEKW. ID. NR: 30
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem opc z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A)
CAAAGGCTACGACAGTGCGGAAAACCGGCAACATCTGGAAGAACATCAGTTGTTGGACGGCATTATGCGCAAAGCCTGCC
PL 211 037 B1
GCAACCGTCCGCTGTCGGAAACGCAAACCAAACGCAACCGGTATTTGTCGAAGACCCGTTATAGTGGATTAAAITTAAAT
CAGGACAAGGOGACGAAGCCGCAGACAGTACAAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACTGGTTTAAATTTAATCC
ACTATATGTGGTCGAACAGAGCTTCGGTACGCTGCACCGTAAATTCCGCTATGCGCGGGCAGCCTATTTCGGACTGATTA
AAGTGAGTGCGCAAAGCCATCTGAAGGCGATGTGTTTGAACCTGTTGAAAGCCGCCAACAAGCTAAGTGCGCCCGCTGCC
GCCTAAAAGGAGACCGGATGCCTGATTATCGGGTATCCGGGGAGGGTTAAGGGGGTATTTGGGTAAAATTAGGAGGTATT
TGGGGCGAAMTAGACGAAAACCTGTGTTTGGGTTTCGGCTGTCGGGAGGGAAAGGAATTTTGCAAAGATCTCATCCTGT
TATTTTCACAAAAACAGAAAACCAAAAACAGCAACCTGAAATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCCCCAAC
GCGGCAGGAATCTATCGGAAATAACCGAAACCGGACGAACCTAGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGGCAGAGTGGTTT
CAGTTGCTCCCGATAAATGCCGCCATCTCAAGTCTCGTCATTCCCTTAAAACAGAAAACCGAAATCAGAAACCTAAAATT
TCGTCATTCCCATAAAAAACAGAAAACCAAGTGAGAATAACAATTCGTTGTAAACAAATAACTATTTGTTAATITTTATT
AATATATGTAAAATCCCCCCCCCCCCCCCCCGAAAGCTTAAGAATATAATTGTAAGCGTAACGATTATTTACGITATGTT
ACCATATCCC-ACTACAATCCAAATTTTGGAGATTTTAACT
SEKW. ID. NR: 31
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem siaD z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ATAATGCAGGCGCTGAAGTTGTTAAACATCAAACACACATCGTTCAAGACGAAATGTCTGATGAGGCCAAACAAGTCATT
CCAGGCAATGCAGATGTCTCTATTTATGAAATTATGGAACGTTOTGCCCTGAATGAAGAAGATGAGATTAAATIAAAAGA
ATACGTAGAGAGTAAGGGTATGATTTTTATCAGTACTCCTTTCTCTCGTGCAGCTGCTTTACGATTACAACGTATGGATA
TTCQ\GCATATAAAATCGGCTCTGGCGAATGTAATAACTACCCATTAATTAAACTGGTGGCC:tCTTTTGGTAAGCCTATT
ATTCTCTCTAOCGGCATGAATTCTATTGAAAGCATCAAAAAGTCGGTACiiAATTATTCGAGAAGCAGGGGTACCTTATGC
TTTGCTTCACTGTACCAACATCTACCCAACCCCTTACGAAGATCTTCGATTGGGTGGTATGAACGATTTATCTGAAGCCT
TTCCAGACGCAATCATTGGi^TGTCTGACCATACCTTAGATAACTATGCTTGCTTAGGAGCAGTAGCTTTAGGCGGTTCG
ATTTTAGAGCGTCACTTTACTGACCGCATGGATCGCCCAGGTCCGGATATTGTATGCTCTATGAATCCGGATACTTTTAA
AGAGCTCAAGCAAGGCGCTCATGCTTTAAAATTGGCACGCGGCGGCAAAAAAGACACGATTATCGCGGGAGAAAAGCCAA
CTAAAGATTTCGCCTTTGCATCTGTCGTAGCAGATAAAGACATTAAAAAAGGAGAACTGTTGTCCGGAGATAACCTATGG
GTTAAACGCCCAGGCAATGGAGACTTCAGCGTCAACGAATATGAAACATTATTTGGTAAGGTCGCTGCTTGCAATATTCG caaaggtgctcaaatcaaaaaaactgatattgaataatgcttattaacttagttactttattaacagaggattggctatt
ACATATAGCTAATTCTCATrAATTTTTAAGAGATACAATA
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 32
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem ctrA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ATACCTGCACTTGAGTTGCCGACCATAi\ATTTAGCATGTTTCAATAAGACTAAiAAATATTCAAATCGAATGGAAGGAAA
TGCAATAAATTTATCAGATTGATATTTTAATAATTCTTGCAGAATACTTTCAGTGCCAGTGTCATTATTAGGGTAGATGC
TAAIGATATTTTGGCCACTTAATTCTAńTCCTTTGAAATATTGGGCCGCATATTGTGGCATTAAAIGTGCTTCIGTAGTC
ACGGGGTGAAACATAGAAATACCATAATTTTCGTATGGTAAAOCGTAATATTCTTTGACTTCTTCTAAGGATGGGAGGGT
GGAAGAGGCCATAACATCTAAATCGGGGGAGCCGATGATGTGAATATGCTTTCTTTTTTCTCCCATTTGCACTAGGCGAG
TGACAGCTTGTTCATTTGCTACEAAGTGGATATGAGAAAGTTTACTAATAGAATGACGAATGGAGTCATCTACTGTACCA
GATAGTTCACCACCTTCGATATGGCAAACIAAACGGCTGCTTAATGCACCTACAGCTGCGCCTGCTAGTGCTTCTAAACG
GTCGCCGTGAATCATGACCATATCAGGTTCAATTTCATCAGATAGACGAGAGATAAACGTAATGGTATTGCCTAAAACGG
CACCCATTGGTTCACCTTGGATTTGATTTGAAAACAGATATGTATGTTGATAGTTTTCTCGAGTTACTTCCTTGTAGGTT
CTGCCATATGTTTTCATCATATGCATACCAGTTACAATCAAATGCAATTCAAGGTCTGGGTGATTTTCAATATAGGCTAA
TAAAGGTTTTAGCTTGCOGAAGTCGGCTCTGGTACCTGTAATGCAAAGiAATTCTTTTCATGATTTTAGAATCTATAAGTA
TATATATATAAGTATAAGGAAGTTGGAAAGAAGAATACTAATTATACTCTACGTACTCATAAATTTATTTCGATTAAGTG
CTATAATTAGGCCATTTATAATTATATrAGGATTTGGCTT
SEKW. ID. NR: 33
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lgtF z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A)
TCTTTTTCGGACTGAAAGGACGCATCATCCCGACATCGAGCGCGTGTTCGTCOGGCAGCCAAGGCATAGGTTATGCCTAC
GAAGCCATCAAATACGGTCTGACCGATATGATGCTGGCGGGCGGAGGCGAAGAATTrTTCCCGTCCGAAGTGTATGTTTT
CGACTCGCTTTATGCCGOCAGCCGCCGCAACGGCGAACCGGAAAAAACCCCGOGCCCATACGACGCGAACCGCGACGGGC
TGGTCATCGGOGAAGGCGCGGGGATTTTCGTGCTGGAAGAATTGGAACACGCCAAACGGCGCGGTGCGATAATTTACGCC
GAACTCGTCGGCTACGGAGCCAACAGCGATGCCTACCATATTTCCACGCCCCGCCCCGACGCGCAAGGCGCAATCCTTGC
CTTTCAGACGGCATTGCAACACGCAGACCTTGCGCCCGAAGACATCGGCTGGATTAATCTGCACGGCACCGGGACGCACC
ACAACGACAGTATGGAAAGCCGCGCCGTTGCAGCGGTTTTCGGCAACAATACGCCCTGCACGTCCACCAAGCCGCAAACC
GGACACACGCTGGGCGCGGCGGGCGCAATCGAAGCCGGGTTCGCGTGGGGCATTGCTGACCGGAAAAGCAATCCCGAAGG
GAAACTTCCGOCCCAGCTTTGGGACGGGCAGAACGATCCCGAOCTTCCCGCCATCAACCTGACCGGCAGCGGCAGCCGCT
PL 211 037 B1
GGGAAACCGAAAAACGCATTGCCGCCAGCTCGTCGTTTGCCTTCGGAGGAAGCAACTGCGTTTTACTCATCGGArGAAAT
AAGTTTGTCAATCCCACCGCTATGCTATACAATACGCGCCTACTCTTGATGGGTCTGTAGCTCAGGGGTTAGAGCAGGGG
ACTCATAATCCCTTGGTCGTGGGTTCGAGCCCCACCGGACCCACCAATTCCCAAGCCCGGACGTATGITTGGGCrTTTTT
GCCGCCCTGTGAAACCAAAATGCTTTGAGAAACCTTGATA
SEKW. ID. NR: 34
Sekwencja nuklectydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lgtB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TAGAAAAATATTTCGCCCAATCATTAGCCGCCGTCGTGAATCAGACTTGGCGCAACTTGGAGATTTTGATTGTCGATGAC
GGCTCGACAGACGGTACGCTTGCCATTGCCPAGGATTTTCAAAAGCGGGACAGCCGTATCAAAATCCTTGCACAAGCTCA
AAATTCCGGCCTGATTCCiGTCTITAAACATCGGGCTGGACGAATTGGCAAAGTCAGGAATGGGGGAAIATATTGCAOGCA
CCGATGCCGACGATATTGCCGCCCCCGACTGGATTGAGAAAATCGTGGGCGAGATGGAAAAAGACCGCAGCATCATCGCG
ATGGGCGCGTGGCTGGAAGTTTTGTCGGAAGAAAAGGACGGCAACCGGCTGGCGCGGCATCACAGGCACGGCAAAATTTG
GAAAAAGCCGACCCGGCACGAAGATATTGCCGACTTTTTCCCTTTCGGCAACCCCATACACAACAACACGATGATTATGA
GGCGCAGCGTCATTGACGGCGGTTTGCGTTACAACACCGAGCGGGATTGGGCGGAAGATTACCAATTITGGTACGATGTC
AGCAAATTGGGCAGGCTGGCTTATTATCCCGAAGCCTTGGTCAAATACCGCCTTCACGCCAATCAGGTTTCATCCAAATA
CAGCATCCGCCAACACGAAATCGCGCAAGGCATCCAAAAAACCGCCAGAAACGATTTTTTGCAGTCTATGGGTTrTAAAA
CCCX3GTTCGACAGCCTTGAATACCGCCAAA1AAAAGCAGTAGCGTATGAATTGCTGGAGAAACATTTGCCGGAAGAAGAT
TTTGAACGCGCCCGCCGGlTTITGTACCAATGCTTCAAACGGACGGACACGCTGCCCGCCGGCGCGTGGCTGGArTTTGC
GGCAGACGGCAGGATGCGGCGGCTGTTTACCTTGAGGCAATACTTCGGCATTTTGCACCGATTGCTGAAAAACCGTTGAA
AAACGCCGCTTTATCCAACAGACAAAAAACAGGATAAATT
SEKW. ID. NR: 35
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lst z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GCGCACGGCTTTTTCTTCATCGGTTTGSGGGTCGGCAGGATAATCGGGGACGGCAAAGCCTTTAGACIGCAATTCTTTAA
TCGCGGCGGTCAGTTGAGGTACGGATGGGCIGATGTTGGGGAGTTTGATTAGGTTTGGATCEGGCTGTTTGAGCAGTTCG
CCCAATTCGGCAAGCGCGTCGGGTACGCGCGGCGCTTCGGTCAGATATTCGGGGAATGCCGCCAAMTACGGCCGGACAG
GGAAATGTCGGCAGTTTTGACATCAATATCGGCGTGGCGGGCAAACGCCTGCACAATCGGCAGCAGCGATTGGGrCGCCA
GCGCGGGGGCTTCGTCGGTATGGGTATAAACAATGGTGGATTTTTGAGTCATAGGATTATTCTCTTGtAGGTTGGTTTTT
PL 211 037 B1
TCTTTTGGAACACATTGCKICGGGGAATGIGCGCGGCTATTATGGCATATTTTGGCGGCTTTGTTCGCGCTTTGTTCGATC
TTGGCGTGTTTGAACGCGGCAGCGTGAAAGGAAGGGGGAAATGGTTTTCCCGCGTTTGGCGGCGGTGTCGGAGGTGCTGT
GCCTGATGTGCGGCGGCATATTTTCGGTGAAATTGATTTTATAGTGGTTTAAATTTAAACCAGTACAGCGTTGCCTCGCC
TTGTCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCITCGTTGCCTIGTCCTGATTTAAATTTAAACCACTATAATATTCGGTAACTG
TCGGAATATCTGCTAAAATTCCGCATTTTTCCGCCTCGGGACACTCGGGGCGTATGTTTAATTTGTCGGAATGGAGTTTT
AGGGAT
SEKW. ID. NR: 36
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem msbB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GCCCGACGGCGAACAGACACGTCGTGAAATCAACCGCTTGGACAGTACGGCGGCGCAATACGACATGCTTGCAGGTTATC
TTGAAAGACTTGCCGGAAAAACCGACCGTTGGGCGTGCGCCTACCGCCAAAATGCCGrCTGAACACCCGATTATCCTTTT
GAAAGCGCGATTATGCCCCATACCCTTCCCGATATTTCCCAATGTATCAGACAAAATrTGGAACAATATTTCAAAGACCT
GAACGGTACCGAAOTTGCGGCGTGTACGATATGGTCTTGCATCAGGTGGAAAAACCGCTGCTGGTGTGCGTGATGGAAC
AATGCGGCGGCAACCAGTCCAAAGCCTCCGTCATGTTGGGACTGAACCGCAATACTTTGCGTAAAAAACTGATTCAACAC
GGTTTGCTGTGAATATGTCGGCAACCGTCCGTATCTTGGGTATTGACCCGGGCAGTCGCGTAACGGGTTTCGGTGTCATC
GATGTCAGGGGGCGCGATCATTTTTACGTCGCCTCCGGCTGCATCAAAACGCCTGCCGATGCGCCTCTGGCAGACAGGAT
TGCCGTGATTGTGCGGCATATCGGCGAAGTCGTTACCGTTTACAAGCCTCAACAGGCGGCAGTGGAACAGGTGTTCGTCA
ACGTCAATCCGGCATCGACGCTGAIGCIGGGTCAGGCTAGGGGCGCGGCATTGGCGGCATTGGICAGCCATAAGCTGCCC
GTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTAGTCGGCAAGGGCAAGGCGGCAAAAGAACAGGTGCAGCATAT
GGTGGTGCAGATGCTGGGGCTTTOGGGAACGCCGCAGGANTGGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGOCTT
ACGCAACCACGGGCTTGGCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGCAGGTTICAATAGTTTCAGACGG
CATTTGTATTTTGCCGTCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAG
SEKW. ID. NR: 37
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem htrB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
CCGCCAAGCGTTTCCCCCTTTGTCGGGCITAACATTTGCTTTGTACGGCAGACTTTTTCCCTTCATAACGCCGCCTTTCC
GAAAAGACGATGGTAGGCGCGACGTAATTCTCAACCCTTAAGGTACGGTTGGACGAAAAGTTTTCCTTTTCATTCCACCT
GCCAACTTTTCGGCTACACCGAGTGGTCICGTTAGGTTTGGGCGAACTACGCCCTTAAAAAAACGGACATTCTTTGCATG
PL 211 037 B1
CCCGTCTCTAAGGTTTCACGGTAAGTTTACCCTTATAAAGAGTTGACTTACCATACTTATCCTTTTAAAACGATATAAAG
GGCGACAGCTGTAATACAAGTATGTTGTACGGCAGACTTCTTCTACCAAACAAAAAGTTCCTTTTAGAGTTACTCGCTTA
TAGACAAATGAAHGCTTAGCCATAGGCTTCCGGTAGGCCTATTTCAACGGCTGGTTCACAGGCTACGCTAAAACCTACGG
TAGAACCGCGTTCTGGGGTTTCGCGCACAGCGGCGTCTTTGGAACCAGTTGTGTCCGAACACGCATAACCGCCCGCrTTA
ATGGTGGTGGCGGGTTCACCTGATGTAGTTTCAGCGTGCGCTTTGGTAGTTTGCGTAGCCGATGTTGAGGAGGCTCGACC
CGAAACTACGGTTGCCGACGCGCCAGCCGCACATGATGCTGGTCGTTAGAGGCCTGTAGCGGGTTCOGCACTTGCTTCCG
CTICCGTAACTGAACTTGGTTCCOCGACKGCTGGTTCCAAACTACAAGCEGATACGGACGCTGCTTTGGGGCTGGGACTA
CGGCAAAOGGTAGATAATCTCGGTGGCGGACTACGTCGCAGTTTCSCI^AAIGCGTTTCTGCOGGAGGACGGAACCGACG
CAGGGCTGCGTTTTCGGGTTGACTGGCACCAAATGCTATCGCTTAGGCCGTTTCATTTTGCGTAACTATGGCAGCAGGAG
AGATACGTTGTGCTGGGCCTTTAGCCAATACTTCTCAACT
SEKW. ID. NR: 38
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem MltA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
CACAAAAACCAAGTrATGACGGGAATAAGGTACAGCAGCCAAACCAAGGCCTCGCCCTGC
GTCGGATGGTCGGTATAGCCGAAAAATCCGCCGAGCAGCACGCCCAACGGGCTGTCrTCG
TGCAAATATTTTGArGAGTCGAACACAAIGTCCTGAAGCGCGTTCCAAATGCCTGCrTCG
TGCAGCGCACGCAGCGAACCGGCAAGCAGACCAGCGGCAACGATAATCAGAAACGCCCCT
GTCCAACGGAAAAACTTCGCCAGATTCAGGCGCATCCCACCCTGATAAATCAACGCGCCA
ATCACGGCGGCAGCCAAAACCCCCGCTACCGCACCGGCCGGCATCTGCCACGTCGGGCTC
TGTTTGAATACGGCAAGCAGGAAAAAAACGCTCTCCAAACCTTCGCGCGCCACGGCAAGA
AACGCCATACCGACCAAGGCCCATCCTTGACCGCTGCCACGGTTCAAAGCCGCCTGCACA
GAATCCTGAAGCTGCCGCTTCATCGAACGGGCGGCTTTTTTCATCCATAAAATCATATAA
GTCAGCATCGCGACAGCAACCAAACCGATAATGCCGACGACGAACTCCTGCTGCTTCTGG
GGAATCTCGCCCGTTGCCGAATGGATTCCGTACCCCAGCCCCAAACACATCAAAGAAGCA
AGAACAACCCCGAACCAGACCTTAGGCATCAGTTTGGAATGTCCGGACTGrTTCAGAAAA
CCGGCAACGATGCCGACGATGAGCGCGGCTTCGATACCCTCGCGCAACATAATTAAAAAA
GCGACCAGCATAAACGCGAACGAACAAGGATGATGAATAATATATTATCGGAATATTTTC
ATTGCTTGTAAATACAAATGCAAGTTATTTTTATCTGCAGTACCGCGCGGCGGAAAGTTC
PL 211 037 B1
CGCAGCTGCAGCTGCGCCCTGTGTTAAAATCCCCTCTCCACGGCTGCCGCAACGCCGCCC
GAAACCATCTTTCTTATTACTGCCGGCAACATTGTCCAIT
SEKW. ID. NR: 39
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem ompCD z Moraxella catarrhalis
GCTGATTTGTGAGCAAGCGGGCGCAICAGGGATTACCTIGCATTTGCGAGAAGATCGTCG
ACATATTCAAGATGAAGATGTTTATGAATTGATTGGGCAATTGACAACACGCATGAATCT
TGAGATGGCAGTCACTGATGAGATGCTAAATATTGCCCTAAAGGTACGACCAGCATGGGT
GTGTTTAGTACCAGAAAAACGCCAAGAGCTGACTACAGAAGGTGGGCTTGATATCGCCAA
TTTATCAAATATTCAAGCATTTATACACAGTCTTCAGCAGGCGGATATTAAGGTTTCTTT
ATTCATCGATCCAGATCCGCATCAAATTGATGCTGCAATTGCTTTGGGTGCTGATGCGAT
TGAGCTGCATACGGGAGCTTATGCTCAAGCGACTTTACAAAATAATCAAAAGCTTGTTGA
TAAAGAGCTTGACCGTATTCAAAAAGCCGTTGCAATGGCACAAAAAAAATCATCATTATT
GATTAATGCAGGTCATGGTTTGACGCGTGATAATGTTGCAGCGATTGCCCAAATTGATGG
TATTCATGAGCTGAATATCGGGCATGCATTGATTTCAGATGCGATATTTATGGGGCTTGA
TAATGCAGTCAAGGCAATGAAAATGGCTTTTATTCAAGATAAAACGACCAATCATTGATG
CGTTAGAAAGAAAATCGTAAATAATGATGACTATTGTGTAATATTATGTATTTTTGTTCA
AAAAAAGGTTGTAAAAAAATTCATTTACCATTAAGCTAAGCCCACAAGCCACAATGAATA
CCTATTGGTTTGACTCATTAGTCACTAAGAATCTGCAAAATTTTGTAACAGATTATTGGC
AGGTCTTGGATCGCTATGCTAAAATAGGTGCGGTAATCTTGAAAAACCAACCATTCCTTG
GAGGAATTTATGAAAAAGGGATAIAAACGCTCTTGCGGTCATCGCAGCCGITGCAGCTCC
AGTTGCAGCTCCAGTTGCTGCTCAAGCTGGTGTGACAGTC
SEKW. ID. NR: 40
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem copB z Moraxella catarrhalis
GATGCTGTTAAAGTGGGTATTGGTCCTGGTTCTATTTGTACAACCCGTATTGTTGCAGGC
ATTGGCGTCCCGCAGATAAGTGCCATTGATAGTGTGGCAAGTGCGTTAAAAGATCGCATT
CCTTTGATTGCCGATGGCGGTATTCGTTTTTCGGGTGATATCGCCAAAGCCATCGCAGCA
PL 211 037 B1
GGCGCTTCATGTATTATGGTGGGTAGCTTGTTGGCAGGTACCGAAGAAGCACCTGGTGAG
GTGGAATTATTCCAAGGTCGTTATTATAAGGCTTArCGTGGTATGGGCAGCTTGGGGGCA
ATGTCTGGTCAAAATGGCTCATCGGATCGTTATTTrCAAGATGCCAAAGATGGTGTTGAA
AAACTGGTTCCAGAGGGTAICGAAGGCCGTGTTCCrTATAAAGGCCCTGIGGCAGGCATC
ATCGGTCAATTGGCAGGTGGTCTAAGATCATCCATGGGTTATACAGGTTGCCAGACCATC
GAACAGATGCGTAAGAATACCAGCTTTGTCAAAGTGACTTCCGCAGGCATGAAGGAATCG
CATGTACACGATGTACAGATTACCAAAGAAGCACCCAATTATCGCCAAAATTAACTCTAT
TAATAGCAAATACAAGCACTCATTAGATAGGGTGGGTGCTTTTTAGAGCATAAAAAATAA
ACTGACACATGACTTATTGTCATATTTTTAAAATGCTTTTAATTTAGATTTTTAATTTAG
ATAATGGCTAAAAATAACAGAATATTAATTTAAAGTTTTCAAAATCAAGCGATTAGATGA
AATTATGAAAATAAATAACAATAATICTGATTTATrTIAACCAATAATAICAATTATCAT
TTACAAGAAAAATTTTTTTTGATAAAATTCTTACTTGTACCTTGCTATTTTTTCTTATTT
ATCATTTTTGGCGGTATTTTCGTTGATTTTAGTAAGTAGATGAGCAAGGGATAATTTGAC
AAAAACAAATTTGATTTCAAGCCTCATAATCGGAGrTATT
SEKW. ID. NR: 41
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem D15 z Moraxella catarrhalis
AAAACTGGTGATGTCTTCACIGCTATTCATGGTGAACCAATCAATGATTGGCTAAGTGCC
ACCAAGATTATTCAGGCAAATCCAGAAACCATGCTTGATGTGACAGTCATGCGTCAAGGT
AAGCAGGTTGATTTAAAATTAATGCCCCGTGGTGTAAAGACACAAAACGGCGTAGTCGGT
CAACTGGGTATTCGCCCCCAGATTGATATCGATACGCTCATTCCTGATGAATATCGTATG
ACGATTCAATATGATGTCGGTGAGGCATTTACTCAAGCCATCCGACGAACTTATGATTTA
TCAATAATGACCTTAGATGCGATGGGTAAGATGATrACAGGATTGATTGGCATTGAAAAT
CTATCAGGTCCCATTGCCA1TGCCGATGTTTCTAAGACCAGTTTTGAGTIGGGATTTCAA
GAAGTGTTATCGACAGCCGCAATCATCAGTTTAAGCTTGGCAGTACTGAATCTTTTACCC
ATTCCAGTGTTAGATGGCGGGCATTTGGTATTTTATACTTATGAATGGATTATGGGCAAA
TCTATGAATGAAGCGGTGCAGATGGCAC-CATTTAAAGCGGGTGCGTTATTGCTTTTTTGT
TTCATGTTACTTGCAATCAGTAACGATATCATGCGATTTTTTGGCTAAGTTCTGATTTAT
PL 211 037 B1
CGTACCATTAACAAAATrTTTGGCTTTTTTAAGCTGAAATACTTGCCAAATTTAACTTTT
TGGCTTACCTTTACACAATATAAATTTGGGTGTAGAAAATTTTGGATACATTTTTATACC
TTATTTTTAGAAATTTTAAAAATTAAGTTTGGATAGACTTATGCGTAATTCATATTTTAA
AGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACA
AGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTGCCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGA
AAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG
SEKW. ID. NR: 42
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem omplA z Moraxella catarrhalis
ACTTGGCGAAAATACCATTTATATCGATTGTGATGTTATACAGGCAGATGGCGGTACACG
CACAGCCAGTATCAGTGGTGCTGCGGTGGCACTTATTGATGCTTTAGAACACTTGCAGCG
TCGTAAAAAC-CTTACCCAAGATCCGCTTTTGGGCTTGGTGGCAGCGGTTTCTGTGGGTGT
TAATCAAGGCCGTGTATTGCTTGATTTGGATTATGCTGAAGATTCAACTTGTGATACCGA
TTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGTTTATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGA
AAAGCCATTTACTCGTGCTGAAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAArTGG
GCAGATTATCGAAGCCCAAAAGCAAGTATTAGGCTGGTGATATGCTAATCGTTGAAGATA
ATGGCGTGATCATCACATTAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGA
TATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTTGATTGCACCCGTTTTTTATG
CAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTGCAGTTGTGGTATTTGTGTTTAATATTCAAAGGCAAA
AAGCCAAAACTTGTCATATGTTTTCACAAGGTCGCTTGAAGATTACGTCCAAACGCTTTG
AGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACA
AAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGTTTTGCTGATGACCGTG aaattaataiagccaaacaggtacttttgggaaagtcaatcaaaaccaatgcggtggcgg
TAACATTGGCTAAGTAGrTGTTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCTTTAACTCCACCCA
CCTAACTTTTTCTTTGTrTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGATTTTATTrTAA
GTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTC
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 43
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem hly3 z Moraxella catarrhalis
GTGATCGGCAACACCCCACCATTCAGGAGCAACCAAAATTGCCCGTGCCTTGCCTGTCTT
GGTGGTATCATTTGGCAGGGCAATGTGGCTAAGTAGTGGTGTGCCATCAGGTGCGGTGGT
GGTGAGTGTACGATTCGTTATTGTCATAAAATTATCCTTTTGGGTTGGATGATATCAATG
AAATACCCrACGGTTGTATGGAATTTTATCCATTGTACCACGGTATTGGTCTTTTTAAAT
TAACAAGCAGCTTCTAGCAAGTCAAAGTTTTTATGCCTATTTTTTCAGATTTTAAGGTAC
AATAAAGCCAATTGTTAATAATATGGTATTGTCAIGATTTATGATGAATTGCGACCAAAA
TTTTGGGAAAATTATCCCTTAGATGCGTTAACAGATGCTGAATGGGAAGCATTATGTGAC
GGATGTGGCGCGTGTTGTTTGGTGAAATTTCTTGATGATGACAATGTTAAATTGACCGAA
TATACCGATGTTGCCTGCCAGCTATTGGATTGCTCAACAGGATTTTGCCAAAACTATGCC
AAGCGTCAAACGATTGTGCCAGATTGTATTCGCTTAACACCTGATATGCTGCCTGATATG
CTGTGGTTGCCACGCCATTGTGCTTATAAGCGGTTGTATCTTGGGCAAAATCTGCCAGCA
TGGCACAGGCTCATTAAACATAGCCAAAACCATGGTGCAGGATTTGCGAAAGTTTCAACT
GCTGGGCGATGTGTGAGTGAGCTTGGTATGAGTGATGAAGACATAGAAAGGCGAGTGGTG
AAATGGGTTAAACCTTGACATGATTGTTGACATGATTGACAGACAATAAAAATTGGCAAA
TTTGATAAAATTGGTGTATGTGTGTGATTTTATCAAAAGCACTTGAATAAAACCGAGTGA
TACGCIAAATTGTAGCAAACCAATCAATTCATCATAATTTIAATGAACACGAGGTTAAAT
TATACTGTCTATGTCTGATGACAATTCAAGCACTTGGTCG
SEKW, ID. NR: 44
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lbpA z Moraxella catarrhalis
TAACAAAGGCAACCCAACACGCAGTTATTTTGTGCAAGGCGGTCAAGCGGATGTCAGTAC
TCAGCTGCCCAGTGCAGGTAAATTCACCTATAATGGTCTTTGGGCAGGCTACCTGACCCA
GAAAAAAGACAAAGGTTATAGCAAAGATGAGGATACCATCAAGCAAAAAGGTCTTAAAGA
TTATATATTGACCAAAGACTTTATCCCACAAGATGACGATGACGATGACGATGACGATAG
TTTGACCGGATCTGATGATTCACAAGATGATAATACACATGGCGATGATGATTTGATTGC
PL 211 037 B1
ATCTGATGATTCACAAGATGATGACGCAGATGGCGATGACGATTCAGATGATTTGGGTGA
TGGTGCAGATGATGACGCCGCAGGCAAAGTGTATCATGCAGGTAATATTCGCCCTGAATT
TGAAAACAAATACTTGCCCATTAATGAGCCTACTCATGAAAAAACCTTTGCCCTAGATGG
TAAAAATAAGGCTAAGITTGATGTAAACTTTGACACCAACAGCCTAACTGGTAAATTAAA
CGATGAGAGAGGTGATATCGTCTTTGATATCAAAAATGGCAAAATTGATGGCACAGGATT taccgccaaagccgatgtgccaaactatcgtgaagaagtgggtaacaaccaaggtggcgg
TTTCTTATACAACATCAAAGATATTGATGTTAAGGGGCAATTTTTTGGCACAAATGGCGA agagttggcaggacggttacatcatgacaaaggcgatggcatcactgacaccgccgaaaa agcaggggctgtctttggggctgttaaagataaataaagcccccctcatcatcgtttagt
CGCTTGACCGACAGTTGATGACGCCCTTGGCAATGTCTTAAAACAGCACirTGAAACAGT
GCCTTGGGCGAATTCTTGGATAAATGCACCAGATTTGCCTCGGGCTAATArCTTGATAAA
ACATCGCCATAAAATAGAAAATAAAGTTTAGGATTTTTTT
SEKW. ID. NR: 45
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lbpB z Moraxeila catarrhalis
CAGCTTGTACCATTTGGTGAATATATACCATTTGGTGGTTTGTTGGATATTTTACCAGGG
CTTGAGGGTGTCGCTAGCCTAAGCCGTGGCGATGATAAGCAACCACCGCTCAAATTGGGC
GGCGGCGTGGGCGATACGATTGGTGCGGCAATTTGTTATGAGGTGGCATATCCTGAGACG
ACGCGTAAAAATGCACTTGGCAGTAATTTTTTATTAACCGTCTCAAACGATGCTTGGTTT
GGTACAACAGCAGGTCCTTTGCAGCATTTACAAATGGTGCAAATGCGAAGCTTGGAGACG
GGGCGATGGTTTGTGCGTGCAACAAACAACGGAGTGACTGCATTAATTGACCATCAAGGA
CGGATTATCAAGCAGATACCGCAGTTTCAGCGAGATATTTTGCGAGGTGATGTACCCAGT
TATGTTGGACACACGCCTTATATGGTTTGGGGGCATTATCCCATGTTGGGGTTTTCTTTG
GTGCTGATTTTTCTTAGTATCATGGCAAAGAAAATGAAAAATACCACCGCCAAACGAGAA
AAATTTTATACCGCTC-ATGGTGTGGTAGACCGCTGAATTGTGCCACTTTGGGCGTTAGAG
CATGAGCAAGATTAGC-CGTTGGGTGAGCTTTGGTTGTATTACTCATCAGCCTACCCGAAA
CCTGCCAAACATCACCGCCCAAAACCTAAACATACAATGGCTAAAAATATCAGAAAATAA
CTTCCTGTATTGTAAATTCTTATGTTATCATGTGATAATAATTATCATTAGTACCAACAT
PL 211 037 B1
ATCCATTACTAAACTTCATCCCCCATCTTAACAGTrACCAAGCGGTGAGCGGATTATCCG
ATTGACAGCAAGCTTAGCATGATGGCATCGGCTGATTGTCTTTTTGCCTTGTTGTGTGTT
TGTGGGAGTTGATTGTACTTACCTTAGTGGTGGATGCTTGGGCTGATTTAATTAAATTTG
ATCAAAGC5GTCTTCACAACACACCAAACGAGATATCACC
SEKW. ID. NR: 46
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem tbpB z Moraxella catarrhalis
AGTTTGCCCTGATTTTGAGAGCCACTGCCATCATGAATTTGTTGGCGTAAACACCACTCG
TATTCTTCTTCGGTTTCCCCTTTCCATGCAAACACAGGGATACCAGCGGCCGCCATGGCA
GCGGCGGCGTGGTCTTGGGTGCTAAAAATATTGCATGATGTCCAGCGAACrTCTGCACCC
AAGGCAACCAAAGTCTCAATCAGCACCGCTGTTTGAATGGTCATGTGGATACAGCCTAGG
ATTTTAGCACCCTIAAGTGGTTGCTGGTCTTGATAGCGTTTTCTTAACCCCATCAGGGCT
GGCATCTCAGCTTCTGCCAAGGCAATCTCACGGCGACCATAATCGGCTAAACGGATATCA
GCGACTTTATAATCGGTGAAGTTTTGGGTGGTACTTGGATTGATTGAGGTAGGCATATCT
TTATTCCTAAGCTATTTTAAAGTATTTTTAACAATAATTTTGATGAATTTGAGATAATTG
ATGCTAAAAGGTTGAATGACCAAACCATCGCTAACAATCAAGAAAAGACArTTIAAGCAT
AAAAAGCAAATGTGTCTTGATGGCTTATTATAACAGTTATTATGATAAATTTGGGTAGAA
AGTTAAATGGATCGTTGGGTAAGTTTGTTGGCTATCCTTAATTAATTATAATTTTTTAAT
AATGCTTTTACTTTATTTTAAAAATAGAGTAAAAAATGGTTGGCTTTGGGTTTTTATCTC
ACTATGGTAGATAAAATTGATACAAAATGGTTTGTATTATCACTTGTATTTGTATTATAA
TTTTACTTATTTTTACAAACrATACACTAAAATCAAAAATTAATCACTTTGGTTGGGTGG
TTTTAGCAAGCAAATGGTTATTTTGGTAAACAATTAAGTTCTTAAAAACGATACACGCTC
ATAAACAGATGGTTTTTGGCATCTGCAATTTGATGCCTGCCTTGTGATTGGTTGGGGTGT
ATCGGTGTATCAAAGTGCAAAAGCCAACAGGTGGTCATTG
SEKW. ID. NR: 47
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem tbpA z Moraxeila catarrhalis
ITGGGGGCGGATAAAAAGTGGTCTTTGCCCAAAGGGGCATATGTGGGAGCGAACACCCAA
PL 211 037 B1
ATCTATGGCAAACATCATCAAAATCACAAAAAATACAACGACCATTGGGGCAGACTGGGG
GCAAATTTGGGCTTTGCTGArGCCAAAAAAGACCTTAGCATTGAGACCTATGGTGAAAAA
AGATTTTATC-GGCATGAGCGrTATACCGACACCATCGGCATACGCATGTCGGTTGATTAT
AGAATCAACCCAAAATTTCAAAGCCTAAACGCCATAGACATATCACGCCTAACCAACCAT
CGGACGCCCAGGGCTGACAGrAATAACACTTTATACAGCACATCATTGATTTATTACCCA
AATGCCACACGCTATTATCTrTTGGGGGCAGACTTTTATGATGAAAAAGTGCCACAAGAC
CCATCTGACAGCTATGAGCGrCGTGGCATACGCACAGCGTGGGGGCAAGAATGGGCGGGT
GGTCTTTCAAGCCGTGCCCAAATCAGCATCAACAAACGCCATTACCAAGGGGCAAACCTA
ACCAGTGGCGGACAAATTCGCCATGATAAACAGATGCAAGCGTCTTTATCGCTTTGGCAC
AGAGACATTCACAAATGGGGCATCACGCCACGGCTGACCATCAGTACAAACATCAATAAA
AGCAATGACATCAAGGCAAArTATCACAAAAATCAAATGTTTGTTGAGTTTAGTCGCATT
TTTTGATGGGATAAGCACGCCCTACTTTTGTTTTTGTAAAAAAATGTGCCATCATAGACA
ATATCAAGAAAAAATCAACAAAAAAAGATTACAAATTTAATGATAATTGTTATTGTTTAT
GTTATTATTTATCAATGTAAATTTGCCGTATTTTGTCCATCACAAACGCATTTATCATCA
ATGCCCAGACAAATACGCCAAATGCACATTGTCAACATGCCAAAATAGGCATTAACAGAC
TTTTTTAGATAATACCATCAACCCATCAGAGGATTATTTT
SEKW. ID. NR: 48
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem ompE z Moraxella catarrhalis
AAAGACATTACACATCATCArTCAAACGCCCAACCATGTACCTCTGCCCCGTGGTCGCAC
GCCAACGCTTTTTGATGCGGrGCGTTGGGTTCAGATGGCTTGTCAATCATTTGGTTTTAT
TAAAATTCATACCTTTGGTAGTTTGGCTTTACCTGATATGTCATTTGATTATCGAAACAA
TACGCAGTTGACCAAACATCAATTTTTAGCCArTTGCCAAGCACTCAATATTACCGCTCA
TACGACCATGCTTGGTATTAAATCATCACATAAAGATACTTTACATCCATTTGAATTGAC
ATTACCCAAATACGGCCATGCCTCAAATTATGATGATGAATTGGTGCAAAACAATCCATT
GGCTTATTTTCATCAACTGTCTGCCGTCTGCCGATATTTTTATACCCAAACGGTTTGTAT
TGTTGGCGGTGAAAGCTCAGGC-AAAACTACCTTGGTGCAAAAACTTGCCAATTATTATGG
TGCCAGCATCGCACCTGAAArGGGTCGATTATACACACACTCCCATCTCGGCGGTAGCGA
PL 211 037 B1
ACTTGCCCTTCAATACAGCGACTACGCATCCArTGCCATCAATCACGCCAACGCTATCGA
AACCGCTCGTACCACTGCCAGCTCTGCTGTTACACTGATTGATACTGATTTTGCGACAAC
GCAAGCATTTTGTGAAATTTATGAAGGGCGAACGCATCCGCTTGTCGCAGAATTTGCTAA
ACAAATGCGATTGGATTTTACGATTTATTTAGATAATAATGTTGCTTGGGTCGCTGATGG
CATGCGTAGGCTTGGTGATGATCATCAACGCAGTTTGTTCGCCAATAAATTGCTTGAGAT
TTTGGCACGATATGATATTAGTTATCATATCATTAATGACACCGACTACCACAAACGCTA
TCTACAAGCATTAAGCTTGATAGACAATCATAITTTTAATCATTTTACAAAAATTCATGA
CAATTAATTAGGGAAAATCTGATGAAAATTGATATTTTAG
SEKW. ID. NR: 49
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem uspal z Moraxella catarrhalis
GGATGTGGCATATCTGCCCArCGACCCAATACACATCGGTCGAGGCTATCAAGATGTGGT
ACGAATTAATAGCCAGTCAGGTAAGGGCGGTGCTGCGTATATCITGCAGCGGCATTTTGG
TITIAATTTACCACGCTGGACACAGATTGATirTGCTCGTGTGGTACAGGCITATGCAGA
AAGTATGGCGCGTGAACTAAAAACTGATGAGCTGCTTGAAATTTTTACCCAAGCGTATCT
TAAGCAAGATAAATTCCGCCrAAGTGACTATACCATCAGCAATAAAGGCGATGCTGTCAG
CITCCAAGGCCAAGTAGCGACACCCAAAGCGGTGITTGAGGTGATTGGICAAGGCAATGG
TGCGTTATCTGCGTTCATTGATGGCTTGGTGAAAICCACAGGCAGACAGATTCATGTCAC
CAATTACGCCGAACACGCCATCGATAACAAAACCCATCAAAAAACCGATACGGATAACCA
AACCGATGCCGCCGTGCCGCTTATATCCAGCTGTCGGTAGAGGGGCAGATTTATTCAGGC
ATCGCCACTTGCCATAGCACCGTATCCGCCATGCTAAAAGGTGCATTATCCGCTTTGGCA
CAGGCGTGGTAATCTGACCCAATCAAAATCCTGCATGATGGCAGGATTTTATTATTTAGT
GGGCTGCCCAACAATGATGATCATCAGCATGTGAGCAAATGACTGGCGTAAATGACTGAT
GAGTGTCTATTTAATGAAAGATATCAATATATAAAAGTTGACTATAGCGATGCAATACAG
TAAAATTTGTTACGGCTAAACATAACGACGGTCCAAGATGGCGGATATCGCCATTTACCA
ACCTGATAATCAGTTTGATAGCCATTAGCGATGGCATCAAGTTGTGTTGTTGTATTGTCA
TATAAACGGTAAATTTGGTTTGGTGGATGCCCCATCTGATTTACCGTCCCCCTAATAAGT
GAGGGGGGGGGAGACCCCAGTCATTTATTAGGAGACTAAG
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 50
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem uspa2 z Moraxella catarrhalis
CCCCAAGCTTTCCGTTTGTGTGCCTGCTGGTGTCGGGCGGTCATACCATGCTGGTGCGTG
CCGATGGTGTGGGCGTGTATCAGATATTGGGCGAGTCTATCGATGATGCGGTGGGTGAAT
GCTTTGATAAAACGGCAAAAATGCTCAAACTGCCCTATCCTGGTGGCCCAAATATCGAAA
AATTAGCCAAAAACGGCAACCCACACGCCTATGAGCTGCCAAGACCCATGCAGCATAAAG
GGCTGGATTTTTCGTTCAGTGGCATGAAAACCGCCATTCATAATCTCATCAAAGACACAC
CAAACGCCCAAAGCGACCCCGCCACACGAGCAGACATCGCCGCAAGCTTTGAGTATGCGG
TGGTGGATACTTTGGTCAAAAAATGCACCAAAGCACTACAGATGACAGGCATTCGCCAGC
TGGTGGTCGCAGGGGGCGTCTCTGCCAATCAGATGCTACGCCGGACCCTGACCGAGACGC
TCCGCCAAATCGATGCGTCGGTGTACTATGCCCCGACCGAGCTATGCACGGATAATGGTG
CGATGATCGCCTATGCTGGCTTTTGTCGGCTCAGCTGTGGACAGTCGGATGACTTGGCGG
TTCGCTGTATTCCCCGATGGGATATGACGACGCTTGGCGTATCGGCTCATAGATAGCCAC
ATCAATCATACCAACCAAATCGTACAAACGGTTGATACATGCCAAAAATACCATATTGAA
AGTAGGGTTTGGGTATTATTTATGTAACTTATATCTAATTTGGTGTTGATACTTTGATAA
AGCCTTGCTATACTGTAACCTAAATGGATATGATAGAGATTTTTCCATTTATGCCAGCAA
AAGAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAACTCTGTCTTTTATCTGTCCGCTGATGCTT
ICTGCCTGCCACCGATGATATCATITATCIGCITTTTAGGCATCAGTTATITCACCGIGA
TGACTGATGTGATGACTTAACCACCAAAAGAGAGTGCTAA
SEKW. ID. NR: 51
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem omp21 z Moraxella catarrhalis
GAGTGAACTTIAITGTAAAATATGATTCATTAAAGTATCAAAATCATCAAACGCAGCATC
AGGGTTTGCTAAATCAATTTTTTCACCATAATTATAGCCATAACGCACAGCAAGCGTAGT
TATGCCAGCGGCTTGCCCTGATAAAATATCATTTTTGGAATCACCAACCATAATGGCATC
AGTCGGTGCGATGCCCAGTGATTGACACAGGTATAATAAAGGCGTTGGGTCGGGCTTTTT
GACGCTGAGCGTATCACCGCCAATCACTTGGTCAAACAGTGTCAGCCATCCAAAATGTGA
PL 211 037 B1
TAAAATTTTAGGCAAATAACGCTCAGGCTTATTGGTACAAATTGCCAAATAAAACCCCGC
TGCTTTTAATCGrTCAAGCCCITGTATAACCCCTGCATAGCTTTGCGTATTTTCAATTGT
TTTATGGGCATArTCTGCCAAAAATAACTCATGGGCATGGTGAATCATAGTCGTATCATA
GATATGATGTGCrTGCATTGCTCGCTCAACCAATTTTAGCGAACCATTGCCCACCCAGCT
TTTGATGATATCAATTGGCATAGGCGGTAAGTTAAGCTTGGCATACATGCCATTGACCGC
CGCCGCCAAATCAGGGGCACTATCGATAAGCGTACCATCCAAATCAAATATAATCAGTTT
TTTGCCAGTCATTGACAGTGITTGCATGCTTTTTCCTTATTCTTAAAATTGGCGGCTGTT
TGGTATTTTTTAAATCAGTCAATTTTTACCATTTGTCATATAATGACAAAGTACAAATTT
AGCAATATTTTAGTGCATTTTTTGGCGAAGTTTTATGAAAACTGGTCATTGGTTGCAAAA
CTTTACACAGTACCTATAAAACTTGCACAGTTAATAAGAAATATTTTGTTACTATAGGGG
CGTCATTTGGAACAAGACAGrTATTTGTAAATAGTTATTTGCAAAAGACGGCTAAAAGAC
AGAACAGCGTTTGTTTCAGTGATTAAGTAGGAGAAAAACA
SEKW. ID. NR: 52
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem ompl06 z Moraxella catarrhalis
TTGATCGGTTTTGCCCCACTGTTTCATGATTTACTCAAAACAGGCGGCTTGATCGTGCTG
GCAGGTCTGACCCAAAACCAAACCCAAGCGGTCATCGATGCCTACTCGCCTTATGTTACG
CTTGATACGCCArTTTGTTArC-CAGATGCCCAAGACTGCCATTGGCAACGCCTAAGCGGC
ATCAAACCTACCAACCCATAAC-CGATATGCCATGAGCCACAAACCTAAGCCAACACCGCT
ATATCAACAAGTTGAGCAGACCGCCAAGCGTTATTTTGAGACATTGGGCGATGCTCATAC
TCATGATGTCTArGCCACTTTTTTGGGCGAATTTGAAAAACCGCTGCTCATCGCCGCACT
CAATCACACGCACGGCAATCAGTCAAAAACCGCCCAAATCCTTGGTATCAATCGTGGCAC
ATTACGCACCAAAATGAAAACCCATCACTTACTTTAGACCGCCAGTTATCGCCATGGATA
TGGGCAGGTGTGCTCGCCTGCCGTATGATGGCGATGACACCCCATTTGCCCCATATCTGC
ACGATTTGACATGATTTAACATGTGATATGAITTAACATGTGACATGATTTAACATTGTT
TAATACTGTTGCCATCATTACCATAATTTAGTAACGCATTTGTAAAAATCATTGCCCCCT
TTTTTTATGTGTATCATATGAATAGAATATTATGATTGTATCTGATTATTGTATCAGAAT
CGTCATGCCTACGAGTTGATITGGGTTAATCACTCTATTATTTGATATGTTTTGAAACTA
PL 211 037 B1
ATCTATTGACTTAAATCACCATATGGTTATAATTTAGCATAATGGTAGGCTTTTTGTAAA
AATCACAICGCAAIATTGTICTACTGTTACCACCATGCTTGAATGACGATCCAAATCACC
AGATTCATTCAAGTGATGTGTTTGTATACGCACCATTTACCCTAATTATTTCAATCAAAT
GCCTATGTCAGCATGTATCATTTTTTTAAGGTAAACCACC
SEKW. ID. NR: 53
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HtrB z Noraxella catarrhalis
ACTATTCTGCTTTTTGTTTTTCACGAATGCGAATGCCCAACTCACGCAACTGGCGATTAT
CAACTTCAGCAGGTGCTTCGGTCAATGGGCAATCTGCCGTCTTGGTTTTTGGGAAGGCGA
TCACATCACGGATTGAGCTGGCACCAACCATCAGCATAATCAGGCGATCTAGACCAAATG
CCAAACCACCGTGCGGCGGTGCACCAAAACGCAATGCArCCATCAAAAACTTAAACTTAA
GCTCTGCTTCTTCTTTAGAAATACCCAAGGCATCAAATACCGCCTCTTGCATGTCAACCG
TATIAATACGCAGCGAACCGCCACCAATTICTGTGCCArTIAGTACCATGTCATAGGCAA
TGGATAGGGCGGTITCGGGACTTTGTTTGAGTTCCTCAACCGAGCCITTTGGGCGTGTAA
AAGGATGATGAACTGATGTCCACTTACCATCATCAGTTrCCTCAAACATTGGAAAATCAA
CGACCCAAAGCGGTGCCCATTCACAGGTAAATAAATTTAAATCAGTACCGATTTTAACAC
GCAATGCACCCATAGCATCATTGACGATTTTGGCTTTATCGGCACCAAAGAAAATGATAT
CGCCAGTITGGGCATCGGTACGCTCAATCAGCTCAATCAAAACCICATCGGTCATATTTT
TAATGATGGGTGATTGTAATCCTGATTCTTTTTCAACGCCATTATTGATATTGCTTGCGT
CATTGACCTTAATATATGCCAATCCACGAGCGCCATAAATACCAACAAATTTGGTGTACT
CATCAATCTGCTTGCGACTCATGTTACCGCCATTTGGAATGCGTAAGGCAACAACACGGC
CTTTAGGATCTTGGGCGGGCCCTGAAAATACTTTAAATTCAACATGTTGCATGATGTCAG
CAACATCAATAAGTTTTAAGGGAATGCGTAAATCAGGCrTATCTGAGGCATAATCACGCA
TGGCATCTGCGTAAGTCATGCGGGGGAAGGTATCAAACTCA
SEKW. ID. NR: 54
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem MsbB z Mor$xella catarrhalis
TGGATCAIATTCTTTATTAATGGTACTGTTTAAACCTGrATTTTAAAGTTTATTGGGTCA
PL 211 037 B1
TATTTTCAAGCTCATCCCATCGC1CAAGCTTCATCATCAAAAGCTCATCAATCTCTACCA
ATCGCTCACCAGCCTTCGTTGCTGCCGCCAAATCGGTATTAAACCATGAACCATCTTCAA
TCTTTTTGGCAAGCTGTGCCTGCTCTrGTTCAAGTGCAGCAATTTCATTAGGCAAATCTT
CAAGTTCACGCTGCTCTTTATAGCTGAGTTTGCGTTTTTGGGCAACGCCTGATTGAGGTG
GTTTGATTTGGATGGGTTCAGCGGGTTTTGTCGCCTTAGGTTTATTGTCTGTGGCGTGAT
GAGCAAGCCATCTTTCATGCTGTTGTACATAGTCTTCATAACCGCCAACATATTCCAAAA
CGATACCGTCGCCGTACTTATCAGTArCAAATACCCAAGTTTGGGTAACAACATTATCCA
TAAAAGCACGGTCATGGCTGATGAGTAATACCGTGCCTTTAAAATTGACCACAAAATCTT
CTAAAAGCTCAAGTGTTGCCATATCCAAATCATTGGTAGGCTCATCAAGCACCAAAACAT
TGGCAGGTTTTAGCAATAATTTGGCCAATAAAACGCGTGCTTTTTCACCGCCTGATAGTG
CTTTAACAGGTGTGCGAGCACGATTTGGCGTGAATAAAAAATCTTGCAAATAGCTTAAAA
TGTGCGTAGTTTTTCCACCAACATCGACATGGTCAGAGCCTTCTGAAACATTATCTGCGA
TAGATTTTTCAGGGTCTAGGTCGTCTrTGAGTTGGTCAAAAAAAGCAATATTTAGATTGG
TGCCAAGCTTAACTGAACCTGACTGAATCGCTGAATCATCCAAACCCAAAATGCTTTTAA
TTAAGGTTGTTTTACCAACGCCATTTrTGCCAATGATACCAACTTTATCACCACGAACAA
GCAGCGTTGAAAAATCCTTAACTAAGGTTTTATTGTCGTAT
SEKW. ID. NR: 55
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem PilQ z Moraxella catarrhalis
CAACTTGAAAATCAGCTCAATGCTCTGCCACGCACAGCACCGATGAGCGAGATTATCGGA
ATGATAAATACCAAAGCACAAGCGGTrAATGTGCAGGTGGTGAGTGCATCAGTTCAAGCA
GGTCGTGAACAGGATTATTATACCGAACGCCCTATCGCAGTGAGTGCGACAGGGGATTAT
CATGCTTTGGGTCGATGGTTACTTGAGTTGTCAGAGGCTAACCATTTGCTGACAGTGCAT
GATTTTGATCTGAAGGCTGGTTTGAACCATCAGCTGATGATGATTGTTCAGATGAAAACT
TATCZYAGCGAACAAACGCCCAAAACCAGTTGCTCAGCAGGTGCCTGATGTTCAATGAATA
TTATCGGTGGGGCATTTTGGGTGCTTGGATTTGGGTTGGGATTGGATGTGCTGATAGCAC
CAGTCAAGTTGTTGATGATAAGCTTGCACATATTACCCATGAAGAGCGTATGGCGATCAG
TGAGCCTGTGCCGATACCCTTATCTGrGCCGATGATATATCAGCAAGGCAAAGATCCTTT
PL 211 037 B1
TATCAATCCTTATAGAAATGTTGAGGTTCTIGATACCAATCATGCCGCTGATCAGCAAGA
TGAGCCAAAAACCGAATCTACCAAAGCTTGGCCTATGGCAGACACTATGCCATCTCAGCC
ATCTGATACTCATCAGTCTGCCAAGGCTCAGGCACAAGTCTTCAAAGGCGATCCGATAGT
CATTGATACCAACCGTGTTCGAGAGCCTTTAGAAAGCTATGAGTTATCAAGCCTACGCTA
TCATGGTCGTATTTTTGATGATGTTAGACTTGTGGCACTCATTATGAGTCCTGATGGCAT
CGTTCATCGTGTGAGTACTGGACAATATCTTGGTAAAAATCACGGAAAAATTACCCATAT
TGACAGTCGTACGArACATCTGATTGAAGCGGTCGCTGATACACAAGGTGGCTATTATCG
CCGTGATGTAAACArTCATTTTATTCATAAGCAATGACAC
SEKW. ID, NR: 56
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipol8 z Moraxella catarrhalis
TTCATGCAACAAGCGACCATCTTGGCCGATGATACCATCCTGCTCACCTAAGAAAATCAG
TTTATCAGCTTGCAGGGCAArGGCTGTGGTCAGTGCTACATCTTCTGCCAATAGATrAAA
AATTTCGCCCGTAACCGAAAAACCTGTCGGICCTAGTAGGACAATATGGTCATTATCCAA
ATTATGGCGAATGGCATCGAGATCAATTGAGCGTACCTCACCTGTCATCTGATAATCCAT
ACCATCTCTGATGCCGTAAGGGCGAGCGGTGACAAAATTACCCGAAATGGCATCAArACG
AGATCCGTACATTGGGGAGTTAGCAAGCCCCATCGACAGCCGAGCTTCGArTTGTAGACG
AATTGAGCCGACTGCCTCCAAGATGGCAGGCATAGATTCATACGGTGTTACACGCACATT
CTCATGTAGGTTTGATATCAGCTTGCGATTTTGTAAATTTTTTTCCACTTGTGGGCGTAC
ACCATGCACAAGCACCAATTrGATGCCCAAGCTGTGTAGCAGTGCAAAATCATGAArCAG
CGTACTAAAATIGTCACGAGCGACCGCCTCATCACCAAACATAACCACAAAGGTTTrGCC
ACGATGGGTGTIAArGTACGGGGCAGAATTACGAAACCAATGCACAGGTGTGAGTGCAGG
AGTGTTCTGATAGGrGCTGACAGAATTCATGAATGCTCCAAAGAGTCAATGGCTGGrAAA
ATAAGAATGGCGAACAATATATGGCGAGAGCGTCTGATGTTGGTCAAATGTCCCATrAAT
AACTATCAAGATACCATCATACCATAGCAAAGTTTTGGGCAGATGCCAAGCGAATTrATC
AGCTTGAlAAGGTTGGCATATGATTlAAAICTACCATCATCGTCGCCAGTTrTGAGCATGT
GTAAGTAGTTACCATAATTAAACAGTCAAGAAATTCACACCGTCAATCAGCTGTGCrATG
CTTATGGGCACATAAAACTTGACCAACACAGGATAAATTIA
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 57
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipoll z Moraxella catarrhalis
GGCATACTTTTGCCATGCTTTATTTTGGCATAACTGCTATAAGCCCATTGCTACTTrTTA
TCATTTATCCATATGTCCAATAATGTGCTTTATGTAATTTAGGCACACTATTAACTCGTG
CCACTGTTAACATTCAGCATAAAAATCTTAACAATGAATCAAAGCATCGTATTGGCTGTT
AAATGATAAGCTTATATrTATTTAAATTCAGACTAAATGATTGTAATATGGACATArCAA
GGTTGAAATCAAAAATTrTGGAGAGTTATGTACGATAATGATAAAAAATTGACCACCATC
GTAGGGGTGTTGTATACGGTGTCTTATATTGCCATATGGTTGGTCAGTGGCTATATrTTA
TGGGGCTGGATTGGTC-TGACAGGATTTACTCGTGCGATACTTTGGCTGATCGCTTGGATG
ATTGTGGGTACGATTGCrGATAGAATTCTGATACCGATTATTTTGACCGTCGTGGTrGGG
TTATTTTCTATCTTTTTTGAAAAAAGGCGATAATTTGGTTATTTTTTCACAAAAAArCAT
GATTTTTTTTGTAAACTATCTAAAATATCAATTATGTTATATTATGTGATAAAAGATGGG
CATGCTTAAGTTTTGGArTGCAAAAATCCTAATATCATCACTGACCAAAGCTGTGATGAT
ATCAAAACTTTATCAAAGTTCTTAGGGTATTATCAAGATATCATACCAAATGAATACTTA
CCCAACTTACTATAAAAATCAAATGATATGACTGTGATTTTATTATCATAGATACAAAAA
TCAAAACGCATGAGCCAAAGGTATGATGAATGAATACAAAATTTCGCACACATTATGACA
ATCTAAATGTCGCCAGAAACGCTGACATTGCGGTGATTTGGTGGGATAGGGGTCAAGCCA
GTGCGATTAAGCTAAATrTTTATGTGGGCAATCGCTGACTTTATTTTATTTGTGCCAGTT
GGAACAATTCGTGGTCTAATGTATTTATTTTAAGGAGATAA
SEKW. ID. NR: 58
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipolO z Moraxella catarrhalis
TCTGGTCTACATCCCAAACTATTTACACAAGAAACACTAAAGACAGTGGAGCAGATGACG
CTCAAAAAGGCATCTTArAGTAATTTGACAGTTAATTTTCGTCAAGTGCTTGTACAAAAA
TACACCATCGTGCAAGAAGTTTGTACCAATTTAAGCACAATCATTTTGGCACACACTGTC
AAGCAATGCTTCAGGCAAATTAGCTGCTGGTAAAGATACTTGGGTCATCATGCAATCGCA
TCAACCCTTCTTGCTGCGTTGAAGCGATAAGTTTGCCATCTTGCCAAAATTGACCArGGT
PL 211 037 B1
TTAGACCCTTGGCGTGGCTTGTGGTATCGCTCCACATGTCGTAGAGTAGArATTCGGTCA
TATCAAAAGC-GCGATGGAAATGTATGGAATGGTCAATACTAGCCATTrGIAGACCTTGTG
TCATCAGGCITAGCCCATGACTCATIAAACCTGTGCIGACCAAArAATAArCAGACACAA
ACGCAAGTAGTGCTTGATGAATGGCAACTGGCTGCTCCCCAATATCAGCGATACGCACCC
AATTGGCTTC-GCGTGGACGCTCAGGCTTGGGTGTCACAGGGTCTCGTGGTGTGACGGGGC
GGATTTCGACATGACGCTGACGCATAAATCTTGCTTTGAGTGGTTCGGGAATTTTATGTA
AATAATCCGCTTTGAGTTCTTGCTCGGTTTTTAGGCTTTCAGGGGGTGGAIAATCAGGCA
TGGTTTCTTGGTAATCAAGCCCGCCTTCCATGGGTGAAAATGAGGCAATCATCGAAAAAA
TGACCTGTTCATTGGTCGTATGATTACCGTTTTTGTCGGTGGTTGGCACATATTGCACCG
CAATGACTTCTCGAGCTGATAAACTGCGTCCATCACGTAAGCGGCGTACTTGATAGATGA
CTGGTAGACC-AATATCGCCACCTCGTAAAAAATAACCATGTAGGCTATGACAAGGTTTAT
CAATCGTTAATGTGTTAGCACCAGCAAGCAGCGCTTGGGCA
SEKW. ID. NR: 59
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipo2 z Moraxella catarrhalis
ΤAAAATGACCTTACAAAATAAAATTATATGTTCAAAAATCGCTTAAGΓΑΤΓGAAAAAAGC
TATAAAAACTTATCTATTAAAGCATAAAAGATATTAAAGCATAAAAGACGAGAAAAGAGC
AAGCGTCAATGATGATATTTCATATAAAAACTTATGAAATTTTTCAATTTrTTATCGATT
GATTCAGCTTGGCTATCGGTGGTCAACTTTGGCTGCCAAGACATCGCCGGCTTTTTGAAA
AATCATCACAATGGCAACAATGATGATGGTTGAAATCCACTTGACATATACCATGTTGCG
ATGCTCACCATAGTTAATCGCAAGGCTTCCCAAGCCACCACCGCCAACCACACCTGCCAT
TGCAGAATAACCAATCAAAGACACCAAGGTCAATGTGACCGCATTAATCAAAATGGGCAG
GCTTTCAGCAAAATAGTATTTGCTGACAACCTGCCAATGCGTTGCACCCATAGATTTGGC
AGCTTCGGTCAGTCCTGTGGGTACTTCTAATAAAGCATTGGCACTCAAGCGTGCAAAAAA
TGGAATTGCIGCCACACTCAAAGGGACGATGGCGGCTGTTGTGCCAAGGGrTGTTCCCAC
CAAAAATCGTGTGACTGGCATGAGAATAATGAGCAAAATAATAAAAGGAACGGAGCGACC
AATATTAATAATAACATCCAAAATTACAAATACACTGCGATTTTCAAGGATACGCCCTTT
ATCGGTTAAAAATGCCAAAAACCCTATCGGTAGCCCAACCAAAACAGCGATGGCAGTGGC
PL 211 037 B1
AGCAAGCCCCATATAGATGGTTTCCCAAGTGGATTGGGCAACCATCTCCCACATTCTTGG
GTGCATTTCACTGACAAATTTTGTGACGATTTCATTCCACATAGCCGATAATCTCAATAT
TGACCCGATGGGTGGTTAAAAATTCTATTGCTrGCATGACCGAGGTGCCTrCACCGATAA
GCTCAGCAATGGTAAAGCCAAATTTTATATCACCTGCATAA
SEKW. ID. NR: 60
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipo? z Moraxella catarrhalis
AGTAAACAATGGTAACAAATACAGCAGTGTCGCACAGTCCTCAGTACGATGATTCTGAAT
TTGAATATGCAGGATTTTGGATACGATTTGTGGCATGTCTTGTCGATAATrTAATTGTTA
TGATTATAATTGCACCGTATTGGTTTTATAATrATCAGCAAATGATGGCCATGCCTGCTG
ACCAAATACCGTTTTATAGTGTTGGGGATGCCATCCTTTATAGTGCTGGGGATGCTATCC
TAAACTTAGTGATGGCGGCGGCGGTTGTTTGGrTTTGGGTAAAAAAAGGTGCAACACCAG
GTAAAATGCTCTTTGGGCTGCAAGTCCGTGATGCCAAAACAGGGCAATTTATCAGTGTGC
CAAGGGCATTATTGCGATATTTTAGTTATCTGATTrCATCCGTGATTCTTrGTTTGGGAC
TTATTTGGGTTGGTTTTGATAAGAAAAAACAAGGCTGGCATGATAAAATTGCCAAAACTG
TTGTGGTAAAACGCATTCGCTGATGGGTCGCCAGTTAAACAATAAAACCArCAAACGCAA
GCAGGGCGATGTGTTTGAGCAGTTGGGGGTAGATAAGCTAAAACAAGCAGGCTATGAAAT
TATTTTAACCAACTTTACCACCCCATTTGTTGGTGAGATTGATATTATCGCCAGACAGCC
TTTGGAGCAATCGCACCGTTTGGTGCAGCCAAGATTTTGTACGGTATTTGrTGAAGTGCG
TAGCCGAACAAGTTCTGTGTATGGTACAGCGCrTGAGAGTGTTACCTCAAAAAAGCAGGC
AAAAATCTACCGAACAGCAGAACGATTTTTAArCAATTATCCCAAATATArTGATGATGC
ATACCGTTTTGATGTCATGGTTTTTGATTTGGrTGATGGATTGATTGAACATGAATGGAT
AAAAAATGCGTTTTGATTGGCTCAATGGTCGTGAATTAAAATCAATCAAGCAATCCGTAG
CTTTACTATAAGATATATCCCAGTAATATGGAAACATAGCA
SEKW. ID. NR: 61
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipo6 z Moraxella catarrhalis
CGTTTAGCTTCATACGCAGACCTTGTGCACCTrCGGGCAACCGAAGCATCACGCCAGCAT
PL 211 037 B1
CACGCATCCGCACAAAACCCATCATGCCATCAATTTCGCTGCTGATATGATATACCCCCA
CCAAAGTAAACCGCTTAAATCGTGGAATAACGCCTGCTGCTGAGGGTGAGGCTTCAGGCA
AAACCAAGGTAACCTTArCCCCCAACTTAAGTCCCATGTCAGAGACAATGGACTCACCTA
ATATAATACCAAACTCGCCGATATGTAAATCATCCAAATTGCCTGCGGTCATATGCrCAT
CAATGATAGAAACTTGCTTTrCGTAATCAGGCTCAATGCCAGAAACCACGATTCCAGTCA
CCTGACCTTCAGCGGTTAACATACCTTGTAGTTGAATATAAGGGGCAACTGCTTGCACTT
CTGGATTTTGCATTTTGATTrTTTCGGCAAGTTCTTGCCAATTTGTCAAAATTTCTGTTG
AGGTAACTGAAGCTTGAGGCACCATGCCAAGAATGCGTGATTTAATTTCACGGTCAAAGC
CATTCATGACCGACAAAACCGTGATAAGCACTGCAACCCCAAGCGTAAGCCCAATGGTTG
AGATAAAAGAAATAAAGGAAATAAAGCCATTTTTACGCTTAGCTTTGGTATATCTAAGCC
CAATAAATAACGCCAAGGGACGAAACATAAGCTGTGTTCCAAACGACCCAACCGTGCTAG
TTTAGCACTTTTTTGGACAAATACCAAACATCACATAACAAATGAATCATCAGGTIGGTT
TTGTTGCGCTTGTGTATCTGrATGATAAGTTTCTTGCTAAAACAGCTTTTTTATGTCAGA
ATACAGAAAAGGTATATACTrATATTTTTAACTTTAAATAGATCTGCTTTTTTATACCGA
TGATTTGGCATGAAGTTTATCGGTCTGATATGCTGGATATAAGTTTATCGGCTTGArATA
AATTTTAATTAATCATCAAATTTTTAAGGAATTTATCATTA
SEKW. ID. NR: 62
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P6 z
Moraxella catarrhalis
TAAGGATACCAGATTTTGGCrTGTCAATCGTTGTGTTAATCATTGTAACGGTTTATAGTG
ATTGTCAATTAATAAGGGTAAAAAAGTATTTATCAAGTAATAATCTTTCTTATATGrGAA
TATAATGACAAATTTATCACATTTTTACAAGGATTTTTTATCAAGATTAGGATATGrTCC
AGCTTAATTATTAGTGATGAGCGTGTGATTATTTGGCATCGTTAAATTTATGAGTGCTAA
AATTGCCAAATGATTAAAATTTTGCTAACATGATAGCCCCTTTGGTAGGCTTTATTTGGT
ATTGATGAGCAATAATAATArACCGAGTTAAATGGATTAACTTAACATACGCCAAAAACT
TAACAACGAAAAGTAGATGArTATGACAGATACAGTACAAAAAGATACAGCACAGTCCCC
CAAAAAAGTTTATCTAAAAGACTACACGCCGCCAGTATATGCAGTTAATAAAGTGGATTT
GGATATCCGCTTGTTTGATGATCATGCTGTCGTTGGTGCCAAACTTAAAATGACACGAGC
PL 211 037 B1
ACACGCAGGCGAGCTTCGGCrTCTTGGGCGAGATTrAAAGCTTAAAAGCATTCACCTAAA
TGGTCAGGAATTAGAGTCGCAGGCGTATCATCTTGATAAGGAAGGCTTAACAATTTTAGA
TGCACCAGATGTCGCAGTGArTGAGACAlTGGTTGAGATTTCACCACAAACCAACACAAC
ACTTGAAGGGCTATATCAAGCAGGAACAGGTGATGATAAGATGTTTGTGACACAATGCGA
ACCTGAGGGTTTTCGCAAAArCACCTTTTrCCCTGACCGCCCTGATGTTTTGACAGAATA
CACCACACGCCTAGAAGCACCAAAGCATTTTAAAACCTTGCTTGCCAATGGTAATTTGGT
TGAGTCAGGAGATGTGGATGAAAATCGCCATTATACCATTTGGCATGATCCTACCAAAAA
ACCCAGCTATCTATTCGCCGCTGTCATTGCCAATCrAGAAG
SEKW. ID. NR: 63
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem MsbB z Haemophilus influenzae (HiRd)
AAATCAAGCGCCTGTGCCTGCTGGTGATGGTTGTGGAGACGAATTATATTCTTGGTTTGA
ACCGCCAAAACCAGGCACTTCAGTGAGCAAACCTAAAGTTACACCGCCTGAGCCGTTTTT
GTGCCAACAGATTTTGAACTCACCGAATCGGAGAGAATGGITAGAATAGCATTGAGGTAA
ATCAATATGGATATCGGCATrGATCTTTTAGCAATATTGTTTTGTGTTGGTTTTGTCGCA
TCATTTATCGATGCAATTGCrGGCGGrGGrGGATTAATCACCATTCCAGCGTTACTCATG
ACAGGTATGCCACCAGCAATGGCGTTAGGCACCAACAAATTGCAAGCTATGGGCGGTGCA
TTATCCGCAAGCCTITATTICTTGCGAAAAAGAGCGGTCAATTTACGCGATATTTGGTTT
ATTTTGATTTGGGTTTTCTIAGGTTCTGCCCTAGGrACATTATTAATTCAATCAATTGAC
GTGGCGATTTTCAAAAAAATGCTTCCTTTTTTGATrTTAGCCATTGGTCTATATTTTTTA
TTTACTCCTAAATTAGGTGArGAAGArCGAAAACAACGATTAAGTTATCTGTTATTTGGT
CTTTTAGTTAGCCCATTTTTAGGTTTTTArGAIGGCTTCTTTGGGCCAGGGACTGGCTCA
ATCATGAGTTTAGCCTGTGTrACTTTGCTAGGATTrAATCTCCCGAAAGCGGCAGCACAT
GCAAAAGTGATGAACTTCACrTCGAACCTrGCTTCrTTTGCACTTTTCTTATTGGGCGGA
CAAATTCTTTGGAAAGTGGGrTTCGTGATGATGGCrGGGAGCATTTTAGGTGCAAATTTA
GGTGCCAAAATGGTGATGACGAAAGGrAAAACCTTGATTCGACCGATGGTTGTTATCATG
TCTTTTATGATGACGGCTAAAATGGTTTACGATCAGGGTTGGTTTCATTTTTAATTCGGA
AAGCGCGCAAAAGTGCGGTTAAAATTAATrACATTTTATTA
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 64
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HtrB z Haemophilus influenzae (HiRd)
TTGAAGTCCCCAATTTACCCACCACAATTCCTGCGGCAACATTGGCTAGGTAACAAGATT
CTTCGAAAGAACGTCCATCTGCTAATGTGGTTGCTAATACACTAATGACAGTGTCACCGG
CTCCCGTCACATCAAACACTTCTTTTGCAACGGTTGGCAAATGATAAGGCTCTTGATTTG
GGCGTAATAATGTCATGCCTTTTTCAGAACGCGTCACCAAAAGTGCGGTTAATTCAATAI
CAGAAATTAATIITAAACCTTTCTTAATAATCICTTCTTCTGTATTACATTTACCTACAA
CGGCTTCAAATICAGACATATTGGGTGTCAATAATGTAGCCCCACGATAACGTTCAAAAI
CAGTTCCCTTTGGATCGATCAACACAGGCACATTCGCTTTGCGTGCAATTTGAATCATTT
TCTGAACATCTITAAGCGTGCCTTTGGCGTAATCAGAAAGAATCAAAGCACCGTAArTTI
TCACCGCACTTTCTAACTTCGCTAATAAATCCTTGCAATCTACATTATTGAAATCTrCTT
CAAAATCAAGGCGGAGCAGCTGTTGATGACGAGATAAAATACGTAATTTAGTAATGGTTG
GATGGGTTTCTAATGCAACAAAATTACAATCAATCTTTTGTTTTTCTAATAAGTGGGAAA
GTGCAGAACCTGICTCATCTTGTCCAATCAATCCCATTAACTGAACGGGTACATTGAGTG
AAGCAATATTCAICGCCACATTTGCAGCACCGCCCGCGCGITCTTCATTTTCTIGTACGC
GAACTACTGGCACTGGTGCTTCTGGTGAAATACGGTTGGTTGCACCGAACCAATAACGAI
CAAGCATCACAICGCCTAATACAAGTACTTTTGCTTGCTTAAATTCTGCTGAATATrGAG
CCATTTTAAAAICTCTCTATTTGAATAACCAAAATTGTGGCGATTTTACCACAACTCAAA
TTTACGATAAACTACGCCCCTAACTTACGTGGAAAGAACAA
SEKW. ID. NR: 65
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem białka D z Haemophilus influenzae (HiRd)
AGCAATAATTATAGCTGGAATATTCTTTAAAGATGAAAGAGATCGTATAAGACAAAAAGA
ATTTTATATTGGAGAATTATTAGCAATTATTGGTTCGCTAATATTCGTAATAAATAGTTC
AAATAATGATGGAAATACAGACTTTTTTCTTGGGGCAATATTTCTTTTTACAGCTATTTT
TATTCAATCTGTACAGAATTTAATTGTAAAAAAAGTAGCCAAAAAGATAAATGCTGTTGT
AATAAGTGCATCGACAGCAACAATTTGAGGAGTATTATTTTIATGTTTAGCTTTTAATAC
PL 211 037 B1
TAAACAAATATATTrATTACAAGATGTTGGCATTGGAATGTTGATAGGTTTAGTTTGCGC
TGGCTTTTATGGGATGCTAACAGGGATGTTGATGGCTTTTTATATTGTTCAAAAACAGGG
AATCACTGTTTTTAACATTTTGCAATTATTAATTCCTCTTTCAACTGCGATAATAGGTTA
CTTAACATTAGATGAAAGAATAAATATCTATCAGGGAATTAGCGGTATTATTGTAATTAT
TGGTTGTGTATTGGCATTAAAAAGAAAAAACAAGGAGTGTTGATATATAAAGTAGATGAr
GTTGGTGGAATAGGTATAGTTAAATATCTGGTTCAATTGGTTTTATTAAGGGCGTTAGCA
ATTCTCCATTTAAGrTTATGTTTGAATTAGATATTTTGGGAAAAGATGGAAGAATAAAGC
TGTIAAATAATGCTGAAACATATGAACTATACCAATACTCAAATAAAAATAATTCTGCTG
GAAATGATTATAAArCTCTAATTCTAACTTGTAGAGAGGATAATGACTATCAATCAGAAA
GAATGATTAAAGCCATTAAAAATATTATTCATTGTATGACTAATAATCATCAACCTATTT
CAAGTGCTGAAACATCTTTAGAAACTATTAAAATTATTCACGGAATAATTAATTCTGTTA
AAATAGGTAATGATCCTAACAATATATAAGGAGAATAAGT
SEKW. ID. NR: 66
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Hin47 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TAAATACTCCAAAATAAATTTCAGATTiACGTGGTCIGTAAGACATiAAAAATAAAAAAAAr
GTTCAATAAC-AGGAGAGCAAATTATCTTGTTTAAAAGGAAATCGGAGCAGTACAAAAACG
GTCITACAAC-TAGCAAATTCTATAAATTTATGTTCIAATACGCGCAATTTTCTAGTCAAT
AAAAAGGTCAAAAAATGAGCTGGATTAACCGAATTTTTAGTAAAAGTCCTTCTTCTTCCA
CTCGAAAAGCCAATGTGCCAGAAGGCGTATGGACAAAATGTACTGCTTGTGAACAAGTAC
TTTATAGTGAAGAACTCAAACGTAATCTGTATGTTTGCCCGAAATGTGGTCATCATATGC
GTAITGATGCTCGTGAGCGTTTATTAAATTTATTGGACGAAGATTCAAGCCAAGAAATTG
CGGCAGATTTAGAACCAAAAGATATTTTAAAATTCAAAGATTTAAAGAAATATAAAGATC
GTAICAATGCGGCGCAAAAAGAAACGGGCGAGAAAGATGCGCTAATTACTATGACAGGTA
CACTTTATAATATGCCAATCGTTGTGGCTGCATCGAACTTTGCTTTTATGGGCGGTTCAA
IGGGTTCTGTAGTTGGTGCAAAATTTGTTAAAGCGGCTGAAAAAGCGATGGAAATGAATT
GTCCATTTGTGrGTTTCTCTGCGAGTGGTGGTGCTCGTATGCAGGAAGCATTATTCTCTr
TAATGCAAATGGCAAAAACTAGTGCCGTACTTGCTCAAATGCGTGAAAAGGGTGTGCCAT
PL 211 037 B1
TTATTTCAGTArTAACGGATCCGACTTTAGGCGGCGTńrCAGCCAGTTTTGCGATGTTAG
GGGATTTAAATATTGCCGAGCCAAAAGCCTTAATTGGTrTTGCAGGGCCACGCGTTATTG
AACAAACTGTGCGTGAAAAATTGCCAGAAGGTTTCCAACGTAGTGAGTTTCTACTTGAGA
AAGGGGCAATTGATATGATCGTGAAACGTTCAGAAATGCGT
SEKW. ID. NR: 67
Sekwencja nuklectydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P5 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TCACTTAATTCAAGCGCATCAATGTTTTCTAAAACATCAACAGAATTGACCGCACTTGTA
TCTAAAATTTCGCCATTTATTAAGACTGCGCGTAATGCCAAAACATGATTAGAGGTTTTA
CCATATTGCAATGAGCCTTGCCCAGAGGCATCGGTGTTAATCATTCCACCTAAAGTCGCT
CGATTGCTGGTGGACAGTTCTGGGGCAAAGAACAAACCATGTGGTTTTAAAAATTGATTA
AGTTGATCTTTTACTACGCCTGCTTGTACTCGAACCCAACGTTCTTTTACATTGAGTTCT
AAGATGGCTGTCATATGACGAGAAAGATCCACTATTATATTGTTATTGATGGATTGCCCA
TTTGTGCCAGTGCCTCCACCGCGAGGCGTAAAGCTGATrGATTGATATTCAGGTAAATTT
GCCAATTTTGTTATCCGCACTATATCAGCAACCGTTTTCGGAAAAAGAATTGCTTGTGGA
AGTTGTTGGTAAACGCTGTTATCCGTAGCCAGACTTAArCTATCTGCATAGTTTGTCGCA
ATATCCCCCTCAAAATGTTGGCATTGAAGATCATCAAGATAATCAAGTACATATTGTTCA
ACTTGAGGAATGCGATTTAGATTTGGCAACATAGTATTTGACCCATTTAAACATATCAGA
TGGAGGCTTTGATAATATCCTAAGGCTAGAATAATGTCGATTAGGAAAGAGAGAGGAGAA
AGTAAAAAGTCTGTTTAAGAAAGTGTTATTTTGGATAAAAACTAAACAAAAAATTCAAAA
GAATTTGATCTrTTCAATTTTTATAGGATAATAAGCGCACTTTTGAACGTTCCTTTGGGG
TAAACATAAGCAAAGGAATTGAATTTGTCAAAAGGTAATAAAGTAGGGCAAATTCAAAAC
CCTAGTTAAGTGACTC-TTTATAATGTAGCTTTAATTAAAAGTTCAGTATAAACAAGGACA
CTTTTTATTACTATTCGATCACTAAATAGAGGACATCAAAA
SEKW, ID, NR: 68
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem D15 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TCGATTGTATCCTATATAAATTATAGACGTAAAAAATCATTAAATAATGCAAACACCGTT
PL 211 037 B1
AAGCTTAATAACAGTGCTGCGCCAATTCGATAACAGATGCTTTGCACCCGCTCAGAAACA
GGTTTTCCTTTAACAGCTTCCATTGTTAAAAAAACTAAATGACCGCCATCTAATACTGGT
AATGGAAATAAAT TCATAATCCC ΤAAAT Τ TACAC TAATCAAT GC CATAAAAC Τ ΤAAAAAA
TACACCAATCCAATATTTGCTGATGCGCCAGCACCTTTrGCAATAGAAATTGGCCCACTT
AAATTATTTAATGACAAATCGCCAGTAAGTAATTTCCCTAATATTTTCAAGGTTAAAAGG
GAAAGCTGTCCTGTTTTTTCAATGCCTTTTTGTAAAGATTCAAGAATACCATATTTTAAT
TCAGTACGGTATTCATCCGCTAATTTTGTTAAGGCTGGGCTAACCCCAACAAACCATTTG
CCATTTTGATTACGCACTGGAGTTAGGACTTTGTCAAArGTTTCTCCATTACGTTCAACT
TTAATAGAAAAAGATTCGCCTTGTTCGACCTGTTTTATAAAATCTTGCCAAGGAAGTGCG
GTTAAATTTTCTTTTAAAATTTTATCACCGATTTGTAAACCAGCTTTCTCAGCGGGAGAA
TTTTGAACAACTTTAGAAAGCACCATTTCAATTTTAGGACGCATAGGCATAATCCCTAAT
GCCTCAAAAGCACTTTCTTTTTCAGGATCGAATGTCCAATTTGTAAGATTTAAAGTCCGT
TGTTGTTCAATATTAGAATTGAAAGGAGAAAGGCTAATCTCAACATTAGGCTCCCCCATT
TTTGTGGCAAGTAGCATATTGATGGTTTCCCAATCTTGAGTTTCTTCGCCATCAATTGTA
AGAAITTGCGTATTGGGTTCAATGTGGGCTTGTGCTGCGATTGAGTTTGGTGTTATTGAT
TCAATCACTGGTTTAACCGTTGGCATTCCATAAAGGTAAAT
SEKW. ID. NR: 69
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Omp26 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TTTGATAAATATCCTTAATTAAATGATGGGTTTAATATTTTCTCTGCCCAATTAAATTAG
GCAGAGAACGTTGTTTTTGAGTTCTGATGAAGAAAAAAGTTCAATTTATTAGAAAGAACC
TCCAATACTAAATTGGAACTGTTCGACATCATCATTTTCATATTTTTTAATTGGTTTGGC
ATAAGAGAATACCAATGGCCCAATAGGAGATTGCCATTGGAATCCGACACCTGTAGAGGC
GCGAATACGGCTTGATTTGCCATAATCGGGTAAGCTTTrTAATACATTGTTATCTAACCC
ACTCTTATCCGATTTCCACTTAGTATTCCAAACACTTGCCGCATCAACAAATAGGGAGGT
TCGGACTGTATTTTGGCTTTTATCACTCACAAACGGTGTTGGTACAATAAGTTCTGCACT
CGCAGTTGTGATTGCATTACCACCAATCACATCAGAACTTATCTTCTTAAAAGTACCATT
ACCATTACCATGTTCTGCATAAATTGCGTTAGGTCCAArACTACCATAAGCAAAACCACG
PL 211 037 B1
TAATGAACGGATGCCACCCGCTGTATAAGTTTGATAGAACGGTAAACGCTTGTTTCCAAA
ACCATTTGGATATCCTGCAGATGCTTTTGCAGATACAACCCAGAGGTGATCTCTGTCTAA
TGGGTAGAAACCCTGTACGTCTGCACrTAGTTTGTAGTATTTGTTATCAGAACCTGGAAT
AGTAACTCGTCCACCAAGACTTGCTTrAACCCCTTTAGTTGGGAAATAGCCTCTATTAAG
GCTGTTATAGTTCCAACCAAAAGAAAAATCAAAGTCATTTGTTTTAATGCCATTACCTTT
AAATTTCATTGATTGAATATATAAATTACGGTTATATTCTAGAGCAAAGTTACTAATTTT
ATTATAGGTATGGCCTAATCCTACATAATAGGAGTTATTTTCATTTACAGGGAAACCTAA
AGTAACATTACTTCCATAAGTCGTACGCTTATAGTTAGAGG
SEKW. ID. NR: 70
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P6 przed genem Haemophilus influenzae (HiRd)
TTAGATTTCTCCTAAATGAGTTTTTTATTTAGTTAAGTATGGAGACCAAGCTGGAAATTT
AACTTGACGATCACTTCCTGGAAGGCrCGCCTTAAAGCGACCAICTGCGGAAACCAATTG
TAGCACCTTTCCTAAGCCCTGTGTAGAACTATAAATAATCATAArTCCATrTGGAGAGAG
GCTTGGGCTTTCGCCTAGAAAAGATGrACTAAGTACCTCTGAAACGCCCGTTGTGAGATC
TTGTTTAACTACATTATTGTTACCATrAATCATCACAAGTGTTTTTCCATCTGCACTAAT
TTGTGCGCTACCGCGACCACCCACTGCTGTTGCACTACCACCGCrTGCATCCATTCGATA
AACTTGTGGCGAACCACTTCTATCGGATGTAAATAAAATTGAATrTCCGTCTGGCGACCA
CGCTGGTTGAGTATTATTACCCGCACCACTCGTCAATTGAGTAGGTGTACCGCCATTTGC
TCCCATAAGC-TAAATATTCAGAACACCATCACGAGAAGAAGCAAAAGCTAAACGAGAACC
ATCTGGCGAAAAGGCTGGTGCGCCATrATGCCCTTGAAAAGATGCCACTACTTTACGTGC
GCCAGAATTIAAATCCTGTACAACAAGTTGTGATTTTTTATTTTCAAACGATACATAAGC
CAAACGCTGC-CCGTCTGGAGACCAAGCTGGAGACATAATTGGTTGGGCACTACGATTGAC
GATAAATTGATTATAGCCATCATAATCTGCTACACGAACTICATAAGGTTGCGAACCGCC
ATTTTTTT3CACAACATAAGCGATACGAGTTCTAAAGGCACCACGGATCGCAGTTAATTT
TTCAAAAACTTCATCGCTCACAGTATGCGCGCCATAGCGTAACCATTTATTTGTTACTGT
ATAGCTATTTTGCATTAATACAGTCCCTGGCGTACCTGATGCACCAACCGTATCAATTAA
TTGATAAGTAATACTATAACCATTACCCGATGGAACCACTT
PL 211 037 B1
SEKW. ID. NR: 71
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem TbpA przed genem Haemophilus influenzae (atypowe)
GGCGATAACCGAGTTTTrGGGGTATTTAGTGCCAAAGAAGACCCACAAAACCCAAAATTA
TCCAGAGAAACCrTAATTGATGGCAAGCTAACTACTTTTAAAAGAACTGATGCAAAAACC
AATACAACAGCCGATACAACAACCAATAAAACAACCAATGCAATAACCGATGAAAAAAAC
TTTAAGACGGAAGATATACTAAGTTTTGGTGAAGCTGATTATCTTTTAATTGACAATCAG
CCTGTTCCGCTTTTACCTGAAAAAAATACrGATGATTTCATAAGTAGTAGGCATCATACT
GTAGGAAATAAACGCTArAAAGIGGAAGCATGTTGCAAGAATCTAAGCTATGTAAAATTT
GGTATGTATTATGAAGACCCACTTAAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAC
CAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAACAAACGACGACAACATCTATCGAGACTTATTATCAA
TTCTTATTAGGTCACCGrACTC-CCAAGGCCGACATACCTGCAACGGGAAACGTGAAATAT
CGCGGTAATTGGTTTGGrTATATTGGTGATGACACGACATCTTACTCCACTACTGGAGAT
AAAAATGCTCTCGCCGAGTTTGATGTAAATTTTGCCGATAAAAAGCTAACAGGCGAATTA
AAACGACACGATAATGGAAATACCGTATTTAAAATTACTGCAGACCTTCAAAGTGGTAAG
AATGACTTCACTGGTACAGCAACCGCAACAAATTTTGTAATAGATGGTAACAATAGTCAA
ACTGGAAATACCCAAATTAATATTAAAACTGAAGTAAATGGGGCATTTTATGGACCTAAG
GCTACAGAATTAGGCGGTTATTTCACGTATAACGGAAATTCTACAGCTAAAAATTCCTCA
ACCGTACCTTCACCACCCAATTCACCAAATGCAAGAGCTGCAGTTGTGTTTGGAGCTAAA
AAACAACAAGTAGAAACAACCAAGTAATGGAATACTAAAAA
SEKW. ID. NR: 72
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem TbpB z Haemophilus influenzae (HiRd)
TAGAATTATATTCTTATACAAAATTGATAATTGTTCGCATTATCATTTTTTTTTTGTAAT
AATGTCAACTTArAATTrTTTAAGTTCATGGATAAAATATGAAAAAIGGCGTAAAACAAC
TTTTTCTCTTATCATTAATAGC-CTTATCATTAACGAATGTAGCTTGGGCAGAAGTTGCAC
GTCCTAAAAATGATACATTGACAAATACGATTCAAAGTGCGGAATTAAAAACCTCCTCTT
TTTCCTCTATGCCTAAGAAAGAAATACCAAATAGGCATATTATTTCTCTTTCCAAAAGCC
PL 211 037 B1
AATTAGCGCACCATCCAAGGCTTGTTTTGCGTGGGTTAATTCCTGCTTTATATCAAAATA
ACACTCAGGCAGTTCAACTGTTATTACCACTATATAAACAATTTCCTCAACAAGATAATT
TCTTACTAACTTGGGCAAAGGCTATTGAAGCTCGTGAACAAGGTGATTTAACTCAATCTA
TTGCTTATTATCGTGAATTATTCGCTCGAGACGCATCTTTACTACCTTTACGTTATTAAT
TAGCTCAAGCTCTATTTTTTAACTATGAAAATGAAGCTGCCAAAATTCAATTTGAAAAAT
TACGTACAGAGGTAGATGATGAAAAATTTTTAGGTGTTATTGATCAGTATCTTTTAACAC
TAAATCAGCGGAATCAATGGATATGGCAAGTAGGATTAAATTTTTTAAATGATGATAATT
TGAATAACGCTCCAAAAAGTGGCACAAAAATTGGTAGTTGGACCGCTTGGGAAAAAGAAA
GTGGGCAGGGGGTAGGGTATTCTTTATCAGTAGAAAAAAAATGGCCATGGGCAGATCATT
TTTTTAGTAAAACTATGTTTAATGGGAATGGAAAATATTATTGGGATAATAAAAAATACA
ATGAGGCIACTGTGCGTATAGGTGGTGGTTTAGGCTATCAAACTGCCTCAGTTGAAGTCT
CGTTGTTTCCTTTTCAAGAAAAACGCTGGTATGCAGGCGGT
SEKW, ID, NR: 73
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HifA (piliny) z Haemophilus influenzae (genom LKP serotypu 1)
TAATAAATTGCTCCATAAAGAGGT1TGTGCCTTATAAATAAGGCAATAAAGATTAATATA
AACCGTTTATTAAAATGCCAAAGGCTTAATAAACAGCAAACTTTGTTTTCCCAAAAAAAG
TAAAAAACTCTTCCATTATATATATATATATATATAATTAAAGCCCTTTTTGAAAAATTT
CATATTTTTTTGAATTAATTCGCTGTAGGTTGGGTTTTTGCCCACATGGAGACATATAAA
AAAGATTTGTAGGGTGGGCGTAAGCCCACGCGGAACATCATCAAACAACTGTAATGTTGT
ATTAGGCACGGTGGGCTTATGCCTCGCCTACGGGGAAATGAATAAGGATAAATATGGGCT
TAGCCCAGTTTATGGATTTAATTATGTTGAAATGGGGAAAACAATGTTTAAAAAAACACT
TTTATTTTTTACCGCACTATTTTTTGCCGCACTTTGTGCATTTTCAGCCAATGCAGATGT
GATTATCACTGGCACCAGAGTGATTTATCCCGCTGGGCAAAAAAATGTTATCGTGAAGTT
AGAAAACAATGATGATTCGGCAGCATTGGTGCAAGCCTGGATTGATAATGGCAATCCAAA
TGCCGATCCAAAATACACCAAAACCCCTTTTGTGATTACCCCGCCTGTTGCTCGAGTGGA
AGCGAAATCAGGGCAAAGTTTGCGGATTACGTTCACAGGCAGCGAGCCTTTACCTGATGA
TCGCGAAAGCCTCTTTTATTTTAATTTGTTAGATATTCCGCCGAAACCTGATGCGGCATT
PL 211 037 B1
TCTGGCAAAACACGGCAGCTTTATGCAAATTGCCATTCGCTCACGTTTGAAGTTGTTTTA
TCGCCCTGCGAAACTCTCGATGGATTCTCGTGATGCAATGAAAAAAGTAGTGTTTAAAGC
CACACCTGAAGGGGTGTTGGTGGATAATCAAACCCCTTATTATATGAACTACATTGGTTT
GTTACATCAAAATAAACCTGCGAAAAATGTCAAAATGGTTG
SEKW. ID. NR: 74
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HifE (piliny) z Haemophilus influenzae (genom LKP serotypu 1)
TAGTAGATTTCCGCACGGGCAAAAATACAATGGTGTTATTTAACCTCACTTTGCCAAATG
GCGAGCCAGTGCCAATGGCATCCACCGCACAAGATAGCGAAGGGGCATTTGTGGGCGATG
TGGTGCAAGGTGGTGTGCTTTTCGCTAATAAACTTACCCAGCCAAAAGGCGAGTTAATCG
TCAAATGGGGTGAGCGAGAAAGCGAACAATGCCGTTTCCAATATCAAGTTGATTTGGATA
ACGCACAAATACAAAGTCACGATATTCAATGCAAAACCGCAAAATAAATAATTGAAGAGG
ATTTATGCAAAAAACACCCAAAAAATTAACCGCGCTTTTCCATCAAAAAICCACTGCTAC
TTGTAGTGGAGCAAATTATAGTGGAGCAAATTATAGTGGCTCAAAATGCTTTAGGTTTCA
TCGTCTGGCTCTGCTTGCTTGCGTGGCTCTGCTTGATTGCATTGTGGCACTGCCTGCTTA
TGCTTACGATGGCAGAGTGACCTTTCAAGGGGAGATTTTAAGTGATGGCACTTGTAAAAT
TGAAACAGACAGCCAAAATCGCACGGTTACCCTGCCAACAGTGGGAAAAGCTAATTTAAG
CCACGCAGGGCAAACCGCCGCCCCTGTGCCTTTTTCCATCACGTTAAAAGAATGCAATGC
AGATGATGCTATGAAAGCTAATCTGCTATTTAAAGGGGGAGACAACACAACAGGGCAATC
TTATCTTTCCAATAAGGCAGGCAACGGCAAAGCCACCAACGTGGGCATTCAAATTGTCAA
AGCCGATGGCATAGGCACGCCTATCAAGGTGGACGGCACCGAAGCCAACAGCGAAAAAGC
CCCCGACACAGGTAAAGCGCAAAACGGCACAGTTATTCAACCCCGTTTTGGCTACTTTGG
CTCGTTATTACGCCACAGGTGAAGCCACCGCAGGCGACGTTGAAGCCACTGCAACTTTTG
AAGTGCAGTATAACTAAAATATTTATTATCCAGTGAAAAAA
SEKW. ID. NR: 75
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P2 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TTATCCGCTA ACATTTCATC AGTAATTCCA TGAACTTTAA TCGCATCAGG
PL 211 037 B1
51 ATCANCGGGG CGATCTGGCT TAATATAAAT ATGAYAATTA TTACCTGTGT
101 AACGACGATT IATTAATTCA ACTGCACCAA ITTCAATAAT GCAGTGTCCT
151 TCATAATGCG CGCCAAGCTG ATTCATACCT GTAGTTTCAG TATCTAATAC
201 AATTTGGCGA TTGGGATTAA TCATTTGTTC AACCTATCTC TTTCCATTAA
251 AATACTTGCC ATTCTACACA ACAACCTTTT TGTTATGCCK AAACAGATTG
301 AAATTTTTAC TGATGGATCT TGCTTAGGTA ATCCAGGGGC GGGCGGAATT
351 GGTGCCGTAT TGCGTTATAA ACAACATGAA AAAACACTCT CCAAAGGCTA
401 TTTCCAAACC ACCAATAATC GAATGGAATT ACGCGCTGTC ATTGAAGCAT
451 TAAATACATT AAAAGAACCT TGCTTCATCA CGCTTTATAG TGATAGCCAA
501 TATATGAAAA ATGGCATAAC CAAATGGATC TTTAACTGGA AAAAAAATAA
551 TTGGAAAGCA AGTTCTGGAA AGCCTGTAAA AAACCAAGAT TTATGGATAG
601 CCTTAGATGA ATCCATCCAA CGTCATAAAA TTAATTGGCA ATGGGTAAAA
651 GGCCATGCTG GACACAGAGA AAATGAAATT TGCGATGAAT TAGCAAAAAA
701 AGGGGCAGAA AATCCGACAT TGGAAGATAT GGGGTACATA GAAGAATAAT
751 ACAACTGATA TAACGTCATA TTTTTCGATA CCTAAAAATA TTTAATACTT
801 AAACCTAAAA CAGAATAAAA AATAATCAAA TTCATTTAAA AAATGTGATC
851 TCGATCAGAT TTCAAGAAAA TTAAAATTTT GGAGTATTGA CATCAAAAAT
901 TTTTTTTGTA AAGATGCAGC TCGTCCGTTT TGGCGATTGG ACAATTCTAT
951 TGGAC-AAAAG TTCAATCATA GATAGTAAAC AACCATAAGG AATACAAATT
1001 A
SEKW. ID. NR: 76
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA (częściowa) genu HtrB Moraxella catarrhalis
TCAGTGCTTG GTTTTTTAAG ATATGTACCG CTGTCAGTCC TGCATGGATT
GGCGGCGTGT GCGTCTTATA TTTCCTATCA TTGCAGGCTT AGTATTTATC
101 GCAGCATCCA AGCCAATTTA ATCTTGGTTC ACCCCAAGAT GCCAGACGCA
151 CAGCGGCAAA AACTCGCCAA ACAAATCCTA AAAAATCAGC TCATCAGTGC
201 AGTCGACAGT CTTAAAACTT GGGCAATGCC ACCAAAATGG TCTATCGCAC
PL 211 037 B1
251 AAATTAAAAC GGTTCATCAT GAAGATATCC TAATCAAAGC ACTTGCCAAT
301 CCAAGTGGTA TGCTTGCCAT TGTGCCTCAT ATCGGCACTT GGGAGATGAT
351 GAATGCTTGG CTCAATACCT TTGGCTCCCC TACTATCATG TATAAGCCCA
401 TCAAAAATGC GGCGGTAGAT CGCTTTGTTT TACAGGGGCG TGAAAGACTA
451 AATGCCAGCC TTGTACCCAC AGATGCTAGT GGTGTTAAGG CAATTTTTAA
501 AACACTCAAA GCAGGTGGAT TTAGTATCAT ACTGCCCGAC CATGTACCTG
551 ATCCATCńGG TGGTGAGATT GCTCCTTTTT TTGGTATTAA AACCCTAACC
601 AGTACGCTGG CGTCAAAGCT TGCTGCAAAA ACTGGTTGTG CTCTTGTTGG
651 CTTAAGCTGT ATTCGGCGTG AAGATGGCGA TGGTTTTGAA ATTTTTTGTT
701 ATGAATTAAA TGATGAACAA CTTTATTCAA AAAATACCAA AATTGCAACC
751 ACTGCTTTAA ATGGTGCGAT GGAACAAATG ATTTATCCAC ATTTTTTGCA
801 TTATATGTGG AGCTATCGTC GGTTCAAGCA TACACCACTA TTAAATAATC
851 CTTATTTACT TAATGAAAAT GAGCTAAAAA AAATAGCCAT AAAGCTTCAA
901 GCCATGTCAA AGGATAGTTA TGAG
Sekwencja białka: 25% tożsamości i 35% podobieństwa do HtrB z
E. coli
SVLGFLRYVP LSVLHGLAAC ASYISYHCRL SIYR£IQANL ILVHPKMPDA
51 QRQKLAKQIL KNQLISAVDS LKTWAMPPKW SIAQIKTVHH EDILIKALAN
101 PSGMLAIVPH IGTWEMMNAW LNTFGSPTIM YKPIKNAAVD RFVLQGRERL
151 NASLVPTDAS GVKAIFKTLK AGGFSIILPD HVPDPSGGEI APFFGIKTLT
201 STLASKLAAK TGCALVGLSC IRREDGDGFE IFCYELNDEQ LYSKNTKIAT
251 TALNGAMEQM IYPHFLHYMW SYRRFKHTPL LNNPYLLNEN ELKKIAIKLQ
301 AMSKDSYE
SEKW. ID. NR: 77
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu HtrB Neisseria (meningokoka B)
ATGTTTCGTT TACAATTCGG GCTGTTTCCC CCTTTGCGAA CCGCCATGCA
CATCCTGTTG ACCGCCCTGC TCAAATGCCT CTCCCTGCTG CCACTTTCCT
PL 211 037 B1
101 GTCTGCACAC GCTGGGAAAC CGGCTCGGAC ATCTGGCGTT TTACCTTTTA
151 AAGGAAGACC GCGCGCGCAT CGTCGCCAAT ATGCGTCAGG CAGGCATGAA
201 TCCCGACCCC AAAACAGTCA AAGCCGTTTT TGCGGAAACG GCAAAAGGCG
251 GTTTGGAACT TGCCCCCGCG TTTTTCAGAA AACCGGAAGA CATAGAAACA
301 ATGTTCAAAG CGGTACACGG CTGGGAACAT GTGCAGCAGG CTTTGGACAA
351 ACACGAAGGG CTGCTATTCA TCACGCCGCA CATCGGCAGC TACGATTTGG
401 GCGGACGCTA CATCAGCCAG CAGCTTCCGT TCCCGCTGAC CGCCATGTAC
451 AAACCGCCGA AAATGAAAGC GATAGACAAA ATCATGCAGG CGGGCAGGGT
501 TCGCGGCAAA GGAAAAACCG CGCCTACCAG CATACAAGGG GTCAAACAAA
551 TCATCAAAGC CCTGCGTTCG GGCGAAGCAA CCATCGTCCT GCCCGACCAC
601 GTCCCCTCCC CTCAAGAAGG CGGGGAAGGC GTATGGGTGG ATTTCTTCSG
651 CAAACCTGCC TATACCATGA CGCTGGCGGC AAAATTGGCA CACGTCAAAG
701 GCGTGAAAAC CCTGTTTTTC TGCTGCGAAC GCCTGCCTGG CGGACAAGGT
751 TTCGATTTGC ACATGCGCCC CGTCCAAGGG GAATTGAACG GCGACAAAGC
801 CCATGATGCC GCCGTGTTCA ACCGCAATGC CGAATATTGG ATACGCCGTT
851 TTCCGACGCA GTATGTGTTT ATGTACAACC GCTACAAAAT GCCG
Sekwencja białka - 30% tożsamości i 38t podobieństwa do Htrb
E. coli
1 MFRLQFGLFP PLRTAMHILL TALLKCLSLL PLSCLHTLGN RLGHLAFYLL
51 KEDRARIVAN MRQAGMNPDP KTVKAVFAET AKGGLELAPA FFRKPEDIET
101 MFKAVHGWEH VQQALDKHEG LLFITPHIGS YDLGGRYISQ QLPFPLTAMY
151 KPPKIKAIDK IMQAGRVRGK GKTAPTSIQG VKQIIKALRS GEATIVLPDH
201 VPSPQEGGEG VWVDFFGKPA YTMTLAAKLA HVKGVKTLFF CCERLPGGGG
251 FDLHIRPVQG ELNGDKAHDA AVFNRNAEYW IRRFPTQYLF MYNRYKMP
SEKW. ID. NR: 78
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu HtrB z Haemophilus influenzae (atypowe)
ATGAAAAACG AAAAACTCCC TCAATTTCAA CCGCACTTTT TAGCCCCAAA
PL 211 037 B1
51 ATACTGGCTT TTTTGGCTAG GCGTGGCAAT TTGGCGAAGT ATTTTATGTC
101 TTCCCTATCC TATTTTGCGC CATATTGGTC ATGGTTTCGG TTGGCTGTTT
151 TCACATTTAA AAGTGGGTAA ACGTCGAGCT GCCATTGCAC GCCGTAATCT
201 TGAACTTTGT TTCCCTGATA TGCCTGAAAA CGAACGTGAG ACGATTTTGC
251 AAGΛΛAATCT TCGTTCAGTA GGCATGGCAA TTATCGAAAC TGGCATGGCT
301 TGGTTTTGGT CGGATTCACG TATCAAAAAA TGGTCGAAAG TTGAAGGCTT
351 ACATTATCTA AAAGAAAATC AAAAAGATGG AATTGTTCTC GTCGGTGTTC
401 ATTTCTTAAC GCTAGAACTT GGCGCACGCA TCATTGGTTT ACATCATCCT
451 GGCATTGGTG TTTATCGTCC AAATGATAAT CCTTTGCTTG ATTGGCTACA
501 AACACAAGGC CGTTTACGCT CCAATAAAGA TATGCTTGAT CGTAAAGATT
551 TACGCGGAAT GATCAAAGCT TTACGCCACG AAGAAACCAT TTGGTATGCG
601 CCTGATCACG ATTACGGCAG AAAAAATGCC GTTTTTGTTC CTTTTTTTGC
651 AGTACCTGAC ACTTGCACTA CTACTGGTAG TTATTATTTA TTGAAATCCT
701 CGCAAAACAG CAAAGTGATT CCATTTGCGC CATTACGCAA TAAAGATGGT
751 TCAGGCTATA CCGTGAGTAT TTCAGCGCCT GTTGATTTTA CGGATTTACA
801 AGATGAAACG GCGATTGCTG CGCGAATGAA TCAAATCGTA GAAAAGGAAA
851 TCATGAAGGG CATATCACAA TATATGTGGC TACATCGCCG TTTTAAAACA
901 CGTCCAGATG AAAATACGCC TAGTTTATAC GATTAA
Sekwencja białka - 57% tożsamości i 66% podobieństwa do HtrB
£. coli
1 MKNEKLPQFQ PHFLAPKYWL FWLGVAIWRS ILCLPYPILR HIGHGFGWLF
51 SHLKVGKRRA AIARRNLELC FPDMPENERE TILQENLRSV GMAIIETGMA
101 WFWSDSRIKK WSKVEGLHYL KENQKDGIVL VGVHFLTLEL GARIIGLHHP
151 GIGVYRPNDN PLLDWLQTQG RLRSNKDMLD RKDLRGMIKA LRHEETIWYA
201 PDHDYGRKNA VFVPFFAVPD TCTTTGSYYL LKSSQNSKVI PFAPLRNKDG
251 SGYTVSISAP VDFTDLQDET AIAARMNQIV EKEIMKGISQ YMWLHRRFKT
301 RPDENTPSLY D*
PL 211 037 B1
SEKW, ID. NR: 79
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu MsbB z Haemophilus influenzae (atypowe)
1 ATGTCGGATA ATCAACAAAA TTTACGTTTG ACGGCGAGAG TGGGCTATGA
51 AGCGCACTTT TCATGC-TCGT ATTTAAAGCC TCAATATTGG GGGATTTGGC
101 TTGGTATTTT CTTTTTATTG TTGTTAGCAT TTGTGCCTTT TCGTCTGCGC
151 GATAAATTGA CGGGAAAATT AGGTATTTGG ATTGGGCATA AAGCAAAGAA
201 ACAGCGTACG CGTGCACAAA CTAACTTGCA ATATTGTTTC CCTCATTGGA
251 CTGAACAACA ACGTGAGCAA GTGATTGATA AAATGTTTGC GGTTGTCGCT
301 CAGGTTATGT TTGGTATTGG TGAGATTGCC ATCCGTTCAA AGAAACATTT
351 GCAAAAACGC AGCGAATTTA TCGGTCTTGA ACATATCGAA CAGGCAAAAG
401 CTGAAGGAAA G AAT AT TAT T CTTATGGTGC CACATGGCTG GGCGATTGAT
451 GCGTCTGGCA TTATTTTGCA CACTCAAGGC ATGCCAATGA CTTCTATGTA
501 TAATCCACAC CGTAATCCAT TGGTGGATTG GCTTTGGACG ATTACACGCC
551 AACGTTTCGG CGGAAAAATG CATGCACGCC AAAATGGTAT TAAACCTTTT
601 TTAAGTCATG TTCGTAAAGG CGAAATGGGT TATTACTTAC CCGATGAAGA
651 TTTTGGGGCG GAACAAAGCG TATTTGTTGA TTTCTTTGGG ACTTATAAAG
701 CGACATTACC AGGGTTAAAT AAAATGGCAA AACTTTCTAA AGCCGTTGTT
751 ATTCCAATGT TTCCTCGTTA TAACGCTGAA ACGGGCAAAT ATGAAATGGA
801 AATTCATCCT GCAATC-AATT TAAGTGATGA TCCTGAACAA TCAGCCCGAG
851 CAATGAACGA AGAAATAGAA TCTTTTGTTA CGCCAGCGCC AGAGCAATAT
901 GTTTGGATTT TGCAATTATT GCGTACAAGG AAAGATGGCG AAGATCTTTA
951 TGATTAA
Sekwencja białka - 451 tożsamości i 561 podobieństwa do genu
MsbB z E. coli
MSDNQQNLRL TARVGYEAHF SWSYLKPQYW GIWLGIFFLL LLAFVPFRLR
DKLTGKLGIW IGHKAKKGRT RAQTNLQYCF PHWTEQQREQ VIDKMFAVVA
101 QVMFGIGEIA IRSKKHLGKR SEFIGLEHIE QAKAEGKNII LMVPHGWAID
151 ASGIILHTQG MPMTSMYNPH RNPLVDWLWT ITRQRFGGKM HARQNGIKPF
PL 211 037 B1
201 LSHVRKGEMG YYLPDEDFGA EQSVFVDFFG TYKATLPGLN KMAKLSKAW
251 IPMFPRYNAE TGKYEMEIHP AMNLSDDPEQ SARAMNEEIE SFVTPAPEQY
301 VWILQLLRTR KDGEDLYD*
SEKW. ID. NR: 80
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu MsbB
Moraxella catarrhalis
1 ATGAGTTGCC ATCATCAGCA TAAGCAGACA CCCAAACACG CCATATCCAT
51 TAAGCATATG CCAAGCTTGA CAGATACTCA TAAACAAAGT AGCCAAGCTG
101 AGCCAAAATC GTTTGAATGG GCGTTTTTAC ATCCCAAATA TTGGGGAGTT
151 TGGCTGGCTT TTGCGTTGAT TTTACCGCTG ATTTTTCTAG CGCTGCGTTG
201 GCAGTTTTGG ATCGGCAAGC GTCTTGGCAT TTTGGTACAT TACTTAGCTA
251 AAAGCCGAGT TCAAGACACT CTAACCAACC TGCAGCTTAC CTTCCCAAAT
301 CAACCAAAAT CAAAACACAA GGCCACCGCA CGGCAAGTAT TTATTAATCA
351 AGGTATTGGT ATTTTTGAAA GTTTATGTGC ATGGTTTCGC CCTAATGTCT
401 TTAAACGCAC TTTTAGCATT TCTGGTTTAC AGCATTTGAT TGATGCCCAA
451 AAACAAAATA AAGCGGTGAT TTTACTTGGT GGACATCGCA CGACGCTTGA
501 TTTGGGCGGT CGGTTATGTA CACAGTTTTT TGCGGCGGAC TGCGTGTATC
551 GCCCACAAAA CAACCCTTTG CTTGAATGGT TTATCTATAA TGCACGCCGC
601 TGTATCTTTG ATGAGCAAAT CTCAAATCGT GAIATGAAAA AACTCATCAC
651 TCGGCTCAAA CAAGGTCGGA TAATTTGGTA TTCACCTGAT CAAGATTTTG
701 GTCTTGAGCA TGGCGTGATG GCGACCTTTT TTGGTGTGCC TGCAGCAACG
751 ATTACCGCTC AGCGTCGTCT TATTAAGCTG GGTGATAAAG CCAATCCTCC
801 TGTCATCATC ATGATGGATA TGCTCAGACA AACGCCCGAT TATATCGCAA
851 AAGGTCACCG TCCACATTAT CACATCAGCC TAAGCGCTGT GTTAAAAAAT
901 TATCCCAGCG ATGACGAAAC CGCCGATGCT GAACGCATCA ATCGACTGAT
951 TGAGCAAAAT ATTCAAAAAG ATTTAACCCA GTGGATGTGG TTTCATCGCC
1001 GCTTTAAAAC TCAAGCCGAT GACACCAATT ACTATCAACA TTAATG
PL 211 037 B1
Sekwencja białka - 28% tożsamości i 37 podobieństwa do genu
MsbB z E. coli
1 MSCHHQHKQT PKHAISIKHM PSLTDTHKGS SGAEPKSFEW AFLHPKYWGV
51 WLAFALILPL IFLPLRWQFW IGKRLGILVH YLAKSRVQDT LTNLQLTFPN
101 QPKSKHKATA RQVFINQGIG IFESLCAWFR POTFKRTFSI SGLQHLIDAQ
151 KQNKAVILLG GHRTTLDLGG RLCTQFFAAD CVYRPQNNPL LEWFIYNARR
201 CIFDEQISNR DMKKLITRLK GGRIIWYSPD QDFGLEHGVM ATFFGVPAAT
251 ITAGRRLIKL GDKANPPVII MMDMLRGTPD YIAKGHRPHY HISLSAVLKN
301 YPSDDETADA ERINRLIEQN IQKDLTQWMW FHRRFKTQAD DTNYYGH*
SEKW. ID. NR: 81
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu MsbB a Neisseria (meningokoka B)
1 ATGAAATTTA TATTTTTTGT ACTGTATGTT TTGCAGTTTC TGCCGTTTGC
51 GCTGCTGCAC AAACTTGCCG ACCTGACGGG TTTGCTCGCC TACCTTTTGG
101 TCAAACCCCG CCGCCGTATC ggcgaaatca ATTTGGCAAA ATGCTTTCCC
151 GAGTGGGACG GAAAAAAGCG CGAAACCGTA TTGAAGCAGC ATTTCAAACA
201 TATGGCGAAA CTGATGCTTG AATACGGCTT ATATTGGTAC GCGCCTGCCG
251 GGCGTTTGAA ATCGCTGGTG CGTTACCGCA ATAAGCATTA TTTGGACGAC
301 GCGCTGGCGG CGGGGGAAAA AGTCATCATT CTGTACCCGC ACTTCACCGC
351 GTTCGAGATG GCGGTGTACG CGCTTAATCA GGATGTACCG CTGATCAGTA
401 TGTATTCCCA CCAAAAAAAC AAGATATTGG ACGCACAGAT TTTGAAAGGC
451 CGCAACCGCT ACGACAATGT CTTCCTTATC GGGCGCACCG AAGGCGTGCG
501 CGCCCTCGTC AAACAGTTCC GCAAAAGCAG CGCGCCGTTT CTGTATCTGC
551 CCGATCAGGA TTTCGGACGC AACGATTCGG TTTTTGTGGA TTTTTTCgGT
601 ATTCAGACGG CAACGATTAC CGGCTTGAGC CGCATTGCCG CGCTTGCAAA
651 TGCAAAAGTG ATACCCGCCA TCCCCGTCCG CGAGGCGGAC AATACGGTTA
701 CATTGCATTT CTACCCGGCT TGGGAATCCT TTCCGAGTGA AGATGCGCAG
751 GCCGACGCGC AGCGCATGAA CCGTTTTATC GAGGAACCGT GCGCGAACAT
PL 211 037 B1
801 CCCGAGCAGT ATTTTTGGCT GCACAAGCGT TTCAAAACCC GTCCGGAAGG
851 CAGCCCCGAT TTTTACTGAT ACGTAA
Sekwencja białka - 25% identyczność i 36% identyczność do
MsbB E. coli
1 MKFIFFVLYV LQFLPFALLH KLADLTGLLA YLLVKPRRRI GEINLAKCFP
51 EWDGKKRETV LKQHFKHMAK LMLEYGLYWY APAGRLKSLV RYRNKHYLDD
101 ALAAGEKVII LYPHFTAFEM AVYALNQDVP LISMYSHQKN KILDAQILKG
151 RNRYDNVFLI GRTEGVRALV KGFRKSSAPF LILPDGDFGR NDSVFVDFFG
201 IQTATITGLS RIAALANAKV IPAIPVREAD NTVTLHFYPA WESFPSEDAQ
251 ADAQRMNRFI EEPCANIPSS IFGCTSVSKP VRKAAPIFTD T*
Postacie wykonania wynalazku zostały opisane poniżej:
A. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków z Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego, który jest możliwy do otrzymania przy użyciu jednego lub więcej sposobów wybranych z następującej grupy:
a) sposób redukowania immunodominujących zmiennych lub nie-ochronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy określania tożsamości takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wytwarzania mniej lub wcale wspomnianego antygenu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
b) sposób regulacji w górę ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia sekwencji silniejszego promotora przed genem kodującym wspomniany antygen, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
c) sposób regulacji w górę ekspresji wyrażanych warunkowo, ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla usunięcia represywnych mechanizmów kontrolnych jego ekspresji, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
d) sposób modyfikowania porcji A lipidu bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w wytwarzaniu porcji A lipidu toksycznego LPS, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla zredukowania lub wyłączenia ekspresji wspomnianego genu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
e) sposób modyfikowania porcji A lipidu bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w wytwarzaniu porcji A lipidu mniej toksycznego LPS, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia sekwencji silniejszego promotora przed wspomnianym genem, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
f) sposób zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmujący etapy modyfikowania chromosomu szczepu bakteryjnego dla zawarcia genu kodującego peptyd polimyksynę A, lub jego pochodną lub analog, połączonego z antygenem ochronnym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu; lub
g) sposób wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pęcherzyków obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla usunięcia zmiennych regionów genu kodującego wspomniany antygen, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu.
B. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków opisany w punkcie A, który można otrzymać wykorzystując jeden lub więcej dalszych sposobów wybranych z następującej grupy:
h) sposób zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu,
PL 211 037 B1 modyfikowania szczepu bakteryjnego dla zredukowania lub wyłączenia ekspresji wspomnianego genu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu; lub
i) sposób regulacji w górę ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia do chromosomu jednej lub więcej dalszych kopii genu kodującego wspomniany antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencje promotorową, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu.
C. Preparat pęcherzyków według wynalazku opisany w punkcie A lub B, przy czym etapy modyfikowania w sposobach a), b), c), d), e), h) i i) wykonuje się przez rekombinacje homologiczne między sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym, i sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym w obrębie szczepu.
D. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie C, przy czym etapy modyfikowania wykonuje się przez podwójne rekombinacje homologiczne crossing-over między dwiema sekwencjami mającymi co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową 'X', i dwiema sekwencjami mającymi co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym w obrębie szczepu oddzielonymi przez sekwencje nukleotydową 'Y', gdzie podczas rekombinacji X i Y są zamieniane.
E. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie D, przy czym dwie sekwencje nukleotydów mają w przybliżeniu tę samą długość, i że wektor stanowi liniowa cząsteczka DNA.
F. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie D lub E, przy czym rekombinacje w sposobach a), b), c), d), e) i h) wykonuje się w regionie chromosomu 1000 bp przed kodonem inicjacji genu, o który chodzi.
G. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie F, przy czym dla sposobu a),
d) lub h) sekwencja nukleotydowa X zawiera cześć regionu promotorowego genu, zaś sekwencja nukleotydową Y albo zawiera region słabego promotora, albo nie zawiera regionu promotora.
H. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie F, przy czym dla sposobu b) lub e) sekwencja nukleotydowa Y zawiera region silnego promotora dla bakterii.
I. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie H, przy czym sekwencję nukleotydową Y wstawia się 200-600 bp przed kodonem inicjacji genu, o który chodzi.
J. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie I, przy czym sekwencję nukleotydową Y wstawia się w przybliżeniu 400 bp przed kodonem inicjacji genu, o który chodzi.
K. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie F, przy czym dla sposobu c) sekwencja nukleotydowa X zawiera część represyjnej sekwencji kontrolnej promotora, zaś sekwencja nukleotydowa Y nie zawiera takiej sekwencji.
L. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie D lub E, przy czym rekombinacje w sposobach a), d) i h) wykonuje się tak, że sekwencja nukleotydowa X zawiera część sekwencji kodującej genu stanowiącego przedmiot zainteresowania.
M. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie D lub E, przy czym rekombinacje w sposobie i) wykonuje się tak, że sekwencja nukleotydowa Y zawiera dalej kopię genu w kasecie ekspresyjnej.
N. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie A-M, który jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Neisseria meningitidis B.
O. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie N, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu b) i/lub i), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: NspA, podobny do Hsf, Hap, PorA, PorB, OMP85, PilQ, PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, lipo02, Tbp2 (lipo28), MltA (lipo30), i ctrA.
P. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie N lub O, przy czym jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu a) , w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa, i Opc.
Q. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach N-P, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu d), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: htrB, msbB i lpxK.
PL 211 037 B1
R. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach N-Q, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu e), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
S. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach N-R, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu c), w którym represyjna sekwencja kontrolna promotora stanowi region operatora fur jednego lub obu z genów TbpB i LbpB.
T. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach N-S, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu h), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC, i ctrD.
U. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach A-M, który jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis.
V. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie U, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu b) i/lub i), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: OMP106, HasR, PilQ, OMP85, lipo06, lipo10, lipo11, lipo18, P6, ompCD, CopB, D15, OmplA1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2, i Omp21.
W. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie U lub V, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu a), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA, i LbpB.
X. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach U-W, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu d), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: htrB, msbB i lpxK.
Y. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach U-X, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu e), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Z. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach A-M, który jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae.
AA. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie Z, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu b) i/lub i), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: D15, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, i Hif.
AB. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie Z lub AA, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu a), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: P2, P5, Hif, proteazę IgA1, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA, i TbpB.
AC. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach Z-AB, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu d), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: htrB, msbB i lpxK.
AD. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach Z-AC, który jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu e), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
AE. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków z Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego, który można otrzymać wykorzystując sposób obejmujący etapy: wprowadzenia genu heterologicznego, ewentualnie kontrolowanego przez sekwencję silnego promotora, do chromosomu metodą rekombinacji homologicznej, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu.
AF. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie AE, przy czym szczep Gram-ujemny stanowi Neisseria gonorrhoeae, a gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z C. trachomatis.
AG. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie AE, przy czym szczep Gram-ujemny stanowi Haemophilus influenzae, a gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z Moraxella catarrhalis.
AH. Preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punkcie AE, przy czym szczep Gram-ujemny stanowi Moraxella catarrhalis, a gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z Haemophilus influenzae.
AI. Szczepionka zawierająca preparat pęcherzyków określony w punktach A-AH i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
PL 211 037 B1
AJ. Szczepionka meningokokowa, która zawiera preparat pęcherzyków określony w punktach
N-T i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych meningokokowych polisacharydów otoczki wybranych z serotypów A, C, Y lub W.
AK. Szczepionka zapalenia opon, która zawiera preparat pęcherzyków określony w punktach N-T albo preparat pęcherzyków określony w punkcie AF, sprzężony polisacharyd otoczki H. influenzae b, i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki.
AL. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego, która zawiera preparat pęcherzyków określony w punktach U-Y i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją atypowymi
H. influenzae.
AM. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego która zawiera preparat pęcherzyków określony w punktach Z-AD i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki, i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Moraxella catarrhalis.
AN. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego określona w punktach AL lub AM, która dodatkowo obejmuje jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przeciwko Streptococcus pneumoniae i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy.
AO. Wektor odpowiedni do przeprowadzenia zdarzeń rekombinacyjnych opisanych w punktach
C-AH.
AP. Zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny, z którego wytwarza się preparat pęcherzyków według wynalazku określony w punktach A-AH.
AQ. Immunoochronna i nietoksyczna Gram-ujemna szczepionka pęcherzykowa, z otoczek bakteryjnych, lub z zabitych całych komórek odpowiednia do zastosowań pediatrycznych.
AR. Izolowana sekwencja polinukleotydowa, która hybrydyzuje w warunkach wysoce ostrych z co najmniej 30 nukleotydową częścią nukleotydów w SEKW. NR ID. : 2-23, 25, 27-81, albo nić komplementarna do niej.
AS. Izolowana sekwencja polinukleotydowa według wynalazku określona w punkcie AR, która zawiera co najmniej 30 nukleotydów.
AT. Izolowana sekwencja polinukleotydowa według wynalazku określona w punkcie AS, która zawiera co najmniej 30 nukleotydów z SEKW. NR ID.: 2-23, 25, 27-81, albo nić komplementarna do niej.
AU. Zastosowanie izolowanej sekwencji polinukleotydowej według wynalazku określonej w punktach AR-AT do przeprowadzenia rekombinacji homologicznej w obrębie 1000 bp przed genem chromosomalnym bakterii Gram-ujemnej dla zwiększenia lub zmniejszenia ekspresji wspomnianego genu.
AV. Sposób genetycznej regulacji w górę ekspresji genu w Gram-ujemnym szczepie bakteryjnym obejmujący etapy: wytwarzania wektora zawierającego sekwencję silnego promotora i sekwencję nukleotydową o długości co najmniej 30 nukleotydów, która jest zdolna do rekombinacji z sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów w regionie 1000 bp przed genem, transformowania szczepu bakteryjnego wektorem, i przeprowadzenia rekombinacji homologicznej między chromosomem i wektorem do wprowadzenia promotora w regionie 1000 bp przed kodonem inicjacji genu.
AW. Sposób według wynalazku określony w punkcie AV, przy czym promotor wprowadza się w regionie 200-600 bp przed kodonem inicjacji genu.
AX. Sposób według wynalazku określony w punkcie AW, przy czym promotor wprowadza się w regionie 400 bp przed kodonem inicjacji genu.
AY. Sposób według wynalazku określony w punktach AV-AX, przy czym rekombinację homologiczną uzyskuje się przez podwójne crossing-over między dwiema sekwencjami mającymi co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową XX', i dwiema sekwencjami mającymi co najmniej 30 nukleotydów na wektorze oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową 'Y', która zawiera sekwencję silnego promotora, w którym wektor stanowi liniową sekwencję nukleotydową, i gdzie podczas rekombinacji X i Y są zamieniane.
AZ. Sposób według wynalazku określony w punkcie AY, przy czym dwie sekwencje nukleotydów mają w przybliżeniu tę samą długość.
BA. Zmodyfikowany szczep bakteryjny, który jest możliwy do otrzymania sposobami określonym w punktach AV-AZ.
100
PL 211 037 B1
BB. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego genetycznie preparatu pęcherzyków z Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego przy użyciu jednego lub więcej sposobów wybranych z następującej grupy:
a) sposób redukowania immunodominujących zmiennych lub nieuchronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy określania tożsamości takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wytwarzania mniej lub wcale wspomnianego antygenu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
b) sposób regulacji w górę ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia sekwencji silniejszego promotora przed genem kodującym wspomniany antygen, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
c) sposób regulacji w górę ekspresji wyrażanych warunkowo, ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla usunięcia represywnych mechanizmów kontrolnych jego ekspresji, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
d) sposób modyfikowania porcji A lipidu bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w wytwarzaniu porcji A lipidu toksycznego LPS, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla zredukowania lub wyłączenia ekspresji wspomnianego genu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
e) sposób modyfikowania porcji A lipidu bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w wytwarzaniu porcji A lipidu mniej toksycznego LPS, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia sekwencji silniejszego promotora przed wspomnianym genem, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
f) sposób zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmujący etapy modyfikowania chromosomu szczepu bakteryjnego dla zawarcia genu kodującego peptyd polimyksynę A, lub jego pochodną lub analog, połączonego z antygenem ochronnym, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
g) sposób wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pęcherzyków obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla usunięcia zmiennych regionów genu kodującego wspomniany antygen, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu;
h) sposób zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmujący etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla zredukowania lub wyłączenia ekspresji wspomnianego genu, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu; lub
i) sposób regulacji w górę ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmujący etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego dla wprowadzenia do chromosomu jednej lub więcej dalszych kopii genu kodującego wspomniany antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencję promotorową i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu.
BC. Sposób immunizowania człowieka jako gospodarza przeciwko chorobie wywołanej przez infekcję jednym lub więcej spośród następujących: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia, znamienny tym, że obejmuje podawanie gospodarzowi immunoochronnej dawki preparatu pęcherzyków określonych w punktach A-AH.
BD. Zastosowanie preparatu pęcherzyków określonego w punktach A-AH do wytwarzania leku do immunizowania człowieka jako gospodarza przeciwko chorobie wywołanej przez zakażenie jednym lub więcej spośród następujących: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia.
PL 211 037 B1

Claims (37)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków z Gram- ujemnego szczepu bakteryjnego, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przy użyciu następującego sposobu:
    b) sposobu regulacji w górę ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed genem kodującym wspomniany antygen, tak że wspomniany gen jest wyrażany na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu; lub
    i) sposobu regulacji w górę ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, modyfikowania szczepu bakteryjnego, aby wprowadzić do szczepu jedną lub więcej dalszych kopii genu kodującego wspomniany antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencję promotorową, i wytwarzania pęcherzyków ze wspomnianego szczepu.
  2. 2. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen jest endogenny.
  3. 3. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że antygen jest konserwowany.
  4. 4. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przy użyciu dalszego sposobu:
    h) sposobu zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu, oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
  5. 5. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że w sposobie i) dalsza kopia genu jest wprowadzana do chromosomu szczepu.
  6. 6. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że w sposobie i) dalsza kopia genu jest wprowadzana do szczepu przez wektor episomalny.
  7. 7. Zmodyfikowany genetycznie preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 1-5, znamienny tym, że etapy modyfikowania w sposobach b), h) i i) wykonuje się przez rekombinacje homologiczne między sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym, i sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym w obrębie szczepu.
  8. 8. Preparat pęcherzyków według zastrz. 7, znamienny tym, że etapy modyfikowania wykonuje się przez podwójne rekombinacje homologiczne crossing-over między dwiema sekwencjami mającymi co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową 'X', i dwiema sekwencjami mającymi co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym w obrębie szczepu oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową 'Y', przy czym podczas rekombinacji X i Y są zamieniane.
  9. 9. Preparat pęcherzyków według zastrz. 8, znamienny tym, że dwie sekwencje nukleotydów mają w przybliżeniu tę samą długość, a wektor stanowi liniowa cząsteczka DNA.
  10. 10. Preparat pęcherzyków według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że rekombinacje w sposobach b) i h) wykonuje się w regionie chromosomu 1000 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
  11. 11. Preparat pęcherzyków według zastrz. 10, znamienny tym, że dla sposobu h) sekwencja nukleotydowa X zawiera część regionu promotorowego genu, zaś sekwencja nukleotydowa Y albo zawiera region słabego promotora, albo nie zawiera regionu promotora.
  12. 12. Preparat pęcherzyków według zastrz. 10, znamienny tym, że dla sposobu b) sekwencja nukleotydowa Y zawiera region silnego promotora dla bakterii.
  13. 13. Preparat pęcherzyków według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencję nukleotydową Y wstawia się w 200-600 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
  14. 14. Preparat pęcherzyków według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencję nukleotydową Y wstawia się w przybliżeniu 400 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
    102
    PL 211 037 B1
  15. 15. Preparat pęcherzyków według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że rekombinacje w sposobie h) wykonuje się tak, że sekwencja nukleotydowa X zawiera część sekwencji kodującej genu będącego przedmiotem zainteresowania.
  16. 16. Preparat pęcherzyków według zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że rekombinacje w sposobie i) wykonuje się tak, że sekwencja nukleotydowa Y zawiera dalej kopię genu w kasecie ekspresyjnej.
  17. 17. Preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 1-16, znamienny tym, że jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Neisseria.
  18. 18. Preparat pęcherzyków według zastrz. 17, znamienny tym, że jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Neisseria meningitidis, ewentualnie serotypu B.
  19. 19. Preparat pęcherzyków według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu b) i/lub i), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej : NspA, podobny do Hsf, Hap, PorB, OMP85, PilQ, PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, lipo02, Tbp2 (lipo28), MltA (lipo30) i ctrA.
  20. 20. Preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 17-19, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie sposobu, w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: PorA, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa i Opc.
  21. 21. Preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 17-20, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu h), w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC, i ctrD.
  22. 22. Preparat pęcherzyków według jednego z zastrz. 1-16, znamienny tym, że jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis.
  23. 23. Preparat pęcherzyków według zastrz. 22, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu b) i/lub i), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: OMP106, HasR, PilQ, OMP85, lipo06, lipo10, lipo11, lipo18, P6, ompCD, CopB, D15, OmplA1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2 i Omp21.
  24. 24. Preparat pęcherzyków według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie sposobu, w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: CopB, OMP10 6, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA i LbpB.
  25. 25. Preparat pęcherzyków według zastrz. 1-16, znamienny tym, że jest wydzielony ze zmodyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae.
  26. 26. Preparat pęcherzyków według zastrz. 25, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez wykorzystanie co najmniej sposobu b) i/lub i), w którym regulowana w górę jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: D15, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 i Hif.
  27. 27. Preparat pęcherzyków według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że jest możliwy do otrzymania przez i wykorzystanie sposobu, w którym regulowana w dół jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: P2, P5, Hif, proteazę IgA1, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA i TbpB.
  28. 28. Szczepionka zawierająca preparat pęcherzyków określony w zastrz. 1-27 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
  29. 29. Szczepionka meningokokowa, znamienna tym, że zawiera preparat pęcherzyków określony w zastrz. 17-21 i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych meningokokowych polisacharydów otoczki wybranych z serotypów A, C, Y lub W.
  30. 30. Szczepionka przeciwko zapaleniu opon, znamienna tym, że zawiera preparat określony w zastrz. 17-21, sprzężony polisacharyd otoczki H. influenzae b i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki.
  31. 31. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego, znamienna tym, że zawiera preparat określony w zastrz. 22-24 i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki, i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją atypowymi
    H. influenzae.
  32. 32. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego, znamienna tym, że zawiera preparat określony w zastrz. 25-27 i jeden lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki, i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Moraxella catarrhalis.
    PL 211 037 B1
    103
  33. 33. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego według zastrz. 31 albo 32, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przeciwko Streptococcus pneumoniae i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy.
  34. 34. Zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny, z którego wytwarza się preparat pęcherzyków określony w zastrz. 1-27.
  35. 35. Sposób wytwarzania szczepionki obejmujący etap wytwarzania jej ze zmodyfikowango Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego określonego w zastrz. 34.
  36. 36. Sposób wytwarzania genetycznie modyfikowanego preparatu pęcherzyków określonego w zastrz. 1-27 przez zastosowanie co najmniej sposobu b) lub i) na szczepie bakterii Gram-ujemnej i wytworzenie pęcherzyków ze zmodyfikowanego szczepu.
  37. 37. Zastosowanie preparatu pęcherzyków określonego w jednym z zastrz. 1-27 do wytwarzania leku do immunizowania człowieka jako gospodarza przeciwko chorobie wywołanej przez zakażenie jednym lub więcej spośród następujących: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia.
PL392363A 1999-08-03 2000-07-31 Kompozycja szczepionki PL211037B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9918319.6A GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-08-03 Vaccine composition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL392363A1 PL392363A1 (pl) 2010-11-22
PL211037B1 true PL211037B1 (pl) 2012-04-30

Family

ID=10858521

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392363A PL211037B1 (pl) 1999-08-03 2000-07-31 Kompozycja szczepionki
PL353891A PL211017B1 (pl) 1999-08-03 2000-07-31 Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353891A PL211017B1 (pl) 1999-08-03 2000-07-31 Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki

Country Status (31)

Country Link
US (4) US20060216307A1 (pl)
EP (6) EP1787655A3 (pl)
JP (3) JP5524437B2 (pl)
KR (2) KR20020027514A (pl)
CN (1) CN1377415B (pl)
AR (1) AR025218A1 (pl)
AT (2) ATE345392T1 (pl)
AU (1) AU770360C (pl)
BR (1) BR0012974A (pl)
CA (3) CA2380840C (pl)
CO (1) CO5280150A1 (pl)
CY (1) CY1107553T1 (pl)
CZ (1) CZ2002403A3 (pl)
DE (2) DE60045324D1 (pl)
DK (1) DK1208214T3 (pl)
ES (3) ES2355517T3 (pl)
GB (1) GB9918319D0 (pl)
GC (1) GC0000258A (pl)
HK (1) HK1048493B (pl)
HU (1) HUP0203056A3 (pl)
IL (2) IL147647A0 (pl)
MX (1) MXPA02001205A (pl)
MY (1) MY129006A (pl)
NO (1) NO332230B1 (pl)
NZ (3) NZ516802A (pl)
PL (2) PL211037B1 (pl)
PT (1) PT1208214E (pl)
SI (1) SI1208214T1 (pl)
TR (2) TR200202448T2 (pl)
WO (1) WO2001009350A2 (pl)
ZA (1) ZA200200824B (pl)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9823978D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Microbiological Res Authority Multicomponent meningococcal vaccine
US10967045B2 (en) 1998-11-02 2021-04-06 Secretary of State for Health and Social Care Multicomponent meningococcal vaccine
NO20002828D0 (no) * 2000-06-02 2000-06-02 Statens Inst For Folkehelse Proteinholdig vaksine mot Neisseria meningtidis serogruppe samt fremgangsmÕte ved fremstilling derav
ES2519440T3 (es) 2000-07-27 2014-11-07 Children's Hospital & Research Center At Oakland Vacunas para la protección de amplio espectro contra enfermedades causadas por Neisseria meningitidis
GB0103170D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0025169D0 (en) 2000-10-13 2000-11-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
SI21352A (sl) 2001-01-23 2004-06-30 Aventis Pasteur Multivalentno meningokokno cepivo iz konjugata polisaharida-proteina
GB0103169D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0103171D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
DK1395648T3 (da) 2001-06-11 2009-08-03 Applied Nanosystems Bv Fremgangsmåder til binding af AcmA-type proteinankerfusioner til cellevægsmateriale af mikroorganismer
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
MX339524B (es) * 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0130123D0 (en) * 2001-12-17 2002-02-06 Microbiological Res Agency Outer membrane vesicle vaccine and its preparation
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
CN102552895B (zh) * 2002-08-02 2014-07-23 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗组合物
RU2364418C2 (ru) * 2002-08-02 2009-08-20 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ ИММУНОТИПА L2 И/ИЛИ L3, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ШТАММА NEISSERIA MENINGITIDIS IgtB-
BR0313100A (pt) * 2002-08-02 2005-06-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Composição imunogênica, composição imunogênica isolada, vacina, método de tratamento ou prevenção de doença bacteriana gram-negativa, uso da vacina, cepa bacteriana gram-negativa geneticamente manipulada, método para preparar a composição imunogênica, método para preparar a vacina, método de preparar uma imunoglobulina para uso na prevenção ou tratamento de infecção neisserial, preparação de imunoglobulina, preparação farmacêutica, e, uso da preparação farmacêutica
US20060057160A1 (en) * 2002-08-02 2006-03-16 Ralph Biemans Vaccine composition
GB0220197D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Univ Utrecht Refolding method
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
US7438918B2 (en) 2002-08-30 2008-10-21 University Of Iowa Research Foundation Lipid A deficient mutants of Neisseria meningitidis
HUE031886T2 (en) 2002-10-11 2017-08-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polypeptide vaccines for extensive protection against hypervirulent meningococcal lines
EP1562982B1 (en) * 2002-11-15 2010-05-05 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
CU23313A1 (es) 2002-11-27 2008-09-25 Inst Finlay Ct De Investigacia Mã0/00todo de obtenciã"n de estructuras cocleares. composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios
EP2172213B1 (en) 2003-01-30 2013-04-03 Novartis AG Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
GB0308691D0 (en) * 2003-04-07 2003-05-21 Xenova Res Ltd Vaccine preparations
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
CU23377A1 (es) * 2003-11-04 2009-05-28 Ct De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Metodo para la incorporacion de antigenos en vesiculas de membrana externa de bacterias y formulaciones resultantes
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0416120D0 (en) 2004-07-19 2004-08-18 Health Prot Agency Stable compositions containing OMV's
AU2005203202C1 (en) * 2004-07-30 2009-02-19 Intervet International B.V. Novel bacterium and vaccine
GB0419408D0 (en) * 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
GB0419627D0 (en) * 2004-09-03 2004-10-06 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
WO2006081259A2 (en) 2005-01-27 2006-08-03 Children's Hospital & Research Center At Oakland Gna1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
SI1858920T1 (sl) 2005-02-18 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteini in nukleinske kisline iz escherichia coli, povezane z meningitisom/sepso
PE20110072A1 (es) 2005-06-27 2011-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
MY150105A (en) 2006-01-17 2013-11-29 Forsgren Arne A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein e; pe)
CA2654706A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Nathalie Devos Neisseria meningitidis lipooligosaccharide vaccine
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
JP5814507B2 (ja) 2006-09-07 2015-11-17 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
WO2008147816A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for the display of proteins on the surface of bacteria and their derived vesicles and uses thereof
CA2695467A1 (en) * 2007-08-02 2009-03-26 Children's Hospital & Research Center At Oakland Fhbp- and lpxl1-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
BR122016015627A2 (pt) 2007-10-19 2018-10-30 Novartis Ag kit, composição antigênica liofilizada e método para preparação de uma composição imunogênica
CN102356089B (zh) 2008-02-21 2014-02-19 诺华股份有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽
CN102015651B (zh) 2008-03-03 2014-12-31 Irm责任有限公司 作为tlr活性调节剂的化合物和组合物
UA99659C2 (uk) 2008-05-30 2012-09-10 Дзе Ю.Ес.Ей., Ес Репрезентед Бай Дзе Секретарі Оф Дзе Армі, Он Бехаф Оф Уолтер Рід Армі Мультивалентна вакцина з нативних везикул зовнішньої мембрани менінгококів, способи її застосування
KR101042541B1 (ko) * 2008-07-25 2011-06-17 한국생명공학연구원 외막소체를 생산하는 재조합 ｇ（－） 박테리아 및 이를이용한 다가항원이 실린 외막소체의 제조방법
GB0816447D0 (en) 2008-09-08 2008-10-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
TWI548746B (zh) * 2009-08-06 2016-09-11 英特威特國際股份有限公司 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法
CN102596240B (zh) 2009-08-27 2015-02-04 诺华股份有限公司 包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽
EP2470205A1 (en) 2009-08-27 2012-07-04 Novartis AG Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation
WO2011027971A2 (ko) 2009-09-01 2011-03-10 주식회사이언메딕스 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체, 및 이를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법
WO2011027956A2 (ko) 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 박테리아에서 유래한 세포밖 소포체 및 이를 이용한 질병 모델
WO2011027222A2 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Novartis Ag Immunogenic compositions including tlr activity modulators
CN102724988B (zh) 2009-09-30 2014-09-10 诺华股份有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽的表达
CA2779816A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Novartis Ag Modified meningococcal fhbp polypeptides
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
BR112012014624A8 (pt) 2009-12-15 2017-12-26 Novartis Ag suspensão homogênea de compostos de imunopotenciação e usos dos destes
CA2792687A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
AU2011288203A1 (en) 2010-03-18 2012-08-23 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for serogroup B meningococcus
SG187201A1 (en) * 2010-07-26 2013-02-28 Qu Biolog Inc Immunogenic anti-inflammatory compositions
US9259462B2 (en) 2010-09-10 2016-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Developments in meningococcal outer membrane vesicles
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
JP5957443B2 (ja) * 2011-03-28 2016-07-27 長瀬産業株式会社 フェリチンの製造方法
EP2505208A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-03 University of Graz Vaccine against Pasteurellaceae
US20150147356A1 (en) 2011-05-12 2015-05-28 Alan Kimura Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines
GB201110980D0 (en) 2011-06-28 2011-08-10 Health Prot Agency Neisserial compositions and expression constructs
EP3299467B1 (en) 2012-02-02 2021-08-11 GlaxoSmithKline Biologicals SA Promoters for increased protein expression in meningococcus
EP3693010A1 (en) * 2012-04-06 2020-08-12 Cornell University Subunit vaccine delivery platform for robust humoral and cellular immune responses
JP6324961B2 (ja) 2012-09-06 2018-05-16 ノバルティス アーゲー 血清群ｂ髄膜炎菌とｄ／ｔ／ｐとの組み合わせワクチン
CN103656631B (zh) * 2012-09-24 2015-08-19 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物及其制备方法
CN111249455A (zh) * 2012-11-30 2020-06-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 假单胞菌抗原和抗原组合
KR20160127104A (ko) 2014-02-28 2016-11-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드
EP3242883A4 (en) 2015-01-06 2018-10-17 ImmunoVaccine Technologies Inc. Lipid a mimics, methods of preparation, and uses thereof
WO2019018744A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS
EP3607967A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Modified meningococcal fhbp polypeptides
WO2020043874A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugated haemophilus influenzae vaccine using bordetella outer membrane vesicle
US20220378902A1 (en) * 2019-08-22 2022-12-01 Sichuan University Bacterial membrane vesicles, and separation and preparation system and method therefor
WO2021113433A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 University Of Connecticut Mycoplasma vaccine composition and methods
CA3194346A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Outer membrane vesicles
CN114681601B (zh) * 2020-12-31 2025-08-19 基础治疗有限公司 脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗及其应用
CN115976088B (zh) * 2022-07-21 2023-09-19 深圳蓝晶生物科技有限公司 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2848965A1 (de) 1978-11-11 1980-05-22 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung von membranproteinen aus neisseria meningitidis und diese enthaltende vaccine
JPS55161029U (pl) 1979-05-08 1980-11-19
US4271147A (en) 1980-01-10 1981-06-02 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same
US4666836A (en) * 1981-01-02 1987-05-19 The Research Foundation Of State University Of New York Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
US5098997A (en) * 1987-12-11 1992-03-24 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for Haemophilus influenzae
RU2023448C1 (ru) 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
WO1990006951A1 (en) 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
EP0449958B9 (en) * 1988-12-19 2003-05-28 American Cyanamid Company Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
CA2087160A1 (en) 1990-07-16 1992-01-17 P. Frederick Sparling Antigenic iron repressible proteins from n. meningitidis related to the hemolysin family of toxins
DE4023721A1 (de) 1990-07-26 1992-01-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von vakzinen und ihre verwendung
US5912336A (en) 1990-08-23 1999-06-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
CA2138997C (en) 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
JP3429313B2 (ja) 1993-05-18 2003-07-22 オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション 中耳炎ワクチン
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
US6265567B1 (en) 1995-04-07 2001-07-24 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated FrpB nucleic acid molecule
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6180111B1 (en) * 1995-05-18 2001-01-30 University Of Maryland Vaccine delivery system
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
EA199800046A1 (ru) 1995-06-07 1998-06-25 Байокем Вэксинс Инк. Полипептид, последовательность днк, вакцинная композиция (варианты), антитело или его фрагмент, вакцина, применения указанных полипептида, последовательности днк и антитела или его фрагмента
BR9609882A (pt) * 1995-08-04 1999-07-27 Univ Guelph Vacina processos para preparar a mesma para tratar uma doença infecciosa para inserir uma molécula de ácido nucleico em uma célula de marcaç o para administrar um agente terapêutico a um hospedeiro e para triar um antígeno imunogênico de um patógeno uso de uma vesícula de membrana composição farmacêutica sistema de liberação de drogas e vesícula de membrana
US6887483B2 (en) * 1995-12-01 2005-05-03 University Of Iowa Research Foundation Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
ES2262177T3 (es) 1996-05-01 2006-11-16 The Rockefeller University Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.
FR2751000B1 (fr) 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
JP4469026B2 (ja) 1996-10-31 2010-05-26 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原およびワクチン
FR2755446B1 (fr) * 1996-11-04 1999-01-08 Inst Curie Lignees cellulaires stables exprimant la proteine cftr ou un mutant de cette proteine, outil de selection de molecules ayant un effet sur le transport intracellulaire de ces proteines
US6685943B1 (en) * 1997-01-21 2004-02-03 The Texas A&M University System Fibronectin binding protein compositions and methods of use
WO1998033923A1 (en) * 1997-01-30 1998-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT msbB or htrB GENES
GB9711964D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Medical Res Council Live attenuated vaccines
EP0998557A2 (en) 1997-07-21 2000-05-10 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
ES2301181T3 (es) * 1997-08-21 2008-06-16 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Mutantes nuevos de bacterias mucosas gram negativas y su aplicacion en vacunas.
EP2218731A1 (en) 1997-11-28 2010-08-18 Merck Serono Biodevelopment Chlamydia trachomatis genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection
GB9726398D0 (en) 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
DE69942176D1 (de) 1998-04-07 2010-05-06 Medimmune Llc Choline-bindende proteine derivate aus pneumokoken als impfstoff
EP2261338A3 (en) 1998-05-01 2012-01-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
WO2000023595A1 (en) 1998-10-22 2000-04-27 The University Of Montana Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof
AU762369B2 (en) * 1998-11-03 2003-06-26 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur LPS with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
US20060057160A1 (en) * 2002-08-02 2006-03-16 Ralph Biemans Vaccine composition
US9473463B2 (en) 2014-07-29 2016-10-18 Combined Conditional Access Development & Support, LLC Control word and associated entitlement control message caching and reuse

Also Published As

Publication number Publication date
US20140294935A1 (en) 2014-10-02
BR0012974A (pt) 2002-05-07
HK1048493A1 (en) 2003-04-04
CA2380840A1 (en) 2001-02-08
TR200200275T2 (tr) 2002-05-21
US20080233154A1 (en) 2008-09-25
GC0000258A (en) 2006-11-01
HK1105581A1 (en) 2008-02-22
HUP0203056A1 (hu) 2002-12-28
WO2001009350A2 (en) 2001-02-08
EP1787655A2 (en) 2007-05-23
PL211017B1 (pl) 2012-03-30
US20160175423A1 (en) 2016-06-23
IL147647A0 (en) 2002-08-14
CY1107553T1 (el) 2013-03-13
NO20020506L (no) 2002-04-02
ES2399057T3 (es) 2013-03-25
EP1792994A2 (en) 2007-06-06
ATE345392T1 (de) 2006-12-15
JP2009284914A (ja) 2009-12-10
EP1808490A2 (en) 2007-07-18
JP2013017487A (ja) 2013-01-31
EP1774977A2 (en) 2007-04-18
KR20130083491A (ko) 2013-07-22
HK1048493B (en) 2007-06-22
PT1208214E (pt) 2007-02-28
DE60045324D1 (de) 2011-01-13
ES2275539T3 (es) 2007-06-16
HUP0203056A3 (en) 2008-04-28
JP5524437B2 (ja) 2014-06-18
DK1208214T3 (da) 2007-03-19
CZ2002403A3 (cs) 2002-05-15
MY129006A (en) 2007-03-30
JP2003506049A (ja) 2003-02-18
EP1792994A3 (en) 2007-10-10
EP1808490A3 (en) 2007-10-24
JP5744813B2 (ja) 2015-07-08
EP1208214B1 (en) 2006-11-15
EP1208214A2 (en) 2002-05-29
EP1797894B1 (en) 2010-12-01
DE60031859D1 (de) 2006-12-28
EP1797894A2 (en) 2007-06-20
ATE490327T1 (de) 2010-12-15
PL392363A1 (pl) 2010-11-22
US20060216307A1 (en) 2006-09-28
AU770360B2 (en) 2004-02-19
DE60031859T2 (de) 2007-05-10
NZ530336A (en) 2005-08-26
MXPA02001205A (es) 2002-07-02
CA2380840C (en) 2014-04-08
TR200202448T2 (tr) 2003-01-21
WO2001009350A3 (en) 2001-08-30
SI1208214T1 (sl) 2007-04-30
AU6833600A (en) 2001-02-19
GB9918319D0 (en) 1999-10-06
IL147647A (en) 2012-08-30
CA2820314C (en) 2016-04-26
NO332230B1 (no) 2012-08-06
ES2355517T3 (es) 2011-03-28
AR025218A1 (es) 2002-11-13
CA2820271A1 (en) 2001-02-08
EP1797894A3 (en) 2007-11-14
NZ530335A (en) 2005-07-29
KR20020027514A (ko) 2002-04-13
CO5280150A1 (es) 2003-05-30
EP1774977A3 (en) 2007-07-04
NZ516802A (en) 2005-09-30
EP1808490B1 (en) 2012-11-14
NO20020506D0 (no) 2002-01-31
AU770360C (en) 2005-04-07
CN1377415A (zh) 2002-10-30
ZA200200824B (en) 2003-11-26
CN1377415B (zh) 2011-05-18
CA2820314A1 (en) 2001-02-08
PL353891A1 (pl) 2003-12-15
EP1787655A3 (en) 2008-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU770360B2 (en) Vaccine composition
US20090117147A1 (en) Vaccines comprising outer membrane vesicles from gram negative bacteria
AU2003270970B2 (en) Vaccine composition
HK1105581B (en) Vaccine composition
HK1108004A (en) Genetically engineered bleb vaccine
HK1105576A (en) Genetically engineered bleb vaccine
HK1105575A (en) Meningococcal vaccine composition
HK1105427A (en) Vaccines of bacterial outer membrane vesicles

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification