PL188874B1

PL188874B1 - Sposób zwiększania wydajności w procesie oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy

Info

Publication number: PL188874B1
Application number: PL97363607A
Authority: PL
Inventors: Duk Sung Hwang; Evelyn Nario; Mark Lepe; Lyndon Luz; Hirokazu Ito; Kazuo Takechi
Original assignee: Alpha Therapeutic Corp
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2005-05-31
Also published as: BR9710107A; CZ435698A3; PT1762576E; ES2320919T3; US5981715A; AU3583197A; EP0944392B1; AU726233B2; PL188830B1; US5616693A; JP2008120822A; JP5245079B2; CA2259499C; DE69739212D1; DE69737294D1; ATE352569T1; EP0944392A1; CA2259499A1; PL188873B1; CA2489773A1

Abstract

1. Sposób zwiekszania wydajnosci w procesie oczyszczania inhibitora alfa-1 -proteinazy z roztworu zawierajacego inhibitor alfa-1-proteinazy, który poddawany jest dezaktywacji wirusów przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem, znamienny tym, ze przed traktowaniem rozpuszczalnikiem-detergentem, do roztworu zawierajacego inhibitor alfa-1-pro-teinazy dodaje sie cukier w ilosci wystarczajacej do zwiekszenia wy- dajnosci pozyskiwanego inhibitora alfa-1-proteinazy, korzystnie w ilosci od 10 do 20% wagowo. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania wydajności w procesie oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy z roztworu zawierającego ten inhibitor, w szczególności ulepszony sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy (alfa-1-antytrypsyny) z pasty zawierającej frakcje Cohna IVj + IV4.

Inhibitor alfa-1-proteinazy (w skrócie alfa-1-PI) znany również jako α-antytrypsyna, jest glikoproteiną surowicy o masie cząsteczkowej 52.000. Alfa-1-PI jest syntetyzowany w wątrobie i występuje w surowicy w ilości 150-350 mg/dl (ekwiwalent 30-80 pmoli ) w oznaceeniach standardowych plazmy.

Alfa-1-PI w płucach działa przez izhibitownzie elastazy neutrofilowej, proteazy serynowej, która w dużych ilościach może prowadzić do rozpadu ścian pęcherzyków. W normalnym płucu, inhibitor alfa-1-proteinazy zapewnia więcej niż 90% ochrony przed elastaząneutrofilową w niższych drogach oddechowych.

Niedobór alfa-1-PI jest autosomalnym, recesywnie dziedzicznym zaburzeniem objawiającym się dużą ilością odmian alleliconych i został scharakteryzowany w układzie alleliczzym określanym jako system inhibitowazin proteinazy (Pi). Allele te zostały usystematyzowane na podstawie poziomu alfa-1-PI, który występuje w surowicy różnych osobników. Osobniki mające normalne poziomy alfa-1-PI zostały określone jako posiadające fenotyp PiMM. Osobniki z niedoborem mają poziom alfa-1-PI niższy niż 35% normalnego przeciętnego poziomu i określone są jako posiadające fenotyp PiZZ alfa. Osobniki zerowe posiadają niewykrywalze ilości białka alfa-1-PI w surowicy i określone są jako posiadające fenotyp Pi(zero)(zer^o).

Niedobór alfa-1-PI charakteryzuje się niskim poziomem (mniej niż 35% przeciętnego poziomu) alfa-1-PI w surowicy i w płucach. Osobniki z niedoborem mają wysokie ryzyko rozwoju rozedmy płuc z niszczeniem ścian pęcherzyków. Rozedma płuc objawia się u osobników z fenotypem PiZZ, PiZ(zero) i Pi^eroKzero). Symptomy pojawiają się u dotkniętych tą przypadłością osobników w trzeciej lub czwartej dekadzie życia.

Rozedma płuc połączona z niedoborem alfa-1-PI rozwija się w wyniku niewystarczającego stężenia alfa-1-PI w niższych partiach dróg oddechowych powodującym brak inhibitowania elastazy neutrofilowej i w wyniku tego rozpad struktury tkanek miąższu płuc. Osobniki z niedoborem alfą-1-PI mają słabą ochronę przed elastazą neutrofilową uwalnianą przez neutrofile w niższych partiach dróg oddechowych. Ten brak równowagi proteinacy/izhibitora proteinazy u osobników z niedoborem alfa-1-PI daje w rezultacie chroniczne zniszczenia i w końcu rozpad miąższu płuc i ścian pęcherzyków.

Osobniki z ciężkim niedoborem alfa-1-PI zwykle posiadają poziom endogenny alfa-1-PI niższy niż 50 mg/dl. Osobniki z tak niskim poziomem alfa-1-PI w ciągu całego życia mają większe niż 80% ryzyko rozwoju rozedmy płuc. Oszacowano, że co najmniej 40.000 pacjen188 874 tów w Stanach Zjednoczonych, lub 2% wszystkich z rozedmą płuc, ma tę chorobę na skutek defektu w genie kodującym alfa-1-PI. Niedobór alfa-1-PI jest jedną z najczęściej występujących wad dziedzicznych ludzi pochodzenia kaukaskiego w Stanach Zjednoczonych i Europie.

Terapia pacjentów z niedoborem alfa-1-PI jest ukierunkowana na bezpośrednią wymianę lub podwyższenie poziomu alfa-1-PI w surowicy. Jeżeli poziom w surowicy zostanie podniesiony, oczekiwanym efektem jest wyższe stężenie w płucach a zatem skorygowanie nierównowagi elastaza neutrofilowa/alfa-1-PI w płucach i zapobieżenie powolnemu rozpadowi tkanki płucnej. Studia nad populacją normalną i z niedoborem alfa-1-PI wskazywały, że minimalny poziom alfa-1-PI w surowicy zapobiegający niekorzystnym zjawiskom wynosi 80 mg/dl lub 11 pmoli (około 57 mg/dl). W konsekwencji, większość terapii polegających na podwyższaniu poziomu alfą-1-PI w surowicy u pacjentów z niedoborem alfa-1-PI ma na ceiu zapewnienie minimalnego bezpiecznego poziomu alfa-1-PI w surowicy, gdyż źródłem pęcherzykowego alfa-1-PI jest alfa-1-PI zawarty w surowicy.

Preparaty alfa-1-PI są dostępne do użytku terapeutycznego od połowy lat 80-tych. Głównym ich zastosowaniem dotychczas była terapia podwyższająca (zastępująca) poziom alfa-1-PI przy dziedzicznym niedoborze alfa-1-PI. Okres półtrwania ludzkiego alfa-1-PI invivo wynosi 4,38 doby z odchyleniem standardowym 1,27 doby. Obecnie zalecana dawka wynosząca 60 mg alfa-1-PI/kg ciała na tydzień podwyższa niski poziom alfa-1-PI do bezpiecznego poziomu wynoszącego 11 umoli lub 80 mg/ml.

Dotychczas alfa-1-PI był oczyszczany różnymi technikami. Jedną z tych technik łączyła chromatografię na anionicie z glikolem polietylenowym (PEG). Inne procedury oczyszczające wykorzystują wytrącanie PEG z następującą po nim chromatografią na anionicie, lub wielokrotne wytrącanie z PEG połączone z chromatografią na anionicie. Inne wykorzystują kombinację wytrącania PEG, etapu jednokrotnej lub wielokrotnej chromatografii na anionicie oraz etapy chromatografii przy użyciu chelatów metali. Jeszcze inne metody wykorzystują techniki rozdziału faz do oczyszczenia alfa-1-PI. Dla oczyszczonego alfa-1-PI zostały odnotowane aktywności specyficzne wynoszące 1,26 jednostek/mg.

Zadaniem wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania alfa-1-PI o wysokiej czystości z większą wydajnością.

Nieoczekiwanie okazało się, że dodanie cukru do roztworu białka na pewnym etapie oczyszczania alfa-1-PI zwiększa jego wydajność.

W sposobie oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy, w którym nieoczyszczoną frakcję białkową, zwłaszcza pastę z frakcją IVi - IV4 Cohna, zawierającą alfa-1-PI w roztworze wodnym o pH wynoszącym około 6 zawiesza się przez czas potrzebny do rozpuszczenia białek rozpuszczalnych, odsącza się zawiesinę i odzyskuje nierozpuszczalne białka, po czym ponownie zawiesza się nierozpuszczalne białka w roztworze wodnym, dodaje się glikol polietylenowy do ponownie zawieszonych nierozpuszczalnych białek w celu wytrącenia α-2-globuliny; z nad wytrąconego osadu oddziela się supematant zawierający alfa-1-PI; do supematantu dodaje się ZnCh i wytrąca surowy alfa-1-PI, który oddziela się, rozpuszcza i kontaktuje ze środowiskiem aniono-wymiennym, po czym wyodrębnia się ze środowiska aniono-wymiennego frakcję zawierającą oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy.

Traktowanie odzyskanej frakcji można przeprowadzać przez ultrafiltrację roztworu zawierającego oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy, a następnie po ultrafiltracji przeprowadzić liofilizację. Oczyszczanie prowadzi się do uzyskania aktywności specyficznej około 1,0 jednostek/OD 28o.

W otrzymanym surowym alfa-1-PI przeprowadza się dezaktywację zanieczyszczeń wirusowych. W tym ceiu surowy alfa-1-PI traktuje się rozpuszczalnikiem i detergentem, na przykład fosforanem tri-n-butylu i polisorbatem 80.

Według wynalazku sposób zwiększania wydajności inhibitora alfa-1-proteinazy w roztworze zawierającym inhibitor alfa-1-proteinazy, który poddawany jest dezaktywacji wirusów przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem polega na tym, że przed traktowaniem rozpuszczalnikiem-detergentem, do roztworu zawierającego inhibitor alfa-1-proteinazy dodaje się cukier w ilości wystarczającej do zwiększenia wydajności pozyskiwanego inhibitora alfa-1 -proteinazy, na ogół w ilości 10% do 20% wagowo.

188 874

Zwykle jako cukier stosuje się sacharozę, maltozę lub glukozę korzystnie sacharozę. Ustalenie dokładnej ilości cukru przeprowadza się rutynowo w laboratorium testując różne stężenia użytego cukru dla danego roztworu zawierającego inhibitor alfa-1-proteinazy.

Po przeprowadzonym oczyszczaniu, w celu dalszego oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy roztwór można traktować bentonitem, co pozwala na uzyskanie oczyszczonego inhibitora alfa-1-proteinazy o aktywności specyficznej około 1,0 jednostek/OD₂80·

Sposobem tym oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy otrzymuje się z wydajnością co najmniej około 1 jednostki na gram pasty frakcji IV|+IV4.

Ogólnie rzecz biorąc, wynalazek obejmuje ulepszony sposób oczyszczania alfa-1-PI. Sposób obejmuje oczyszczanie frakcji białkowej, korzystnie, pasty z frakcją Cohna IVi + Γ/4, która zawiera alfa-1-PI. Nieoczyszczoną frakcję białkową zawiesza się w zimnej wodzie lub roztworze soli o pH wynoszącym około 6, aby rozpuścić białka rozpuszczalne łącznie z albuminą, alfa-2-globuliną (alfa-2-makroglobuliną i hatoglobuliną) oraz beta-globuliną (transferyną). Roztwór filtruje się, aby odzyskać białka nierozpuszczalne łącznie z alfa-1-PI, które następnie przemywa się woda (lub roztworem soli). Przemytą frakcję białek nierozpuszczalnych następnie ponownie wprowadza się do wody (lub roztworu soli) i nastawia się pH na około 8,5. W celu wytrącenia alfa-2-globuliny dodaje się PEG. Do supematantu odzyskanego z nad osadu dodaje się ZnC-h w celu wytrącenia surowego alfa-1-PI. Surowy alfa-1-PI jest następnie ponownie solubilizowany w buforze NaEDTA i zadaje się go fosforanem tri-n-butylu (TNBP) i polisorbitalem 80, w celu dezaktywacji wirusów. Podczas dezaktywacji wirusów w celu stabilizacji alfa-1-PI i aby podwyższyć wydajność korzystnie, dodaje się cukier taki jak sacharoza, maltoza, glukoza lub podobne.

Tak potraktowany roztwór następnie kontaktuje się z środowiskiem jonowymiennym w celu oddzielenia alfa-1-PI od pozostałych białek. Frakcję zawierającą alfa-1-PI następnie odzyskuje się i korzystnie zadaje bentonitem w celu usunięcia jeszcze obecnych apolipoprotein. Otrzymany w rezultacie oczyszczony roztwór alfa-1-PI następnie odzyskuje się i zagęszcza.

Alfa-1-PI oczyszczony tym sposobem wykazuje aktywność specyficzną większą niż 1,0 jednostek/OD28o- Niniejszym sposobem uzyskuje się wydajność większą niż 1,0 jednostki/gram pasty i korzystnie większą niż 1,3 jednostek/gram pasty.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się lepszą jakość i wydajność alfa-1-PI a proces oczyszczania jest szybszy od innych procesów..

Sposób według wynalazku przedstawią unikalną kombinację etapów oczyszczania zapewniając wysoką wydajność i wysoką aktywność specyficzną preparatu alfa-1-PI.

Alfa-1-PI otrzymuje się przez oczyszczenie frakcji białkowej. Nieoczyszczoną frakcją białkową może być plazma, alfa-1-PI wyprodukowane metodą rekombinacji lub jakiekolwiek inne źródło zawierające alfa-1-PI. W korzystnym przykładzie wykonania, nieoczyszczoną frakcją białkową jest pasta z frakcją Cohna IVj + IV4, której otrzymywanie jest dobrze znane ze stanu techniki.

A. Początkowy etap przerobu pasty z frakcją ΓΥχ + IV4

Pastę z frakcją Cohna IV) + IV4 (lub inną nieoczyszczoną frakcją białkową) zawiesza się w 5 ± 2 częściach wody lub roztworu soli, tj. około 0,15 do około 0,15 mola NaCl na 1 część pasty z frakcją Cohna IVj + IV4 w temperaturze poniżej 15°C, przy pH około 6,0 ± 0,2 przez co najmniej jedną godzinę. Rozpuszczalne białka, łącznie z albuminą, alfa-2-globuliną oraz beta-globuliną, oddziela się następnie od białek nierozpuszczalnych, w tym od alfa-1-PI, za pomocą prasy filtracyjnej, wirowania lub podobnych. Pozostałość przemywa się w temperaturze poniżej 15°C wodą lub roztworem soli o pH 6 ±0,2, w ilości około 5 objętości w stosunku do pierwotnej ilości pasty, w celu usunięcia pozostałości białka rozpuszczalnego, fizycznie uwięzionego w nierozpuszczalnej paście. Stwierdzono, że w zawiesinie pasty z frakcją IVi + IV4 w wodzie lub roztworze soli o pH 6,0 + 0,2, i kolejnym przemywaniu usuwane są prawie wszystkie albuminy i większość alfa-2- i beta protein w precypitacie frakcji Cohna IV, + IV4.

B. Wytracanie glikolem polietylenowym (PEG)

Pozostałe nierozpuszczalne białka ponownie zawiesza się w około 5 ± 2 objętościach wody o pH 8,5 ± 0,5 na 1 objętość pozostałości, w temperaturze około 15°C ± 5°C korzystnie przez około 6 godzin, jednak czas ten może być krótszy lub dłuższy. Krótsze czasy nie są ko188 874 rzystne ze względu na to, że przy dłuższych czasach osiągane są wyższe wydajności. Sześć godzin jest optymalną kombinacją czasu , i wydajności. Następnie dodaje się stały Tris do osiągnięcia końcowego stężenia 10 ± 5 mmoli oraz stały NaCl do osiągnięcia końcowego stężenia 150 ± 20 mmoli i nastawia się pH na 8,0. Następnie dodaje się glikol polietylenowy 3350 (PEG) do osiągnięcia końcowego stężenia 15% ± 5% wagowo i miesza się w temperaturze w 15°C ± 5°C przez około jedną godzinę. PEG dodaje się w celu wytrącenia alfa-2-globuliny.

Tworzący się precypitat PEG usuwa się za pomocą prasy filtracyjnej. Prasę filtracyjną myje się przed i po filtracji za pomocą roztworu zawierającego 150 ± 25 mmola NaCl i 15 ± 5% wagowo PEG przy pH 8,0 ± 0,5. Alternatywnie precypitat może być usuwany przez odwirowanie.

C. Wytracanie ZnCl?

ZnCl2 (100 ± 10 mmoli) dodaje się do supematantu PEG do osiągnięcia końcowego stężenia 6 ± 5 mmoli i nastawia się pH roztworu na 4,5 ± 0,5. Roztwór chłodzi się do temperatury 5 ± 5°C i miesza przez co najmniej godzinę. ZnCh wytrąca surowy alfa-1-PI. Surowy alfa1-1Ί zatęża się przez filtrację, korzystnie przez filtrację Prostak™, opisaną w „Prostak OpenChannel Module”, Millipore Corporation, lub przez wirowanie a filtrat usuwa się. Zatężona zawiesina lub precypitat mogą być zamrożone do przyszłego przerobu.

D. Dezaktywacja wirusów przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem

Surowy alfa-1-PI ponownie rozpuszcza się w 50 mmolach NaEDTA w filtrze Prostak z recyrkulacją. Jako stabilizator podczas dezaktywacji wirusów dodaje się cukier, korzystnie sacharozę, w ilości około 15 ± 5% wagowo (lub około 0,25 ± 0,05 mola cytrynianu trójsodowego), roztwór miesza się w temperaturze 15°C ± 5°C dopóki sacharoza nie rozpuści się.

W roztworze zawierającym alfa-1-PI dezaktywuje się wirusy przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem. Roztwór 10 ± 1% wagowo/objętość polisorbitalu 80 i 3 ± 0,3% wagowo fosforanu tri-n-butylu dodaje się do roztworu alfa-1-PI do końcowego stężenia 1,0 ± 0,5% wagowo/objętość polisorbitalu 80 i 0,3 ± 0,15% wagowo fosforanu tri-n-butylu. Roztwór następnie inkubuje się w temperąturtze 27°C ± 3°C przez nie mniej niż 6 godzin aby zdezaktywować wszystkie wirusy, które mogą być obecne w alfa-1-PI.

Stwierdzono, że obecność cukru, np. sacharozy, jako stabilzatora podczas dezaktywacji wirusów poprzez zadawanie rozpuszczalnikiem-detergentem zwiększa wydajność jednostek alfa-1-PI w porównaniu z próbką kontrolną, tj. roztworem alfa-1-PI dezaktywowanym na wirusy przez rozpuszczalnik detergent bez cukru jako stabilizatora. Zwiększenie wydajności wynosi korzystnie co najmniej 10%, korzystniej co najmniej 20% a nawet co najmniej 30%. Po inkubacji, zadawany roztwór alfa-1-PI chłodzi się do temperatury O - 10°C i nastawia się pH na 8,0 ±0,1.

E. Chromatografia aniono-wymienna

Roztwór potraktowany SD następnie rozcieńcza się w około 1 objętości wody na objętość roztworu potraktowanego SD. Rozcieńczony roztwór następnie dodaje się do wstępnie zrównoważonego środowiska chromatografii QAE lub innego środowiska anionowymiennego, które wiąże się z alfa-1-PI, umożliwiając oddzielenie innych białek od alfa-1-PI. Można tu stosować kąpiel lub chromatografię kolumnową. Po zaabsorbowaniu alfa-1-PI przemywa się buforem zawierającym 20 ± 10 mmola fosforanu sodu, przy pH równym 8 ± 1. Eluat, który zawiera alfa-1-Pl pozyskuje się do dalszej przeróbki.

Po usunięciu alfa-1-PI, środowisko anionowymienne oczyszcza się przez przemywanie kolejno: wodnym roztworem zawierającym 2 ± 0,2 mola NaCl, 20 ± 0,2 mmola fosforanu sodu, o pH 8 ± 1; następnie wodą do iniekcji, (WFl); po czym roztworem wodnym zawierającym 500 mmola NaOH; i wreszcie WFl. Środowisko chromatograficzne przechowuje się w 2 ± 0,2 molowym NaCl, 20 ± 10 mmolowym fosforanie sodu, pH 8 ± 1.

F. Traktowanie eluatu zawierającego alfa-1-PI

Eluat zawierający alfa-1-PI łączy się i traktuje bentonitem 0,1 do 1,0% wagowo przez około godzinę lub dłużej aby zredukować ilość apolipoprotein korzystnie do ilości mniejszej niż około 0,01 mg/ml apolipoproteiny A i do ilości mniejszej niż około 0,01 mg/ml apolipoproteiny B. Bentonit usuwa się za pomocą filtracji, korzystnie filtracji Cuno®, jak opisano w „Zeta Plus® C Series Filter Medium” Cuno Inc. Otrzymany roztwór zagęszcza się przez

188 874 ultrafiltrację membranową dopóty, aż aktywność alfa-1-PI wyniesie co najmniej 10 jednostek/ml. Zagęszczony produkt następnie filtruje się przez filtr 0,45 pm aby usunąć jakiekolwiek drobne pozostałości. Alfa-1-PI następnie filtruje się metodą Planova dla usunięcia wirusów. Sterylnie filtrowany przez filtr 0,22 pm, rozdzielany jest do fiolek i liofilizowany do przechowywania. Alfa-1-PI przechowuje się w temperaturze 2-8°C. Liofilizowany alfą-1-PI może być ponownie rozprowadzony w sterylnej wodzie do podawania pacjentom.

G. Oznaczenie aktywności alfa-1-PI

Do pomiaru aktywności alfa-1-PI może być zastosowana próba chromogeniczna ponownie rozpuszczonego alfa-1-PI. Podczas próby używany jest chromogeniczny substrat wrażliwy na trypsynę, który uwalnia p-nitroanilinę w obecności trypsyny (z firmy Sigma Chemical Co. z St Louis. Missouri). Uwalniana p-nitroanilina jest wykrywana przy 405 nm. Ałfa-1-PI inhibituje uwalnianie p-nitroaniliny z substratu. Aktywność alfa-1-PI w produkcie jest oznaczana w oparciu o standardową krzywą aktywności alfa-1-PI. Próba chromogeniczna liofilizowanego alfa-1-PI ponownie rozpuszczonego sporządzonego wyżej wymienionym sposobem wykazuje, że aktywność specyficzna wynosi co najmniej około 1,0 jednostek/OD28oH. Podawanie

Alfa-1-PI może być podawany przez infuzję pacjentom w ilościach około 0,08 ml/kg masy ciała na minutę przez pierwszych 10 minut. Jeżeli pacjent nie odczuwa żadnego dyskomfortu, dawka może być zwiększana dopóki jest tolerowana. Jeżeli jest tolerowana, kolejne infuzję dla tego samego pacjenta mogą zawierać większe dawki. Jeżeli występują jakieś dolegliwości, dawka powinna zostać zredukowana lub infuzja przerwana, aż znikną objawy. Infuzja może zostać wtedy ponowiona przy dawce tolerowanej przez pacjenta.

Przykład 1

Pastę z frakcją IVt+IV4 (600g) frakcjonowaną według schematu Cohna zawieszano przez jedną godzinę w 1800 ml wody w temperaturze 5°C przy pH 6,0 bez jakiegokolwiek miareczkowania. Po powstaniu zawiesiny, zawiesinę przefiltrowano przez filtr 10CP (Cuno) w prasie filtracyjnej. Przesącz zebrano, oznaczono, zmierzono aktywność specyficzną (S.A.) alfa-1-PI (w poniższych tabelach oznaczany Al PI) oraz gęstość optyczną przy 280 nm (OD280nn)· Pastę w prasie filtracyjnej przemywano 600 ml wody w temperaturze 5°C i przesącz zebrano. Postępowanie to powtórzono czterotnie, wszystkie przesącze zebrano, oznaczono i dokonano pomiaru aktywności specyficznej (S.A.) alfa-1-PI (A1PI) oraz OD28o- Otrzymano 350 g pasty. Aktywność A1PI i OD280 dla wszystkich próbek przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Aktywność A1P1 i OD280 dla frakcji przemywanych wodą

Próbka	Objętość (ml)	Al PI (j/ml)	Całkowity A1PI (j)	OD280	S. A. G/OD)
Mycie 0	1450	0,06	87	22,2	0,003
Mycie 1	600	0,1	60	29,9	0,003
Mycie 2	600	0,08	48	25,5	0,003
Mycie 3	600	0,04	24	13,0	0,003
Mycie 4	600	0	0	4,8	0
Mycie 5	600	0	0	3,0	0

Przykład 2

350 g pasty otrzymanej w przykładzie 1 ponownie zawieszono w 1050 ml wody o pH 8,5 w temperaturze 18°C w ciągu 6 godzin. Stały Tris dodano do końcowego stężenia 10 mmoli oraz dodano stały NaCl do końcowego stężenia 150 mmoli i nastawiono pH na 8,0. Glikol polietylenowy (PEG 3350) dodano do końcowego stężenia 15%o wagowo i mieszano w temperaturze 18°C przez jedną godzinę. Otrzymany w rezultacie precypitat usunięto na prasie filtracyjnej z filtrem 10 CP odzyskując supematant. Pastę pozostałą na prasie filtracyj188 874 nej przemyto roztworem zawierającym 15% wagowo PEG 3350, 10 mmoli Tris, i 150 mmoli NaCl. Filtrat i ciecz po przemyciu zmieszano. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2 Precypitacja PEG 3350

Próbka	Objętość (ml)	A1PI O/ml)	Całkowity Al PI (j)	OD₂80	S. A. G/OD)
Ponownie roztworzon filt.PEG	1400	1,063	1488	13,32	0,0798
2465	0,513	1265	2,16	0,2375

Przykład 3

Do odzyskanego filtratu PEG 3350 z przykładu 2 dodano ZnCh do końcowego stężenia 2 mmole, pH nastawiono na 7,5 a temperaturę obniżono do 5°C dla wytrącenia surowego alfa-1-PI. Po godzinie mieszania, surowy alfa-1-PI przefiltrowano za pomocą filtracji Prostak w celu zagęszczenia i otrzymaną zawiesinę ponownie roztworzono roztworem NaEDTA. Rezultaty przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3 Precypitacja ZnCl₂

Próbka	Objętość (ml)	Al PI (j/ml)	Całkowity Al PI (j)	OD₂₈o	S. A. G/OD)
Filtrat Prostak	2200	0,0159	35	0,15	0,106
NaEDTA roztworzon	264	4,305	1065	13,72	0,3138

Przykład 4

Do roztworu NaEDTA z przykładu 3 dodano sacharozę w ilości 16,7% wagowo i mieszano roztwór w temperaturze 18°C dopóki sacharoza nie rozpuściła się całkowicie. Do tego roztworu dodano polisorbat-80 o końcowym stężeniu 1,0%, fosforan tri-n-butylu o końcowym stężeniu 0,3%. Roztwór inkubowano w temperaturze 27,5°C przez czas nie krótszy niż 6 godzin dla zdezaktywowania jakichkolwiek możliwych zanieczyszczających wirusów w otoczkach lipidowych. Po inkubacji roztwór ochłodzono do temperatury 5°C i nastawiono pH na 8,0. Dla porównania powyższy proces powtórzono bez dodawania sacharozy. Stabilność alfa-1 -PI podczas zadawania rozpuszczalnikiem detergentem w obecności 16,7% sacharozy (SD Al PI) oraz bez sacharozy (próba kontrolna) pokazano w tabeli 4.

Tabela 4

Stabilność Al PI podczas zadawania rozpuszczalnikiem detergentem w obecności sacharozy

Próbka	Objętość (ml)	Al PI g/ml)	Całkowity Al PI 0)	%A1 PI z NaEDTA
SD A1PI	311	3,35	1042	97,8
Kontrola	293	2,13	624	58,6

Przykład 5

Do otrzymanego roztworu SD alfa-1-PI z przykładu 4, dodano 311 g destylowanej wody, aby obniżyć siłę jonową roztworu przed wprowadzeniem do kolumny QAE. Roztwór ten wprowadzono do 300 ml wstępnie zrównoważonej kolumny jonowymiennej QAE przy przepływie 12 ml/min. Kolumnę przemyto 6 1 bufora fosforanowe solankowego (20 mmola NaCl, 20 mmola NaH2PO4, pH 8,0). Alfa-1-PI przemyto 1,8 1 buforu fosforanowo solankowego (100 mmoli NaCl, 20 mmoli NaH2P O4, pH 8,0).

Środowisko jonowymienne oczyszczono przez przemycie kolejno; 2 molowym NaCl. 20 mmolowym NalFPCU, pH 8,0, 500 mmolowym NaOH oraz wodą destylowaną. Ośrodek

188 874 chromatograficzny przygotowano do przechowywania w 2 molowym NaCl, 20 mmolowym NaH0PO4, pH 8,0. Oznaczono sumę frakcji zawierających alfa-1-PI a wyniki przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Chromatografia jonowymienna QAE

Próbka	Objętość (ml)	Al PI (j /ml)	Całkowity Al PI (j)	OD280	S. A. Q/OD)
Eluat	1500	0,62	930	0,58	1,058

Przykład 6

Do zebranego eluatu otrzymanego w przykładzie 5 dodano 3,0 g bentonitu wolnego od ciał pirogennych i mieszano roztwór w temperaturze 20°C przez 1 godzinę. Bentonit usunięto za pomocą filtracji Cuno. Filtrat zagęszczono przez ultrafiltrację. Koncentrat przefiltrowano metodą Planova oraz wielokrotnie sterylnie filtrowano. Filtrat został rozdzielony do fiolek i liofilizowany do przechowywania. Wszystkie próbki zostały oznaczone a rezultat został przedstawiony w tabeli 6.

Tabela 6

Chromatografia jonowymienna QAE

	Objętość (ml)	Al PI (j /ml)	Całkowity Al PI (j)	OD280	S. A. (j/OD)
F. Cuno	1710	0,52	885	0,385	1,351
Koncentrat	75	11,6	870	8,092	1434
Fiolka	92	9,4	865	6,225	1,510

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób zwiększania wydajności w procesie oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy z roztworu zawierającego inhibitor alfa-1-proteinazy, który poddawany jest dezaktywacji wirusów przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem, znamienny tym, że przed traktowaniem rozpuszczalnikiem-detergentem, do roztworu zawierającego inhibitor alfa-1-proteinazy dodaje się cukier w ilości wystarczającej do zwiększenia wydajności pozyskiwanego inhibitora alfa-1-proteinazy, korzystnie w ilości od 10 do 20 % wagowo.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako cukier stosuje się sacharozę, maltozę lub glukozę, korzystnie sacharozę.