PL188830B1

PL188830B1 - Sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy

Info

Publication number: PL188830B1
Application number: PL97330934A
Authority: PL
Inventors: Duk Sung Hwang; Evelyn Nario; Mark Lepe; Lyndon Luz; Hirokazu Ito; Kazuo Takechi
Original assignee: Alpha Therapeutic Corp
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2005-04-29
Also published as: BR9710107A; CZ435698A3; PT1762576E; ES2320919T3; US5981715A; AU3583197A; EP0944392B1; AU726233B2; US5616693A; JP2008120822A; JP5245079B2; CA2259499C; DE69739212D1; DE69737294D1; ATE352569T1; EP0944392A1; CA2259499A1; PL188873B1; CA2489773A1; PT944392E

Abstract

Sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy z zanieczyszczonej frakcji bialkowej zawierajacej inhibitor alfa-1-proteinazy w procesie wieloetapowym z wyko- rzystaniem glikolu polietylenowego i wymiany anionowymiennej, znamienny tym, ze zawiesza sie zanieczyszczona frakcje bialkowa zawierajaca inhibitor alfa-1-proteinazy w roztworze wodnym o pH okolo 6 przez czas potrzebny do rozpuszczenia sie rozpusz- czalnych bialek; oddziela sie te nierozpuszczalne bialka; ponownie zawiesza sie nieroz- puszczalne bialka w roztworze wodnym; dodaje sie glikol polietylenowy do ponownie zawieszonych nierozpuszczalnych bialek i wytraca alfa-2-proteiny; po wytraceniu gliko- lem polietylenowym oddziela sie supernatant zawierajacy inhibitor alfa-1-proteinazy; z supematantu wytraca sie surowy inhibitor alfa-1-proteinazy przez dodanie ZnCl2 i wydziela sie surowy inhibitor alfa-1-proteinazy; odzyskany surowy inhibitor alfa-1- -proteinazy rozpuszcza sie; solubilizowany surowy inhibitor alfa-1-proteinazy podaje sie do srodowiska anionowymiennego a nastepnie odbiera sie frakcje zawierajaca inhi- bitor alfa-1-proteinazy ze srodowiska anionowymiennego. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy, w szczególności ulepszony sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy (alfa-1-antytrypsyny) z frakcji białkowych zawierających inhibitor alfa-1-proteinazy, zwłaszcza z pasty zawierającej frakcje Cohna IV) + IV4.

Inhibitor alfa-1-proteinazy (w skrócie alfaH-PI) znany również jako α-antytrypsyna, jest glikoproteiną surowicy o masie cząsteczkowej 52.000. Alfa-1-PI jest syntetyzowany w wątrobie i występuje w surowicy wilości 150-350 mg/dl (ekwiwalent 30-80 pmoli) w oznaczeniach standardowych plazmy.

Działanie alfa-1-PI w płucach polega na inhibitowaniu elastazy neutrofilowej, proteazy serynowej, która w dużych ilościach może prowadzić do rozpadu ścian pęcherzyków. W normalnym płucu, inhibitor alfa-1-proteinazy zapewnia więcej niż 90% ochrony przed elastazą neutrofilową w niższych drogach oddechowych.

Niedobór alfa-1-PI jest autosomalnym, recesywnie dziedzicznym zaburzeniem objawiającym się dużą ilością odmian allelicznych i został scharakteryzowany w układzie allelicznym określanym jako system inhibitowania proteinazy (Pi). Allele te zostały usystematyzowane na podstawie poziomu alfa-1-PI, który występuje w surowicy różnych osobników. Osobniki mające normalne poziomy alfa-1-PI zostały określone jako posiadające fenotyp PiMM. Osobniki z niedoborem mają poziom alfa-1-PI niższy niż 35% normalnego przeciętnego poziomu i określone są jako posiadające fenotyp PiZZ alfa. Osobniki zerowe posiadają niewykrywalne ilości białka alfa-1-PI w surowicy i określone sąjako posiadające fenotyp Pi(zero)(zero).

Niedobór alfa-l-PI charakteryzuje się niskim poziomem (mniej niż 35% przeciętnego poziomu) alfa-l-PI w surowicy i w płucach. Osobniki z niedoborem mają wysokie ryzyko rozwoju rozedmy płuc z niszczeniem ścian pęcherzyków. Rozedma płuc objawia się u osobników z fenotypem PiZZ, PiZ(zero) i Pi(zero)(zero). Symptomy pojawiają się u dotkniętych tą przypadłością osobników w trzeciej lub czwartej dekadzie życia.

Rozedma płuc połączona z niedoborem alfa-1-PI rozwija się w rezultacie niewystarczającego stężenia alfa-1-PI w niższych partiach dróg oddechowych powodującym brak inhibitowania elastazy neutrofilowej i w wyniku tego rozpad struktury związanych tkanek miąższu płuc. Osobniki z niedoborem alfa-1-PI mają słabą ochronę przed elastazą neutrofilową uwalnianą przez neutrofile w niższych partiach dróg oddechowych. Ten brak równowagi proteinazy/inhibitora proteinazy u osobników z niedoborem alfa-l-PI daje w rezultacie chroniczne zniszczenia i w końcu rozpad miąższu płuc i ścian pęcherzyków.

Osobniki z ciężkim niedoborem alfa-1-PI zwykle posiadają poziom endogenny alfa-1-PI niższy niż 50 mg/dl. Osobniki z tak niskim poziomem alfa-1-PI podczas całego życia mają większe niż 80% ryzyko rozwoju rozedmy płuc. Oszacowano, że co najmniej 40.000 pacjentów w Stanach Zjednoczonych, lub 2% wszystkich z rozedmą płuc, ma tę chorobę na skutek defektu w genie kodującym alfa-1-PI. Niedobór alfa-1-PI jest jedną z najczęściej występujących wad dziedzicznych ludzi pochodzenia kaukaskiego w Stanach Zjednoczonych i Europie.

Terapia pacjentów z niedoborem alfa-1-PI jest ukierunkowana na bezpośrednią wymianę lub podwyższenie poziomu alfa-l-PI w surowicy. Jeżeli poziom w surowicy zostanie podniesiony, oczekiwanym efektem jest wyższe stężenie w płucach a zatem skorygowanie

188 830 nierównowagi elastaza neutrofilowa/alfa-1-PI w płucach i zapobieżenie powolnemu rozpadowi tkanki płucnej. Studia nad populacją normalną i z niedoborem alfa-1-PI sugerowały, że minimalny poziom alfa-1-PI w surowicy zapobiegający niekorzystnym zjawiskom wynosi 80 mg/dl lub 11 pmoli (około 57 mg/dl). W konsekwencji, większość terapii polegających na podwyższaniu poziomu alfa-1-PI w surowicy u pacjentów z niedoborem alfa-1-PI ma na celu zapewnienie minimalnego bezpiecznego poziomu alfa-1-PI w surowicy, ponieważ alfa-1-PI w surowicy jest źródłem pęcherzykowego alfa-l-PI.

Preparaty alfa-1-PI są dostępne do użytku terapeutycznego od połowy lat 80-tych. Głównym ich zastosowaniem dotychczas była terapia podwyższająca (zastępująca) poziom alfa-1-PI przy dziedzicznym niedoborze alfa-1-PI. Okres półtrwania ludzkiego alfa-1-PI in vivo wynosi 4,38 doby z odchyleniem standardowym 1,27 doby. Obecnie zalecana dawka wynosząca 60 mg alfa-1-PI/kg ciała na tydzień podwyższa niski poziom alfa-1-PI do bezpiecznego poziomu wynoszącego 11 pmoli lub 80 mg/ml.

Dotychczas alfa-1-PI był oczyszczany różnymi technikami. Jedna z tych technik łączyła chromatografię na anionicie z glikolem polietylenowym (PEG). Inne procedury oczyszczające wykorzystują wytrącanie PEG z następującą po nim chromatografią na anionicie, lub wielokrotne wytrącanie z PEG połączone z chromatografią na anionicie. Inne wykorzystują kombinację wytrącania PEG, etapu jednokrotnej lub wielokrotnej chromatografii na anionicie oraz etapy chromatografii przy użyciu chelatów metali. Jeszcze inne metody wykorzystują techniki rozdziału faz do oczyszczenia alfa-1-PI. Dla oczyszczonego alfa-1-PI zostały odnotowane aktywności specyficzne wynoszące 1,26 jednostek/mg.

Według wynalazku sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy z zanieczyszczonej frakcji białkowej zawierającej inhibitor alfa-1-proteinazy prowadzi się wieloetapowe w procesie, w którym:

- zawiesza się zanieczyszczoną frakcję białkową zawierającą inhibitor alfa-1-proteinazy w wodnym roztworze o pH około 6 przez czas wystarczający do rozpuszczenia się rozpuszczalnych białek;

- oddziela się te nierozpuszczalne białka;

- ponownie zawiesza się nierozpuszczalne białka w roztworze wodnym;

- dodaje się glikol polietylenowy do ponownie zawieszonych nierozpuszczalnych białek i wytrąca a-2-proteiny;

- po wytrącaniu glikolem polietylenowym oddziela się supematant zawierający inhibitor alfa-1-proteinazy;

- z supematantu wytrąca się surowy inhibitor alfa-1-proteinazy przez dodanie ZnCl₂i wydziela Si surowy inhibitor alfa-l-proteinazy;

- odzyskany surowy inhibitor alfa-1-proteinazy rozpuszcza się;

- solubilizowany surowy inhibitor alfa-1-proteinazy podaje się do środowiska anionowymiennego i

- ze środowiska anionowymiennego odbiera się frakcję zawierającą inhibitor alfa-1-proteinazy.

Korzystnie, temperaturę i pH solubilizowanej zanieczyszczonej frakcji białkowej doprowadza się do laboratoryjnie ustalonych wartości, przy których rozpuszcza się albumina, alfa-2 proteina i beta proteiny, a nie rozpuszcza się inhibitor alfa-l-proteinazy.

Zanieczyszczoną frakcję białkową zawierającą inhibitor alfa-l-proteinazy zawiesza się w 3 do 7 objętościach wodnego roztworu na każdą część zanieczyszczonej frakcji zawierającej inhibitor alfa-l-proteinazy, przy czym jako roztwór wodny stosuje się wodę lub roztwór zawierający NaCl w stężeniu 0,05 do 0,15 molowym, zaś pH wodnego roztworu zawierającego ponownie zawieszoną nierozpuszczalną proteinę doprowadza się do 8,5.

W wyselekcjonowanych warunkach temperatury i pH roztworu glikolu polietylenowego oraz dobranym stężeniu glikolu polietylenowego przeprowadza się wytrącanie alfa-2-proteiny bez wytrącania inhibitora alfa-1-proteinazy. Glikol polietylenowy stosuje się do stężenia 10 do 20%.

Korzystnie, pH supernatantu z wytrącania glikolem polietylenowym doprowadza się do 7,5. Do supernatantu, po wytrącaniu glikolem polietylenowym, dodaje się ZnCh

188 830 w temperaturze, pH i w stężeniu ZnCl2 dostatecznym do wytrącenia surowego inhibitora alfa-1-proteinazy. Korzystnie, ZnCl2 dodaje się do stężenia 1do 11 mmoli.

Surowy inhibitor alfa-1-proteinazy wyodrębnia się za pomocą filtracji Prostak i solubilizuje w roztworze wodnym, po czym surowy inhibitor alfa-l-proteinazy otrzymany po wytrącaniu następnie poddaje się dezaktywacji jakiegokolwiek zanieczyszczenia wirusowego.

W celu dezaktywacji zanieczyszczenia wirusowego surowy inhibitor alfa-l-proteinazy traktuje się rozpuszczalnikiem i detergentem takim jak fosforan tri-n-butylu i polisorbat 80.

Korzystnie, surowy inhibitor alfa-1-proteinazy traktuje się fosforanem tri-n-butylu w ilości 0,15 do 0,45% wag/obj. i polisorbatem 80 w ilości 0,5 do 1,5% wag/obj.

Ponadto, do frakcji zawierającej inhibitor alfa-1-proteinazy dodaje się bentonit dla zaadsorbowania apolipoproteiny.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie inhibitora alfa-1-proteinazy o aktywności właściwej, co najmniej 1,0 jedn/OD280, z wydajnością co najmniej 1 jednostkę na gram frakcji IVi+IV4 pasty.

Korzystnie, otrzymaną frakcję roztworu zawierającego oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy poddaje się ultrafiltracji.

Roztwór zawierający oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy po ultrafiltracji liofilizuje się.

Zazwyczaj, oczyszczanie inhibitora alfa-1-proteinazy prowadzi się jak następuje: nieczyszczoną frakcję białkową zawierającą inhibitor alfa-l-proteinazy zawiesza się w roztworze wodnym o pH około 6 przez czas potrzebny do rozpuszczenia białek rozpuszczalnych, w temperaturze, w której rozpuszcza się albumina, alfa-2-proteina oraz beta-proteiny, ale nie rozpuszcza się inhibitor alfa-l-proteinazy, przesącza się zawiesinę i odzyskuje nierozpuszczalne białka zawierające inhibitor alfa-1-proteinazy, ponownie zawiesza się białka w roztworze wodnym przy pH około 8/5, do roztworu zawierającego ponownie zawieszone nierozpuszczalne białka dodaje się glikol polietylenowy do stężenia od około 10% do około 20% wagowo dla wytrącenia a-2-protein bez wytrącania inhibitora alfa-1-proteinaz.y, odbiera się supernatant. Po wytrąceniu glikolem polietylenowym, który zawiera inhibitor alfa-1-proteinazy, doprowadza się supematant to pH około 7,5, dodaje się ZnCh do supematantu dla wytrącenia surowego inhibitora alfa-1-proteinazy, który odsącza się i ponownie solubilizuje się w roztworze wodnym; w rozpuszczonym ponownie surowym inhibitorze alfa-1-proteinazy dezaktywuje się zanieczyszczenia wirusowe przez traktowanie rozpuszczalnikiem i detergentem, potraktowany rozpuszczalnikiem i detergentem surowy inhibitor alfa-1-proteinazy dodaje się do środowiska anionowymiennego, odzyskuje się frakcję zawierającą inhibitor alfa-1-proteinazy ze środowiska anionowymiennego, traktuje się frakcję zawierającą inhibitor alfa-1-proteinazy bentonitem dla zaadsorbowania apolipoprotein i odzyskuje się roztwór zawierający oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy.

Korzystnie, traktowanie odzyskanej frakcji przeprowadza się przez ultrafiltrację roztworu zawierającego oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy, a następnie po ultrafiltracji przeprowadza się liofilizację. Oczyszczanie prowadzi się do uzyskania aktywności specyficznej około 1,0 jedn/OD280.

W ogólności wynalazek dotyczy ulepszonego sposobu oczyszczania alfa-1-PI. Sposób obejmuje oczyszczanie nieoczyszczonej frakcji białkowej, korzystnie, pasty z frakcją Cohna IV1 + IV4, która zawiera alfa-1-PI. Nieczyszczoną frakcję białkową zawiesza się w zimnej wodzie lub roztworze soli o pH wynoszącym około 6, aby rozpuścić białka rozpuszczalne łącznie z albuminą, alfa-2-globuliną (alfa-2-makroglobuliną i hatoglobuliną) oraz beta-globuliną (transferyną). Roztwór filtruje się, aby odzyskać białka nierozpuszczalne łącznie z alfa-1-PI, które następnie przemywa się wodą (lub roztworem soli). Przemytą frakcję białek nierozpuszczalnych następnie ponownie wprowadza się do wody (lub roztworu soli) i pH nastawia się na około 8,5. W celu wytrącenia alfa-2-globuliny dodawane jest PEG. Do odzyskanego supematantu z nad osadu dodaje się ZnCl2 w celu wytrącenia surowego alfa-1-PI. Surowy alfa-1-PI jest następnie ponownie solubilizowany w buforze NaEDTA i zadany fosforanem tri-n-butylu (TNBP) i polisorbatem (Tween 80), aby zdezaktywować wirusy. W celu stabilizacji alfa-1-PI podczas dezaktywacji wirusów aby podwyższyć wydajność korzystnie, dodaje się cukier taki jak sacharoza, maltoza, glukoza lub podobne.

188 830

Tak potraktowany roztwór następnie wprowadza się do środowiska jonowymiennego w celu oddzielenia alfa-1-PI od pozostałych białek. Frakcję zawierającą alfa-1-PI następnie odzyskuje się i korzystnie zadaje bentonitem w celu usunięcia jeszcze obecnych apolipoprotein. Otrzymany w rezultacie oczyszczony roztwór alfa-1-PI jest następnie odzyskiwany i zagęszczany.

Alfa-1-PI oczyszczony tym sposobem wykazuje aktywność specyficzną większą niż 1,0 jedn/OD₂8o· Tym sposobem uzyskuje się wydajność większą niż 1,0 jednostki/gram pasty i korzystnie większą niż 1,3 jednostek/gram pasty.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się lepszą jakość i wydajność alfa-1-PI a proces oczyszczania jest szybszy od innych procesów.

Szczegółowy opis wynalazku

Sposób według wynalazku przedstawia unikalną kombinację etapów oczyszczania zapewniając wysoką wydajność i wysoką aktywność specyficzną preparatu alfa-1-PI.

Alfa-1-PI otrzymuje się przez oczyszczenie frakcji białkowej. Nieczyszczoną frakcją białkową może być plazma, alfa-1-PI wyprodukowane metodą rekombinacji lub jakiekolwiek inne źródło zawierające alfa-1-PI. W korzystnym przykładzie wykonania, nieczyszczoną frakcją białkową jest pasta z frakcją Cohna IV i + FĄ, której otrzymywanie jest dobrze znane ze stanu techniki.

A. Początkowy etap przerobu pasty z frakcją IVj + IV4

Pastę z frakcją Cohna IV1 + W4 (lub inną nieczyszczoną frakcją białkową) zawiesza się w 5 ± 2 częściach wody lub roztworu soli, tj. około 0,15 do około 0,15 mola NaCl na 1 część pasty z frakcją Cohna IV1 + IV4 w temperaturze poniżej 15°C, przy pH około 6,0 ± 0,2 przez co najmniej jedną godzinę. Rozpuszczalne białka, łącznie z albuminą, alfa-2-globuliną oraz beta-globuliną, oddziela się następnie od białek nierozpuszczalnych, w tym od alfa-1-PI, za pomocą prasy filtracyjnej, wirowania lub podobnych. Pozostałość przemywa się w temperaturze poniżej 15°C wodą lub roztworem soli o pH 6 ± 0,2, w ilości około 5 objętości w stosunku do pierwotnej ilości pasty, w celu usunięcia pozostałości białka rozpuszczalnego, fizycznie uwięzionego w nierozpuszczalnej paście. Stwierdzono, że w zawiesinie pasty z frakcją IV1 + IV4 w wodzie lub roztworze soli o pH 6,0 ± 0,2, i kolejnym przemywaniu usuwane są prawie wszystkie albuminy i większość alfa-2- i beta protein w precypitacie frakcji Cohna IV1 + W4.

B. Wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

Pozostałe nierozpuszczalne białka ponownie zawiesza się w około 5 ± 2 objętościach wody o pH 8,5 ± 0,5 na 1 objętość pozostałości, w temperaturze około 15°C ± 5°C korzystnie przez około 6 godzin, jednak czas ten może być krótszy lub dłuższy. Krótsze czasy nie są korzystne ze względu na to, że przy dłuższych czasach osiągane są wyższe wydajności. Sześć godzin jest optymalną kombinacją czasu i wydajności. Następnie dodaje się stały Tris do osiągnięcia końcowego stężenia 10 ± 5 mmoli oraz stały NaCl do osiągnięcia końcowego stężenia 150 ± 20 mmoli i nastawia się pH na 8,0. Następnie dodaje się glikol polietylenowy 3350 (PEG) do osiągnięcia końcowego stężenia 15% ± 5% wagowo i miesza się w temperaturze w 15°C ± 5°C przez około jedną godzinę. PEG dodaje się w celu wytrącenia alfa-2globuliny.

Tworzący się precypitat PEG usuwa się za pomocą prasy filtracyjnej. Prasę filtracyjną myje się przed i po filtracji za pomocą roztworu zawierającego 150 ± 25 mmola NaCl i 15 ± 5% wagowo PEG przy pH 8,0 ± 0,5. Alternatywnie precypitat może być usuwany przez odwirowanie.

C. Wytrącanie ZnCl₂

ZnCl₂ (100 ± 10 mmoli) dodaje się do supernatantu PEG do osiągnięcia końcowego stężenia 6 ± 5 mmoli i nastawia się pH roztworu na 4,5 ± 0,5. Roztwór chłodzi się do temperatury 5 ± 5°C i miesza przez co najmniej godzinę. ZnCl₂ wytrąca surowy alfa-1-PI. Surowy alfa-1-PI zatęża się przez filtrację, korzystnie przez filtrację Prostak™, opisaną w „Prostak Open-Channel Module”, Millipore Corporation, lub przez wirowanie a filtrat usuwa się. Zatężona zawiesina lub precypitat mogą być zamrożone do przyszłego przerobu.

D. Dezaktywacja wirusów przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem

188 830

Surowy alfa-1-PI ponownie rozpuszcza się w 50 mmolach NaEDTA w filtrze Prostak z recyrkulacją. Jako stabilizator podczas dezaktywacji wirusów dodaje się cukier, korzystnie sacharozę, w ilości około 15 ± 5% wagowo (lub około 0,25 ± 0,05 mola cytrynianu trój sodowego), roztwór miesza się w temperaturze 15°C ± 5°C dopóki sacharoza nie rozpuści się.

W roztworze zawierającym alfa-1-PI dezaktywuje się wirusy przez traktowanie rozpuszczalnikiem-detergentem. Roztwór 10 ± 1%o wagowo/objętość polisorbitalu 80 i 3 ± 0,3% wagowo fosforanu tri-n-butylu dodaje się do roztworu alfa-1-PI do końcowego stężenia 1,0 ± 0,5% wagowo/objętość polisorbitalu 80 i 0,3 ± 0,15% wagowo fosforanu tri-n-butylu. Roztwór następnie inkubuje się w temperaturze 27°C ± 3°C przez nie mniej niż 6 godzin aby zdezaktywować wszystkie wirusy, które mogą być obecne w alfa-1-PI.

Stwierdzono, że obecność cukru, np. sacharozy, jako stabilzatora podczas dezaktywacji wirusów poprzez zadawanie rozpuszczalnikiem-detergentem zwiększa wydajność jednostek alfa-1-PI w porównaniu z próbką kontrolną, tj. roztworem alfa-1-PI dezaktywowanym na wirusy przez rozpuszczalnik detergent bez cukru jako stabilizatora. Zwiększenie wydajności wynosi korzystnie co najmniej 10%, korzystniej co najmniej 20% a nawet co najmniej 30%. Po inkubacji, zadawany roztwór alfa-1-PI chłodzi się do temperatury 0 - 10°C i nastawia się pH na 8,0 ± 0,,1.

E. Chromatografia anionowymienna

Roztwór potraktowany SD następnie rozcieńcza się w około 1 objętości wody na objętość roztworu potraktowanego SD. Rozcieńczony roztwór następnie dodaje się do wstępnie zrównoważonego środowiska chromatografii QAE lub innego środowiska anionowymiennego, które wiąże się z alfa-1-PI, umożliwiając oddzielenie innych białek od alfa-1-PI. Można tu stosować kąpiel lub chromatografię kolumnową. Po zaabsorbowaniu alfa-1-PI przemywa się buforem zawierającym 20 ± 10 mmola fosforanu sodu, przy pH równym 8 ± 1. Eluat, który zawiera alfa-1-PI pozyskuje się do dalszej przeróbki.

Po usunięciu alfa-1-PI, środowisko anionowymienne oczyszcza się przez przemywanie kolejno: wodnym roztworem zawierającym 2 ± 0,2 mola NaCl, 20 ± 0,2 mmola fosforanu sodu, o pH 8 ± 1; następnie wodą do iniekcji (WFI); po czym roztworem wodnym zawierającym 500 mmola NaOH; i wreszcie WFI. Środowisko chromatograficzne przechowuje się w 2 ± 0,2 molowym NaCl, 20 ± 10 mmolowym fosforanie sodu, pH 8 ± 1.

F. Traktowanie eluatu zawierającego alfa-l-PI

Eluat zawierający alfa-1-PI łączy się i traktuje bentonitem 0,1 do 1,0% wagowo przez około godzinę lub dłużej aby zredukować ilość apolipoprotein korzystnie do ilości mniejszej niż około 0,01 mg/ml apolipoproteiny A i do ilości mniejszej niż około 0,01 mg/ml apolipoproteiny B. Bentonit usuwa się za pomocą filtracji, korzystnie filtracji Cuno®, jak opisano w „Zeta Plus® C Series Filter Medium” Cuno Inc. Otrzymany roztwór zagęszcza się przez ultrafiltrację membranową dopóty, aż aktywność alfa-1-PI wyniesie co najmniej 10 jednostek/ml. Zagęszczony produkt następnie filtruje się przez filtr 0,45 ąm aby usunąć jakiekolwiek drobne pozostałości. Alfa-l-PI następnie filtruje się metodą Planova dla usunięcia wirusów. Sterylnie filtrowany przez filtr 0,22 (im, rozdzielany jest do fiolek i liofilizowany do przechowywania. Alfa-1-PI przechowuje się w temperaturze 2-8°C. Liofilizowany alfa-1-PI może być ponownie rozprowadzony w sterylnej wodzie do podawania pacjentom.

G. Oznaczenie aktywności alfa-1-PI

Do pomiaru aktywności alfa-1-PI może być zastosowana próba chromogeniczna ponownie rozpuszczonego alfa-1-PI. Podczas próby używany jest chromogeniczny substrat wrażliwy na trypsynę, który uwalnia p-nitroanilinę w obecności trypsyny (z firmy Sigma Chemical Co. z St Louis, Missouri). Uwalniana p-nitroanilina jest wykrywana przy 405 nm. Alfa-1-PI inhibituje uwalnianie p-nitroaniliny z substratu. Aktywność alfa-l-PI w produkcie jest oznaczana w oparciu o standardową krzywą aktywności alfa-1-PI. Próba chromogeniczna liofilizowanego alfa-1-PI ponownie rozpuszczonego sporządzonego wyżej wymienionym sposobem wykazuje, że aktywność specyficzna wynosi co najmniej około 1,0 jedn/OD₂80.

H. Podawanie

Alfa-1-PI może być podawany przez infuzję pacjentom w ilościach około 0,08 ml/kg masy ciała na minutę przez pierwszych 10 minut. Jeżeli pacjent nie odczuwa żadnego dyskomfortu, dawka może być zwiększana dopóki jest tolerowana. Jeżeli jest tole8

188 830 rowana, kolejne infuzję dla tego samego pacjenta mogą zawierać większe dawki. Jeżeli występują jakieś dolegliwości, dawka powinna zostać zredukowana lub infUzja przerwana, aż znikną objawy. Infuzja może zostać wtedy ponowiona przy dawce tolerowanej przez pacjenta.

Przykład 1

Pastę z frakcją IV1 + IV4 (600g) frakcjonowaną według schematu Cohna zawieszano przez jedną godzinę w 1800 ml wody w temperaturze 5°C przy pH 6,0 bez jakiegokolwiek miareczkowania. Po powstaniu zawiesiny, zawiesinę przefiltrowano przez filtr 10CP (Cuno) w prasie filtracyjnej. Przesącz zebrano, oznaczono, zmierzono aktywność specyficzną (S.A.) alfa-1-PI (w poniższych tabelach oznaczany A1PI) oraz gęstość optyczną przy 280 nm (OD280nm)- Pastę w prasie filtracyjnej przemywano 600 ml wody w temperaturze 5°C i przesącz zebrano. Postępowanie to powtórzono czterotnie, wszystkie przesączę zebrano, oznaczono i dokonano pomiaru aktywności specyficznej (S.A.) alfa-1-PI (A1PI) oraz OD280· Otrzymano 350 g pasty. Aktywność A1PI i OD280 dla wszystkich próbek przedstawiono w tabeli 1.

Tabela I

Aktywność A1PI i ODaao dla frakcji przemywanych wodą

Próbka	Objętość (ml)	A1PI (j/ml)	Całkowity A1PI (j)	OD280	S. A. (j/OD)
Mycie 0	1450	0,06	87	22,2	0,003
Mycie 1	600	0,1	60	29,9	0,003
Mycie 2	600	0,08	48	25,5	0,003
Mycie 3	600	0,04	24	13,0	0,003
Mycie 4	600	0	0	4,8	0
Mycie 5	600	0	0	3,0	0

Przykład2

350 g pasty otrzymanej w przykładzie 1 ponownie zawieszono w 1050 ml wody o pH

8,5 w temperaturze 18°C w ciągu 6 godzin. Stały Tris dodano do końcowego stężenia 10 mmoli oraz dodano stały NaCl do końcowego stężenia 150 mmoli i nastawiono pH na 8,0. Glikol polietylenowy (PEG 3350) dodano do końcowego stężenia 15% wagowo i mieszano w temperaturze 18°C przez jedną godzinę. Otrzymany w rezultacie precypitat usunięto na prasie filtracyjnej z filtrem 10 CP odzyskując supematant. Pastę pozostałą na prasie filtracyjnej przemyto roztworem zawierającym 15% wagowo PEG 3350, 10 mmoli Tris, i 150 mmoli NaCl. Filtrat i ciecz po przemyciu zmieszano. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Precypitacja PEG 3350

Próbka	Objętość (ml)	A1PI G/ml)	Całkowity Al PI (j)	OD280	S. A. (j/OD)
Ponownie roztworżeń filt.PEG	1400	1,063	1488	13,32	0,0798
2465	0,513	1265	2,16	0,2375

Przyklad3

Do odzyskanego filtratu PEG 3350 z przykładu 2 dodano ZnCi.2 do końcowego stężenia 2 mmole, pH nastawiono na 7,5 a temperaturę obniżono do 5°C dla wytrącenia surowego alfa-1-PI. Po godzinie mieszania, surowy alfa-1-PI przefiltrowano za pomocą filtracji Prostak w celu zagęszczenia i otrzymaną zawiesinę ponownie roztworzono roztworem NaEDTA. Rezultaty przedstawiono w tabeli 3.

188 830

Tabela 3

Precypitacja ZnCl2

Próbka	Objętość (ml)	AIPI (j/ml)	Całkowity AIPI (j)	OD280	S. A. (j/OD)
Filtrat Prostak	2200	0,0159	35	0,15	0,106
NaEDTA roztworzeń	264	4,305	1065	13,72	0,3138

Przykład4

Do roztworu NaEDTA z przykładu 3 dodano sacharozę w ilości 16,7% wagowo i mieszano roztwór w temperaturze 18°C dopóki sacharoza nie rozpuściła się całkowicie. Do tego roztworu dodano polisorbat-80 o końcowym stężeniu 1,0%, fosforan tri-n-butylu o końcowym stężeniu 0,3%. Roztwór inkubowano w temperaturze 27,5°C przez czas nie krótszy niż 6 godzin dla zdezaktywowania jakichkolwiek możliwych zanieczyszczających wirusów w otoczkach lipidowych. Po inkubacji roztwór ochłodzono do temperatury 5°C i nastawiono pH na 8,0. Dla porównania powyższy proces powtórzono bez dodawania sacharozy. Stabilność alfa-1 -PI podczas zadawania rozpuszczalnikiem detergentem w obecności 16,7% sacharozy (SD AIPI) oraz bez sacharozy (próba kontrolna) pokazano w tabeli 4.

Tabela 4

Stabilność AIPI podczas zadawania rozpuszczalnikiem detergentem w obecności sacharozy

Próbka	Objętość (ml)	AIPI (j/ml)	Całkowity AIPI (j)	% AIPI z NaEDTA
SD AIPI	311	3,35	1042	97,8
Kontrola	293	2,13	624	58,6

Przykład5

Do otrzymanego roztworu SD alfa-1-PI z przykładu 4, dodano 311 g destylowanej wody, aby obniżyć siłę jonową roztworu przed wprowadzeniem do kolumny QAE. Roztwór ten wprowadzono do 300 ml wstępnie zrównoważonej kolumny jonowymiennej QAE przy przepływie 12 ml/min. Kolumnę przemyto 6 1 bufora fosforanowe solankowego (20 mmola NaCl, 20 mmola NaH2P04, pH 8,0). Alfa-1-PI przemyto 1,8 1 buforu fosforanowe solankowego (100 mmoli NaCl, 20 mmoli NaHjPOą, pH 8,0).

Środowisko jonowymienne oczyszczono przez przemycie kolejno; 2 molowym NaCl, 20 mmolowym NaH2P04, pH 8,0, 500 mmolowym NaOH oraz wodą destylowaną. Ośrodek chromatograficzny przygotowano do przechowywania w 2 molowym NaCl, 20 mmolowym NaH2P04, pH 8,0. Oznaczono sumę frakcji zawierających alfa-1-PI a wyniki przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Chromatografia jonowymienna QAE

Próbka	Objętość (ml)	AIPI (j/ml)	Całkowity AIPI G)	OD280	S. A. (j /OD)
Eluat	1500	0,62	930	0,58	1,058

Przykład 6

Do zebranego eluatu otrzymanego w przykładzie 5 dodano 3,0 g bentonitu wolnego od ciał pirogennych i mieszano roztwór w temperaturze 20°C przez 1 godzinę. Bentonit usunięto za pomocą filtracji Cuno. Filtrat zagęszczono przez ultrafiltrację. Koncentrat przefiltrowano metodą Planova oraz wielokrotnie sterylnie filtrowano. Filtrat został rozdzielony do fiolek i liofilizowany do przechowywania. Wszystkie próbki zostały oznaczone a rezultat został przedstawiony w Tabeli 6.

188 830

Tabela 6

Chromatografia jonowymienna QAE

	Objętość (ml)	A1PI (j /ml)	Całkowity Al PI (j)	OD280	S. A. (j/OD)
FiltrCuno	1710	0,52	885	0,385	1,351
Koncentrat	75	11,6	870	8,092	1,434
Fiolka	92	9,4	865	6,225	1,510

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oczyszczania inhibitora alfa-1-proteinazy z zanieczyszczonej frakcji białkowej zawierającej inhibitor alfa-1-proteinazy w procesie wieloetapowym z wykorzystaniem glikolu polietylenowego i wymiany anionowymiennej, znamienny tym, że zawiesza się zanieczyszczoną frakcję białkową zawierającą inhibitor alfa-1-proteinazy w roztworze wodnym 0 pH około 6 przez czas potrzebny do rozpuszczenia się rozpuszczalnych białek; oddziela się te nierozpuszczalne białka; ponownie zawiesza się nierozpuszczalne białka w roztworze wodnym; dodaje się glikol polietylenowy do ponownie zawieszonych nierozpuszczalnych białek i wytrąca alfa-2-proteiny; po wytrąceniu glikolem polietylenowym oddziela się supernatant zawierający inhibitor alfa-1-proteinazy; z supematantu wytrąca się surowy inhibitor alfa-1-proteinazy przez dodanie ZnCl2 i wydziela się surowy inhibitor alfa-1-proteinazy; odzyskany surowy inhibitor alfa-1-proteinazy rozpuszcza się; solubilizowany surowy inhibitor alfa-1-proteinazy podaje się do środowiska anionowymiennego a następnie odbiera się frakcję zawierającą inhibitor alfa-1-proteinazy ze środowiska anionowymiennego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperaturę i pH solubilizowanej zanieczyszczonej frakcji białkowej doprowadza się do wartości, przy których rozpuszcza się albumina, alfa-2-proteina i beta proteiny, a nie rozpuszcza się inhibitor alfa-1-proteinazy.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zanieczyszczoną frakcję białkową zawierającą inhibitor alfa-1- proteinazy zawiesza się w 3 do 7 objętościach wodnego roztworu na każdą część zanieczyszczonej frakcji zawierającej inhibitor alfa-1-proteinazy.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że jako roztwór wodny stosuje się wodę lub roztwór zawierający NaCl w stężeniu 0,05 do 0,15 molowym.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH wodnego roztworu zawierającego ponownie zawieszone nierozpuszczalne białka doprowadza się do 8,5.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się wytrącanie alfa-2-proteiny bez wytrącania inhibitora alfa-1-proteinazy w wyselekcjonowanych warunkach temperatury i pH roztworu glikolu polietylenowego oraz dobranym stężeniu glikolu polietylenowego.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że glikol polietylenowy dodaje się do stężenia 10 do 20%.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że pH supematantu z wytrącania glikolem polietylenowym doprowadza się do 7,5.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do supematantu, po wytrącaniu glikolem polietylenowym, dodaje się ZnCL· w temperaturze, pH i w stężeniu ZnCL· dostatecznym do wytrącenia surowego inhibitora alfa-1-proteinazy.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 9, znamienny tym, że po wytrącaniu glikolem polietylenowym surowy inhibitor alfa-1-proteinazy wytrąca się z supematantu przez dodanie ZnCh do stężenia 1do 11 mmoli.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że surowy inhibitor alfa-1-proteinazy wyodrębnia się za pomocą filtracji prostak i solubilizuje w roztworze wodnym.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że surowy inhibitor alfa-1-proteinazy otrzymany po wytrącaniu następnie poddaje się dezaktywacji jakiegokolwiek zanieczyszczenia wirusowego.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w celu wymienionej dezaktywacji surowy inhibitor alfa-1-proteinazy traktuje się rozpuszczalnikiem i detergentem.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że surowy inhibitor alfa-1-proteinazy traktuje się fosforanem tri-n-butylu i polisorbatem 80.
15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że surowy inhibitor alfa-1-proteinazy traktuje się fosforanem tri-n-butylu w ilości 0,15 do 0,45% wag/obj. i polisorbatem 80 w ilości 0,5 do 1,5%o wag/obj.

188 830
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej do frakcji zawierającej inhibitor alfa-l-proteinazy dodaje się bentonit dla zaadsorbowania apolipoproteiny.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces oczyszczania prowadzi się do otrzymania inhibitora alfa-1-proteinazy o aktywności właściwej co najmniej 1,0 jedn/OD28o.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oczyszczony inhibitoralfa-1-proteinazy otrzymuje się z wydajnością co najmniej łjednostkę na gram frakcji IV1 + IV4 pasty.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymaną frakcję roztworu zawierającego oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy poddaje się przez ultrafiltracji.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że roztwór zawierający oczyszczony inhibitor alfa-1-proteinazy po ultrafiltracji liofilizuje się.