CZ435698A3

CZ435698A3 - Způsob oddělování inhibitoru alfa-1-proteinasy od pastové Cohn-ovy frakce IV1 + IV4

Info

Publication number: CZ435698A3
Application number: CZ984356A
Authority: CZ
Inventors: Duk Sung Hwang; Evelyn Nario; Mark Lepe; Lyndon Luz; Hirokazu Ito; Kazuo Takechi
Original assignee: Alpha Therapeutic Corporation
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 1999-05-12
Also published as: BR9710107A; PT1762576E; ES2320919T3; US5981715A; AU3583197A; EP0944392B1; AU726233B2; PL188830B1; US5616693A; JP2008120822A; JP5245079B2; CA2259499C; DE69739212D1; DE69737294D1; ATE352569T1; EP0944392A1; CA2259499A1; PL188873B1; CA2489773A1; PT944392E

Description

Způsob oddělování inhibitoru í\-l-proteinasy od pastové Cohn-ovy frakce IV^ + IV^

Oblast techniky

Tento vynález, se týká zlepšeného způsobu čistění inhibitoru ol-l-pxOteinasy ( ot-antitrypsinu).

Dosavadní stav techniky

Inhibitor -1-proteinasy (zde též <T~1-PI), známý rovněž jako cž, -antitrypsin, je sérovým glykoproteinem v mol.hmotností 52.000. Tato látka je syntetizována v játrech a je obsažena v séru v množstvích mezi 150 až 350 mg/dl), což se rovná 30 až 80 y&l při testování krevlít nínnL standardy · cÁ-l-PI působí v plících inhibičně na neutrofilní elastasu, serinovou proteasu, jež ve velkých množstvích může vést k destrukci alveolárních stěn. V normálních plících představuje ot-1-PI více než 90%ní anti-neutrofilní elastasovou ochranu v nižším dýchacíra traktu.

Nedostatek ^-l-PI je autosomální, zhoršující jee dědičná svízel, ovlivňovaná celou, řadou allelických variant a byla charakterizována allelickým uspořádáním označovaným jako proteasový inhibiční systém (Pl). Tyto allely byly seskupeny na základě hladin X^-l-PI, jak se projevují v séru různých jednotlivcůoNormální jednotlivci mají normální hladinu’ ot-l~PI v seru (normální jednotlivci se označují jako PiMM fenotypy)₀ Deficitní jednotlivci mají sérovou hladinu

4.-1-PI pod 35% normálního průměru (tito jednotlivci jsou označování jako PiZZ fenotypy). Nultí jednotlivci mají nedokazatelný obsah ot-l-PI proteinu v seru (odtud označení Pi(nula$(nula) fenotypy

Nedostatek cZ-l-PI je charakterizován nízkými hladinami d-l-PI v seru (méně než 35% průměrné normální hladiny) a v plících. Tento nedostatek je u zmíněných jednotlivců spojen s vysokým rizikem vývoje panacinární záduchy. Taková záducha převládá u jednotlivců s fenotypy PiZZ, PiZ(nula) a • ft • ·

-2«·· ft ft ·

I · ftft • ftft « I • · 4 ·· ft*

PiZ(nulaO(nula). Symptomy tohoto stavu se obvykle projeví u postižených jednotlivců, v třetím nebo čtvrtém desetiletí jejich života.

Záducha ve spojitosti s nedostatkem -1-PI se rozvijí v důsledku nedostačujících koncentrací οζ-1-PI v nižších částech dýchacího traktu, kde je třeba inhibovat neutrofilní elastasu, vedoucí k rozrušení spojovacího tkáňového pletiva plicního parenchymu. Jednotlivci $ nedostatkem cž-l-PI jsou málo chráněni proti neutrofilní elastase, uvolňované neutrofily v nižší části dýchacího traktu. Tato nerovnována inhibitoru proteasaiproteasa u jednotlivců s nedostatkem ck-l-PI se projeví chronickým poškozováním a posléze i zničením plicního parenchymu a alveolárních stěn.

Jednotlivci s vážným nedostatkem ^/-1-PI se vyznačují typicky hladinami 4.-1~PI v endogenním séru pod 50 mg/dl, to dle stanovení standardizovanými postupy. Jednotlivci s tak nízkými sérovými hladinami ói-l-PI mají vyšší riziko, než je 80$, že se u nich během doby života projeví záducha. Odhaduje se, že v USA nejméně 40.000 pacientů,,nebo jinak 2% ze všech, trpíeích záduchou, jsou postiženi tímto neduhem v důsledku defektu v génu s kódováním oC -1-PI. Nedostatek á,-l-PI představuje jednu z nejbežnějšíctusmrtelných nemocí Kavkazanů ve Spoj.Státech a Evropě.

Léčení pacientů s nedostatkem J^-l-PI směřuje k nahrazení nebo zvýšení hladiny Λ.-1-ΡΙ v séru. Zvýší-li se hladina c\-l-PI v séru, lze předpokládat, že v důsledku toho se zvýší koncentrace v plících, čímž se upraví nerovnována neutrofilní elastasa: «Á-1-ΡΙ v plících a předejde se destrukci plicní tkáně, nebo se tento pochod zpomalí.Studie při sledování normální ‘a c/.-1-PI deficitní populace vedly k názoru, že minimální ochranná hladina Λ-1-PI v gíéru odpovídá 80 mg/dl nebo jinak llpM (asi 57 mg/dl), to při použití čistých standardů)·.

V důsledku toho je nejúčinnější léčba et-l-PI-deficitních pacientů zaměřena na zajištění Či dosažení minimální ochranné hladiny ^-l-PI v séru, protože sk-l-PI v séru je zdrojem alveolární. 4.-1-PI.

• · • ·

-3Přípravky s obsahem ^-1-PI pro terapii jsou dostupné od let 1980, Nejvyšší využití je směrováno na terapii zmnožení (nahrazení) kongenůtálního nedostatku ς^-Ι-ΡΙ, Poločas života lidského oL-l-PI in vivo odpovídá 4,38 dnům se standardizovanou úchylkou 1,27 dnů. Běžné doporučovaná dávka 60 mg Á-l-PI/kg tělesné hmotnosti týdne upraví nízkou hladinu <Á-1-PI v séru nad ochrannou hladinu 11 uM nebo 80 mg/dl.

Dříve byl cA-l-PI čištěn různými postupy. Jeden z nich kombinuje chromatografování na aniotově-výmenném chromatografickém prostředí s následujícím PEG^srážením. Jiné způsoby čistění využívají PEG srážení s následnou aniontově-výměnnou chromatografií, nebo několikanásobné PEG vysrážení s následnou aniontově-výměnnou chromatografií. Jinak byly použity kombinace PEG srážení, jeden či více stupňů aniontově-výměnné chromatografie a stupen kovově-chemátové chromatografie.

A ještě další způsoby využívají techniku dělení fází k vyčistění ot-l-PI. Specifické aktivity 1,26 jedn./mg byly oznámeny pro čištěný <-l-PI.

Podstata vynálezu

Vynález se řízen na zlepšený způsob čistění tÁ-l -Pl; záleží v použití nečisté proteinové frakce, s výhodou Cohn-ovy frakce IV^ + IV^ ve formě pasty, jež obsahuje </cl-PI. Nečistá proteinová frakce se suspenduje ve studené vodě nebo v roztoku solanky za hodnoty pH asi 6 k rozpuštění rozpustných proteinů, čítaje v to albumin, <-2-globulin ( (λ-2-makroglobulin a hatoglobulin) a P-globulin (transferrin). Suspenze se potom filtruje, aby se tak získaly nerozpustné proteiny s obsahem cF-l-PI a ty se progiyjí vodou (nebo roztokem solanky^, Prakce proraytých nerozpustných proteinů se znovu suspenduje ve vodě (nebo v roztoku solanky), hodnota pH se upraví asi na 8,5 a přidáním PEG se vysráží -2~globulin. Kapalina nad sedlinou se odlije a přidáním chloridu zinečnatého se vysrá^+/ZPBG = polyethylenglykol 3350 • · • · · · 1 • · 1 «* ·· ft • · · ·

-4zí surový <^-l-PI. Tato surová látka se znovu rozpustí v pufru sodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny a viry se desaktivují přidáním Tween-u 80 a tri-n-butylesteru kyseliny fosforečné (TNBP). S výhodou se přidá některý ze sacharidů, jako je sacharosa, maltosa, glukosa a pod., aby se stabilizoval v průběhu desaktivace virů a zvýšil se pak výtěžek.

Takto zpracovaný roztok se nanese na aniontovš-výměnné prostředí k oddělení -1-PI od dalších zbývajících proteinů. Frakce, obsahující -1-PI se oddělí a zpravidla se upraví přidáním bentonitu, aby se tak odstranily jakékoli apolipo-pro teiny, jsou-li přítomny. Takto vzniklý čištěný roztok Jl-1-PI se dále zahustí.

Tímto způsobem vyčištěný c^-l-PI iraa specifickou účinnost nad 1,0 /jedn./ODggQ. Tímto postupem lze dosáhnout výtěžku nad asi 1,0 jedn/g pasty, s výhodou pak nad asi 1,3, jedn/g pastýř

Použitím postupu dle tohoto vynálezu se zlepší kvalita i výtěžek oÍ-l-PI. Dále pak se tímto postupem zkrátí doba čistění ve srovnání s jinými způsoby.

Podrobný popis

Způsob zahrnuje jedinečnou kombinaci stupňů čistění za dosažení vysokého výtěžku a vysoké specifické aktivity ol-l~PI přípravku.

Čistění ck-l-PI vychází z nečisté proteinové frakce.

Touto nečistou proteinovou frakcí může být plazma, dále

4.-1-PI získaný jakoukoli rekombinantní metodou či jakýkoli jiný zdroj, obsahující o( -1-PI protein. Při výhodném provedení je výchozí frakcí Cohn-ova frakce IV^ + IVve formě pasty; její příprava je na tomto úseku velmi dobře známa.

Počáteční zpracování pastovité frakce IV-^ + IV

Pastovitá frakce IV^ + IV, (nebo jiná nečistá proteinová frakce) se suspenduje v 5 * 2 dílech vody nebo roztoku solanky (tj. asi 0,05 až asi o,15 M chloridu sodného na 1 díl • · · · 1 • · <

• · «·

-5frakce, tedy IV^ + IV^) za teploty pod asi 15° C a za hodnoty pH asi 6,0 i 0,2, a to nejméně asi na hodinu. Rozpustné proteiny, zahrnující albumin, <^-2-globulin a |h-globulin, se potom oddělí od nerozpustných proteinů, obsahujících i inhibitor ok-l-proteinasy, filtrací za tlaku, odstředěním a pod. Zbytek se promyje za teploty pod 15° C asi pětinásobnými podíly vody nebo roztoku solanky (se zřetelem na objem původní pasty) za hodnoty pH 6 ± 0,2, aby se tak odstranily jakékoli zbytky rozpustných proteinů, zachycené fyzikálně v nerozpustné pastě.

Bylo zjištěno, že suspendováním pastovité frakce IV-, + IV^ ve vodě nebo v roztoku solanky za hodnoty pH 6,0 - 0,2 s následujícím promýváním vodou se odstraní takřka všechny albuminy a vysráží se většina z o<-2~ a ^-proteinů z frakcí IV_n + IV '4'

Srážwní použitím PEG

Nerozpustné proteinové zbytky se znovu suspendují v asi b » 2 objemech vody za hodnoty pil 8,5 0,5 na objem zbytku za teploty od asi 15°C i 5°C_Z s výhodou po dobu asi 6 hodin, ačkoliv se mohou využít kratší či delší časy. Kratší doby výhodné nejsou, protože výtěžek se vylepšuje, jak se doba zpracování prodlužuje. Jako optimálnímkombinace doby a výtěžku při postupu se ukazuje být 6 hodin. Potom se přidá pevný Tris do konečné koncentrace 10 i 5 mM, a přidá se také pevný chlorid sodný do konečné koncentrace 150 i 20 mM, hodnota pH se upraví na 8,0. Posléze se přidá polyethylenglykol 3350 (PEG) do konečné koncentrace 15 5% hmotn.

a reakční směs se michá asi hodinu za teploty 15 5°C. Přidáním PEC- se vysřáží -2-globulin.

Sraženina, jež se vyloučí po přidání PEG,se odsagg za tlaku, filtrační tlakové zařízení se promyje před filtrací i potom použitím roztoku s obsahem 150 ± 25 mM chloridu sodného + 5% hmotn. PEG, to za hodnoty pH 8,0 í 0,5. Potom lze také sraženinu získat odstředěním»

-6·· ♦ · » flfl ·

F flflfl • flflfl · • · · • fl fl *

Srážení chloridem zinecnatým

Do kapaliny nad sraženinou po přidání PSG se přidá chlorid zinečnatý (100 i 10 mM) až do konečné koncentrace 6 i 5 mM a hodnota pH roztoku se upraví na 7,5 - 0,5.

Ro ztok se ochladí na teplotu 5 - 5^V C, míchá se nejméně hodinu; chlorid zinečnatý vysráží surový -1-PI, ten se oddělí filtrací, s výhodou použitím Prostak*' filtrací, jak je to popisováno například v Prostak Open-Channel Modules, Millipore Corporation, na což se zde odkazuje, nebo odstředěním a filtrát se odebere. Koncentrovanou suspenzi nebo sraženinu lze pro dslší upotřebení zmrazit.

Virové desaktivování zpracováním bez rozpouštědla

Surový Λ-1-ΡΙ se znovu rozpustí v asi 50 mM roztoku sodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové použitím filtrace Prostak a recirkulace. Sacharid, s východou sacharosa, se přidá v množství asi 15 í 5% hmotn. (nebo asi 0,25 + 0,05 trisodné soli kyseliny citrónové), jakož i stabilizátor během virové desaktivace. Roztok se míchá za teploty 15 5° 0, až se sacharosa rozpustí.

Roztok, obsahující -1-PI se z hlediska viru deaktivuje působením rozpouštědla povahy detergentu« K roztoku d(-l-PI se přidá roztok 10 - 1% hnotn/obj polysorbitalu 80 a 3 ⁴ 0,3% hmotn tri-n-butylesteru kyseliny fosforečné, a to až do konečné koncentrace 1,0 i 0,5% hmotn/pbj. polysorbitalu-80 a 0,3 - 0,15% hmotn. tri-n-butylesteru kyseliny fosforečné.

Dále se roztok inkubuje za teploty 27° 3° C, pH 8 - 0,5 po dobu nejméně 6 hodin, aby se tím desaktivoval jakýkoli virus, přítomný v Λ-1-PI.

Bylo nalezeno, že za přítomnosti sacharidu, například sacharosy jako stabilizátoru během virové desaktivace při použití způsobu rozpouštědlo/detergent se zvyčuje výtěžek dl-1-PI v jednotkách ve srovnání s kontrolním pokusem, t.j. za virové desaktivace roztoku ct-l-PI rozpouštědlem/detergentem bez sacharidu jako stabilizátoru. Zvýšení výtěžku činí s výhodou nejméně 10%, s výhodou nejméně 20% a nejvýhodněji nejméně 30%.

• ·

-7Po inkubování se upravený roztok e>L-l-PI ochladí na 0° až -10°C, hodnota pH pak na 8,0 i ¢,1. Aniontově-výměnná chromatografie

Získaný roztok se potom zředí asi jedním objemem qvody na objem .získaného roztoku, zředěný roztok se dále nanese na předem rovnovážně upravené chromatografické prostředí QAE nebo na jiné podobné aniontové-výměnné prostředí, jež vážw

-1-PI, což dovoluje oddělení této látky od jiných proteinů. Přitom lze použít bud chromatografování dávek nebo sloupcovou chromatografií. Jakmile se σ^-1-PI naváže adsorpci na prostředí, promyje se toto pufrem obsahujícím 20 i 10 mM chloridu sodného a 20 ± mM prim.fosforečnanu sodného (NaHgPO^). za pH hodnoty 8 ± 1, aby se tak odstranily nenavázané podíly, čítaje v to ^-proteiny. Potom se eluuje z aniontově-výměnného chromatografického prostředí J.-1-PI eluováním promývací kapalinou, obsahující 100 i 50 mM chloridu sodného a 20 i 10 mM fosforečnanu sodného za pH 8 i Eluát s obsahem d-1-PI se jímá pro další zpracovávání.

Po odstranění ct~_l-PI se aniontově-výmšnné prostředí vyšistí promytím následujícími složkami takto: vodný roztok, obsahující 2 i 0,2 mM chloridu sodného a

1 10 mM fosforečnanu sodného, pH 8 ± 1, vodou, určenou k injikování,

Vodným roztokem, obsahujícím. 50 irM hydroxidu sodného a potom znovu vodou, určenou k injikování. Chromatografické prostředí se potom uchovává v 2 - 0,2 M roztoku chloridu sodného, 20 - 10 mM roztoku fosforečnanu sodného, pH 8 í 1.

Zpracovávání eluátu s obsahem ot-l-PI

Eluáty obsahující (Á_1-PI se spojí a přidáním 0,1 až 1,0% (hmotn/hmotn) bentonitu se hodinovým či delším působením odstraní či sníží množství apolipo-proteinů na méně než asi 0,01 mg/ml spolipo proteinu A a méně než asi 0,01 mg/ml apolipo proteinu B. Bentonit se potfom odfiltruje, s výhodou použi• ·

I · • · ·

-8tím filtrace Cuno, naříklad jak je to popisováno v Zeta Plus C Series Pilter Medium, Cuno lne, na což se zde pro úplnost odkazuje. Získaný roztok se potom koncentruje použitím ultrafiltraSní membrány, až se aktivita oí.-1-PI rovná nejméně^.0 jedn./ml. Koncentrovaný filtrát se dále filtruje 0,45 mikronovým filtrem se zřetelem na odstranění jakýchkoli pevných podílů, potom se <U.-l-PI filtruje použitím Plánová k odstranění viru, sterilně se filtruje 0,22 mikronovým filtrem k rozdělení do drobných ampulek a pro uskladnění se lyofilizuje. Uskladňuje se tak <A-1-PX za teploty 2 - 8°C.

Lyofilizovaný oi-l-PI se může pak znovu rozpustil ve sterilní vodě při podávání pacientovi.

Testy aktivity á^-l-PI

Ghromogenní test se může využít k zjištění aktivity UL-l-PI v rekonstituovaném J.-1-PI. Test využívá trypsinem sensitivní chromogenm substrát, · ze ktereho se uvolňuje p-nitroanilin za přítomnosti trypsinu (Sigma Chemical Co.,

Sr.Louis, Missouri). Uvolněný p-nitranilin se zjistí za vlnové délky 405 nm. d-l-PI inhibuje uvolnění p-nitranilinu ze substrátu. Aktivita -1-PI v produktu se stanoví porovnáním se standardizovanou křivkou aktivity db -1-PI·Ghromogenní test rekonstituovaného lyofilizovaného d.-1-PI, připraveného ve shodě s právě zde výše popisovaným postupem prokazuje specifickou aktivitu nejméně asi 1,0 jedn/0D₉gQ.

Podávání

Pacientovi lze podávat d(-l-PI infuzemi rychlostí asi 0,08 ml/kg tělesné hmotnosti za minutu po prvých 10 minut, Nezt.ěžuje-li si pacient na cokoli, lze rychlost podávání zvyšovat, jak je to tolerováno, a pokud je to tolerováno, pak další následné infuze témuž pacientovi mohou být zvýšeny. Dojde-li k opaku, sníží se rychlost nebo se infuze přeruší, až symtomy zmizí. Pak lze infuzi obnovit za rychlosti, jež je pacientem tolerována.

-9Mají-li se podávat vysoké dávky, pak lze několik ampulek ©(-l-PI spojit do prázného, sterilního i.v. infuzního kontejneru za užití aseptického postupu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

600 g pasty frakce IV^ + IV^ z Cohn-ova frakcionačního schemaáu se suspenduje v 1800 ml vody za teploty 5° C a hodnoty pH 6,0 bez jakékoli titrace po dobu hodiny. Po skončeném suspendování se suspenze filtruje za tlaku 10 GP filtrem (Cuno). Piltrát se shromáždí, testuje a změří se specifická aktivita ot-l-PI a optická hustota při 280 nm ^^0D280 nm ).

Pasta zbylá v tlakovém filtru se promyje použitím 600 ml vody při 5° C, filtrát se jímá a tento postup se opakuje ještě čtyřikrát. Všechny filtráty se testují za změření specifické aktivity i optické hustoty. Hmotnost výsledné pasty: 350 g. Specifická aktivita a optická hustota všech procesních vzorků je popsána v následující tabulce I.

T a b u 1 k a I

Aktivita ď-l-PI a opt.hustota (280 nm) frakcí vymytých vodou

Vzorek Objem	ol~lPI <-ΪΡΙ celkově	Opt.hus 2 80	tota nm	opec.aktivita (u/OD) i
promytí	(mL)	(u/mL)	(U)'
0	1450	0,06	87	22,2	0,003
1	600	0,1	60	29,9	0,003
2	600	0,08	48	25,5	0,003
3	600	0,04	24	13,0	0,003
4	600	0	0	4,8	0
5	600	0	0	3,0	0
U = unit,	jednotek
Příklad 2
350 g	výsledné pasty	z příkladu 1	se znovu	suspenduje v

4

-10»444 44

1050 ml vody za hodnoty pH 8,5 za teploty 18° C po dobu 6 hodin. Přidá se pevný Tris do koncové koncentrace 10 mM a pevný chlorid sodný do koncové koncentrace 150 mM za úpravy pH na hodnotu 8,0. Polyethylenglykol (PEG 3350) se dále přidá do koncové koncentrace 15% (hmotn), vše se míchá hodinu při 18? 0, vzniklá sraženina se odstraní tlakovým filtrem s 10 CP filtrem pro získání kapaliny nad sedlinou. Pasta v tlakovém filtru se potom promývá roztokem s obsahem 15% (hmotn) po.lyethylenglykolu PEG-3350, 10 mM Tris a 150 mM chloridu sodného. Piltrát a podíl z filtrování se spojí. Výsledek je shrnut v tabulce 2.

T a. b u 1 k a 2

PEG-3350 srážení

Vzorek Objem	Z-TPI	i-lPI (celkově)	Opt.hustota	Spec.akt.
(ml)	(u/ml)	(u)	280 nm	(u/OD)
pův. 1400	1,063	1488	13,32	0,0798
PEG-filt-
rát 2465	0,513	1265	2,16	0,2375

Příklad 3

K získanému filtrátu PEG-3350 z příkladu 2 se přidává chlorid zinečnatý do koncové koncentrace 2 mM, hodnota pH se upraví na 7,5, teplota se sníží na 5° C k vysrážení surového ď-lPI. Po hodinovém míchání se surový Λ-1-ΡΙ odfiltruje (Prostak) a získaná suspenze se znovu rozpustí v roztoku sodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
-	Ta b u 1 k a Srážení chloridem	3 zinečnatým
Vzorek Objem	ά-1-ΡΙ	<K~1PI(celkově) Opt.hustota	Spec.ak
(ml)	(u/ml)	(u)	280 nm	(u/OD)
Prostak filtrát 2200	0,0159	35	0,15	0,106
po NaEDTA 264	4,305	1065	13,72	0,3138

·· · · • · ·· 4

-11Příklad 4 Sacharosa v množství 16,7 % (hmotn) se přidá k roztoku po rozpuštění působením sodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (příklad 3) a vše se míchá za teploty 18° C, až se sacharosa zcela rozpustí. K tomuto roztoku se,přidá polysorbát-80 do konečné koncentrace 1,0% a tri-n-bůtylester kyseliny fosforečné do konečné koncentrace 0,3%. Roztok se dále inkubuje za teploty 27,5° cjúejméně po 6 hodin pro desaktivování jakéhokoli možného viru, znečistujícího zachycením v lipidu. Po skončeném inkubování se roztok ochladí na 5° 0, hodnota pH se upraví na 8,0 a pro kontrolu se výše uvedený postup opakuje,aniž se přidá sacharosa. Stabilita Λ-1-ΡΙ během působení roapouštědla-detergentu (SD) za přítomnosti 16,7% sacharosy a bez sacharosy (kontrolní pokus) je vyjádřena v následující tabulce 4.

SD

Tabulka 4

Stabilita c^_l-PI během reakce s rozpouštědlem-detcrgentem za přítomnosti sacharosy Vzorek Objem J^-1-PI oL-l-PI(celkově) % pi-l-PI z NaSDTA (ml) (u/ml) (u) ___

-ctl-PI 311 3,35 1042 97,8

2,13 624 58,6 kontrola 293

Příklad 5

K získanému roztoku J -1-PI v rozpouštědle-detergentu z příkladu 4 se přidá 311 g destilované vody ke snížení iontového zatížení před nanesením na QAS kolonu. Roztok se nanese na 300 ml předem upravené QAE iontoměničové kolony s^průtokem 12 ml/min. Kolona se promyje použitím 6 ml fosfáto vého pufru s obsahem solanky (20 mM chloridu sodného, 20 mM prim. fosforečná nu sodného NaH_oP0,,, pH 8,0). Dále se získá cL-ΙΡΙ eluováním za použití 1,8 L fosfátového pufru s obsahem solanky (lOOrnM chloridu sodného, 20 mM uvedeného fosfátu, • · ·· · · 4 • · 4 ·· ·· mM BaHgPO^, pH 8,0, 500mM destilovanou vodou. ChromatograpH 8,0).

Iontoměničové prostředí se promyje postupně použitím:

M roztok chloridu sodného, roztoku hydroxidu sodného fické prostředí se uchovává v 2 M roztoku chloridu sodného, 20 mM WaHgPO^, pH 8,0. Spojené frakce s obsahem οζ-1-PI se testují, výsledky viz následující tabulce 5.

Tabulka ř ' QAE-iontová ohromatografie

Vzorek Objem ^-IPI d—1PI (celkově) (ml) (u/ml) (u)

Eluát 1500 0,62 930

Opt.hustota Spec.akt, 280 nm (u/OD)

0,58

1,058

Příklad 6

Ke spojenému eluátu z příkladu 5 se přidá 3,0 g depyrogenovaného bentonitu a vše se míchá hodinu při 20° 0. Bentonit se odstraní filtrací (Cuno), filtrát se zahustí ultraíiltrací. Koncentrát se filtruje (Plánová) a dále v sériích sterilně. Filtrát se rozdělí do ampulek s lyofilizováním pří skladování. Všechy procesní vzorky byly testovány, výsledky v tabulce 6:

Tabulka 6

Vzorek Objem d-lPI cK-ΙΡΙ (celkově) Opt.hustota Spec.akt.

	(ml)	(u/ml)	(u)	280 nm	(u/OD)
Filtrát
(Cuno)	1710	0,52	885	0,385	1,351
Koncent-
rát	75	11,6	870	8,092	1,434
Konečný
vzorek	92	0,4	865	6,225	1,510

Vynález není jakkoli omezován specifickými příklady provedení. Odborníkům jsou jasné možné variace materiálů, stupňů, procesních parametrů, líčících se od zde popisovaných provedení, aniž by se přitom odbočilo z rozsahu vynálezu. Keni tedy vynález jakkoli omezován předloženými příklady, viz také přiložené nároky.

Vul. . 1 <« iK KALENSKÝ - ₃, _;ř AVáééh ' ’ ' ' ' -, i!

120 OQ Praha va 2

Česká republika

• ·

-13ΙΪ Á R O K Y

Tat-lPI, vyznačující se tím, že

Claims

Ρ A T Ε Ν T 0 V $ Způsob čistění shrnuje tyto stupně:

použije se nečistá proteinová frakce obsahující ^L-1P±, tato frakce obsahující pl-l-PI se suspenduje ve vodném roztoku o hodnotě pH asi 6 po dobu dostačující k tomu, aby se rozpustily rozpustné proteiny, suspenze se filtruje a zachytí se nerozpustné proteiny, k resuspendovaným nerozpustným proteinům se přidá pólyethyjtenglykol PSG 3350 k vysrážení cÁ“2-glpbulinu, oddělí se kapalina nad sedlinou po polyethylenglykolem PEG 3350, přič sedlinou obsahuje pL-l-PI, k této kapalině se přidá chlorid tomto srážení emž kapalina nad zinečnatý k vysrážení surového «^-l-PI, oddělí se surový cZ-l-PI, získaný surový 1-PI se rozpustí, rozpuštěný surový ol-l-PI se nanese na iontoměničové anexové prostředí, a z tohoto aniontově-výmšnného prostředí se izoluje frakce, obsahující vyčištěný ^Κ-1-ΡΙ.
2 o Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nečistá proteinová frakce obsahující <L-1-PI, suspenduje v asi 3 až asi 7 objemech vodného roztoku na každí díl nečisté proteinové frakce, obsahující ot-l-PI.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vodný roztok volí ze skupiny, kterou tvoří voda a roztoky obsahující chlorid sodný v koncentraci od asi 0,05 do asi 0/15 M.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hodnota pH vodného roztoku, obsahujícího nerozpustný protein, upraví na hodnotu asi 8,5.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ···· ·· »· ·· • v « » · · ·

4« · · « • · « ·· ··

-14se polyethylenglykol PEG přidává do kocentrace 10% až asi 20% zmoth/hmotn.

Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hodnota pH kapaliny nad sedlinou po vysrážení polyethylenglykolem upraví asi na 7,5.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se přidává chlorid zinečnatý dokoncentrace oči asi 1 do asi 11 -mlí.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že

se dále zpracovává de: m zinečnatým, aby ty • 9. Způsob se na surový ck-lPI 10. Způsob se na surový HH

řečné a polysorbátem 80₀

11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se na surový -1-PI působí tri-n-butylesterem kyseliny fosforečné v množství 0,15 až 0,45% (hmotn/obj) a polysorbátem 80 v množství 0,5 až 1,5% (hmo.tn/obj).

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se přidává bentonit do eluátu, obsahujícího inhibitor

-1-proteinasy₀

13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vyčištěný ς^-Ι-ΡΙ má specifickou aktivitu asi 1,0 jedn/ODggQ.

14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vyčištěný J<-1EI ^se získá ve výtěžku nejméně asi 1 jedn. na gram pastovité frakce IV^ + IV

15. Způsob čistění ©t-ΙΡΙ, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně přípravu nečisté proteinové frakce s obsahem </-lPI, ··

4*4 4«4«

4«

4 4 4

4 4 4

I 4 44 4 » 4 4 » 4

4·· « *

4 9 4
9« *· •44« 44

-15suspendování nečisté proteinové frakce s obsahem J.-1PI ve vodném roztoku za hodnoty pH asi 6 po dobu dostačující k rozpuštění rozpustných proteinů., filtrování suspenze s izolováním nerozpustných proteinů, obsahujících oč-lPI, resuspendování proteinů ve vodném roztoku o hodnotě pH asi 8,5, přidání pólyethylenglykolu k vodnému roztoku, obsahujícímu resuspendovaný nerozpustný protein na koncentraci od asi 10% do asi 20% hmotn/hmotn k vysrážení %^-2-globulinů, oddělení kapaliny nad sedlinou po srážení polyethylenglykolem s tím, že tato kapalina obsahuje Jl-1?I, úpravu pH této kapaliny nad sedlinou na asi 7,5, přidání chloridu zinečnatého k této kapalině k vysrážení surového Jl-IPI, oddělení surového «k-ΙΡΙ filtrací (Prostak) s novým rozpuštěním surového cL-ΙΡΙ ve vodném roztoku, působením rozpouštědla a detergentu na znovu rozpuštěný ot-lPI pro desaktivování jakéhokoli virového znečistění, nanesení surového ofylPI po použití rozpouštědla a detergentu na aniontově-výměnné prostředí, izolování frakce s obsahem JL-1PI z a niontově-výmě nižného prostředí, smíchání frakce s obsahem pt-ΙΡΙ s bentonitem k adsorbování upolipoproteinu, a získání roztoku s obsahem vyčištěného Qj-lPI.

l6. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že dále obsahuje úpravu izolované frakce z přeópředposledního s-tupne ultrafiltrací roztoku obsahujícího vyčištěný 4<-l-PI.

χγ. Způsob podle nároku 3L6, vyznačující se tím, že dále obsahuje lyofilizování ultrafiltrovaného roztoku, obsahujícího vyčištěný JL-lPIo

9 4

-16• · • 4 4 ·

4 4 · • 4 4 4 * »4 ·· ·· • 4 · 4 · • · 4 4 4

4 S · 4 4 · · » 4 4 4 »44 45 4*

1S„ Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že vyčištěný d,-lPI má specifickou aktivitu asi 10 jedn/spec. hustota C®280·

19.

vy čištěný g pastovité

20.

Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, žs Á-lPl se získá ve výtěžku nejméně 1,0 jedn. na frakce IV^ + IV^.

Zpus ob čistění vyznačující se tím, že zahrnuje stupně obstarání nečisté proteinové frakce s obsahem ^U-lPI, suspendování nečisté proteinové frakce ve vodném roztoku za teploty a hodnoty pH, solubiiizující albumin, d<-2-protein a '^-proteiny bez solubilizování ^-ÍPI, oddělení nerozpustných proteinů, čítaje v tool-lPI, ze solubilizovaných proteinů, resuspendování nerozpustných proteinů ve vodném roztoku a přidání polyethylenglykolů k roztoku, když se teplota a hodnota pH roztóku i'koncentrace polyethylenglykolů volí tak, že se vysrážejí aL-2-proteiny aniž se vysráží ck~ 1PI, oddělí se kapalina nad sedlinou ze srážení polyethylenglykolem a přidá se chlorid zinečnatý, přičemž se teplota a hodnota plí roztoku a koncentrace chloridu zinečnatého zvolí tak, že se vysráží surový ck-lPl, izoluje se vysrážený surový oí-l?I a rozpustí se ve vodném roztoku, nanese se vodný roztok s obsahem surového o/-lPI na aniontově-výměnné prostředí, a izoluje se frakce, obsahující vyčištěný U.-1PI z anionto vě-výměnného prostředí.

. 21. Způsob zvyšování výtěžku v jednotkách proteinu z proteinového roztoku po virové desaktivaci působením rozpouštědla-detergentu, vyznačující se tím, že se přidá do proteinového roztoku sacharid v množství dostačujícím ke zvý· šení výtěžku proteinu po virové desaktivaci rozpouštědlem-de tergentem_o • ·

-17• · · 9 » · · ⁴ ► · ·· • · · 9 <

• · <

• · ··

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že proteinem je d-lPIo

23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se sacharid přidává do roztoku proteinu v množství od asi 10% do asi 20% hmotn/hmotn.

!4.

Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se jako sacharid použije sacharosa.

25. Způsob odstraňování apolipoproteinu z roztoku proteinů, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

přidání bentonitu do roztoku proteinu, ponechání bentonitu ve styku s roztokem proteinu po dobu dostačující k tomu, aby bentonit adsorbovak apolipoproteiny, a odstraní se bentonit z roztoku proteinů.

26.

dobou styku hodiny.

Způsob podle nároku bentonitu s roztokem

25, vyznačující se tím, že proteinů je nejméně jedna

27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že množství přidaného bentonitu činí od asi 0,1 do asi 1,0% hmotn./hmotn.

28. Způseb podle nároku 25, vyznačující se tím, že množství kteréhokoli z apolipoproteinu A a apolipoproteinu B, zbylé po odstranění bentonitu z proteinového roztoku Činí pod asi 0,01 mg/ml.

i 20 00 Praha 2, Málkova 2