CZ367799A3 - Izolovaná DNA molekula, kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu, DNA konstrukt, rostlinná buňka a transgenická rostlina, peptid, způsob přípravy transgenické rostlinné buňky, osivo transgenické rostliny, způsob produkce tabákové rostliny a způsob snížení a zvýšení exprese genu - Google Patents

Izolovaná DNA molekula, kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu, DNA konstrukt, rostlinná buňka a transgenická rostlina, peptid, způsob přípravy transgenické rostlinné buňky, osivo transgenické rostliny, způsob produkce tabákové rostliny a způsob snížení a zvýšení exprese genu Download PDF

Info

Publication number
CZ367799A3
CZ367799A3 CZ19993677A CZ367799A CZ367799A3 CZ 367799 A3 CZ367799 A3 CZ 367799A3 CZ 19993677 A CZ19993677 A CZ 19993677A CZ 367799 A CZ367799 A CZ 367799A CZ 367799 A3 CZ367799 A3 CZ 367799A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
dna
promoter
quinolate
plant cell
Prior art date
Application number
CZ19993677A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297379B6 (cs
Inventor
Mark A. Conkling
Nandini Mendu
Wen Song
Original Assignee
North Carolina State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21960004&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ367799(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by North Carolina State University filed Critical North Carolina State University
Publication of CZ367799A3 publication Critical patent/CZ367799A3/cs
Publication of CZ297379B6 publication Critical patent/CZ297379B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Description

Oblast techniky
Uvedený vynález se dotýká rostlinné chinolát-fosforibosyltrasferázy a DNA kódující tento enzym. Detailněji se uváděný vynález dotýká použití DNA kódující chinolát-fosforibosyltrasferázu pro produkci transgenických rostlin majících geneticky pozměněné úrovně nikotinu, a takto produkovaných rostlin.
Dosavadní stav techniky
Předmětem zájmu je produkce tabákových rostlin se sníženými úrovněmi nikotinu, uvádějící zájem vzhledem k návykové vlastnosti nikotinu. Dodatečně jsou tabákové rostliny s extrémně nízkými úrovněmi produkce nikotinu nebo žádnou produkcí nikotinu zajímavé jako recipienty transgenů zhodnocujících obchodně užitkové produkty, takové jako farmaceutické prostředky, kosmetické prostředky nebo potravinářské přísady. Pro odstranění nikotinu z tabáku byla navržena řada různých způsobů. Avšak většina těchto způsobů odstraňuje z tabáku společně s nikotinem i další složky, čímž nepříznivě ovlivňuje tabák. Klasické techniky pěstování kultury produkují tabákové rostliny s nižšími úrovněmi nikotinu (přibližně 8 %), než jsou úrovně shledané ··· ···· ···· ···· · · · ···· • ·· · · ·· ······ • · · · · · · ··· ··· ··· ·· ·· ·· v planých typech tabákových rostlin. Žádané jsou tabákové rostliny a tabák mající dokonce další redukce obsahu nikotinu. Jedním způsobem snížení úrovně biologického produktu je snížení množství požadovaného enzymu biosyntetickou cestou vytvářející žádaný produkt. Pokud se ovlivněný enzym přirozeně nachází v množství omezujícím rychlost reakce (porovnáno s dalšími enzymy nezbytnými pro biosyntézu), bude jakékoliv snížení tohoto množství enzymu snižovat produkci konečného produktu. Jestliže však množství enzymu rychlost běžně neomezuje, musí jeho přítomnost v buňce být snížena na úrovně omezující rychlost reakce s cílem snížit množství konečného produktu biosyntézy. Opačně, jestliže přirozeně se vyskytující množství enzymu omezuje rychlost, potom jakékoliv zvýšení aktivity enzymu bude vést ke zvýšení objemu biosyntetického konečného produktu.
Nikotin se utváří původně v kořenech tabákové rostliny a je následně transportován do listů, kde je skladován (Tso, Fyziologie a biochemie tabákových rostlin, str. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa (1972)). Povinným krokem biosyntézy nikotinu je vytváření kyseliny nikotinové z kyseliny chinolinové, tedy krok, který je katalyzován enzymem chinolinfosforibosyl-transferázou („QPRTáza). QPRTáza se projevuje jako enzym ovlivňující rychlost reakce v průběhu biosyntézy, dodávající kyselinu nikotinovou pro syntézu nikotinu v tabáku. Viz např. Feth a spol., „Regulace aktivity enzymů nikotinové cesty v tabákovém kalu, Planta, 168, str. 402-07 (1986); Wagner a spol., „Regulace aktivity enzymů nikotinové cesty u tabáku, Physiol. Plant., 68, str. 667-72 (1986). Modifikace úrovní nikotinu u rostlin tabáku pozitivní regulací hnilobné methyltransferázy (PMTáza) je navrženo v U.S. Patentech 5 369 023 a 5 260 205, od Nakatani a Malik. PCT žádost WO 94/28142 od Wahad a Malík popisuje DNA kódující PMT a použití antikódujících a kódujících PMT konstruktů.
• · ·· ·
Podstata vynálezu
Prvním hlediskem předloženého vynálezu je izolovaná DNA molekula obsahující SEQ ID č.:l; DNA sekvence, které kódují enzym obsahující SEQ ID č.:2; DNA sekvence, které hybridizují na uváděné DNA a které kódují enzym chinolát-fosforibosyltransferáza; a DNA sekvence, které se liší od výše uvedených DNA sekvencí díky degeneraci genetického kódu. Peptid kódovaný uváděnými DNA je dalším hlediskem vynálezu.
Dalším hlediskem předloženého vynálezu je DNA konstrukt obsahující promotor schopný působit v rostlinné buňce a DNA část, kódující enzym chinolát-fosforibosyl-transferáza, umístěnou ve směru z promotoru a k tomuto účinně připojenou. DNA kódující enzym může být v kódujícím nebo antikódujícím směru. Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda přípravy transgenické rostlinné buňky mající sníženou expresi chinolátfosforibosyl-transferázy (QPRTáza) zajištěním rostlinné buňky typu známého pro expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy; transformace rostlinné buňky exogenním DNA konstruktem obsahujícím promotor a DNA tvořenou částí sekvence kódující mRNA (mediátorová RNA) chinolát-fosforibosyl-transferázy.
Dalším hlediskem předloženého vynálezu je transgenická rostlina druhů Nicotiana mající sníženou expresi chinolát-fosforibosyltransferázy (QPRTáza) oproti ne-transformované kontrolní rostlině. Buňky uváděných rostlin obsahují DNA konstrukt, který zahrnuje část DNA sekvence kódující mRNA rostlinné chinolátfosforibosyl-transferázy.
Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda snížení exprese genu chinolát-fosforibosyl-transferáza v rostlinné buňce pěstováním rostlinné buňky transformované k obsahu exogenní DNA, kdy transkriptní řetězec exogenní DNA je doplňkový k mRNA chinolát-fosforibosyl-transferázy, která je pro buňku endogenní. Transkripce doplňkového řetězce snižuje expresi endogenního genu chinolát-fosforibosyl.
• · · · • · · ·· · ···
Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda produkce tabákové rostliny se sníženými úrovněmi nikotinu v jejich listech pěstováním tabákové rostliny s buňkami, které obsahuji exogenní DNA sekvenci, kdy transkripční řetězec exogenní DNA sekvence je doplňujícím k endogenní chinolát-fosforibosyltransferáza-mediátorové RNA v buňkách.
Dalším hlediskem vynálezu je metoda tvorby transgenické > rostlinné buňky mající zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyltransferázy (QPRTáza) transformací rostlinné buňky známé pro expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy exogenním DNA konstruktem, který obsahuje DNA sekvenci kódující chinolátfosforibosyl-transferázu.
Dalším hlediskem předloženého vynálezu je transgenická Nicotiana rostlina mající zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyltransferázy (QPRTáza), kdy buňky transgenické rostliny obsahují exogenní DNA sekvenci kódující rostlinnou chinolát-fosforibosyltransferázu.
Dalším hlediskem vynálezu je metoda zvýšení exprese genu chinolát-fosforibosyl-transferáza v rostlinné buňce pěstováním rostlinné buňky transformované k obsahu exogenní DNA kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu.
Dalším hlediskem předloženého vynálezu je metoda produkce tabákové rostliny mající zvýšené úrovně nikotinu v jejích listech pěstováním tabákové rostliny zahrnující buňky, které obsahují exogenní DNA sekvenci kódující chinolát-fosforibosyltransferázu, účinnou v buňkách.
Nikotin tabákových rostlin je produkován kondenzací kyseliny nikotinové a 4-methylaminobutanalu. Biosyntetická cesta vedoucí k produkci nikotinu je znázorněná na obrázku 1. Dvě regulační místa genů v chromozómu (Nicl a Nic2) působí jako ko-dominantní (úrovňové) regulátory produkce nikotinu. Analýza enzymů v kořenech jednoduchého a dvojitého Nic mutanta ukazuje, že aktivita dvou enzymů, chinolát-fosforibosyl-trasferázy (QPRTáza) a hnilobné methyl-transferázy (PMTáza), je přímo úměrná úrovním biosyntézy nikotinu.
• · ··· · · · · · » · · ···· ··· · · · · • · · · · · · ······ • · · · · · · ······ ··· ·· ·· ··
Porovnání aktivity enzymů v tabákových tkáních (kořenech a kalu) s různou schopností syntézy nikotinu ukazuje, že aktivita QPRTázy je v přesném vzájemném vztahu (koreluje) s obsahem nikotinu (Wagner a Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders a
Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) prokazují, že úroveň QPRTázy v kořenech mutantů s nízkými úrovněmi nikotinu je přímo úměrná k úrovním nikotinu v listech.
i Předložený vynález zahrnuje novou cDNA sekvenci (SEQ ID č.:l) kódující rostlinnou chinolát-fosforibosyl-transferázu (QPRTáza) sekvence SEQ ID č.:2. Vzhledem k tomu, že aktivita QPRTázy je v přesném korelačním vztahu s obsahem nikotinu, transgenické tabákové rostliny, ve kterých úrovně QPRTázy jsou v kořenech rostliny sníženy (porovnáno s úrovněmi u planých typů rostlin), vedou k rostlinám majícím snížené úrovně nikotinu v listech. Předložený vynález poskytuje metody a konstrukty nukleových kyselin pro produkci uváděných transgenických rostlin, stejně jako uváděné transgenické rostliny. Uváděné metody zahrnují expresi kódující NtQPTl RNA, která snižuje množství QPRTázy v kořenech tabákových rostlin. Nikotin byl dodatečně shledán v netabákových druzích a čeledích rostlin, ačkoliv přítomné množství je obvykle mnohem nižší než v N.tabacum.
Předložený vynález také zajišťuje molekuly antikódující a kódující rekombinantní DNA kódující QPRTázu nebo molekuly antimediátorové (pozitivní) RNA QPRTázy a vektory obsahující „ uváděné molekuly rekombinantní DNA, stejně jako buňky transgenických rostlin a rostliny transformované uváděnými DNA molekulami a vektory. Transgenické tabákové buňky a rostliny tohoto vynálezu jsou charakteristické nižším nebo vyšším obsahem nikotinu, oproti netransformovaným kontrolním tabákovým buňkám a rostlinám.
Tabákové rostliny s extrémně nízkými úrovněmi produkce nikotinu nebo žádnou produkcí nikotinu jsou zajímavé jako recipienty transgenů vytvářejících obchodně hodnotné produkty, takové jako farmaceutické prostředky, kosmetické prostředky nebo potravinářské přísady. Tabák je zajímavý jako recipientní rostlina transgenů kódujícího žádaný produkt, jelikož je snadno geneticky upravitelný a produkuje velké množství biomasy na jedem akr; tabákové rostliny se sníženými zdroji týkajícími se produkce nikotinu, budou ve shodě s tím zahrnovat více zdrojů využitelných pro produkci transgenických produktů. Metody transformace tabáku transgeny produkujícími požadované produkty jsou v oboru známé; použit může být jakýkoliv vhodný způsob využívající tabákové rostliny s nízkým obsahem nikotinu ve shodě s předloženým vynálezem.
Tabákové rostliny se sníženou expresí QPRTázy a sníženými úrovněmi nikotinu, ve shodě s předloženým vynálezem, budou potřebné pro produkci tabákových výrobků majících snížený obsah nikotinu. Tabákové rostliny ve shodě s předloženým vynálezem budou vhodné pro použití v jakémkoliv tradičním tabákovém produktu, zahrnujícím, ale nikterak omezeným na, tabák do dýmky, doutníku a cigaretový tabák a žvýkací tabák, tabákový produkt může být v jakékoliv formě zahrnující listový tabák, sekaný tabák a řezaný tabák.
Provedení předloženého vynálezu mohou být zajištění trasgenických rostlin majících také vhodná pro zvýšenou expresi
QPRTázy a zvýšený obsah nikotinu v rostlině. Uvedená provedení, a rostliny takto produkované tabákových produktů majících metody použití těchto provedení mohou být potřebné po výrobu upravený obsah nikotinu nebo pro produkci rostlin majících obsah nikotinu zvýšený pro jeho insekticidní účinky.
Současní vynálezci zjistily, že TobRD2 gen (viz Conkling a spol., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) kóduje QPRTázu Nicotiana tabacum a na tomto místě poskytuje cDNA sekvenci NtQPTl (dříve označovanou jako TobRD2) a amino kyselinovou sekvenci kódovaného enzymu. Porovnání NtQPTl amino kyselinové sekvence s GenBank databází ukazuje omezenou podobnost sekvence k bakteriálním proteinům, které kódují chinolát-fosforibosyl-transferázu (QPRTáza) (obrázek 3).
Chinolát-fosforibosyl-transferáza je nezbytná pro biosyntézu nového nikotin-adenindinukleotidu (NAD) jak v prokaryonech, tak i v eukaryonech. V tabáku jsou vysoké úrovně QPRTázy zjištěny v kořenech, ale ne v listech. K určení, že NtQPTl kóduje • ·0·
00
0
00 00 » 0 0 0 0 4 ) · 0 0 0 « > 0 · 0 0 0 0 0 « » 0 0 «
0 0 0 0 0
QPRTázu, současní vynálezci použili Escherichia coli druh bakterií (TH265), mutant postrádající chinolát-fosforibosyltransferázu (nadC). Tento mutant nemůže růst na minimálním médiu postrádajícím kyselinu nikotinovou. Avšak, exprese NtQPTl proteinu u tohoto bakteriálního druhu dodala NadC+ fenotyp (obrázek 4) potvrzující, že NtQPTl kóduje QPRTázu.
Současní vynálezci zkoumali účinky Nicl a Nic2 mutantů v tabáku a vlivy upravených tabákových rostlin na úrovně ustáleného stavu mRNA NtQPTl a úrovně nikotinu. (Odstranění apikální dominance vrchní úpravou na počátku období květu je dobře známé a vede ve zvýšené úrovně biosyntézy nikotinu a transportu nikotinu v tabáku a je běžnou praxí při produkci tabáku). Jestliže NtQPTl je ve skutečnosti zahrnuto při biosyntéze nikotinu, očekáváním bude, že (1) NtQPTl mRNA úrovně budou nižší v Nicl/Nic2 dvoumutantech a (2) NtQPTl mRNA úrovně budou zvýšeny po vrchní úpravě. NtQPTl mRNA úrovně v Nicl/Nic2 dvojitých mutantech byly shledány přibližně 25 % úrovní planého typu (obrázek 5) . Dále, po šesti hodinách od provedení vrchní úpravy, NtQPTl mRNA úrovně tabákových rostlin se zvýšily asi osm-krát. NtQPTl bylo takto zjištěno jako klíčový kontrolní gen způsobu biosyntézy nikotinu.
Transgenické rostlinné buňky a rostliny
Kontroly exprese genu v rostlinných buněčných genomech je možné dosáhnout zapojením heterologní DNA pod transkripční kontrolou promotoru účinného v hostiteli, přičemž transkripční řetězec heterologní DNA je doplňkovým k řetězci DNA, který je přepsán z upravovaného endogenního genu. Zavedená DNA, označovaná jako kódující DNA, zajišťuje RNA sekvenci, která je doplňková k přírodně produkovaným (endogenním) mRNA kyselinám a která potlačuje expresi endogenní mRNA. Mechanismus uvedené regulace exprese genu kódováním není zcela jasný. Aniž bychom si přáli být omezeni pouze na jednu jednotlivou teorii, je známé, že jedna teorie regulace kódováním nabízí, aby transkripce kódující DNA vytvářela RNA molekuly, které se váží na a ochraňují nebo potlačují transkripci molekul endogenních mRNA.
• · • · • · • · · to to ···
Kódující produkt může být podle metod předloženého vynálezu doplňkovým ke kódující nebo nekódující (nebo oběma) části přirozeně se vyskytující koncové RNA. Kódující konstrukt může být zaveden do rostlinných buněk jakýmkoliv vhodným způsobem a může být zapojen do rostlinného genomu pro indukovatelnou nebo konstitutivní transkripci pozitivní (kódující) sekvence. Viz např. U.S. Patent 5 453 566 a 5 107 065, od Shewmaker a spol., (v textu zahrnut poznámkami).
Pojmy exogenní nebo heterologní DNA (nebo RNA), jak jsou použity v textu, se vztahují na DNA (nebo RNA), která byla zavedena do buňky (nebo předchůdce buněk) úpravou provedenou člověkem. Uvedená heterologní DNA může být kopií sekvence, která se přirozeně nachází v buňkách určených pro transformaci nebo v jejich částech.
K produkci tabákové rostliny mající snížené úrovně QPRTázy a nikotinu, než netransformovaná kontrolní mohou být tabákové buňky transformovány exogenním QPRT kódujícím transkripčním celkem obsahujícím neúplnou QPRT cDNA sekvenci, plnou délku QPRT cDNA sekvence, chromozomální sekvenci nebo plnou délku QPRT sekvence, v pozitivní (kódující) orientaci s vhodnými účinně propojenými kontrolními sekvencemi. Vhodné kontrolní sekvence zahrnují iniciační sekvenci transkripce tudíž nižší obsah tabáková rostlina, neúplnou QPRT chromozomální („promotor”) transformovány, sekvenci. Pro účinnou v rostlinách, které mají být a polyadenylační/traskripční cílovou koncovou určení klonů nesoucích sekvence QPRTázy v kódujícím (pozitivním) směru účinně připojené na kontrolní sekvence jsou použity běžné techniky, takové jako restrikční mapování, Southernova hybridizace a analýza nukleotidové sekvence. Tabákové rostliny jsou následně regenerovány z úspěšně transformovaných buněk. Je nejvhodnější, aby použitá kódující sekvence byla doplňující k endogenní sekvenci, avšak malé obměny exogenních a endogenních sekvencí mohou být také tolerovány. Je výhodné, aby kódující DNA sekvence byla dostatečně sekvenčně příbuzná tak, aby byla schopná vazby k endogenní sekvenci • · 9 9
9 9 9 9
9 9 9 ·
999 999
9 9 ·· ·· ···· • ·· • ·· v kontrolované buňce za striktních podmínek, které jsou popsány dále v textu.
Pro vytvoření transgenických rostlin charakterizovaných nižším než obvyklým množstvím specifického enzymu byla použita v několika laboratořích technologie kódování. Např., rostliny s nižšími úrovněmi chalkonsyntázy, enzymu květního pigmentu biosyntetické cesty, byly vytvořeny dodáním antimediátorového genu chlakonsyntázy do genomu tabáku a petúnie. Tyto transgenické rostliny tabáku a petúnií vytváří květy světlejší, než je jejich obvyklé zbarvení (Van der Krol a spol., „Antimediátorový gen chalkonsyntázy v trasgenických rostlinách potlačuje květní pigmentaci”, Nátuře, 333, str. 866-69 (1988)). Kódující RNA technologie byla také úspěšně použita pro potlačení produkce enzymu polygalakturonázy u rajčat (Smith a spol., „Potlačení exprese genu polygalakturonázy u transgenických rajčat antimediátorovou RNA”, Nátuře, 334, str. 724-26 (1988); Sheehy a spol., „Redukce aktivity polygalakturonázy u rajčat antimediátorovou RNA, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 880509 (1988)) a malých dílčích částí enzymu ribulóza-bisfosfátkarboxylóza u tabáku (Rodermel a spol., „Vzájemné působení jaderných organel: Jaderný antimediátorový gen potlačuje úrovně enzymu ribulóza-bisfosfát-karboxyláza u transformovaných tabákových rostlin'
Cell,
55, str.
673-81
1988'
Transgenické rostliny charakterizované vyššími než obvyklými množstvími zmíněného enzymu mohou být případně produkovány transformací rostlin genem pro tento enzym v negativním (tj. normálním) směru. Úrovně nikotinu v transgenických tabákových rostlinách předloženého vynálezu mohou být zjištěny obvyklou zkouškou přítomnosti nikotinu. Transformované rostliny, ve kterých je úroveň QPRTázy v porovnání s netransformovanými kontrolními rostlinami snížena, budou mít shodně úroveň nikotinu v porovnání s kontrolní úrovní sníženou; transformované rostliny, ve kterých je úroveň QPRTázy oproti netransformovaným kontrolním rostlinám zvýšena, budou mít shodně úroveň nikotinu při porovnání s kontrolní úrovní zvýšenou.
• Φ 00
0 0 0 0
0 0 0 0
000 000
0 0
0 00 ···· • 00 • 00
Heterologní sekvence použitá v metodách kódování předloženého vynálezu může být volena tak, aby byl vytvořen RNA produkt doplňkový k celé mRNA sekvenci QPRTázy nebo k její části. Sekvence může být doplňková k jakékoliv sousedící sekvenci přirozené mediátorové RNA, tj. může být doplňková k endogenní mRNA sekvenci proximálně na 5'-konci nebo v místě překrytí, ve směru od místa překrytí, mezi místem překrytí a iniciačním kodonem a může tvořit celek nebo pouze část nekódované oblasti, může tvořit můstek nekódované a kódované oblasti, být doplňková k celku nebo části kódované oblasti, doplňková k 3'-nepřeměněné oblasti mRNA. Vhodné kódující sekvence mohou být alespoň od asi 13 do asi 15 nukleotidů, alespoň asi 16 až asi 21 nukleotidů, alespoň asi 20 nukleotidů, alespoň asi 30 nukleotidů, alespoň asi 50 nukleotidů, alespoň asi 75 nukleotidů, alespoň asi 100 nukleotidů, alespoň asi 125 nukleotidů, alespoň asi 150 nukleotidů, alespoň asi 200 nukleotidů, nebo více. Dodatečně, sekvence mohou být prodlouženy nebo zkráceny na 3' nebo 5' jejich koncích.
Jednotlivá kódující sekvence a délka kódující sekvence se bude měnit podle stupně požadovaného útlumu, stabilitě kódující sekvence a podobných. Pracovník zkušený v oboru bude instruován ve výběru vhodných kódujících sekvencí QPRTázy použitím metod dostupných v oboru a informací poskytnutých v tomto textu.
S ohledem na obrázek 2A a SEQ ID č.:l uvedenou v textu, oligonukleotid vynálezu může představovat souvislou dílčí část cDNA sekvence QPRTázy v pozitivní orientaci jakékoliv délky, která je dostatečná k dosažení požadovaných účinků, pokud je tato transformovaná do recipientní rostlinné buňky.
Předložený vynález může být také použit v metodách antikódujícího společného potlačení produkce nikotinu. Antikódující DNA sekvence použité v provedení předloženého vynálezu mají délku dostatečnou, jestliže se projevují v rostlinné buňce, k potlačení přirozené exprese rostlinného proteinu QPRTáza podle uváděného textu v této rostlinné buňce. Uváděné antikódující DNA sekvence mohou být základně zcela genomové nebo doplňkové DNA kódující enzym QPRTáza nebo jeho • ···* · ·· ·· ·· ··· ···· ···· • ··· · · · · · · · « · · ·· ·· ······ • · * · · · · «···*· »·· ·· · · · · dílčí části, uváděné dílčí části mají obvykle délku alespoň 15 nukleotidů. Metody zjištění délky antikódující DNA, která vede v potlačení exprese nativního genu v buňce, jsou pracovníkům zkušeným v oboru dostupné.
Podle dalšího možného celku předloženého vynálezu, Nicotiana rostlinné buňky jsou transformovány DNA konstruktem obsahujícím DNA část kódující enzymatickou RNA molekulu (tj. „ribozym”), které enzymatická RNA molekula je orientována proti (tj. rozštěpení) mRNA-transkriptu DNA kódující rostlinou QPRTázu podle popisu v textu. Ribozymy obsahují substrátové vazebné úseky, které se váží k přístupným úsekům cílové mRNA a oblasti, které katalyzují rozštěpení RNA, zamezující přemístění a produkci proteinu. Vazebné úseky mohou zahrnovat kódující sekvence doplňkové k cílové mRNA sekvenci; katalytický motiv může představovat kladivový motiv nebo jiné motivy, takové jako vlásenkový motiv. Štěpná místa ribozymu uvnitř cílové RNA mohou být původně identifikována prohlížením cílové molekuly na štěpná místa ribozymu (např. GUA, GUU nebo GUC sekvence). Jakmile jsou identifikována tato místa, krátké RNA sekvence 15, 20, 30 nebo ribonukleotidů, odpovídající oblasti cílového genu, zahrnující štěpné místo mohou být ohodnoceny předpokládanými strukturálními vlastnosti. Vhodnost možných cílových míst může být také ohodnocena zkouškou jejich přístupnosti pro hybridizaci volnými oligonukleotidy použitím zkoušky protekce ribonukleázy, která je v oboru známá. DNA sekvence kódující enzymatické RNA molekuly mohou být produkovány známými technikami. Viz např. T. Cech a spol., U.S. Patent 4 987 071; Keene a spol., U.S. Patent 5 559 021; Donson a spol., U.S. Patent 5 589 367; Torrence a spol., U.S. Patent 5 583 032; Joyce, U.S. Patent 5 580 967; Gold a spol., U.S. Patent 5 595 877; Wagner a spol., U.S. Patent 5 591 601; a U.S. Patent 5 622 854 (objevy kterých jsou textu zahrnuty poznámkami celkově). Produkce uvedené enzymatické RNA molekuly v rostlinné buňce a přerušení produkce proteinu QPRTáza snižuje aktivitu QPRTázy v rostlinných buňkách základně stejným způsobem jako produkci kódující RNA molekuly: tj. přerušením kódování mRNA v buňce, která produkuje enzym. Pojem „ribozym”, • · · · » · · <
I · · <
·· · ··<
• I • * ·· použitý v textu, popisuje kyselinu nukleovou obsahující RNA, která působí jako enzym (takový jako endoribonukleáza) a může být použit vzájemně zaměnitelně za „enzymatickou RNA molekulu. Předložený vynález dále zahrnuje DNA kódující ribozymy, DNA kódující ribozymy, která byla vložena do expresívního vektoru, hostitelské buňky obsahující uvedené vektory a metody snížení produkce QPRTázy v rostlinách použitím ribozymů.
Sekvence nukleových kyselin použité pro provedení předloženého vynálezu zahrnují sekvence se sekvenčními podobnostmi k SEQ ID č.:1 a kódující protein mající aktivitu chinolát-fosforibosyltransferázy. Tato definice by měla podchytit přírodní alelické variace proteinů QPRTázy. DNA sekvence, které hybridizují na DNA sekvence SEQ ID č.:l a kód exprese QPRTázy, především rostlinných enzymů QPRTázy, mohou být tudíž použity pro provedení předloženého vynálezu.
Mohou existovat četné formy QPRT enzymu tabáku. Četné formy enzymu mohou existovat díky post-kódující modifikaci jednotlivého genového produktu nebo vzhledem k četným formám NtQPTl genu.
Podmínky, které povolují jiné DNA sekvence kódující expresi proteinu majícího aktivitu QPRTázy k hybridizací na DNA SEQ ID č.:l nebo na jiné DNA sekvence kódující protein uvedený jako SEQ ID č.:2, mohou být stanoveny běžným způsobem. Např. hybridizace takových sekvencí může být provedena při méně přísných podmínkách nebo dokonce velmi přísných podmínkách (např. podmínkách uvedených pro přesné promývání 0,3 M NaCl, 0,03 M citrátu sodného, 0,1 % SDS při 60 °C nebo dokonce 70 °C na DNA kódující protein uvedený v textu jako SEQ ID č. :2 standardní zkouškou hybridizace in šitu). Viz J. Sambrook a spol., Molekulární klonování, Laboratorní manuál (druhé vydání 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Obecně, uvedené sekvence budou alespoň z 65 % podobné, 75 % podobné, 80 % podobné, 85 % podobné, 90 % podobné nebo dokonce 95 % podobné nebo více s posloupností uvedenou zde jako SEQ ID č.:l nebo DNA sekvence kódující proteiny sekvence SEQ ID č.:2. (Určení sekvenční podobnosti byla provedena využitím dvou sekvencí orientovaných ·>· · ·· • ···» · *· ·» · 99 9 9 9
999 999 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
999 999 9 99 99 9 9 9 9 pro maximální srovnání; rozdíly v jedné ze dvou srovnávaných posloupností jsou pro maximální srovnání povoleny. Délky rozdílů 10 nebo nižší jsou výhodné, délky rozdílů 5 nebo nižší jsou výhodnější a délky rozdílů 2 nebo nižší jsou ještě výhodnější). Dostupné jsou různé metody hybridizace, které berou v úvahu izolaci cDNA klonů, kterých mRNA úrovně jsou co nejnižší, asi 0,05 % póly (A+) RNA. Viz M. Conkling a spol., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). Ve stručnosti, cDNA knihovny jsou prohledány použitím jedno-řetězcových cDNA nukleotidových sond reverzní transkripční mRNA z rostlinné tkáně (např. kořenů a/nebo listů). Nitrocelulózová nebo nylonová membrána je pro účely diferenciálního prohledávání namočena v 5xSSC, umístěna v 96 komorovém sacím kolektoru, 150 μύ kultury ustálené přes noc je přenesené ze vzorové očkovací plotny do každé komory a vakuum je aplikované, dokud všechna tekutina neprostoupila přes filtr. 150 pL denaturačního roztoku (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) je umístěno v každé komoře použitím složené pipety a ponecháno asi 3 minuty klesnout. Sání je aplikováno, jak je uvedeno výše, a filtr odstraněn a neutralizován v 0,5 M tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Tento je následně sušen ve vakuu a inkubován s příslušnou nukleotidovou sondou. Použitím filtrů nylonových membrán a ponecháním vzorové očkovací plotny skladované při teplotě -70 °C v 7 % DMSO, mohou být filtry několikrát prosévány četnými nukleotidovými sondami a odpovídající klony izolovány po několikaletém skladování.
Pojem „gen, jak je použit v textu, označuje DNA sekvenci, která inkorporuje (1) protisměrné (5') regulační signály zahrnující promotor, (2) kódující obast specifikující produkt, protein nebo RNA genu, (3) ve směru (3') oblasti zahrnující transkripční zakončení a polyadenylační signály a (4) přičleněné sekvence požadované pro účinnou a specifickou expresi.
DNA sekvence předloženého vynálezu se může základně sestávat ze sekvence poskytnuté v textu vynálezu (SEQ ID č.:l) nebo ekvivalentních nukleotidových sekvencí představujících alely nebo polymorfní varianty těchto genů, nebo jejich kódujících oblastí.
ι
Použití fráze „podstatná sekvenční podobnost v prezentované specifikaci a nárocích označuje, že DNA, RNA nebo amino sekvence, které mají nepatrné a nevyplývající variace ze skutečných sekvenci nárokovaných ve vynálezu jsou považovány za k sekvencím předloženého vynálezu. V tomto ohledu • ·**· »· ·· ί · · <· » ♦ · 1
999 ··* « · ·· 99 kyselinové sekvenční popsaných a ekvivalentní ,nepatrné a a nárokovaným sekvence budou nevyplývající sekvenční variace označují, že „podobné sekvence (tj. sekvence, které mají podstatnou sekvenční podobnost s DNA,
RNA nebo proteiny odhalenými a nárokovanými v textu) budou funkčně rovnocenné k sekvencím popsaným v předkládaném vynálezu. Funkčně rovnocenné působit podstatně stejným způsobem k produkci podstatně stejných prostředků jako kyselina nukleová a amino kyselinové prostředky popsané a nárokované vynálezem.
DNA sekvence popsané tímto vynálezu mohou být transformovány do rozmanitosti hostitelských buněk. Rozmanitost vhodných hostitelských buněk majících požadovaný růst a vlastnosti ošetření je snadno dostupná v oboru.
Použití fráze „izolované nebo „podstatně čisté v předkládané specifikaci a nárocích jako modifikátoru DNA, RNA, polypeptidů nebo proteinů označuje, že DNA, RNA, polypeptidy nebo proteiny takto označené byly separované z jejich in vivo buněčného prostředí úpravou provedenou člověkem.
Pojmy „přirozená DNA sekvence nebo „přírodní DNA sekvence, jak jsou použity v textu, označují DNA sekvenci, která může být izolovaná z netransgenických buněk nebo tkání. Přirozené DNA sekvence jsou takové, které nebyly pozměněny synteticky, takové jako místně cílené mutageneze. Jakmile jsou identifikované přírodní DNA sekvence, DNA molekuly mající přírodní DNA sekvence mohou být syntetizovány chemicky nebo produkovány použitím rekombinantních DNA procedur, známých v oboru. Jak je použito v textu, přírodní rostlinná DNA sekvence je taková, která může být izolovaná z netransgenických rostlinných buněk nebo tkání. Jak je použito, přírodní tabáková DNA sekvence je ta, která může být izolovaná z netransgenických tabákových buněk nebo tkání.
··· · · · · ···· • ··· · · « · · · · • ·· · · ♦ · ······ • · · · · · · ··· ··· ··· ·· ·· ··
DNA konstrukce nebo „transkripční kazety předloženého vynálezu zahrnují, ve směru transkripce 5' k 3', promotor podle diskuse uvedené v textu, DNA sekvenci diskutovanou v textu účinně spojenou s promotorem a volitelně koncovou sekvenci zahrnující koncový signál RNA polymerázy a polyadenylační signál pro polyadenylaci. Všechny z těchto regulačních oblastí by měly být schopné působení v buňkách tkáně určené pro transformaci.
V provedení vynálezu může být použit jakýkoliv vhodný koncový signál, jejich příklady zahrnují, ale nejsou tímto seznamem ve svém rozsahu nikterak limitovány, terminátor nopalinsyntáza (nos), terminátor oktapinsyntáza (ocs), CaMV terminátor nebo přírodní koncové signály odvozené ze stejného genu jako transkripční iniciační oblast nebo odvozené z různých genů. Viz např. Rezian a spol. (1988), uvedeno výše a Rodermel a spol. (1988), uvedeno výše.
Pojem „účinně spojené, jak je použit v textu, označuje DNA sekvence na jednotlivé DNA molekule, které jsou spojené tak, že působení jedné je ovlivněno druhou. Promotor je takto účinně spojen s DNA, pokud je tento schopný ovlivnit transkripci této DNA (tj.DNA je transkripčně kontrolována promotorem). Promotor je uveden jako „protisměrný z DNA, která je obráceně uvedená jako „ve směru z promotoru.
Transkripční kazeta může být zajištěna v DNA konstruktu, který také má alespoň jeden replikační systém. Pro snadnější pochopení, je běžné mít replikační systém funkční v Escherichia coli, takové jako ColEl, pSCIOl, pACYC184 nebo podobné. Tímto způsobem může být výsledný konstrukt v každém stavu po každé manipulaci klonován, sekvenčně seřazen a stanovena správnost úpravy. V dodatku nebo místo E.coli replikačního systému může být použito široké spektrum hostitelských replikačních systémů, takových jako replikační systémy P-l inkompatibilních plazmidů, např. pRK290. V dodatku k replikačnímu systému bude často existovat alespoň jeden přítomný signální znak (indikátor), který může být použitelný v jednom nebo více hostitelských systémech, nebo různé signální znaky individuálních hostitelských systémů. Tj. jeden signální znak může být použit pro selekci v prokaryontní hostiteli, zatímco jiný signální znak může být použit pro selekci v eukaryontním hostiteli, především rostlinném hostiteli. Signální znaky mohou být ochranou proti biocidům, takovým jako antibiotika, toxiny, těžké kovy nebo podobné; mohou zajišťovat doplnění přidáním prototropie do auxotrofního hostitele; nebo mohou poskytnout patrný fenotyp přes produkci nové sloučeniny v rostlině.
Různé malé části obsahující různé konstrukty, transkripční kazety, signální znaky a podobné mohou být následně zavedeny štěpením restrikčním enzymem vhodného replikačního systému a zapojením jednotlivého konstruktu nebo dílčí části do dostupného místa. DNA konstrukt může být izolován pro další úpravy následně po ligaci a klonování. Všechny tyto techniky jsou více než postačitelně doloženy příklady v literatuře, např. J. Sambrook a spol., Klonování molekul, Laboratorní manuál (druhé vydání, 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Vektory, které mohou být použity k transformaci rostlinné tkáně konstrukty nukleových kyselin předloženého vynálezu zahrnují jak Agrobacterium vektory a balistické vektory, stejně jako vektory vhodné pro DNA- zprostředkovanou transformaci.
Pojem „promotor” označuje oblast DNA sekvence, která inkorporuje nezbytné signály kóduj ící pro ucmnou expresi sekvence. Tyto mohou zahrnovat sekvence, ke kterým se váže RNA polymeráza, ale nejsou těmito typy sekvencí limitovány, a mohou zahrnovat oblasti, ke kterým se váží jiné regulační proteiny, spolu s oblastmi zahrnutými v regulační části kódovaní proteinu a mohou zahrnovat kódující sekvence.
Promotory použité v provedení předloženého vynálezu mohou představovat konstitutivní aktivní promotory. Dostupná je celá řada konstitutivních aktivních promotorů, které jsou účinné v rostlinách. Výhodným příkladem je Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promotor, který je konstitutivně vyjádřen ve většině rostlinných tkání. V jiném případě, promotor může představovat promotor specifikovaný pro kořeny nebo promotor specifikovaný pro kořeny a kůru, jak je detailněji vysvětleno dále v textu.
·· · · · · • ··
Kódující sekvence byly vyjádřeny v transgenických tabákových rostlinách použitím Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promotoru. Viz např. Cornelissen a spol., „Jak RNA úroveň, tak i účinnost kódování jsou u transgenického tabáku redukovány antimediátořovou RNA”, Nukleové kyseliny Res. 17, str. 833-43 (1989); Rezaian a spol., „Antimediátorové RNA okurkového mozaikovitého viru u transgenických rostlin určené pro kontrolu viru”, Molekulární biologie rostlin 11, str. 463-71 (1988); Rodermel a spol., „Vzájemné působení nukleárních organel. Nukleární antimediátorový gen potlačuje úrovně enzymu ribulózobifosfát-karboxylóza u transformovaných tabákových rostlin”, Cell 55, str. 673-81 (1988); Smith a spol., „Antimediátorová RNA inhibice exprese genu polygalakturonázy u trasgenických rajčat”, Nátuře 334, str. 724-26 (1988); Van der Krol a spol., „Antimediátorový gen chalkonsyntáza u transgenických rostlin potlačující pigmentaci květin”, Nátuře 333, str. 866-69 (1988).
Použití CaMV 35S promotoru pro expresi QPRTázy v transformovaných tabákových buňkách a rostlinách vynálezu je výhodné. Použití CaMV promotoru pro expresi jiných rekombinantních genů v kořenech tabáku byla přesně popsána (Lam a spol., „Místně specifické mutace přeměňují in vitro faktor vazebnosti a mění formu exprese genu transgenických rostlin”, Proč. Nat. Acad. Sci. (Pojednání národní akademie věd) USA 86, str. 7890-94 (1989); Poulsen a spol., „Rozčlenění 5' protisměrných posloupností pro selektivní expresi genu Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B”, Mol. Gen. Genet. (Molekuární genová genetika) 214, str. 16-23 (1988)).
Další promotory, které jsou aktivní pouze v kořenových tkáních (promotory specifické v kořenech) jsou také pro metody předloženého vynálezu velmi výhodné. Viz, např. U.S. Patent 5 459 252, od Conkling a spol.; Yamamoto a spol., Rostlinná buňka, 3:371 (1991). TobRD2 specifický promotor kořenů-kůry může být také použit. Viz, např. U.S. Patent SN 08/508 786, nyní přístupná, od Conkling a spol., PCT WO 9705261. Všechny patenty • · • ··· · · · · · · · • ·· ·· ·· ······ • · · · ♦ · · ··· ··· ··· ·· ·· ·· citované v textu jsou určeny pro začlenění v textu poznámkami v jejich celistvosti.
QPRTáza rekombinantní DNA molekuly a vektory použité k produkci transformovaných tabákových buněk a rostlin tohoto vynálezu mohou dále obsahovat dominantní volitelný signální gen. Vhodné dominantní volitelné signální znaky pro použití v tabáku zahrnují mimo jiné antibiotické rezistentní geny kódující neomycinfosfotransferázu (NPTII), hygromycinfosfotransferázu (HPT) a chloramfenikolacetyltransferázu (CAT). Jiný dobře známý dominantní volitelný signální znak vhodný pro použití v tabáku představuje genovou mutantu dihydrofolátreduktázy, která kóduje dihydrofolátreduktázu odolnou vůči metotrexáze. DNA vektory obsahující vhodné antibiotické rezistentní geny a odpovídající antibiotika jsou obchodně dostupné.
Transformované tabákové buňky jsou voleny ze sousední četnosti netransformovaných buněk umístěním smíšené četnosti buněk do kultivačního prostředí obsahujícího vhodnou koncentraci antibiotik (nebo jiných sloučenin běžně toxických k tabákovým buňkám), proti kterým je. produkt zvoleného dominantního volitelného signálního genu rezistentní. Takto pouze takové tabákové buňky, které byly transformovány, zůstávají na živu a rozmnožující se.
Metody tvorby rekombinantních rostlin předloženého vynálezu, obecně, zahrnují nejdříve zajištění rostlinné buňky schopné regenerace (rostlinná buňka obvykle spočívá ve tkáni schopné regenerace). Rostlinná buňka je následně transformována DNA konstruktem obsahujícím transkripční kazetu předloženého vynálezu (jak je uvedeno v textu) a rekombinantní rostlina je regenerována z transformované rostlinné buňky. Jak je vysvětleno níže, krok transformace je proveden technikami, které jsou v oboru známé, tyto zahrnují, ale nejsou uvedenými příklady limitovány, ostřelování rostlinné buňky mikročásticemi nesoucími transkripční kazetu, infikování buňky Agrobacterium tumefaciens obsahujícím Tiplazmid nesoucí transkripční kazetu nebo jakoukoliv jinou techniku vhodnou pro produkci trasgenické rostliny.
0 0 · 0 · ·· ·· ·· • 00 · 0 0 · · · 0 · • · ·· ··· 0 0·· • «· 00 00 «00000
0 0 0 0 · ·
000 000 000 «0 ·· ·· 19
Řada Agrobacterium vektorových systémů použitelných pro provedení předloženého vynálezu je známá. Např. U.S. Patent 4 459 355 popisuje metodu transformace přístupných rostlin, včetně dikotů, Agrobacterium druhem obsahujícím Tiplazmid.
Transformace dřevin Agrobacterium vektorem je popsána v U.S. Patentu 4 795 855. Dále, U.S. Patent 4 940 838, od Schilperoort a spol., popisuje binární Agrobacterium vektor (tj. vektor, ve kterém Agrobacterium obsahuje jeden plazmid mající oblast Tiplazmidu, ale žádnou T oblast, a druhý plazmid mající T oblast, ale žádnou vir oblast) použitelný pro provedení předloženého vynálezu.
Mikročástice nesoucí DNA konstrukt předloženého vynálezu, které mikročástice je vhodná pro transformaci ostřelováním rostlinné buňky, jsou také použitelné pro vytváření transformovaných rostlin předloženého vynálezu. Mikročástice je vhnána do rostlinné buňky k produkci transformované rostlinné buňky a z transformované rostlinné buňky je vytvořena rostlina. Při provádění předloženého vynálezu může být použita jakákoliv vhodná metoda transformace ostřelováním buněk a přístroje. Příklady přístrojů a procedur jsou popsány v Sanford a Wolf, U.S. Patent 4 945 050 a v Christou a spol., U.S. Patent 5 015 580. Pokud je použita procedura transformace ostřelováním, transkripční kazeta může být inkorporována do plazmidu schopného replikace nebo vázání (intergace) v buňce určené pro transformaci. Příklady mikročástic vhodných pro použití v uváděných systémech zahrnují 1 až 5 pm zlaté kulovité částice. DNA konstrukt může být nanesen na mikročástici jakoukoliv vhodnou technikou, takovou jako vysrážením.
Rostlinné druhy mohou být transformovány DNA konstruktem předloženého vynálezu DNA-zprostředkovanou transformací protoplastu rostlinné buňky a následnou regenerací rostliny transformovaného protoplastu metodami, které jsou v oboru velmi dobře známé. Fúze tabákového protoplastu s lipozomy obsahujícími DNA nebo způsobem elektroporace je v oboru známá. (Shillito a spol., „Přímý přenos genu do protoplastu dvouděložných nebo • · • · · ···· ···· • ··« ··· ···· • « · · · · · ······ • · · · · · · ··· ··· ··· ·· ·· *· jednoděložných rostlin řadou metod, zahrnujících elektroporací”. Metody v enzymologii 153, str. 313-36 (1987)).
Termín „transformace”, jak je použit v textu, označuje zavedené exogenní DNA do buněk k produkci transgenických buněk trvale transformovaných exogenní DNA.
Transformované buňky jsou indukovány k regeneraci intaktních tabákových rostlin přes aplikaci kultivačních technik tabákové tkáně a buňky, které jsou v oboru dobře známé. Metoda regenerace rostliny je volena tak, aby byla kompatibilní s metodou transformace. Stálá přítomnost a orientace sekvence QPRTázy u transgenických tabákových rostlin může být ověřena mendelovskou dědičností sekvence QPRTázy, jak je uvedeno ve standardních metodách DNA analýzy aplikovaných na potomstvo vznikající z kontrolovaného křížení. Následně po regeneraci transgenických tabákových rostlin z transformovaných buněk, introdukovaná DNA sekvence je snadno transferovaná do jiných variet tabáku pomocí běžné praxe pěstování rostlin a bez nenáležitého experimentování.
Např. pro analýzu izolace transgenu, generované transformované rostliny (Ro) mohou být pěstovány do stádia zralosti, testovány pro úrovně nikotinu a samoopyleny k produkci Rx rostlin. Procentický podíl Ri rostlin nesoucích transgen je homozygotní vzhledem k transgenu. K identifikaci homozygotních Rx rostlin jsou pěstovány transgenické Ri rostliny až do stádia zralosti a samoopyleny. Homozygotní Ri rostliny budou produkovat R2 potomstvo, ve kterém každá rostlina potomstva nese transgen; potomstvo heterozygotních Rx rostlin se bude oddělovat 3:1.
Nikotin slouží jako přírodní pesticid, který napomáhá ochraně tabákových rostlin před napadením škodlivým hmyzem. Proto se může stát žádoucí dodatečná transformace rostlin s nízkým nebo žádným obsahem nikotinu, produkovaných předkládanými metodami, transgeny (takovým jako Bacillvs thuringíensis), které dodatečně budou poskytovat ochranu proti hmyzu.
Výhodnými rostlinami vhodnými pro použití v předloženým metodách jsou druhy Nicotiana nebo tabáku, včetně N. tabacum, N. rustica a N.glutinosa. Použity mohou být jakékoliv druhy nebo čeledě nízký obsah ·· · ··· tabáku. Výhodnými jsou druhy, které již mají nikotinu, takové jako Nicl/Nic2 dvojitý mutant.
Jakákoliv rostlinná tkáň schopná klonového šíření, organogenezí nebo embryogenezí, mohou být transformovány vektorem předloženého vynálezu. Termín „organogeneze, jak je použit v textu, označuje proces, ve kterém jsou nadzemní části rostlin a kořeny vyvinuty postupně z meristematických středů; termín „embryogeneze, jak je použit v textu, označuje způsob, kterým jsou společně vyvinuty nadzemní části rostliny a kořenové části rostliny současně probíhajícím způsobem (ne následně), jestli ze somatických buněk nebo gamet. Jednotlivá zvolená tkáň se bude měnit podle systému šíření klonování dostupného pro a nejlépe se hodícího pro individuální druhy určené ke zpracování. Příkladové cílové tkáně zahrnují listy, pyl, klíčky, děložní lístky, hypokotyl, tkáně kalu, existující meristematická tkáň (např. apikální meristém, laterální pupen a kořenový meristém) a indukované meristematické tkáně (např. meristém děložních lístků a meristém hypokotylu).
Rostliny předloženého vynálezu mohou mít různé podoby. Rostliny mohou představovat chiméry transformovaných buněk a netransformovaných buněk; rostliny mohou představovat klonální transformace (např. všechny buňky transformované k obsahu transkripční kazety); rostliny mohou být očkovány transformovanými a netransformovanými tkáněmi (např. transformovaný kořenový svazek naočkovaný na netransformovaných štěp z citrusových plodů). Transformované rostliny mohou být šířeny různými prostředky, takovými jako klonální šíření nebo klasickými technikami pěstování. Např. první generace (nebo TI) transformovaných rostlin může být samoopylena za vzniku homozygotní druhé generace (nebo T2) transformovaných rostlin dále šířené klasickými technikami pěstování. Dominantní volitelný signální znak (takový jako nptll) může být spojen s transkripční kazetou usnadňující pěstování.
Z pohledu výše uvedeného bude jasné, že rostliny, které mohou být využity při praxi přeloženého vynálezu, zahrnují rostliny rodu Nicotiana.
·· · • · » · » · • · ·
Těm, kteří jsou velmi dobře obeznámeni s metodami rekombinantních DNA, které jsou popsané výše, pochopí, že jeden může použít plnou délku cDNA molekuly QPRTázy nebo plnou délku chromozomálního genu QPRTázy, spojené v antikódujícím směru s vhodně účinně spojenými řídícími sekvencemi pro konstrukci transgenických tabákových buněk a rostlin. (Pracovníci zkušení v oboru budou také chápat, že vhodné řídící sekvence pro expresi genu v aktikódujícím směru zahrnují jakékoliv ze známých eukaryontních kódujících počátečních sekvencí, v dodatku k promotoru a polyadenylačních/transkripčních koncových sekvencí popsaných výše.) Uvedené transformované tabákové rostliny jsou charakterizovány zvýšenou úrovní QPRTázy a tudíž i vyšším obsahem nikotinu, než netransformované kontrolní tabákové rostliny.
Mělo by být tudíž jasné, že použití DNA sekvence QPRTázy pro snížení nebo zvýšení úrovní QPRT enzymu a tím také snížení nebo zvýšení obsahu nikotinu u tabákových rostlin spadá do rozsahu předloženého vynálezu.
Podle vyjádření v textu zahrnuje úroda většinu rostlin předloženého vynálezu a stejného rodu, které jsou pěstovány společně na zemědělském poli. Pojem „zemědělské pole označuje obvyklý malý pozemek nebo skleník. Předložený vynález tímto poskytuje metodu produkce úrody rostlin mající pozměněnou aktivitu QPTRázy a tím mající snížené nebo zvýšené úrovně nikotinu porovnáno s podobnou úrodou netransformovaných rostlin stejného druhu a čeledi.
Příklady, které následují, jsou sestaveny pro ilustraci předloženého vynálezu a nejsou nikterak konstruovány ve smyslu jeho omezení.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje biosyntetickou cestu vedoucí k nikotinu. Aktivita enzymů známá jako kontrolovatelná pomocí Nicl a Nic2 představuje QPRTázu (chinolát-fosforibosyl-transferáza) a PMTázu (hnilobná methyl-transferáza).
9 9 9
9 9
9 9
999 999
9
99 • · ··· • 99
Obrázek 2A uvádí sekvenci nukleové kyseliny NtQPTl cDNA (SEQ ID č.:l) s kódující sekvencí (SEQ ID č.:3) znázorněnou velkými písmeny.
Obrázek 2B uvádí odvozenou amino kyselinovou sekvenci (SEQ ID č.:2) QPRTázy tabáku kódovanou NtQPTl cDNA.
Obrázek 3 srovnává odvozenou NtQPTl amino kyselinovou posloupnost a příslušné sekvence Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepře, Salmonella typhimurium, Escherichía coli, lidské a Saccharomyces cerevisiae.
Obrázek 4 ukazuje výsledky doplnění mutanta Escherichía coli postrádajícího chinolát-fosforibosyl-transferázu (TH265) s NtQPTl cDNA. Buňky byly transformovány expresívním vektorem nesoucím NtQPTl; růst transformovaných TH265 buněk vyjadřujících NtQPTl na minimálním médiu postrádajícím kyselinu nikotinovou ukázal, že NtQPTl kóduje QPRTázu.
Obrázek 5 porovnává úrovně nikotinu a relativně ustálený stav úrovní NtQPTl mRNA v Nicl a Nic2 tabákových mutantech: planý typ Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2); Nicl Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2); Nic2 Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2); a Nicl Nic2 Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2). Celé sloupce označují mRNA transkripční úrovně; šrafované sloupce označují úrovně nikotinu. Obrázek 6 graficky znázorňuje relativní úrovně NtQPTl mRNA za určitou dobu u upravených tabákových rostlin porovnáno s neupravenými kontrolními rostlinami. Celé sloupce ukazují mRNA transkripční úrovně; šrafované sloupce označují úrovně nikotinu.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1: Izolování a sekvenční analýza
TobRD2 cDNA (Conkling a spol., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) byl podroben sekvenční analýze a je v textu označen jako SEQ ID č.:l, a odvozená amino kyselinová sekvence jako SEQ ID č.:2. Odvozená amino kyselinová posloupnost byla odhadnuta jako cytosolický protein. Ačkoliv rostlinné geny QPTázy nebyly uvedeny, porovnání NtPTl amino kyselinové posloupnosti s GenBank ·· • · · · • · · · ··· ··· * · • e ·· • ·
• • 99 · ·
• 9 • 9 ·
• • ··
• • 9
• 9
• ·
databází (obrázek 3) odhalilo omezené sekvenční podobnosti s jistými bakteriálními a jinými proteiny; aktivita chinolátfosforibosyl-transferázy (QPRTáza) byla ukázána pro
S.typhimurium, E.coli a N.tabacum geny. NtQPTl kódující QPTázu má podobnost k odvozené dílčí části peptidů kódované Arabidopsis EST (označení exprese sekvence) sekvencí (Genbank Accession number F20096) , která může představovat část genu Arabidopsis QPTáza.
Příklad 2: In-situ hydridizace
Pro určení prostorového rozložení TobRD2 mRNA transkriptu v různých tkáních kořenů, byla u netransformovaných rostlin uskutečněna in šitu hybridizace. In sítu hydridizace kódující části řetězce TobRD2 na TobRD2 mRNA v kořenové tkáni byla provedena použitím technik, které byly popsány v Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5,242 (1987) a Smith a spol., Plant Mol. Biol. Rep. 5,237 (1987). Sedm dní staré tabákové (Nicotiana tabacum) kořenové sazenice byly ustáleny v glutaraldehydu tlumeném fosfátem, uložené v Paraplast Plus (Monoject lne., St. Louis, MO) a rozděleny na tloušťku 8 mm k získání příčných stejně jako podélných bloků. Kódující TobRD2 transkripty, syntetizované in vitro s přítomností 35S-ATP, byly použity jako nukleotidové sondy. Označená RNA byla hydrolýzována alkalickou úpravou k získání 100 až 200 základní průměrné délky média před použitím.
Hybridizace byly prováděny v 50 % formamidu po dobu 16 hodin při teplotě 42 °C s průměrným 5 x 106 počtem odčítacích impulzů za minutu (cpm) označené RNA na mililitr hybridizačního roztoku. Destičky se vyvinuly následně po aplikaci požadovaným vlivů a tyto byly zviditelněny pod světlými a tmavých poli mikroskopu. Hybridizační signál byl lokalizován v rohovité vrstvě buněk kořenů (výsledky nebyly znázorněny). Porovnání jak světlých, tak i tmavých obrazů polí stejných částí lokalizovalo TobRD2 transkripty parenchymatických buněk vnější kůry kořenů. V epidermu nebo stele nebyl viditelný žádný hybridizační signál.
• · · ·· · to • to • ···· • · to • · ··
Příklad 3: TobRD2 MRNA Úrovně u Nicl a Nic2 tabákových mutantech a vzájemný vztah k úrovním nikotinu
Ustálený stav mRNA úrovně na TobRD2 byl zkoušen v Nicl a Nic2 mutantních tabákových rostlinách. Nicl a Nic2 jsou pro regulaci aktivity chinolát-fosforibosyl-transferázy a aktivity hnilobné methyl-transferázy známé a jsou ko-dominantními regulátory produkce nikotinu. Prezentované výsledky jsou ilustrované na obrázku 5A a 5B, ukazujícím, že TobRD2 exprese je regulována Nicl a Nic2.
RNA byla izolovaná z kořenů planého typu Burley 21 tabákových rostlin (Nicl/Nicl Nic2/Nic2); kořenů Nicl - Burley 21 (nicl/nicl Nic2/Nic2); kořenů Nic2 - Burley 21 (Nicl/Nicl nic2/nic2); a kořenů Nicl-Nic2-Burley 21 (nicl/nicl nic2/nic2). Čtyři Burley 21 tabákové řady (nic) byly pěstovány po dobu jednoho měsíce v půdě ze semene a přemístěny do hydroponických komor v provzdušněném živném roztoku ve skleníku na dobu jeden měsíc. Tyto řady byly izogenní, kromě dvou loci s nízkým obsahem nikotinu a měly genotypy Nicl/Nicl Nic2/Nic2, Nicl/Nicl nic2/nic2, nicl/nicl Nic2/Nic2, nicl/nicl nic2/nic2. Kořeny byly sklizeny z asi 20 rostlin pro každý genotyp a upraveny pro izolaci RNA. Celková RNA (ljLxg) z každého genotypu byla podrobena elektroforézi přes 1 % gel agarózy obsahující 1,1 M formaldehydu a transferována do nylonové membrány podle Sambrook a spol. (1989). Membrány byly hybridizovány s 32P-označenými TobRD2 cDNA malými částmi. Relativní intenzity TobRD2 transkriptů byly měřeny využitím denzitometrie. Obrázek 5 (celé sloupce) ilustruje relativní transkripční úrovně (porovnáno k Nicl/Nicl Nic2/Nic2'í pro každý ze čtyř genotypů. Relativní obsah nikotinu (porovnáno k Nicl/Nicl Nic2/Nic2) čtyř genotypů je znázorněn šrafovanými sloupci.
Obrázek 5 graficky porovnává relativně ustálený stav TobRD2 mRNA úrovně, využitím úrovně zjištěné u planého typu Burley 21 (Nicl/Nicl Nic2/Nic2) jako referenčního (kontrolního) množství. TobRD2 úrovně mRNA v Nicl/Nic2 dvojitých mutantech byly ·· · ·· · ·* · ·· · · * ··· » · · • · · · · · * * · · · · · »·· ··* ··· ·· ** ** přibližně 25 % úrovní planého typu tabáku. Obrázek 5B dále porovnává relativní úrovně nikotinu v blízké izogenní řadě tabáku studované v tomto příkladu (celé sloupce označuji TobRD2 transkripční úrovně; šrafované sloupce označuji úroveň nikotinu). Existují těsné vzájemné vztahy mezi úrovněmi nikotinu a TobRD2 transkripčními úrovněmi.
Příklad 4: Vliv nanášení na TobRD2 mRA úrovně
V oboru je známé, že odstranění horní části květu tabákové rostliny (vrchní úprava) zvyšuje růst kořenů a zvyšuje obsah nikotinu v listech rostliny. Vrchní úprava rostlin je obvyklou praxí pěstování tabáku pro obchodní účely a optimální čas pro vrchní úpravu dané tabákové úrody při známých podmínkách pěstování může být snadno určen odborným pracovníkem.
Tabákové rostliny (N. tabacum SRÍ} byly pěstovány v půdě ze semene po dobu 1 měsíce a přeneseny do nádob obsahujících písek. Rostliny byly pěstovány ve skleníku další dva měsíce, dokud nezačaly nasazovat květy. Horní části květů a dva uzly byly ze čtyř řad rostlin odstraněny(vrchní úprava). Kořenová část byla z každé rostliny po udaném čase sklizena a nahromaděna pro extrakci RNA. Kontrolní rostliny nebyly podrobeny vrchní úpravě. Celková RNA (lgg) každého časového bodu byla podrobena elektroforéze přes 1 % gelu agarózy obsahujícího 1,1 M formaldehydu a transformována na nylonovou membránu podle Sambrook a spol., (1989). Membrány byly hybridizovány 32Poznačenými TobRD2 cDNA malými částmi. Relativní intenzity TobRD2 transkriptů byly měřeny využitím denzitometrie. Obrázek 6 ilustruje relativní transkripční úrovně (porovnáno s nulovou hodnotou času) pro každý časový úsek s vrchní úpravou (celé sloupce) nebo bez vrchní úpravy (šrafované sloupce).
Relativní úrovně TobRD2 byly stanoveny v kořenové tkáni po 24 hodinách; výsledky jsou znázorněny na obrázku 6 (celé sloupce udávají TobRD2 transkripční úrovně v rostlin s vrchní úpravou; šrafované sloupce udávají TobRD2 transkripční úrovně u kontrolních rostlin bez povrchové úpravy). Během šesti hodin po
99
9 9 9 9
9 9 9 9
999 999
9 9
99 • *· • ···· · ·
9 99
9 9
9 provedení vrchní úpravy tabákových rostlin se mRNA úrovně pro TobRD2 zvýšily přibližně osm-krát u rostlin s vrchní úpravou; po stejnou dobu nebylo zjištěno žádné zvýšení u kontrolních rostlin).
Příklad 5:
Doplnění bakteriálního mutanta postrádajícího QPRTázu DNA sekvencí SEQ ID č.:l obsahuj ícím expresívním
Escherichia coli druh TH265 představuje mutant postrádající chinolát-fosforibosyl-transferázu (nadC-} a tudíž nemůže růst v prostředí postrádajícím kyseliny nikotinové.
TH265 buňky byly transformovány expresívním vektorem (pWS161) DNA sekvenci SEQ ID č.:l nebo transformovány vektorem (pKK233), pouze. Růst transformovaných bakterií byl porovnáván s růstem TH265 (pKK233) transformovaného typu a s růstem netransformovaného TH265 nadC- mutanta. Růst byl porovnán na minimálním médiu molekulární elektronikou (postrádajícím kyseliny nikotinovou) a na minimálním médiu s dodanou kyselinou nikotinovou také molekulární elektronikou.
E.coli druh s QPTáza mutací (nadC), TH265, byl poskytnut způsobem podle Dr.K.T.Hughes (Hughes a spol., J. Bact. 175:479 (1993). Buňky byly udržovány na LB médiu způsobilé buňky připraveny podle popisu od Sambrook a spol. (1989). Expresívní
1984) s TobRD2 cDNA Výsledný plazmid, plazmid byl vytvořen v pKK2233 (Brosius, klonovanou pod kontrolou Tac promotoru pWS161, byl transformován do TH265 buněk. Transformované buňky byly následně očkovány na minimální médium (Vogel a Bonner, 1956) agarové plotny bez nebo s využitím kyseliny nikotinové (0,0002 %) jako suplementu. TH265 buňky samotné a TH265 transformované s pKK2233 byly očkovány na podobných deskách za účelem použití jako kontrolního vzorku.
Výsledky jsou znázorněny na obrázku 4. Pouze TH265 transformované DNA sekvencí SEQ ID č.:l rostla v prostředí postrádajícím kyselinu nikotinovou. Tyto výsledky ukazují, že exprese DNA sekvence SEQ ID č.: Iv TH265 bakteriálních buňkách dodává NadC+ fenotyp k těmto buňkám, potvrzující, že tato • 9 ··· 99 9 · 9 9 9 9 • 9·· 9 9 · · 9 9 9 • · · 9999 999 999 • 9 · 9 · 9 9 ··· ··· 9·· 99 99 99 sekvence kóduje QPRTázu. TobRD2 název byl tudíž pozměněn na NtQPTl.
Příklad 6: Transformace tabákových rostlin
DNA sekvence SEQ ID č.:l, v kódujícím směru, je účinně připojena k rostlinnému promotoru (CaMV 35S nebo TobRD2 specifického promotoru kořene-kůra) k produkci dvou různých DNA kazet: CaMV35S promotor/kódující SEQ ID č.:l a TobRD2 promotor/kódující SEQ ID č.:1.
Planý typ tabáku a tabák s nízkým obsahem nikotinu jsou vybrány pro transformaci, např. planý typ Burley 21 tabák (Nicl+/Nic2+) a homozygotní nicl-/nic2- Burley 21. Většina tabákových rostlinných buněk každé řady jsou transformovány použitím každé DNA kazety. Transformace je provedena použitím Agrobacterium vektoru, např. Agrobacterinm-binárního vektoru nesoucího Tiokrajové sekvence a nptll gen (dodávající odolnost proti kanamycinu a kontrolované nos promotorem (nptll)).
Transformované buňky jsou vybrané a regenerované na transgenické tabákové rostliny (Ro) . Ro rostliny jsou pěstovány do zralého stádia a testovány pro úrovně nikotinu; podskupina transformovaných tabákových rostlin ukázala výrazně nižší úrovně nikotinu v porovnání k netransformovaným kontrolním rostlinám.
Ro rostliny jsou následně samoopyleny a v Ri potomstvu je analyzováno vyštěpení transgenu. Ri potomstva jsou pěstována do zralého stádia a samoopylena; vyštěpení transgenu mezi R2 potomstvem označuje, které Ri rostliny jsou homozygotní pro transgen.
·· * · · · • · • ··»· · *· ·* · ·· · • « · · · · • · · · · • · · · ······ ··· ··
SEKVENCE (1) Obecné informace:
(i) Žadatel: Conkling, Mark A
Mendu, Nandini Song, Wen (ii) Název vynálezu:
(iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Korespondenční adresa:
(A) Adresa: Kenneth Sibley, Bell Seltzer Park &
(B) Ulice: Post Office Drawer 34009 (C) Město: Charlotte (D) Stát: North Carolina (E) Země: USA (E) Kód: 28234 (v) Údaje o počítačovém systému (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOC/S-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0. Verze #1.30 (vi) Běžné údaje o aplikaci:
(A) Číslo aplikace:
(B) Datum podání:
(C) Klasifikace:
(viii) Informace o zástupci/zmocněnci:
(A) Jméno: Sibley, Kenneth D.
(B) Číslo registrace: 31,665 (C) Referenční/jednací číslo: 5051-338P • · ·· ··
Gibson • · · • ···· • · · • · · • 0
• · · ·· • · 9 9 ·· (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: 919-420-2200 (B) Telefax: 919-881-3175 (2) Informace o SEQ ID č.:l (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1399 párů bází (B) Typ: kyselina nukleová (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:
(A) Jména/Klíč. CDS (B) Umístění: 52..1104 * ·«·· ·· · • ··* • · · ·· · · • · « • · · • » <* ··· ·· ♦ ·» ·· • · · · • · · · ··· ·«· • · • 9 »· (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.:l
CAAAAACTAT TTTCCACAAA AKCATKCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TK 57 Met Phe
AGA GCT ATT CCT KC ACT GCT ACA GTG CAT CCT TAT GCA AK ACA GCT 105
Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile Thr Ala
5 10 15
CCA AGG KG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA 153
Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn Thr Arg
20 25 30
GTG GAG TCA KA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT KA 201
Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr Asp Leu
35 40 45 50
AAG GAA GK ATG AAA CK GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT KA GGA 249
Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu -Asp Ala Gly Asn Leu Gly
55 60 65
GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT 297
Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser Asp Ala
70 75 80
CAT TTT CTA GCA AAG GAA GAC GGG ATC ATA GCA GGA AK GCA CK GCT 345
His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala Leu Ala
85 90 95
GAG ATG ATA TTC GCG GAA GTT GAT CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT 393
Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu Trp Tyr
100 105 110
GTA AAT GAT GGC GAT AAA GK CAT AAA GGC KG AAA TK GGC AAA GTA 441
Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val
115 120 125 130
CAA GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT ATA GCT GAG AGG GK GK CTC AAT 489
Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val Leu Asn
135 140 145
TK ATG CAA AGA ATG AGT. GGA ATA GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA 537
Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala
150 155 160
GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC KG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT 585
Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro
165 170 175
• »
GGA Gly HA CGT HG GTG GAT AAA TGG GCG GTA HG ATC GGT GGG GGG AAG Val Asp Lys Trp Ala Val Leu lle Gly Gly Gly Lys 633
Leu Arg 180 Leu
185 190
AAT CAC AGA ATG GGC HA TH GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681
Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met lle Lys Asp Asn His
195 200 205 210
ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729
lle Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gin
215 220 225
TAT HG GAG CAA AAT AAA CH CAA ATA GGG GH GAG GH GAA ACC AGG 777
Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin lle Gly Val Glu Val Glu Thr Arg
230 235 240
ACA AH GAA GAA GTA CGT GAG GTÍ CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG 825
Thr lle Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin Thr Lys
245 250 255
ACT TCG HG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GH GH CCA HA TCT 873
Thr Ser Leu Thr Arg lle Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser
260 265 270
AAC GGA GAT AH GAT GTA TCC ATG CH AAG GAG GCT GTA GAA HG ATC 921
Asn Gly Asp lle Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu lle
275 280 285 290
AAT GGG AGG TH GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GH ACC CH GAA ACA 969
Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr
295 300 305
GTA CAC AAG AH GGA CAA ACT GGT GH ACC TAC AH TCT AGT GGT GCC 1017
Val His Lys lle Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr lle Ser Ser Gly Ala
310 315 320
CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CH GAC AH TCC CTG AAG ATC GAT ACA 1065
Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp lle Ser Leu Lys lle Asp Thr
325 330 335
GAG CTC GCC CH GAA GH GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114
Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala
340 345 350
TACHCTGCT ATAGGGHGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT 1174
CATTHACTA GHGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA 1234 HGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTTTCC AACCHAHG CHGAGHGG TAAHTCAH 1294 ATAGCTHGT TTTCATGTTT CATGGAAHT GHACAATGA AAATACHGA THATAAGH 1354 TGGTGTATGT AAAAHCTGT GHACHCAA ATAHHGAG ATGH 1399
(2) Informace o SEQ ID č.:2
(i) Charakteristiky sekvence
(A) Délka: 351 amino kyselin
(B) Typ: amino kyselina
(C) Topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: protein
(xi) Popis sekvence : SEQ ID č.:2
Met Phe Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile
1 5 10 15
Thr .Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn
20 25 30
Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr
35 40 45
Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn
50 55 60
Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Bno- Leu Asp Met Glu Ser
65 70 75 80
Asp Ala His Phe Leu Ala 85 Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala 90 Gly Ile 95 Ala
Leu Ala Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu
100 105 110
Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly
115 120 125
Lys Val Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val
130 135 140
Leu Asn Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu
145 150 155 160
Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr
165 170 175
Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp
195 200 205
Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val
210 215 220
Asp Gin Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin Ile Gly Val Glu Val Glu 225 230 235 240 • · • · · · * · · ··· · · 4
Thr Arg Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin
245 250 255
Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro
260 265 270
Leu Ser Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu
275 280 285
Leu Ile Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu
290 295 300
Glu Thr Val His Lys Ile Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile
325 330 335
Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala
340 345 350
(2) Informace o SEQ ID č.:3 (i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 1053 párů bází (B) Typ: kyselina nukleová (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.:3
ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60
TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120
AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180
GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA KCCTCUGA TATGGAATCC 240
GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300
ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360
GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT 420
GAGAGGGTTG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480
ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA 540
CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600 • · · · · · · ··«<·· • · · · · · · ······ ·»· · · ·· · ·
TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660
CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720
ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780
TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840
TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900
AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960
GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC 1020
GCCCTTGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 1053 • · · ·
Ρι/w- wfr

Claims (44)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná DNA molekula obsahující sekvenci volenou ze skupiny zahrnující:
    (a) SEQ ID č.:1 (b) DNA sekvence, které kódují enzym mající SEQ ID č.:2 (c) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA sekvenci (a) nebo (b) uvedenou výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyl-transferázu; a (d) DNA sekvence, které se liší od DNA (a), (b) nebo (c), uvedených výše, díky degeneraci genetického kódu.
  2. 2. DNA konstrukt obsahující expresívní kazetu vyznačující se tím, že konstrukt obsahuje ve směru 5' k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a DNA část podle nároku 1 umístěnou ve směru od uvedeného promotoru a účinně s tímto spojenou.
  3. 3. DNA konstrukt obsahující expresívní kazetu vyznačující se tím, že konstrukt obsahuje ve směru 5'k 3' rostlinný promotor a DNA část podle nároku 1 umístěnou ve směru uvedeného promotoru a účinně s tímto spojenou, uvedená DNA část je v kódujícím směru.
  4. 4. DNA konstrukt vyznačující se tím, že obsahuje ve směru 5'k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a DNA kódující chinolátfosforibosyl-transferázu, uvedená DNA je účinně spojená s uvedeným promotorem.
  5. 5. DNA konstrukt vyznačující se tím, že obsahuje ve směru 5'k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a DNA kódující rostlinnou chinolát-fosforibosyl-transferázu, uvedená DNA je v kódujícím směru a účinně spojená s uvedeným promotorem.
    4 4 4 • 4 4 4 ··
  6. 6. DNA konstrukt podle nároku 2, 3, 4 nebo 5 vyznačující se tím, že jeho promotor je konstitutivně aktivní v rostlinných buňkách.
  7. 7. DNA konstrukt podle nároku 2, 3, 4, nebo 5 vyznačující se tím, že jeho uvedený promotor je selektivně aktivní v buňkách rostlinné kořenové tkáně.
  8. 8. DNA konstrukt podle nároku 2, 3, 4 nebo 5 vyznačující se tím, že jeho uvedený promotor je selektivně aktivní v buňkách rostlinné tkáně kůry kořenů.
  9. 9. DNA konstrukt podle nároků 2, 3, 4, nebo 5 vyznačující se tím, že uvedený konstrukt dále obsahuje plazmid.
  10. 10. DNA konstrukt podle nároku 2, 3, 4 nebo 5 vyznačující se tím, že tento je přenášen rostlinným transformačním vektorem.
  11. 11. DNA konstrukt podle nároku 2, 3, 4 nebo 5 vyznačující se tím, že tento je přenášen rostlinným transformačním vektorem, přočemž rostlinný transformační vektor představuje Agrobacterium tumefaciens vektor.
  12. 12. Rostlinná buňka obsahující DNA konstrukt podle nároku 2, 3,
    4 nebo 5.
  13. 13. Transgenická rostlina obsahující rostlinné buňky podle nároku 12.
  14. 14. Peptid mající sekvenci SEQ ID č.:2.
  15. 15. Peptid kódovaný DNA sekvencí volenou ze skupiny zahrnující:
    (a) SEQ ID č.:1 *«··· · ·» 99 99
    999 999 9 9 9 9 9
    9999 999 9999
    9 99 99 99 999999 • · 9 9 9 9 9
    999999 999 99 99 99 (b) DNA sekvence, které hybridizují na izolovanou DNA bodu (a) výše a které kódují enzym chinolát-fosforibosyltransferázu; a (c) DNA sekvence, které se liší od DNA bodu (a) nebo (b) výše díky degeneraci genetického kódu.
  16. 16. Způsob přípravy transgenické rostlinné buňky mající sníženou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTázy) vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje:
    • přípravu rostlinné buňky typu známého pro expresi chinolátfosforibosyl-transferázy;
    • přípravu exogenního DNA konstruktu, konstrukt obsahuje ve směru 5' k 3' promotor účinný v rostlinné buňce a DNA obsahující část sekvence kódující mRNA chinolátfosforibosyl-transferázy, uvedená DNA je účinně spojená s uvedeným promotorem; a • transformaci uvedené rostlinné buňky uvedeným DNA konstruktem k produkci transformovaných buněk, uvedená rostlinná buňka má sníženou expresi QPRTázy při srovnání k netransformované buňce.
  17. 17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená DNA obsahující část sekvence kódující mRNA chinolát-fosforibosyltransferázy je v kódujícím směru.
  18. 18. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená DNA obsahující část sekvence kódující mRNA chinolát-fosforibosyltransferázy je v antikódujícím směru.
  19. 19. Způsob pode nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená rostlinná buňka představuje Nicotiana tabacum.
  20. 20. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že dále zahrnuje regeneraci rostliny z uvedené transformované rostlinné buňky.
    • · • 9 · · 9 • 99
    9· 99
  21. 21. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený promotor je konstitutivně aktivní.
    podle nároku je selektivně
  22. 22. Způsob promotor tkáně.
  23. 23. Způsob promotor kořenové
    16 vyznačující se tím, že uvedený aktivní v buňkách rostlinné kořenové podle nároku 16 vyznačující se je selektivně aktivní k buňkám kůry.
    tím, že uvedený rostlinné tkáně
  24. 24. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený krok transformace je proveden ostřelováním uvedené rostlinné buňky mikročásticemi nesoucími uvedený DNA konstrukt.
  25. 25. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený krok transformace je proveden infikováním uvedené rostlinné buňky s Agrobacterium tumefaciens obsahujícím Tiplazmid nesoucí uvedený DNA konstrukt.
  26. 26. Způsob produkce osiva transgenického tabáku vyznačující se tím, že zahrnuje sběr osiva z transgenické tabákové rostliny produkované způsobem podle nároku 19.
  27. 27. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená exogenní DNA sekvence je doplňující k uvedené mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRT mRNA) expresivní v uvedené rostlinné buňce v oblasti volené z:
    (a) 5'-nepřeměněná sekvence uvedené QPRT mRNA;
    (b) 3'-nepřeměněná sekvence uvedené QPRT mRNA; a (c) přeměněná oblast uvedené QPRT mRNA.
  28. 28. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená exogenní DNA sekvence je doplňková alespoň na 15 nukleotidů
    99 9 9 • 99 uvedené mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy expresívní v uvedené rostlinné buňce.
  29. 29. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená exogenní DNA sekvence je doplňková alespoň na 200 nukleotidů uvedené mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy expresívní v uvedené rostlinné buňce.
  30. 30. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená exogenní DNA sekvence obsahuje chinolát-fosforibosyltransferázu, kódující sekvenci volenou z DNA sekvencí nároku 1.
  31. 31. Transgenická rostlina druhů Nicotiana vyznačující se tím, že tato má sníženou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) proti netransformované kontrolní rostlině, uvedená transgenická rostlina obsahuje transgenické rostlinné buňky obsahující:
    • exogenní DNA konstrukt obsahující ve směru 5'k 3' promotor účinný v uvedené rostlinné buňce a DNA obsahující část DNA sekvence, která kóduje rostlinnou mRNA chinolátfosforibosyl-transferázy, uvedená DNA je účinně spojená s uvedeným promotorem;
    uvedená rostlina projevuje sníženou expresi QPRTázy porovnáno s netransformovanou kontrolní rostlinou.
  32. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že uvedená část DNA obsahující část DNA sekvence kódující mRNA chinolátfosforibosyl-transferázy je v kódujícím směru.
  33. 33. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že uvedená část DNA obsahující část DNA sekvence kódující mRNA chinolátfosforibosyl-transferázy je v antikódujícím směru.
  34. 34. Transgenická rostlina druhů Nicotiana vyznačující se tím, že tato má sníženou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTáza) proti netransformované kontrolní rostlině, kdy * · • · · 4 4 4 · » ♦ · 4 •••4 4 · · 4 4 4 4
    4 44 44 4 · »44444 • 4 4 * 4 4 4
    444 444 44 4 44 44 44 uvedená transgenická rostlina představuje potomstvo rostlin podle nároku 31.
  35. 35. Osivo transgenické rostliny druhů Nicotiana vyznačující se tím, že tato má sníženou expresi chinolát-fosforibosyltransferázy (QPRTáza) proti netransformované kontrolní rostlině, kdy uvedená transgenická rostlina je rostlinou podle nároku 31 nebo jejím potomstvem.
  36. 36. Úroda vyznačující s tím, že obsahuje většinu rostlin podle nároku 31 rostoucích společně na zemědělském pozemku.
  37. 37. Způsob snížení exprese genu chinolát-fosforibosyltransferázy v rostlinné buňce vyznačující se tím, že způsob zahrnuje:
    • pěstování rostlinné buňky transformované k obsahu exogenní
    DNA, kdy přenesený řetězec uvedené exogenní DNA je doplňkovým k mRNA chinolát-fosforibosyl-transferázy endogenní v uvedené buňce, čímž transkripce uvedeného doplňkového řetězce snižuje expresi uvedeného genu chinolát-fosforibosylu.
  38. 38. Způsob produkce tabákové rostliny se sníženými úrovněmi nikotinu v listech uvedené tabákové rostliny vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje:
    • pěstování tabákové rostliny nebo rostlin jejich potomstva, přičemž uvedená rostlina obsahuje buňky obsahující DNA konstrukt zahrnující transkripční iniciační oblast účinnou v uvedené rostlině a exogenní DNA sekvenci účinně spojenou s uvedenou transkripční iniciační oblastí, kdy přenesený řetězec uvedené DNA sekvence je doplňujícím k endogenní mediátorové RNA chinolát-fosforibosyl-transferázy v uvedených buňkách.
    • · • · » · · ·
    9 99
    9 9
    1 · 9
    4 9 9 •99 999 • 9
    9 · ··
  39. 39. Způsob přípravy transgenické rostlinné buňky mající zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTázy) vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje:
    • zajištění rostlinné buňky typu známého pro expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy;
    • zajištění exogenního DNA konstruktu, který obsahuje ve směru od 5' k 3'promotor účinný v rostlinné buňce a DNA sekvenci kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu, uvedená DNA sekvence je účinně spojená s uvedeným promotorem; a • transformaci uvedené rostlinné buňky uvedeným DNA konstruktem k produkci transformovaných buněk, uvedená rostlinná buňka mající zvýšenou expresi QPRTázy porovnáno k netransformované buňce.
  40. 40. Transgenická rostlina druhů Nicotiana vyznačující se tím, že má zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyl-transfrázy (QPRTázy) proti netransformované kontrolní rostlině, uvedená transgenická rostlina obsahuje transgenické rostlinné buňky obsahující:
    • exogenní DNA konstrukt obsahující ve směru 5'k 3' promotor účinný v uvedené rostlinné buňce a DNA sekvenci kódující rostlinnou chinolát-fosforibosyl-transferázu, uvedená DNA je účinně spojená s uvedeným promotorem;
    uvedená rostlina projevuje zvýšenou expresi QPRTázy porovnáno s netransformovanou kontrolní rostlinou.
  41. 41. Transgenická rostlina druhů Nicotiana vyznačující se tím, že má zvýšenou expresi chinolát-fosforibosyl-transferázy (QPRTázy) oproti netransformované kontrolní rostlině, kdy uvedená transgenická rostlina je potomstvem rostliny podle nároku 74.
  42. 42. Způsob zvýšení exprese genu chinolát-fosforibosyltransferázy v rostlinné buňce vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje:
    • 9 • pěstování rostlinné buňky transformované k obsahu exogenní DNA, kdy uvedená exogenní DNA kóduje chinolátfosforibosyl-transferázu.
  43. 43. Způsob podle nároku 83 vyznačující se tím, že uvedená transformovaná rostlinná buňka je získána způsobem zahrnujícím: • začlenění konstruktu obsahujícího ve směru transkripce promotor funkční v uvedené rostlinné buňce a DNA sekvenci kódující chinolát-fosforibosyl-transferázu funkční v uvedené buňce do genomu hostitelské rostlinné buňky, uvedená DNA sekvence je účinně spojená s uvedeným promotorem a transkripční koncovou oblastí funkční v uvedené buňce, čímž je získána transformovaná rostlinná buňka.
  44. 44. Způsob produkce tabákové rostliny se zvýšenou úrovní nikotinu v listech uvedené tabákové rostliny vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje:
    • pěstování tabákové rostliny nebo jejího rostlinného potomstva, kdy uvedená rostlina obsahuje buňky obsahující DNA konstrukt zahrnující transkripční iniciační oblast funkční v uvedené rostlině a exogenní DNA sekvenci účinně spojenou s uvedenou transkripční iniciační oblastí, kdy uvedená DNA sekvence kóduje chinolát-fosforibosyltransferázu funkční v uvedených buňkách.
CZ0367799A 1997-06-12 1998-06-10 Izolovaná DNA molekula, DNA konstrukt, rostlinná bunka a transgenická rostlina, peptid, zpusob prípravy transgenické rostlinné bunky, osivo transgenické rostliny, zpusob produkce tabákové rostliny a zpusob snízení a zvýsení exprese genu CZ297379B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4947197P 1997-06-12 1997-06-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ367799A3 true CZ367799A3 (cs) 2000-04-12
CZ297379B6 CZ297379B6 (cs) 2006-11-15

Family

ID=21960004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0367799A CZ297379B6 (cs) 1997-06-12 1998-06-10 Izolovaná DNA molekula, DNA konstrukt, rostlinná bunka a transgenická rostlina, peptid, zpusob prípravy transgenické rostlinné bunky, osivo transgenické rostliny, zpusob produkce tabákové rostliny a zpusob snízení a zvýsení exprese genu

Country Status (37)

Country Link
US (9) US6586661B1 (cs)
EP (3) EP1457562B1 (cs)
JP (4) JP4095678B2 (cs)
KR (1) KR100365969B1 (cs)
CN (2) CN100482799C (cs)
AP (1) AP1169A (cs)
AT (1) ATE262039T1 (cs)
AU (1) AU748514B2 (cs)
BG (1) BG64319B1 (cs)
BR (1) BRPI9810870B1 (cs)
CA (2) CA2484366A1 (cs)
CU (1) CU23174A3 (cs)
CZ (1) CZ297379B6 (cs)
DE (2) DE991766T1 (cs)
DK (1) DK0991766T3 (cs)
EA (2) EA009898B1 (cs)
EE (1) EE04595B1 (cs)
ES (1) ES2154624T3 (cs)
GE (1) GEP20032871B (cs)
GR (1) GR20010300003T1 (cs)
HU (1) HU225888B1 (cs)
ID (1) ID29311A (cs)
IL (3) IL132184A0 (cs)
LT (1) LT4706B (cs)
LV (1) LV12507B (cs)
NO (1) NO324872B1 (cs)
NZ (1) NZ500963A (cs)
OA (1) OA11219A (cs)
PL (1) PL201266B1 (cs)
PT (1) PT991766E (cs)
RO (1) RO121968B1 (cs)
RS (1) RS49677B (cs)
SI (1) SI20215B (cs)
SK (1) SK161899A3 (cs)
TR (1) TR199902728T2 (cs)
UA (1) UA72187C2 (cs)
WO (1) WO1998056923A1 (cs)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US20100251425A9 (en) * 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
US6911541B2 (en) * 2000-08-30 2005-06-28 North Carolina State University Promoter fragment that is recognized by the product of the tobacco Nic gene
WO2002038588A2 (en) * 2000-11-07 2002-05-16 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
DE10055870A1 (de) 2000-11-10 2002-05-29 Degussa Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
WO2002037990A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 Vector Tobacco Ltd. Method and product for removing carcinogens from tobacco smoke
MXPA03011101A (es) * 2001-06-06 2005-02-17 22Nd Century Ltd Llc Utilizacion de biomasa de tabaco.
WO2005103296A2 (en) * 2004-03-30 2005-11-03 Vector Tobacco, Ltd. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
EA200400013A1 (ru) * 2001-06-08 2004-06-24 Вектор Тобакко Лтд. Модификация содержания никотина и нитрозамина в табаке
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
JP2005508648A (ja) * 2001-11-09 2005-04-07 ベクター・タバコ・インコーポレーテッド 炭でフィルターされた巻きタバコのメントール化のための組成物及び方法
JP2005512554A (ja) * 2001-12-19 2005-05-12 ベクター・タバコ・インコーポレーテッド タバコ製品に清涼効果を付与する方法および組成物
EP1455608B1 (en) * 2001-12-19 2006-10-11 Vector Tobacco Ltd. Method and composition for mentholation of cigarettes
AU2003230833A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Vector Tobacco Ltd. Tobacco having reduced nicotine and nitrosamines
EA200600449A1 (ru) * 2003-08-19 2006-08-25 ТВЕНТИ СЕКОНД СЕНЧУРИ ЛИМИТИД, эЛэЛСи Табачное изделие (варианты), способ его изготовления (варианты), трансгенное растение табака, способы повышения содержания никотина, редуцирующих сахаров и уровня биосинтеза алкалоидов в растении и способ изготовления восстановленного табака
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
EP1684603A2 (en) * 2003-10-02 2006-08-02 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7538071B2 (en) 2003-11-21 2009-05-26 Carl Berger Methods of reducing the nicotine content of tobacco plants and tobacco plants obtained thereby
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US8989833B2 (en) 2004-07-13 2015-03-24 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
AU2012203977B2 (en) * 2005-02-28 2015-01-29 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
CN106381327A (zh) 2005-02-28 2017-02-08 二十二世纪有限公司 鉴定烟草植物的方法、生产烟草植物细胞的方法、植物细胞和降低了生物碱的产品
WO2006124448A2 (en) 2005-05-11 2006-11-23 Vector Tobacco Inc. Reduced risk tobacco products and methods of making same
FR2889003A1 (fr) * 2005-07-22 2007-01-26 St Microelectronics Sa Adaptation automatique d'une source video a un recepteur
EP2038406A2 (en) 2006-06-19 2009-03-25 National Research Council of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
PL2450446T3 (pl) 2006-09-13 2015-10-30 22Nd Century Ltd Llc Zwiększanie poziomów alkaloidów nikotynowych
US9551003B2 (en) 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US9106606B1 (en) 2007-02-05 2015-08-11 F5 Networks, Inc. Method, intermediate device and computer program code for maintaining persistency
CN110885834B (zh) 2007-05-25 2023-08-11 22世纪有限责任公司 编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用
US20100206317A1 (en) * 2007-09-28 2010-08-19 Vector Tobacco, Inc. Reduced risk tobacco products and use thereof
PL2231861T3 (pl) * 2007-12-13 2015-04-30 Philip Morris Products Sa Rośliny transgeniczne modyfikowane w celu zmniejszenia transportu kadmu, produkty pochodne i metody związane
RU2577971C2 (ru) 2009-11-19 2016-03-20 Нэшнл Юниверсити Корпорейшн Окаяма Юниверсити Система для увеличения экспрессии генов и вектор, содержащий указанную систему
JP5631410B2 (ja) 2009-12-11 2014-11-26 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド シールド付きの抽出ポート及び光学的制御を有する血液分離システム
EP2537929B1 (en) 2010-02-17 2017-04-12 Japan Tobacco, Inc. Plant component regulation factor, and use thereof
US9862923B2 (en) 2010-03-26 2018-01-09 Philip Morris Usa Inc. Cultured tobacco cells as a matrix for consumable products
EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Philip Morris Products S.A. Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
US8716571B2 (en) 2011-09-21 2014-05-06 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having reduced amounts of amino acids and methods for producing such lines
US9137958B2 (en) 2012-02-08 2015-09-22 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having altered amounts of environmental contaminants
PH12015501204B1 (en) * 2012-12-21 2022-07-15 Philip Morris Products Sa Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
WO2016179356A1 (en) * 2015-05-05 2016-11-10 North Carolina State University Methods and compositions for reducing the tobacco specific nitrosamine nnk in tobacco
JP7292035B2 (ja) 2015-06-26 2023-06-16 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー アルカロイドレベル改変タバコ植物体及び製品を作出する組成物及び方法
EP3480314A1 (en) 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
EP4041899A1 (en) * 2019-10-10 2022-08-17 Altria Client Services LLC Compositions and methods based on qpt engineering for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用
CN116983432A (zh) * 2023-07-07 2023-11-03 深圳先进技术研究院 用于治疗类风湿性关节炎的药物

Family Cites Families (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US299541A (en) 1884-06-03 heae-n
US254285A (en) 1882-02-28 David w
US38123A (en) * 1863-04-07 Improvement in harvesters
US819751A (en) * 1905-01-04 1906-05-08 Giuseppe Gianoli Process of charging silk.
US2479526A (en) 1940-12-11 1949-08-16 Wurton Machine Company Apparatus for curing green tobacco
US2728803A (en) 1951-12-28 1955-12-27 Standard Oil Co Separation of ethylbenzene from other c8 aromatic hydrocarbons by extraction with hf-bf3
US2728603A (en) 1954-12-13 1955-12-27 James H Stagg Lawn and garden sprinkler
DE1917552U (de) 1964-01-31 1965-06-10 Fritz Tautenhahn Flaechig-ornamentales gitterwerk.
US3693631A (en) 1971-04-28 1972-09-26 Reynolds Leasing Corp Tobacco expansion process
US3840025A (en) 1972-08-14 1974-10-08 Industrial Nucleonics Corp Tobacco moisture control system and method
US3905123A (en) 1973-10-15 1975-09-16 Industrial Nucleonics Corp Method and apparatus for controlling a tobacco dryer
US4319587A (en) 1975-06-09 1982-03-16 Irving S. Moser Smoking article
DE2531285C2 (de) 1975-07-12 1982-10-28 Deutsche Benkert Gmbh & Co Kg, 4690 Herne Filterzigarette
US4192323A (en) 1977-09-21 1980-03-11 Gas-Fired Products, Inc. Apparatus and method for automatically controlling curing conditions in a tobacco curing barn
US4557280A (en) 1978-06-15 1985-12-10 Brown & Williamson Tobacco Corporation Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment
US4243056A (en) 1979-01-12 1981-01-06 Philip Morris Incorporated Method for uniform incorporation of additives into tobacco
FR2478958A1 (fr) 1980-04-01 1981-10-02 Decoufle Dispositif d'alimentation en encre des appareils d'imprimerie pour machines a confectionner les cigarettes
US4499911A (en) 1980-12-09 1985-02-19 Johnson William H Energy efficient curing and drying system
GB2092149B (en) * 1981-02-03 1985-01-03 Searle & Co Imidazoline hydrazone and hydrazine derivatives production thereof and use in medicine
US4459355A (en) 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
NL8203963A (nl) 1982-10-14 1984-05-01 Naarden International Nv Werkwijze voor het aromatiseren van droog plantaardig materiaal.
ATE52800T1 (de) 1983-01-13 1990-06-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zum einbringen von expressionsfaehigen genen in pflanzenzellgenome und hybride ti plasmidvektoren enthaltende agrobacterium-staemme verwendbar in diesem verfahren.
US6051757A (en) 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
WO1984002920A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Genetically transformed plants
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
DE3484215D1 (de) 1983-01-17 1991-04-11 Monsanto Co Chimaerische gene geeignet zur expression in pflanzenzellen.
US6174724B1 (en) 1983-01-17 2001-01-16 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4751348A (en) 1983-07-16 1988-06-14 Cold Spring Harbor Laboratory Nicotiana plants with both altered polyamine levels and flower structures and method for obtaining these plants
US4766855A (en) * 1983-07-20 1988-08-30 Cummins Engine Co., Inc. Plasma jet ignition apparatus
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
DE3486053T3 (de) 1983-10-20 2004-01-08 The Research Foundation Of State University Of New York Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS.
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US6281410B1 (en) 1986-07-31 2001-08-28 Calgene Llc Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
NL8502948A (nl) 1985-10-29 1987-05-18 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.
US4795855A (en) 1985-11-14 1989-01-03 Joanne Fillatti Transformation and foreign gene expression with woody species
GB8529851D0 (en) 1985-12-04 1986-01-15 Rothmans Of Pall Mall Linear layered cigarette
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4700725A (en) 1986-04-17 1987-10-20 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette
US4699158A (en) 1986-04-17 1987-10-13 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette with tactile indicator
EP0242418B1 (de) 1986-04-23 1989-01-04 R.J. Reynolds Tobacco GmbH Verfahren zur Behandlung von Tabak und ähnlichen organischen Materialien
US4766911A (en) 1986-06-23 1988-08-30 R. J. Reynolds Tobacco Company Method for tracing smoking articles
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5229292A (en) 1986-07-28 1993-07-20 Stine Seed Farm, Inc. Biological control of insects using pseudomonas strains transformed with bacillus thuringiensis insect toxingene
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US4835162A (en) 1987-02-12 1989-05-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterents
US4966916A (en) 1987-02-12 1990-10-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterrents
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US4954442A (en) 1988-08-31 1990-09-04 Purdue Research Foundation Opine enhancement of vir gene induction
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
GB8827592D0 (en) 1988-11-25 1988-12-29 Taniguchi T Improvements in & relating to regulation of expression
US5223419A (en) 1989-03-14 1993-06-29 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US4990607A (en) 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
WO1991001379A1 (en) 1989-07-18 1991-02-07 Oncogene Science, Inc. Method of transcriptionally modulating gene expression and of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5665543A (en) 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
NL8901931A (nl) 1989-07-26 1991-02-18 Mogen International N V En Rij Werkwijze voor het plaatsgericht introduceren van vreemd dna in het genoom van planten.
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5062434A (en) 1989-09-22 1991-11-05 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper
GB8923716D0 (en) 1989-10-20 1989-12-06 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5177308A (en) 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
ATE130371T1 (de) 1989-12-19 1995-12-15 Ciba Geigy Ag Verfahren und vorrichtung zur genetischen transformation von zellen.
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
WO1991011535A1 (en) 1990-01-30 1991-08-08 Childrens Hospital Of Los Angeles Inhibition of transcription by double-stranded oligonucleotides
CA2036935A1 (en) 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
GB9005945D0 (en) 1990-03-16 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
WO1991014790A1 (en) 1990-03-27 1991-10-03 New England Medical Center Hospitals, Inc. Inhibitors of transcription activation activity of papillomaviruses
US5109876A (en) 1990-04-19 1992-05-05 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette paper and cigarette incorporating same
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5035252A (en) 1990-12-14 1991-07-30 Mondre Steven J Nicotine-containing dental floss
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
JPH04265569A (ja) * 1991-02-19 1992-09-21 Canon Inc 音声信号記録装置及び再生装置
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5683985A (en) 1991-04-18 1997-11-04 The Salk Institute For Biological Studies Oligonucleotide decoys and methods relating thereto
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
WO1993000546A1 (en) 1991-06-20 1993-01-07 Reinforced Plastics/Composites Pty Ltd A connecting system
WO1993000446A1 (en) 1991-06-27 1993-01-07 Genelabs Technologies, Inc. Screening assay for the detection of dna-binding molecules
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
WO1993005646A1 (en) * 1991-09-13 1993-04-01 Technology Management Services, S.A. Reduction of nicotine levels in tobacco
WO1993014768A1 (en) 1992-01-27 1993-08-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for neutralizing intracellular nucleic acid-binding protein biological activity in a cell, including methods and compositions useful to regulate gene function
ATE201236T1 (de) 1992-02-26 2001-06-15 Zeneca Mogen B V Zur ortsspezifischen rekomination fähige agrobakterium stämme
US5780051A (en) 1992-04-02 1998-07-14 Dynagen, Inc. Methods and articles of manufacture for nicotine cessation and monitoring nicotine use
JP3660354B2 (ja) 1992-04-02 2005-06-15 セムバイオシス ジェネティクス インコーポレイテッド 調節シグナルとしてのオイルボディタンパク質シスエレメント
US5626152A (en) 1992-08-26 1997-05-06 Molins Plc Cigarette making machine
US5469871A (en) 1992-09-17 1995-11-28 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette and method of making same
BR9307547A (pt) 1992-11-27 1999-06-01 Voxel Processo e aparelho para fabricar um holograma
JPH08503853A (ja) 1992-11-30 1996-04-30 チューア，ナム−ハイ 植物における組織−及び発生−特異的な発現を付与する発現モチーフ
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
ATE203772T1 (de) 1993-05-13 2001-08-15 Aventis Cropscience Nv Markiergen
WO1994028142A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Philip Morris Products Inc. Putrescine n-methyltransferase, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltransferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content
US5540242A (en) 1993-07-07 1996-07-30 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper having reduced sidestream properties
US5377697A (en) 1993-08-27 1995-01-03 Hoechst Celanese Corporation Cigarette filter test apparatus and associated method for measuring filter hot collapse and tobacco consumption
US5810020A (en) 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
EP1350514A3 (en) 1993-10-29 2004-07-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic use of cis-element decoys in vivo
US6399376B1 (en) 1993-11-05 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
WO1995016031A1 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Japan Tobacco Inc. Method of transforming plant and vector therefor
US5394894A (en) 1994-02-22 1995-03-07 Zade; Ismail Y. Method and apparatus for elimination of smoking
US5858774A (en) 1994-05-12 1999-01-12 The Research Foundation Of State University Of New York Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters
ES2081257B1 (es) 1994-05-12 1996-07-16 Sagrera Jorge Martinez Instalacion y procedimiento para el curado de tabaco.
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
JP3235934B2 (ja) 1994-08-04 2001-12-04 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
IT1275697B1 (it) 1994-12-20 1997-10-17 Olmo Giancarlo Dell Metodo per stampare direttamente su carta microincisioni di ologrammi,chinogrammi,reticoli di diffrazione o microincisioni
US5733744A (en) 1995-01-13 1998-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Binary BAC vector
EP0817856A1 (en) 1995-03-22 1998-01-14 Novo Nordisk A/S Introduction of dna into bacillus strains by conjugation
AU712624B2 (en) 1995-03-30 1999-11-11 Takara Bio Inc. Plant promoter and method for gene expression using said promoter
EP0824918B1 (en) 1995-05-12 2007-03-28 AnGes MG, Inc. REMEDY AND PREVENTIVE FOR DISEASES CAUSED BY NF-kappaB
US5837876A (en) * 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9517263D0 (en) 1995-08-23 1995-10-25 Cancer Res Campaign Tech Expression systems
JPH11511336A (ja) 1995-09-25 1999-10-05 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト 真核細胞に搬入された外来ｄｎａの改良組込み
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
US6198827B1 (en) * 1995-12-26 2001-03-06 Rocktron Corporation 5-2-5 Matrix system
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
CA2251738A1 (en) 1996-04-16 1997-10-23 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
WO1997044064A2 (en) 1996-05-20 1997-11-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Oligonucleotides which specifically bind retroviral nucleocapsid proteins
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
US5834236A (en) 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US6135121A (en) 1996-06-28 2000-10-24 Regent Court Technologies Tobacco products having reduced nitrosamine content
USRE38123E1 (en) 1996-06-28 2003-05-27 Regent Court Technologies, Llc. Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5845647A (en) 1996-06-28 1998-12-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US5803081A (en) 1996-06-28 1998-09-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US6037525A (en) 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5830318A (en) 1996-10-25 1998-11-03 Schweitzer-Mauduit International, Inc. High opacity tipping paper
US5929306A (en) 1996-11-15 1999-07-27 University Of Kentucky Research Foundation KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5
US6202649B1 (en) 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US6096947A (en) 1997-01-14 2000-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving transformation efficiency
AU5918398A (en) 1997-01-28 1998-08-18 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for modulation of alkaloid biosynthesis and flower formation in plants
US6166032A (en) 1997-02-07 2000-12-26 Synapse Pharmaceuticals International, Inc. Method for controlling tobacco use and alleviating withdrawal symptoms due to cessation of tobacco use
ES1036967Y (es) * 1997-04-15 1998-05-01 Techpack Espana S L Cazoleta perfeccionada para estuche de lapiz de labios.
US6163521A (en) * 1997-04-16 2000-12-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Disk having read-only and read-write areas
US6020989A (en) * 1997-05-14 2000-02-01 Affinity Co., Ltd. Laminated bodies and windows using them
US6586661B1 (en) 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
UY25037A1 (es) 1997-06-13 1998-12-11 Shell Int Research Un proceso para producir material vegetal modificado geneticamente que comprende una o mas secuencias de adn de interes establemente incorporadas
US6020969A (en) 1997-07-11 2000-02-01 Philip Morris Incorporated Cigarette making machine including band inspection
US6391547B1 (en) 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
ATE269411T1 (de) 1997-08-25 2004-07-15 Nunhems Zaden Bv Verbesserte, durch agrobakterien vermittelte transformation von pflanzen
ZA988332B (en) 1997-09-12 1999-03-23 Performance Plants Inc In planta transformation of plants
CA2248622A1 (en) 1997-09-23 1999-03-23 Joe Celeste Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues
AU750808B2 (en) 1997-10-03 2002-07-25 Cary Medical Corporation Compositon for the treatment of nicotine addiction containing a nicotine receptor antagonist and an anti-depressant or anti-anxiety drug
US6077992A (en) 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
US6187994B1 (en) 1997-11-18 2001-02-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for genetic modification of plants
US6060310A (en) 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AU2877899A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Regents Of The University Of California, The A novel inhibitor of the inflammatory response induced by tnfalpha and il-1
WO1999049029A1 (en) 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd Control of gene expression
JP3444191B2 (ja) 1998-03-31 2003-09-08 日本製紙株式会社 フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子
US6136799A (en) 1998-04-08 2000-10-24 Abbott Laboratories Cosolvent formulations
NZ507093A (en) 1998-04-08 2003-08-29 Commw Scient Ind Res Org Methods and means for reducing the phenotypic expression of a nucleic acid of interest in a plant
US5938017A (en) 1998-05-04 1999-08-17 Wik; Dennis O. Article for assisting persons to quit smoking and method for same
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
AU770309B2 (en) 1998-06-05 2004-02-19 Regent Court Technologies Monoamine oxidase (MAO) inhibitors and uses thereof
US6271031B1 (en) 1998-08-12 2001-08-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Quinolinate metabolism enzymes
US7807865B1 (en) 1998-08-31 2010-10-05 Monsanto Technology Llc Transgene assay using stable agrobacterium rhizogenes transformation
AU764100B2 (en) 1998-10-01 2003-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
DE19847767A1 (de) 1998-10-16 2000-04-20 Decoufle Sarl Anordnung zum Zuführen von fließfähiger Druckfarbe zu einem Druckwerk für einen Zigarettenpapierstreifen
DE19852757A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Eth Zuerich Zuerich Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen
DE69924005T2 (de) 1998-12-22 2006-04-13 National Research Council Canada, Ottawa Transgene pflanzen mit konditional lethalem gen
AU2594300A (en) 1998-12-23 2000-07-12 Samuel Roberts Noble Foundation, Inc., The Plant transformation process
CN1347457A (zh) 1999-04-19 2002-05-01 罗拜奥公司 植物转化方法
WO2000067558A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6314964B1 (en) 1999-09-15 2001-11-13 Schweitzer-Mauduit International, Inc. Cigarette paper containing carbon fibers for improved ash characteristics
EP1250447B1 (en) 1999-11-29 2011-12-21 Midwest Oilseeds, Inc. Methods, media and apparatus for the introduction of molecules into plant cells and bacteria using aerosol beams
EP2161340A3 (en) 1999-12-16 2010-09-22 CropDesign N.V. Optimized T-DNA transfer and vectors therefor
AU2625501A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for gene silencing
AU2778801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 Baylor University Antisense compositions and methods
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
WO2001077350A2 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
WO2002000926A2 (en) 2000-06-30 2002-01-03 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with signal transduction
US6911541B2 (en) 2000-08-30 2005-06-28 North Carolina State University Promoter fragment that is recognized by the product of the tobacco Nic gene
WO2002038588A2 (en) 2000-11-07 2002-05-16 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
MXPA03011101A (es) 2001-06-06 2005-02-17 22Nd Century Ltd Llc Utilizacion de biomasa de tabaco.
US20060157072A1 (en) 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
EA200400013A1 (ru) 2001-06-08 2004-06-24 Вектор Тобакко Лтд. Модификация содержания никотина и нитрозамина в табаке
US6557560B2 (en) 2001-06-18 2003-05-06 Ctc Canada Inc. Cigarette making machine
EA200600449A1 (ru) 2003-08-19 2006-08-25 ТВЕНТИ СЕКОНД СЕНЧУРИ ЛИМИТИД, эЛэЛСи Табачное изделие (варианты), способ его изготовления (варианты), трансгенное растение табака, способы повышения содержания никотина, редуцирующих сахаров и уровня биосинтеза алкалоидов в растении и способ изготовления восстановленного табака
CN106381327A (zh) 2005-02-28 2017-02-08 二十二世纪有限公司 鉴定烟草植物的方法、生产烟草植物细胞的方法、植物细胞和降低了生物碱的产品
EP2038406A2 (en) 2006-06-19 2009-03-25 National Research Council of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
CA2666383C (en) 2006-10-13 2015-12-22 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes

Also Published As

Publication number Publication date
US20040168211A1 (en) 2004-08-26
AP1169A (en) 2003-06-30
JP2001522250A (ja) 2001-11-13
HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
DK0991766T3 (da) 2004-07-12
US7425670B2 (en) 2008-09-16
LT4706B (lt) 2000-09-25
DE991766T1 (de) 2002-04-04
LV12507B (en) 2000-11-20
KR20010013663A (ko) 2001-02-26
US20060191035A1 (en) 2006-08-24
HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
EP1457562B1 (en) 2012-08-08
EA200000007A1 (ru) 2000-06-26
JP4095678B2 (ja) 2008-06-04
CN1304576C (zh) 2007-03-14
US20020108151A1 (en) 2002-08-08
EP1457562A1 (en) 2004-09-15
EP0991766B1 (en) 2004-03-17
CZ297379B6 (cs) 2006-11-15
ES2154624T3 (es) 2004-11-01
HK1065066A1 (en) 2005-02-08
BG64319B1 (bg) 2004-09-30
EP1457563A1 (en) 2004-09-15
CA2287776A1 (en) 1998-12-17
OA11219A (en) 2003-07-17
RO121968B1 (ro) 2008-09-30
WO1998056923A1 (en) 1998-12-17
NZ500963A (en) 2001-09-28
CN1618972A (zh) 2005-05-25
EE9900575A (et) 2000-08-15
GR20010300003T1 (en) 2001-06-29
CA2287776C (en) 2012-04-03
EP0991766A1 (en) 2000-04-12
NO996169D0 (no) 1999-12-13
IL192232A0 (en) 2008-12-29
US7304220B2 (en) 2007-12-04
US7605308B2 (en) 2009-10-20
CN1257542A (zh) 2000-06-21
RS49677B (sr) 2007-11-15
LT99142A (en) 2000-06-26
US20060200872A1 (en) 2006-09-07
EA004652B1 (ru) 2004-06-24
ES2154624T1 (es) 2001-04-16
EA009898B1 (ru) 2008-04-28
AP9901680A0 (en) 1999-12-31
US20060191036A1 (en) 2006-08-24
IL132184A0 (en) 2001-03-19
US20070011774A1 (en) 2007-01-11
TR199902728T2 (xx) 2000-09-21
US7645925B2 (en) 2010-01-12
UA72187C2 (uk) 2005-02-15
US6423520B1 (en) 2002-07-23
US6586661B1 (en) 2003-07-01
SI20215B (sl) 2007-04-30
SI20215A (sl) 2000-10-31
KR100365969B1 (ko) 2002-12-26
US7795509B2 (en) 2010-09-14
BRPI9810870B1 (pt) 2021-06-01
NO996169L (no) 1999-12-13
SK161899A3 (en) 2000-06-12
LV12507A (en) 2000-06-20
JP2009112316A (ja) 2009-05-28
DE69822463T2 (de) 2005-01-20
GEP20032871B (en) 2003-01-27
AU748514B2 (en) 2002-06-06
CN100482799C (zh) 2009-04-29
EE04595B1 (et) 2006-02-15
JP4288206B2 (ja) 2009-07-01
PT991766E (pt) 2004-08-31
JP2004290201A (ja) 2004-10-21
EA200400186A1 (ru) 2004-08-26
IL132184A (en) 2010-11-30
PL201266B1 (pl) 2009-03-31
HK1069411A1 (en) 2005-05-20
JP2008131950A (ja) 2008-06-12
NO324872B1 (no) 2007-12-17
CA2484366A1 (en) 1998-12-17
HU225888B1 (en) 2007-11-28
ATE262039T1 (de) 2004-04-15
HK1027379A1 (en) 2001-01-12
JP4459271B2 (ja) 2010-04-28
PL337442A1 (en) 2000-08-14
BR9810870A (pt) 2000-11-14
US7408098B2 (en) 2008-08-05
BG103886A (en) 2000-07-31
US20030140366A1 (en) 2003-07-24
AU7829198A (en) 1998-12-30
YU64899A (sh) 2004-12-31
ID29311A (id) 2001-08-16
CU23174A3 (es) 2006-09-22
DE69822463D1 (de) 2004-04-22
EP1457563B1 (en) 2012-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0991766B1 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2004203879B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2002300895B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
HK1027379B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
HK1069411B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression in tobacco plants
HK1065066B (en) Increase of quinolate phosphoribosyl transferase expression in plants
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20180610