PL201266B1 - Wyizolowana cząsteczka DNA, kostrukty DNA, peptyd, komórka roślinna tytoniu, roślina transgeniczna i jej nasiona, sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej, sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, sposób wytwarzania rośliny tytoniu, sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, produkt tytoniowy, zastosowanie komórki roślinnej tytoniu oraz zastosowanie rośliny tytoniu - Google Patents

Wyizolowana cząsteczka DNA, kostrukty DNA, peptyd, komórka roślinna tytoniu, roślina transgeniczna i jej nasiona, sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej, sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, sposób wytwarzania rośliny tytoniu, sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, produkt tytoniowy, zastosowanie komórki roślinnej tytoniu oraz zastosowanie rośliny tytoniu

Info

Publication number
PL201266B1
PL201266B1 PL337442A PL33744298A PL201266B1 PL 201266 B1 PL201266 B1 PL 201266B1 PL 337442 A PL337442 A PL 337442A PL 33744298 A PL33744298 A PL 33744298A PL 201266 B1 PL201266 B1 PL 201266B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plant
dna
promoter
tobacco
cell
Prior art date
Application number
PL337442A
Other languages
English (en)
Other versions
PL337442A1 (en
Inventor
Mark A. Conkling
Nandini Mendu
Wen Song
Original Assignee
Univ North Carolina State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21960004&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL201266(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ North Carolina State filed Critical Univ North Carolina State
Publication of PL337442A1 publication Critical patent/PL337442A1/xx
Publication of PL201266B1 publication Critical patent/PL201266B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy wyizolowanych cz asteczek DNA koduj acych ro slinny enzym fosforybozylo- transferaz e chinolanow a (QPRTaz e), konstruktów obejmuj acych taki DNA, komórek ro slinnych tytoniu oraz ro slin transgenicznych obejmuj acych konstrukty wed lug wynalazku. Wynalazek dotyczy równie z sposobów zmian ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanu. PL PL PL PL

Description

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 10.06.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
10.06.1998, PCT/US98/11893 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
17.12.1998, WO98/56923 PCT Gazette nr 50/98 (51) Int.Cl.
C12N 15/54 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01)
Wyizolowana cząsteczka DNA, kostrukty DNA, peptyd, komórka roślinna tytoniu, roślina transgeniczna i jej nasiona, sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej, sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, sposób wytwarzania rośliny tytoniu, sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, produkt tytoniowy, zastosowanie komórki roślinnej tytoniu oraz zastosowanie rośliny tytoniu (73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:
12.06.1997,US,60/049,471
NORTH CAROLINA STATE UNIVERSITY, Raleigh,US (43) Zgłoszenie ogłoszono:
14.08.2000 BUP 17/00 (72) Twórca(y) wynalazku:
Mark A. Conkling,Fuquay-Varina,US Nandini Mendu,Durham,US Wen Song,San Diego,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.03.2009 WUP 03/09 (74) Pełnomocnik:
Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.
(57) Wynalazek dotyczy wyizolowanych cząsteczek DNA kodujących roślinny enzym fosforybozylotransferazę chinolanową (QPRTazę), konstruktów obejmujących taki DNA, komórek roślinnych tytoniu oraz roślin transgenicznych obejmujących konstrukty według wynalazku. Wynalazek dotyczy również sposobów zmian ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanu.
PL 201 266 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka DNA, konstrukty DNA, peptyd, komórka roślinna tytoniu, roślina transgeniczna i jej nasiona, sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej, sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, sposób wytwarzania rośliny tytoniu, sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, produkt tytoniowy, zastosowanie komórki roślinnej tytoniu oraz zastosowanie rośliny tytoniu.
Wytwarzanie tytoniu o obniżonym poziomie nikotyny jest interesujące ze względu na problemy związane z uzależniającym charakterem nikotyny. Ponadto, rośliny tytoniu o wyjątkowo niskim poziomie wytwarzania nikotyny, lub nie wytwarzające nikotyny, są pożądane jako biorcy dla transgenów wyrażających cenne handlowo produkty, takie jak środki farmaceutyczne, składniki kosmetyczne lub dodatki do żywności. Opracowano różnorodne sposoby usuwania nikotyny z tytoniu. Jednakże, większość z tych procesów usuwa oprócz nikotyny inne składniki z tytoniu, tym samym niekorzystnie wpływając na tytoń. Klasycznymi technikami hodowli roślin wytworzono rośliny tytoniu o niższym poziomie nikotyny (około 8%) niż w dzikich roślinach tytoniu. Pożądane są rośliny tytoniu oraz tytoń wykazujące dalsze obniżenie poziomu nikotyny.
Jednym ze sposobów zmniejszenia poziomu produktu biologicznego jest obniżenie ilości niezbędnego enzymu w szlaku biosyntetycznym prowadzącym do wytworzenia tego produktu. Gdy enzym ten naturalnie występuje w ilości ograniczającej szybkość reakcji (względem innych enzymów niezbędnych w szlaku); każde obniżenie jego ilości spowoduje spadek w wytwarzaniu produktu końcowego. Jeżeli ilość enzymu nie jest normalnie ograniczająca, jego zawartość w komórce musi zostać obniżona do poziomu ograniczającego szybkość reakcji w celu zmniejszenia wydajności szlaku. Odwrotnie, jeżeli naturalnie występująca ilość enzymu jest ograniczająca, wówczas dowolne zwiększenie ilości enzymu spowoduje przyrost ilości końcowego produktu szlaku biosyntetycznego.
Nikotyna tworzy się przede wszystkim w korzeniach rośliny tytoniu i jest następnie transportowana do liści, gdzie jest przechowywana (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). Niezbędnym etapem biosyntezy nikotyny jest wytworzenie kwasu nikotynowego z kwasu chinolinowego, który to etap jest katalizowany przez enzym fosforybozylotransferazę chinolinową (QPRTazę). QPRTaza wydaje się być enzymem ograniczającym szybkość szlaku dostarczającego kwasu nikotynowego do syntezy nikotyny w tytoniu. Patrz np. Feth i wsp., Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway, Planta, 168, pp. 402-07 (1986); Wagner i wsp., The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco, Physiol. Plant., 68, pp 667-72 (1986). Modyfikacja poziomu nikotyny w roślinach tytoniu przez antysensowną regulację ekspresji metylotransferazy putrescynowej (PMTazy) została opisana w patentach USA nr 5,369,023 oraz 5,260,205 udzielonych na rzecz Nakatani i Malik. W Zgłoszeniu PCT WO 94/28142 złożonym przez Wahad i Malik opisano DNA kodujący PMT oraz użycie sensownych i antysensownych konstruktów PMT.
Wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki DNA obejmującej sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z:
(a) ID. SEKW. NR 1;
(b) sekwencji DNA, które kodują enzym o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na ID. SEKW. NR 2 (c) sekwencji DNA, które hybrydyzują z wyizolowanym DNA według punktu (a) lub (b) powyżej i które kodują enzym fosforybozylotransferazą chinolanową ; oraz (d) sekwencji DNA, które różnią się od DNA według (a), (b) lub (c) powyżej ze względu na degenerację kodu genetycznego i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową.
Wynalazek również dotyczy konstruktu DNA obejmującego w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz sekwencję DNA według wynalazku, umieszczoną poniżej tego promotora i funkcjonalnie z nim połączoną.
Wynalazek również dotyczy konstruktu DNA, który obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor roślinny oraz sekwencję DNA według wynalazku, umieszczoną poniżej tego promotora i funkcjonalnie z nim połączoną, przy czym sekwencja DNA jest w orientacji antysensownej.
Wynalazek również dotyczy konstruktu DNA, który obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz DNA kodujący roślinną fosforybozylotransferazę chinolaPL 201 266 B1 nową, o sekwencji nukleotydowej określonej w ID. SEKW. NR 1 według wynalazku, przy czym DNA jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
Ponadto wynalazek dotyczy konstruktu DNA, który obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz DNA kodujący roślinną fosforybozylotransferazę chinolanową, o sekwencji nukleotydowej określonej w ID. SEKW. NR 1 według wynalazku, przy czym DNA jest w orientacji antysensownej i jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
W korzystnym wykonaniu konstruktu DNA wedł ug wynalazku promotor jest konstytutywnie aktywny w komórkach roślinnych.
W innym korzystnym wykonaniu konstruktu DNA wedł ug wynalazku promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia rośliny.
W korzystnym wykonaniu konstruktu DNA wedł ug wynalazku promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia roś liny.
Korzystnie konstrukt DNA według wynalazku dodatkowo obejmuje plazmid.
Korzystnie konstrukt DNA według wynalazku jest niesiony przez wektor do transformacji roślin, którym korzystnie jest Agrobacterium tumefaciens.
W zakres wynalazku wchodzi również komórka roślinna tytoniu zawierająca konstrukt DNA według wynalazku.
Wynalazek ponadto dotyczy rośliny transgenicznej obejmującej komórkę według wynalazku.
Wynalazek dotyczy też peptydu o sekwencji aminokwasowej, przedstawionej na ID. SEKW. NR 2.
Wynalazek obejmuje także peptyd kodowany przez sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z:
(a) ID. SEKW. NR 1;
(b) sekwencji DNA, które hybrydyzują z sekwencją DNA według punktu (a) powyżej i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową; oraz (c) sekwencji DNA, które różnią się od DNA według (a) lub (b) powyżej ze względu na degenerację kodu genetycznego i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej o obniżonej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy), który obejmuje:
transformowanie komórki roślinnej typu, o którym wiadomo że wyraża fosforybozylotransferazę chinolanową, konstruktem egzogennego DNA, który obejmuje w kierunku od końca 5' do 3' promotor działający w komórce roślinnej oraz heterologiczny DNA zawierający część sekwencji kodującej mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej, przy czym heterologiczny DNA jest funkcjonalnie połączony z tym promotorem, w celu wytworzenia stransformowanej komórki roślinnej, która wykazuje obniżoną ekspresję QPRTazy w porównaniu z nietransformowaną komórką roślinną, przy czym taki heterologiczny DNA obejmuje co najmniej 25 nukleotydów sekwencji według wynalazku.
W sposobie wedł ug wynalazku heterologiczny DNA moż e być w orientacji antysensownej lub w orientacji sensownej.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku komórka roś linna jest komórką Nicotiana tabacum. Korzystnie obejmuje on ponadto regenerację rośliny tytoniu ze stransformowanej komórki roślinnej.
W sposobie wytwarzania transgenicznej komórki roś linnej o obniż onej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej korzystnie promotor jest konstytutywnie aktywny lub wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia rośliny, korzystnie jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia rośliny. Korzystnie etap transformacji jest przeprowadzony przez bombardowanie komórki roślinnej mikrocząstkami niosącymi konstrukt DNA lub przez infekowanie komórki roślinnej Agrobacterium tumefaciens zawierającym plazmid Ti niosący ten konstrukt DNA.
Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, obejmującego zbiór nasion z transgenicznej rośliny tytoniu według wynalazku.
W korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku heterologiczna sekwencja DNA wedł ug wynalazku jest komplementarna do RNA informacyjnego fosforybozylotransferazy chinolanowej (mRNA QPRT) wyrażanego w komórce roślinnej, w obszarze wybranym spośród:
(a) 5' niepodlegającej translacji sekwencji mRNA QPRT;
(b) 3' niepodlegającej translacji sekwencji mRNA QPRT;
(c) podlegającego translacji obszaru mRNA QPRT
PL 201 266 B1
W innym korzystnym sposobie heterologiczna sekwencja DNA wedł ug w wynalazku jest komplementarna do co najmniej 15 nukleotydów informacyjnego RNA fosforybozylotransferazy chinolanowej wyrażanego w tej komórce roślinnej.
W kolejnym korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku heterologiczna sekwencja DNA według wynalazku jest komplementarna do co najmniej 200 nukleotydów informacyjnego RNA fosforybozylotransferazy chinolanowej wyrażanego w tej komórce roślinnej.
W nastę pnym korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku heterologiczna sekwencja DNA obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą fosforybozylotransferazę chinolanową określoną w ID. SEKW. NR 1.
Wynalazek dotyczy rośliny transgenicznej z rodzaju Nicotiana wykazującej zredukowaną ekspresję fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, która to roślina transgeniczna obejmuje transgeniczne komórki roślinne zawierające:
W egzogenny konstrukt DNA obejmujący w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w tej komórce roślinnej oraz sekwencję heterologicznego DNA kodującego mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej, która to sekwencja heterologicznego DNA jest funkcjonalnie połączona z promotorem;
przy czym roślina ta wykazuje obniżoną ekspresję QPRTazy w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną a taki heterologiczny DNA obejmuje co najmniej 25 nukleotydów sekwencji określonej w wynalazku.
Heterologiczny DNA w roślinie transgenicznej według wynalazku jest w orientacji antysensownej lub w orientacji sensownej.
Wynalazek również dotyczy nasion rośliny transgenicznej rodzaju Nicotiana o zredukowanej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, które obejmują heterologiczną sekwencję DNA według wynalazku, i pochodzi z rośliny według wynalazku.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, który obejmuje:
hodowlę komórki roślinnej stransformowanej heterologicznym DNA o sekwencji określonej w wynalazku, przy czym transkrybowana nić z sekwencji heterologicznego DNA jest komplementarna do mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej endogennego dla komórki, przy czym transkrypcja nici komplementarnej zmniejsza ekspresję genu fosforybozylotransferazy chinolanowej.
Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania rośliny tytoniu o obniżonym poziomie nikotyny w liściach, który obejmuje:
hodowlę rośliny tytoniu, lub jej roślin potomnych, przy czym roślina ta obejmuje komórki zawierające egzogenny konstrukt DNA obejmujący obszar inicjacji transkrypcji funkcjonujący w tej roślinie oraz heterologiczną sekwencję DNA według wynalazku funkcjonalnie połączoną z obszarem inicjacji transkrypcji, przy czym transkrybowana nić sekwencji heterologicznego DNA jest komplementarna do informacyjnego RNA fosforybozylotransferazy chinolanowej endogennego dla tej komórki.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej o podwyższonej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy), który obejmuje: wzrost komórki roślinnej, która jest stransformowana egzogennym konstruktem DNA, który to konstrukt obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz sekwencję heterologicznego DNA według wynalazku, przy czym sekwencja heterologicznego DNA jest funkcjonalnie połączona z promotorem tak, że ekspresja heterologicznej sekwencji DNA w komórce daje w transgenicznej komórce roślinnej podwyższoną ekspresję QPRTazy w porównaniu z komórkami niestransformowanymi.
Wynalazek również dotyczy rośliny transgenicznej rodzaju Nicotiana wykazującej zwiększoną ekspresję fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, która obejmuje transgeniczne komórki roślinne zawierające: egzogenny konstrukt DNA obejmujący w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz sekwencję heterologicznego DNA według wynalazku kodującą mRNA fosforybo-zylotransferazy chinolanowej, przy czym heterologiczny DNA jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
Wynalazek również dotyczy rośliny transgenicznej z rodzaju Nicotiana o zwiększonej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z komórką niestransformowanej rośliny kontrolnej, przy czym komórka rośliny transgenicznej jest potomkiem komórki roślinnej według wynalazku.
PL 201 266 B1
W zakres wynalazku również wchodzi sposób zwię kszania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, który obejmuje:
hodowlę komórki roślinnej stransformowanej egzogennym DNA, przy czym egzogenny DNA obejmuje sekwencję DNA według wynalazku i koduje fosforybozylotransferazę chinolanową.
W korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku stransformowana komórka roś linna uzyskana jest sposobem obejmującym: integrację do genomu komórki roślinnej gospodarza konstruktu egzogennego DNA obejmującego, w kierunku transkrypcji, promotor działający w tej komórce roślinnej, sekwencję heterologicznego DNA według wynalazku kodującą fosforybozylotransferazę chinolanową funkcjonującą w tej komórce, która to sekwencja heterologicznego DNA jest połączona funkcjonalnie z promotorem oraz obszarem terminacji transkrypcji działającym w tej komórce, co prowadzi do uzyskania stransformowanej komórki roślinnej.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania rośliny tytoniu o zwiększonym poziomie nikotyny w liściach który obejmuje:
hodowlę rośliny tytoniu, lub jej roślin potomnych, przy czym roślina obejmuje komórki zawierające konstrukt z egzogennym DNA obejmujący obszar inicjacji transkrypcji funkcjonujący w tej roślinie oraz sekwencję heterologicznego DNA według wynalazku funkcjonalnie połączoną z obszarem inicjacji transkrypcji, przy czym sekwencja heterologicznego DNA koduje fosforybozylotransferazę chinolanową działającą w tych komórkach.
Wynalazek również dotyczy produktu tytoniowego obejmującego komórkę roślinną tytoniu według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również produkt tytoniowy wytworzony z roś liny tytoniu według wynalazku.
Wynalazek również dotyczy zastosowania komórki roślinnej tytoniu według wynalazku do wytwarzania produktu tytoniowego.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania rośliny tytoniu według wynalazku do wytwarzania produktu tytoniowego.
Na figurze 1 przedstawiono szlak biosyntetyczny prowadzący do nikotyny. Aktywności enzymatyczne regulowane przez Nic1 i Nic2 to QPRTaza (fosforybozylotransferaza chinolanowa) i PMTaza (metylotransferaza putrescynowa).
Na figurze 2A przedstawiona jest sekwencja nukleotydowa cDNA NtQPT1 (ID. SEKW. NR 1), w której sekwencja kodują ca (ID. SEKW. NR 3) został a zaznaczona duż ymi literami.
Na figurze 2B przedstawiona jest teoretyczna sekwencja aminokwasowa (ID. SEKW. NR 2) QPRTazy tytoniu kodowana przez cDNA NtQPT1.
Na figurze 3 porównano teoretyczną sekwencję aminokwasowa NtQPT1 z pokrewnymi sekwencjami z Rhodospirillium rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, człowieka i Saccharomyces cerevisiae.
Na figurze 4 przedstawione są wyniki komplementacji mutanta Escherichia coli pozbawionego fosforybozylotransferazy chinolanowej (TH265) przez cDNA NtQPT1. Komórki transformowano wektorem ekspresyjnym niosącym NtQPT1. Wzrost stransformowanych komórek TH265 wyrażających NtQPT1 na podłożu minimalnym wykazał, że NtQPT1 koduje QPRTazę.
Na figurze 5 porównane są poziomy nikotyny i względne poziomy mRNA NtQTP1 w stanie podstawowym w mutantach tytoniu Nic1 i Nic2: dzikim Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) Nici Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic2 Burley 21 (Nicl/Nic1 nic2/nic2) oraz Nic1 Nic2 Burley 21 (nic1/nic1 nic2/nic2). Zaczernione słupki oznaczają poziom transkryptów mRNA, ukośnie kreskowane słupki oznaczają poziom nikotyny.
Na figurze 6 przedstawiony jest wykres względnych poziomów mRNA NtQPT1 w czasie w ogłowionych roślinach tytoniu w porównaniu z kontrolnymi roślinami nieogłowionymi. Zaczernione słupki oznaczają poziom transkryptów mRNA, ukośnie kreskowane słupki oznaczają poziom nikotyny.
Nikotyna jest wytwarzana w roślinach tytoniu przez kondensację kwasu nikotynowego i 4-metyloaminobutanalu. Szlak biosyntetyczny prowadzący do wytworzenia nikotyny jest przedstawiony na figurze 1. Dwa loci regulatorowe (Nic1 i Nic2) działają jako kodominujące regulatory wytwarzania nikotyny. Analiza enzymatyczna korzeni pojedynczych i podwójnych mutantów Nic wykazuje, że aktywności dwóch enzymów, fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) i metylotransferazy putrescynowej (PMTazy) są wprost proporcjonalne do poziomów biosyntezy nikotyny. Porównanie aktywności enzymatycznej w tkankach tytoniu (korzeniu i kalusie) różniących się zdolnością syntezy nikotyny wykazuje, że aktywność QPRTazy jest ściśle skorelowana z zawartością nikotyny (Wagner i Wagner,
PL 201 266 B1
Planta 165:532 (1985)). Saunders i Bush W (Plant Physiol 64:236 (1979) wykazali, że poziom QPRTazy w korzeniach mutantów o niskim poziomie nikotyny jest proporcjonalny do poziomu nikotyny w liś ciach.
Niniejszy wynalazek obejmuje nową sekwencję cDNA (ID. SEKW. NR 1) kodującą roślinną fosforybozylotransferazę chinolanową (QPRTazę) o sekwencji ID. SEKW. NR 2. Ponieważ aktywność QPRTazy jest ściśle skorelowana z zawartością nikotyny, konstrukcja transgenicznych roślin tytoniu, w których poziom QPR-Tazy w korzeniach roś lin jest obniż ony (w porównaniu z poziomem w roś linach dzikich) daje w rezultacie rośliny o obniżonym poziomie nikotyny w liściach. Niniejszy wynalazek umożliwia wytworzenie takich roślin transgenicznych wykorzystując odpowiednie sposoby i konstrukty kwasów nukleinowych. Sposoby takie obejmują ekspresję antysensownego RNA NtQPT1, co obniża ilość QPRTazy w korzeniach rośliny. Nikotyna znajduje się również w innych niż tytoń gatunkach i rodzinach roś lin, jednak jej zawartość jest zwykle znacznie niż sza niż w N. tabacum.
Wynalazek dotyczy również sensownych i antysensownych zrekombinowanych cząsteczek DNA kodujących QPRTazę lub cząsteczki antysensownego RNA QPRTazy, oraz wektorów zawierających te zrekombinowane cząsteczki DNA, a także transgenicznych komórek roślinnych i roślin stransformowanych tymi cząsteczkami DNA i wektorami. Transgeniczne komórki tytoniu i rośliny według tego wynalazku charakteryzują się obniżoną lub podwyższoną zawartością nikotyny w porównaniu z niestransformowanymi kontrolnymi komórkami i roś linami tytoniu.
Rośliny tytoniu o wyjątkowo niskim poziomie wytwarzania nikotyny, lub niewytwarzające nikotyny są atrakcyjne jako biorcy transgenów wyrażających cenne handlowo produkty takie jak środki farmaceutyczne, składniki kosmetyczne lub dodatki do żywności. Tytoń jest atrakcyjny jako roślina biorcy dla transgenu kodującego pożądany produkt, ponieważ tytoń łatwo podddaje się technikom inżynierii genetycznej i produkuje bardzo znaczną biomasę z akra. Rośliny tytoniu, w których zminiejszone są zasoby przeznaczane na wytworzenie nikotyny przeznaczają odpowiednio więcej dostępnych im zasobów na wytwarzanie produktów transgenu. Sposoby transformacji tytoniu transgenami wytwarzającymi pożądane produkty są znane w dziedzinie i odpowiednie techniki można zastosować wobec roślin tytoniu o niskiej zawartości nikotyny według wynalazku.
Rośliny tytoniu według wynalazku o obniżonej ekspresji QPRTazy i obniżonym poziomie nikotyny są korzystne do wytwarzania produktów tytoniowych o obniżonej zawartości nikotyny. Rośliny tytoniu według wynalazku są odpowiednie do wykorzystania w każdym tradycyjnym produkcie tytoniowym, obejmującym, lecz nie wyczerpująco: tytoń fajkowy, cygarowy i papierosowy, a także tytoń do żucia, i który może być w postaci obejmującej tytoń liściasty, siekany lub cięty.
Konstrukty według tego wynalazku mogą być również przydatne do wytwarzania roślin transgenicznych o podwyższonym poziomie ekspresji QPRTazy i zwiększonej zawartości nikotyny w roślinie. Takie konstrukty, sposoby wykorzystujące te konstrukty oraz rośliny tak uzyskane mogą być korzystne w wytwarzaniu produktów tytoniowych o zmienionej zawartoś ci nikotyny, lub w wytwarzaniu roś lin, których zawartość nikotyny jest zwiększona ze względu na jej działanie owadobójcze.
Twórcy wykazali, że gen TobRD2 (patrz Conkling i wsp., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) koduje QPRTazę Nicotiana tabacum i przedstawili w opisie sekwencję cDNA NtQPT1 (dawniej nazywaną TobRD2) oraz sekwencję aminokwasową kodowanego enzymu. Porównanie sekwencji aminokwasowej NtQPT1 z bazą danych GenBank wykazuje ograniczone podobieństwo sekwencji do białek bakteryjnych kodujących fosforybozylotransferazę chinolanową (QPRTazę) (figura 3).
Fosforybozylotransferaza chinolanową jest niezbędna do biosyntezy de novo dinukleotydu nikotynoadeninowego (NAD) zarówno u prokariontów, jak i eukariontów. W tytoniu wysoki poziom QPRTazy wykrywa się w korzeniach, lecz nie w liściach. W celu stwierdzenia, że NtQPT1 koduje QPRTazę twórcy wykorzystali szczep bakterii Escherichia coli (TH265), mutanta pozbawionego fosforybozylotransferazy chinolanowej (nadCT) Mutant ten nie jest w stanie rosnąć na podłożu minimalnym pozbawionym kwasu nikotynowego. Jednakże ekspresja białka NtQPT1 w tym szczepie bakterii nadała mu fenotyp NadC* (figura 4) potwierdzając, że NtQPT1 koduje QPRTazę.
Twórcy zbadali efekty mutacji Nic1 i Nic2 u tytoniu, oraz wpływ ogławiania roślin tytoniu na podstawowy poziom mRNA NtQPT1 i poziom nikotyny. (Zniesienie dominacji wierzchołkowej przez ogławianie na początku fazy kwitnienia, jak dobrze wiadomo, daje w rezultacie zwiększony poziom biosyntezy i transportu nikotyny u tytoniu i jest standardową praktyką przy produkcji tytoniu.) Jeżeli NtQPT1 jest istotnie zaangażowany w biosyntezę nikotyny, oczekuje się, że (1) poziom mRNA NtQPT1 będzie niższy w podwójnych mutantach Nic1/Nic2 i 92) poziom mRNA NtQPT1 wzrośnie po ogłowieniu. Stwierdzono, że poziom mRNA NtQPT1 w podwójnych mutantach Nic1/Nic2 wynosi około 25% poPL 201 266 B1 ziomu dzikiego (figura 5). Ponadto, w ciągu sześciu godzin po ogłowieniu, poziom mRNA NtQPT1 w roślinach tytoniu wzrósł około oś miokrotnie. Tym samym stwierdzono, że NtQPT1 jest kluczowym genem regulatorowym szlaku biosyntezy nikotyny.
Transgeniczne komórki roślinne i rośliny
Regulacja ekspresji genów w genomach komórek roślinnych może być osiągnięta przez integrację heterologicznego DNA pod kontrolą transkrypcyjną promotora, który jest funkcjonalny u gospodarza, i w którym transkrybowana nić heterologicznego DNA jest komplementarna do nici DNA transkrybowanej z endogennego genu podlegającego regulacji. Wprowadzony DNA, określany jako antysensowny DNA, dostarcza sekwencji RNA, która jest komplementarna do naturalnie wytworzonego (endogennego) mRNA, i która hamuje ekspresję endogennego mRNA. Mechanizm takiej regulacji ekspresji genu przez antysens nie jest całkowicie zrozumiany. Nie chcąc ograniczać się do teorii, warto zauważyć, że jedna z hipotez antysensownej regulacji proponuje, że transkrypcja antysensownego DNA wytwarza cząsteczki RNA, które wiążą się i zapobiegają lub hamują transkrypcję endogennych cząsteczek mRNA.
Produkt antysensowny może być komplementarny do obszarów kodujących lub niekodujących (lub obu) naturalnie występującego docelowego RNA. Konstrukt antysensowny może być wprowadzony do komórek roślinnych w dowolny odpowiedni sposób i może być włączony do genomu rośliny dla indukowalnej lub konstytutywnej transkrypcji sekwencji antysensownej. Patrz np. patenty USA nr 5,453,566 i 5,107,065 dla Shrewmakerowi i wsp. (włączone niniejszym w całości przez odniesienie).
W znaczeniu tu uż ywanym egzogenny lub heterologiczny DNA (lub RNA) odnosi się do DNA (lub RNA), który został wprowadzony do komórki (lub przodka komórki) przez człowieka. Taki heterologiczny DNA może być kopią sekwencji, która naturalnie występuje w transformowanej komórce, lub jej fragmentem.
Dla wytworzenia rośliny tytoniu o obniżonym poziomie QPR-Tazy, a tym samym niższej zawartości nikotyny niż niestransformowana kontrolna roślina tytoniu, komórka tytoniu może być stransformowana egzogenną antysensowną jednostką transkrypcyjną obejmująca częściową sekwencję cDNA QPRT, pełnej długości sekwencję cDNA QPRT, częściową sekwencję chromosomową QPRT lub pełną sekwencję chromosomową QPRT, w orientacji antysensownej z odpowiednimi przyłączonymi funkcjonalnie sekwencjami regulatorowymi. Odpowiednie sekwencje regulatorowe obejmują sekwencję inicjacji transkrypcji (promotor) funkcjonującą w transformowanej roślinie oraz sekwencję poliadenylacji i terminacji transkrypcji. Standardowe techniki, takie jak mapowanie restrykcyjne, hybrydyzacja typu Southerna i analiza sekwencji nukleotydowych są następnie stosowane do zidentyfikowania klonów niosących sekwencje QPRTazy w orientacji antysensownej, funkcjonalnie połączonych z sekwencjami regulatorowymi. Rośliny tytoniu są następnie regenerowane z poprawnie stransformowanych komórek. Najkorzystniej sekwencja antysensowna jest komplementarna do sekwencji endogennej, drobne rozbieżności między sekwencjami endogennymi i egzogennymi mogą jednak być tolerowane. Korzystnie antysensowna sekwencja DNA wykazuje wystarczające podobieństwo sekwencji i może wiązać się z endogenną sekwencją w regulowanej komórce w ostrych warunkach opisanych poniżej.
Technika antysensowna została użyta w kilku laboratoriach do wytworzenia roślin transgenicznych charakteryzujących się niższą niż normalna ilością konkretnych enzymów. Na przykład, rośliny o obniż onym poziomie syntazy chalkonu, enzymu szlaku biosyntezy barwnika kwiatów, uzyskano przez wstawienie antysensownego genu syntazy chalkonu do genomu tytoniu i petunii. Takie transgeniczne rośliny tytoniu i petunii wytwarzają kwiaty o jaśniejszym niż normalne zabarwieniu (Van der Kroi i wsp., An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmenetation, Nature, 333, pp. 866-69 (1988)). Technologię antysensownego RNA zastosowano również z sukcesem do zahamowania produkcji enzymu poligalaktouronazy w pomidorach (Smith i wsp., Antisense RNA Inhibition of Polygalactouronase Gene Expression in transgenic Tomatoes, Nature, 334, pp. 724-26 (1988); Sheehy i wsp., Reduction of Polygalactouronase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, pp. 8805-09 (1988)), a także małej podjednostki enzymu karboksylazy rybulozobisfosforanu w tytoniu (Rodermel i wsp., Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants, Cell, 55, pp. 673-81 (1988)). Alternatywnie, rośliny transgeniczne cechujące się większą niż normalnie ilością danego enzymu mogą być wytworzone przez transformację roślin genem kodującym ten enzym w sensownej (tzn. normalnej) orientacji. Poziom nikotyny w transgenicznych roślinach tytoniu według wynalazku może być wykrywany standardowymi metodami oznaczenia nikotyny. Stransformowane rośliny, w których poziom QPRTazy jest obniżony w porównaniu z niestransformowanymi
PL 201 266 B1 roślinami kontrolnymi, będą odpowiednio miały obniżony poziom nikotyny w porównaniu z kontrolą; stransformowane rośliny, w których poziom QPRTazy jest zwiększony w porównaniu z niestransf ormowanymi roślinami kontrolnymi, będą odpowiednio miały podwyższony poziom nikotyny w porównaniu z kontrolą.
Heterologiczna sekwencja użyta w sposobach wykorzystujących metody antysensowne może być wybrana tak, by wytwarzać produkt RNA komplementarny do całej sekwencji mRNA QPRTazy, lub do jej fragmentu. Sekwencja może być komplementarna do dowolnej ciągłej sekwencji naturalnego informacyjnego RNA, to znaczy może być komplementarna do endogennej sekwencji mRNA bliskiej końcowi 5', czyli miejscu przyłączenia czapeczki, leżącej poniżej miejsca przyłączenia czapeczki, pomiędzy miejscem przyłączenia czapeczki a kodonem inicjacyjnym, i może pokrywać całość, lub tylko fragment obszaru niekodującego, może obejmować obszar niekodujący i kodujący, być komplementarna do całości, lub fragmentu obszaru kodującego, komplementarna do końca 3' obszaru kodującego, lub komplementarna do 3' nietranslowanego obszaru mRNA. Odpowiednie sekwencje antysensowne mogą liczyć co najmniej od około 13 do około 15 nukleotydów, co najmniej od około 16 do około 21 nukleotydów, co najmniej około 20 nukleotydów, co najmniej około 30 nukleotydów, co najmniej około 50 nukleotydów, co najmniej około 75 nukleotydów, co najmniej około 100 nukleotydów, co najmniej około 125 nukleotydów, co najmniej około 150 nukleotydów, co najmniej około 200 nukleotydów, lub więcej. Dodatkowo, sekwencje mogą być wydłużone lub skrócone na końcach 3' lub 5'.
Konkretna sekwencja antysensowna i długość sekwencji antysensownej będą zmienne w zależności od stopnia pożądanego hamowania, stabilności sekwencji antysensownej itp. Specjalista w tej dziedzinie wykorzysta dla wyboru odpowiednich sekwencji antysensownych QPRTazy dostępne w nauce techniki oraz dostarczone tu informacje. W odniesieniu do figury 2A oraz ID. SEKW. NR 1 odpowiedni oligonukleotyd może być ciągłym fragmentem sekwencji cDNA QPRTazy w orientacji antysensownej o dowolnej długości wystarczającej dla uzyskania pożądanego efektu po transformacji do komórki roślinnej biorcy.
Wynalazek niniejszy może również zostać wykorzystany w metodach sensownej kosupresji wytwarzania nikotyny. Sensowne DNA użyte w niniejszym wynalazku mają wystarczającą długość, aby przy ekspresji w komórkach roślinnych, suprymować natywną ekspresję roślinnego białka QPRTazy w komórkach roślinnych, tak jak tu opisano.
Takie sensowne DNA mogą być zasadniczo pełnymi genomowymi lub komplementarnymi DNA kodującymi enzym QPRTazę, lub ich fragmentem, przy czym fragmenty te mają co najmniej 15 nukleotydów długości. Metody oceniania długości sensownego DNA dającego w rezultacie supresję ekspresji natywnego genu są dostępne biegłym w tej dziedzinie.
Możliwe jest transformowanie komórek rośliny Nicotiana konstruktem DNA zawierającym segment DNA kodujący enzymatyczną cząsteczkę RNA (tzn. rybozym), które to enzymatyczne cząsteczki RNA są skierowane przeciwko, tzn. przecinają, transkrypt mRNA DNA kodujący roślinną QPRTazę jak tu opisano. Rybozymy zawierają domenę wiązania substratu, które wiążą się z dostępnymi obszarami docelowego mRNA, oraz domeny katalizujące cięcie RNA, uniemożliwiając translację i wytwarzanie biał ka. Domeny wiążące mogą obejmować sekwencje antysensowne komplementarne do docelowych sekwencji mRNA; motyw katalityczny może być motywem typu młotka (hammerhead) lub innym motywem, takim jak motyw szpilki do włosów. Miejsca cięcia przez rybozym w docelowym mRNA mogą być wstępnie zidentyfikowane przez wyszukanie w docelowej cząsteczce miejsc cięcia przez rybozym (np. sekwencji GUA, GUU lub GUC). Po zidentyfikowaniu, krótkie sekwencje RNA o dł ugoś ci 15, 20, 30 lub wię cej rybonukleotydów odpowiadają ce obszarowi docelowego genu zawierającemu miejsce cięcia, mogą być rozpatrzone pod kątem przewidywanych cech strukturalnych. Odpowiedniość potencjalnych celów może być również oceniona przez badanie ich dostępności dla hybrydyzacji z komplementarnymi oligonukleotydami, przy zastosowaniu znanych w technice testów ochrony przed rybonukleazami.
DNA kodujący enzymatyczne cząsteczki RNA może być wytworzony odpowiednio, przy użyciu znanych technik. Patrz np. T. Cech i wsp., patent USA nr 4,987,071; Keene i wsp., patent USA nr 5,559,021; Donson i wsp., patent USA nr 5,589,367; Torrence i wsp., patent USA nr 5,583,032; Joyce, patent USA nr 5,580,967; Gold i wsp., patent USA nr 5,595,877; Wagner i wsp., patent USA nr 5,591,601; oraz patent USA nr 5,622,854 (których treść jest niniejszym włączona w całości przez odniesienie). Wytwarzanie takiej enzymatycznej cząsteczki RNA w komórce roślinnej i zakłócenie wytwarzania białka QPRTazy zmniejsza aktywność QPRTazy w komórkach roślinnych w sposób zasadniczo taki sam, jak wytwarzanie antysensownej cząsteczki RNA, to znaczy przez zakłócenie translacji mRNA
PL 201 266 B1 w komórce wytwarzającej enzym. Termin rybozym jest tu użyty dla opisania zawierającego RNA kwasu nukleinowego, który działa jako enzym (taki, jak endorybonukleaza), i może być używany zamiennie z terminem enzymatyczna cząsteczka RNA. Sekwencje kwasów nukleinowych zastosowane w rozwią zaniach wedł ug wynalazku obejmują sekwencje wykazują ce podobień stwo do Id Sekw. nr 1 i kodują ce biał ko wykazują ce aktywność fosforybozylotransferazy chinolanowej. Definicja ta w zamierzeniu obejmuje naturalną zmienność alleliczną białek QPRTazy. Tak więc, sekwencje DNA hybrydyzujące z DNA Id Sekw. nr 1 i kodujące ekspresję QPRTazy, w szczególności roślinnych enzymów QPRTazy, mogą być również zastosowane w rozwiązaniach według wynalazku.
Może istnieć wiele form enzymu QPRTazy tytoniu. Istnienie wielu form enzymu może być związane z posttranslacyjną modyfikacją produktu pojedynczego genu lub z istnieniem wielu form genu NtQPT1.
Warunki umożliwiające hybrydyzację innych sekwencji DNA kodujących ekspresję białek wykazujących aktywność QPRTazy z DNA Id Sekw. nr 1 lub innymi sekwencjami DNA kodującymi białko podane jako Id Sekw. nr 2, mogą być ustalone w rutynowy sposób. Na przykład, hybrydyzacja takich sekwencji może być przeprowadzona w warunkach o obniżonej ostrości, lub nawet w warunkach ostrych (np. warunkach reprezentowanych przez ostrość płukania w 0,3M NaCl, 0,03M cytrynianie sodu, 0,1% SDS w 60°C lub nawet w 70°C do DNA kodującego białko podane tu jako Id Sekw. nr 2 w standardowym teście hybrydyzacji in situ Patrz. J. Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Ogólnie, takie sekwencje będą przynajmniej w 65% podobne, w 75% podobne, w 80% podobne, w 85% podobne, w 90% podobne, a nawet w podobne 95% lub wię cej, do sekwencji podanej tu jako Id Sekw. nr 1, lub sekwencji DNA kodujących białko o Id Sekw. nr 2. (Wyznaczenie podobieństwa sekwencji dokonuje się przy dopasowaniu obu sekwencji dla uzyskania najwyższej zgodności; dopuszczalne są luki w którejkolwiek z dwóch dopasowywanych sekwencji dla maksymalizacji zgodności. Luki o długości 10 lub mniej są korzystne, luki o długości 5 lub mniej są korzystniejsze, a luki o długości 2 lub mniej są jeszcze korzystniejsze.)
Dostępne są procedury hybrydyzacji różnicowej, które pozwalają na izolację klonów cDNA, których poziomy mRNA są w granicach około 0,05% poli (A+) RNA. Patrz M. Conkling i wsp., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). W skrócie, biblioteki cDNA są przeszukiwane przy użyciu jednoniciowych sond cDNA z poddanego odwrotnej transkrypcji mRNA z tkanki roślinnej (np. korzeni i/lub liści). Dla przeszukiwania różnicowego membranę nitrocelulozową lub nylonową moczy się w 5xSSC, umieszcza w 96-studzienkowym aparacie próżniowym, 150 μL stacjonarnej nocnej hodowli przenosi się z płytki wzorcowej do każdej studzienki i próżnię włącza się aż do całkowitego przejścia cieczy przez filtr. 150 μL roztworu denaturującego (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) umieszcza się w każdej studzience przy użyciu wielokanałowej pipety i pozostawia na około 3 minuty. Włącza się ssanie jak powyżej i filtr usuwa oraz neutralizuje w 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Następnie zapieka się go przez 2 godziny in vacuo i inkubuje z odpowiednimi sondami. Przy użyciu filtrów nylonowych i przechowywaniu płytek wzorcowych w -70°C w 7% DMSO filtry mogą być przeszukiwane wielokrotnie różnymi sondami, zaś odpowiednie klony odzyskane po kilkuletnim przechowywaniu.
W użytym tu znaczeniu termin gen oznacza sekwencję DNA która obejmuje (1) leżące powyżej (5') sygnały regulatorowe, w tym promotor, (2) obszar kodujący wyznaczający produkt genu, białkowy lub RNA, (3) leżące poniżej (3') obszary zawierające sygnały terminacji transkrypcji i poliadenylacji oraz (4) związane sekwencje wymagane dla wydajnej i specyficznej ekspresji.
Sekwencja DNA według tego wynalazku może obejmować zasadniczo sekwencję tu dostarczoną (Id Sekw. nr 1), lub równoważną sekwencję nukleotydową reprezentującą allele lub warianty polimorficzne tych genów, lub ich obszarów kodujących.
Użycie zwrotu istotne podobieństwo sekwencji w przedstawionym opisie i zastrzeżeniach oznacza, że sekwencje DNA, RNA lub aminokwasowe, które posiadają niewielkie i nieistotne różnice w sekwencji w porównaniu z właściwymi sekwencjami tutaj opisanymi i zastrzeżonymi są uważane za równoważne z sekwencjami według wynalazku. W tym aspekcie, niewielkie i nieistotne różnice w sekwencji oznaczają, że podobne sekwencje (tzn. sekwencje posiadające istotne podobieństwo sekwencji z DNA, RNA lub białkami tutaj opisanymi i zastrzeżonymi) będą funkcjonalnie równoważne z sekwencjami opisanymi i zastrzeżonymi w wynalazku. Funkcjonalnie równoważne sekwencje będą działały w zasadniczo ten sam sposób w wytwarzaniu zasadniczo tej samej kompozycji jak nukleotydowe i aminokwasowe kompozycje opisane i zastrzeżone.
PL 201 266 B1
Dostarczone sekwencje DNA mogą być transformowane do szeregu różnych komórek gospodarzy. Różnorodne odpowiednie komórki gospodarzy o odpowiednich pożądanych charakterystykach hodowli i manipulacji są swobodnie dostępne w technice.
Użycie zwrotu wyizolowany lub zasadniczo czysty w przedstawionej specyfikacji i zastrzeżeniach jako określenia dla DNA, RNA, polipeptydów lub białek oznacza, że DNA, RNA, polipeptydy lub białka tak opisane zostały wydzielone z ich środowiska komórkowego in vivo przez działanie człowieka.
W znaczeniu tu użytym natywna sekwencja DNA lub naturalna sekwencja DNA oznacza sekwencję DNA, która może być wyizolowana z nietransgenicznych komórek lub tkanki. Natywne sekwencje DNA to takie, które nie zostały sztucznie zmienione, na przykład przez mutagenezę ukierunkowaną. Po zidentyfikowaniu natywnych sekwencji DNA, cząsteczki DNA mające natywne sekwencje DNA mogą być chemicznie syntetyzowane lub wytwarzane przy użyciu procedur rekombinacji DNA znanych w technice. W użytym tu znaczeniu, natywna sekwencja DNA rośliny jest taką, która może być wyizolowana z nietransgenicznych komórek lub tkanki rośliny. W użytym tu znaczeniu, natywna sekwencja DNA tytoniu jest taką, która może być wyizolowana z nietransgenicznych komórek lub tkanki tytoniu.
Konstrukty DNA, lub kasety transkrypcyjne wynalazku obejmują, od końca 5' do 3' w kierunku transkrypcji, promotor, sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z promotorem, oraz ewentualnie sekwencję terminacji zawierającą sygnał stop dla polimerazy RNA oraz sygnał poliadenylacji dla poliadenylazy. Wszystkie te obszary regulacyjne powinny być zdolne do działania w komórkach tkanki, która ma być transformowana. Dowolny odpowiedni sygnał terminacyjny może być zastosowany w realizacji przedstawionego wynalazku, przykłady takich obejmują , lecz nie wyczerpują , terminator syntazy nopaliny (nos), terminator syntazy oktapiny (ocs), terminator CaMV, lub natywne sygnały terminacyjne uzyskane z tego samego genu, co obszar inicjacji transkrypcji, lub uzyskane z innego genu. Patrz np. Rezian i wsp. (1988) powyżej i Rodermel i wsp. (1988) powyżej.
Termin funkcjonalnie połączone, w użytym tu znaczeniu, odnosi się do sekwencji DNA na jednej cząsteczce DNA, które są połączone tak, by funkcjonowanie jednej było pod wpływem drugiej. Tak więc, promotor jest funkcjonalnie połączony z DNA wtedy, gdy jest zdolny do wpływu na transkrypcję tego DNA (tzn. DNA jest pod kontrolą transkrypcyjną tego promotora). O promotorze mówi się, że jest powyżej DNA, który z kolei jest określany jako będący poniżej promotora.
Kaseta transkrypcyjna może być dostarczona w konstrukcie DNA, który ma również co najmniej jeden system replikacyjny. Dla wygody, przyjęto stosować system replikacyjny działający w Escherichia coli taki, jak ColE1, pSC101, pACYC184 lub podobne. W ten sposób, na każdym etapie po każdej manipulacji uzyskany konstrukt może być klonowany, sekwencjonowany, i może być ustalona poprawność manipulacji. Dodatkowo, lub w miejsce systemu replikacji E. coli można zastosować system replikacji o szerokim zakresie gospodarza, taki jak systemy replikacyjne plazmidów niezgodności P-1, np. pRK290. Dodatkowo obok systemu replikacyjnego często obecny będzie przynajmniej jeden marker, który może być przydatny w jednym lub wielu gospodarzach, lub różne markery dla każdego z gospodarzy. To znaczy, jeden marker moż e być uż yty do selekcji w gospodarzu prokariotycznym, podczas gdy inny marker może być zastosowany do selekcji w gospodarzu eukariotycznym, w szczególności gospodarzu roślinnym. Markery te mogą zapewniać ochronę przed zabójczym czynnikiem takim, jak antybiotyki, toksyny, metale ciężkie, lub im podobne, może też zapewniać komplementację, przez nadanie prototrofii gospodarzowi auksotroficznemu, lub może nadać widoczny fenotyp przez wytwarzanie nowego związku w roślinie.
Różne fragmenty zawierające różne konstrukty, kasety transkrypcyjne, markery i im podobne, mogą być wprowadzane kolejno przez cięcie enzymami restrykcyjnymi odpowiedniego systemu replikacyjnego oraz wstawienie danego konstruktu w dostępne miejsce. Po ligacji i klonowaniu konstrukty DNA mogą być wyizolowane dla dalszej manipulacji. Wszystkie te techniki są odpowiednio wyszczególnione w literaturze, jak na przykład w J. Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)).
Wektory, które mogą być użyte do transformacji tkanki roślinnej konstruktami kwasów nukleinowych według przedstawionego wynalazku obejmują zarówno wektory Agrobacterium jak i wektory balistyczne, jak również wektory odpowiednie do transformacji za pośrednictwem DNA.
Termin promotor odnosi się do obszaru sekwencji DNA, która zawiera niezbędne sygnały dla wydajnej ekspresji sekwencji kodującej. Mogą zawierać się w tym sekwencje, z którymi wiąże się polimeraza RNA, lecz sekwencje te nie wyczerpują możliwości, w których mogą zawierać się obszary,
PL 201 266 B1 z którymi wiążą się inne białka regulacyjne wraz z obszarami zaangażowanymi w regulację translacji białka i mogące zawierać sekwencje kodujące.
Promotory zastosowane w realizacji tego wynalazku mogą być promotorami aktywnymi konstytutywnie. Dostępne są liczne konstytutywnie aktywne promotory działające w roślinach. Korzystnym przykładem jest promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora (Ca-MV), który jest wyrażany konstytutywnie w większości komórek roślinnych. Alternatywnie, promotorem moż e być promotor specyficzny dla korzenia, lub promotor specyficzny dla kory korzenia, jak wyjaśniono to bardziej szczegółowo poniżej.
Sekwencje antysensowne były wyrażane w transgenicznych roślinach tytoniu przy użyciu promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). Patrz np. Cornelissen i wsp., Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco, Nucleic Acids Res. 17, pp. 833-43 (1989); Rezaian i wsp., Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus, Plant Molecular Biology 11, pp. 463-71 (1988); Rodermel i wsp., Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants, Cell, 55, pp. 673-81 (1988); Smith i wsp., Antisense RNA Inhibition of Polygalactouronase Gene Expression in transgenic Tomatoes, Nature, 334, pp. 724-26 (1988); Van der Kroi i wsp., An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmenetation, Nature, 333, pp. 866-69 (1988).
Użycie promotora CaMV 35S dla ekspresji QPRTazy w transformowanych komórkach i roślinach tytoniu według tego wynalazku jest korzystne. Użycie promotora CaMV dla ekspresji innych zre-kombinowanych genów w korzeniach tytoniu zostało dobrze opisane (Lam i wsp., Site-Specific Mutations Alter In vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, pp. 7890-94 (1989); Poulsen i wsp. Dissection of 5' Upstream Sequences for Selec-tive Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene, Mol. Gen. Genet. 214, pp. 16-23 (1988)).
Inne promotory, które są aktywne wyłącznie w tkankach korzenia (promotory specyficzne dla korzenia) są również szczególnie wskazane w metodach według tego wynalazku, patrz np. Patent USA nr 5,459,252 dla Conklinga i wsp.; Yamamoto i wsp., The Plant Cell, 3:371 (1991). Specyficzny dla kory korzenia promotor TobRD2 może również być użyty. Patrz np. zgłoszenie patentowe USA SN 08/508,786, przyznane teraz dla Conkling i wsp.; PCT WO 9705261. Wszystkie cytowane tu patenty są w całości włączone jako odnośniki.
Zrekombinowane cząsteczki DNA i wektory QPRTazy wykorzystane do wytworzenia stransformowanych komórek i roślin tytoniu według tego wynalazku mogą dodatkowo zawierać dominujący gen markera selekcyjnego, odpowiednie dominujące markery selekcyjne do użycia w tytoniu obejmują, między innymi, geny oporności na antybiotyki kodujące fosfotransferazę neomycyny (NPTII), fosfotransferazę higromycyny (HPT) oraz acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT). Innym dobrze znanym dominującym markerem selekcyjnym do użycia w tytoniu jest zmutowany gen reduktazy dihydrifolianu, który koduje reduktazę dihydrofolianu oporną na methotrexat. Wektory DNA zawierające odpowiednie geny oporności na antybiotyki i odpowiednie antybiotyki są dostępne w handlu.
Stransformowane rośliny tytoniu są selekcjonowane z otaczającej populacji komórek niestransformowanych przez umieszczenie mieszanej populacji w podłożu hodowlanym zawierającym odpowiednie stężenie antybiotyku (lub innego związku normalnie toksycznego dla komórek tytoniu), na który wybrany dominujący C marker selekcyjny nadaje oporność. W ten sposób jedynie te komórki tytoniu, które zostały stransformowane przeżyją i będą się dzielić.
Sposoby wytwarzania zrekombinowanych roślin według wynalazku, ogólnie obejmują najpierw dostarczenie komórki roślinnej zdolnej do regeneracji (komórki roślinnej typowo zlokalizowanej w tkance zdolnej do regeneracji). Komórka roś linna jest nastę pnie transformowana konstruktem DNA zawierającym kasetę transkrypcyjną według tego wynalazku (jak to tu opisano) i odtwarzana zostaje ze stransformowanej komórki zrekombinowana roślina. Jak wyjaśniono poniżej, etap transformacji prowadzony jest technikami znanymi w dziedzinie, obejmującymi, lecz nie wyczerpywanymi przez, bombardowanie komórki roślinnej mikrocząstkami niosącymi kasetę transkrypcyjną, infekcję komórki Agrobacterium tumefaciens zawierającym plazmid Ti niosący kasetę transkrypcyjną, lub dowolną inną technikę odpowiednią dla wytworzenia rośliny transgenicznej.
Znane są liczne systemy wektorowe Agrobacterium przydatne w realizacji tego wynalazku. Na przykład w patencie USA nr 4,459,355 opisano sposób transformowania podatnych roślin, w tym dwuliściennych, szczepem Agrobacterium zawierającym plazmid Ti. Transformacja roślin drzewiastych wektorem Agrobacterium jest opisana w Patencie USA nr 4,795,855. Ponadto, Patent USA nr 4,490,838
PL 201 266 B1 przyznany dla Schilperoorta i wsp., opisuje binarny wektor Agrobacterium (tzn. taki, w którym Agrobacterium zawiera jeden plazmid posiadający obszar vir plazmidu Ti, lecz bez obszaru T, i drugi plazmid posiadający obszar T, lecz bez obszaru vir) przydatny w realizacji tego wynalazku.
Mikrocząstki niosące konstrukt DNA według tego wynalazku, które to mikrocząstki są odpowiednie do transformacji balistycznej komórki roślinnej, są również przydatne dla wytwarzania stransformowanych roślin według tego wynalazku. Mikrocząstka jest wprowadzona do komórki roślinnej dając stransformowaną komórkę roślinną, a roślina jest regenerowana ze stransformowanej komórki roślinnej. Dowolna odpowiednia metodologia i aparatura do transformacji balistycznej może być wykorzystana w praktykowaniu tego wynalazku. Przykładowa aparatura i procedury są opisane przez Sanford i Wolf, patent USA nr 4,945,050, oraz przez Christou i wsp., Patent USA nr 5,015,580. Przy użyciu procedur transformacji balistycznej, kaseta transkrypcyjna może być włączona w plazmid zdolny do replikacji w, lub do integracji do komórki mającej ulec transformacji. Przykłady mikrocząstek odpowiednich do zastosowania w takich systemach obejmują kulki złota o średnicy 1 do 5 μm. Konstrukt DNA może być osadzony na mikrocząstkach dowolną odpowiednią techniką, taka jak precypitacja.
Gatunki roślin mogą być transformowane konstruktem DNA według tego wynalazku przez transformację za pośrednictwem DNA protoplastów komórek roślinnych i następnie regenerację rośliny ze stransformowanych protoplastów zgodnie z procedurami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Fuzja protoplastów tytoniu z liposomami zawierającymi DNA lub przez elektroporację jest znana w tej dziedzinie (Shillito i wsp., Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation, Methods in Enzymology 153, pp. 313-36 (1987)).
W użytym tu znaczeniu, transformacja oznacza wprowadzenie egzogennego DNA do komórek, tak aby wytworzyć transgeniczne komórki stabilnie stransformowane egzogennym DNA.
Stransformowane komórki są indukowane do regeneracji kompletnych roślin tytoniu przy użyciu technik hodowli komórek tytoniu i technik hodowli tkankowej, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Metodę regeneracji rośliny wybiera się tak, aby była ona zgodna z metodą transformacji. Stabilna obecność i orientacja sekwencji QPRTazy w transgenicznych roślinach tytoniu może być zweryfikowana przez mendlowski dziedziczenie sekwencji QPRTazy, stwierdzone standardowymi metodami analizy DNA zastosowanymi do potomstwa uzyskanego z kontrolowanych krzyżówek. Po regeneracji transgenicznych roślin tytoniu ze stransformowanych komórek, wprowadzona sekwencja DNA jest łatwo przenoszona do innych odmian tytoniu przez konwencjonalne techniki hodowli roślin i bez zbędnych eksperymentów.
Dla przykładu, w celu przeanalizowania segregacji transgenu, zregenerowane stransformowane rośliny (R0) mogą być hodowane do osiągnięcia dojrzałości, zbadane pod kątem poziomu nikotyny i skrzyżowane wsobnie dla wytworzenia roślin R1. Pewna ilość roślin R1 niosących transgen jest homozygotyczna względem transgenu. W celu identyfikacji homozygotycznych roślin R1, transgeniczne rośliny R1 są hodowane do osiągnięcia dojrzałości i krzyżowane wsobnie. Homozygotyczne rośliny R1 wytworzą potomstwo R2, w którym każda roślina potomna niesie transgen; potomstwo heterozygotycznych roślin R1 będzie segregować w stosunku 3:1.
Ponieważ nikotyna służy jako naturalny pestycyd, który pomaga ochronić rośliny tytoniu przed uszkodzeniem przez szkodniki, może okazać się pożądane dodatkowe stransformowanie roślin o niskim poziomie nikotyny, lub pozbawionych nikotyny, wytworzonych przedstawionym sposobem, transgenem (takim, jak Bacillus thuringiensis), który zapewni dodatkową ochronę przed owadami.
Korzystnymi gatunkami do użycia w przedstawionym sposobie są gatunki Nicotiana, czyli tytoniu, w tym N. tabacum, N. rustica i N. glutinosa. Można użyć każdego szczepu czy odmiany tytoniu. Korzystne są szczepy, które już mają niską zawartość nikotyny, takie jak podwójne mutanty Nic1/Nic2.
Dowolna tkanka roślinna zdolna do dalszej propagacji klonalnej, czy to przez organogenezę, czy też embriogenezę, może być transformowana wektorem według tego wynalazku. Termin organogeneza, w użytym znaczeniu, oznacza proces, w którym rozwijają się łodygi i korzenie rozwijają się kolejno z centrów merystematycznych; temin embriogeneza, w użytym znaczeniu, oznacza proces w którym łodygi i korzenie rozwijają się razem w skoordynowany sposób (nie kolejno), czy to z komórek somatycznych, czy z gamet. Wybór konkretnej tkanki będzie zależał od systemów propagacji klonalnej dostępnych i najlepiej przystosowanych do konkretnego transformowanego gatunku. Przykładowe docelowe tkanki obejmują krążki liściowe, pyłek, zarodki, liścienie, hipokotyle, tkankę kallusową, istniejące tkanki merystematyczne (np. merystemy wierzchołkowe, pomocnicze stożki wzrostu i merystemy korzeniowe) oraz zaindukowane tkanki merystematyczne (np. merystem liścienia i merystem hipokotyla).
PL 201 266 B1
Rośliny według tego wynalazku mogą przyjmować różnorodne formy. Rośliny mogą być chimerami stransformowanych i niestransformowanych komórek; rośliny mogą być klonalnymi transformantami (np. wszystkie komórki stransformowane i zawierające kasetę transkrypcyjną); rośliny mogą zawierać przeszczepy stransformowanej i niestransformowanej tkanki (np. stransformowany podkład korzeniowy z przeszczepionym niestransformowanym zrazem w gatunkach cytrusów). Stransformowane rośliny mogą być propagowane na wiele sposobów, takich jak klonalna propagacja lub klasyczne techniki hodowli. Na przykład, pierwsze pokolenie (lub T1) stransformowanych roślin może być skrzyżowane wsobnie by wytworzyć homozygotyczne drugie pokolenie (lub t2) stransformowanych roślin, zaś rośliny T2 dalej propagowane przez klasyczne techniki hodowli. Dominujący marker selekcyjny (taki jak nptll) może być związany z kasetą transkrypcyjną dla ułatwienia hodowli.
W świetle powyższego jest oczywiste, że rośliny, które można stosować w rozwiązaniach według wynalazku obejmują te należące do rodzaju Nicotiana.
Zaznajomieni z metodami rekombinacji DNA opisanymi powyżej zauważą, że można do konstrukcji transgenicznych komórek i roślin tytoniu wykorzystać pełnej długości cząsteczkę cDNA QPRTazy lub pełnej długości gen chromosomowy QPRTazy, połączone w orientacji sensownej z odpowiednimi połączonymi funkcjonalnie sekwencjami regulatorowymi. (Biegli w tej dziedzinie zauważą też, że odpowiednie sekwencje regulatorowe dla ekspresji genów w orientacji sensownej obejmują dowolne znane eukariotyczne sekwencje startu translacji, w połączeniu z promotorem i sekwencjami poliadenylacji i terminacji transkrypcji opisanymi powyżej). Takie stransformowane rośliny tytoniu charakteryzują się podwyższonym poziomem QPRTazy, a zatem wyższą zawartością nikotyny niż niestransformowane kontrolne rośliny tytoniu.
Należy zatem rozumieć, że użycie sekwencji DNA QPRTazy dla zmniejszenia lub zwiększenia poziomu enzymu QPRT, i tym samym zmniejszenia lub zwiększenia zawartości nikotyny w roślinach tytoniu wchodzi w zakres niniejszego wynalazku.
W uż ytym tu znaczeniu, uprawa oznacza wiele ro ś lin wedł ug wynalazku i należących do tego samego rodzaju, posadzonych razem w polu uprawnym. Przez pole uprawne rozumie się zwykły obszar ziemi lub szklarnię. Tak więc, wynalazek niniejszy pozawala na prowadzenie uprawy roślin posiadających zmienioną aktywność QPRTazy, a tym samym wykazujących zwiększony lub zmniejszony poziom zawartości nikotyny w porównaniu z podobną uprawą składającą się z niestransformowanych roślin tego samego gatunku i odmiany.
Poniżej zamieszczone przykłady mają na celu zilustrowanie wynalazku a nie ograniczenie jego zakresu.
P r z y k ł a d 1
Izolacja i sekwencjonowanie cDNA TobRD2 (Conkling i wsp., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) zsekwencjonowano i dostarczono tu jako ID. SEKW. NR 1, zaś teoretyczną sekwencję aminokwasową jako ID. SEKW. NR 2. Dla teoretycznej sekwencji aminokwasowej przewidziano, że jest ona białkiem cytosolowym. Mimo, że nie były wcześniej znane roślinne geny QPTazy, porównania sekwencji aminokwasowej NtPT1 z bazą danych GenBank (figura 3) wykazały ograniczone podobieństwo sekwencji do pewnych białek bakteryjnych i innych; aktywność fosforybozylotransferazy (QPRTazy) wykazano dla genów S. typhimurium, E. coli i N. tabacum. Kodowana przez NtQPT1 QPRTaza wykazuje podobieństwo do przewidywanego fragmentu peptydowego kodowanego przez EST (etykietę sekwencji wyrażanej) Arabidopsis (numer dostępu GenBank F20096), która może stanowić część genu QPTazy Arabidposis.
P r z y k ł a d 2
Hybrydyzacje in situ
W celu wyznaczenia przestrzennego rozmieszczenia transkryptów mRNA TobRD2 w róż nych tkankach korzenia przeprowadzono hybrydyzacje in situ w roślinach niestransformowanych. Hybrydyzacje in situ antysensownej nici TobRD2 z mRNA TobRD2 w tkance korzenia przeprowadzono z użyciem technik opisanych przez Meyerowitz i wsp., Plant Mol. Biol. Rep. 5,242 (1987) oraz Smith i wsp., Plant Mol. Biol. Rep. 5,237 (1987). Korzenie siedmiodniowych siewek tytoniu (Nicotiana tabacum) utrwalono w glutaraldehydzie buforowanym fosforanem, zalano Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) i pocięto na skrawki grubości 8 mm dla uzyskania przekrojów poprzecznych i podłużnych. Jako sondy wykorzystano antysensowne transkrypty TobRD2, syntetyzowane in vitro w obecności 35S-ATP. Wyznakowany RNA poddano przed użyciem hydrolizie alkalicznej dla uzyskania fragmentów o średniej długości 100 do 200 zasad.
PL 201 266 B1
Hybrydyzacje prowadzono w 50% formamidzie przez 16 godzin w 42°C przy aktywności właściwej około 5x106 zliczeń na minutę (cpm) wyznakowanego RNA na mililitr roztworu hybrydyzacyjnego. Po ekspozycji, skrawki wywołano i wizualizowano przy użyciu mikroskopii w jasnym i ciemnym polu.
Sygnał hybrydyzacyjny był zlokalizowany w korowej warstwie komórek w korzeniach (wyniki nie przedstawione). Porównanie obrazów jasnego i ciemnego pola tych samych przekrojów zlokalizowało transkrypty TobRD2 w komórkach miękiszowych kory korzenia. Sygnał hybrydyzacyjny nie był widoczny w naskórku ani w walcu osiowym.
P r z y k ł a d 3
Poziom mRNA TobRD2 u mutantów tytoniu Nic1 i Nic2 i korelacja z poziomem nikotyny
Zbadano poziom podstwowy mRNA TobRD2 u mutantów roślin tytoniu Nic1 i Nic2. Wiadomo, że Nic1 i Nic2 regulują aktywność fosforybozylotransferazy chinolanowej i metylotransferazy putrescynowej i są kodominującymi regulatorami wytwarzania nikotyny. Przedstawione wyniki zilustrowano na figurach 5A i 5B, które to wskazują, że ekspresja TobRD2 jest regulowana przez Nic1 i Nic2.
RNA izolowano z korzeni dzikich roślin tytoniu Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2), korzeni Burley 21 Nic1 (nic1/nic1 Nic2/Nic2), korzeni Burley 21 Nic2 (Nic1/Nic1 nic2/nic2), oraz korzeni Burley 21 Nic1-Nic2 (nic1/nic1 nic2/nic2).
Cztery linie tytoniu Burley 21 (nic) hodowano z ziaren w glebie przez miesiąc i przeniesiono do komór hydroponicznych w napowietrzanym roztworze odżywczym na miesiąc. Linie te były izogeniczne, z wyjątkiem dwóch loci odpowiadających za niski poziom nikotyny i miały genotypy Nic1/Nic1
Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2. Korzenie zebrano z około 20 roślin każdego genotypu i połączono do izolacji RNA. Całkowity RNA (1 μg) z każdego genotypu poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym zawierającym 1,1 M formaldehyd i przeniesiono na filtr nylonowy według Sambrook i wsp. (1989). Filtry hybrydyzowano z wyznakowanymi 32P fragmentami cDNA To-bRD2. Względną ilość transkryptów TobRD2 zmierzono densytometrycznie. Figura 5 (zaczernione słupki) ilustruje względne poziomy transkryptu (w porównaniu z Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) dla każdego z czterech genotypów. Względna zawartość nikotyny (w porównaniu z Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) dla czterech genotypów przedstawiona jest ukośnie kreskowanymi słupkami.
Figura 5 graficznie porównuje względne podstawowe poziomy mRNA TobRD2, stosując poziom stwierdzony w dzikim Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) jako punkt odniesienia. Poziom mRNA TobRD2 w podwójnych mutantach Nic1/Nic2 wynosił około 25% poziomu w dzikim tytoniu. Na figurze 5B porównywane są względne poziomy nikotyny w prawie izogenicznych liniach tytoniu badanych w tym przykładzie (zaczernione słupki wskazują poziom transkryptu TobRD2, zakreskowane słupki wskazują poziom nikotyny). Występuje ścisła korelacja między poziomem nikotyny a poziomem transkryptu TobRD2.
P r z y k ł a d 4
Wpływ ogławiania na pozom mRNA TobRD2
Dobrze wiadomo, że usunięcie wierzchołka kwiatowego rośliny tytoniu (ogławianie) zwiększa wzrost korzeni i zwiększa zawartość nikotyny w liściach rośliny. Ogławianie rośliny jest standardową praktyką w przemysłowej uprawie tytoniu, najwłaściwszy czas ogławiania danej rośliny tytoniu przy znanych warunkach wzrostu może być łatwo ustalony przez osobę o normalnej biegłości w tej dziedzinie.
Rośliny tytoniu (N. tabacum SR1) hodowano z ziaren w glebie przez miesiąc i przeniesiono do doniczek zawierających piasek. Rośliny hodowano w szklarni przez kolejne dwa miesiące do momentu, gdy zaczęły rozwijać kwiaty. Wierzchołki kwiatowe wraz z dwoma węzłami usuwano następnie z czterech roślin (ogławianie). Fragment korzeni był zbierany z każdej z roślin po wskazanym czasie i łączony do ekstrakcji RNA. Rośliny kontrolne nie były dekapitowane. Całkowity RNA (1 μg) z każdego punktu czasowego poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym zawierającym 1,1 M formaldehyd i przeniesiono na filtr nylonowy według Sambrook i wsp. (1989). Filtry hybrydyzowano z wyznakowanymi 32P fragmentami cDNA TobRD2. Względną ilość transkryptów TobRD2 zmierzono densytometrycznie. Figura 6 ilustruje względne poziomy transkryptu (w porównaniu z czasem zero) dla każdego punktu czasowego z ogławianiem (słupki zaczernione) i bez ogławiania (słupki zakreskowane).
Względny poziom transkryptu TobRD2 wyznaczono w tkance korzenia w ciągu 24 godzin; wyniki przedstawiono na figurze 6 (zaczernione słupki wskazują poziom transkryptu TobRD2 w roślinach ogłowionych, zakreskowane słupki wskazują poziom transkryptu TobRD2 w nieogłowionych kontrolach). Przed upływem sześciu godzin po ogłowieniu poziom mRNA TobRD2 wzrósł, około ośmiokrotnie w roślinach ogłowionych, nie stwierdzono w tym samym czasie żadnego wzrostu w roślinach kontrolnych.
PL 201 266 B1
P r z y k ł a d 5
Komplementacja mutanta bakteryjnego pozbawionego QPRTazy przez DNA ID. SEKW. NR 1
Szczep Escherichia coli TH265 jest mutantem pozbawionym fosforybozylotransferazy chinolanowej (nadCT) i przez to niezdolnym do wzrostu na podłożach pozbawionych kwasów nikotynowych.
Komórki TH265 transformowano wektorem ekspresyjnym (pWS161) zawierającym DNA o ID. SEKW. NR 1, lub transformowano wyłącznie wektorem ekspresyjnym (pKK233). Wzrost bakterii stransformowanych porównano ze wzrostem transformantów TH265 (pKK233) oraz ze wzrostem niestransformowanego mutanta TH265 nadC. Wzrost porównano na podłożach minimalnych ME (pozbawionych kwasu nikotynowego) i na podłożach minimalnych ME z dodanym kwasem nikotynowym.
Szczep E. coli z mutacją QPTazy (nadC) uzyskano dzięki uprzejmości dr K.T.Hughes'a (Hughes i wsp., J. Bact. 175:479 (1993)). Komórki hodowano na podłożu LB i przygotowano komórki kompetentne według opisu w Sambrook i wsp., (1989). Skonstruowano plazmid ekspresyjny w pKK2233 (Brosius, 1984), w którym cDNA TobRD2 wklonowano pod kontrolą promotora tac. Uzyskanym plazmidem, pWS161 transformowano komórki TH265. Stransformowane komórki wysiano następnie na szalki agarowe z podłożem minimalnym (Vogel i Bonner, 1956) bez, lub z dodatkiem, kwasu nikotynowego (0,0002%). Same komórki TH265 i TH265 stransformowany pKK2233 wysiano na podobne szalki jako kontrole.
Wyniki przedstawiono na figurze 4. Tylko TH265 stransformowane DNA o ID. SEKW. NR 1 rosły na podłożach pozbawionych kwasu nikotynowego. Wyniki te pokazują, że ekspresja DNA o ID. SEKW. NR 1 w komórkach bakterii TH265 nadała im fenotyp NadC+, potwierdzając ż e sekwencja ta koduje QPRTazę. Nazwę TobRD2 zmieniono zatem na NtQPT1.
P r z y k ł a d 6
Transformacja roślin tytoniu
DNA o ID. SEKW. NR 1, w orientacji antysensownej, jest funkcjonalnie połączone z promotorem roślinnym (CAMV 35S lub specyficzny dla kory korzenia promotor TobRD2) wytwarzając dwie różne kasety DNA: promotor CaMV 35S/antysensowny ID. SEKW. NR 1 i promotor TobRD2/antysensowny ID. SEKW. NR 1.
Do transformacji wybrano dziką linię tytoniu oraz linię tytoniu o niskiej zawartości nikotyny, np. dziki tytoń Burley 21 (Nic1+/Nic2+) oraz homozygotyczny mutant nic1-/nic2- Burley 21. Wiele komórek rośliny tytoniu z każdej linii transformuje się przy użyciu każdej z kaset DNA. Transformacja jest przeprowadzana przy użyciu wektora Agrobacterium, np. binarnego wektora Agrobacterium niosącego sekwencje graniczne Ti oraz gen nptll (nadający oporność na kanamycynę, pod kontrolą promotora nos (nptll)).
Stransformowane komórki są selekcjonowane i regenerowane dając transgeniczne rośliny tytoniu (R0). Rośliny R0 są hodowane do dojrzałości i badane pod kątem poziomu nikotyny, podzbiór stransformowanych roślin tytoniu wykazuje znacząco niższy poziom nikotyny w porównaniu z niestransformowanymi roślinami kontrolnymi.
Rośliny R0 są następnie krzyżowane wsobnie i analizowana jest segregacja transgenu w potomstwie R1. Potomstwo R1 hoduje się do osiągnięcia dojrzałości i krzyżuje wsobnie; segregacja transgenu wśród potomstwa R2 wskazuje, które rośliny R1 są homozygotyczne pod względem transgenu.
PL 201 266 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:
Conkling, Mark A.
Mendu, Nandini Song, Wen (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
Regulacja ekspresji fosforybozylortansferazy chinolanu (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI (A) ADRESAT: Kenneth Sibley, Bell Seltzer Park
Gibson (B) ULICA: 5Post Office Drawer 34009 (C) MIASTO: Charlotte (D) STAN: North Carolina (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 28234 (v) FORMA CZYTELNA KOMPUTEROWO:
(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1.0. Wersja #1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA (A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZŁOŻENIA (C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE RZECZNIKA (A) NAZWISKO: Sibley, Kenneth D.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 31,665 (C) NUMER SPRAWY: 5051-338P (ix) DANE TELEKOMUNIKACYJNE (A) TELEFON: 919-420-2200 (B) TELEFAKS: 919-881-3175 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE ID. SEKW. NR 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1399 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) FORMA: jednoniciowa (D) TOPOLGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHY:
PL 201 266 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 52..1104 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 1: ·
CAAAAACTAT TTTCCACAAA ATTCATTTCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TTT
Met Phe 1
AGA GCT ATT CCT TTC ACT GCT ACA
Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr
5 10
CCA AGG TTG GTG GTG AAA ATG TCA
Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser
20 25
GTG GAG TCA ITA GAG GTG AAA CCA
Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro
35 40
AAG GAA GTT ATG AAA CK GCA CTC
Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu
55
GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT
Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile
70
CAT TTT CTA GCA AAG GAA GAC GGG
His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly
85 90
GAG ATG ATA TTC GCG GAA GK GAT
Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp
100 105
GTA AAT GAT GGC GAT AAA GTT CAT
Va1 Asn Asp Gly Asp Lys Val His
115 120
CAA GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT
Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val
135
τπ ATG CAA AGA ATG AGT. GGA ATA
Phe Met Gin Arg 150 Met Ser Gly Ile
GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC
Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile
165 170
GTG CAT CCT TAT GCA ATT ACA GCT
Val His Pro Tyr Ala Ile Thr Ala
15
GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA
Ala Ile Ala Thr 30 Lys Asn Thr Arg
CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT TTA
Pro Ala His Pro Thr Tyr Asp Leu
45 50
TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA
Ser Glu -Asp Ala Gly Asn Leu Gly
60 65
CCT CK GAT ATG GAA TCC GAT GCT
Pro 75 Leu Asp Met Glu Ser 80 Asp Ala
ATC ATA GCA GGA ATT GCA CK GCT
Ile Ile Ala Gly Ile Ala Leu Ala
95
CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT
Pro Ser Leu Lys 110 Va1 Glu Trp Tyr
AAA GGC TTG AAA TTT GGC AAA GTA
Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val
125 130
ATA GCT GAG AGG GTT GTT CTC AAT
Ile Ala Glu Arg Val Val Leu Asn
140 145
GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA
Ala Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala
155 160
KG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT
Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro
175
105
153
201
249
297
345
393
441
489
537
585
PL 201 266 B1
GGA KA CGT KG GTG GAT AAA TGG GCG GTA KG ATC GGT GGG GGG AAG 633
Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly Gly Lys
180 185 190
AAT CAC AGA ATG GGC KA TK GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681
Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp Asn His
195 200 205 210
ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729
Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gln
215 220 225
TAT KG GAG CAA AAT AAA CK CAA ATA GGG GK GAG GK GAA ACC AGG 777
Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Val Glu Val Glu Thr Arg
230 235 240
ACA AK GAA GAA GTA CGT GAG GK CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG 825
Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Thr Lys
245 250 255
ACT TCG KG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GK GK CCA KA TCT 873
Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser
260 265 270
AAC GGA GAT AK GAT GTA TCC ATG CK AAG GAG GCT GTA GAA KG ATC 921
Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu Ile
97£ 9Qn 9DC 9ΩΠ £_UU £_LJU C—t \J
AAT GGG AGG TK GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GK ACC CK GAA ACA 969
Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr
295 300 305
GTA CAC AAG AK GGA CAA ACT GGT GK ACC TAC AK TCT AGT GGT GCC 1017
Val His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser Gly Ala
310 315 320
CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CK GAC AK TCC CTG AAG ATC GAT ACA 1065
Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile Asp Thr
325 330 335
GAG CTC GCC CK GAA GK GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114 Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala
340 345 350
TACKCTGCT ATAGGGKGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT 1174
CATTKACTA GKGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA 1234
KGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTKCC AACCKAKG CKGAGKGG TAATKCAK 1294
ATAGCTKGT TKCATGTK CATGGAATK GKACAATGA AAATACKGA TKATAAGK 1354
TGGTGTATGT AAAAKCTGT GKACKCAA ATATTKGAG ATGK 1399
PL 201 266 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE ID. SEKW. NR 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 351 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 2:
Met Phe 1 Arg Ala Ile 5 Pro Phe Thr Ala Thr Val 10 His Pro Tyr Ala 15 Ile
Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn
20 25 30
Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr
35 40 45
Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn
50 55 60
Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro- Leu Asp Met Glu Ser
65 70 75 80
Asp Ala His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala
85 90 95
Leu Ala Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu
100 105 110
Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly
115 120 125
Lys Val Gin Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val
130 135 140
Leu Asn Phe Met Gin Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu
145 150 155 160
Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr
165 170 175
Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp
195 200 205
Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val
210 215 220
Asp Gin Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin Ile Gly Val Glu Val Glu
225 230 235 240
PL 201 266 B1
Thr Arg Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin
245 250 255
Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro
260 265 270
Leu Ser Asn 275 Gly Asp Ile Asp Val 280 Ser Met Leu Lys Glu 285 Ala Val Glu
Leu Ile 290 Asn Gly Arg Phe Asp 295 Thr Glu Ala Ser Gly 300 Asn Val Thr Leu
Glu 305 Thr Val His Lys Ile 310 Gly Gin Thr Gly Val 315 Thr Tyr Ile Ser Ser 320
Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile
325 330 335
Móp rhr Giu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala 34ϋ 345 350 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE ID. SERW. NR 3;
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1053 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) FORMA: jednoniciowa CD) TOPOLGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA ' .
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 3;
ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60
TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120
AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180
GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA TTCCTCTTGA TATGGAATCC 240
GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300
ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360
GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT 420
GAGAGGGHG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480
ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA 540
CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600
PL 201 266 B1
TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660 CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720 ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780 TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840 TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900 AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960 GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC 1020 GCCCTTGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 1053

Claims (72)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowana cząsteczka DNA obejmująca sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z:
    (a) ID. SEKW. NR 1;
    (b) sekwencji DNA, które kodują enzym o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na ID. SEKW. NR 2 (c) sekwencji DNA, które hybrydyzuj ą z wyizolowanym DNA wedł ug punktu (a) lub (b) powyż ej i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową ; oraz (d) sekwencji DNA, które róż nią się od DNA wedł ug (a), (b) lub (c) powyż ej ze wzglę du na degenerację kodu genetycznego i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową.
  2. 2. Konstrukt DNA obejmujący w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz sekwencję DNA określoną w zastrz. 1, umieszczoną poniżej tego promotora i funkcjonalnie z nim połączoną.
  3. 3. Konstrukt DNA wedł ug zastrz. 2, znamienny tym, ż e promotor jest konstytutywnie aktywny w komórkach roś linnych.
  4. 4. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia rośliny.
  5. 5. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia roś liny.
  6. 6. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że konstrukt dodatkowo obejmuje plazmid.
  7. 7. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin.
  8. 8. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin, którym jest Agrobacterium tumefaciens.
  9. 9. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor roślinny oraz sekwencję DNA określoną w zastrz. 1, umieszczoną poniżej tego promotora i funkcjonalnie z nim połączoną, przy czym sekwencja DNA jest w orientacji antysensownej.
  10. 10. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że promotor jest konstytutywnie aktywny w komórkach roś linnych.
  11. 11. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia roś liny.
  12. 12. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia roś liny.
  13. 13. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że konstrukt dodatkowo obejmuje plazmid.
  14. 14. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin.
  15. 15. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin, którym jest Agrobacterium tumefaciens.
  16. 16. Konstrukt DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz DNA kodujący roślinną fosforybozylotransferazę chino22
    PL 201 266 B1 lanową, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na ID. SEKW. NR 1, przy czym DNA jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
  17. 17. Konstrukt DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że promotor jest konstytutywnie aktywny w komórkach roślinnych.
  18. 18. Konstrukt DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia roś liny.
  19. 19. Konstrukt DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia roś liny.
  20. 20. Konstrukt DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że konstrukt dodatkowo obejmuje plazmid.
  21. 21. Konstrukt DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin.
  22. 22. Konstrukt DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin, którym jest Agrobacterium tumefaciens.
  23. 23. Konstrukt DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz DNA kodujący roślinną fosforybozylotransferazę chinolanową, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na ID. SEKW. NR 1, przy czym DNA jest w orientacji antysensownej i jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
  24. 24. Konstrukt DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że promotor jest konstytutywnie aktywny w komórkach roślinnych.
  25. 25. Konstrukt DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia roś liny.
  26. 26. Konstrukt DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia roś liny.
  27. 27. Konstrukt DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że konstrukt dodatkowo obejmuje plazmid.
  28. 28. Konstrukt DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin.
  29. 29. Konstrukt DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że jest niesiony przez wektor do transformacji roślin, którym jest Agrobacterium tumefaciens.
  30. 30. Komórka roślinna tytoniu zawierająca konstrukt DNA określony w zastrz. 2.
  31. 31. Komórka roślinna tytoniu zawierająca konstrukt DNA określony w zastrz. 9.
  32. 32. Komórka roślinna tytoniu zawierająca konstrukt DNA określony w zastrz. 16.
  33. 33. Komórka roślinna tytoniu zawierająca konstrukt DNA określony w zastrz. 23.
  34. 34. Roślina transgeniczna obejmująca komórkę określoną w zastrz. 30.
  35. 35. Roślina transgeniczna obejmująca komórkę określoną w zastrz. 31.
  36. 36. Roślina transgeniczna obejmująca komórkę określoną w zastrz. 32.
  37. 37. Roślina transgeniczna obejmująca komórkę określoną w zastrz. 33.
  38. 38. Peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na ID. SEKW. NR 2.
  39. 39. Peptyd kodowany przez sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z:
    (a) ID. SEKW. NR 1;
    (b) sekwencji DNA, które hybrydyzują z sekwencją DNA według punktu (a) powyżej i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową; oraz (c) sekwencji DNA, które różnią się od DNA według (a) lub (b) powyżej ze względu na degenerację kodu genetycznego i które kodują enzym fosforybozylotransferazę chinolanową.
  40. 40. Sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej o obniżonej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy), znamienny tym, że obejmuje:
    transformowanie komórki roślinnej typu, o którym wiadomo że wyraża fosforybozylotransferazę chinolanową, konstruktem egzogennego DNA, który obejmuje w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz heterologiczny DNA zawierający część sekwencji kodującej mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej, przy czym heterologiczny DNA jest funkcjonalnie połączony z tym promotorem, w celu wytworzenia stransformowanej komórki roślinnej, która wykazuje obniżoną ekspresję QPRTazy w porównaniu z nietransformowaną komórką roślinną, przy czym taki heterologiczny DNA obejmuje co najmniej 25 nukleotydów sekwencji określonej w zastrz. 1.
  41. 41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że heterologiczny DNA jest w orientacji antysensownej.
  42. 42. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że heterologiczny DNA jest w orientacji sensownej.
    PL 201 266 B1
  43. 43. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że komórka roślinna jest komórką Nicotiana tabacum.
  44. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że obejmuje ponadto regenerację rośliny tytoniu z tej stransformowane j komórki roślinnej.
  45. 45. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że promotor jest konstytutywnie aktywny.
  46. 46. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki korzenia rośliny.
  47. 47. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że promotor jest wybiórczo aktywny w komórkach tkanki kory korzenia rośliny.
  48. 48. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że etap transformacji przeprowadza się przez bombardowanie komórki roślinnej mikrocząstkami niosącymi konstrukt DNA.
  49. 49. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że etap transformacji przeprowadza się poprzez infekowanie komórki roślinnej Agrobacterium tumefaciens zawierającym plazmid Ti niosący ten konstrukt DNA.
  50. 50. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że heterologiczna sekwencja DNA określona w zastrz. 1 jest komplementarna do RNA informacyjnego fosforybozylotransferazy chinolanowej (mRNA QPRT) wyrażanego w komórce roślinnej, w regionie wybranym spośród:
    (a) 5' niepodlegającej translacji sekwencji mRNA QPRT;
    (b) 3' niepodlegającej translacji sekwencji mRNA QPRT;
    (c) podlegającego translacji regionu mRNA QPRT
  51. 51. Sposób według zastrz. 40, zamienny tym, że heterologiczna sekwencja DNA określona w zastrz. 1 jest komplementarna do co najmniej 15 nukleotydów informacyjnego RNA fosforybozylotransferazy chinolanowej wyrażanego w tej komórce roślinnej.
  52. 52. Sposób według zastrz. 40, zamienny tym, że heterologiczna sekwencja DNA określona w zastrz. 1 jest komplementarna do co najmniej 200 nukleotydów informacyjnego RNA fosforybozylotransferazy chinolanowej wyrażanego w tej komórce roślinnej.
  53. 53. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że heterologiczna sekwencja DNA obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą fosforybozylotransferazę chinolanową określoną w zastrz. 1 na ID. SEKW. NR 1.
  54. 54. Sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, znamienny tym, że obejmuje zbiór nasion z transgenicznej rośliny tytoniu określonej w zastrz. 44.
  55. 55. Roślina transgeniczna z rodzaju Nicotiana wykazująca zredukowaną ekspresję fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, która to roślina transgeniczna obejmuje transgeniczne komórki roślinne zawierające:
    egzogenny konstrukt DNA obejmujący w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w tej komórce roślinnej oraz sekwencję heterologicznego DNA kodującego mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej, która to sekwencja heterologicznego DNA jest funkcjonalnie połączona z promotorem; przy czym roślina ta wykazuje obniżoną ekspresję QPRTazy w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, a taki heterologiczny DNA obejmuje co najmniej 25 nukleotydów sekwencji określonej w zastrz. 1.
  56. 56. Transgeniczna roślina według zastrz. 55, znamienna tym, że heterologiczny DNA jest w orientacji antysensownej.
  57. 57. Transgeniczna roślina według zastrz. 55, znamienna tym, że heterologiczny DNA jest w orientacji sensownej.
  58. 58. Nasiona rośliny transgenicznej rodzaju Nicotiana o zredukowanej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, znamienne tym, że obejmują heterologiczną sekwencję DNA określoną w zastrz. 1, a roślina jest rośliną określoną w zastrz. 55.
  59. 59. Sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, znamienny tym, że obejmuje:
    hodowlę komórki roślinnej stransformowanej heterologicznym DNA o sekwencji określonej w zastrz. 1, przy czym transkrybowana nić z sekwencji heterologicznego DNA jest komplementarna do mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej endogennego dla komórki, przy czym transkrypcja nici komplementarnej zmniejsza ekspresję genu fosforybozylotransferazy chinolanowej.
  60. 60. Sposób wytwarzania rośliny tytoniu o obniżonym poziomie nikotyny w liściach, znamienny tym, że obejmuje: hodowlę rośliny tytoniu, lub jej roślin potomnych, przy czym roślina ta obejmuje
    PL 201 266 B1 komórki zawierające egzogenny konstrukt DNA obejmujący region inicjacji transkrypcji funkcjonujący w tej roślinie oraz heterologiczną sekwencję DNA określoną w zastrz. 1 funkcjonalnie połączoną z regionem inicjacji transkrypcji, przy czym transkrybowana ni ć sekwencji heterologicznego DNA jest komplementarna do informacyjnego RNA fosforybozylotransferazy chinolanowej endogennego dla tej komórki.
  61. 61. Sposób wytwarzania transgeniczne j komórki roślinnej o podwyższonej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy), znamienny tym, że obejmuje: wzrost komórki roślinnej, która jest stransformowana egzogennym konstruktem DNA, obejmującym w kierunku od końca 5' do 3', promotor działający w komórce roślinnej oraz sekwencję heterologicznego DNA określonego w zastrz. 1, która jest funkcjonalnie połączona z promotorem tak, że ekspresja heterologicznej sekwencji DNA w komórce daje w transgenicznej komórce roślinnej podwyższoną ekspresję QPRTazy w porównaniu z komórkami niestransformowanymi.
  62. 62. Roślina transgeniczna rodzaju Nicotiana wykazująca zwiększoną ekspresję fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z niestransformowaną rośliną kontrolną, znamienna tym, że obejmuje transgeniczne komórki roślinne zawierające: egzogenny konstrukt DNA obejmujący w kierunku od końca 5' do 3' promotor działający w komórce roślinnej oraz sekwencję heterologicznego DNA określonego w zastrz. 1 kodującą mRNA fosforybozylotransferazy chinolanowej, przy czym heterologiczny DNA jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
  63. 63. Roślina transgeniczna rodzaju Nicotiana o zwiększonej ekspresji fosforybozylotransferazy chinolanowej (QPRTazy) w porównaniu z komórką niestransformowanej rośliny kontrolnej, przy czym komórka rośliny transgenicznej jest potomkiem komórki roślinnej określonej w zastrz. 61.
  64. 64. Sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, znamienny tym, że obejmuje: hodowlę komórki roślinnej stransformowanej egzogennym DNA, który obejmuje sekwencję DNA określoną w zastrz. 1 i koduje fosforybozylotransferazę chinolanową.
  65. 65. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że stransformowana komórka roślinna uzyskana jest sposobem obejmującym: integrację do genomu komórki roślinnej gospodarza konstruktu egzogennego DNA obejmującego, w kierunku transkrypcji, promotor działający w tej komórce roślinnej, sekwencję heterologicznego DNA określoną w zastrz. 1 kodującą fosforybozylotransferazę chinolanową funkcjonującą w tej komórce, która to sekwencja heterologicznego DNA jest połączona funkcjonalnie z promotorem, oraz regionem terminacji transkrypcji działającym w tej komórce, co prowadzi do uzyskania stransformowanej komórki roślinnej.
  66. 66. Sposób wytwarzania rośliny tytoniu o zwiększonym poziomie nikotyny w liściach, znamienny tym, że obejmuje: hodowlę rośliny tytoniu, lub jej roślin potomnych, przy czym roślina obejmuje komórki zawierające konstrukt z egzogennym DNA obejmujący region inicjacji transkrypcji funkcjonujący w tej roślinie oraz sekwencję heterologicznego DNA określoną w zastrz. 1 funkcjonalnie połączoną z regionem inicjacji transkrypcji, przy czym sekwencja heterologicznego DNA koduje fosforybozylotransferazę chinolanową działającą w tych komórkach.
  67. 67. Produkt tytoniowy obejmujący komórkę roślinną tytoniu określoną w zastrz. 63.
  68. 68. Produkt tytoniowy wytworzony z rośliny tytoniu określonej w zastrz. 55.
  69. 69. Produkt tytoniowy wytworzony z rośliny tytoniu określonej w zastrz. 62.
  70. 70. Zastosowanie komórki roślinnej tytoniu określonej w zastrz. 63 do wytwarzania produktu tytoniowego.
  71. 71. Zastosowanie rośliny tytoniu określonej w zastrz. 55 do wytwarzania produktu tytoniowego.
  72. 72. Zastosowanie rośliny tytoniu określonej w zastrz. 62 do wytwarzania produktu tytoniowego.
    PL 201 266 B1
PL337442A 1997-06-12 1998-06-10 Wyizolowana cząsteczka DNA, kostrukty DNA, peptyd, komórka roślinna tytoniu, roślina transgeniczna i jej nasiona, sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej, sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, sposób wytwarzania rośliny tytoniu, sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, produkt tytoniowy, zastosowanie komórki roślinnej tytoniu oraz zastosowanie rośliny tytoniu PL201266B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4947197P 1997-06-12 1997-06-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL337442A1 PL337442A1 (en) 2000-08-14
PL201266B1 true PL201266B1 (pl) 2009-03-31

Family

ID=21960004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL337442A PL201266B1 (pl) 1997-06-12 1998-06-10 Wyizolowana cząsteczka DNA, kostrukty DNA, peptyd, komórka roślinna tytoniu, roślina transgeniczna i jej nasiona, sposób wytwarzania transgenicznej komórki roślinnej, sposób wytwarzania transgenicznych nasion tytoniu, sposób wytwarzania rośliny tytoniu, sposób obniżenia ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, sposób zwiększania ekspresji genu fosforybozylotransferazy chinolanowej w komórce roślinnej, produkt tytoniowy, zastosowanie komórki roślinnej tytoniu oraz zastosowanie rośliny tytoniu

Country Status (37)

Country Link
US (9) US6586661B1 (pl)
EP (3) EP1457563B1 (pl)
JP (4) JP4095678B2 (pl)
KR (1) KR100365969B1 (pl)
CN (2) CN100482799C (pl)
AP (1) AP1169A (pl)
AT (1) ATE262039T1 (pl)
AU (1) AU748514B2 (pl)
BG (1) BG64319B1 (pl)
BR (1) BRPI9810870B1 (pl)
CA (2) CA2484366A1 (pl)
CU (1) CU23174A3 (pl)
CZ (1) CZ297379B6 (pl)
DE (2) DE69822463T2 (pl)
DK (1) DK0991766T3 (pl)
EA (2) EA004652B1 (pl)
EE (1) EE04595B1 (pl)
ES (1) ES2154624T3 (pl)
GE (1) GEP20032871B (pl)
GR (1) GR20010300003T1 (pl)
HU (1) HU225888B1 (pl)
ID (1) ID29311A (pl)
IL (3) IL132184A0 (pl)
LT (1) LT4706B (pl)
LV (1) LV12507B (pl)
NO (1) NO324872B1 (pl)
NZ (1) NZ500963A (pl)
OA (1) OA11219A (pl)
PL (1) PL201266B1 (pl)
PT (1) PT991766E (pl)
RO (1) RO121968B1 (pl)
RS (1) RS49677B (pl)
SI (1) SI20215B (pl)
SK (1) SK161899A3 (pl)
TR (1) TR199902728T2 (pl)
UA (1) UA72187C2 (pl)
WO (1) WO1998056923A1 (pl)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586661B1 (en) 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US20100251425A9 (en) * 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
EP1724355A3 (en) * 2000-08-30 2007-05-23 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
JP2004533807A (ja) * 2000-11-07 2004-11-11 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ プトレッシン−ｎ−メチルトランスフェラーゼプロモーター
DE10055870A1 (de) 2000-11-10 2002-05-29 Degussa Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
AU2002228901A1 (en) 2000-11-10 2002-05-21 Vector Tobacco (Bermuda) Ltd. Method and product for removing carcinogens from tobacco smoke
CN1288248C (zh) * 2001-06-06 2006-12-06 二十二世纪有限责任公司 烟草生物质的用途
CA2449920A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Vector Tobacco Ltd. Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
WO2005103296A2 (en) * 2004-03-30 2005-11-03 Vector Tobacco, Ltd. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
WO2003041521A2 (en) * 2001-11-09 2003-05-22 Vector Tobacco Inc. Method and composition for mentholation of charcoal filtered cigarettes
AU2002361809A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-09 Vector Tobacco Inc. Method and compositions for imparting cooling effect to tobacco products
EP1455608B1 (en) * 2001-12-19 2006-10-11 Vector Tobacco Ltd. Method and composition for mentholation of cigarettes
AU2003230833A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Vector Tobacco Ltd. Tobacco having reduced nicotine and nitrosamines
AU2004266694A1 (en) 2003-08-19 2005-03-03 22Nd Century Limited, Llc Reduced-exposure tobacco products
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
EP1684603A2 (en) * 2003-10-02 2006-08-02 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7538071B2 (en) 2003-11-21 2009-05-26 Carl Berger Methods of reducing the nicotine content of tobacco plants and tobacco plants obtained thereby
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US8989833B2 (en) 2004-07-13 2015-03-24 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
AU2012203977B2 (en) * 2005-02-28 2015-01-29 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
KR101413122B1 (ko) 2005-02-28 2014-07-18 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
AU2006247739A1 (en) 2005-05-11 2006-11-23 Vector Tobacco Inc. Reduced risk tobacco products and methods of making same
FR2889003A1 (fr) * 2005-07-22 2007-01-26 St Microelectronics Sa Adaptation automatique d'une source video a un recepteur
CA2656430C (en) 2006-06-19 2014-08-05 Jonathan E. Page Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
WO2007072224A2 (en) 2006-09-13 2007-06-28 Nara Institute Of Science And Technology Increasing levels of nicotinic alkaloids
US9551003B2 (en) * 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US9106606B1 (en) 2007-02-05 2015-08-11 F5 Networks, Inc. Method, intermediate device and computer program code for maintaining persistency
CN110872589A (zh) 2007-05-25 2020-03-10 22世纪有限责任公司 编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用
US20100206317A1 (en) * 2007-09-28 2010-08-19 Vector Tobacco, Inc. Reduced risk tobacco products and use thereof
EP2559766B1 (en) * 2007-12-13 2017-10-18 Philip Morris Products S.A. Plants modified for reduced cadmium transport, derivative products, and related methods
CA2781332C (en) 2009-11-19 2018-09-04 National University Corporation Okayama University System for increasing gene expression and vector comprising the system
CN102781494B (zh) 2009-12-11 2015-04-01 泰尔茂比司特公司 具有防护提取端口和光学控制的血液分离系统
EP2537929B1 (en) 2010-02-17 2017-04-12 Japan Tobacco, Inc. Plant component regulation factor, and use thereof
US9862923B2 (en) 2010-03-26 2018-01-09 Philip Morris Usa Inc. Cultured tobacco cells as a matrix for consumable products
EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Philip Morris Products S.A. Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
US8716571B2 (en) 2011-09-21 2014-05-06 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having reduced amounts of amino acids and methods for producing such lines
US9137958B2 (en) 2012-02-08 2015-09-22 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having altered amounts of environmental contaminants
AP2015008563A0 (en) * 2012-12-21 2015-06-30 Philip Morris Products Sa Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
US20180291388A1 (en) * 2015-05-05 2018-10-11 North Carolina State University Methods and compositions for reducing the tobacco specific nitrosamine nnk in tobacco
US10405571B2 (en) 2015-06-26 2019-09-10 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
EP3480314A1 (en) 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
JP2022552261A (ja) * 2019-10-10 2022-12-15 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するためのｑｐｔ操作に基づく組成物および方法
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用
CN116983432A (zh) * 2023-07-07 2023-11-03 深圳先进技术研究院 用于治疗类风湿性关节炎的药物

Family Cites Families (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US254285A (en) 1882-02-28 David w
US299541A (en) 1884-06-03 heae-n
US38123A (en) * 1863-04-07 Improvement in harvesters
US819751A (en) * 1905-01-04 1906-05-08 Giuseppe Gianoli Process of charging silk.
US2479526A (en) 1940-12-11 1949-08-16 Wurton Machine Company Apparatus for curing green tobacco
US2728803A (en) * 1951-12-28 1955-12-27 Standard Oil Co Separation of ethylbenzene from other c8 aromatic hydrocarbons by extraction with hf-bf3
US2728603A (en) 1954-12-13 1955-12-27 James H Stagg Lawn and garden sprinkler
DE1917552U (de) 1964-01-31 1965-06-10 Fritz Tautenhahn Flaechig-ornamentales gitterwerk.
US3693631A (en) 1971-04-28 1972-09-26 Reynolds Leasing Corp Tobacco expansion process
US3840025A (en) 1972-08-14 1974-10-08 Industrial Nucleonics Corp Tobacco moisture control system and method
US3905123A (en) 1973-10-15 1975-09-16 Industrial Nucleonics Corp Method and apparatus for controlling a tobacco dryer
US4319587A (en) 1975-06-09 1982-03-16 Irving S. Moser Smoking article
DE2531285C2 (de) 1975-07-12 1982-10-28 Deutsche Benkert Gmbh & Co Kg, 4690 Herne Filterzigarette
US4192323A (en) 1977-09-21 1980-03-11 Gas-Fired Products, Inc. Apparatus and method for automatically controlling curing conditions in a tobacco curing barn
US4557280A (en) 1978-06-15 1985-12-10 Brown & Williamson Tobacco Corporation Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment
US4243056A (en) 1979-01-12 1981-01-06 Philip Morris Incorporated Method for uniform incorporation of additives into tobacco
FR2478958A1 (fr) 1980-04-01 1981-10-02 Decoufle Dispositif d'alimentation en encre des appareils d'imprimerie pour machines a confectionner les cigarettes
US4499911A (en) 1980-12-09 1985-02-19 Johnson William H Energy efficient curing and drying system
GB2092149B (en) * 1981-02-03 1985-01-03 Searle & Co Imidazoline hydrazone and hydrazine derivatives production thereof and use in medicine
US4459355A (en) 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
NL8203963A (nl) 1982-10-14 1984-05-01 Naarden International Nv Werkwijze voor het aromatiseren van droog plantaardig materiaal.
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
US6051757A (en) 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
EP0131624B1 (en) 1983-01-17 1992-09-16 Monsanto Company Plasmids for transforming plant cells
US6174724B1 (en) 1983-01-17 2001-01-16 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
SU1582990A3 (ru) 1983-01-17 1990-07-30 Монсанто Компани (Фирма) Способ получени трасформированных клеток двудольных растений
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4751348A (en) 1983-07-16 1988-06-14 Cold Spring Harbor Laboratory Nicotiana plants with both altered polyamine levels and flower structures and method for obtaining these plants
US4766855A (en) * 1983-07-20 1988-08-30 Cummins Engine Co., Inc. Plasma jet ignition apparatus
DE3486053T3 (de) 1983-10-20 2004-01-08 The Research Foundation Of State University Of New York Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS.
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US6281410B1 (en) 1986-07-31 2001-08-28 Calgene Llc Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
NL8502948A (nl) 1985-10-29 1987-05-18 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.
US4795855A (en) 1985-11-14 1989-01-03 Joanne Fillatti Transformation and foreign gene expression with woody species
GB8529851D0 (en) 1985-12-04 1986-01-15 Rothmans Of Pall Mall Linear layered cigarette
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
NZ219472A (en) 1986-03-28 1990-08-28 Calgene Inc Regulation of phenotype in plant cells using dsdna constructs
US4700725A (en) 1986-04-17 1987-10-20 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette
US4699158A (en) 1986-04-17 1987-10-13 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette with tactile indicator
DE3661587D1 (en) 1986-04-23 1989-02-09 Reynolds Tobacco Gmbh Process for treating tobacco and similar organic materials
US4766911A (en) 1986-06-23 1988-08-30 R. J. Reynolds Tobacco Company Method for tracing smoking articles
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5229292A (en) 1986-07-28 1993-07-20 Stine Seed Farm, Inc. Biological control of insects using pseudomonas strains transformed with bacillus thuringiensis insect toxingene
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US4835162A (en) 1987-02-12 1989-05-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterents
US4966916A (en) 1987-02-12 1990-10-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterrents
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US4954442A (en) 1988-08-31 1990-09-04 Purdue Research Foundation Opine enhancement of vir gene induction
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
GB8827592D0 (en) 1988-11-25 1988-12-29 Taniguchi T Improvements in & relating to regulation of expression
US5223419A (en) 1989-03-14 1993-06-29 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US4990607A (en) 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US5665543A (en) 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
AU660405B2 (en) 1989-07-18 1995-06-29 Osi Pharmaceuticals, Inc. Method of transcriptionally modulating gene expression and of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
NL8901931A (nl) 1989-07-26 1991-02-18 Mogen International N V En Rij Werkwijze voor het plaatsgericht introduceren van vreemd dna in het genoom van planten.
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5062434A (en) 1989-09-22 1991-11-05 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper
GB8923716D0 (en) 1989-10-20 1989-12-06 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5177308A (en) 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
ATE130371T1 (de) 1989-12-19 1995-12-15 Ciba Geigy Ag Verfahren und vorrichtung zur genetischen transformation von zellen.
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
WO1991011535A1 (en) 1990-01-30 1991-08-08 Childrens Hospital Of Los Angeles Inhibition of transcription by double-stranded oligonucleotides
CA2036935A1 (en) 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
GB9005945D0 (en) 1990-03-16 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
WO1991014790A1 (en) 1990-03-27 1991-10-03 New England Medical Center Hospitals, Inc. Inhibitors of transcription activation activity of papillomaviruses
US5109876A (en) 1990-04-19 1992-05-05 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette paper and cigarette incorporating same
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5035252A (en) 1990-12-14 1991-07-30 Mondre Steven J Nicotine-containing dental floss
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
JPH04265569A (ja) * 1991-02-19 1992-09-21 Canon Inc 音声信号記録装置及び再生装置
CA2108144A1 (en) 1991-03-06 1992-09-07 Jack A. Roth Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
CA2106386A1 (en) 1991-04-18 1992-10-19 Barbara C. F. Chu Oligodeoxynucleotides and oligonucleotides useful as decoys for proteins which selectively bind to defined dna sequences
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
WO1993000546A1 (en) 1991-06-20 1993-01-07 Reinforced Plastics/Composites Pty Ltd A connecting system
DK0593618T3 (da) 1991-06-27 1998-11-23 Genelabs Tech Inc Screeningsassay til påvisning af DNA-bindende molekyler
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
WO1993005646A1 (en) * 1991-09-13 1993-04-01 Technology Management Services, S.A. Reduction of nicotine levels in tobacco
AU3584993A (en) 1992-01-27 1993-09-01 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and compositions for neutralizing intracellular nucleic acid-binding protein biological activity in a cell, including methods and compositions useful to regulate gene function
EP0628082B1 (en) 1992-02-26 2001-05-16 Zeneca Mogen B.V. Agrobacterium strains capable of site-specific recombination
AU678154B2 (en) 1992-04-02 1997-05-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
US5780051A (en) 1992-04-02 1998-07-14 Dynagen, Inc. Methods and articles of manufacture for nicotine cessation and monitoring nicotine use
US5626152A (en) 1992-08-26 1997-05-06 Molins Plc Cigarette making machine
US5469871A (en) 1992-09-17 1995-11-28 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette and method of making same
DE69327809T2 (de) 1992-11-27 2000-10-12 Voxel, Laguna Hills Verfahren und vorrichtung zur herstellung von hologrammen
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
ES2161245T3 (es) 1993-05-13 2001-12-01 Aventis Cropscience Nv Gen marcador.
EP0701614A1 (en) * 1993-06-01 1996-03-20 Philip Morris Products Inc. Putrescine n-methyltransferase, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltransferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content
US5540242A (en) 1993-07-07 1996-07-30 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper having reduced sidestream properties
US5377697A (en) 1993-08-27 1995-01-03 Hoechst Celanese Corporation Cigarette filter test apparatus and associated method for measuring filter hot collapse and tobacco consumption
US5810020A (en) 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
PT732929E (pt) 1993-10-29 2008-08-26 Brigham & Womens Hospital Utilização terapêutica de ''engodos'' de elementos cis in vivo
US6399376B1 (en) 1993-11-05 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
US5731179A (en) 1993-12-08 1998-03-24 Japan Tobacco Inc. Method for introducing two T-DNAS into plants and vectors therefor
US5394894A (en) 1994-02-22 1995-03-07 Zade; Ismail Y. Method and apparatus for elimination of smoking
US5858774A (en) 1994-05-12 1999-01-12 The Research Foundation Of State University Of New York Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters
ES2081257B1 (es) 1994-05-12 1996-07-16 Sagrera Jorge Martinez Instalacion y procedimiento para el curado de tabaco.
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
JP3235934B2 (ja) 1994-08-04 2001-12-04 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
IT1275697B1 (it) 1994-12-20 1997-10-17 Olmo Giancarlo Dell Metodo per stampare direttamente su carta microincisioni di ologrammi,chinogrammi,reticoli di diffrazione o microincisioni
US5733744A (en) 1995-01-13 1998-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Binary BAC vector
WO1996029418A1 (en) 1995-03-22 1996-09-26 Novo Nordisk A/S Introduction of dna into bacillus strains by conjugation
CA2216148A1 (en) 1995-03-30 1996-10-03 Toshiharu Ohba Plant promoter and method for gene expression using said promoter
ES2285712T3 (es) 1995-05-12 2007-11-16 Anges Mg, Inc. Medicamento para la terapia y profilaxis de varias enfermedades relacionadas con nf-kappa b.
US5837876A (en) * 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9517263D0 (en) 1995-08-23 1995-10-25 Cancer Res Campaign Tech Expression systems
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
BR9610738A (pt) 1995-09-25 1999-07-13 Novartis Ag Integração aperfeiçoada de dna exógeno transferido para as células eucarióticas
US6198827B1 (en) * 1995-12-26 2001-03-06 Rocktron Corporation 5-2-5 Matrix system
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
EP0927044A4 (en) 1996-04-16 1999-09-08 Immusol Inc DEFINED TARGET VIRAL VECTORS
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
EP1011729B1 (en) 1996-05-20 2008-01-09 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligonucleotides which specifically bind retroviral nucleocapsid proteins
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
US5834236A (en) 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US6135121A (en) 1996-06-28 2000-10-24 Regent Court Technologies Tobacco products having reduced nitrosamine content
USRE38123E1 (en) 1996-06-28 2003-05-27 Regent Court Technologies, Llc. Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5845647A (en) 1996-06-28 1998-12-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US5803081A (en) 1996-06-28 1998-09-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US6037525A (en) 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5830318A (en) 1996-10-25 1998-11-03 Schweitzer-Mauduit International, Inc. High opacity tipping paper
US5929306A (en) 1996-11-15 1999-07-27 University Of Kentucky Research Foundation KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5
US6202649B1 (en) 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US6096947A (en) 1997-01-14 2000-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving transformation efficiency
WO1998032843A2 (en) 1997-01-28 1998-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for modulation of alkaloid biosynthesis and flower formation in plants
US6166032A (en) 1997-02-07 2000-12-26 Synapse Pharmaceuticals International, Inc. Method for controlling tobacco use and alleviating withdrawal symptoms due to cessation of tobacco use
ES1036967Y (es) * 1997-04-15 1998-05-01 Techpack Espana S L Cazoleta perfeccionada para estuche de lapiz de labios.
US6163521A (en) * 1997-04-16 2000-12-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Disk having read-only and read-write areas
US6020989A (en) * 1997-05-14 2000-02-01 Affinity Co., Ltd. Laminated bodies and windows using them
US6586661B1 (en) 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
AR015873A1 (es) 1997-06-13 2001-05-30 Shell Int Research Un proceso para producir material vegetal modificado geneticamente que comprende una o mas secuencias de adn de interes establemente incorporadas
US6020969A (en) 1997-07-11 2000-02-01 Philip Morris Incorporated Cigarette making machine including band inspection
US6391547B1 (en) 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
CA2301707A1 (en) 1997-08-25 1999-03-04 Nunhems Zaden B.V. Improved agrobacterium-mediated transformation of plants
ZA988332B (en) 1997-09-12 1999-03-23 Performance Plants Inc In planta transformation of plants
CA2248622A1 (en) 1997-09-23 1999-03-23 Joe Celeste Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues
JP2001518520A (ja) 1997-10-03 2001-10-16 キャリー メディカル コーポレイション ニコチンレセプターアンタゴニストおよび抗抑うつ薬または抗不安薬を含有するニコチン嗜癖を治療する組成物
US6077992A (en) 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
WO1999025821A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for genetic modification of plants
US6060310A (en) 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6265538B1 (en) * 1998-02-27 2001-07-24 The Regents Of The University Of California Inhibitor of the inflammatory response induced by the TNFA and IL-1
CN101818145A (zh) 1998-03-20 2010-09-01 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
JP3444191B2 (ja) 1998-03-31 2003-09-08 日本製紙株式会社 フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
US6136799A (en) 1998-04-08 2000-10-24 Abbott Laboratories Cosolvent formulations
US5938017A (en) 1998-05-04 1999-08-17 Wik; Dennis O. Article for assisting persons to quit smoking and method for same
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
JP2002516869A (ja) 1998-06-05 2002-06-11 レジェンド コート テクノロジーズ モノアミンオキシダーゼ（ｍａｏ）阻害剤とその使用
US6271031B1 (en) 1998-08-12 2001-08-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Quinolinate metabolism enzymes
AU5796099A (en) 1998-08-31 2000-03-21 Monsanto Company A new method of identifying non-host plant disease resistance genes
CA2344700C (en) 1998-10-01 2005-03-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
DE19847767A1 (de) 1998-10-16 2000-04-20 Decoufle Sarl Anordnung zum Zuführen von fließfähiger Druckfarbe zu einem Druckwerk für einen Zigarettenpapierstreifen
DE19852757A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Eth Zuerich Zuerich Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen
AU776046B2 (en) 1998-12-22 2004-08-26 Dow Agrosciences Llc Transgenic plants and methods for production thereof
JP2002533090A (ja) 1998-12-23 2002-10-08 ザ、サミュアル、ラバツ、ノゥブル、ファウンデイシャン、インク 植物形質転換法
HU228627B1 (hu) 1999-04-19 2013-04-29 Rhobio Növényi transzformációs eljárás
AU4991500A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6314964B1 (en) 1999-09-15 2001-11-13 Schweitzer-Mauduit International, Inc. Cigarette paper containing carbon fibers for improved ash characteristics
ATE538205T1 (de) 1999-11-29 2012-01-15 Midwest Oilseeds Inc Verfahren, medien und vorrichtung zur einführung von molekülen in pflanzenzellen und bakterien mittels aerosolstrahlen
ATE447036T1 (de) 1999-12-16 2009-11-15 Cropdesign Nv Optimisierter t-dna transfer und entsprechende vektoren
AU2625501A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for gene silencing
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
AU2001253255A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
WO2002002807A2 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with cell signalling
EP1724355A3 (en) 2000-08-30 2007-05-23 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
JP2004533807A (ja) 2000-11-07 2004-11-11 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ プトレッシン−ｎ−メチルトランスフェラーゼプロモーター
CN1288248C (zh) 2001-06-06 2006-12-06 二十二世纪有限责任公司 烟草生物质的用途
US20060157072A1 (en) 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
CA2449920A1 (en) 2001-06-08 2002-12-19 Vector Tobacco Ltd. Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco
US6557560B2 (en) 2001-06-18 2003-05-06 Ctc Canada Inc. Cigarette making machine
AU2004266694A1 (en) 2003-08-19 2005-03-03 22Nd Century Limited, Llc Reduced-exposure tobacco products
KR101413122B1 (ko) 2005-02-28 2014-07-18 22엔디 센츄리 리미티드, 엘엘씨 식물의 니코틴 알칼로이드 수준의 감소
CA2656430C (en) 2006-06-19 2014-08-05 Jonathan E. Page Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
BRPI0717355B1 (pt) 2006-10-13 2018-01-16 North Carolina State University Método para obtenção de uma planta transgênica de nicotina, método para obtenção de uma semente; construto de ácido nucléico recombinante; método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotina

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001522250A (ja) 2001-11-13
US6586661B1 (en) 2003-07-01
JP2004290201A (ja) 2004-10-21
ID29311A (id) 2001-08-16
CZ297379B6 (cs) 2006-11-15
DK0991766T3 (da) 2004-07-12
DE69822463T2 (de) 2005-01-20
NO996169L (no) 1999-12-13
CU23174A3 (es) 2006-09-22
HK1027379A1 (en) 2001-01-12
US6423520B1 (en) 2002-07-23
EE9900575A (et) 2000-08-15
EA009898B1 (ru) 2008-04-28
EP1457563A1 (en) 2004-09-15
HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
ATE262039T1 (de) 2004-04-15
SK161899A3 (en) 2000-06-12
JP4459271B2 (ja) 2010-04-28
SI20215B (sl) 2007-04-30
KR100365969B1 (ko) 2002-12-26
JP2009112316A (ja) 2009-05-28
JP4288206B2 (ja) 2009-07-01
PT991766E (pt) 2004-08-31
HU225888B1 (en) 2007-11-28
US7605308B2 (en) 2009-10-20
US7425670B2 (en) 2008-09-16
US20060191036A1 (en) 2006-08-24
US20040168211A1 (en) 2004-08-26
RO121968B1 (ro) 2008-09-30
WO1998056923A1 (en) 1998-12-17
IL192232A0 (en) 2008-12-29
EP1457562B1 (en) 2012-08-08
TR199902728T2 (xx) 2000-09-21
UA72187C2 (uk) 2005-02-15
EA004652B1 (ru) 2004-06-24
DE69822463D1 (de) 2004-04-22
EP1457563B1 (en) 2012-08-08
AU748514B2 (en) 2002-06-06
LV12507B (en) 2000-11-20
US7645925B2 (en) 2010-01-12
DE991766T1 (de) 2002-04-04
EA200400186A1 (ru) 2004-08-26
KR20010013663A (ko) 2001-02-26
US7408098B2 (en) 2008-08-05
PL337442A1 (en) 2000-08-14
EE04595B1 (et) 2006-02-15
SI20215A (sl) 2000-10-31
CN1304576C (zh) 2007-03-14
GR20010300003T1 (en) 2001-06-29
ES2154624T3 (es) 2004-11-01
HK1065066A1 (en) 2005-02-08
LT99142A (en) 2000-06-26
AP9901680A0 (en) 1999-12-31
GEP20032871B (en) 2003-01-27
LV12507A (en) 2000-06-20
ES2154624T1 (es) 2001-04-16
EP1457562A1 (en) 2004-09-15
HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
CA2287776C (en) 2012-04-03
CA2484366A1 (en) 1998-12-17
CN1257542A (zh) 2000-06-21
BR9810870A (pt) 2000-11-14
US20070011774A1 (en) 2007-01-11
AP1169A (en) 2003-06-30
CN1618972A (zh) 2005-05-25
US20060191035A1 (en) 2006-08-24
US20060200872A1 (en) 2006-09-07
HK1069411A1 (en) 2005-05-20
BG103886A (en) 2000-07-31
CN100482799C (zh) 2009-04-29
OA11219A (en) 2003-07-17
RS49677B (sr) 2007-11-15
CZ367799A3 (cs) 2000-04-12
CA2287776A1 (en) 1998-12-17
AU7829198A (en) 1998-12-30
NZ500963A (en) 2001-09-28
YU64899A (sh) 2004-12-31
US7795509B2 (en) 2010-09-14
EA200000007A1 (ru) 2000-06-26
IL132184A (en) 2010-11-30
NO996169D0 (no) 1999-12-13
EP0991766A1 (en) 2000-04-12
US7304220B2 (en) 2007-12-04
NO324872B1 (no) 2007-12-17
JP2008131950A (ja) 2008-06-12
IL132184A0 (en) 2001-03-19
BRPI9810870B1 (pt) 2021-06-01
JP4095678B2 (ja) 2008-06-04
US20020108151A1 (en) 2002-08-08
BG64319B1 (bg) 2004-09-30
LT4706B (lt) 2000-09-25
EP0991766B1 (en) 2004-03-17
US20030140366A1 (en) 2003-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP1169A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression.
AU2004203879B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2002300895B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
HK1027379B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
HK1069411B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression in tobacco plants
HK1065066B (en) Increase of quinolate phosphoribosyl transferase expression in plants

Legal Events

Date Code Title Description
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 379455

Country of ref document: PL