DD160280A5 - Verfahren zur herstellung eines eine immunologische oder biologische aktivitaet von humanfibroblast-interferon aufweisenden polypeptids - Google Patents

Abstract

DNA-Sequenzen, Rekombinant-DNA-Molekuele und mit ihnen transformierte Wirte, die Polypeptide erzeugen, die eine biologische oder immunologische Aktivitaet von Humanfibroblast-Interferon aufweisen, die fuer diese Polypeptide kodierenden Gene und Methoden zur Erzeugung und Anwendung dieser DNA-Sequenzen, Molekuele, Wirte, Gene und Polypeptide. Die DNA-Sesquenzen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie fuer ein eine biolog. o. immunologische Aktivitaet von Humanfibroblast-Interferon aufweisendes Polypeptid kodieren. In entsprechenden Wirten ermoeglichen diese DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Molekuele die Erzeugung und Identifizierung von Genen und Polypeptiden, die eine biologische oder immunologische Aktivitaet von Humanfibroblast-Interferon aufweisen, und ihre Verwendung in Antivirus-, Antitumor- und Antikrebsmitteln.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, Rekombinant-DNA-Moleküle und ein Verfahren für die Herstellung von Humanfibroblast-Interferon ähnlichen Polypeptiden. Genauer gesagt betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die in entaprechenden Wirtsorganismen verwirklicht werden» Die hier beschriebenen Rekombinant-DNA-Moleküle sind durch DNA-Sequenzen gekennzeichnet, die für Polypeptide kodieren, deren Aminosäure-Sequenz und Zusammensetzung im wesentlichen mit Humanfibroblast-Interferon übereinstimmen, und die eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanfibroblast-Interferon aufweisen. Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgehen wird, können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Rekombinant-DNA-Moleküle und Verfahren für die Erzeugung von Polypeptiden verwendet werden, die in Antivirus-, Antitumor- und Antikrebsmitteln und -verfahren und in der Immunomödulation nützlich sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: In dieser Anmeldung wird die in Nature, 286, S. 2421 (10. Juli 1980) veröffentlichte Interferon-Nomenklatur verwendet. Diese Nomenklatur ersetzt die in unseren früheren Anmeldungen, gegenüber denen die vorliegende Anmeldung Priorität hat, verwendete. Zum Beispiel wird IP jetzt als IPN bezeichnet und Pibroblast-Interferon wird Jetzt als IFN-/J bezeichnet.

Bekanntlich gibt es zwei Klassen von Interferones ("IFN"). Interferone der Klasse I sind kleine säurebeständige (Glyco-)-Protetne, durch die Zellen gegenüber Virusinfektionen res istent werden (A. Isaacs und J. Lindenmann, "Virus Interference I. The Interferon" (Virus int erf erenz I. Das Interferon), Proc <,

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Royal Soc. Ser. B., 147, S. 258 - 267 (1957) und W.E. Stewart, II, The Interferon System« Springer Verlag (1979) (anschließend "The Interferon Syatem")). IPNe der Klasse II sind säurelabil· Gegenwärtig sind sie schlecht charakterisierte Obwohl sie bis zu einem gewissen Grade zellspezifisch sind (The Interferon System, S. 135 - 145) sind IFNe nicht virusspezifisch. Stattdessen schützen IPNe Zellen gegenüber einem breiten Spektrum von Viren.

Human-Interferon ("HuIPN") ist in drei Gruppen eingeteilt worden, Λ , β und yf · HuIFN-0 oder Pibroblast-Interferon wird nach entsprechender Induktion in Diploid-Fibroblastzellen erzeugt» Es wird außerdem in geringfügigen Mengen zusammen mit einer beträchtlichen Menge HuIFN-ίλ in Lymphoblastoidzeilen erzeugt. Aus diesen Zellen gewonnenes IPN- (b ist umfassend gereinigt und gekennzeichnet worden (E. Knight, Jr., "Interferon: Purification And Initial Characterization Prom Human Diploid Cells" (Interferons Reinigung und erste Charakterisierung von Human-Diploidzellen), Proo. Natl. Acad. Sei. USA, 73, S. 520 523 (1976)). Es handelt sich um ein Glyco-Protein mit einer relativen Molekülmasse von etwa 20 000 (M. Wiranowaka-Stewart, u.a., "Contributions Of Carbohydrate Moieties To The Physical And Biological Properties Of Human Leucocyte, Lymphoblastoid And Fibroblast Interferons" (Beiträge der Carbohydrat-Komponenten zu den physikalischen und biologischen Eigenschaften von Humanleukozyten-, Lymphoblastoid- und Fibroblast-Interferonen) Abat. Ann. Meeting Amer. Soc. Mlcroblolo S. 246 (1978)). Es iat vermutlich infolge der Carbohydratkomponenten auch hinsichtlich der Größe heterogen·

Die Aminosäurezusammensetzung von authentischem Humanfibroblast-Interferon ist auch veröffentlicht worden (E. Knight, Jr. u.a.,, "Human Fibroblast Interferon* Amino Acid Analysis And Amino-Terminal Amino Acid Sequence" (Humanfibroblast-Interfe-

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roni Aminofläureanalyae und Amino-Terminal-Aminosäuresequenz), Science, 207, S. 525 - 526 (1980)). Und an der Aufklärung der Aminoaäuresequenz von authentischem Humanfibroblast-Interferon wird gearbeitet. Bis heute wurde die Aminoaäureaequenz des NHp-Terminua des authentischen auegereiften Proteins für die ersten 13 Aminosäurereate bekanntgegeben: Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser,.. (E. Knight, Jr., u.R., supra).

Berichten zufolge kodieren zwei ausgeprägte Gene, einea an Chromosom 2 und das andere an Chromosom 5 gelegen, für IPN-/3 (D.L. Slate und P.H. Ruddle, "Pibroblast Interferon In Man Is Coded By Two loci On Separate Chromosomes" (Fibroblast-Interferon beim Menschen wird durch zwei Stellen an getrennten Chromosomen kodiert), Cell, 16, S. 171 - 180 (1979)). Andere Untersuchungen zeigen jedoch, daß sich daa Gen für IPN-(*> an Chromosom 9 befindet (A. Medger, u.a., "Involvement Of A Gene On Chromosome 9 In Humanfibroblast Interferon Production" (Beteiligung einea Gens an Chromosom 9 bei der Erzeugung von Humanfibroblast-Interferon), Nature, 280, S. 493 - 495 (1979)).

Obwohl authentisches HuIFN-/3 glycosyliert wurde, ergibt die Entfernung der Carbohydrat-Komponente (P.J. Bridgen, u.a., "Human Lymphoblastoid Interferon" (Humanlymphoblastoid-Interferon) J. Biol. Chem., 252, S. 6585 - 6587 (1977) oder die Synthese von IFN-β in Gegenwart von Inhibitoren, die dazu beitragen, die Glycosylierung auszuschließen (W.E. Stewart, II, u.a., "Effect Of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties If Human Leucocyte Interferon" (Wirkung von Glycosylierunga-Inhibitoren auf die Erzeugung und Eigenschaften von Humanleukozyten-Interferon) Virology, 97, S. 473 (1979); J. Pujiaawa, u.a«, "Nonglycosylated Mouse L Cell Interferon Produced By The Action Of Tunicamycin" (Nicht-glycosyliertes Mäuse-L-Zellen-Interferon, erzeugt durch die Wir-

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kung von Tunlcamycin) J. Blol. Chem.. 253» S. 8677 - 8679 (1978); E.A. Havell, a.a., "Altered Molecular Species Of Human Interferon Produced In The Presence Of Inhibitors Of Glycoaylation" (Veränderte Molekülspezies von Human-Interferon, erzeugt in Gegenwart von Inhibitoren für die Glycosylierung), J, Blol. Chem., 252, S. 4425 - 4427 (1977)){ The Interferon System, S. 181) eine kleinere Form von IPN-/3 , die immer noch den größten Teil oder ihre gesamte IFN-Aktivität aufweist·

HuIFN-P kann wie viele Humanproteine auch polymorph sein. Daher können Zellen von bestimmten Individuen IFN-ß-Spezies innerhalb der allgemeineren IFN-P -Klasse erzeugen, die physiologisch dem Prototyp der Klasse, von der sie ein Teil ist, ähnlich sind, sich aber strukturell leicht unterscheiden. Wenn auch die Proteinstruktur des IFN-ß im allgemeinen gut definiert ist, so können doch einzelne Individuen IFN-ß e erzeugen, die leichte Variationen davon sind.

IFN-β ist gewöhnlich in normalen oder gesunden Zellen nicht nachweisbar (The Interferon System, S. 55 - 57)· Stattdessen wird das Protein durch die Einwirkung eines IFN-Induktors auf die Zelle erzeugt· IFN-Induktoren sind gewöhnlich Viren, können aber auch Nicht-Viren-Charakter haben, wie natürliche oder synthetische doppel-strängige RNA, intrazelluläre Mikroben, Mikrobenprodukte und verschiedene chemische Mittel. Zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um diese Nicht-Viren-Induktoren mit Erfolg dafür einzusetzen, Humanzellen gegenüber Virusinfektionen resistent zu machen (S. Baron und F. Dianzani (Herausg.) Texas Reports On Biology And Medicine 35 ("Texas Reports"), S. 528 - 540 (1977)). Diese Versuche waren nicht sehr erfolgreich. Stattdessen wird die Verwendung von exogenem HuIFN-fb nicht besonders bevorzugt·

Interferon-Therapie gegenüber Viren und Tumoren oder Krebs iat mit verachiedenen Dosismengen und unter verachiedenen Verabrei chungsmöglichkel ten durchgeführt worden (The Interferon Syatem, S. 305 - 321). Zum Beiapiel wurde Interferon wirksam oral durch Einimpfen — intravenös, intramuakulär, intranaaal, intradermal und subkutan — und in Form von Augentropfen, Salben und Sprays verabreicht. Ea wird gewöhnlich ein- bia dreimal täglich in Doaen von ΛΟΓ bia 10 Einheiten verabreicht. Die Dauer der Therapie hängt von dem Patienten und dem zu behandelnden Zuatand ab. Beiapielaweiae werden Virusinfektionen gewöhnlich durch tägliche Doaen oder Zweimal täglich verabreichte Doaen über einen Zeitraum von mehreren Tagen bia zu zwei Wochen und Tumore und Kreba gewöhnlich durch tägliche oder mehrmalige tägliche Doaen über mehrere Monate oder Jahre behandelt. Die wirkaamate Therapie für einen bestimmten Patienten muß aelbatverständlich von dem behandelnden Arzt bestimmt werden, der bo bekannte Paktoren wie den Verlauf der Krankheit, die vorausgegangene Therapie und die Reaktion des Patienten auf Interferon bei der Wahl der Verabreichungaweiae und einer Doaierung berücksichtigen wird.

AIa Antivirenmittel wurde HuIPN zur Behandlung folgender Erkrankungen verwendet: Infektionen der Atemwege (Texas Reports, S. 486 - 496); Herpes aimplex keratitis (Texas Reports, S. 497 - 500; R. Sundmacher, "Exogenous Interferon In Eye Diaeasea" (Exogenea Interferon bei Augenkrankheiten), International Virology IV, The Hague, Abstract, Nr. W2/11, S. 99 (1978)); Akuter haemorrhagiacher Conjunctivitia (Texas Reporta, S. 501 - 510); Adenovirua Keratoconjunctivitia (A. Romano, u.a», ISM Memo I-A8131 (Oktober 1979)); Varizellen-Zoster (Texaa Reports, S. 511 - 515); Cytomegalovirus-Infektion (Texas Reports, S. 523 - 527) und Hepatitis B (Texas Reports, S. 516 - 522). Siehe auch The Interferon System, S. 307 - 319. Die Anwendung von IFN als Antivirusmittel in größerem Umfang macht Jedoch größere Mengen IFN erforderlich als bisher zur Verfügung gestanden haben.

Neben seiner Antlvirua-Wirküng hat IPN noch andere Wirkungen. Zum Beispiel wirkt es dem Einfluß dea Kolonieatimulationafaktora entgegen, ea inhibiert daa Wachatum haemopoitischer Koloniebildungazellen und stört die normale Differenzierung von Granulocyten- und Makrophagenvorläufern (Texas Reporta _t S. 343 - 349). Ea inhibiert ebenfalla die Erythrold-Differenzierung in EMSO-behandelten Priend-Leukämiezellen (Texaa Reporta. S. 420 - 428). Ea iat bemerkenai/iert, daß einige Zeil-Reihen wesentlich empfindlicher auf HuIPN- β ala auf HuIPN-^ in dieser Beziehung reagieren (S. Einhorn und H. Strander "Ia Interferon Tiaaue-Specific? - Effect Of Human Leucocyte And Fibroblast Interferone On The Growth Of Lymphoblaatoid And Oateoaarcoma Cell Lines" (Iat Interferon geviebe-spezifiach ? - Einfluß von Humanleukozyten- und -fibroblaat-Interferonen auf daa Wachatum von lymphoblaatoid- und Oateoaarcom-Zellreinen) J. Gen. Vlrol.. 35, S. 573 - 577 (1977); T. Kuwata, u.a., "Compariaon Of The üuppreaaion Of Cell And Virua Grovith In Transformed Human Cella By Leucocyte And Pibroblaat Interferon" (Vergleich der Unterdrückung von Zellen- und Vlrusvsachatum in tranaformierten Humanzellen durch Leukozyten- und Pibroblaat-Interferon), J. Gen. Vlrol«, 43, S. 435 - 439 (1979)).

IPN kann auch eine Rolle bei der Regulierung der Immunreaktion spielen· Zum Beispiel kann IPN in Abhängigkeit von der Doala und der Verabreichungadauer in bezug auf daa Antigen in vivo und in vitro immunopotenzierend und immunoauppreaaiv sein (Texaa Reporta, S. 357 - 369). Außerdem konnte beobachtet werden, daß spezifisch aenaibiliaierte Lymphozyten IPN nach Kontakt mit Antigen erzeugen. Ein derartiges antigen-induziertea IPN könnte aomit ein Regulator für die Immunreaktion eein und die zirkulierenden Antigenspiegel und die Expreaaion von ZeIlimmunität beeinfluasen (Texaa Reporta, S. 370 - 374)« Ea ist auch bekannt, daß IPN die Aktivität von Killerlymphozyten und die von Antikörpern abhängige, zell-mittelbare Zytotoxizität

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verstärken kann (R.R. Herberman, u.a., "Augmentation By Interferon Of Human Natural And Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity" (Durch Interferon verstärkte natürliche und von Antikörpern abhängige, zell-mittelbare Zytotoxizität bei Menschen), Nature, 277, S. 221 - 223 (1979); P. Beverley und D. Knight, "Killing Cornea Naturally" (Töten erfolgt natürlich) Nature, 278, S. 119 - 120 (1979); Texas Reports, S. 375 - 380; J. R. Huddiestone, u.a., "Induction And Kinetics Of Natural Killer Cells in Humans Following Interferon Therapy" (Induktion und Kinetik natürlicher Killerzellen bei Menschen nach der Interferon-Therapie), Nature, 282, S. 417 419 (1979); S. Einhorn, u.a. _t "Interferon And Spontaneous Cytotoxicity In Man. II. Studies In Patients Receiving Exogenous Leukocyte Interferon" (Interferon und spontane Zytotoxizität bei Menschen. II. Untersuchungen an Patienten, die exogenes Leukozyten-Interferon erhielten) Acta Med. Scand», 204, S. 477 - 483 (1978)). Beide können direkt oder indirekt an dem immunologischen Angriff auf Tumorzellen beteiligt sein.

Daher findet HuIPN neben seiner Anwendung als Antivirusmittel auch potentielle Verwendung in der Antitumor- und Antikrebetherapie (The Interferon System, S. 319 - 321 und 394 - 399). Es ist Jetzt bekannt, daß IFNe das Wachstum vieler Klassen von Tumoren bei vielen Tieren beeinträchtigen (The Interferon System, S. 292 - 304). Sie scheinen wie auch andere Antitumormittel am wirksamsten zu sein, wenn sie gegen kleine Tumore angewandt werden. Die Antitumorwirkungen von Tier-IFN sind von der Dosierung und der Zeit abhängig, sei wurden aber bei unter den toxischen Mengen liegenden Konzentrationen demonstriert. Daher wurden zahlreiche Untersuchungen und klinische Versuche auf die Antikrebseigenschaften von HuIFNen gerichtet und werden in diesem Sinne weitergeführt. Dazu gehört die Behandlung von verschiedenen bösartigen Erkrankungen wie Osteosarkom, akute Myeloidleukämie, multiples Myelom und Hodgkinsche Krankheit (Texas Reports, S. 429 - 435).Außerdem

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konnte kürzlich gezeigt werden, daß HuIPN- β lokale Tumorregreaaion hervorruft, wenn ea in subkutane Tumorknoten bei an Melanomkarzinom und Bruatkarzinom erkrankten Patienten injiziert wird (T. Nemoto, u.a., "Human Interferone And Intraleaaional Therapy Of Melanoma And Breaat Carcinoma" (Humaninterferon- und Intraleaionaltherapie bei Melanom- und Bruatkarzinom), Amer. Aasoc, For Cancer Reaearch, Abachn. Nr. 993t S. 246 (1979)). Obwohl die Ergebnisse dieser klinischen Versuche sehr ermutigend sind, wurde die Anwendung von IFN-ß gegen Tumore und Krebs sehr stark durch die unzureichende Bereitstellung von gereinigtem IFN-β behindert.

Bemerkenswert ist, daß einige Zellreihen, die den antizellularen Wirkungen von ΙΡΝ-Λ widerstehen, gegenüber IFN- β empfind lieh bleiben. Dieae unterachiedliche Wirkung legt nahe, daß IFN-β mit Erfolg gegen bestimmte Klassen von resistenten Tumorzellen angewandt werden könnte, die unter selektivem Druck bei mit hohen Losen von IFN-dt behandelten Patienten auftreten (T. Kuwata, u.a., aupra; A.A. Creasy, u,a», "The Role Of G₀-G₁ Arrest In The Inhibition Of Tumor Cell Growth By Interferon" (Die Rolle der Gq-G--Arretierung bei der Inhibition dea Tumorzellenwachatuma durch Interferon), Auazüge, Conference On Regulatory Functiona Of Interferons (Konferenz über die Regulationafunktionen von Interferonen), N.Y. Acad. Sei., Nr. 17 (23. - 26. Oktober 1979)).

Auf der biochemischen Ebene induzieren IFNe die Bildung von mindestens 3 Proteinen, einer Protelnkinase (B. Lebleu, u.a., "Inferferon, Double-Stranded RNA And Protein Phosphorylation" (Interferon, doppelaträngige DNA und Protein-Phoaphorylierung), Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 73, S. 3107 - 3111 (1976); A. G. Hovaneasian und I.M. Kerr, »The (2·-5')01igoadenylate (ppp Α2·-5Α2'-5'A) Synthetase And Protein Kinaae(s) From Interferorn-Treated Cells" (Die (2'-5') Oligoadenylat

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(ppp A2'~5A2'-5'A)-Synthetaae und Protelnklnase(n) von mit Interferon behandelten Zellen), Ear» J. Biοehem., 93» S. 515-526 (1979)), eine (2·-5*)01igo(A)-Polymerase (A. G. Hovanessi- ^an* n.a«, "Synthesis Of Lov»-Molecular Weight Inhibitor Of Protein Synthesis With Enzyme Prom Interferon-Treated Cells" (Synthese eines niedrigmolkularen Inhibitors der Proteinsynthese mit Enzym von mit Interferon behandelten Zellen), Nature,· 268, S. 537 - 539 (1977)J A. G. Hovanessian und I. M. Kerr, Eur. J. Bipchem, supra) und eine Phosphodiesterase (A. Schmidt, u.a., "An Interferon-Induced Phosphodiesterase Degrading (2'-5')oligoisoadenylate And The C-C-A Terminus If tRNA" (Eine durch Interferon induzierte Phosphodiesterase, die (2'-5') Oligoisoadenylat und den C-C-A Terminus von tRNA abbaut), Proc. Natl. Aoad. Sei. USA, 76, S. 4788 - 4792 (1979)).

Beide IFN-β und I¥E-<k scheinen ähnliche enzymatische Wege auszulösen (C. Baglioni, "Interferon-Induced Enzymatic Activities And Their Role In The Antiviral State" (Durch Interferon induzierte enzymatische Aktivitäten und ihre Rolle im Antivirua-Status), Cell, 17, S. 255 - 264 (1979)), und beide können sich einen gemeinsamen aktiven Kern teilen, da sie beide einen Chromosom-21-kodierten Zellrezeptor erkennen (M. Wiranowska-Stevmrt, "The Role Of Human Chromosome 21 In Sensitivity To Interferons" (Die Rolle von Human-Chromosom 21 bei der Sensibilität gegenüber Interferonen) J. Gen. Virol., 37, S. 629 - 634 (1977)). Das Auftauchen eines oder mehrerer dieser Enzyme in mit IFN behandelten Zellen müßte eine weitere Charakterisierung von Proteinen mit einer IfN-artigen Aktivität ermöglichen.

Heute wird HuIFN-ß durch Humanzellreihen, die in GeMiebekulturen gezüchtet werden, erzeugt· Ein großer Erzeuger stellt nur 40 - 50 χ 10 Einheiten rohes IFN-ß pro Jahr her (V.G_e U-*Eu» "Human Interferon; Large Scale Production In Em-

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bryo Fibroblast Culturea" (Human-Interferon: Maasenproduktion in Embryo-F ibrobl aatkult uren), in Hainan Interferon (W.R. Stinebring und P.J· Chappie, Herausg·), Plenum Publishing Corp S. 55 - 60 (1978)). Nach der Reinigung durch Adsorption auf kontrollierten Porenglasperlen kann IFN-/3 mit spezifischer Aktivität von etvia 10 Einheiten/mg in einer Ausbeute von 50 % aus den rohen Zellextrakten gewonnen werden (A. Billiau, u.a., "Human Fibroblaat Interferon For Clinical Trials: Production, Partial Purification And Characterization" (Human-Fibroblast-Interferon für klinische Versuche: Erzeugung, tei] vieise Reinigung und Charakterisierung) Antimicrobial Agents And Chemotherapy, S. 49 - 55 (1979)). Eine ineitere Reinigung

bia zu einer spezifischen Aktivität von etwa *\Q Einheiten/mg kann durch Zinkchelat-Affinitätaohromatographie mit etvia , 100 tigern Erfolg vorgenommen werden (A. Billiau, u.ao, "Production, Purification And Properties Of Human Fibroblast Interferon" (Erzeugung, Reinigung und Eigenschaften von Human-Fibroblast-Interferon), Abstracts, Conference On Regulatory Functions Of Interferons, N.Y. Acad. Sei. Nr. 29 (22. - 26_β Oktober 1979)). Da die spezifische Aktivität von HuIM-P so hoch ist, ist die für kommerzielle Anwendungsfälle gebrauchte Menge von IFN-^i gering. Zum Beispiel würden 100 g reines IFN-ß 3 bis 30 Millionen Dosierungen ergeben.

Durch neuere Fortschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie ist es möglich geworden, die für spezifische nicht-bakterielle eukaryotische Proteine kodierende DNA in Bakterienzellen einzufügen© Im allgemeinen umfaßt die Konstruktion de artiger Rekombinant-DNA-Moleküle mit einer anderen als der durch chemische Synthese hergestellten DNA folgende Schritt Erzeugung einer einstrangigen DNA-Kopie (cDNA) einer gereinigten Measenger-RNA (mRNA)-Template für das verlangte Protein; Umwandlung der cDNA in doppelsträngige DNA; Anfügung der DNA an eine entsprechende Stelle in einem entsprechenden Cloningvehikel zur Bildung eines Rekombinant-DNA-Moleküls

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und Tranaformieren einea entsprechenden Wirtes mit diesem Rekombinant-DNA-Molekül. Durch eine solche Transformation kann der Wirt das verlangte Protein erzeugen. In E. coil sind verschiedene nicht-bakterielle Gene und Proteine unter Anwendung der Rekombinant-DNA-Technologie gewonnen worden. Dazu gehören beispielsweise IPN-<^ (S. Nagata, U_- .a., "Synthesis In E. coli Of A Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity" (Synthese eines Polypeptides mit Humanleukozyten-Interferon-Aktivität in E. coli), Mature, 284, S. 316 - 320 (198O)). Außerdem wurde dieRekombinant-DTTA-Technologie zur Erzeugung eines Plasmids angewandt, von dem behauptet wird, daß es eine für IPN-/5 kodierende Gen-Sequenz enthält (T. Taniguchi, üjjij_t "Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Pibroblast Interferon Gene Sequence" (Konstruktion und Identifikation eines Bakterienplasmids, das die Human-Pibroblast-Interferon-Gensequenz enthält), Proc. Japan Acad. Ser. B.. 55, S. 464 - 469 (1979)).

Doch in keiner der vorstehenden Veröffentlichungen ist die tatsächliche Gensequenz von IPN-ß beschrieben worden und in keiner wurde diese Sequenz mit der ursprünglichen Aminosäure-Sequenz oder der Aminosäurezusammensetzung von authentischem IPW-/J verglichen. Die früheren Arbeiten konzentrierten sich nur auf ΙΡΝ-Λ , ein bestimmtes chemisches, biologisches und immunologisches Interferon der Klasse I von IPN-β (cf, supra). Di6 letztere Veröffentlichung basiert lediglich auf Hybridisierungswerten. Mit Hilfe dieser Angaben alleine kann man nicht bestimmen, ob das gewählte Clon die vollständige oder tatsächliche für IFN-ß kodierende Gensequenz enthält, oder ob die geclonte Gensequenz in der Lage sein wird, IPN-ß in Bakterien zu verwirklichen. Die Hybridisierung besagt nur, daß ein bestimmter DNA-Insert bis zu einem gewissen Grade einer mRNA-Komponente der PoIy(A)-RNA homolog und komplementär dazu ist, die bei der Injektion in Oocyten Interferonaktivität induziert. Außerdem ist das Ausmaß irgendwelcher Homologie von

den für den Screenlngprozeß gewählten Hybridisierungsbedingungen abhängig. Daher kann die Hybridiaierung zu einer mRNA-Komponente von PoIy(A)-RNA alleine nicht demonatrieren, daß es sich bei der gewählten DNA-Sequenz um eine Sequenz handelt, die für HuIFN-/i oder ein Polypeptid, daa die immunologische oder biologische .Aktivität von HuIPN- β aufweist, kodiert, oder ob sich eine aolche Sequenz für die Erzeugung derartiger Polypeptide in entsprechenden Wirten eignet.

Auf einem Seminar am 25. Februar 1980 in Zürich behauptete Taniguchi, daß er die Nucleotid-Sequenz für einen seiner Hybridiaierungaclone bestimmt habe. Er sagte außerdem, daß die ersten 13 durch diese Sequenz kodierten Aminosäuren mit den von Knight, u.a., aupra für authentisches HuIFN-ß bestimmten identisch waren. Taniguichi hat nicht die volle Nucleotidaequenz für seinen Clon bekannt gegeben und auch nicht aeine Ami noaäurezuaammenaetzung mit der für authentisches HuIFN-/! bestimmten verglichen. Tanigulchi hat inzwischen die volle Nucleotid-Sequenz für sein Hybrid isierungsclon bekannt gegeben (T. Taniguichi, u.a., Gene, 10, S. 11 - 15 (1980)). Die Sequenz weicht um ein Nucleotid von der in der Britischen Patentanmeldung 8011306, eingereicht am 3» April 1980, beschriebenen und beanspruchten ab, eine Anmeldung gegenüber der die vorliegende Abmeldung Priorität beansprucht. Die von Taniguichi veröffentlichte Aminosäuresequenz ist mit der in der vorstehenden Anmeldung beachriebenen und beanspruchten identisch. Taniguichi hat auch nichts über die Expression in einem entsprechenden Wirt von Polypeptiden, die eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFN- (?> besitzen, zum Zeitpunkt der Einreichung der Britischen Patentanmeldung 80.18701, eingereicht am 6. Juni 1980, gesagt, eine Anmeldung gegenüber der die vorliegende Anmeldung Priorität beanaprucht Es aind diese Expression in einem Wirt von Polypeptiden, die eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFN-/$ zeigen, und die Methoden, Polypeptide, Gene und Rekombinant-

DNA-Moleküle davon, die die vorliegende Erfindung kennzeichnen O

Die Erfindung hat auch nicht das Ziel, wie die offensichtliche Vermutung der Research Disclosure Nr. 18309, S. 36I 362 (1979) besagt, reine oder im wesentlichen reine IFN-** mRNA herzustellen, ohne vorher zu versuchen, das IPN-Gen zu clonen oder dem Fibroblast-Interferon ähnliche Polypeptide in Bakterienvfirten zu erzeugen.

Schließlich sollte man einsehen, daß die Selektion einer DNA-Sequenz oder die Konstruktion eines Rekombinant-DNA-Moleküls, das zu einer mRNA von PoIyA-RMA hybridisiert, wobei die mRNA HuIFN-Aktivität in Oocyten erzeugt, nicht ausreicht, um zu demonstrieren, daß die DNA-Sequenz oder der Hybridinsert des Rekombinant-DNA-Moleküla HuIPN entspricht. Stattdessen kann bei einem fehlenden Vergleich der durch eine bestimmte DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz des authentischen Proteins nur die Erzeugung eines Polypeptids, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPl¹I aufweist, tatsächlich demonstrieren, daß die ausgewählte DNA-Sequenz oder das konstruierte Rekombinant-DNA~Molekül HuIPW entspricht. Wichtiger ist noch, daß erst nach dem Nachweis solcher HuIFN-Aktivität die DNA-Sequenz, das Rekombinant-DNA-Molekül oder mit ihnen verwandte Sequenzen mit Erfolg für die Selektion anderer, HuIPN entsprechender Sequenzen gemäß der Erfindung verwendet werden können, oder um Rekombinant-DNA-Moleküle zu erzeugen, die Produkte mit einer immunologischen oder biologischen Aktivität von HuIM-/2> verwirklichen.

Man wird somit aus dem Vorstehenden klar erkennen, daß das Problem der Erzeugung von HuIPN-& unter Anwendung der Rekombinant-DNA-Technologie sich ganz wesentlich von jedem der

oben beschriebenen Verfahren unterscheidet· Hier maß eine bestinmte DNA-Sequenz mit unbekannter Struktur - diejenige, die für die Expression von HuIM- β in einem entsprechenden Wirt kodiert - in einem hoch komplizierten Gemisch von ΕΝΑ-Sequenzen gefunden und daraua abgetrennt werden, damit sie für die Erzeugung von HuIFN-f& verwendet werden kann. Außerdem wird die see Lokallaierungs- und Trennungsproblem noch durch die vorausgesagte übermäßig geringe Konzentration der verlangten DNA-Sequenz in dem komplizierten Gemisch und den Mangel an einem wirksamen Mittel zur raschen Analyse der vielen DNA-Sequenzen des Gemische, um die gewünschten Sequenz selektieren und abtrennen zu können, vergrößert.

Ziel der Erfindung:

Mit Hilfe der Erfindung sollen die erläuterten Probleme dadurch gelöst werden, daß für die Expression von HuIPN-β in einem entsprechenden Wirt kodierende DNA-Sequenzen lokalisiert und abgetrennt werden, um dadurch DNA-Sequenzen, Rekombinant-DNA-MoIeküle und Methoden zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe ein Wirt transformiert wird, um ein, eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanflbroblast-Interferon aufweisendes Polypeptid zu erzeugen·

Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPN-β aufweisen, für die Verwendung als Mittel gegen Viren, Tumore und Krebs und bei Behandlungsmethoden zu gewinnen. Die Erfindung ermöglicht die Produktion dieser Polypeptide in Mengen und mit Hilfe von Methoden, die bisher nicht zur Verfügung standen·

Darlepunp des Wesens der Erfindung:

Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgehen wird, sind dii

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erf lndungagemäßen DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle in der Lage, in einem entsprechenden Wirt die Erzeugung von . eine inmunologische oder biologische Aktivität von HuIFN-ß aufweisenden Polypeptiden zu bestimmen. Die Replikation dieser DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle in einem entsprechenden Wirt ermöglicht auch die Erzeugung von für diese Polypeptide kodierenden Genen in großen Mengen. Die Molekülstruktur und die Eigenschaften dieser Polypeptide und Gene sind leicht zu bestimmen. Die Polypeptide und Gene sind entweder in der im Wirt erzeugten Form oder nach entsprechenden Derivatisierung oder Modifizierung in Zusammensetzungen und für Methoden zum Nachweis und zur Verbesserung der Erzeugung dieser Produkte selbst und für die Verwendung bei Mitteln gegen Viren, Tumore und Krebs und Behandlungsmethoden und in der Immunomodulation nützlich.

Das vorliegende Verfahren unterscheidet sich daher insofern von den oben erwähnten bisherigen Verfahren, als dieses Verfahren im Gegensatz zu den genannten bisherigen Verfahren die Herstellung und Selektion von DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Molekülen betrifft, die entsprechende DNA-Sequenzen enthalten, die für mindestens ein eine immunologische oder biologische A ktivität von HuIM-/3 aufweisendes Polypeptid kodieren.

Aus dem Vorstehenden wird man erkennen, daß das grundlegende Merkmal der Erfindung die Schaffung einer DNA-Sequenz ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPN-ß> aufweisendes Polypeptid kodiert und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den DNA-Inserts von G-pHFIF-1, G-pHFIF-3, G-pHFIF-6, G-pHFIF-7, G-pPla-HFIF-67-12, G-pPla-HFIF-67-12Ä19» G-pPla-HIFI-67-8, G-pPla-HIFI-67-12Δ279T, G-pPla-HFIF-67-12Δ218Μ1, G-pPla-HFIF-67-12AM1, G-pPla-HFIF~67-12A 19BX-2,

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DNA-Sequenzen, die zu einem der vorstehenden DNA-Inserts hybridisieren, DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen, mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen oder Inserts, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons umfassen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie ein Polypeptid aufweist, das bei Expression der Codons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen dafür kodiert wurde. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie die Produktion von HuIPN-/3 und HuIFN-ß>-artigen Polypeptiden in Wirten ermöglichen.

Auafuhrungsbe!spiele^

In den Zeichnungen stellen dari

Fig₀ 1i eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemaßen Verfahrens zur Herstellung eines Gemischs von Rekombinant-DNA-Molekülen, von denen einige durch eingefügte DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, gekennzeichnet sind;

Fig. 2 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Initial-Clon-Screening-Verfahrens;

Flg. 3s eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Clon-Screening-Verfahrens unter Verwendung von erfindungsgemäß erzeugten DNA-Sequenzen;

Fig. 4: die Darstellung der zusammengesetzten Nucleotid-Sequenz des Kodierungsstranges von HuIFN-(X-DNA. Die Sequenz ist vom Beginn des Inserts bis in den nicht übersetzten Bereich des Inserts numeriert. Die Nucleotide 65 - 127 stellen eine Signalsequenz dar und die Nucleotide 128 - 625 das "ausgereifte" Fibroblast-Interferon. Die Aminosäuresequenzen des Signalpeptidea sind über ihren jeweiligen Nucleotidsequenzen angegeben; wobei die Aminosäuren des Signalpolypeptids von -21 bia -1 numeriert sind und die Aminosäuren von vollentwickeltem Interferon von 1 bis 166 numeriert sind. Eine Überprüfung der Restriktions- und Fragmentanalysedaten der HuIFN-A-DNA, die in den in Verbindung mit der Britischen Patentanmeldung 80.11306, eingereicht am 3. April 1980, hinterlegten Kulturen vorhanden 1st, hat ergeben, daß zwei Nucleotide in Fig. 4 im Vergleich der Fig. 4 jener Britischen Patentanmeldung verändert worden sind. Diese Veränderungen sind in der der vorgeschlagenen Signalsequenz von HuIFN-β -DNA vorausgehenden nicht übersetzten Sequenz vorgenommen worden. Diese Veränderungen haben keinen Einfluß auf die Sequenz von HuIFN-ß-DNA oder die Aminosäuresequenz ihres Tranalationaproduktea und verändern auch nicht die Verwendung der Sequenz als Hybridiaierungsaonde zum Screening von Clonen für HuIFN- β verwandte DNA-Inaerts.

Fig. 5i die Orientierungs- und Restriktionskarten verschiedener erfindungagemäßer Plasmide;

Fig, 6: einen Vergleich der Aminosäurezusammensetzung von Humanfibroblast-Interferon, wie sie erfindungsgemäß bestimmt wurde, und wie sie von authentischem Fibroblast-Interferon bestimmt wurde;

Fig. 7i eine Restriktionskarte des erfindungsgemäßen HuIFN-β -

- ie - 11 8 ö y y ι

Gens und der für das Sequenzieren von pHFIF3, pHFIF6 und pHFIF7 angewandten Sequenzierungsstrategie;

Fig. 8j eine achematische Darstellung der Konstruktion dea erfingungsgemäßen Rekombinant-DNA-Möleküls pPla-HFIF-67-1;

Pig. 9ί eine achematlache Darstellung der Konstruktion dea erfindungagemäßen Rekombinant-ENA-Moleküla pPla-HPIP-67-12 und pPLa-HPIF-67-12 U19;

Fig. 10: eine aohematlache Daratellung der Konstruktion des erfindungagemäßen Rekombinant-DNA-Moleküls pPLc-HPIP-67-8;

Pig. 11: eine schematische Daratellung der Orientierungs- und Partialreatriktionakarte dea erfindungagemäßen pPla-HFIF-67-12;

Pig. 12ί eine schematische Daratellung der Orientierungs'- und Partialreatriktionakarte von erfindungsgemäßem pPLa-HFIF-67-12Δ19;

Pig. 13s eine achematische Darstellung der Orientierungs- und Partialreatriktionakarte von erfindungagemäßem pPLc-HPIPI-67-8.

Zum besseren Veretändnls der hler dargelegten Erfindung folgt eine ausführliche Beschreibung.

In der Beschreibung werden folgende Bezeichnungen verwendet:

Nacleotld - Eine Monomer-Einheit von DNA oder RNa, die aus einer Zuckerkomponente (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base besteht· Die Base ist über den Glycosid-Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) mit der Zuckerkomponente verbunden, und diese Kombination von Base und Zucker wird ein Nucleosid genannt· Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin (¹¹A"), Guanin (^MG^M)i Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").

DNA-Sequenz - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander durch Phosphodiester-Bindungen zwischen dem 3'~ 5'-Kohlenstoff benachbarter Pentosen verbunden sind.

Cpdon - Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), die durch mRNA ein Translations-Initiierungssignal oder ein Translatione-Terminationssignal kodiert. Zum Beispiel kodieren die Nucleotidtripletts TTA, TTG, OTT, CTC, CTA und CTG für das Aminosäure-Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translations-Terminationssignale und ATG ist ein Translations-Initiierungasignal.

Orientlerungssyatem (reading frame) - Die Gruppierung von Codons während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß das richtige Orientierungssystem (reading frame) beibehalten werden. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Orientierungasystemen (reading frames) oder Phasen verwirklicht werden, von denen jede eine andere Aminosäuresequenz ergibt:

GCT GGT TGT AAG — Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG — Leu-Val-Val ⁰⁰ TGG JTTG TAA G — Trp-Leu-(STOP)

Polypeptid - Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den </ -Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind·

Genom - Die gesamte MA einer Zelle oder eines Virus. Es umfaßt unter anderem die für die Polypeptide der Substanz kodierenden Strukturgene, sowie Operator-, Promotor- und Ribosombinde- und-wechselwirkungs-Sequenzen, einschließlich Sequenzen wie die Shine-Delgarno-Sequenzen.

Strukturen - Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Template- oder Messenger-RNA ("mRNA") eine für ein spezifisches Polypeptid charaktersitische Sequenz von Aminosäuren kodiert.

Transcription - Der Prozeß der Erzeugung von mRNA von einem Strukturgen.

Translation - Der Prozeß der Erzeugung eines Polypeptide von mRNA.

Expression - Der Prozeß, den ein Strukturgen zur Erzeugung eines Polypeptide durchläuft. Es handelt sich um eine Kombination von Transcription und Translation.

Plasmid - Eine nicht-chromosome doppelsträngige DNA-Sequenz,

die ein intaktes "Replikon" aufweist, so daß sich das Plasmid in einer Wirtszelle replizieren kann. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus untergebracht wird, können die Eigenschaften dieses Organismus infolge der DNA des Plasmids verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transfor-

- 2t -

Τ3

raiert ein das Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tet ) tragendes Plasmid eine zuvor gegenüber Tetracyclin empfindliche Zelle in eine diesem gegenüber reaistente. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird ala "Transformant" bezeichnet«

J^ de, £, .„Pakt er i op nage - Bakterienviren, von denen viele aus in eine Proteinhülle oder -mantel ("Capaid") eingekapselten DMA-Sequenzen bestehen.

~ ^Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die sich in einer Wirtszelle replizieren kann, gekennzeichnet durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungssteilen, an denen derartige DNA-Sequenzen in einer vorher bestimmbaren Weise abgebrochen werden können, ohne daß sich daraus der Verlust einer wesentlichen biologischen "Funktion der DNA ergibt, z* B. Implikation, Erzeugung von Coat-Proteinen oder Verlust von Promotor- oder Bindestellen, und die eine Markierungssubstanz enthalten, die zur Verwendung bei der Identifizierung transformierter Zellen geeignet ist, z. B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz, Ein Cloning-Vehilcel wird oftmals als Vektor bezeichnet.

- Der Prozeß zur Gewinnung einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Vermehrung gewonnen wurden*

Rekombinan;^ oder Hybrid-.ΏΚΓA - Ein Molekül, das aus

Segmenten von DNA von verschiedenen Genomen besteht, die hintereinander außerhalb von lebenden Zellen vereinigt worden sind und die Fähigkeit haben, einige Wirtszellen zu infizieren und darin zurückgehalten werden können.

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Expressions-Kontroll-Sequenz - Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Strukturgenen steuert und reguliert, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft iat· Sie enthalten das lao-Syatem, Hauptoperator- und -promotor-Regionen von Phage X , die Kontrollregion von fd-Coat-Protein und andere Se quenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und deren Viren steuern.

In Fig. 1 wird eine schematiscbe Darstellung einer Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung eines Gemische von Rekombinant-DNA-Molekülen gezeigt, von denen einige eingefügte DNA-Sequenzen aufweisen, die die Erfindung kennzeichnen.

Darstellung von PoIy(A)RNA, die Humanfibroblast-Inferferon mMA (IFN-A-mRNA) enthält

Die im Rahmen der Erfindung verwendete RNA wurde aus Human-VGS-Zellen extrahiert, einer Diploid-Pibroblast-Zellreihe, die in Einschichtkulturen bei 37 ⁰C vermehrt werden kann· INP-/5 wird in diesen Zellen nach der Induktion mit PoIy(I,C) in Gegenwart von Cycloheximid erzeugt.

Für eine typische RNA-Isolierung wurde jede der 20 Rollflaachen mit Diploid-VGS-Zellen in zusammenlaufender Monoschicht über Nacht mit 100 Einheiten IFN-ß je ml "angeregt", und die Kulturen wurden 1 h lang mit 100 /Ug/ml PoIy(I, C) und 50 .ug/ml Cycloheximid induziert, mit Cycloheximid (50/Ug/ml) 4 h lang inkubiert, durch Abkratzen in mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung geerntet und ausgeschleudert. Die Zellen wurden 15 min bei O ⁰C lysiert, um den intakten, die DNA enthaltenden Zellkern zu entfernen und die cytoplasmische RNA zu isolieren, indem sie in hypertonischer Pufferlösung (10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,4), 10 mM NaCl und 1,5 mM MgCL₂V suspen-

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alert wurden und NP40 bis 1 % zugegeben wurde· Die Zellkerne wurden durch 5 min Pelletisieren in einem Sorvall-Rotor SS-34 mit 3000 U/min entfernt. Natriumdodecylsulfat ("SDS") und EDTA wurden zur obenstehenden Flüssigkeit bis 1 % bzw. 10 mM gegeben, und das Gemisch wurde fünfmal mit 2 χ Volumen von 1*1 redestilliertem Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (25 51) extrahiert, wobei die die RNA enthaltenden wäßrigen Phasen durch 10 min Zentrifugieren in einem Sorvall Rotor SS-34 mit 8000 U/min nach jeder Extraktion getrennt wurden. Die RNA wurde aus der wäßrigen Phase durch die Zugabe von T/10 VoI 2 M Natriumacetat (pH-Wert 5,1) and 2,5 VoI Äthanol ausgefällt. Gewöhnlich wurden 60 bis 90 /Ug der gesamten cy~ toplaamischen RNA je Rollflasche gewonnen.

Andere Verfahrensweisen wurden zur Extraktion der cytoplasmiachen RNA gleichfalls angewandt. Beispielsweise wurden die Zellen nach der Homogenisierung in 0,2 M Tri-HGl (pH-Wert 9,0), 50 mM NaGl, 20 mM EDTA und 0,5 % SDS vollständig Iysiert und mit Phenol-Chloroform wie oben extrahiert (P.H. Reynolds, u.a», "Interferon Activity Produced By Translation Of Human Interferon Messenger RNA In Cell-Free Ribosomal Systems And In Xenopus Oocytes" (Durch Translation von Human-Interferon-Mesaenger RNA in zell-freien Ribosom-Systemen und in Xenopas Oocyten erzeugte Interferon-Aktivität). Prοc. Nat1^_-Aoad. Sei. USA, 72, S. 4881 - 4887 (1975)) oder die gewaschenen Zellen wurden in 400/Ul 0,1 M NaCl, 0,01 M Tri-HGl (pH-Wert 7,5) und 0,001 M EDTA ("NTE-Puffer") suspendiert, und es wurden 2,5 ml 4 M Guanidiniuraisothiocyanat und 1 Wiß-Mercaptoäthanol in 20 mM Natriumacetat (pH-Wert 5»0) zugegeben und die Zellen homogenisiert. Das Lysat wurde auf eine 1,3-ml-Unterlage von 5,7 M GsCl in einem Beckmann-SW-60 Ti-Nitrocellulose-Röhrchen aufgetragen, 17 h lang mit 39 000 U/min zur Pelletisierung der RNA und zu ihrer Trennung von DNA Proteinen und Lipiden zentrifugiert, und die RNA wurde einmal mit Phenol-Chloroform extrahiert (J. Morser, u.a.,

"Characterization Of Interferon Messenger RNA Prom Human Lymphoblastoid Cells" (Charakterisierung von Interferon-Messenger RNA von Humanlymphoblastoidzellen), J. Gen. Virol., 44» S. 231 - 234 (1979)).

Die gesamte RNA wurde auf die Anwesenheit von IM- β -mRNA durch Injektion in das Cytoplasma von Xenopua laevia Oooyten und die Bestimmung der darin induzierten IPN-ß-Aktivitat analysiert (J. Reynold, u.a.» aupra). Die Analyse wurde durch Auflösen von RNA in Wasser und die Injektion von etwa 50 nl in jede Oocyte vorgenommen· Die Oocyten wurden über Nacht bei Raumtemperatur in Barth-Medium inkubiert (J. Gurdon, J. _m Embrvol. Exper. Morphol., 20, S. 401-414 (1968)), in einem Teil dea Mediums homogenisiert, die Bruchstückchen durch Zentrifugieren entfernt und die IPN-ß-Aktivltat der überatehenden Flüssigkeit bestimmt· Der Nachweis der IPN-/?>-Aktivität erfolg te durch Reduzierung der durch Viren induzierten cytopathischen Wirkung (W.E. Stewart und S.E. Sulkin, "Interferon Production In Hampsters Experimentally Infected With Rabies Virus" (Interferon-Erzeugung in Hamstern, die experimentell mit Tollwutvirus infiziert worden waren), Proc» Soc. Bxp. Biol. Med., 123, S. 650 - 653 (1966)). Der Angriffsvirus war VesiculärstomatitisviruB (Indiana-Stamm) und bei den Zellen handel te es sich um Human-Diploid-Fibroblaste, die Trisomie für Chromosom 21 zur Erzielung höherer IFN-ß-Sensibilität aufwiesen. Die IPN- /3-Aktivität wird im Verhältnis zu dem IFN-Bezugsstandard 69/19 angegeben.

IPN-β-mRNA enthaltende PoIy(A)-RNA wurde von der cytoplasmiachen RNA durch 10 min Adsorption auf 01igo(dT)-Cellulose (Typ 7, P-L Biochemical) in 0,4 M NaCl, 10 mM Tri-HCl (ph-Wert 7»8), 10 mM EDTA und 0,2 % SDS bei Raumtemperatur iaoliert. Die Aggregat ion von RNA wurde durch 2 min langes Erhitzen der RNA vor der Adsorption auf 70 ⁰C auf ein Mindest-

maß reduziert. Nach dem Waschen der Cellulose mit dem oben genannten Puffer, wurde die Poly(A)-RNA-Fraktion mit 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA und 0,2 % SES eluiert. Sie enthielt gewöhnlich 4 bis 5 % der Gesamt-RNA, wie durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm ermittelt wurde.

Eine weitere Reinigung, um die PoIy(A)-ENA mit IFN-|5-mRNA anzureichern, wurde mit Hilfe von Formamid-Saccharose-Gradienten vorgenommen (T. Pawson, u.a., "The Size Of Rous Sarcoma Virus mRNAs Active In Cell-Free Translation" (Größe von Rous-Sarkom-Virus-rnRNAen, die bei der zell-freien Translation aktiv sind"), Nature, 268, S. 416 - 420 (1977)). Diese Gradienten ergaben eine viel stärkere Auflösung als die nicht-denaturierenden Saccharose-Gradienten. Gewöhnlich wurden etwa 80 /Ug PoIy(A)-MA in 50 % Formamid, 100 mM LiCl, 5 mM EDTA, 0,2 % SDS und 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,4) gelöst, 2 min lang auf 37 ⁰C erhitzt, um die Aggregation zu verhindern, und auf einen 5 bis 20 $*igen Saccharosegradienten in einem Beckmann SV/-60 Ti Polyallomer-Röhrchen aufgegeben. Nach Zentrifugieren bei 20 ⁰C über einen Zeitraum von 4 1/2 h mit 60 000 U/min in dem Beckmann-Ti-Rotor SVV-60, wobei total C-markierte eukaryotiache RNA als Größenmarkierer diente, wurde der Gradient fraktioniert und die optische Dichte der Fraktionen bestimmt. Alle RNA-Fraktionen wurden zweimal mit 0,5 M NaCl und 2,5 VoI Äthanol ausgefällt und wie oben beschrieben hinsichtlich der Interferon-niRNA-Aktivität analysiert. Durch diese Reinigungaprozesse wird eine etwa 40-fache Anreicherung des IFN-ßmRNA-Gehaltes der PoIy(A)-ENA erzielt.

Obwohl die RNA von VGS-Zellen nur eine mit IFN-β verwandte mRNA-Fraktion zu enthalten schien, scheint RNA von anderen Zellreihen zumindest eine andere und möglicherweise mehrere IFN-P-verwandte mRNA-Funktionen zu enthalten. Diese letztere mKNA hybridisiert nicht zu der ersteren mRNA, sondern kodiert

für ein Protein, daa IFN-/^-Aktivität aufweist und durch Antiaeren gegen authentisches IPN- β inaktiviert wird. Das CIo- nen und die Expression solcher mRNA und anderer mRNAn, die damit durch Hybridisierung verwandt sind, sind auch Teil der vorliegenden Erfindung, da die anschließend beschriebenen Verfahren auch dafür anwendbar sind.

A-lternativ wurde die auf Oligo(dT)-adsorbierte mRNA (60 /Ug) durch Elektrophorese in einem 4 ^igen Polyacrylamidgel in 7 M Harnstoff, 0,1 % SDS, 50 mM Triborat (pH-Wert 8,3) und 1 mM EDTA fraktioniert, wobei die mRNA in diesem Puffer gelöst und 1 min lang auf 55 ⁰C erhitzt wurde, bevor die Aufgabe auf das Gel erfolgte. Nach der Elektrophorese wurden Schnitte von 2 mn Breite von dem Gel angefertigt und die RNA von jedem homogenisierten Gelschnitt eluiert und weiterhin durch Adsorption auf 01igo(dT)-Celluloae von Verunreinigungen befreit und in bezug auf IFN-/i-mRNA wie zuvor analysiert·

An dieser Stelle sollte man beachten, daß selbst das von den Formamidsaccharoaegradienten und der Polyacrylamidgel-Fraktionierung gewonnene Poly(A)-RNA-Produkt eine sehr große An- zahl unterschiedlicher mRNAn enthält. Außer der für IPN-β spezifischen mRNA sind alle anderen mRNAn unerwünschte Verunreinigungsstoffe (Pig. 1). Leider verhalten sich diese Verunrein igungs -RNAn ähnlich wie HuIFN-/3-mRNA im übrigen erfindungagemäßen Gloningprozeß. Daher wird ihr Vorhandensein in der PoIy(A)-RNA zur endgültigen Erzeugung einer großen Anzahl unerwünschter Bakterienclone führen, die Gene enthalten, die für andere Polypeptide als IPN- β kodieren können. Diese Verunreinigung bereitet bei der Isolierung der verlangten IPN-β-Hybridclone komplizierte Screeningprobleme. Im Falle von IFN-β wird daa Screeningproblem noch durch den Mangel an einer ausreichend gereinigten Probe von HuIPN- (J)-mVS$A oder DNA oder einem Teil davon, die als Screeningsonde für die Identifikati-

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on der erwünschten Clone wirken, verschlimmert. Daher ist der Screeningprozeß für die IPN- ß-Clone sehr zeitaufwendig und schwierig. Da 'zu. erwarten iat, daß nur ein sehr geringer Prozentsatz der IFN-|S-Clone seibat IFN-ß in einer biologisch oder immunologisch aktiven Form verwirklichen werden, gleicht die Isolierung eines aktiven Clons der Suche "nach der Nadel im Heuhaufen".

Mit Erfolg kann man die Rekombinant-DNA-Technologie zur Gewinnung einer gereinigten Probe von HuIFN-p-mRNA oder cDNA oder eines Teiles davon anwenden. Diese gereinigte mRNA oder CDNA kann dann zum schnellen Screening zahlreicher Bakterienclone verwendet werden, wodurch die Möglichkeit der Isolierung eines Clones, das IFN- β in einer aktiven Form verwirklicht, ganz beträchtlich erhöht wird.

Synthese von doppelsträngiger cDNA_{t -} die IFN-Q-cDNA enthält

Mit IFN- ß>~mRNA angereicherte PoIy(A)-RNA wurde als Template zur Erzeugung von komplementärer DNA ("cDNA") im wesentlichen nach der Beschreibung von R. Devos, u.a., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Full-Size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA" (Konstruktion und Charakterisierung eines Plasrnids, das eine DNA-Kopie von Bakteriophage MS2 RNA in nahezu voller Größe enthält), J. Mol. Blöl., 128, S. 595 - 619 (1979) für die Konstruktion eines Plasmida verwendet, das eine DNA-Kopie von Bacteriophage-MS2-RNA enthält.

Einsfcrängige cDNA wurde von der PoIy(A)-RNA durch RNA-abhängige DNA-Pölymerase (25 Einheiten) von Vogel-Myeloblastosisviren ("AMV") Umkehrtransscriptase (ein Geschenk von Dr. J. Beard, Life Sciences, Gulfport, Florida) hergestellt, wobei die Initiierung durch einen (dT)-Q-Primer (6 /Ug, Miles) hy-

bridiaiert an den Poly(A)-Schweif der RITA, in 50 /ul 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8,3), 1OmMMgCl₂, 30 mM/5-Mercaptoäthanol, 4 mM Na₄PoO.,, 2,5 /Ug//ul inaktiviertem Rinderserumalbumin, dTTP, dATP, dGTP und dGTP, je mit 0,5 mM, und cÄ,--³²P-OATP (20 /uCi, Amersham) erfolgte. Nach 30 Minuten bei 41 ⁰C wurde die Reaktion durch die Zugabe von EDTA bia 10 mM abgebrochen, das Reaktionagemiach mit gleichen Volumina von Phenol Chloroform tIaoamylalkohol (25:24*1) extrahiert und die wäßrige Phase auf eine Säule von Sephadex G50 aufgegeben und in TE-Puffer (10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA) eluiert. Die Hohlraumfraktionen, die Radioaktivität aufwiesen, wurden durch die Zugabe von 10 ,ug E. coil Transfer-RNA, Kaliumacetat (pH-Wert 5,1) bia 0,2 M und 2,5 VoI Äthanol ausgefällt.

Die ν»ie oben aynthetiaierte cDNA-Population ist in Wirklichkeit ein komplexes Gemisch von cDNAn, die von den verschiedenen mRNAn stammen, die in der angereicherten Poly(A)-mRNA vorhanden waren (Fig. 1). Wegen der vorzeitigen Termination durch AMV-Umkehrtranacriptaae aind außerdem viele der cDNAn unvollständige Kopien der verschiedenen mRNAn in der PoIy(A)-RNA (in Fig. 1 nicht dargestellt)·

Bevor die cDNA doppelsträngig gemo.cht wird, wird sie aus ihrer Verbindung mit der komplementären Template-RNA durch Ausfällen mit Äthanol und 30 min Inkubation in TE-Puffer (10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA) mit Ribonuclease T₁ (10 Einheiten, Sankyo Co., Ltd) und Pankreas-Ribonuclease A (10 /ag, Sigma) bia 10 /ul bei 37 ⁰C gelöst (wobei die Ribonucleasen frei von einatrüngig-speziflachen Endo- und Exodeaoxyribonucleasen sind). Durch die Entfernung des Template-Stranges durch Ribonuclease, und nicht durch Alkali, wird die mögliche' cDNA-Mutation durch alkali-katalysierte Deaminierung verhindert.

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Der cDNA-Strang kann durch DNA-Polymeraae I doppelaträngig gemacht «erden (Ao Efstratiadis, u.a. _t "Enzymatic In Vitro Synthesis Of Globin Genea" (Enzymatiaehe Syntheae von Globin-Genen in vitro), Cell, 7, S. 279 - 288 (1976)). Das obige 10-/ul-Gemiach von Ribonucleaae und cDNA viurde auf 20 /Ul mit MgCl₂ bia 10 mM, DTT bis 10 mM, Kaliumphoaphat (pH-Wert 6,9) bis 100 mM, dATP, dCTP, dTTP und dGTP je beia 0,3 mM, cA -^²P-dTAP (20 /uGi, Amereham) und DNA-Pοlymerase I (40 Einheiten, Biolabs) verdünnt. Nach 6 h bei 15 ⁰O wurden EDTA bis 10 mM und SDS bia 0,1 % zugegeben, und die doppelsträngige cDNA wurda durch Extraktion (PhenoliChloroformilsoamylalkohol), Chromatographie (Sephadex G50) und Ausfällung von Hohlrauinfraktionen wie zuvor iaoliert.

Zur Öffnung der einaträngigen Haarnadelschleife, die in der doppelaträngigen ο DNA-Struktur verbleibt, viurde die ausgefällte cDNA in 100 ,ul 0,2 M NaCl, 50 mM Natriumacetat (pH-Wert 4j5)» 10 mM Zinkacetat und 2/Ug durch Hitze denaturierter Kalbs· Thymusdrüsen-DNA gelöst und mit Sl-Nuclease (5 Einheiten, Sigma) 30 min lang bei 37 ⁰C umgesetzt. Durch die Zugabe von EDTA bia 10 mil, Extraktion mit Phenol:ChloroformJIaoamylalkohol und die Ausfällung der wäßrigen Phase durch die Zugabe von 10 /Ug E. coIi Tranafer-RNA als Träger 0,2 M Natriumacetat (pH-Wert 5,1) und 2,5 VoI Äthanol wurde ein stumpf-endendes doppelaträniges cDNA-Gemisch gewonnen. Dieses Gemisch ist heterogen, und zwar sowohl infolge der Heterogenität der zu ihrer Herstellung als Template verwendeten PoIy(A)-RNA (Pig. 1) als auch infolge der vorzeitigen Termination der cDNA-Transcriptaae durch die AMV Umkehr-Transcriptase (in Pig. 1 nicht dargestellt).

Um die Wirkung der Heterogenität der letzteren abzuschwächen, wurde die doppelsträngige cDNA durch Elektrophorese auf einem 4 %igen Polyacrylamidgel in 50 mM Triboratpuffer (pH-Wert

- 3Q

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8,3) und 1 mM EDTA₁ 5'- P-markierten Restriktionsfragmenten (?iX174 (RP)-DNA), die als Größenmarkierer dienten, gemessen. Es wurden DNA-Bänder von entsprechender Größe (z. B₀ Größenklassen 800 bis 900 bp (Basenpaare), 700 bis 800 bp, 650 bis 700 bp und 550 bis 650 bp) ausgewählt. Da die doppelsträngige cDNA, die aus der auf Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogenen PoIy(A)-RNA erzeugt worden war, ein ausgeprägtes Band von etwa 850 bp auswies, wurde von diesem Band angenommen, daß es die DNA voller Länge repräsentiert. Die Bänder wu den durch Zerkleinern des Gels in 0,5 M Ammoniumacetat und 0,1 % SDS und Rühren über Nacht eluiert. Nachdem die Bruchstückchen durch Zentrifugleren entfernt worden waren, wurde die DNA auf Hydroxylapatitpulver adsorbiert, in 5 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,5) auf eine Säule von Sephadex G50 aufgegeben, gründlich mit Puffer gewaschen, mit 0,45 M Natriumphosphat (pH-Wert 7,5) eluiert und sofort durch den Siebungseffekt der Sephadex-G50-Matrix entsalzen. Die die eluier

•so

te DNA enthaltenden Fraktionen, wie durch die ^J P-Radioaktivität festgestellt wurde, wurden durch die Zugabe von 10 /Ug Ά* coü Transfer-RNA, Natriumacetat bis 0,2 M und 2,5 VoI Äthanol ausgefällt.

Der Ertrag aus der oben beschriebenen cDNA-Hersteilung wird durch ein typisches Experiment nachgewiesen, bei dem etwa 2 /Ug PoIy(A)-RNA, nach dem Pormamid-Saccharose-Gradienten etwa 16 ng doppelsträngige cDNA mit einem Größenbereich von 800 bis 900 bp ergaben.

Es muß wieder betont werden, daß es sich bei dieser doppelsträngigen cDNA um ein Gemisch von sehr vielen cDNAn handelt, von denen nur sehr wenige IPN-ß-cDNA sind (Pig. 1).

Cloning, von doppelstränglger DNA

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Eine große Vielzahl von Wirt-Cloningvehikel-Kombinatlonen kann für das Cloning der erfindungsgemäß hergestellten, doppelsträngigen cDNA verwendet werden. Zum Beispiel können nützliche Cloningvehikel aua Segmenten von Chromosomen-, Nichtchromosomen- und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen viie verschiedenen bekannten Derivaten von SV4O und bekannten Bakterienplasmiden, z. B, Plasmiden von E. coli einschließlich col El, pCR1, pBR322, PMB9 und ihre Derivate, breiteren Wirtsbereich-Plaamiden, z. B. RP4, Phagen-DNAn, z. B. den zahlreichen Derivaten von Phage λ , ζ. B. NM 989, und anderen DNA-Phagen, z_e B. M 13 und Fi1amenteοua einaträngigen'DNA-Phagen und Vektoren, die von Kombinationen von Plasraiden und Phagen-DNAn abgeleitet sind, wie Plasmiden, die zur Verwendung von Phagen-MA oder anderen Expressions-Kontroll-Sequenzen modifiziert wurden, oder Hefeplasmiden wie dem 2/U-Plasmid oder Derivaten davon. Brauchbare Wirte können Bakterienwirte wie E. coil ^{m 101}» Ιϊ^οοίΐ X1776, E. coil X2282, E. coli MRC1 und Stämme ^von Paeudomonas, Bacillus ,subtilis. Bacillus atearothermophi-I₁Us und anderen Bazillen, Hefearten und andere Fungi, Tier- und Pflanzenviirte wie Tier- (einschließlich Human-) oder Pflanzenzellen in Kultur oder andere Wirte umfassen. Natürlich werden nicht alle Wirt-Vektor-Kombinationen gleich wirksam sein. Die entsprechende Selektion der Wirt-Cloningvehikel-Kombination kann von Fachleuten unter Berücksichtigung der oben erläuterten Prinzipien vorgenommen werden, ohne vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

Außerdem können in Jedem spezifischen Cloningvehikel verschiedene Stellen für die Insertion der doppelsträngigen DNA ausgewählt werden. Diese Stellen werden normalerweise durch die Reatriktions-Endonuclease, die diese abbricht, bezeichnet» Beispielsweise liegt in pBR322 die Pstl-Stelle in dem Gen für ß-Lactamase zwischen den Nucleotid-Tripletts, die für die Aminosäuren 181 und 182 dieses Proteins kodieren. Diese Stelle

y /

wurde anfangs von S. Nagata, ü».a», supra, bei seiner Synthese von Polypeptiden, die eine immunologische oder biologische Aktivität von IFN-«^ aufvieiaen, verwendet. Eine der beiden HindiI Endonuclease-Erkennungsateilen liegt zwischen den für die Aminosäuren 101 und 102 kodierenden Tripletts und einer der zahlreichen Tag-Stellen an dem für Aminosäure 45 kodierenden Triplett von /3-Lactamase in pBR322. In ähnlicher Weise liegen die EcoRI-Stelle und die PvuII-Stelle in diesem Plasmid außerhalb irgendeiner Codierungsregion, wobei die EcoRI-Stelle zwischen den für Resistenz gegenüber Tetracyclin bzw. Ampicillin kodierenden Genen liegt. Diese Stellen wurden von T. TaniguLchi u.a. supra in seinem Rekombinant-Syntheseschema verwendet. Diese Stellen sind durch den Fachmann leicht auszumachen. Es ist natürlich verständlich, daß ein erfindungsgemäß nützliches Cloningvehikel keine Reatriktions-Endonucleaae-Stelle für die Insertion des gewählten DNA-Fragmentes haben muß. Stattdessen könnte das Vehikel durch andere Mittel mit dem Fragment verknüpft werden.

Der Vektor oder das Cloningvehikel, und vor allem die darin für die Anfügung dea gewählten DNA-Fragmentea zur Bildung eines Rekombinant-DNA-Moleküls gewählte Stelle werden durch die verschiedensten Faktoren bestinmt, z. B. die Anzahl der auf ein bestimmtes Restriktionsenzym ansprechenden Stellen, die Größe des zu verwirklichenden Proteins, die Suszeptibilitä des verlangten Proteins gegenüber proteolytischem Abbau durch V/irtszellenenzyme, Kontamination oder Bindung des Proteins, das durch Wirtzellenproteine, die während der Reinigung schwer zu entfernen sind, zu verwirklichen ist, Expressionscharakteristika, wie die Lage von Initiator- und Terminator-Codons in bezug auf Vektorsequenzen, und andere vom Fachmann erkannte Faktoren. Die Wahl eines Vektors und einer Insertionsstelle für ein bestioimtes Gen wird durch eine Ausgewogenheit dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht alle Selektionen für einen bestimmten Fall gleich wirksam sind»

Wenn auch mehrere Methoden im Fachgebiet für die Insertion fremder DNA in ein Gloningvehikel oder einen Vektor zur Bildung eines Rekombinant-DNA-MolekUla bekannt sind, ist die für ein erfindungsgemäßes Initial-Cloning bevorzugte Methode das Digerieren des Plasmids (vor allem von pBR322) mit dem Reatriktionsenzym, das für die zur Insertion gewählte Stelle typisch iat (vor allem P₁StI), und die Zugabe von dA~Schweifen zu den 3¹"Termini durch Terminaltransferase. In ähnlicher Weise wird die doppelsträngige cDNA durch das Anhängen von dT-Schweifen an den 3'-Termini verlängert, um die Verknüpfung mit dem geschweiften Plasmid zu ermöglichen. Das geschweifte Plasmid und die cDNA werden anschließend zur Insertion der cDNA in die entsprechende Stelle des Plasmids und zur Zirkularisierung der Hybrid-DNA verstärkt (annealed), wobei der komplementäre Charakter der Schweife ihre Kohäsion erlaubt (Fig· 1). Das resultierende Rekombinant-DNA-Molekül trägt Jetzt ein eingefügtes Gen an der gewählten Pertl-Restriktionsstelle (Fig. 1). Diese Methode der dA-dT-Schweifung für die Insertion wird von D.A» Jackson, ü^a·» beschrieben "Biochemical Methods For Inserting New Genetic Information Into DNA Of Simian Virus 4Oi Circular SV40 Molecules Containing Lambda Phage Genes And The Galetose Operon Of Jjjg cih. ei_rlc hi .a c_oli " (Biochemische Methoden für die Insertion neuer genetischer Informationen von Affen-Virus 40 in DWAi Zirkuläre SV40 DNA-Moleküle, die Lambda-Phagen-Gene und das Galactose-Operon von Escherichia coll enthalten), Proc.» Natlo Acad._i?iiiiiSci. USA, 69, S. 2904 - 2909 (1972) und R. Devos, JisJLi.» supra). Dadurch entstehen etwa 3nial so viele Rekombinant-BNA-Moleküle \«ie bei dG-dC-Schweifung.

Natürlich eignen sich auch andere bekannte Methoden der Insertion von DNA-Sequenzen in Cloningvehikel zur Bildung von Rekombinant-DNA-Molekülen im Rahmen der Erfindung. Diese umfassen beispielsweise dG-dC-Schweifung, direkte Ligation, synthetische Linker, Exonuclease- und Polymerese-verknUpfte Reparaturreaktionen mit anschließender Ligation, oder Verlange-

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rang des DNA-Stranges mit DNA-Polymeraae und einer entsprechenden einsträngigen Template mit anschließender Ligation·

Es ist natürlich zu "beachten, daß die an der gewählten Stelle des Cloningvehikels eingefügten Nucleotidsequenzen oder oDNA-Fragmente Nucleotide enthalten können, die kein Teil des wirklichen Strukturgene für das verlangte Polypeptid sind, oder daß sie nur ein Fragment des vollständigen Strukturgens für das verlangte Protein enthalten können. Welche DNA-Sequenz auch eingefügt wird, erforderlich dafür ist lediglich, daß ein transformierter Wirt ein Polypeptid mit einer biologischen oder immunologischen Aktivität von HuIFN-P) erzeugen wird, oder daß die DNA-Sequenz selbst als Hybridisierungssonde zur Selektion von Glonen nützlich ist, die DNA-Sequenzen enthalten, die für die Erzeugung von Polypeptiden mit einer immunologischen oder biologischen Aktivität von HuIFN-ß brauchbar sind·

Das Cloningvehikel oder der das fremde Gen enthaltende Vector wird zur Transformation eines Wirtes verwendet, so daß der Wirt eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFN-/3 aufweisende Polypeptide, für die das Hybridgen kodier verwirklichen kann. Die Selektion eines passenden Wirtes wird auch durch eine Reihe von Faktoren bestimmt, die im Fachgebiet bekannt sind. Dazu gehören beispielsweise Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor, Toxizität von durch das Hybridplasmid kodierten Proteinen, leichte Gewinnung des erwünschten Proteins, Expressionscharakteristika, Biosicherheit und Kosten. Ea muß ein Gleichgewicht zwischen diesen Faktoren unter dem Gesichtspunkt gesucht werden, daß möglicherweise nicht alle Wirte gleich wirksam für die Expression ei-' nes bestimmten Rekombinant-DNA-Moleküla sein werden.

Bei der vorgestellten Synthese ist das bevorzugte Initial-Cloningvehikel das Bakterlenplasmid p3R322 und die bevorzugte Initial-Reatriktions-Endonucleasestelle darin ist die Pa^I-b'telle (Fig. 1), Das Plasmid ist ein kleines (relative MolekUlmasse ca» 2,6 Megadalton) Plasmid, das Resistenzgene gegenüber den Antibiotika Ampicillin (Amp) und Tetracyclin (Tet) trägt» Das Plasmid ist vollständig charakterisiert worden (P. Bolivar, o^b.«,, "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System" (Konstruktion und Charakterisierung neuer Cloningvehikel II. Ein Mehrzweck-Cloningsystem), Gene., S. 95 - 113 (1977); J. G. Sutcllffe, "pBR322 Restriction Map Derived From The DNA Sequences Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long" (pBR322»Restriktionskarte, abgeleitet von der DNA-Sequenzi Genaue DNA-Größenmarkierer bis zu 4361 Nucleotidpaare

lang), NUCle ic Ac Ida,. Research, 5, S. 2721 - 2728 (1978); J. G.

Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence Of The Eacherichia coil. Plasmid pBR322" (Vollständige Nucleotid-Sequenz des

coll Plaamids pBR322), Cold Spring Harbor Sympo-

43» If S, 77-90 (1978)). Durch die Einfügung des DNA-Produktes in diese Stelle entsteht eine große Anzahl von Bakterienclonen, von denen jedes eines der DNA-Gene oder Fragmente davon, die in dem zuvor zubereiteten cDNA-Produkt vorhanden waren₈ enthält» Wieder werden nur sehr wenige dieser Clone das Gen für IFN-(S oder Fragmente davon enthalten (Fig. 1) und keines wird die Expression von eine immunologische oder biologische Aktivität von IFN-β aufweisenden Polypeptiden ermöglichen. Der bevorzugte erfindungsgemäße Initialwirt ist Eo coil HB 101 ο

1 ο Parat e 1 lung yon_ P s_t I -ge_s pal t enem_} d A- ve rl ange rtan pBR3 22 Plaamid pBr322 wurde bei 37 ⁰C vollständig mit Pstl-Endonuclease (New England Biolabs) in 10 mM TrI-HCl (pH-Wert 7,6) 7 mM MgCIg, 7 mM 2-Mercaptoäthanol digeriert. Das Gemisch wurde mit 1 VoI Phenol und 10 VoI Äther extrahiert und mit 2,5

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VoI Äthanol t 0,2 M Natriumacetat-Lösung auegefällt.

Die Zugabe von homopolymeren dA-Schweifen (Fig. 1) durch Terminal-Deaoxynucleotid-Transferase (TdT) (gereinigt nach L₀ Chang und F.J. Bollum "Deoxynuceotide-Polymerizing Enzymes Of-CaIf Thymus Gland" (Desoxynucleotid-Polymerisierunga-Enzyme von Kalb-Thymusdrüae), J. Blol. Chem. _t 246, S. 909 - 916 (1971) erfolgte in einem Realttionavolumen von 50 /ul, das 0,14 M Kaliumcacodylat, 30 mM Tri-HCl (pH-Wert 6,8), 1 mM CoSO., 0,2 yug/yul durch Hitze inaktiviertes Rinderserumalbumin, 0,8 mM DTT, 0,2 mM dATP und etwas A-³²P-dATP enthielt« Die Inkubation dauerte 5 min bei 37 ⁰C vor der Zugabe von EDTA bia 10 mM und SDS bis 0,1 %, und das Gemisch wurde mit Phenol extrahiert und in TE-Puffer auf Sephadex G50 chromatographierte Die Zwischenraumfraktionen, die das linearisierte und verlängerte pBR322 enthielten, wurden durch Adsprption in 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA und 0,4 M NaCl auf 01igo(dT)-Cellulose gereinigt. Nach gründlichem Waschen wurden die verlangten Fraktionen mit 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,8) und 1 mM EDTA eluiert.

2. Darstellung von dT-verlängerter DNA

Doppelsträngige DNA wurde mit dTMP-Residuen in ähnlicher V/eise verlängert, wie es oben für die dA-Schweifbildung von pJ3R322 beschrieben wurde, nur wurde anstelle von dATP und et- -³²P-ATP dTTP und etwas %-dTTP verwendet. Die Reinigung auf 01ig(dT)-Cellulose wurde natürlich weggelassen. Wie zuvor handelt es sich bei der dT-verlängerten DNA um ein Gemisch verschiedener Spezies, von denen nur sehr wenige HuIFN-ßverwandt sind (Fig. 1).

3· Darstellung von mit Ca -behandelten E. coli HB101 Mit Ca⁺⁺-behandelte E. coli HB101 wurden nach der Methode von

Ε,Μ_β Lederberg und S₉N. Cohen, "Transformation Of Salmonella Typhlmurlum By Plaamid Deoxyribonucleic Acid" (Transformation ^Vün Salmonella Tyj>M_miarium By Plasmid Deoxyribonucleic Acid" (Transformation von Salmonella Typhimurium durch Plasmid-Desoxyribonucleinaäure), J. Baoterlol.» 119, S. 1072 - 1074 (1974) durch Einimpfen der E. coil HB101 (ein Geschenk von Ho Boyer) in 5 ml LB-Kedium (10 Teile Bactotrypton, 5 Teile Hefeextrakt und 5 Teile WaGl je Liter) hergestellt und die Kulturen über Nacht bei 37 °C vermehrt«. Die frischen Kulturen wurden 1/100 in 20 ml LB-Medium verdünnt und bis zu einer Dichte von etwa 2 χ 10 Bakterien je ml vermehrt, rasch in Eis abgeschreckt und 5 min lang mit 6000 U/min in einem Sorvall-Rotor SS34 bei 4 ⁰C pelletisiert« Die bei 0 bis 4 ⁰C gehaltenen Zellen wurden mit 20 ml 100 mM GaGl₂ gewaschen. Nach 20 min in Eis, wurden die Zellen repelletisiert und in 2 ml 100 mM CaGIp reauspendiert und 15 min lang auf 0 ⁰G gehalten. Mit Glycerin bis 11 % ergänzte Aliquoten (200 /Ul) konnten mehrere Monate lang bei -80 C ohne Einbuße an Aktivität aufbewart werden (DeA. Morrison, "Transformation In Escherlchia colls Cryogenic Preservation Of Competent Cells" (Transformation in Escherlchia C₁OlJ.: Tiefternperaturkonservierung kompetenter Zellen), J. Meter Ιο,!., 132, S. 349 - 351 (1977)).

4. Xeratärken von dA-verlänp;ertem pBR322 und dT-verlängerter

Die komplementären dA- und dT-Schweife des Vektors und des DNA Inserts ermöglichen die Verstärkung zur Bildung des anfangs verlangten Hybrid-Plasmids oder Rekombinant-DNA-Moleküls. Zu diesem Zweck wurden der dA-geschweifte, Pjrtl-gespaltene pBR322"Vektor und das Gemisch von gemessenen dT-geschvseiften cm An in TSE-Puffer (10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,6), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) bis 1,5 /Ug/ml Plasmid und bis zu einem Molverhälthia von Plasmid zu DNA-Insert von 1,5 zu 2,0 gelöst. Nach 10 min Erhitzen auf 65 ⁰C wurde das Gemisch langsam im Laufe von 4 h auf Raumtemperatur abgekühlt»

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Bei dem Produkt handelt es sich natürlich um ein großes Gemisch verschiedener Rekombinant-DNA-Moleküle and einiger CIoningvehikel ohne eingefügte LEfA-Sequenzen» Jedoch enthält jedes Rekombinant-DN A-MoIekül an der Patl-Stelle ein cDNA-Segment. Jedes derartige cDNA-Segment kann ein Gen oder ein Fragment davon aufweisen. Nur sehr vienige der cDNA-Fragmente kodieren für HuIFN-|?> oder einen Abschnitt davon (Fig. 1). Di größere Mehrheit kodiert für eines der anderen Proteine oder für Abschnitte davon, deren mRNAn Teil der in dem erfindunga· gemäßen Verfahren verwendeten PoIy(A)-KNA waren (Fig. 1). Ea tat auch zu beachten, daß keiner der Clone der oben hergestellten Sammlung die Expression von Polypeptiden, die ein« immunologische oder biologische Aktivität von IM-/3 aufweisen, ermöglicht.

5ο Transfektion von E, coli HB101 mit den verstärkten Hybrid' plasmiden

P3-Behältereinrichtungen wurden nach Bedarf für den Transfek tionsprozeß und alle anschließenden Schritte, in denen die resultierenden transformierten Bakterien behandelt wurden, verwendet. Aliquoten (90 /Ul oder weniger) des obigen Gemischs wurden auf O ⁰C gekühlt und 1 M CaCIp wurde bis 0,1 M zugesetzt. Aliquoten (100 ,ul oder weniger) dieser Lösung wu den zu 200 ,ul Ca⁺⁺-behandelten E. coli HB101 in Eis gegeben, und nach 30 min Abstehen bei 0 ⁰C wurden die Zellen 5 min lang bei 37 ⁰C hitzegeschockt und wieder 15 min lang bei 0 ⁰C gekühlt» Nach der Zugabe von 2 ml LB-Medium wurden die Zellen bei 37 ⁰C in einem Schüttelwasserbad 30 bis 45 min lang inkubiert und die Bakteriensuspension auf 1,2 TSigen Aga platten, die LB-Medium mit einem Zusatz von 10 /Ug/ml Tetracyclin enthielten, ausgestrichen.

Da Plasmid pBR322 das Gen für Tetracyclin-Resistenz enthält, werden E. coil Wirte, die mit einem Plasmid transformiert

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wurden, bei dem dieses Gen intakt ist, in dieses Antibiotikum enthaltenden Kulturen wachsen, unter Ausschluß ^ener nicht ao transformierten Bakterien. Daher wird durch die Züchtung in Tetracyclin enthaltender Kultur die Selektion von mit einem Kekorabinant-DNA-Molekül oder recyclisierten Vektor transformierten Wirten ermöglicht·

Nach 24 h bei 37 ⁰C wurden einzelne Kolonien entnommen und in 100 ,ul LB-Medium (wie oben ergänzt) in den Vertiefungen von Mikrotiter-Platten (Dynatech) suspendiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37 ⁰C wurden 11 ,ul Dirnethylsulfoxid in jede Vertiefung eingemischt und die Schalen mit Klebestreifen abgedichtete Die Platten wurden bei -20 ⁰C aufbewahrt, und es wurde eine Sammlung von 17 000 einzelnen Clonen tranaformier- ^^ev Ji* CjQI₁J HB101 angelegt. Dte se Sammlung stammte von 270 fMol (128 ng) dT-geschweiften cDNA-Inserts, die ihrerseits von 4,4 /Ug Gradienten-gereinlgter PoIy(A)-RNA synthetisiert worden waren. Etwa 98 % der Clone dieser Sammlung waren gegenüber Carbenicillin (eihem stabileren Ampicillinderivat) empfindlich. Daher enthielten etwa 98 % der Sammlung ein Plasmid mit einem Insert des /i-Lactamase-Gens von pBR322 in der Pstl-Stelle und nur etwa 2 % enthielten einen rezirkularisierten Vektor ohne Insert.

Diese 17 000 Clone enthalten eine Auswahl von Rekombinant-DNA-MoIekülen, die vollständige oder teilweise Kopien des Gemiacha von mRNAn in dem Poly(A)-RNA-Präparat von HuIPN-β erzeugenden Zellen repräsentieren (Fig. 2). Die Mehrzahl davon wird nur ein einziges Rekombinant-DNA-Molekül enthalten. Nur sehr wenige dieser Rekombinant-DNA-Moleküle sind mit HuIFN- β verwandt. Daher mußten die Clone gesiebt werden, um die HuIPN-(b -verwandten Clone von den anderen zu trennen.

Screening,prozeB für ein HuI FN-/5-o DNA enthaltendes Clon

Es gibt verschiedene Möglichkeiten für das Screening von Bakterienclonen, die HuIF¹N- ft -c DNA enthalten. Diese umfassen beispielsweise RNA-Selektions-Hybridisierung (Alwine, u«a_{e t} infra), Differentialhybridisierung (T.P.St. John und R.W. Davis, "Isolation Of Galcatose-Indueible DNA-Sequences Prom Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaque Filter Hybridization" (Isolierung von durch Galactose induzierbaren DNA-Sequenzen von Saccharomyces Cerevisiae durch Differential-Plaque-Filterhybridisierung), Cell, 16, S. 443 - 452 (1979)), Hybridisierung mit einer synthetischen Sonde (B₀ Noyes, u.ao, "Detection And .bartial Sequence Analysis Of Gtistrin mRNA By Using An OligodeoxynucleotideProbe" (Nachweis und Partial-Sequenz-Analyse von Magen-mRNA unter Anwendung einer Üligidesoxynucleotid-Sonde), PrQC ₁ Natl» Acad. Sei. USA, 76, S. 1770 - 1774 (1979)) oder Screening hinsichtlich von Clonen, die das verlangte Protein erzeugen, durch immunologische (I. Villa-Komaroff, u.a.», "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin" (Ein Proinsulin synthetisierendes Bakterienclon), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, S. 3727 - 3731 (1978)) oder biologische (A.C.Y. Chang, a. a., "Phenotypic Expression ^1η 3· ^G°li Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Keductase" (Phenotypische Expression einer für Mäuse-Dihydrofolat-Heduktaae kodierenden DNA-Sequenz Ln Έ» coll), Nature, 275, S. 617 - 624 (1978)) Analysen. Es wurde die RNA-Selektions-Hybridisierung gewählt, da sie die zweckmäßigste und erfolgreichste Methode für das Primärs.creening ist.

A. RNA-Selektions-HybridIsierungsanalyae 1· Übersicht über die Initialanalyse

In Pig. 2 ist zu sehen, daß die Rekombinant-DNA-Moleküle von einzelnen Kulturen von etwa 46 Clonen, die gegenüber Carbenicillin empfindlich und gegenüber Tetracyclin resistent waren, aus der obigen Sammlung von Clonen isoliert wurden (zwei Ge-

mische von 2 Clonen sind in Pig. 2 gezeigt) (Schritt A) ο Die Rekombinant«»PUA-MoIektile wurden gespalten, und zu Total-RNA hybridisiert, die wie zuvor hergestellte HuIi¹N-ß-mRNA enthielt (Sohritt B), Alle Rekombinant-DNA-Moleküle-Total-RNA-· Hybriden wurden von der niohthybridiaierten Total-ENA abgetrennt (Schritt C)β Die hybridisierte Total-HNA wurden von d@n Hybridan zurückgewonnen und gereinigt (Schritt D)» Die gewonnene KMA -wurde hinsichtlich HuIi¹N-/$~mRNA-Aktiv!tat vsie oben analysiert (Schritt B)· Wenn, und nur dann, das Gemisch von Rekombinant-MA-Molekülen ein Rekombinant-DNA-Molekül enthält₉ daa eine eingefügte Nucleotid-Sequenz aufweist, die unter harten HybridIeierungsbedingungen zu HuIFN-6 -mENA in der Total-RHA hybridisieren kann, ^tird die von dem Hybrid freigesetzte mREA die Bildung von HuIFH**/3 in Oooyten herbeiführen, weil von Irgendeinem anderen Rekomblnant-DNA-MoIekül-Total-RNA-Hybrid freigesetzte ÄA nicht IBT» (?> verwandt aeln wird» Wenn eine Gruppe von 46 Clonen eine poaitiv© Reaktion ergab, wurden die Clone zu 6|tfntergruppen (4 Untergruppen zu 8 und 2 Untergruppen zu 7) umgruppiert und Jede Untergruppe wie oben analysiert· Dieses Verfahren viurde fortgesetzt, bis ein einelges_s dieser Analyse entsprechendes Clon identifiziert war«

Es gibt kein® Gewähr, daß die Rekombinant-DNA-Moleküle nnd die damit tranaf®rmierten Bakterienkulturen, die auf dieae Weise identifiziert werden, die vollständige IM-ß-oDÜTA-Sequenz enthalten, oder daß etvea di© DNA-Sequenz tatsächlich für IM-ß kodiert oder dem Clon ermöglicht, Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von TFSl"β aufweisen, zu vervsirklichen· Dagegen werden die Rekombinant«» DNA-Moleküle vermutlich ausgedehnte Nucleotid-Sequenzen, die In bezug auf die IPN- |£>-mKNA-Ko die rungs sequensen komplementär sind, enthalten» Daher kann das Rekombinant-MA-Molekül zumindest als Quelle für eine Sonde zum raschen Screening anderer R©kombinant-DliA-MoIeküle und mit ihnen transformierter Clone

/ L

verwendet werden, um weitere Gruppen von Clonen zu identifizieren, die eine authentische oder vollständige IFN-/3-Nucl®- otid-Kodiorungssequenz enthalten können. Diese Clone können dann hinsichtlich der möglichen Expression von ein© bi®logiache oder immunologische Aktivität von IPlT- β aufweisenden Polypeptiden verwendet werden· Und die Nucleotid-Sequens des . eingefügten BKA-Fragmentes dieses Hybridplasmlds und ihres Amin«aäuretranelationapr©duktea kann bestimmt und, wenn möglich, mit der Aminoaäurezuaammensetaung und der für authentisches IPN-/S angegebenen Initialsequenz korreliert werden (aupra).

2o Auflfjührung der Inltlalanglyae

Schritt A - Darstellung des Rekombinant-DNA-Molekül-Gemischs

Duplikate einer Mlkrotlterplatte, die 96 Clone der obigen Sammlung von Clonen enthielt, warden auf LB-Agarplatten angefertigt, von denen eine 10 /Ug/ml Tetracyclin enthielt und die andere durch 100 /ug/ml Carbenicillin ergänzt worden war. Auf diese Weise wurden zwei Gruppen von etwa 45 bis 46 Clonen, die gegenüber Tetracyclin res!stent und gegenüber Carbenicillin empfindlich waren, gewonnen und über Nacht bei 37 ⁰C in 100 ml LB-Medium, das 10 /ug/sil Tetracyclin enthielt, getrennt gezüohtet. Dleae Kulturen wurden zuaemmengenommen, in einem Sorvall-Rotor GS-3 10 min lang mit 8000 U/mln zentrifugiert, zweimal mit TES-Puffer (50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8), 5 mM EDTA, 5 mM ITaCl) gewaschen und in 40 ml TES je Liter Anfangsvolumen der Kultur resaependiert. Die Zellen wurden mit Lysozym-Triton X-100 lysiert (Me Kahn, J!ij&·t "Plasmid Cloning Vehicles Derived J^rom Plaamldsi CoI El, P, R6K und RK2" (Plasmid-Cloningvehllcel, abgeleitet von den Plasmiden CoI El, P, R6K und RK2) in mology, 68j Recombinant DNA (Rekombinant-DIA) (R. Wu, Herausgeb·) (1980) (in Druck). Vierzig ml der in TES suspendierten Zellen wurden mit 20 ml 10 #iger Saccharose in 50 mM TrI-HGl

(pH-Wart 8) und Lysozym biß 1,3 mg/ml kombiniert und 20 min laiig bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dieser Suspension wurden 1 ml 0,5 M BDTA-UaOH (pH-Wert 8), 8 ml 0,2 #lges Triton X-100, 25 mM EDTA, 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8) zugesetzt und die Lyaia im Lauf® von 30 min bei Raumtemperatur fertiggestellt. Zellbruchstüokehen und der größte Teil der Chromosomen-DNA wurden durch 45 min Pelletisieren in einem Beckman·*· Rotor SW27 mit 24 000 U/mln entfernt· Die obenstehende Flüssigkeit wurd© in Eis gekühlt, mit 1/3 VoI 40 tigern PolySthylenglycol 6000-2 M ITaOl kombiniert und über Nacht bsi 0 ⁰C stehen gelassen. Das resultierende Präzipitat wurde 10 min lang in einem Sorvall Rotor HB4 mit 5000 U/min bei 4 ⁰C gesammelt und in TES-Puffer gelöst« Die Lösung mit 0,2 YoI 10 mg/ml Äthidiumbromid (Serya) und CsCl bis 1 g/ml vüirde in einem Beckmann-Ti-Rotor R60 bei 40 000 U/min mindestens 48 h lang % θ nt r if ugle rt, vjobei ein Polyallomer-Eöhrchen gewöhnlich für das Lysat von 1-21 des ursprünglichen Kulturvolumens reicht« Unter UV-Beleuchtung waren in dem Röhrchen zwei HTA-Bänder erkennbar· Daa Band mit der höchsten Dichte entspricht Plaemid Form I DHA, das zielte Band, entspricht Form II vjnü. Form III Plasmid-DHAn und etrrae Chrome soüian-DITA* Das erste Band isurde aus dem Röhrchen gesammelt, das Äthiöiumbromid durch secha Isojsraylalkohol-Extraktionen entfernt und die vsäS-rige Phase mit 3 VoI Wasser mit einem Zusatz von bis zu. 0,2 M Natriumacetat (pH-Wert 5,1) vor der D?TA-Ausfä?.lung mit 2,5 VoI Äthanol verdünnt. Die DUA -wurde erneut gelöst, mit Phenol extrahiert und wieder mit Äthanol auegef äl?.t. Die Qualität der MA wurde mit Hilfe der' Elektrophorese au? eineüi 1 $igen Agaroeegel in 40 κΜ Tri-HOAc (p!J-Wart 7,8), 20 mM !Iatriumacetat, 2'isM EDTA und anschlie'Bsnöea

Färben mit Äthidiuiabroiaid ermittelt· W©nn die WA duroh zu viel RNA verunreinigt ^ar, ^urde sie weiter durch Zentrif!^gie· ren mit neutre.lem Saccharoß©-öradienten gereinigt! 300 /Ug DITA in 10 mM Tri-HCl (pH»Wert 7,6) und 1 mM EDTA wtiröan auf einen 5 bis 20 jSlgen 36«*ml-Saccharosegradienten in 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,6), 1 mM EDTA, 1 M NaCl aufgegeben, 16 h

lang In Eollyallomer-Röhrehen mit 24 000 U/min in einem Beckmann-Rotor SW27 "bei 18 ⁰C zentrifugiert, und die (0D₂g₀)-Fraktionen enthaltende DNA wurde geaammelt und mit Natriumacetat-Athanol atiagefällt·

Schritt B - Hybridisierung der DNA mit Total-RNA Etwa 150 yug auf diese Weise hergestellte MA wurden mit etwas einheitlich markierter ^ P-Markierer-DNA und 2/Ug ρSOTV-1 DIA (einem Rekombinant-Plaamid, das eine cDNA-Kopie voller Größe von Satelliten-Tabaknekrosevirus ("STOTV")-HNA enthält; Jo Van Snmelo, JjLtJb.* "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Pull-Size DITA Copy Of Satellite Tobacco Necrosis Virus RNA" (Konstruktion und Charakterisierung eines Plaamids, das eine DNA-Kopie in fast voller Größe von Satslliten-Tabaknekroaevirus-RNA enthält), J,.. Mol« B.iol., (in Druck) ale interne Kontrolle zusammengenommen, durch. Ultraschall in einem MSE-Ultraschallgerät geschert und mit Natriumacetat-Xthanol ausgefällt.

Eine Diazobenzyloxymethyl (DBl/O-Cellulose-Feststoffmatrix (siehe J. C Alwine, Ji₁Bj., "Method For Detection Of Specifio HHfAs In Agaroae Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl Paper And Hybridizing With USA Probes" (Verfahren zum Nachweis spezifischer RKAn in Agarosegelen durch Übertragung auf Diaaobenzyloxymethyl-Papier und Hybrid is ie rung rait DNA-Sonden) , Prooj^ Natl. Acad« SoJL_v.USA_> 74, S. 5350 - 5354 (1977)) viurds nach der Methode von J.C. -Alkine, J^a₁, "Detection Of Specific RNAs Or Specific Fragments Of DNA Fractionation In Gels And Transfer To Dlazobenyloxymethyl Paper" (Nachweise ep32iflecher RNAn oder spezifischer Fragmente von der DNA-Fraktionierur_g in Gelen und Übertragung auf Diazobenzyloxymethyl-Papier), ll^i^odj Enzymology, 68τ Recombinant DNA (R· Wu, Herauageb.) (19S0) hergestellt« Für eine Papiermatrix uurde ein Blatt ^.Oaatman Papier 540 gleichmäßig in eine Lösung eingetaucht, die 2 - 3 mg 1-(m-Nitrobenzyloxy)methylpyridiumohlorid (EBPC/BDH) und 0,7 ml

- 22

Natriumaoetattrihydrat in 28,5 /«ll Waaaer je cm enthielt, bei 60 C bis zur Trockne und danach weitere 10 min lang inkubiert und bei 130 bis 135 ⁰C 30 bia 40 min lang vj arme be handelt. Nach mehrmaligem Waschen mit Wasser (®twa 20 min), dreimal mit Aceton (etwa 20 min) und Trocknen wurde sie auf bewahrt. Das Papier wurde 30 min lang bei 60 ⁰C in 0,4 ml 20 % Natriumdithionit-Wasser Je cm unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Das Papier wurde erneut viermal mit Wasser, einmal mit 30 5Siger Essigsäure 5 min lang und viermal mit Wasser ge- waschen, in 0,3 ml je cm eiskalte 1,2 M HCl, der 10 mg/ml frisches NaMOp unmittelbar vor Gebrauch zugesetzt «orden ren, 30 min lang bei 0 ⁰C gegeben und zweimal schnell mit eiskaltem Waaaer und einmal mit 80 tigern Dimethylaulfoxid (Spektrofotometriaohe Qualität, Merck) - 20 tigern 25 nsM triumphosphat (pH*»Wert 6,0) gewaschen. Für eine Pulvermatrix wurde im wesentlichen die gleiohe Verfahrensweise unter Verwendung von mikrogranularem Cellulosepulver (Whatman CC31) angewandt, wobei die Mengen auch in besag auf die entsprechende Celluloaeinatrix angegeben wurden.

Anfangs wurde eine Pulvermatrix: wegen der stärkeren Bindekapazität verwendet, so daß verhältnismäßig geringers Volumina für die Hybridieierung, die Waschen und die BIuLerung βΐη^β-setst werden konnten. Anschließend viurde eine -PapiematriZ für das Screening einaelner Clone verwendet. Die Verwendung von Papier ermöglicht eins wirksame Sluierting mit Wasser, die sich für die letzte Analyse von IM-/3-mR3?A als beeeer erwies.

Die oben hergeatellte DNA wurde in 25 mM !f (pH-Wert 6,0) gelöst, 1 min lang erhitat, abgeschreckt, und 4 VoI DMSO wurden zugegeben. Die Kopplung mit der Matrix (50 mg Pulver) oder mit einem Papierblatt (Durchmesser 10 mm) erfolgte gewöhnlich über ein Wochenende bei 4 °C unter stan-

- 46 - . / / rs ο η i «-

digem Mischen. Daa Volumen der 33NA wurde zlemlloh klein gehalten, um einen engen Kontakt mit der Matrix zu ermöglichen und die wirksame Kopplung der MA an die Matrix dadurch zu. unterstützen· Nach der Kopplung wurde die Matrix viermal mit Waaaer und viermal mit 0,4 H TTaOH jeweils 10 min lang bei 37 ⁰C, erneut viermal mit Wasser bei Raumtemperatur and eehlleßlich zweimal mit Hybridisierungp^f fer (50 % Formamid (entionisiert, Baker), 40 mM Plperazin-N,TI^f ~bls(2-äthanaulfonsäure) (pH-Wert 6,4) ("PIPES", Sigma), 1 mM SDTA, 0,6 M NaCl und 0,1 % SBS ) "bei 4 ⁰C gewaschen. Die Kopplungsergebniaae wurden durch. ^J P-Radioaktivität gemessen.

Zwanzig /Ug wie zuvor hergestellte Total-RMA und 50 ng ST57-RMA wurden in 250 ,al (50 /Ul für Paplenaatrix) Hybrid is is«· rungapuffer gelöst und zu der DNA-gekoppelten Matrix gegeben. Die Matrix wurde 2 min lang auf 70 ⁰G erhitßt und über Nacht unter leichtem Mischen auf 37 ⁰C gehalten.

Sohrltt C - Trennung von hybridisierter Total-RIA-BTA von nioht-hybrid ie werter Total-R?TA

Nach dem Zentrifugieren der Pulvermatrix wurden die nioht hybridisierten RIfAn entfernt und die Matrix siebenmal mit einer Gesamtmenge von 2 ml 50 tigern Formamid, 10 mM PIPES (pH-Wert 6,4), 1 mM EDTA, 0,3 M 3TaCl onö 0,1 % SDS gewaschen, wobei der geringare Salzgehalt "bei diesen V'aacliiingan nioht-apezifieche BJU-™TA-Bindung oestabllLsiert· Jeiar raschung folgte Zentrifugieren und Resuepenaion d.ir Matrix in dem Puffer. Für die anschließende Analyse v.avd® die erste WaschlöBung mit der unhybridIsierten W.A ("Fraktion 1") vereinigt und die Waachlösungon 2 bis 4 ("Jraktior. 2^M) un& die Waschlösungen 5 bis 7 ("Fraktion 3") "wurden zusammengenommen. Bei Hybridiaierungen auf einer"Papiermatrix Miuräe eine ähnliche Verfahrensweise angewandt, nur wurde dabei das Gesamtvolumen der Waschlb"sangen auf 1 ml begrenzt.

- 47 - L· L,

- Reinigung von hybridisierter Total-RHA

Die hybridisierte Total-ΕΪΓΑ-ΜΑ wurde aas einer Palvermatrix mit 3 Eluierungen von insgesamt 900 ,al 99 % Formamid, 0,2 % SDS bei 70 ⁰C 2 min lang eluiert and in Eis abgeschreckt. Das Totalhybridisierongsverfahren and die Elaierang mit Formamid erfolgten im wesentlichen nach der Beschreibung von A.G. Smith (persönliche MitteHang). Die hybridisierte Total RIA-DNA wurde von einer Papiermatrix eluiert, indem zunächst eine Wäsche mit 100 /ul eiskaltem Wasser vorgenommen wurde worauf 2 min lang zwei Wasserelaierongen (insgesamt 300 /ul) bei 80 ⁰C folgten. Für die anschließende Analyse warden diese Elatlonen and die 100 yul Waschlösung vereinigt ("Fraktion 4^M).

Zu der einen Hälfte ;jeder der vier Fraktionen warden 0,1/Ug Kalbeleber-tHNA oder Ribosomen-RltfA gegeben (Fraktionen 1Λ, 2A, 3A und 41) and aar anderen Hälfte warden 8 /ag eukaryotische Poly(A)~RNA oder Ribosomen-RNA gegeben (Fraktionen 1B, 2B, 3B and 4B). Die Fraktionen wurden durch Ausfällen. unter Zugabe von 0,5 M ITaCl und 2,5 VoI Äthanol gereinigt, um Spuren von Formamid und anderen Verunreinigungen zu entfernen·

Schritt,,E - Bestimmung der Aktivität von IPÜT-/^-mR^TA

Die Fraktionen 1A, 2A, 3A und 4A cardan in 25 /Ul mit cleaee behandeltes Kaninchsn-Reticulooyt-Lyaat (hergestellt nach der Verfahrensweise von K.B. Pelham and R.J. Jackson, "An Efficient mRNA-Dependent Translation System For Reticulocyte Lysates" (Ein wirksames mRHA-abhängiges Tran3Iationsaystem für Retioalocyt-Lysat), E;jr«^_r,,J.^₁JB₁Iοcjiesi^,' 7, S. 247 - 256 (1976)) nach d©r Verfahrensweise von B. LeBXeu, juju, "Tranalatlon Of Mouse Interferon mRWA In 2SB52JJL JiSSz. via Oocytas And In Rabbit Reticulocyte Lysates" (Translation von Mäuse-Interferon-mMA in Ze^ojguj^aevis Oocyten

- Λ- ά. \J U Z)

und in Kaninohen-Reticulocyt-Lyaaten), Blöchern..JBlojghya« Cornmun., 82, S. 665 - 673 (1978) übertragen, nur wurden 250 mM Spermidin-HCl, 1 mM Fructose-1,6-dlphosphat in Gegenwart von -^S-Methionin (0,5 mCi/ml, Ameraham) zugegeben· Nach der Inkubation wurden 25 /Ul Reticulocyt-Lyeat von oben mit 1/ul 10 % Desoxycholat-10 % Triton X100 und 2 /ul Antiserum-PBS (1»9) vereinigt und eine Stunde lang auf 37 ⁰C gehalten» Zwanzig /Ul Staphylocoocua^aareus Cowan I (frisch, gewaschen, S.W. Kessler, a^&^, "Rapi<t Isolation Of Antigens Prom Cells With A Staphylocooeal Protein Α-Antibody Adsorbents Parameters Of The Interaction Of Antibody-Antigen Complexes With Protein A" (Schnelle Isolierung von Antigenen aua Zellen mit einem Staphyloooccen Protein A-Antikorper-Adaorptionamittel j Parameter der Wechselwirkung von Antikb'rper-Antigen-Komplexen mit Protein A), J_-.Jmmunplo^y, 115, S. 1617 - 1624 (1975)), in 10 % 100 mM NaCl, 10 mM Tri-ECl (pE-Wert 7,4), 1 mM EDTA, 0,05 % NP40 wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min lang auf 20 ⁰C gehalten und 2 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge 5412 zentrifugiert. Das Pellet *mröe gewaschen und zweimal mit PBS zentrifugiert, und daa fertige Pellet wurde in Probenpuffer gelöst und auf einem 13 $igen Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen, τ;1θ von U,K. laemmli, u^a. "Cleavage Of Structural Proteins During The Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4^M (Spaltung von Strukturgenen während des Aufbaus des Kopfes von Bacteriophage T4), Hato®» 227, S. 680 - 685 (1970) beschrieben wird, und aut orad i ographi ert* Ein Vergleich dsr S^TV-ICTA-Transr.a,-tloneprodiikte in den Fraktionen 1A und 4A vermittelt ci.isn Eindruck von d©r Wirksamkeit dar Hybrid is !©rung und dta Rl¹TA-Abbauea in dem Prozeß. Die Fraktionen 1B, 2B₉ 3B and. /.B r.\xrden in 2 /Ul V/asaer gelöst und in Oocyten hinsichtlich des IM- P-mBW Gehaltes raie oben beschrisbsn analysiert»

3· AQjekjyLeßend^^

.folien Einige anschließende Analysen einzelner Clone wurden auf Ii-

trocelluloaefolien durchgeführt (M. Cochet, α.a.« "Cloning Of An Almost Pull-Length Chicken Conalbumin Double-Stranded oDNA" (Cloning einer doppeisträngigen cDNA faat voller Länge von Hühner-Coalbumin), Nucleic AcIda Research, 6, S. 2435 2452 (1979)). Die DNA wurde in 2 M UaCl und 0,2 M UaOH gelöst, 1 min lang auf 100 ⁰C erhitzt, abgeschreckt und auf viaschinittelfreie Ultrafilter (Porengrö'ße 0,45 /um, Durchmeaser 7 rom) getüpfelt. Die Filter wurden 2 h lang bei 80 ⁰C wärmebehandelt, in 0,3 M UaCl, 2 mM EDTA, 0,1 % SDS, 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5)-gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet· Die RNA wurde 3 h lang bei. 47 ⁰C in 30 % Formamid, 0,5 M NaCl, 0,4 % SDS, 2 mM EDTA, 50 xM PIPBS (pH-Wert 7,5) hybridisiert. Die Hybridielerimg wurde durch Verdünnen mit 10 YoI 0,1 M NaCl abgebrochen und die Filter wurden mehrmals in 15 ml 0,3 M NaCl, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5) durch Schütteln bsi 45 ⁰C und mehrere Male in der gleichen Lösung ohne SDS bei 4 ⁰C gewaschen. Die .EIuierung der hybridisierten RNA-IÜA erfolgte in 30 /ul 5 ruM. Kaliumchlorid 1 m lang bei 100 ⁰C.

4. .Ergebniaae der _{r r}RNA-Selekt_ipns-_tHybr

Sechzehn Gruppen von et^a 46 Clonen wurden'ausgewählt (Gruppen A - P). In sechs dieser Gruppen enthielt fraktion 1B die einzige IW- f%-mRNA Aktivität, in acht der Gruppen ^urde keine IM-$-MiRNA entdeckt und in svsei Gruppen (Gruppen C und 0) wurde IFN«»5HmKHA in Fraktion 4B festgestellt. Die Analysen der Gruppe C und Gruppe 0 werden in der folgenden Form wiedergegeben* Logarithmus von IPM- p-Ei.nheiten (gseioht in bezug auf den Bezugastandard 69/19), nachgewiesen in der Analyse von Fraktion 1B (nlcht««hybridiaiert) und in der Analyse von Fraktion 4B (hybridisiert). Die'Nachvieisgrenze war 0,1.

Gruppe	Fraktion 1B	Fraktion 4B
C	1,0	0
	0,5	0,5
	0	0,2
0	0	0
	0,2	0,5

Gruppe O wurde in 6 Untergruppen (Untergruppen O₁ bia Og? vier mit acht Clonen und zwei mit sieben Clonen) unterteilt und wie zuvor hybridisiert und analysiert, nur wurde eine 400-ml-Kultur Je Clon verwendet. Die Untergruppen brachten folgende Ergebnisse, die in der gleichen Form wie oben wiedergegeben werden. Die Hybrid is ierting wurde auf DMB-Celluloaepulver durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben w ird»

Untergruppe	Fraktion 1B	Fraktion 4B
°1	0	1,2
	0	1,5
	0	0,5
	0	0,5
	0,2	0,5
	0	1,2*
°2	0,7	0
°3	0,7	0
	0,5	0
°4	0	0
0S	0,5	0
°6	0	0

α DBM-Cellulose-Papier-Methode

Untergruppe O₁ wurde in ihre einzelnen Clone unterteilt (bezeichnet als Clone O₁ ,^ bis O₁^₈ und wie zuvor hybridisiert und analysiert, nur wurde eine 700-ml-KuItür je Clon verwendet.

Die Hybridisierung wurde nieder auf DBM-Celluloee-Pulver durchgeführt, nenn nichts anderes angegeben viird.

Fraktion 1B	Fraktion 4B
0,2	0
0,7	0
0,7	0*
1,0	0**
1,2	0
0,2	0*
0,7	0**
1,2	0
1,0	0,2*
1,2	1,0(?)*
1,2	0**
1,2	0
1,2	0
1,0	0*
1,2	0**
0,7	0
0,7	$0,2*
1,0	0
0,7	0
1,0	«0,2*
0,5	0**
0,5	0
1,2	0*
<0,2	0,5«
0	1,7«
<0,2	1,2*
0	0,7**
0	1,0**

DBM-Gellulose-Papier-Methode Nitrocellttlose-Folien

"-228897 2

Somit enthält Clou 01/8 ein Rekombinant-DNA-Molekül, daa IFN-/5-mRNA von Tot al-RHA, die IFN-ß-rnRNA enthält, hybrid la leren kann·

Hloht-spezIflache RNA-DNA-Bindung iat höchst unwahrscheinlich, da ein Vergleich der Fraktionen 1A und 4A im wesentlichen keine nicht-apezifiache Bindung von STNV-DNA bei dieeem gleichen Experiment ergab, wie z. B. durch Tranalation in einem Kaninohen-Retloulocyt-Lyaat in Gegenwart von ^S-Methlonin und an- achließende Gel-Blektrophoreae nach obiger Beschreibung ermittelt wurde. Clon 01/8 wurde als E. coil HB101(G-pBR322(Pst)/ HFIF1 (⁸G-HBIOi-PHPIPI")! sein Rekombinant-DNA-Molekül als G-pBR322(Pat)HFIF1 (»pHFIFI») und sein Hybrid-Insert als "pHFIFI-Fragment" bezeichnet. Diese Nomenklatur besagt, daß das Clon und Rekombinant-DNA-Mölekül aus Gent ("G") atammt und Plaamid pBR322 aufweist, das an der PsJI-Steile HuIFN-ßoDNA ("HPIP") enthält, wobei das bestimmte Molekül das zuerst gelegene 1st (^M1^M).

Identifizierung von Clonen. die zu pHPIPI kreuz-hybrIdleierte Rekpmblnant-DNA-MoIeküle enthalten

Oben isoliertes pHFIPI wurde verwendet, um die Sammlung von zuvor hergestellten Clonen auf Bakterienclone, die Rekomblnant-DNA-Moleküle mit verwandten Hybrid-Inserts enthalten, durch Kolonie-Hybridisierung einem Screening zu unterziehen (U. Grundstein und D.S. Hogness, "A Method Por The Isolation Of Cloned DNA¹S That Contain A Specific Gene" (Eine Methode für die Isolierung von geclonten DNAn, die ein spezifisches Gen enthalten), Proo. ffatl. Aoad. Sei. USA. 72, S. 3961 -3965 (1975)). Diese Methode ermöglicht die rasche Identifizierung von verwandten Clonen durch Hybridlaierung einer von pHPIPI hergestellten radioaktiven Sonde zu der DNA von lysierten Bakterien-Kolonien, die in Nitrocellulosefiltern untergebracht sind.

Die Ln Mikrotiter-Platten wie oben beschrieben aufbewahrte Sammlang von Clonen wurde auf ähnlich großen Nltrocelluloaefollen (0,45 /um Porendurchmeaeer, Schleicher und Schuel oder Ultrafilter), die zuvor zur Entfernung von Detergens gekocht «orden mären, repliziert, und die Folien wurden auf XB-Agar-Platten, die Tetracyclin (10/ttg/ml) enthielten, gebracht* Bakterienkolonien wurden über Naoht bei 37 ⁰C gezüchtet. Die Lysis und die Fixierung der Bakterien auf den Nltrocellulosefollen erfolgte daroh aufeinanderfolgendes Waschen in 0,5 N NaOH (zweimal 7 min lang), 1 M Tri-HCl (pH-Wert 7,5) (7 min), 0,5 M TrI-HCl (pH-Wert 7,5) and 1,5 M NaCl (7 min), 2 χ SSC (0,15 M NaCl), 0,015 M Natriumeitrat (pH-Wert 7,2) (7 min)). Nach gründlichem Spülen mit Äthanol und Luftrocknung wurden die Folien 2 h lang unter Vakuum bei 80 ⁰C wärmebehandelt und bei Raumtemperatur aufbewahrt·

Ein für das pHFIFI-Fragment (infra) apezifIschee Hlnfl-Restrlktionsfragment diente ala Sonde für die Infra beschriebene KoloniehybridisIerung. Dieses Fragment ("*170 Basenpaare) wurde durch Elektrophorese der Hinf-Digestlonsprodukte von pHFIFI in einem 6 #lgen Polyaorylamidgel gereinigt· Nach dem Färben der DNA-Bänder mit A'thidlumbromld wurde das spezifische Fragment eluiert, wieder der Elektrophorese unterzogen und durch "Nick-Translation" -^P-markiert (P.W.J, Rlgby, u.a.. "Labeling Deoxyrlbonuclelo Acid To High Specific Activity In Vitro By Nick Translation With DNA PoIymerase I" (Markierung von Desoxyrlbonuoleinsäure mit hoher spezifischer Aktivität In vitro durch Nick-Translatlon mit DNA-Polymeraae I), J. Mol. Bio!.. 113, S. 237 - 251 (1977)), indem es in 50 ,ul 50 mM TrI-HCl (pH-Wert 7,4), tO mM MgCl₂, 20 mM ß-Meroaptoäthanol, die jeweils 2,5/Ul dCTP, dTTP und dGTP bei 400 /UM, 100 pMol <k -ATP (Amersham, 2000 Ci/mMol) und 2,5 Einheiten DNA-Polymerase I (Boehrlnger) enthielten, bei 14 C 45 min lang inkubiert wurde· Die nicht umgesetzten Desoxynucleosidtriphosphate wurden durch Gelfiltration

.. CL· O O Ό Ι

über Sephadex G-50 In TE-Puffer entfernt· Die etark klerte EHA wurde mit 0,1 VoI 2 M Natriumaoetet (pH-Wert 5,1) und 2,5 VoI Äthanol bei 20 ⁰C auegefällt·

Die Hybridisierung der obigen Sonde zu der auf dem Filter imprägnierten DNA wurde Im wesentlichen nach der Beschreibung von D. Hanaban und M. Meeeleon durchgeführt (persönliche Mitteilung): Die wie oben hergestellten Filter wurden 2 h lang bei 68 ⁰C in 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rlnderserumalbumln, 0,15 M NaCl, 0,03 M TrI-HCl (pH-Wert 8), 1 mM EDTA vorinkubtert und mit 0,02 % Flnooll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,75 M NaCl, 0,15 M Tri-HCl (pH-Wert 8), 5 mM EDTA und 0,5 % SDS gespült. Die Hybridisierung fand über Nacht bei 68 ⁰C in einer der obigen Reinigungslösung identischen Lösung unter Verwendung der ^ P-markierten Sonde statt, die 5 min lang vor Gebrauch bei 100 ⁰C denaturiert worden war. Die hybridisierten Filter wurden zweimal mit 0,3 M NaCl, 0,06 Tri-HCl (pH-Wert 8), 2 mM EDTA 2 h lang bei 68 ⁰C vor der Lufttrocknung und der Autoradiographie gewaschen.

Etwa 1350 Clone aus der DNA-Größenklasse 800 bis 900 stammend wurden ausgewählt. Dreizehn Kolonien, einschließlich pHFIFI, brachten ein positives Ergebnis· Diese Clone wurden mit G-HB101-pHFIF1 bis 13 bezeichnet und ihre Rekombinant-DNA-Moleküle mit pHFIFI bis 13· Eines der Clone, pHFIF2, wurde mit PoIy(A)-RNA, die IFN-ß-mRNA enthielt, hybridisiert und unter Verwendung von DBM-Cellulose-Papler analysiert (supra)» Da die gesamte IFN-RNA-Aktlvltät In der hybridisierten Fraktion entdeckt wurde und die unhybridislerte BNA keinerlei nachweisbare Aktivität enthielt, ist es klar, daß durch Kolonie-Hybridisierung zu einem Teil des pHFIFI-Fragmentes identifizierte Clone auch zu IFN-ß-mRNA hybridisierten.

-228897 2

Ea 1st natürlich einleuchtend, daß diese Methode des Clon-Screening unter Verwendung des HuIFN-P-KITA-Inaerts von pHFIFI oder eines anderen SNA-Inserts eines Clona, der unter Anwendung des DNA-Inserts von pHFIFI nie oben "beschrieben identifiziert wurde, genauso gut für andere Clone angewandt werden kann, die DNA-Sequenzen enthalten, die aus der Rekombinant-DNA-Technologle, Synthese, natürlichen Quellen oder einer Kombination davon stammen, oder für Clone, die DNA-Sequenzen enthalten, die mit einer der obigen DNA-Sequenzen durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensübstitutionen, Insertionen, Inversionen oder Deletionen verwandt sind. Daher liegen derartige DNA-Sequenzen und ihre Identifikation ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung. Es 1st auch selbstverständlich, daß DNA-Sequenzen, die durch die obigen DNA-Sequenzen nicht ausgewählt werden, die jedoch aufgrund ihrer Anordnung von Nucleotiden für diejenigen Polypeptide kodieren, die durch die obigen DNA-Sequenzen dafür kodiert wurden, auch im Rahmen der Erfindung liegen·

CharakterIslarung; der IFN- /^-verwandten Rekomblnant-Plasmide

Die durch Kolonie-Hybrid is ieruüg entdeckten dreizehn Clone (pHFIF1-13) wurden welter charakterisiert. Es wurde eine physikalische Karte dieser Clone konstruiert und die Orientierung der Inserts in den verschiedenen Clonen bestimmt·

Die physikalischen Karten der Plasmide wurden durch Digestion mit verschiedenen Restriktionsenzymen (New England Biolabs) in 1OnM Tri-HCl (pH-Wert 7,6), 7 mM MgCl₂ und 7mM ß-Meroaptoäthanol bei 37 ⁰C mit Hilfe bekannter Verfahren konstruiert· Die Digestionaprodukte wurden in 2,2 jSigen Agarose- oder 6 jSlgen Polacrylamldgelen In 40 mM TrI-HOAc (pH-Wert 7,8), 20 mM EDTA der Elektrophorese unterzogen« Nach dem Kenntlichmachen durch Färben mit Äthidiumbromld wurden sie analysiert und mit der ausführlichen physikalischen Karte von

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pBR322 verglichen (J·G. Sutcllffe, aupra). Auf der Grundlage dieser Digeationamuater nurden Reatriktionakarten der verschiedenen Plasmide konstruiert. Diese wurden durch Sequenzieren der DNA-Inserts in einzelnen der Plasmide verfeinert, vor allem nach dem Verfahren von A.M. Maxam und W. Gilbert, "A Hew Method For Sequencing MA^M (Ein neuea Verfahren für die Sequenzierung von DNA), Proo. Natl. Acad« Sei. USA, 74, S. 560 - 564 (1977)).

Plasmid-DNA wurde von einzelnen pHFIF1-13 erfindungagemäß nach dem Verfahren von Kahn, u.a. (aupra) hergeatellt, daa hier zuvor zur Iaollerung der DNA von den Gruppen von Clonen für daa Screening angewandt wurde. Pie isolierte Form I MA wurde durch Zentrifugieren mit neutralem Saccharose-Gradienten wie zuvor gereinigt und durch verschiedene Reatriktionsenzyme eingeschränkt, Im wesentlichen nach der Empfehlung des Lieferanten (New England Biolabs)·

Eingeschränkte DNA wurde 30 min lang bei 65 C In Gegenwart von 4 Einheiten Bakterien-Alkallphoaphatase und 0,1 % SDS dephoaphorlliert. Nach zwei Phenolextraktionen und Äthanol-Aue fällung wurde die DNA 5'-terminal mit ?"-³²Ρ-ΑΤΡ (~>3000 Cl/mMol) und Polynucleotldklnase (P-L Bioohemicals, Inc.) markiert·

Für die Sequenzierung wurden markierte Fragmente auf zweierlei Welse behandelt. Einige wurden auf einem Polyacrylamidgel vor der Spaltung mit einem zweiten Restriktionaenzym gereinigt. Andere wurden aofort mit einem zweiten Restriktionsenzym gespalten. In beiden Fällen wurden die verlangten Fragmente auf einem Polyacrylamidgel in Trlborat-EDTA-Puffer getrennt« Fig. 7 zeigt die verschiedenen Restriktionsfragmente (die Kreise zeigen die Markierung und der Pfeil die Sequenzierungsrioh-

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tung) und die unter Einsatz von pHFIFI, pHFIF3_t pHFIF6 und pHFIF? angewandte Sequensierungastrategle·

Die Fragmente wurden nach der Methode von A.M, Maxam und W. Gilbert (supra) abgetaut. Die Produkte wurden auf Polyacrylamldgelen verschiedener Konzentrationen und Länge in 50 mM Triborat, 1 mM EDTA (pH-Wert 8,3) bei 900 Y bis 2000 V fraktioniert.

Jede Verlängerung des cDNA-Inaerts wurde von beiden Strängen sequenziert, und jede Restriktionsetelle, die als markierter Terminus diente, wurde unter Anwendung eines sie überspannenden Fragments sequenziert. Die zusammengesetzte Nuoleotid-Sequenz, die auf diese Weise für den Kodierungsstrang von IFN-ß-DNA oder Gen und seine entsprechende Aminosäuresequenz gewonnen wurde, 1st in Fig. 4 wiedergegeben. Da keines der Plasmide pHFIFI-13 das vollständige Gen für HuIFN- β enthielt, ergibt sich Flg. 4 aus einer Kombination der Werte von wenigstens zwei derartigen Plasmlden. In diesem Zusammenhang zeigt Fig. 5 die Verwandtschaft der Inserts pHFIFI, pHFIF3» pHFIF6 und pHFIFT, wobei die durchgehenden Pfeile oder Winkel die Orientierung der verschiedenen Teile der Inserts angeben·

In Flg. 4 wird der heteropolymere Teil des Inserts an einem Ende von einem an T¹S reichen Segment und von einem Band von A's flankiert (wodurch vermutlich der PolyA-Terminus der mRNA wiedergegeben wird.) Zur Orientierung ist der Insert vom ersten Nucleotld dee zusammengesetzten Inserts bis zu einem weit in dem nicht übersetzten Abschnitt des Inserts gelegenen Nucleotid numeriert. Bin ATG-Init~iierungs-Triplett an Position 65-67 und ein ATG-Terminations-Trlplett an Position 626-628 begrenzen ein durch Nonsense-Codona nicht unterbrochenes Orientierungaayatem (reading frame). Eine andere über-

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aetzbare Sequenz, d. h. In verschiedenen Orientlerungssystemen (reading framea), die von einem ATG oder einem GTG und einem Terminationssignal flankiert wird, iat zu kurz, um für ein Polypeptid mit der erwarteten Größe von IPN-ß kodieren zu können. Daher enthält die Region zwischen den Nucleotiden 65 und 625 höohat wahrscheinlich die Nuoleotid-Sequenz für die zusammengesetzte DNA-Sequenz, die erfindungsgemäß für IEH-(S kodiert.

Diese Sequenz schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, daß Modifikationen dea Gens wie Mutationen, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen nicht bereite in dem Gen stattgefunden haben oder nicht anschließend zur Modifizierung seiner Eigenschaften oder der Eigenschaften der davon übersetzten Polypeptide angewandt werden könnten· Sie schließt auch nicht jeglichen Polymorphismua aus, der zu physiologisch ähnlichen, aber strukturell etwas anderen Genen oder Polypeptiden führen könnte als den in Pig· 4 angegebenen (supra» S· 3) Zum Beispiel hat ein anderes erfindungagemäß identifiziertes Clon ein ^MT^H anstelle eines ^WC" am Nuoleotid 90 der für IPN-kodierenden Nuoleotid-Sequenz. Durch diese Veränderung im dritten Nucleotid des Codona wird die davon kodierte Aminosäure nicht verändert· Die durch die DNA-Sequenz von Pig· 4 kodierte Aminosäuresequenz ist mit der von Tanlguichi, u.a., supra erwähnten Aminosäuresequenz identisch·

Man sollte natürlich beachten, daß durch übliche Verfahren ge clonter cDNA von PoIyA-BNA (A. Efstratladia, u< >a· supra) 5^f-Terminal-Nucleotide fehlen können und ale sogar künstliche Sequenzen enthalten kann (E.I. Richards, u»a.t "Molecular Cloning And Sequence Analysis Of Adult Chicken /S-Globin cDNA^N (Molekülcloning und Sequenzanalyse von ausgereifter Hühner-ß-Globln-cDNA), Nucleic Aclda Research. 7, S. 1137 -

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1146 (19795). Daher ist es nicht erwiesen, ob das an den Nucleotiden 65 - 67 gelegene ATG tatsächlich das erste ATG von authentischer IFN-β Kodlerungasequenz ist· Für die Zweoke der folgenden Beschreibung wird jedoch angenommen, daß das ATG an den Nucleotiden 65 - 67 das erste ATG von authentischer IFN-ß-mRNA ist.

Vergleicht man das durch diese Region des Inserts kodierte Polypeptid mit der Sequenz von 13 Amino-Terminal-Aminosäuren von authentischem Humanfibroblast-Interferon — MetSerTyrAen-LeuLeuGlyPhaLeuGlnArgSerSer —, bestimmt von Knight, u.a», (j3U£ra), so hat es den Anschein, als ob das gewählte Orientierungaayatem (reading frame) stimmt, und als ob die Nucleotide 65 - 127 für ein Signalpeptid kodieren können, das der für das "ausgereifte" Polypeptid kodierenden Nucleotld-Sequenz vorausgeht·

Außerdem ist in eukaryotischen mRNAn das erste AUG-Triplett von dem S'-'^erminue gewöhnlich die Initilerungsstelle für die Protelnsyntheae (M. Kozak, ^MHow Do Eukaryotio Ribosomes Select Initiation Regions In Messeriger RNA?" (Wie wählen eukaryotische Riboaoman Inltiierungsregionen in Messenger-RNA?), Cell, 15, S. 1109 - 1125 (1978)). Hier ist das Codon in dem zusammengesetzten Fragment, das der ersten Aminosäure von Fibroblast-Interferon entspricht, 22 Codons vom ersten ATG entfernt. Das führt wiederum zu der Vermutung, daß der für Fibroblast-Interferon kodierenden DNA-Sequenz eine Sequenz vorausgehen kann, die ein Signal-Polypeptid von 21 Aminosäuren bestimmt· Die mutmaßliche Signalsequenz enthält eine Reihe hydrophober Aminosäuren. Sine derartige Ansammlung hydrophober Residuen ist natürlich für Signalsequenzen charakteristisch (siehe B.D. Davis und P.C. Tal, "The Meohanism Of Protein Secretion Across Membranes" (Der Mechanismus der Proteinauascheidung auf Membranen), Nature, 283, S. 433 (1980)).

-60- ^28897 2

Die anscheinend dem "ausgereiften¹* HuIPN-/* entsprechende Nucleotid-Sequenz umfaßt 498 Nucleotide, die für 166 Aminosäuren kodieren. Unter der Annahme, daß keine Carboxyterminal-Verarbeitung erfolgt, beträgt die relative Molekülmaase des Interferon Polypeptide 20085» Die Basenzusammensetzung der Kodierungssequenz ist 45 % G+C. Der Codon—Einsatz Innerhalb der Interferon-Kodlerungsaequenzen stimmt mit dem für Säugetler-mRNAn im allgemeinen angewandten überein (R. Grantham, u.a», "Coding Catalog Usage And The Genome Hypothesis" (Anwendung des Kodierungskataloges und die Genom-Hypothese), Nucleic Aclda Research, 8, S. 49 - 62 (1980)). Alle beobachteten Abweichungen können auf die geringe beteiligte Anzahl zurückzuführen sein·

Bei der Struktur des in Pig· 4 für das zusammengesetzte Fragment gezeigten Polypeptide sind natürlich keine Modifikationen hinsichtlich des Polypeptids berücksichtigt, die durch seine Wechselwirkung mit in vivo Enzymen z, B. Glycosylierung, hervorgerufen sein könnten» Es ist daher zu beachten, daß die In Pig. 4 gezeigte Aminosäuresequenz nicht mit in vivo erzeugtem HuIPN-|3 identisch sein muß.

Ein Vergleich der ersten 13 Aminosäuren von authentischem Pibroblast-Interferon (Knight, u.a., supra) und der von dem zusammengesetzten Gen abgeleiteten Sequenz von Pig. 4 ergibt keinen Unterschied· Die Aminosäurezusammensetzungen, die einerseits direkt für authentisches Pibroblast-Interferon bestimmt wurden, und die von der Sequenz des erfindungsgemäßen zusammengesetzten Gens andererseits abgeleitet wurden, zeigen auch erhebliche Ähnlichkeiten. Pig. 6 zeigt einen Vergleich dieser Zusammensetzungen.

Obwohl keines der anfangs im Rahmen der Erfindung hergestell-

61» L· L Q Q Ό

ten Rekomblnant-EUA-Moleküle die vollständige DNA-Sequenz für Fibroblaat-Interferon enthält, stellen sie eine nützliche Sonde für das Screenen von Sammlungen von DNA-Sequenzen für diejenigen Sequenzen dar, die mit HuIFN-ß verwandt sind. Außerdem ist ©ine Kombination von Absohnitten der Inserts dieser Rekombinant-DNA-Moleküle zur Schaffung der vollständigen IFN-β -Kodierungssequenz, wie unten demonstriert wird, dem Fachmann bekannt» Zum Beispiel geht aus der Betrachtung von Fig. 5 und Fig. 8 klar hervor, daß das Pail-Bglll-Fragment von pHFIF6 mit dem PstI-HaeII-Fragment von pHFIF? verknüpft -werden kann, oder daß das EooRI-Patl-Fragment von pHFIF6 mit dem Pstl-Haell-Fragment von pHFIF7 verknüpft werden kann, oder das jBglll-Pjjtl-Fragment von pHFIFG mit dem P£tl-Bglll-Fragment von Clon 7 zur Bildung einer zuaarnmengesetssten HuIFN-A-Kodierungesequenz verknüpft werden kann« Das Verknüpfen dieser Fragmente kann selbstverständlich vor oder nach der Insertion des geclonten Fragmentes in ein gewünschtes Plasmid vorgenommen werden.

Darstellung von Plasmiden, die die vollständige, für HuIFN-kodierende DNA-Sequenz enthalten, zur Expression von

Bakteriophage λ enthält zwei starke Promotoren, Px und Pp, deren Aktivität von einem Repressor-Protein, dem Produkt des Phagen-Gana el, gesteuert wird. In Gegenwart des Repressors wird die transcription von diesen Promotoren vollkommen unterdrückt. Durch die Entfernung des Repressors wird eine starke Transcription von Pt und P„ in Gang gesetzt (zur Information sieh© H· Ssybalski und W* Szybalekl, ^WA Comprehensive Molecular Map Of Bacteriophage λ " (Eine umfassende Molekülkart© von Bekiüerlophage λ ), Gene, 7, 217 - 270 (1979))·

Derivate des Multikopie-Plasmlda pBR233 (F. Bolivar, JU₂Jv, "Construction And Characterisation Of üfevi Cloning Vehicles.

a / ι

II. A. Multiple Cloning System" (Konstruktion und Charakterisierung von neuen Clonlngvehlkeln. II. Ein Mehrfach-Clonlng-System), Gene, 2, S. 95 - 113 (1977)) wurden zur Aufnahme des Ρτ-Promotors konstruiert. Diese Plaemide werden in der Britischen Patentanmeldung 80.28983, eingereicht am 8· September 1980, beschrieben, auf die hler Bezug genommen viird.

A. Struktur von den Ρτ-Promotor enthaltenden Plasmlden Plaamld pPLa2311

Plasmid pPLa2311 (in Fig. 8 dargestellt) besteht aus drei Haell-Fragmenten. Daa größte Fragment, etwa 1940 Basenpaare, enthält die Ρ^Οχ-Region von Bacteriophage ^ und die ß-Lactamase-Gen-Region von pBR322 (J. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence Of The Eacherlohia coil Plasmid pBR322^w (Vollständige Nucleotid-Sequenz des Eecherlohla coil Plasmida PBR322 (Cold Spring Harbor Symposium, 49, 77 - 90 (1978)). Neben diesem Fragment befindet sich ein 370-Baaenpaare-HaeII-Fragment, das von Plaamid Col E₁ stammt· Der Ausgangspunkt der Repllkation überspannt die Verbindungsstelle zwischen diesen beiden Fragmenten (A. Oka, u.a·, "Nucleotide Sequence Of Small CoIE₁ Derivates» Structure Of The Regions Essential For Autonomous Replication And Collcin E₁ Immunity¹¹ (Nucleotid-Seqaenz von kleinen CoIE₁ Derivaten. Struktur der für autonome Replikation und Colicin E-j-Immunltät wesentlichen Regionen), Mol. Gen. Genet.. 172, 151 - 159 (1979)). Daa dritte Haell-Fragment, etvia 1600 Basenpaare lang, kodiert für Reslatenz gegenüber Kanamycin. Dieses Fragment wurde ursprünglich von Plasmid PCR₁ abgeleitet (C. Covey, u.a», "A Method For The Detection Of Restriction Sites In Bacterial Plasmld DNA" (Eine Methode für den Nachweis von Restrlktlonaateilen in Bakterien-Plaamid-DNA), Mol. Gen. Genet,, 145, 155 - 158 (1976))· Die Richtung der Transcription von dem P_L-Promotor läuft im gleichen Sinne wie das ß-Lactamase-Gen. Plasmld pPLa2311 verleiht Resistenz gegenüber 100/Ug/ml Carbenicillin und 50/Ug/ml Kanamycin.

Plaemid G~pPLa8 (in Fig_e 9 dargestellt) \nurde von pPLa2311 abgeleitet, indem die Psrfc3>S teile in dem [b-Lactamaee-Gen in eine BamHI-Stelle umgewandelt viurde· Dies erfolgte durch S^-Nacleaa β-Behandlung von Pjstl «-geöffnet em pPla2311 und anschließende Stumpf-Enden-Ligation zu ein BamHI-^Linker-Pragment (erhalten von Collaborative Research,, Inc, Waltham, Mass.) und Rezirkulariaierung des Moleküls nach BamHI-Spaltung. Plasmid pPlaß spezifiziert keine Resistenz gegenüber Carbenicillin mehr, aber verleiht noch Resistenss gegenüber Kanamycin.

Plasmid G-p?Lc24 (In Pig» 10 dargestellt), enthält das ßlaotamase-Gen und den Replikationsursprung von pBR322. Ein 29O-"Basenpaar©»HaeII-Ec£RI~Pragment enthält die P^O^-Reglon von Bakteriophage Λ * Die Richtung der Transcription von dem Ρτ-Promotor verläuft star EcoRI-Stelle hin. Ein 431-Basenpaar-EpoRI-BamHI-Fraggient kodiert für die Ribosombtndeetelle und die ersten 98 Aminosäureresiduen dea Bakteriophage~MS2-Replikase-Genßj, das von Plasmid pMS2-7 gewonnen isurde (R₉ Devos, u.a., "Construotion And Characterization Of A Plasmid Containing Nearly Pull-Size WA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA» (Konstruktion und Charakterisierung eines Plaemids, das eine Kopie in fast voller Groß© von Bakteriophage MS2 RNA enthält), i. ¹²⁸S¹ 595 -619 (1979)). Die Translation des

JÄS2 Replikase-Proteinfragments läuft-kol ine ar mit der Transcription von dem P^-Promotor.

B, Xf32erjJjirj,bMn£i£0_sraAja^B£U^ P^^Promotor-Aktivltäi;

Die Transcription des Pv^Promotors — vorhanden an den Plasmiden pPLa2311» pPLaß und pPLc24 — ^ird unterbunden, indem die Plasmide in einem JSg^jsoljL Stamm, gehalten werden, der daa Repressorprotein synthetisierte Wegen des selbstregelnden Verlaufs der Synthese (M₀ Ptashn©^ Ji^a».» "Autoregulation And

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Function Of Δ Repreaaor In Bacteriophage > ^M (Selbatregelung und Funktion einea Repreaaora In Bakteriophagen ) Science, 194, S. 156 - 161 (1976)), lat eine Kopie dea cI-Gena an dem Chromoaom elnea lyaogenen Stainmea in der Lage, den an einem Multikopie-Plasmid vorhandenen P^-Promotor vollkommen zu unterdrücken.

Bei den erfindungagemäß verwendeten Stämmen handelte ea aich um E. coil Κ12ΔΗΙ (K12 M72 Iac AtrpEA2 Sm² (λ cI857 N_ftni7 Ν_81η53ΔΗΙ bio); U. Bernard u.a., "Conatruction Of Plaamid Cloning Vehiclea That Promote Gene Expreaaion From The Bacteriophage Tl Pt Promotor¹¹ (Konatruktion von Plaamid-Cloningvehikeln, die die Gen-Expreaaion von dem Bakteriophage Λ P^ Promotor fördern), Gene, 5, S. 59 - 76 (1979)) und E. coll M5219 (K12 M72 lac^trp^Sm¹¹ (A CI857AHI bio252); H. Greer, "The kll Gene Of Bacteriophage λ ^w (Daa kil-Gen von Bakteriophage λ ), Virology, 66, 589 - 604 (1975))· Beide Stämme weiaen eine defekte, nicht-auaachneldbare λ -Prophage auf, die ein Mutant -.el- Gen trägt. Daa Mutant-Gen kodiert für einen temperatur-empfindllchen Repreaaor, wodurch daa Ingangaetzen der Transcription von dem P^-Promotor durch Veränderung der Temperatur möglich iat — bei 28 ⁰C iat der Repreaaor aktiv und unterdrückt die Tranacription von dem Ρτ-Promotor, aber bei 42 ⁰C wird der Repreaaor inaktiviert und die Tranacription von dem Ρτ-Promotor wird In Gang geaetzt·

Durch die 4, HI-DeIetion der Prophage wird ein Teil dea cro-Gena entfernt und alle anderen Gene welter nach rechte von

gebracht (M. Caatellazzl, u.a., "Iaolation And Characterization Of Deletion In Bacteriophage λ Reaidlng Aa Prophage I E. coll K12^H (Iaolierung und Charakteriaierung von Deletionen in Bakteriophage λ , die ala Prophage I E. ooll K12 vorkommt), Mol. Gen. Genet., 117, 211 - 218 (1972)). Die Deletion dea cro-Gena let günatlg, da die Anaammlung dee c.rp

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Proteine bekanntlich, die Transcription von dem Ρτ-Promotoi unterdrückt (A. Johnson jijju, "Mechanism Of Action Of The pro Protein Of Bacteriophage λ ^tt (Wirkungamechanlamu.fi dee cro-Protelna von Bakteriophage λ ), Proo. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1783 - 1787 (1978))· Der Stamm M5219 enthält außerdem die bio252»Deletion, die alle Gene llnka von £111, einschließlich kil entfernt.

Nach der Temperaturinduktion verwirklicht Stamm M2519 ein funktionalles N~Gen~Produkt. Stamm Κ12ΛΗΙ dagegen zwei gelbe Mutationen in N₈ die ea funktionell N-negativ machen. Daa Produkt des N-Gena wirkt bekanntlich als ein Anti-Terminator in Bakteriophage λ (J.W, Koberts, "Transcription Termination And Late Control In Phage Λ ^w (Tranaoription, Termination und letzte Steuerung in Phage λ ), Proc. Natl., Acad. Sei, USA, 72, 3300 - 3304 (1975))« Der Anti-Termlnationaeffekt wurde ebenfalls bei Terminat©r«rSequenzen beobachtet, die natürlich nicht an Phage Λ DNA vorhanden aind (z. B. der natürliche Stopp am End© des jjrj3~0peron), vorausgesetzt, das MA-Tranacript beginnt an dem Ργ-Promotor· Des weiteren wurden die durch die Anwesenheit eines Nonsense-Godons In dem Ρτ-Transorlpt eingeführten Polaritätseffekte unter der Wirkung des N-Gen-Proteina gemildert (zur Information siehe N. Franklin und C. Yanofsky, (The N Protein Of X t Evidence Bearing On Transcription Termination, Polarity And The Alteration Of E. Coll RNA Polymerese^M (Das N-Protein von λί Nachweis über Transcription, Termination, Polarität und die Veränderung von E._i coil ENA-Polymeraae), in ENA-Polymeraae (Cold Spring Harbor Laboratory, 1976), S. 693 - 706) Stehen die oben genannten Plasmide in einer wärme-induzierbaren Bakterien _o_I Unterlage zur Verfügung, dann kann experimentell die Aktivität des P^-Promotora in Gang gesetzt oder abgebrochen werden· Und die Wahl von K12AHI oder M5219 gestattet, daß die Transcription entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart des N-Gen-Produktea erfolgt. Letzteres könnte, wie oben beschrieben wurde, in den Fällen vorteilhaft sein,

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in denen DNA-Regionen transcribiert werden sollen, die Transcriptions-Termlnator-artlge Sequenzen oder Verlangeamunga-Sequenzen für die DNA-Polymerase enthalten.

C. Konstruktion von Glonen, bei denen eine für HuIPN-β kodierende DNA-Sequenz in ein Plasmid, das den P^-Promotor enthältt eingesetzt 1st .

In der folgenden Beschreibung wurden die Isolation von Plaamid-DNA, die Restriktionsanalyse von DNA und die Ligation von DNA-Fragmenten wie oben für das Clonen von doppelsträngiger DNA beschrieben vorgenommen. Der Transformationssohritt wurde gleichfalls wie oben ausgeführt, nur erfolgte bei Verwendung von Stämmen Κ12ΔΗΙ und M5219 als Wirt der Wärmeachock 5 min lang bei 34 ⁰C und das Inkubieren der transformierten Zellen bei 28 ⁰C.

1. Konstruktion von Plasmid G-pPLa-HFIF-67-1 Die Grundlage für diese Konstruktion war die Beobachtung, daß die Kombination entsprechender Restriktionsfragmente von den Clonen G-pBR322(Pat)/HFIF-6 und G-pBR322(Pst)/HFIF-7 die Rekonstruktion einer vollständigen fortlaufenden Kodlerungssequenz von IFN- β ermöglicht. Der Lauf der abgeleiteten Fragmente durch die verschiedenen Konstruktionsschritte 1st schematisch in Fig. 8 dargestellt. Plasmid G-pBR322(Pst)/ HFIF-6 wurde mit EcoRI und Pstl gespalten und mit Plasmid G-pBR322(Pst)/HFIF-7 verbunden, das mit Pstl und Pyul gespalten worden war. Nach der Ligation wurde das Gemisch mit EcoRI und Haell digeriert. Ein 4-facher Molübersohuß dieses Gemiachs wurde anschließend mit Plasmid G-pPLa2311 verbunden, das mit Haell und EcoRI digeriert worden war. Transformanten wurden in Stamm ΟβΟΟν-^ά^ (λ) (der wegen seiner relativ hohen Transformationsfähigkeit und da er einen Wild-Typ von cJ-Gen enthält, verwendet wurde) durch Selektion für Kamamycin-Resistenz gewonnen. Von 15 ausgewählten Transformanten

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hatten zwei ihre Resistenz gegenüber Carbenicillin verloren· Die Reatriktionsanalyse der von den Plaamiden dieser Transformanten isolierten DUA ergab, daß eines die in Pig. 8 dargestellte verlangte Struktur von G-pPLa-HFIF-67-1 hatte. Dieses Plaamid enthielt eine einzigartige EcoRI-Stelle und eine einzigartige Patl-Stelle. Kombinierte jScjsRI-Pjrtl-Digeatlon erzeugte awei Fragmente -«· von denen daa kleinere mit einem nach der EcoRI-Pa^I-Spaltong von G-pBR322(Pst)/HFIF-6 gewonnenen Fragment komigrierte. Die Bglll-Digeatlon sonderte ein kleines Fragment von etwa 650 Basenpaaren aus. Die Größe dieses letzteren Fragmentes stimmt mit der erwarteten Größe nach der Vereinigung des proximal en BgII I •"Pat I-Fr agme nt e a von Clon G»pBR322(Pat)/HFIF-6 mit dem dletalen Petl-Bglll-Te11 von G-pBR322(Pst)/HFIF-7 überein. HlncII-Digeation erzeugte drei Fragmente, wie aus dem Vorhandensein der HlncII-St eilen in der Pt-Region, dem Amino-Terminalteil des ß>-Lactamase-Gena und dem nioht-übersetzten 5'-Ende der DNA-Sequenz von HuIFN- /3 zu erwarten war· Dieaea Plasmid wurde als G-pPLa-HFIF-67-1 bezeichnet.

Auf der Grundlage der oben genannten Charakterisierung durch Restriktlona-Enzymanalyae müßte Plasmid G-pPLa-HFIF-67-1 die vollständige Kodierungssequenz für HuIFN- β enthalten. Die Richtung der vorgesehenen Transcription läuft kolinear mit der des Pt-Promotors. Zwischen dem Pt und dem HuIFN- β -Kodierungssequenz-Gen weist daß Plasmid immer noch den Poly(A.T)-Schweif und ein umgekehrtes 3'-End-Fragment wie in G-pBR322 (Pst)/HFIF-6 auf.

2, Konstruktion von Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12 Der nächste Schritt bei den Konstruktionen betraf die Entfernung des Poly(A.T)-Schweifes und eines Teiles des umgekehrten 3'End-Fragmentes von G-pPLa-HFIF-67-1 (siehe Fig. 9). G-pPLa-HFIF»67-1-DNA wurde mit BgIII und HgAII gespalten. Da die HuIFN- f> -Kodierungssequenz keine Hpall-Stelle enthält,

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wird durch diese Behandlung dea die gesamte Kodierungseequenz für IFN-ß enthaltende Bglll-Fragment gewonnen und gleichzeitig der übrige Teil dea Vektors inaktiviert. Das resultierende Bglll-Fragment wurde mit Plasmld G-pPLa8 verbunden, das mit BamHI digeriert norden war· Die Enzyme BgIII und BamHI erzeugen identische abgestufte Enden, so daß die Bglll-Enden mit einer geöffneten BamHI-Stelle und umgekehrt verbunden werden können. Eine in dieser Weise rekonstruierte Stelle 1st kein Substrat mehr für BgIII oder BamHI, sondern wird von dem Enzym Sau3AI (Mbol) erkannt (V. Pirottä, "Two Restriotion Endonucleaeea Prom Bacillus globlgil" (Zwei Restriktions-Endonucleasen von Bacillus' globigll), Nucleic Acids Rea. _t 3» 1747 1760 (1976)). Nach der Ligation wurde daa Gemisch wieder mit BamHI gespalten, um diejenigen G-pPLa8-läoleküle auszuschließen, die einfach rezlrkularisiert waren. Es wurden wieder Transf ormanten in 0600γ^^( λ ) gewonnen, die für Kamamycin-Reeistenz selektierten.

Die Transformanten wurden durch Größenbestlmmung ungespaltenei DNA auf Agaroaegel nach obiger Beschreibung zur Charakterisierung der IFN-β-verwandten Rekombinant-Plaamide ausgewählt. Clone, die eich als etwas größer als die G-pPLa8-Eltern erwiesen, wurden weiterhin der Restriktionsanalyse mit entweder Pstl oder HlncII unterzogen. Es wurde ein Clon gefunden, das eine einzige Patl-Stelle und drei HinoII-Stellen enthielt. Ein Fragment dieses Clons komigrierte mit einem HincII-Fragment von pPLa8, das von dem P^ abgeleitet war, zu der [b -Lactamaae-Region. Ein anderea kleines Fragment des Clona wies etwa 400 Basenpaare auf — was mit der Insertion des Bglll-Fre mentes in G-pPLa8 im Orientierungeainne in bezug auf den P^- Promotor übereinstimmt. Dieses Plasmid wurde als G-pPLa-HFIF-67-12 bezeichnet. Die zur Konstruktion dieses.Plasmids angewandten Schritte sind schematisch in Fig. 9 dargestellt« Eine ausführlichere Karte dieses Plasmids ist in Fig. 11 zu sehen. Die Größe des Plasmids ( ** 4450 Basenpaare) wurde nach

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der Größe seiner beteiligten Fragmente berechnet, die ihrerseits aufgrund ihrer relativen Mobilität bei der Elektrophorese auf Agarosegel geschätzt worden waren.

E.g_coli Κ12ΔΗΙ und M5219 wurden anschließend mit dem charakterisierten Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12 transformiert.

Die Betrachtung der bestimmten Nuoleotidsequene um die BgIII/ BamHI-Verbindungsstelle in G-pPLa-HFIF-67-12 herum, ergab ein interessantes Merkmal, Das an AUG der fh -lactemase-Kodierungsaequenz dieses Plasmida initiierte Polypeptid endet an einem innerhalb des nicht-überaetzten 5'-Endes der HuIFN- ß> -Kodierungsee quenz gelegenem Doppel-Ambra-Codon. Diese Terminations-Codons liegen 23 Nucleotide vor dem Initiierungs-AUG des HuIFN-ß>-Signalpeptids: d. h. j

CCC, ProVerbindungsstelle BeffiEC/Bglll

JGG.AUC.UUCAGU.UUC^GGA.GGC.AAC.CUU.UCG.AAG.CCU· Arg-Ile-Phe~Ser-Phe-Gly-Gly-Asn-Leu-Ser-Lys-Pro-

UUG.CUC.UGG.CAC.AAC.AGG.UAG.UAG GCGACACUGUUCGUGUUGUCAAC Leu-Leu-Trp-His-Asn-Arg am am

AUG-(HuIFN*β-Signal-Peptid-Kodierungsse quenz)-AUG-(ausgere if · tea HuIFN-/^-Kodierende Sequenz).

Die eingerahmte Figur betrifft die Anzahl von Aminosäurereaiduen in dem P -Lactamaseprotein von pBR322 (J. Sucliffe, supra). Das Sternchen (^Ä) besagt, daß das in dieser Position an pBR322 vorhandene CCU-Codon infolge der Umwandlung der Pstl-Stelle in pPLa2311 in eine BamHI-Stelle in pPIa8 in CCC umgewandelt wurde (siehe oben).

Durch eine Konstruktion wird somit die Möglichkeit der Reinitiierung an dem AUG des HuIPU- /i-Signal-Peptide geschaffen un< somit die mögliche Expression von IFN-/^, das mit seinem Signal-Peptid verschmolzen ist, das aber nicht mit einem Teil voi β -Lactamase verschmolzen ist* Eine derartige interne Reinitiierung nach vorzeitiger Termination 1st in dem Repressor-Gei des E, coil Lactose-Operons beobachtet worden (T. Platt, u.a., "Translational Restarts: AUG Reinitiation Of A lac Represaor Fragment" (Translationa-Neustartsi AUG-Relnitiierung eines 2ϋ£ Repressor-Fragmentes), Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 69, 897 901 (1972)). Diese Konstruktion könnte die Ausscheidung von ausgereiftem IFU-/3 durch einwandfreie Erkennung der HuIFN-|3 Signalsequenz ermöglichen.

3. Konstruktion von Plasmld G-pPLa-HFIF-67-i2A19 Aus der bekannten Sequenz von pBR322 und der HuIFIT-15-Kodierungssequenz kann man ableiten, daß die Deletion des kleinen HinoII-Fragmentes aus G-pPLa-HFIF-67-12 (aus innerhalb vonß-Lactamaae bis zu 3 Nucleotide vor dem AUG initiierenden HuIFN-(^>-Signalpeptid) zu einem fortlaufenden Translationa-Orientierungssystem (reading frame), führt, das an dem AUG von β -Lactamaee beginnt und nach der HuIFN- ß>-Kodierungssequenz endet· Von dieser Konstruktion kann man daher voraussagen, daß sie für ein PolypeptLd kodiert, das aus 82 Aminosäureresiduen von derf^-Lactamase-Kodierungssequenz, einer an der verschmolzenen Hlnc-Stelle kodierten Aminosäure, dem HuIFN-/5-Signalpeptid und ausgereiftem HuIFN-ß> beateht, d. h·t

82 GUU

AACAUG-(HuIFN- β -Sigiialpeptid-Kodlerungssequenz )-AUG-

Val--Aan-Met

(ausgereiftes HuIFN-^»-kodierende Sequenz)

Die eingerahmte Figur betrifft die Anzahl von Amlnosäureresidue

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in dem ^-Lactamaeprotein von pBR322 (J. Sutcllffe, aupra)» Daher könnte dieae Konstruktion die Expression einea verachmolzenen Polypeptida ergeben, das aus einem Teil von/3-Lactamase beateht, das durch eine Aminosäure mit dem HuIFN-j2>-Slgnalpeptld verschmolzen ist, das selbst mit ausgereiftem HuIM-/3 verschmolzen iat. Bin derartiges Fuaionaprotein kann man von der Zelle erwarten.

G~pPLa~HFIF»*67-12 wurde teilweise mit HlncII digeriert. Nach der Ligation bei einer DNA-Konzentration von etwa 0,01 /Ug/ml wurde die DNA mit Xorll, einem Isoschlzomerem von Pvul, das 3'-vorstehende Enden erzeugt (R. Wang, lua.« Blochem. BIophya. Aota, in Druck), gespalten und bei niedriger DNA-Konzentration religiert· Eltern-G-pPla-HFIF-67-12 enthält zwei Xorll-Stellen* eine Stelle inaktiviert das Kanamycin-Gen und das andere befindet sich in dem HincII-Fragment, das von dem Plasmid ausgeschieden werden soll. Der Schritt der Xprll-Dlgestion-Religation hat den Zweck, Eltern-DNA-Moleküle zu eliminieren, die durch das HlncII-Enzym nicht gespalten wurden. Solche Moleküle besitzen zwei Xorll-Stellen, und unter den für die Ligation angewandten Bedingungen ist es höchst unwahr ache inl ich, daß zwei Fragmente wieder vereinigt werden. Transforraanten wurden in Ο6θθΓ^πι^(λ ), das für Kanamycin selektiert, gewonnen und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein einer einzigen Pvul-Stelle untersucht. Die weitere Analyse der Clone wurde unter Anwendung von HlnoII-Dlgestion vorgenommen. Ein Clon, dem das kleinste HincII-Pragment fehlte, das aber sonst mit G-pPLa-HFIP-67-12 identisch war, wurde als G-pPLa-HPIP-67-12A 19 bezeichnet. Die zur Konstruktion dieses Plasmlds angewandten Schritte aind in Pig. 12 aohematisch wiedergegeben. Eine ausführlichere Karte dieses Plasmids ist in Pig. 9. ζα sehen. Die Größe des Plasmids (*v 4050 Basenpaare) wurde durch Zusammenfassen der Größe seiner einzelnen Fragmente geschätzt, die ihrerseits aufgrund ihrer relativen Mobilität bei der Elektrophorese in Agarosegelen geschätzt worden waren. E. coil Κ12ΔΗΙ und M5219

τ b a a /

wurden dann mit dem charakterisierten Plaamid G-pPLa-HFIF-67-12A 19 transformiert.

4· Konstruktion von Plaamid G-pPLc-HFIF-67-β

Plaamid G-pPLc24 bietet eine «eitere Möglichkeit für die Inaertion von HuIPN- ß~Sequenzen in einer solchen Art und Welse, daß ein anderes Fusionspolypeptid potentiell synthetiaiert werden kann. Duroh die Insertion des Bglll-Fragmentea von G-pPLa-HFIF-67-1 in die BamHI-Stelle von G-pPLc24 ergeben sich ein für 98 Aminoaäureresiduen dea MS2-Replikase-Gen kodierendes fortlaufendea Orientierungaayatem (reading frame (W· Piers, u.a., "Complete Nucleotide Sequence Of Bacteriophage MS2 RNA» Primary And Secondary Structure Of The Replicase Gene" (Vollständige Nucleotid-Sequenz von Bakteriophage MS2 RNAs Primäre und sekundäre Struktur dee Repllkase-Gens) Nature, 260, 500 - 507 (1976)), 27 Aminosäuren, die durch Se quenzen zwischen der Bglll-Stelle und dem Initilerungs-AUG der Signal-Sequenz von HuIFN-»p kodiert wurden, gefolgt dura das HuIFN-/2>~Signalpeptid und ausgereiftes HuIFN-ß , d· h.:

98 UGG

GAU. CUÜ· OAG. UUU· CGG. AGG, CAA. CCU. ίπτσ . GAA· GCC . UUU. GCtJ. Trp-Aap-Leu-Gln-Phe-Arg-Arg-Gln-Pro-Phe-Glu-Ala-Phe-Ala-

CUG.GCA.CAA.CAG.GUA.GUA.GGC.GAC.ACU.GUU.CGU.GUU.GUC.AAC. Leu-Ala-Gln-Gln-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Val-Arg-Val-Val-Asn-

AUG-(HuIFN-ß-Signalpept id-Kod ierungsae quenz)-AUG-(aas gere if xSI HuIFN-ß kodierende Sequenz).

Die eingerahmte Figur betrifft die Anzahl von Aminosäureresiduen in dem MS2 Replikaae-Gen-Protein (R. Devoa, u.a., supra; W. Fiers, u.a., aupr-a). Somit könnte diese Konstruktion die Expression eines verschmolzenen Polypeptide ermöglichen, das aus einer Portion von MS2 Replikase besteht, die durch 27 Aminosäuren mit dem HuIFN-ß-Signalpeptid verschmol·

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zen ist, das seinerseits mit auegereiftem HuIFN-ß verschmolzen ist«.

G-pPLa-HFIF-67-1 DNA viurde mit BgIII digeriert und mit BamHigespaltener pPLc24 DNA verbunden. Das Ligationsgemisch wurde wieder mit BamHI abgebrochen, um ursprüngliche pPLc24 Moleküle zu eliminieren, und wurde in C600r^Bw(^ ) transformiert, das für Resistenz gegenüber Carbinicillin selektiert. Die Tranaformanten wurden durch. Restriktion mit HincII analysiert. Aus den bekannten Positionen der Restriktionsstellen an pPLc24 kann man voraussagen, daß die Insertion des BJgIII-II¹N-Ii-Fragmentes im Orientierungssinne in bezug auf P^ ein zusätzliches HincII-Fragment von etwa 650 Basenpaaren erzeugen müßte. Ein diese Konfiguration aufweisendes repräsentatives Glon wurde als pPLc-KFIF-67-8 bezeichnet. Die zur Konstruktion dieses Plasmida angewandten Schritte sind in Fig. 10 wiedergegeben. Eine ausführlichere Karte dieses Plasmids 1st in Fig. 13 zu sehen. Die Größe des Plasmids (^ 3850 Basenpaare) wurde durch Zusammenfassen der Größe seiner einzelnen Fragmente ermittelt, die ihrerseits aufgrund ihrer relativen Mobilität bei der Elektrophorese in Agarosegelen geschätzt »orden waren· E. coli Κ12Δ.ΗΙ und M5219 wurden mit dem charakterisierten Plasmid G-pPLc-HFIF-67-8 transformiert·

5· Konstruktion von Plaamld G-pPLa-HFIF-67-12^2793? PJasmid pKT279 (ein Gesohenk von K. Talmadge; pKT279 ist ein Derivat von pBR322, bei dem eine Portion des Gena für fi-Lactamase beseitigt wurde und eine Patl-Stelle vorhanden 1st, die an Aminosäure 2 von /3»-Lactamase konstruiert wurde) wurde mit Patl digeriert und die 3'-terminal Verlängerung wurde entfernt und das Fragment wurde stumpf-endend ausgeführt, indem eine Behandlung mit E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in Gegenwart von Desoxynucleosidtriphospha-

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ten vorgenommen wurde. Das Pstl-lineariaierte und 3'-stumpfendene DNA-Fragment von pKT279 wurde anschließend mit EcoRI zur Erzeugung eines Fragmentes digeriert, das unter anderem für die Signalsequenz von /3-Lactamase und die ersten vier Aminosäuren von ausgereiftem Protein kodiert.

Dieses kleine Fragment wurde danach verwendet, um das Hpal-EcoRI-Fragment von pPLa-HFIF-67-12Δ19 (wobei die Hpal-Stelle sich aufgrund der oben beschriebenen Deletion von G-pPLa-HFIF-67-12 ergibt) durch Ligation des Hpal-EcoRI eingeschränkten pPXa-HFIF-67-12A19 mit diesem Fragment in Gegenwart von T4 DNA-Ligase zu ersetzen.

Die vorausgesagte Sequenz an der Pstl (stumpf-endend en)-Hp_al-Verblndungssteile ist:

(ß-Lactamase~Signalpeptid-Kodierungasequenz)-CAC.CGC.AAC.

Hls-Arg-Asn-

AUG-CHuIFN-^-Signalpeptld-Kodlerungssequenzi-AUG-Causgereif-

tea HuIFN-(i kodierende Sequenz)

Folglich führt die Konstruktion zu IFN-ß, dem zwei Signalsequenzen im Tandem vorausgehen — eine Bakterien-Signalsequenz (/i -Lactamase) und die IFN- β -Signalsequenz — die durch mehrere Aminosäuren verbunden sind. Daher könnte diese Konstruktion die Expression von ausgereiftem, mit zwei Signalpeptiden verschmolzenen HuIFN- β ermöglichen, oder wenn die Tandemkombination einer Bakterien-Signalsequenz und der Signalsequenz von HuIFN- ß» durch die Bakterie erkannt und einwam frei gespalten wurde, kann die Konstruktion die Expression voi ausgereiftem HuIFN-ß und seine Ausscheidung aus der Zelle ergeben·

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g>-ooli M5219 «urde mit pPLa-HFIF~67-12A 279T transformiert.

6o Konstruktion von Plaamid G-pPLa-HFIF-67-12A218M1 Plaamid pKT218 (ein Geschenk von' K. Talmadge; pKT218 iat ein Derivat von pBR322, das eine Portion des Gene für ß~Lactamase aufweist und deeaen Signalsequenz getilgt ist, und das eine an Aminosäure 4 der Signalaequenz von A-Lactamase konstruierte Pjrtl-Stelle hat) wurde mit Eo₁ORI und AIuI zur Erzeugung eines Fragmentes digeriert, das unter anderem für den Anfangsteil dea A-Lactamase-Signalpeptids kodiert. Dieses Fragment wurde in Gegenwart von T4 DNA-ligase mit einem Fragment vereinigt, das von pPLa-HFIF-67-12 A^S durch Alul-Digestion in Gegenwart von Aotinomycln D (0,05 mM) (zur Einschränkung des Plaamids an der Alul-Stelle in dem IFN-/3-Signalpeptld) und Restriktion mit EcοRI erzeugt worden viar.

Das resultierende Plasmid, das als pPLa-HFIF-67-i2d 218M1 bezeichnet wurde, enthielt den Anfangsteil dea für daa yß-Lactamase-Signalpeptid kodierenden Gens, einen Teil des das HuIFN-13-Signalpeptid kodierenden Gens und das für ausgereiftes HuXFN-ß kodierende Gen. Die vorausgesagte Sequenz der entsprechenden Region des Plasmids ist»

GCU,CUU₉UCC-AUG-(ausgereiftes HuIFN-^-kodierende Sequenz) Ala-Leu-Ser-Met-

Die eingerahmte Figur bezieht sich auf die Anzahl von Aminosäureresiduen in dem ß-Laotamase-Slgnalpeptid von pKT218_o Daher kann diese Konstruktion die Expression von ausgereiftem HuIFN-ρ ermöglichen, das mit einem Teil einer Bakterien-Signalaequenz und einer Portion seiner eigenen Signalsequenz ver-

schmolzen Lato Wieder könnte, nenn der Bakterienviirt die Hybrid-Signalaequenz erkennt und einwandfrei epaltet, ausgereiftes HuIFN-/& von dieaem Plaamid verwirklicht und aua der Zelle auageachieden werden·

E. coil M5219 wurde mit pPLa-HIFI-67-i2A218M1 transformiert·

7. Konstruktion von Plaamid G-pPLa-HPIF-67-12.Zi.M1 Plaamid pPLarHFIF-67-124 19 wurde wie zuvor mit AIuI in Gegenwart von Actinomycin D(O,05 mM) linear!alert, um an der AIuI-Steile in dem Signalpeptid von HuIPN-β einen Abbruch zu erzeugen. Naoh der Dlgeation mit Hpal wurde die DNA in Gegenwart von T4 DNA-Ligasθ rezirkularisiert· Daa resultierende Plaamid, daa ala pPLa-HFIF-67-124M1 bezeichnet wird, hatte nur einen kleinen Teil der IPN-/^-Signalaequenz, die der für auagereiftea IFN-/3 kodierenden DNA-Sequenz vorausgeht·

Die vorauageaagte Sequenz der Verbindungaatelle iati

GUC.UUU.CCA.UGA· Leu-Phe-Pro-STOP

AUG- (ausgereiftes HuIFN-/5 kodierende Sequenz]

Die vertikal eingerahmte Figur bezieht aich auf die Anzahl der Aminoaäurereaiduen in /^Lactamaae· Die horizontal eingerahmte Figur bezieht sich auf die Sequenz in einem zweiten Orientiarungaayatem (reading frame). Daher wird die Translation der /5-Lactamaae-Kodierungsaequenz und der übrigen Portion der Kodlerungasequenz für daa Signalpeptid von IFN-β an den UGA-Stoppoodon angehalten. Daa Staft-Codon (AUG) für auagereiftea IFN- fi ist jedoch an der gleichen Stelle vor-

_ 77 -

handen, allerdings in einem anderen Orientierungasystem (reading frame). Daher kann die Reinitiierung der Tranalation an dem Punkt zur Erzeugung von ausgereiftem HuIPN-β stattfinden.

,coil M5219 wurde mit pPLa-HFIF-67-122lM1 transformiert.

^Q" Konstruktion von Plaamid G-pPLa-HFIF-67-12Ai9 ΒΣ-2 Plaamid pPLa-HFIF-67-12 Δ.19 wurde mit Hpal linearlaiert und mit Exonucleaae BAL 31 behandelt, um Basenpaare sequentiell vom Ende des lineariaierten DNA-Fragmentes zu entfernen. (H. G^rav» üäJjl» "Extracellular Nucleases Of Paeudomonaa BaI 31· I· Characterization Of Single Strand-Specific Deoxyribonuclease" (Extrazelluäre Nucleasen von Pseudomonas BaI 31. I· Charakterisierung von einaträngig-spezlfischer Deaoxyribonucleaae) Nucleic Aolda Res.. 2, S. 1459 - 1492 (1975)). Durch Verändern der Dauer und der Bedingung bei der BxonucIeaae-Behandlung werden eine Reihe von DNA-Fragmenten mit verschieden vielen Nucleotiden von der Kodierungaaequenz für daa Signalpeptid von HuIFN-β , wenn überhaupt, die dem AUG-Start-Oodon von ausgereiftem HuIFN-β vorausgehen, konstruiert. Dieae Fragmente können anschließend eo manipuliert werden, daß Riboaom-Bindestellen in verschiedenen Entfernungen von dem Start-Codon konstruiert werden und die erwünschte sekundäre Struktur nahe dem Codon geschaffen wird, um die Expression von ausgereiftem HuIFN-β zu fördern.

Die mit Exonuclease behandelten Fragmente wurden mit Ε._; coil DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) in Gegenwart von dATP und dGTP stumpf endend gemacht, um alle 5'-vorstehenden Enden auszufüllen. Anschließend wurde ein doppel-stränglger Zhol-Linker, der die Sequenz 5^l-CCTCGAGia-3^l (Collaborative Research) hat, an die stumpf-endenden DNA-Fragmente gebracht. Diese Fragmente wurden dann mit einem doppeisträngigen EcoRI-Lln-

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ker, der die Sequenz 5*-CCGAATTCGG-3' hat (Collaborative Research) aufweist, erweitert* flach der EcoRI-Digestion wurden die Fragmente mit "klebrigen" EcoRI-Enden mit E. coll DNA-Ligaae rezirkulärlaiert. Die Verwendung dieser Ligaae anstelle von T4 DNA-Ligase schließt die Rezirkulärisation von stumpf-endenden Fragmenten aus·

Ea wurde ein Plasmid ausgewählt und als pPLa-HFIF-67-12£ 19 BX-2 bezeichnet. Es hat eine Xhol-Stelle etwa 25 Basenpaare vor dem AUG-Start-Codon von ausgereiftem HuIFN-ß. Der Xhol-Stelle geht auch eine durch die Ligation des EcjoRI-linkera des Hp_al-Fragment es an die unmittelbar dem P^-Promotor in pPLa-HFIF-67-12A19 vorausgehende EcoRI-Stelle erzeugte EoοRI Stelle voraus. Daher wurde auf die ß-Lactamase-Kodierungasequenz verzichtet. Da außerdem zumindest ein Teil der HuIFN-ß> Signalsβqaenz entfernt worden ist, ist nur die Expression von ausgereiftem HuIFN-ß möglich.

E. coil K12ÄHI wurde mit pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 transformiert»

Isolierung und Charakterisierung von durch Bakterien erzeug-

tem HuIFN-ft

A. Darstellung von Bakterienextrakten 1» Induktlonaverfahren

Eine Aliquote von Vorratskulturen (bei -80 ⁰C in 50 % GIycerin-50 % LB-Medium eingefroren), einschließlich von Vorratskulturen der Stämme Κ12ΔΗΙ und M5219, die mit den die IFN- /^-Fragmente nach obiger Beschreibung enthaltenden Plasmiden transformiert worden waren, wurde in frisches LB-Mediui mit dem verlangten Antibiotikum eingeimpft und bis zur Sätti· gung bei 28 ⁰C gezüchtet. Zwei 500-ml-Chargen von LB-Medlum

ohne Antibiotikum warden jeweils mit 1 ml gesättigten Zellen

geimpft und unter kräftigem Schütteln bei 28 ⁰C bis zu βίο

ner Zelldichte von 2 χ 10 /ml vermehrt. Eine Charge wurde auf 42 ⁰C gebracht und weiter geschüttelt. Je nach dem verwendeten Plasmid wurde die Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Umstellung auf 42 ⁰C geerntet. Die auf 28 ⁰C gehaltene Kontrollkultur wurde zur gleichen Zeit wie die Kultur von 42 ⁰C geerntet. Die Zellen wurden durch 10 min Zentrifugieren in dem GSA-Rotor (Sorvall) mit 8000 U/min gesammelt. Die Pellets wurden in 20 ml 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,4), 30 mM NaGl gewaschen und 10 min lang in dem SS34 Rotor (Sorvall) mit 10 000 U/min repelletisiert· Das Pellet wurde schnell in Trockeneis-Methanol eingefroren und bei -80 ⁰C aufbewahrt. Wenn die geernteten Zellen osmotisch geschockt werden sollten, wurde der Gefrierschxitt weggelassen.

Es sind zwei verschiedene Verfahren für die Lysis und die Extraktion der Bakterien angewandt worden·

2. Extraktionsverfahren Lysis, A

Die Zellen wurden in einem endgültigen Volumen von 4 mL des oben beschriebenen Puffers resuspendiert und Lysozym (Sigma) wurde bis 1 mg/ml zugesetzt* Die Inkubation erfolgte 30 min lang bei 0 ⁰C. Die Suspension wurde zwei Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen, indem sie nacheinander in ein Äthanol-COg-Gemisch (-80 ⁰C) und ein Wasserbad von 37 ⁰C getaucht wurde. Die S-100-Fraktion wurde durch einstündigea Ultrazentrifugieren der lysierten Bakterien (4 ml) in einem Beckman SW60 Ti-Rotor mit 60 000 U/min bei 4 ⁰C hergestellt, worauf das Obenstehende weiter verwendet wurde.

-βο-228897 2

Lyaifl B

Iyaia B wurde wie oben beschrieben (Lysis A) durchgeführt, nur viurde die Lösung von 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) - 30 mM NaCl durch 50 mM HEPES (Sigma)- NaOH (pH-Wert 7,0), 30 mM TTaCl, 3 mM fi> -Mercaptoäthanol und 3 % Serum von neugeborenen Kälbern (Gibco) ersetzt·

Oamotiacher Schock

Sofort nach dem Ernten und Waschen wurde das Zeil-Pellet in 20 % Saccharose, 100 mM EDTA, 100 mM Trie-HCl (pH-Wert 7,4) bei einer maximalen Zelldichte von 1 χ 10 /ml resuspendiert· Die Suspension viurde 10 min lang auf Eis gehalten und anschließend 10 min lang mit 10 000 U/min in dem Sorvall-Rotor SS34 zentrifugiert. Die Sacoharoselösung viurde vorsichtig aus dem Röhrchen abgegossen und das Pellet wurde in einem gleichen Volumen Wasser resuapendiert (Zelldichte 1 χ 10 / ml). Die reeuspendierten Zellen blieben 10 min lang auf Eis und wurden anschließend 10 min lang erneut mit 10 000 U/min in dem SS34-Rotor (Sorvall) zentrifugiert. Das Obenstehende wurde auf 3 % in fötalem Kalbsserum, 50 mM in HEPES-Puffer (pH-Wert 7), 30 mM in NaCl und 3 mM In A-Mercaptoäthanol eingestellt. Dieaes Obenstehende wird als "Osmotischer Schock-Obenstehendes" bezeichnet» Es wurde bei 0 C aufbewahrt·

3· Ammoniumsulfat-Präzipitation

1 ml einer (NH^)₂SO,-Lösung, gesättigt bei Raumtemperatur, wurde zu 0,5 ml Kontroilösung oder einem S-100-Extrakt gegeben. Dieaes Gemisch wurde mindestens 30 min lang auf Eis gehalten, worauf das Präzipitat 10 min lang bei Raumtemperatur in einer Eppendorf-Zentrifuge pelletisiert wurde. Das Pellet wurde wieder in PBS (mit Phosphat gepufferte physiologische Kochsalzlösung) gelöst.

- 81 B. Interferon-Titrationen

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1. Direkte Antivirus-Analyse

HuIFN-A wurde in Mikrotiterschalen (Sterilin) mit Hilfe einer, CPE (cytophatischer Effekt) - Inhibitionstechnik in für Chromosom 21 trisomischen Humanfibroblasten analysiert. Die Zellen wurden einen Tag vor Gebrauch gesät, mit Serienverdünnungen (1Og₁₀ β 0,5) der Probe 24 h lang inkubiert und mit Vasicular-Stomatitis-Virus (Indiana Stamm)-10~ Verdünnungen einer Vorratslösung, die 10 ' Mäuse C-929 Plaque bildende Einheiten/ml enthielt, zusammengebracht. Der CPE wurde 24 h nach der VSV-Behandlung notiert, und der Interferon-Endpunkt wurde als die Probenverdünnung definiert, die eine Reduzierung des Virus-CPE von 50 % hervorrief. Alle Analysen enthielten einen internen Standard von HuIFN-ß , der seinerseits gegen den NIH-Fibroblast-Bezugsstandard G023-902-527 geeicht worden war. Die für Chromosom 21 trisomische Zellreihe (anschließend als Tp₁ bezeichnet) stammte von einer Hautbiopsie eines weiblichen Patienten mit Langdon-Downschen Syndrom. Ihr Karyotyp war ermittelt worden und zeigte Diploidie für alle Chromosomen außer für Chromosom 21 (trisomisch). Die Sensibilität dieser Zellreihe gegenüber Interferon scheint mit der Sensibilität von gegenüber Chromosom 21 trisomischen Zellreihen vergleichbar, wie von E. De Clercq, u. a., "Non-antiviral Activities Of Interferon Are Not Controlled By Chromosome 21" (Nicht-Antivirus-Aktivitäten von Interferon werden nicht von Chromosom 21 gesteuert), Nature, 256, S. 132 - 134 (1975) sowie von E. De Clercq, u. a. "Chromosome 21 Does Not Code For An Interferon Receptor" (Chromosom 21 kodiert nicht für einen Interferon-Rezeptor), Nature, 264, S. 249 - 251 (1976) beschrieben wird.

Für andere Analysen wurde die Zellreihe E₁SM verwendet (A. Billiau, u. a., _v"Human Fibroblast Interferon For Clinical

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Trials: Production, Partial Purification And Characterization" (Humanfibroblaat-Interferon für klinisohe Versuche: Herstellung, Partiaireinigung und Charakterisierung), Anti-mlcrobial Agents And Chemotherapy, 16, S, 49 - 55 (1979)). Diese Zellreihe ist ein für Chromosom 21 disomisches Diploid-Pibroblast und stammt von einem 2 Monate alten Humanfötus. Im Vergleich mit der Zellreihe Tp₁ ist E-SM um einen Paktor von 10 weniger sensitiv gegenüber HuIPN-

2» 2 ,5-A Synthetase-Analyse

Eine andere Möglichkeit für den Nachweis der Anwesenheit von Interferon ist die Anwendung einer 2,5-A Synthetase-Analyse. Es konnte gezeigt werden, daß Interferon dieses Enzym induziert, das ATP in Trimere (und in geringerem Umfang in Dimere, Tetramere und Multimere) von 2,5-A umwandelt (A. Kimchi, .u^eu., "Kinetics Of The Induction Of Three Translation-Regulatory Enzymes By Interferon" (Kinetik der Induktion von drei Translationa-Regelenzymen durch Interferon), Proc. Natl. Ac ad. Sc₁J. USA, 76, 3208 - 3212 (1979).

Konfluente 25-cm -Kolben, die Kulturen von E₁SM-ZeIlSn enthielten (A. Billlau, u.a., supra) wurden 20 h lang mit einer 1:6-Verdünnung von Bakterienextrakten oder Kontroll-Interferon in MEM - 10 % fötalem Kalbsserum behandelt» Die Kulturen wurden mit Trypsin (0,25 %), EDTA (0,17$) abgelöst, und ausgiebig mit UO mM NaCl in 35 mM Trl-Puffer (pH-Wert 7,5) gewaschen· Alle anschließenden Arbeitsgänge wurden bei 4 ⁰C ausgeführt. Die Zellen wurden in 1,5 bis 2,0 VoI 20 mM HEPES-Puffer (pH-Wert 7,4)ι der 10 mM KCl, 1,5 mM Magnesiumacetat und 0,5 mM Dithiothreitol (»Lysis-Puffer I") enthielt, in einem Dounce-Glashomogenisatör homogenisiert· Das Homogenat wurde 20 min lang mit 10 000 ι £ zentrifugiert , und das Obenstohende (S10) wurde, wenn es nicht sofort gebraucht wurde, in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

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Konfluente 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten (10⁵ Zellen in 0,2 ml je 0,28 om² Vertiefung) wurden mit Interferon oder den entsprechenden Bakterienextrakten wie oben behmdelt· Nach 20-stündiger Behandlung wurden die Platten auf Eis abgekühlt und dreimal mit 140 mM NaCl in 35 mM Tri-Puffer (ph-Wert 7,5) gewaschen. Die Kulturen wurden anschließend lysiert, indem in jede Vertiefung 5/ul einer Lösung gegeben wurden, die 0,5 % Nonidet P40 und 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) in Lysispuffer I enthielt. Nach kräftigem 20 minütlgem Schütteln auf Eis wurden die Zellysate gesammelt und 20 min lang mit 10 000 χ g wie oben zentrifugiert.

3,5/ul des wie oben beschriebenen hergestellten Lysats (Lysis A oder Lysis B) wurden 2 h lang bei 31 ⁰C in 6/ul eines Inkubationsgemischs, das 100 mM Kaliumacetat, 25 mM Magnesiumacetat, 10 mM HBPES/KOH (pH-Wert 7,4), 5 mM ATP, 4 mM Pructose-1,6-bisphosphat, 1 mM Dithiothreitol und 20 /ug/ml PoIy(I)-PoIy(G) und 2,uCi lyophilisiertes (^-³²P)-ATP (400 Cl/mMol, vom Radiochemieal Centre, Amersham, GB) enthielt, inkubiert. Nach Abbruch der Reaktion durch 3 min Erwärmen auf 95 ⁰C und 2 min Klärung mit 9 000 χ £ wurden die Proben mit 150 Einheiten/ml alkalischer Phosphatase von Kalbsdarm (Boehringer, Mannheim, Kat.-Nr. 405612) 1 h lang bei 37 ⁰G behandelt, wieder geklärt und auf Dünnschichtplatten aus Polyäthylenimincellulose (Polygram, eel 3OO PEI 20 χ 30 om von Macherey-Nagel Co., Düren, Deutschland) aufgetüpfelt. Die Platten wurden zweimal in 2 1 destilliertem Wasser gewaschen und unter Vakuum vor der Chromatographie in 1 M Essigsäure 2 bis 3 h lang getrocknet. Nach dem Trocknen wurden sie 1 bis 24 h lang der Autoradiographie unterzogen.

C. Nachweis von HuIFN- β -Aktivität in Bakterienextrakten 1· Kontrollexperimente

Bei der Durchführung der oben beschriebenen Analysen waren

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zwei Hauptprobleme zu verzeichnen· Beide sind für die Interpretation der Analyaedaten wichtig. Bakterienextrakte (einschließlich Kontrollextrakte), die aus der Lysis nach den oben beschriebenen Verfahren stammten, schienen einen Wicht-Interferonverwand ten Paktor zu enthalten, der bei der Analyse Antivirus-Aktivität zeigte» Es ist nicht klar, ob der Paktor selbst ein Antivirusmittel war oder ob der Paktor eine Antivirus-Substanz, z. B. Interferon, unter den Analysebedingungen induzierte. Das Vorhandensein des Paktors wurde wiederholt in S100-Extrakten nachgewiesen. Die Aktivität des Paktors war, vielleicht infolge der Zelldichte, oftmals stärker in Kontrollextrakten von E, coil HB1O1 als in ähnlichen Kontrollextrakten der Κ1-2ΔΗΙ- oder M5219-Wirtsbakterien, In denen die Aktivität des Paktors immer unter etwa 0,7 log-«/ml lag. Aus irgendeinem Grund wurde die Antivirus-Aktivität des Faktors durch Präzipitation mit (NEL)₂SO. unter Bedingungen, die ebenfalls Interferon bei Kontrollexperimenten ausfällten, reduziert oder manchmal sogar vollkommen eliminiert·

Wegen der auf diesen Verunreinigungafaktor zurückzuführenden Antivirus-Aktivität ist es schwierig, Schlußfolgerungen über die Anwesenheit von Spurenmengen Interferon in Bakterienextrakten zu ziehen· Es war aber möglich, zwischen Antivirus-Aktivität des Paktors und der Aktivität von authentischem Interferon durch die Anwendung der Diploid-Pibroblaste E^SM zu unterscheiden· Diese Zellen sind gegenüber HuIPN-/S weniger empfindlich als gewöhnliche für Chromosom 21 trlsomiache Zellen. Aber die Zellen reagieren auf den Paktor viel empfindlicher als auf bona fide Interferon, Zum Beispiel werden unter Verwendung von pMS2-7 (R. Devos, u.a., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Pull-size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 HNA" (Konstruktion und Charakterisierung eines Plasmida, das eine DNA-Kopie in fast voller Größe von Bakteriophage MS2 BNA enthält), J. Mol. Blol., 128, S, 595 - 619 (1979)) In E, yoli HB101 (H· Boyer und D. Rou-

land-Dusaoix, "A Complementation Analysis Of Restriction And Modification Of DNA in Escherichla coll" (Eine Ergänzungsanalyse von Restriktion und Modifikation von DNA in Escherichla coll), J. Mol. Blol, 41, S. 459 - 472 (1969)) oder K12£HI-G-pPLa2311 als Kontroll-Lysate die diese Wirkung zeigenden Werte in der folgenden Tabelle zeigt, wobei die Antivirus-Aktivität als log^Q-Einheiten/ml gemessen wurde«

IgI VM

HP101-pMS2-7 (Lysis A) 0,7 HB101-PMS2-7 (Lysis B, aber kein

β-Mercaptoäthanol und

kein Kalbsserum) <0,2 1,2

HB101-PMS2-7 (Lysis B) nicht durchgeführt 0,7

HB101-PMS2-7 (Lysis B) 0,2 1,0

HB101-PMS2-7 (Lysis B) 0,7 2,5

K124 HI-G-p-PLa2311 (Lysis B) 0,2 4,0

K12 Δ HI-G-pPLa2311 (42 ⁰Cj osmo-

tischer Schock) 0,5 ^>1,7

Außerdem wird die Anwesenheit von authentischem HuIFN-ß durch ein anderes Verhältnis der Werte von Tg^E^SM und einen hohen Wert von T₂₁ gegenüber demjenigen, der auf die Anwesenheit des Paktors zurückzuführen ist, reflektiert. Das geht aus den folgenden Daten hervor:

T₂₁ E₁SM

Durch oamotischen K12AHI-G-pPLa2311 (42 ⁰G) 0,5

Schook K12AHI-G-pPLa2311 (42 ⁰C) 1,5

Obenstehendes + HuIFN-ß(authentisch)

Lysis B HB101-PMS2-7 0,2 2,5

nach HB101-pMS2-7 + HuIFN-(3> 2,7 2,5

(NH₄) SO₄ (authentisch)

Präzipitation (Vor der Lysis zugesetzt)

Ein Vergleich der Aktivitäten T₂^E₁SM und eine Messung der absoluten Aktivität bei T₂--Zellen erlaubt daher die Anwendung von Antivirus-Analysen,wie sie oben beschrieben wurden, um die Anwesenheit von HuIFN-ß in Bakterienextrakten eindeutig nachweisen zu können· Außerdem sollte beachtet werden» daß bei Extrakten τοη Kulturen von E, coil (entweder K12/ÜHI oder M5219), die mit einigen erfindungsgemäßen Plasmiden transformiert worden waren, z· B. mit G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-124 19, G-pPLc-HFIF-67,8, G-pPLa-HFIF-67-12a 279T, G-pPLa-HFIF-67-12A218MI, G-pPLa-HFIF-67-12ΛMI oder G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2, ein solcher Konflikt durch den unbekannten Faktor bei den Antivirus-Analysen weniger ausgeprägt war· Bei diesen Analysen ergaben die nicht sehr stark konzentrierten Extrakte (zum Beispiel wurden Zellen von 150-

ml-Kulturen bei 6 χ 10 Zellen/ml lyslert und in 4 ml extrahiert) einen geringen oder nicht nachweisbaren Grad an auf den unbekannten Faktor zurückzuführender Antivirus-Aktivität.

Das Vorhandensein dieses Verunrelnigungsfaktors konnte auch in der Analyse der 2,5-A-Synthetase-Aktivität nachgewiesen werden. Hier kann der Faktor jedoch durch Ausfällung mit (NH.)₂S0. vollkommen eliminiert werden. Daher kann das wirkliche Vorhandensein von HuIFN- β in einem Bakterienextrakt, im Unterschied zum Vorhandensein des Verunreinigungafaktora, eindeutig in dieser Analyse nachgewiesen werden*,

Dagegen haben Extrakte von E. coil HB101/G-pBR322(Pst)/HFIF-6, das eine unvollständige kolineare Kodierungssequenz hat (nur die allerletzten Basenpaare fehlen) und daher nicht fähig ist, ein ausgereiftes Polypeptid zu verwirklichen, wiederholt eine positive 2,5-A Synthetase-Aktivität ergeben, aber bisher noch keine erkennbare Antivirus-Aktivität. Das zeigt, daß die 2,5-A, Analyse nicht als das einzige Kriterium für das Vorhandensein eines vollständig von Bakterien stammenden Interferons angesehen werden kann. Außerdem zeigt sie, daß

weniger ala das vollständig ausgereifte Interferon eine nützliche Aktivität haben kann.

2,5-A Synthetase-Aktivität wird durch ^²P-Einbau in den 2,5-A Trimer gemessen, wie durch Autoradiographie gezeigt wird· Die Ergebnisse (dreimalige Wiederholung) sind in der folgenden Tabelle angeführt, wobei steigende positive Werte einen stärkeren Einbau von ^J H wiedergeben«

Extrakt a/pHFIF-6·*-+++\ nach (NEL)₂SO. Präzipitation-» ++ Extrakt b/pMS2-7 -♦·+++; nach (NH J₂SO. Präzipltation-fc Extrakt b/pMS2-7 -*+++; nach (NH^)₂SO₄ Präzipitation-·-++ plus HuIPN- β

Ein zweites wichtiges Problem ist bei diesen Analysen die geringe Rückgewinnung von durch Humanfibroblaste während und nach verschiedenen Versuchssehrltten ausgeschiedenem HuIFN-fl· Ein Vergleich der Rückgewinnungen von Leukozyten-Interferon und Fibroblast-Interferon, die einem S*-100-Extrakt zugesetzt worden waren, ergibt, daß HuIFN-ß nur mit einem Wirkungsgrad von 10 % zurückgewonnen wird, im Vergleich zu der 100 $igen Rückgewinnung von HuIFN-tk (Die Antivirus-Werte sind als log-jQ-Einheiten/ml angegeben, analysiert auf Tg^

IFN-ei verdünnt in S-100-Extrakt von HB101-pMS2-7 (Lysis A) 2,5 -Λverdünnt in E-MEM plus 3 % Kalbsserum 2,7

IFN-/b verdünnt in S-100-Extrakt von HB101-pMS2-7 (Lysis A) 0,7 IFN-ß verdünnt in E-MEM plus 3 % Kalbsserum 1,7

Andere Experimente, bei denen IFN-(b dem Zellpellet vor der Lysis und Extraktion zugesetzt worden war (selbst bei bis

3 % als Stabilisator zugesetztem Kalbsserum) zeigten, daß nur 10 bis 30 % IPN-fb zurückgewonnen wurde*

HB101-PMS2-7 plus IPN- Ib

IPN- P>

(keine Bakterien)

(Lysis B, aber kein

ß-Mercaptoäthanol oder Kalbsserum)

(Gleiche Behandlung wie in Lysis B)

	CS	1Og10	Einheiten/ml	E1SM
EPI	8	T21		' 1,7
pH	7	0,7	(10 %)	• 1,7
pH	6	1,0	(20 %)	I 1,7
pH	6	0,7	(10 %]	> 1,5
pH	1,7	(50 %:

Es wurden weitere Versuche durchgeführt, um die Stabilität und Rückgewinnung von IPN-β-Aktivität zu testen. Die Präzipitation mit (NH^)pSO. nach obiger Beschreibung, entweder mit Bakterienextrakten oder ohne, führte häufig zu einer Verringerung des Titers bei der Antivirus-Analyse:

Einheiten/ml

Präzipitation mit ₄₂₄

IPN-Λ IPN- β HB101-PMS2-7 + IPN-/3 (Lysis B) K12AHI-G-pPLa2311 (28 ⁰C) + IPN- β

(Lysis B)

K12UHI-G-pPLa2311 (28 °) + I PN-^

(Lysis B)

vorher

1,0

2,7 1,5

1.7 2,2

nachher

0,5 2,5

1,2

1,5 3,0

Die Dialyse von IPN-ß (über Nacht bei 4 ⁰C gegen PBS), entweder mit oder ohne Bakterienextrakte, führte gewöhnlich auch zu einer verringerten Rückgewinnung der IPN- β-Aktivität.

log..Q Einheiten/ml

Dialyse vorher nachher

IFN- β in PBS 1,0 0,5

IFN- β in PBS 2,7 2,5

K12 Δ HI-G-pPLa8 (28 ⁰C) + IFN- β (lysis Β)1,2 <0,2

Κ12dHI-G-pPLa8 + IFN-β (Lysis B) 3,0 1,7

Κ12ΔHI-G-pPLa8 + IFN- β (Lysis B) 2,5 1,0

Κ12 AHI-G-pPLa8 + IFN- /1 (Lysis B) 1,5 0,5

Da IFN- f) ein Typ I Interferon ist, müßte seine Aktivität säurebeständig sein. Das wurde durch Dialysieren von IFN- f*>~ Proben über Nacht bei 4 ⁰C in 5 mM Glycin-HCl (pH-Wert 2,2) mit und ohne Bakterienextrakte getestet.- Diese Behandlung führte zur Bildung eines Präzipitats, das 2 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge mit 12 000 χ £ pelletislert wurde. Das Obenstehende wurde danach auf Antivirus-Aktivität hin geprüft. Obgleich nach dieser Behandlung etwas die Antivirus-Aktivität zurückgeblieben war, war ein beträchtlicher Rückgang in der Menge des zurückgewonnenen Interferons zu verzeichnen·

log₁₀ Einheiten m/l

Dialyse vorher nachher

HB101-pMS2-7 (Lysis A) + IFN-ß 0,7 0,5 K12AHI-G-pPLa2311 (28 ⁰C) osmotischer

Schock + IFN- β 1,2 1,2

M5219-G-pPLa8 (42 ⁰C) (Lysis B) + IFN-/b 1,2 0,7

M52i9-G-pPLa8 (28 ⁰C) (Lysis B) + IFN-ß 3,0 2,0

Die bei diesen verschiedenen Behandlungen im Vergleich zu den oben beschriebenen Kontrollextrakten festgestellten Verringerungen der HuIFN-/5-Aktlvität müssen mit Vorsicht interpretiert werden. Die niedrigeren Antivirus-Titer bedeuten nicht unbedingt, daß Interferon abgebaut worden ist. Die niedrige-

ren Titer können auf ein nicht^apezifischea Pestkleben der HuIFN-ß an den Dialysemembranen oder auf Komponenten in den Bakterienextrakten, z· B. Membrankomponenten, zurückzuführen sein. Zum Beispiel ist erniesen, daß IFN-/3 ein hydrophobes Protein ist (dessen Hydrophobizität auch durch seine Aminosäuresequenz bedingt ist), das nicht-spezifisch an den Röhrchen* andungen oder anderen Oberflächen haften kann· Außerdem kann Bakterien-IFN-ß ohne Glycoaylierung noch hydrophober sein. Daher können Schlußfolgerungen über die Rückgewinnung des von Humanzellen ausgeschiedenen glycosylierten IFN-ß nicht ohne weiteres auf von Bakterien stammendes IFN-/J extrapoliert wordene

2· Demonstration der IFN-/3-Aktlvltät a· Ant iνIrua-Akt ivltät

Bakterienextrakte von E. coil M5219 oder Κ12ΔΗΙ, die die Plasmide G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF~67-12A. 19, G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67-12A279T, G-pPLa-HFIF-67-124 218 MI, G-pPLa-HPIP-67-12AMI' oder G-pPLa-HFIF-67-12Δ19 BX-2 enthielten, wurden auf IFN-/£-Antivirus-Aktivität hin analysiert· Die für die Induktion und Herstellung der S-100-Extrakte und die Obenstehenden bei osmotlschem Schock angewandten Verfahren entsprachen im wesentlichen den oben beschriebenen. 150 ml Bakterienkultur (3 bis 6 χ 10⁸ Zellen/ml) wurden für jedes Experiment verwendet· Alle biologischen Titer sind in log^Q-Einheiten/ml angegeben.

G-pPLa-HFIF-67-12 wurde zum Transformieren von E« coil 115219 und E, coil K12AHI verwendet, und die S-100-Extrakte wurden durch Lysis B hergestellt· Alle Proben wurden mit (NH^)₂SO. vor der Prüfung der Antivirus-Aktivität ausgefällt·

228897 2

E₁SM

Κ12Δ HI-G-pPLa-HFIF-67-12 (28 ⁰C) <0,2 <1,0 K12 4HI-G-pPLa-HFIF-67-12

(42 ⁰C, 90 min) 0,2/0,5 <1,0/<1,0

M5219-G-pPLa-HFlF-67-12 (28 ⁰C) <0,2 <1,0 Μ5219-G-pPLa-HFIF-67-12

(42 ⁰C, 90 min) 0,7/0,7 <1,0/<1,2

Die zweite Zahl in der obigen Tabelle ist der Titer, der bei der Wiederholungsanalyse der gleichen Probe bestimmt viurde. Ein Kontrollexperinient, bei dem authentisches IFN-/J zu E. coli HB101-pMS2-7 vor der Lysis der Zellen gegeben wurde, ergab eine IFN-fi -Rückgewinnung von 30 % bei der Analyse. Es ist daher klar, daß nach der Induktion IFN-β-Antivirus-Aktivität in dem Bakterienlysat nachgewiesen werden kann· Die Titer zeigen deutlich, obwohl sie unter dem Nachweisniveau von E.jSM-Zellen liegen, daß die IFN- β -Aktivität nicht auf eine Aktivität von Verunreinigungsbakterien zurückzuführen ist. Eine solche Aktivität von Verunreinigungsbakterien würde Werte von mindestens 2,0 bei E₁SM ergeben, die den Werten von 0,5 oder 0,7 bei T₂₁~Zellen entsprechen müßten (siehe Kontrollexperimente von oben)·

G-pPLa-HPIF-67-12A 19

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A 19 wurde zum Transformieren von E. coli M5219 verwendet, und S-100-Extrakte wurden mit Hilfe von Lysis B hergestellt· A-IIe Proben wurden mit (NHJgSO. wie oben beschrieben ausgefällt, und in bezug auf Antivirus-Aktivität analysiert. Wieder ist das Vorhandensein von HuIFN-ß-Antivirua-Aktivität in den Extrakten deutlich. Der Wert in Klammern gibt den Nachweisgrad infolge einer gewissen Toxizität der betreffenden Proben bei den Humanzellen in Gewebekulturen an

. 228897 2

i) M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (28 ⁰C)

-HFIF-67-12ä19 (42 ⁰C, Zelldichte = 3 ζ 10⁸/ml)

ii) M5219-G-PPLa-KPIP-ST-12Δ19 (42 ⁰C, 90 min, endgültige

	auf	T	21	0,5)	auf	CVJ	E1S	M
i)	<0	,5		2,	2	( <	2,0)
ii)	CVJ	,2	(<	2,		2,0)

Ein Kontrollexperiment, bei dem authentiachea IFN-ß zu HB1O1-pMS2-7 vor der Lyaia der Zellen gegeben wurde, ergab eine Rückgewinnung von 30 %, Hier zeigen die hohen Werte bei T₂₁-Zellen und daa Verhältnia der Aktivität bei T₂₁ gegenüber der von B₁SM, daß bei den temperatur-induzierten Proben eine erhebliche Aktivität von Verunreinigungabakterien (wie oben erläutert) zu verzeichnen war·

G-pPLc-HFIF-67-8

Plaamid G-pPLc-HFIF-67-8 wurde zum Tranaformieren von E« coil M5219 verwendet, und S-100-Extrakte wurden mit Hilfe von Lyaia B hergeatellt. Alle Proben wurden mit (NH.)₂S0, ausgefällt und in bezug auf Antivirua-Aktivität analyaiert·

i) M5219-G-pPLc-HPIP-67-8 (28 ⁰C)

ii) M5219-G-pPLc-HPIP-67-8 (42 ⁰C, 180 min, endgültige

Zelldichte « 6 χ 10⁸/ml)

auf T₂₁ auf E₁SM

i) < 0,5 2,2 (< 2,0)

ii) 2,2 (< 0,5) 2,2 (<2,0)

Der Wert in Klammern gibt den Nachweiagrad infolge von Toxizitat an. Ein Kontrollexperiment, bei dem authentiachea IFN-β

228897 2

vor der lysis der Zellen zu HB1O1-pMS2-7 gegeben wurde, zeigte eine Rückge κι Innung von 30 %. Wiederum wurde deutlich, daß der Bakterienextrakt HuII¹H-β-Antivirus-Aktivität zeigte.

Bei einem anderen Experiment wurde das durch osmotischen Schock Obenstehende dieser Zellen in bezug auf IFN-ß-Antlvirua-Aktivität analysiert:

i) Kontrolle: M5219-G-pPLa-HPIP-67-12A 19 (28 ⁰C) ii) M5219-G-pPLo-HFIF-67-8 (28 ⁰C)

iii) M5219-G-PPLC-HFIF-67-8 (42 ⁰C, 180 min, Zelldichte =

6 χ 10⁸/ml)

Die Analysen wurden mit Tp«-Zellen vor und nach der Ausfällung mit (NH.)pSO- vorgenommen. Der Wert in Klammern gibt die Nachweisgrenze an_o

Vor der Präzipitation nach der Präzipitation

i) <0,2 <0,2

ii) <0,2 < 0,2

iii) 1,5 (<0,2) 0,7 (<0,2)

Die Rückgewinnung von IFIT-C> betrug bei Kontrollexperimenten etwa 10 %t Die Kontroll-Lysate zeigten keine nachweisbare Aktivität bei E-SM. Die bei den durch osmotischen Schock gewonnenen Obenstehenden ermittelten Werte machen deutlich, daß der temperatur-induzierte M5219-G-PPLC-HFIF-67-8-EX-trakt eine Antivirus-Aktiv!tat besitzt, die in nicht-induzierten Proben nicht zu finden ist. Probe (iii) wurde nach der Ausfällung mit (NH₄J₂SO₄ bei einem Titer von 0,7 logi₀-Einheiten Je ml auf einen pH-Wert von 2,2 wie oben beschrieben dialysiert und zeigte keine nennenswerte Verringerung der Aktivität. Diese Säure-Stabilität ist eine besondere Eigenschaft von Typ 1 Interferone^ z. B. IFN-Λ♦

228897 2

G-pPLa-HFIF-67-i24 279T

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12Δ279T wurde zum Transformieren von E, coll· 115219 verwendet, und S-100-Extrakte wurden mit Hilfe von Lyaia B hergestellt. Die Proben wurden mit (NH₄)_gS0^ vor der Analyse durch CPE auf T₂₁-Zellen ausgefällt. Die Extrakte der bei 42 ⁰C induzierten Zellen zeigten einen Antivirus-Titer von 1,5 bis 1,7 1Og_1Q Einheiten/ml Extrakt.

G-pPLa-HFIF-67-12A218 M

Plaamid G-pPLa~HFIF-67-12A218liI wurde zum Transformieren von h, coli M5219 verwendet, und es wurden S-100-Extrakte mit Hife von Lyaia B hergestellt· Die Proben wurden mit (NH.JpSO. vor der Analyse durch CPE auf T₂₁-Zellen ausgefällt. Die Extrakte der bei 42 ⁰C induzierten Zellen ergaben einen Antivirus-Titer von 1,5 log-jo Einheiten/ml Extrakt.

G-pPLa-HFIF-67-12 A MI

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12AMI wurde zum Transformieren von E. coli M5219 verwendet, und die S-100-Extrakte wurden mit Hilfe von Lysis B hergestellt. Die Proben wurden mit (NH,)₂ SO. vor der Analyse durch CPE auf T₂₁-Zellen ausgefällt. Die Extrakte der bei 42 ⁰C induzierten Zellen ergaben einen Antivirus-Titer von 2,0 log₁₀ Einheiten/ml Extrakt.

G-pPLa-HFIF-67-12*19 BX-2

Plaamid G-pPLa-HFIF-67-12Δ19 BX2 wurde zum Transformieren von E. coli Κ12ΔΗΙ verwendet, und S-100-Extrakte wurden mit Hilfe von Lysia B hergestellt. Die Proben wurden mit (NH.)₂ SO. vor der Analyse durch CPE auf T₂--Zellen und FS-4-Zellen ausgefällt· Die Extrakte der bei 42 C induzierten Zellen ergaben einen Antivirus-Titer von 1,7 bis 2,0 log_1Q Einheiten/ml Extrakt«,

228897 2

b. Antikörper-Neutralisation von HuIFN-fi-Antivirus-Aktivität Ein weiterer Bevieia für die Bakterienexpression von IFN-fb wird durch Antikörper-Neutralisationa-Experimente erbracht· Das Anti-Interferon-Antiserum wurde in Ziegen erzeugt, mit 10' Einheiten authentischem IPN-ß (auageschieden von Humanfibroblastzellen) immunisiert und auf kontrollierten Porenglaaperlen gereinigt (A. Billiau, u.a., a upra). Nachdem die Bakterienextrakte wie oben in bezug auf Antivirus-Aktivität analysiert worden waren, wurden Serienverdünnungen des Antiseruma zu ähnlichen Proben gegeben, die Gemische 1 h lang bei 37 ⁰C inkubiert, zu Humandiploidfibroblaaten T₂₁ gegeben und wie oben beschrieben in bezug auf Antivirus-Aktivität analysiert. Der Neutralisationagrad durch IFN-/i-Antiserum reicht von +++ (vollständige Neutralisation.) bis - (keine Neutralisation). Der Wert in Klammern gibt die annähernde Antiaerumverdünnung für 50 #ige Neutralisation an.

1) M5219-G-pPLc-HFIF-67~8 (42 ⁰C, 180 min;, das ergab 2,2 log_1o Antiviruaeinheiten/ml auf T₂--Zellen

2) M5219-G-pPLa-8 (42 ⁰C, 180 min), dem IFN-β (von Humanfibroblaaten) vor der Lysis zugesetzt wurde (die 1,7 log₁₀ Antivirus-Einheiten auf T₂₁-Zellen ergab).

Verdünnung von Antiserum (1) (2) 10-3 ₊₊₊

το"⁵ + do"⁴·⁵)

ίο"⁶ 1 + do"⁶)

Ähnliche Ergebnisse wurden mit Extrakten von 115219-PPLa-HFIF-67-12Δ19 (42 ⁰C) erzielt. Die Unterschiede im Neutralisationatiter zwischen dem erfindüngagemäßen bakteriellen IFN-ß und authentischem IFN-/S könnten auf Differenzen in der Antigenizität oder in der apezifischen IFN-Aktivität dieser

228897 2

Bakterienproteine im Verhältnis zu authentischem IPN-zurückzuführen aein und auf fehlender Glycosylierung in den Bakterienproteinen beruhen. ·

c. Stabilität von HuIFN-/S »Antivirus-Aktivität (1) Wärmebehandlung:

IFN-/3 hat, im Gegensatz zu IFN-e<» , die sehr ungewöhnliche Eigenschaft, daß seine Antivirus-Aktivität nach dem Kochen in 1 % SDS, 1 % (b -Mercaptoäthanol, 5 M Harnstoff zurückgewonnen wird (Stewart, W.E. II u,a.« "Distinct Molecular Species Qi Human Interferon, Requirements For Stabilisation And Reactivation Of Human leucocyte And Fibroblast Interferon" (Bestimmte Molekülspezies von Human-Interferon, Bedingungen für die Stabilisierung und Reaktivierung von Humanleukozyten· und -fibroblaat-Interferon), J. Gen. Virol., 26, 327 - 331 (1975)), wenn auch eine 100 JSige Rückgewinnung im allgemeinen nicht erzielt wird. Für diese Analyse wurden die Bakterienzellen einer 150-ml-Kultur in dem Puffer für Lysis B resuspendiert, und es wurde ein gleiches Volumen von 2 % SDS, 2 % ß-Mercaptoäthanol und 10 M Harnstoff zugesetzt, das Gemisch 2 min lang gekocht, und es wurden S-100-Fraktionen hergestellt.

i) Kontrolle: M5219-G-pPLa-HFIF-67-i2Δ19 (28 ⁰C) ii) Kontrolle: 3 Io6₁₀ Einheiten von HuIFN-/1 verdünnt in

Lysis B Puffer

iii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42 ⁰G, 180 min, Zelldichte =

6 χ 10⁸/ml).

Die Analysen wurden auf T_g1-Zellen durchgeführt. Der Wert in Klammern gibt die Nachweisgrenze infolge innerlicher Toxizität enο

-«- 228897 2

Vor dem Sieden Nach dem Sieden

i) <1,5 <1,5

ii) 2,2 (< 1,5.) , .2,0 (<O,5) iii) 3,0 (< 2,0) *2,2 (< 1,5)

Das Kontroll experiment ergab eine Rückgevi Innung von etwa 10 % der IPN-β-Aktivität. Es konnte kein nachweisbarer Wert in E-SM bei parallelen Kontrollysaten ermittelt werden. Diese Angaben machen deutlich, daß, obwohl nur etwa 10 % des zugesetzten IFN-/3 bei dem Kontrollexperiment zurückgewonnen wurden, die IFN-/3 -Antivirus-Aktivität in dem Extrakt der temperatur-induzierten M5219-G-PPLC-HPIP-67-8-KU1-tur sogar nach dieser harten Behandlung vorhanden war. In Wirklichkeit wurde eine höhere Antivirus-Aktivität nach dieser Behandlung im Vergleich zum Lysis-B-Verfahren gefunden, was auf das mögliche Anhaften von IFN-β an den Zellkomponenten bei dem letzteren Verfahren hindeuten könnte.

(2) Dialyse

Die HuIFN-ß-Antivirus-Aktivität ist gleichfalls nicht-dialysierbar. Zum Beispiel war nach Dialyse gegen PBS über einen.Zeitraum von 16 h bei neutralem pH-Wert und 4 ⁰C die Antivirus-Aktivität (log₁₀ Einheiten/ml) der Bakterienextrakte noch vorhanden, wenn auch mit einem geringeren Titer:

i) M5219~pFLc-HFIF-67-8 (42 ⁰C) ii) M5219-pPLa-HFIF-67-12A19 (42 ⁰G) iii) IFN-/?) in M5219-pPLa-8 (42 ⁰C)

22 88 97 2

	Vor der Dialyse	Nach der Dialyse
i)	2,3	2,3
i)	3	. . 2,3
i)	1,5	1,3
ii)	2,3	1,3
ii)	2,3	2
ii)	2,3	1

Die festgestellte Abnahme der Aktivität nach der Dialyse könnte auf das nicht-spezifische Pesthaften von IFN-/3 an den Dialysemembranen usvn zurückzuführen sein·

(3) Präzipitation mit

Die Antivirus-Aktivität (log_1Q Einheiten/ml) der erfindungagemäßen Bakterienextrakte war nach der Präzipitation mit 67 %igem gesättigtem Ammoniumsulfat (2 VoI (NH₄J₂SO₄ Lösung auf 1 VoI Extrakt), einer Konzentration, die bekanntlich HuIPN-ß ausfällt, erhalten geblieben. Nach 30 min auf Eis wurde das Pellet 10 min lang mit 12 000 χ g zentrifugiert und zur Analyse nieder in PBS gelöst:

i) M5219-pPLc-HPIF-67-8

ii) M5219-pPLa-HFIF-67-12Ä19

iii) im-f> in M5219-pPLa-8

Vor der Präzipitation i) 2 i) 2 ii) 2 iii) 1,3 iil) 1,5

(42 ⁰C) (42 ⁰C) (42 ⁰C)

Nach der Präzipitation 2

2,3 2

1,3 1,3

228897 2

(4) pH-2-Behandlung

Die Antiviraa-Aktivität (1Og_1Q Einheiten/ml) der erfindungsgemäßen Bakterienextrakte war auch gegen Säure beständig. Die Extrakte wurden entweder 15 h lang gegen 50 ml Glycin-HCl (pH-Wert 2,2) dialysiert, worauf die Dialyse gegen PBS über einen Zeitraum von 3 h folgte, oder mit HGl angesäuert, worauf die Neutralisation mit NaOH folgte. Nach Entfernung des Präzipitats wurde die Analyse vorgenommen:

i) M5219~pPLc-HFIF-67-8 ii) M52i9-pPLa-HFIF-67-12&19 iii) IFN-ß in M5219-pPLa-8

	vor Säure
i)	2
1)	0,7
ü)	2
iii)	3

(42	0O	Säure
(42	0O	,3
(42	0C)	,7
	Nach
1
0
1
2

d· 2.5-A Synthetaae-Aktlvltät

Die osmotlachen Schockprodukte von M52i9-G-pPLc-HFIF-67-8 (oben beschrieben) wurden in bezug auf die Anwesenheit von 2,5-A Synthetase wie oben beschrieben mit Mikrotiterplatten analysiert, nur wurden Heia-Zellen anstelle von E-SM-Zellen verwendet. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

1) M5219-G-pPLc-HPIP-67-8 (28 ⁰C) (siehe oben) ii) M5219-G-pPLc~HFIF-67-8 (42 ⁰C) (siehe oben)

Die die 2,5-A Synthetase-Aktivität wiedergebenden Werte zeigen tat.

gen in die Trimer-Form von 2,5-A eingebaute ^ P-Radioakti-

-ic«. 228897 2

(vorgenommene Zählungen)

1) unbehandelte Zellen

2) Bakterienextrakt (i)j Verdünnung 1/6

3) Bakterienextrakt (ii): Verdünnung 1:6

4) Bakterienextrakt (i) + IM-/J bis 1,5 log-in Einheiten/ml

5) aiehe 3, aber mit Anti-IFN-/1-Antiserum inkubiert

6) siehe 4, aber mit IPN-ß-Antiserum inkubiert

7) Kontroll-IFN-/3

0,5 1°βιο Einheiten/ml

8) Kontroll-IFN-ß

1 log-j Q Einheiten/ml

9) Kontroll-IFN-ß

1,5 loß-jo ^^niie^^eia-/^m^·

10) Kontroll-IFN-ß

2 log^Q Einheiten/ml

3342 cpm 1972 cpm 6960 cpm

7037 cpm

3950 cpm

2960 cpm

4463 cpm

7680 cpm

13615 cpm

25040 cpm

(Nach Subtraktion von endogenem Hintergrund )

0 cpm

-137O cpm

36I8 cpm

3695 cpm 608 cpm

-382 cpm

1120 cpm

4338 cpm 10273 cpm 21698 cpm

Die Ergebnisse der Analyse der 2,5-A Synthetase-Aktivität zeigen, daß das obenstehende osmotische Schockprodukt des temperatur-induzierten M5219-G-pPLc-HPIP-67-8, das Antivirus-Aktivität besitzt (siehe oben), gleichfalls 2,5-A Synthetase-Aktivität induziert, während es bei dem nichtinduzierten Bakterienstamm nicht der Fall ist. Dadurch stimmen die Ergebnisse der Antivirus-Aktivitäts-Analyse überein.

Der Stimulationsgrad der 2,5-A Synthetase ist gleich der

-228897 2

Aktivität von zu dem Kontroll-Lyaat gegebenem IFN-ß (Vergleiche Proben (3) und (4)). Die Anwendung einer von den Proben (7) bis (10) entwickelten Konzentrationakurve zeigt, daß, unter Berücksichtigung der Verdünnung, eine Aktivität von log₁₀ 1,7 Einheiten/ml in beiden Proben (3) und (4) geschätzt werden kann, was mit den Werten der direkten Antivirus-Analyse übereinstimmt, d. h. 1,5 ¹⁰S-Jo Blake*·*⁶*¹ bei beiden Proben. Diese Versuchsreihe zeigt auch, daß die Induktion von 2,5-A Synthetase durch Anti-IFN-/J-Antiserum neutralisiert werden kann, wie es der Fall bei der Antivirus-Analyse ist.

e» Antivirus-Aktivität bei anderen Zellreihen Die Extrakte (i) und (ii) (M5219-G-PPLC-HPIF-67-8, oben) wurden gleichfalls in bezug auf Antivirus-Aktivität bei verschiedenen von Katzen, Mäusen, Affen und Kaninchen stammenden Zellreihen getestet. Sie zeigten bei diesen Zellen keinerlei nachweisbare Antivirus-Aktivität; was auch bei von Humanzellen stammendem authentischem IFN-β der Fall war. Es konnte auch keine Aktivität bei einer von Katzenlungen stammenden Zellreihe gefunden werden, die gegenüber Humanleukozyten-Interferon sensitiv war· Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Beweis, daß d,^ furöl ^|f !ik^frjrfn erzeugte IFN- β Eigenschaften ha^t, die im wesentli,oheX mit dqn^en^gen von IFN-/3 identisch sind, das von induzierten Humanfibroblastzellen ausgeschieden wurde. ' '

f. Sensibilität gegenüber Protease

Die Sensibilität des von den erfindungsgemäßen Bakterienwirten stammenden IFN-/i wurde durch einstündige Behandlung der verdünnten Bakterienextrakte mit steigenden Mengen Trypsin bei 37 ⁰C getestet. Die Antivirus-Aktivität des IFN-0 wurde durch das Trypsin bei einer ähnlichen Konzentration aufgehoben wie der, die die Aktivität von dem zu einem inaktiven Kon-

-«2- 22 88 9 7 2

troll-Lyaat zugeaetzten authentischen H¹N-/S aufgehoben hat.

	(42	ι	*	u/ml)	Trypsin Endpunkt (ms/ml)
M5219-pPLa-HPIF-67-12A19	(42	0O	(1000	u/ml)	0,03
M5219-pPLc-HFIF-67-8	(42	0O	(1000	u/ml)	0,03
IFN-ß in M5219~pPLa-8	(42	0O	(1000	u/ml)	0,03
M5219-pPLc-HFIF-67-8	(42	0O	( 30	u/ml)	0,03
IFN-/b in M5219-pPLa-8		0C)	( 30		0,03
(u β Einheiten)

3. Identifizierung dea aktiven IFN- ft -Produktea Verachiedene Experimente haben gezeigt, daß Prä-HuIFN-nicht aktiv iat und nicht durch Bakterienzellen unter Analysebedingungen zu einem aktiven Produkt verarbeitet wird. Daher beruht die IFN-ß-Aktivität, die in den verachiedenen oben beschriebenen Bakterienextrakten entdeckt wurde, wahrscheinlich darauf, daß die erwarteten verschmolzenen Proteine (z. B. HuIFN-/5 mit |3>-Lactamaae,MS2 oder Bakterien-Signalsequenzen verschmolzen) durch die Bakterien oder unter den Analyaenbedingungen zu einem aktiven Produkt verarbeitet wurden.

Ea iat nicht aicher, ob daa aktive Produkt in derartigen Extrakten auagereiftea HuIFN-ß Iat (auagereiftea HuIFN-ß iat natürlich daa Produkt von G-pPLa-HFIF-67-12AM1 und G-pPLa-HIIF-67-12d19 BX-2). Doch die Fraktionierung der beiapielaweiae von induziertem M5219-pPLa-HFIF-67-120£19 oder von induziertem M5219-pPI»c-HFIF-67-8 gewonnenen Bakterienextrakte durch Polyacrylamidgel-Elektrophoreae unter denaturierenden Bedingungen deckte daa Vorhandensein von zwei aktiven Produkten auf. Daa erate dieser Produkte hatte eine annähernde Größe von 15 000 bis 18 000 Dalton und könnte auagereiftem

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IFN-β entsprechen. Das zweite Produkt, das eine größere relative Molekülmasse hatte, könnte ein Fusionsprodukt oder ein unvollständig verarbeitetes, Produkt sein, das IFN-β Aktivität besitzt, oder es könnte ein Produkt sein, das unter den Analysebedingungen zu ausgereiftem IFN-(S verarbeitet wird· Die Aminosäuresequenzierung der verschiedenen Expressionsprodukte unter Anwendung bekannter Techniken wird die Bestimmung ermöglichen, welche Proteinprodukte, wenn irgendwelche, außer ausgereiftem HuIFN-/S die Aktivität von HuIFN-ß zeigen.

Verbesserung der Ausbeute und Aktivität von erfindungsgemäß erzeugten, HuIFN- |3-Aktivität aufweisenden Polypeptiden Die Produktionsmenge eines Proteins wird durch drei Hauptfaktoren bestimmt: Die Anzahl von Kopien seines Gens innerhalb der Zelle, den Wirkungsgrad, mit dem diese Genkopien transcribiert werden und den Wirkungsgrad, mit dem sie übersetzt werden. Der Wirkungsgrad der Transcription und der Translation (die zusammen die Expression darstellen) ist seinerseits von den Nucleotid-Sequenzen abhängig, die normalerweise vor der erwünschten Kodierungss6quenz sitzen. Diese Nucleotid-Sequenzen oder Expressions-Kontroll-Sequenzen bestimmen unter anderem.die Stelle, an der die RNA-Polymerase zur Initiierung der Transcription wirksam wird (der Promotor-Sequenz), und an der Ribosomen sich binden und mit der mENA (dem Transcriptionsprodukt) zur Initiierung der Translation in Wechselwirkung treten. Nicht alle derartigen Expressions-Kontroll-Sequenzen funktionieren mit dem gleichen Wirkungsgrad. Es empfiehlt sich daher, die spezifischen Kodierungssequenzen für das verlangte Protein von ihren benachbarten Nucleotid-Sequenzen zu trennen und sie stattdessen mit anderen bekannten Expressions-Kontroll-Sequenzen zu verschmelzen, um höhere Expressionsgrade zu fördern. Wenn das geschehen ist, kann das neu geschaffene DNA-Fragment in ein Plasmid mit einer höheren Anzahl von Kopien

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oder ein Bakteriophagen-Derivat eingesetzt werden, um die Anzahl von Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und dadurch die Ausbeute an verwirklichtem Protein weiter zu steigern.

Wie oben beschrieben, können verschiedene Expressions-Kontroll-Sequenzen verwendet werden. Diese umfassen die Operator-, Promotor- und Eibosombinde- und -wechselwirkungssequenzen (einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Lactose-Operons von E. coli ("das lac-System") die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli ("das trp-Syatem"), die Hauptoperator- und -promotorregionen von Phage Λ (Ot₄Pl ^nacn obiger Beschreibung von 0_RP_R), eine Kontrollregion von Filamentous einsträngigen DNA-Phagen oder andere Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren steuern. Daher kann zur besseren Erzeugung eines bestimmten Polypeptide in einem entsprechenden Wirt das für dieses PoIypeptid kodierende Gen wie zuvor erzeugt werden und von einem näher an seiner früheren Expressions-Kontroll-Sequenz liegenden Rekombinant-DNA-Molekül oder unter der Kontrolle einer der obigen Expressions-Kontroll-Sequenzen entfernt werden. Derartige Verfahrensweisen sind im Fachgebiet bekannt.

Andere Methoden zur Verbesserung des Trans1ationswirkungsgrades umfassen die Insertion von chemisch oder enzymatisch hergestellten Oligonucleotiden vor dem Initiierungscodon. Durch dieses Vorgehen kann eine optimalere Primär- und Sekundärstruktur der Messenger-RNA erzielt werden. Genauer gesagt,

die Sequenz kann so bestimmt werden, daß das Initiierunga-AUG-Godon in einer leicht zugänglichen Position (d. h. nicht durch die Sekundärstruktur verdeckt) entweder an der Oberseite einer Haarnadel oder in einer anderen einsträngigen Region auftritt. Auch die Position und Sequenz des oben genannten Shine-Dalgarno-Segmentes kann gleichfalls optimiert werden.

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Die Bedeutung der allgemeinen Struktur (Faltung) der Messenger-RNA iat bewiesen worden (D. Iserentant und W. Fiers "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of Translation Initiation" (Sekundäre Struktur von mRNA und Wirkungsgrad der Tranalationsinitiierung), Gene, 9, 1 - 12 (1980).

Weitere Steigerungen der Zellausbeute der verlangten Produkte hängen von einer Erhöhung der Anzahl von Genen ab, die in der Zelle genutzt werden können· Das kann durch die Insertion des HuIFN-ß-Gens (mit seinen Transcriptions- und Translationskontrollelementen oder ohne dieselben) in ein Plasmid mit einer noch höheren Kopienanzahl oder in ein Plasmid mit einer temperaturgeregelten Kopienanzahl (d. h. ein Plasmid, das eine Mutation trägt, so daß die Kopienanzahl des Plasmids nach Erhöhung der Temperatur zunimmt; B. Uhling.u.a«, "Plasmids With Temperature-rdependent Copy Number For Amplification Of Cloned Genes And Their Products" (Plasmide mit temperaturabhängiger Kopienanzahl zur Verstärkung geklönter Gene und deren Produkte), Gene, 6, 91 - 106 (1979)) erfolgen. Andererseits kann eine Erhöhung der Genmenge zum Beispiel durch die Insertion von Rekombinant-DNA-Molekülen, die in der oben beschriebenen Weise erzeugt wurden, in die zurückhaltende Bakteriophage ^ erzielt werden, und zwar am einfachsten durch Digestion des Plaamids mit einem Restriktionsenzym, um ein lineares Molekül zu gewinnen, das dann mit einem eingeschränkten Phage \ -Cloningvehikel (z» B. des Typs, wie er von N.E. Murray,u.a. "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants" (Lambdoid-Phagen, die die Rückgewinnung von in vitro Rekombinanten vereinfachen), Mol. Gen. Genet.« 150, 53 - 61 (1977) und von N.E. Murray, u.a., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4" (Molekül-Cloning des DNA-Ligase-Gens von Bakteriophage T4)» J. MoI. Biol., 132, 493 - 505 (1979) beschrieben wird) und dem durch Inkubation mit DNA-Ligase erzeugten Rekombinant-DNA-Molekül vermischt wird. Die vorgesehenen Rekombinant-Phage

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wird dann wie zuvor selektiert und zur Lyaogenisierung eines Wirtastammea von E. coli verwendet.

Besondera nützliche λ -Cloningvehikel enthalten eine temperatur-empfindliche Mutation in dem Repressiona-Gen £1 und unterdrückbare Mutationen in Gen £!, dessen Produkt für die Lysis der Wirtszelle erforderlich ist, und Gen E, dessen Produkt das Haupt-Capsid-Protein des Virus ist. Mit Hilfe dieses Systems werden die lyaogenen Zellen bei einer verhältnismäßig niedrigen Temperatur (z. B. 28 bis 32 ⁰C) gezüchtet und dann auf eine höhere Temperatur (z. B. 40 bis 45 ⁰C) gebracht, um die Exzision der Prophage zu induzieren. Längeres Züchten bei höheren Temperaturen führt zu hohen Produktionswerten des Proteins, das innerhalb der Zellen festgehalten wird, da diese nicht in der normalen Weiae durch Phagen-Gen-Produkte Iysiert wurden, und da der Phagen-Gen-Insert nicht eingekapselt wurde, bleibt er für weitere Transcription zur Verfügung. Künstliche Lysis der Zellen setzt dann das verlangte Produkt in großer Menge frei. Da im vorliegenden Fall auch das λ -ßepressor-System zur Steuerung der Expression angewandt wurde, kann es erforderlich aein, die Exzision der Prophage und somit der Anzahl der Genkopien durch eine heteroimmune Kontrollregion, z. B. von der Lambdoid Phage 21 abgeleitet, zu steuern.

Es ist zu beachten, daß IFN-Λ-Aktivität aufweisende Polypeptide (die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt wurden), in Form eines verschmolzenen Proteins (z. B. mit einem die Auascheidung bestimmenden prokaryotischen N-Terminal-Segment verknüpft) oder in Form von Prointerferon (z. B. mit der Interferon-Signalaequenz beginnend, die nach Ausscheidung abgespalten werden kann) oder ala ausgereiftes Interferon hergestellt werden kann (wobei das Letztere möglich ist, da ausgereiftes Fibroblast-Interferon mit Methionin, einer

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für die Initiierung der Translation benutzten Aminosäure, beginnt). Die Ausbeute an diesen verschiedenen Formen von Polypeptid kann durch eines der oben beschriebenen Verfahren oder eine Kombination davon verbessert werden. Ea können auch verschiedene Codona für einige oder alle Codons substituiert werden, die in den vorgestellten DNA-Sequenzen verwendet wurden. Diese substituierten Codons können für Aminosäuren kodieren, die mit denen identisch sind, die durch die ersetzten Codons kodiert wurden, können aber zu einer höheren Ausbeute an Polypeptid führen. Alternativ kann durch das Austauschen eines Codons oder einer Kombination von Codons, die zu einem Aminosäureaustausch oder' einem längeren oder kürzeren HuIFN-^-verwandten Polypeptid führen, dessen Eigenschaften in einer günstigen Weise verändert werden (z. B. die Stabilität erhöht, die Löslichkeit erhöht, die Antivirus-Aktivität verstärkt, die 2,5-A Synthetase-Aktivität erhöht oder der Wirts-Spezifitätsbereich erweitert werden).

Beispielsweise wurde eine derartige Verbesserung durch die Einfügung eines erfindungsgemäßen DNA-Fragments, das die für Prä-IFN-/?> kodierende DNA-Sequenz umfaßt, in einen CIoningvektor, der den letzten Promotor enthält, und Spalten der Sequenz von SV40 unter der Kontrolle dieses Promotors erzielt. Eine solche Konstruktion in Affenzellen ergab etwa 1Cr Einheiten/ml verarbeitetes IFN-^). Ähnliche Konstruktionen in anderen Cloningvektoren und eukaryotischen Zellen sind hier auch vorgesehen.

Schließlich kann die Aktivität der durch die erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküle erzeugten Polypeptide durch Fragmentierung, Modifizierung oder Derivatisierung der DNA-Sequenzen oder der erfindungsgemäßen Polypeptide durch allgemein bekannte Maßnahmen verbessert werden, ohne damit vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

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Identifizierung einea für HuIFN-ß kodierenden Chromosomen-Gena '

Eine Sammlung von Hybridphagen,_tdie von Fragmenten von fötaler Humari-Chromoaomen-DNA, die durch teilweise Spaltung mit Haell und AIuI hergestellt und mit EcoRI-Linkern mit λ Charon 4A Armen vereinigt worden war, gewonnen wurden, ist von R.M. Lawn, u.a., Cell, 15, S. 1157 - 1174 (1978) angelegt worden. Diese Gen-Bank wurde mit Hilfe eines "in situ" Verfahrens durchgesehen (W. D. Benton und R.W. Davis, Science, 196, S. 180 - 182 (1977); T. Maniatis, u.a., Cell, 15, S. 687 - 701 (1978)), wozu als Sonde der ³²P-marklerte IPN-ß>-cDNA-Insert diente, der durch Tagl-Bglll-Restriktlon von pHFIF-21"¹" abgetrennt worden war. (⁺ Plasmid pHFIF-21 wurde durch die erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifiziert, Das Tagl-Bglll-Fragment dieses Plasmids enthält fast die gesamte 5'-unübersetzte Region und die gesamte Kodierungsregion von IPN-/b). Ein Hybrldisierungs-positives Phagenclon wurde von 600 000 Plaques durch wiederholte Plaque-Heinigung isoliert. (T. Maniatis, u.a., supra). Dieses Plaque wurde als λ CH4A-gHPIP-1 bezeichnet. Die Restriktionsanalyse dieses Plaque zeigte, daß es etwa 16,3 Kb Human-DNA enthielt»

EcoRI-Digeation von Λ CH4A-gHPIF-1 erzeugte außer den beiden Armen von Charon 4A Phage acht Insertfragmente —4,6, 3,5, 2,4, 1,9, 1,3, 1,2, 0,8 und 0,6 Kb lang. Nach Southern Löschen hybridisierte nur das 1,9 Kb-Fragment zu dem Tagl-Bglll-Fragment von pHPIF-21.

Das 1,9 Kb-Fragment wurde direkt In die EcoRI-Stelle von pBR322 recloned (ein Derivat von pBR322, das auch einen Chloramphenicol-Resistenz-Markierer trägt, der eine einzige EcoRI-Stelle enthält). Nach der Ligation von 0,6 /Ug EcoRI-digerierter X CH4A-gHFIF-1 DNA mit 100 ng pBR325 und Transformation in E. coil HB101 wurden verschiedene Clone ausge-

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wählt* Nur die daa 1,9 Kb-Pragment enthaltenden Clone hybridisierten zu der IFN-ß-cDNA-Sonde. Dieaea Clon wurde ala p(325)-gHFIF-4 bezeichnet.

Ein Vergleich dea von pHPIF-21 und p(325)-gHPIF~4 abgeleiteten Reatriktionafragmentea zeigte, daß in dem Chromoaomen-Clon keine vermittelnden Sequenzen vorhanden aind und daß die von diesem Clon getragene DNA-Information mit der von pHPIP-21 identisch iato

Die Identifizierung und Isolierung der für HuIPN-ß kodierenden Chromosomen-DNA ermöglicht die Transformation entsprechender Wirte mit dieser DNA und die Expression von HuIPN-ß daraus. Eine solche Expression iat vorteilhaft, weil die zu den Chromoaomen-DNA-Sqquenzen gehörenden verschiedenen Signale in derartigen Clonen vorhanden sein werden. Diese Signale stehen dann zur Verfügung, um höhere Ausbeuten bei Expression und möglicherweise Nach-Expreaaionsverarbeitung des durch die Kodierungsregion der Chromoaomen-DNA kodierten Polypeptids zu triggern.

Mikroorganismen und nach den hier beschriebenen Verfahren erzeugte Rekombinant-DNA-Moleküie werden durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung der Deutachen Sammlung von Mikroorganiamen in Göttingen, Westdeutschland, am 2. April 1980 hinterlegt wurden und als HPIP-A bis C identifiziert wurden:

^A$ E. coil HB101 (G-pBR322(Pat)/HPIP3) ^B: E» coli KB101 (G-pBR322(Pst)/HFIP6) ^{Ci E}» coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HPIP7)

Diese Kulturen wurden mit den Zugangsnummern DSM 1791 bis 1793 versehen. Sie werden auch durch Kulturen vertreten, die

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in der Kulturensammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland, am 5. «Juni 1930 unter den Bezeichnungen HPIP-D bis .G hinterlegt wurden: ^Di E» coil 115219 (G-pPLa-HPIF-67-12) ^Ei E. coli K12A HI (G-pPLa-HFIF-67-12) ^Fi E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12A19) ^Gi E. coil M5219 (G-pPLc-HPIF-67-8)

Diese Kulturen erhielten die Zugangsnummern 1851 bis 1854. Sie sind auch durch Kulturen vertreten, die in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 26. Februar 1981 unter den Bezeichnungen HFIF H und I: ^Hs E. coli M5219 (pPLa-HFIF-67-12A MI) !* E. coil HB101 (p[325]-gHFIF-4)

hinterlegt wurden· Diese Kulturen erhielten die Zugangsnummern ATCC 3/824 bzw. 3/825.

Wenn auch oben eine Anzahl von Ausführungsbeispielen der Erfindung erläutert wurden, so ist selbstverständlich, die Grundkonstruktion verändert wird, um andere ,Ausführungs^ formen zu schaffen, bei denen die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung angewandt werden. Daher soll der Geltungsbereich der Erfindung durch die angefügten Ansprüche und weniger durch die oben anhand von Beispielen beschriebenen spezifischen Ausführungsbeispiele festgelegt werden.

Claims (9)

1. Erfindungsanspruc

   1. Verfahren zur Herstellung eines eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanfibroblast-Interferon aufweisenden Polypeptids, gekennzeichnet dadurch, daß ein Wirt, der mit einem Rekombinant-DNA-Molekül transformiert ist, gezüchtet wird, wobei das Rekombinant-DNA-Molekül durch einen DNA-Insert gekennzeichnet ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die DNA-Inserts von G-pPla- -HFIF-67-12, G-pPla-HFIF-67-12£19, G-pPlc-HFIF-67-8 , DNA-Sequenzen, die zu einem der vorstehenden DNA-Inserts hybridisieren, DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, DeIetionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen oder einem der vorstehenden Inserts, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons umfassen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie ein bei Expression der Codons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen und Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist und operativ an eine Expressions-Kontroll-Sequenz gebunden ist, und daß das Polypeptid gesammelt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Expressions-Kontroll-Sequenz aus einer Gruppe, umfassend ein ß-Lac-System, ein top-System, die Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage^ , die Kontrollregion von fd-Coatprotein und andere Sequenzen, die die Eypression von Genen prokaryotischeroder enkaryotischer Zellen und deren Viren steuern, ausgewählt wird.

   -J2T-

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3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Rekombinant-DNA-Molekül aus der G-pPla-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12A19 und G-pPLc-HFIF-67-8 umfassenden Gruppe ausgewählt wird·
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Rekombinant-DNA-Molekül aus der G-pPLa-HFIF-67-12A279T, G-pPLa-HFIF-67-l2£2l8Ml₁ G-pPLa-HFIF-67-12 ΔΜΙ. und G-pPLa- -HFIF-67-12-&19 BX-2 umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rekombinant-DNA-Molekül umd p^3257-gHFIF-4 handelt.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß der DNA-Insert aus der DNA-Sequenzen der Formel:

   atgäccaacaagtgtctcctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctc tttccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaaggagcaattttcagtgtca gaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatactgcctcaaggacaggatgaac tttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgca ttgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatcta gcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagat aaaccatctgaagacagtcctggaagaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaa aactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaa ggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatccflltaaggaac ttttacttcattaacagacttagaggttacctccgaaac, atgagctacaacttgct' tgqattcctacaaagaagcagcaattttcagtgtcagaagctcctgtgcaattgaat gggaggcttgaatactgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagatta agcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctcca gaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctffaatgagactatt GTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGG aagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacct gaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgt gcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagactta caggttacctccgaaac

   UMFASSENDEN Gruppe ausgewählt wird.

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7. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet
   dadurch, daß der Wirt aus der Stämee von E, coli., Pseudotnonas, Bacillus subtilis. Bacillus stearothermophilus,
   andere Bazillen, Hefen, Fungi, tiecische oder pflanzliche Wirte und Humangewebezellen umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Polypeptid um IFN-ß handelt.
9. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, gekennzeichnet
   dadurch, daß das erzeugte Polypeptid aus der aus Polypeptiden der Formel:

   MetThrAsnLysCysLeuLeuGlnlleAla LeuLeuLeuCysPheSerThrThrAla LeuSerMetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGlnCys •GlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeuLysAspArgMet AsnPheAspIleProGluGluTyrCysLeuLysAspArgMetAsnPheAspIlePro GluGluIleLysGlnLeuGlnGlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrlleTyr GluMetLeuGlnAsnllePheAlallePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrp AsnGluThrlleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnlleAsnHisLeu LysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThrArgGlyLysLeuMet SerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArglleLeuHisTyrLeuLysAlaLys GIuTyrSerHiseysAlaTrpThrlleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyr PhelleAsnArgLeuThrGlyTyrLeuArgAsn, MetSerTyrAsnLeuLeuGly

   PheLeuGlnArgSerAsnPheGlnCasGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGly

   ArgLeuGluTyrCysLeuLysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLys GlnLeuGlnGlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrlleTyrGluMetLeuGln AsnllePheAlallePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsnGluThrlle ValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnlleAsnHisLeuLysThrValLeu GluGluLysLeuGluLysGluAspPheThrArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHis LeuLysArgfTyrTyrGlyArglleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHis CysAlaTrpThrlleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPhelleAsnArg LeuThrGlyTyrLeuArgAsn

   und Polypeptiden bestehenden Gruppe ausgewählt wird, die

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   nach einem gleichen Verfahren gewonnen wurden und mit jedem der obenstehenden Polypeptide durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der für sie kodierenden DNA-Sequenzen verwandt sind.