DD225714B5 - Verfahren zur Herstellung von Aklanonsaeure - Google Patents
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Aklanonsäure auf mikrobiologischem Wege. Aklanonsäure ist eine geeignete Vorstufe zur halbsynthetischen Herstellung verschiedener neuer antibiotisch wirksamer Substanzen, die bei der Chpmotherapie von Tumor-, Virus- und von Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier sowie als Immunsuppressiva und Ergotropica von potentiellem Nutzen sind.
Aklanonsäure ist ein neues Produkt. Ein Verfahren zur Herstellung ist bisher nicht bekannt. Drei strukturell ähnliche Anthrachinon-Derivate wurden in Kulturbrühen von zwei Mutanten des Aclacinomycin-Bildners Streptomyces galilaeus MA 144-M1 gefunden (Tobe, M. et al., 1982. J; Antibiot, 34,1641-1645). Als Ausgangssubstanzen für Mutasynthesen bzw. Partialsynthesen von Anthracyclin-Antibiotika wurden bisher Anthracyclinone (Yoshimoto, A. et al., 1980. J. Antibiot., 33, 1150-1157JOkI, T. et al., 1980. J. Antibiot., 33,133Ϊ-1340; Yoshimoto, A. et al., 1980. J. Antibiot., 33,1158-1166; Yoshimoto, A. et al., 1981. J. Antibiot., 34,1492-1494; Eur. Pat. appl. EP 62, 327,13 Oct 1982) bzw. Anthracycline (Arcamone, F.: Doxorubicin. Academic Press, New York 1981) eingesetzt.
Die Erfindung hat die ökonomisch günstige Herstellung von Aklanonsäure zum Ziel. Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dem Aklanonsäure als Ausgangsprodukt für Mutasynthese bzw. Partialsynthese von Anthracyclin-Antibiotika auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden kann. Überraschend wurde gefunden, daß der aus einer Erdprobe von der Schwellenburg bei Erfurt isolierte Mikroorganismus Streptomyces spec. S.706 es gestattet, Aklanonsäure aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen.
Unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen wird in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet. Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist unter der Registriernummer ZIMET 43717 in der ZIMET Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt worden. Der Mikroorganismus besitzt die für die Gattung Streptomyces charakteristischen Eigenschaften, ist jedoch nicht fähig, Luftmycel und Sporen zu differenzieren, so daß eine Artzuordnung unmöglich ist. Für den Bildner der Aklanonsäure wird daher die Bezeichnung Streptomycesspec. ZIMET 43717 gewählt. Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43717 sowie seiner Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Glucose/Gelatine (5%ig) lyophilisierte Mycelfragmente werden auf geeignete Agarnährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C, vorzugsweise 28°C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus organischen Salzen. AisKöhlenstpffquelle können Stärke, Glukose, Glyzerin, Dextrin, Mannit, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen außer den o.a. stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zugabe von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natrium-Phosphat bzw. Kalium-Phosphat als vorteilhaft erwiesen. Die Isolierung der Aklanonsäure wird in der Weise durchgeführt, daß die Substanz aus dem tiefroten Mycel mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, extrahiert, nach Konzentrieren mit Wasser versetzt und bis zum Farbumschlag nach gelb angesäuert wird. Nunmehr wird die Substanz durch Zugabe von organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln erneut extrahiert und aus den Extraktkonzentraten durch Zugabe von Petroläther ausgefällt. Durch Abfiltrieren und Waschen mit Petroläther wird Aklanonsäure als gelbbraunes Pulver erhalten, das durch Säulenchromatografie weiter gereinigt werden kann. Die auf diese Weise isolierte reine Aklanonsäure ist eine in gelb-orangefarbenen Nadeln kristallisierende Substanz. Sie löst sich mäßig gut in Chloroform, wenig in Aceton, Methanol und Wasser. Aklanonsäure löst sich leicht in Natriumbicarbonatlösung mit brauner Farbe sowie in NaOH und in konz. Schwefelsäure mit roter Farbe. Die rote Farbe in verdünnter NaOH schlägt nach Ansäuern nach gelb um. Die Substanz läßt sich aus C2H5OH leicht Umkristallisieren und schmilzt danach bei 203-2040C (Zers.). Aklanonsäure hat die Summenformel C21H16O8 (MG = 396). Maxima UV/Vis (CHCI3): 258, (282), 438nm. IR (KBr) im CO-Bereich: 1 622, 1 670,1 700cm'1. MS: m/z M.+ -; 352,0934 C20H16O6 (M+ - CO2); sowie 337 (C9H13O6); 334 (C20H14O5); 323 (C18H11O6); 295 (C17H11O5); 281 (C16H9O5); 277 (C17H9O4); 254 (C15H10O4). NMR: Tabelle 1. Die Sturkturformel ist in Abb. 1 gezeigt.
Zur näheren Charakterisierung der Aklanonsäure dienen folgende Derivate:
Aklanonsäuremonomethylester. Durch Einwirkung von etherischer Lösung von Diazomethan auf Aklanonsäure in CHCI3ZCH3OH, 2Min. bei O0C: gelbe Kristalle (C2H5OH). Schmelzpunkt: 143-144°C. Summenformel: C22H18O8. Analyse: ber.: C 64,39, H 4,39; gef.: C 63,91, H 4,40. IR (KBr): 1 625, 1 675, 1 748cm"1. MS: m/z M+ 410, 1010 (C22H18O3); 392 (C22H16O7); 381
С20Н13О8);379 (С21Н15О7);354 (C19H14O7); 353 (C19 H13O7); 349 (C19H9O7); 339 (C18H11O7); 337 (C19H13O6); (C18HnO6);322 (C18H10O6); 307 (C17H7O6); 295 (C16H7O6); 294 (C17H10O5); 281 (C16H9O5); (C15H7O4). NMR: Tabelle 1
Durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel soll die Erfindung erläutert, jedoch nicht begrenzt werden.
A) Zwei 500ml-Steilbrustf laschen enthalten je 80 ml des folgenden Vorzucht-Mediums:
Glukose 1,50%
Sojamehl 1,50%
Natriumchlorid 0,50%
Calciumkarbonat 0,10%
in Leitungswasser
Sterilisierung: 35min bei 110°C. Nach der Sterilisierung liegt die Acidität bei pH 6,3.
Jede Steilbrustflasche wurde mit einer Mycelsuspension beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten 10 bis 14 Tage alten Kultur des Stammes ZIMET 43717 hergestellt wird.
Saccharose 0,300%
Dextrin 1,500%
Harnstoff 0,010%
Hefeextrakt 0,100%
Pepton (bakt.) 0,500%
Natriumchlorid 0,050%
Eisensulfat 0,001 %
primäres Kaliumphosphat 0,050%
Agar-Agar 2,000%
in Aquadest.
Sterilisierung: 40 min bei 116°C. Nach der Sterilisierung liegt die Acidität zwischen pH 6,5 und pH 7,0. Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48 Stunden bei 280C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 180 U/min bebrütet. 8ml einer so bebrüteten Vorzucht-Kultur dienen zur Beimpfung von 500-ml-SteilbrustfIaschen, die je 80ml des folgenden Produktionsmediums enthalten:
Glukose 2,0%
Sojamehl 2,0%
Natriumchlorid 0,5%
Calciumkarbonat 0,3%
in Leitungswasser
Sterilisierung: 35min bei 1100C. Die Acidität beträgt nach der Sterilisation pH 6,3.
Die Temperatur während der Fermentation liegt bei 28°C und die Schüttelfrequenz bei 180U/min. Nach 72-96stündiger Fermentation wird die höchste Ausbeute an Aklanonsäure erreicht.
B) Man verfährt wie bei Verfahrensteil A) mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:
Kartoffelstärke 1,0000%
Glukose 1,0000%
Sojamehl 1,5000%
prim. Kaliumphosphat 0,1000%
Natriumchlorid 0,3000%
Magnesiumsulfat 0,1000%
Kupfersulfat 0,0070%
Eisensulfat 0,0001 %
Magnesiumchlorid 0,0008%
Zinksulfat 0,0002% Sterilisierung: 30min bei 1200C. Die Acidität liegt nach der Sterilisierung bei pH 7,0.
C) Man verfährt wie bei B) mit dem Unterschied, daß das Vorzucht- und Produktionsmedium folgende Zusammensetzung aufweist:
Vorzucht-Medium: Dextrin 1,000%
Saccharose 0,300%
Harnstoff 0,010%
Natriumchlorid 0,050%
primäres Kaliumphosphat 0,050%
Hefeextrakt 0,100%
Pepton (bakt.) 0,500%
Eisensulfat 0,001%
in Aqua dest.
Sterilisierung: 40min bei 1200C. Acidität nach dem Sterilisieren pH 6,5 bis pH 7,0. Produktions-Medium:
| Glukose | 4,000 % |
| Trockenhefe | 1,500 % |
| Natriumchlorid | 0,200% |
| sekundäres Kaliumphosphat | 0,100% |
| Calciumkarbonat | 0,100% |
| Magnesiumsulfat | 0,010% |
| Eisensulfat | 0,001 % |
| Zinksulfat | 0,001 % |
Kupfersulfat 0,001 %
in Leitungswasser Sterilisierung: 30min bei 1200C (Glukose separat 20min bei 1100C). Acidität nach dem Sterilisieren: pH 7,0.
D) Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Verfahrensteiles A) dadurch, daß die zu beimpfende Kultur aus folgendem halbfesten Nährboden entwickelt wird:
Hafermehl 2,0%
Agar-Agar 2,0%
in Leitungswasser
Die Sterilisierung wird in üblicher Weise durchgeführt und die Acidität liegt bei pH 7,0. Anschließend beimpft man das im Verfahrensteil A) beschriebene Vorzucht-Medium, und mit dem so erhaltenen Impfmaterial werden 500 ml-Steilbrustflaschen beimpft, die 80ml des wie folgt zusammengesetzten Produktions-Nährmediums enthalten:
Glukose 1,0%
Kartoffelstärke 1,0%
Sojamehl 1,0%
Trockenhefe 0,5%
Natriumchlorid 0,5%
Calciumcarbonat 0,3%
in Leitungswasser Sterilisierung: 40min bei 1100C. Nach dem Sterilisieren liegt die Acidität bei pH 7,0.
E) Mit einer Kultur des Stammes ZIMET 43717 von einem halbfesten Nährboden, wie unter D) beschrieben, beimpft man 400ml des im Verfahrensteil A) angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2I-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet 48Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180U/min. Die so erhaltenen 400ml Kulturbrühe dienen zu Beimpfung von 2Ol des im Verfahrensteil A) beschriebenen Produktions-Mediums, das in einem 32I-Glasfermenter enthalten ist. Während der Fermentation, die miteiner Rührgeschwindigkeit von 400 U/min und mit einer Luftzufuhr von 151/min ausgeführt werden kann, wird die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert.
F) Als Anzucht-Agar wird der unter E) beschriebene eingesetzt, die Vorzucht in dem im Teil A) aufgeführten Medium zunächst für 24 Stunden in einer 500ml-Steilbrustflasche mit 80ml Inhalt und daran anschließend für weitere 24 Stunden im gleichen Medium in einem 21-Glaskolben mit 400 ml Inhalt durchgeführt wird, ehe ein 4001-V2A-Tank beimpft werden kann, der das im Teil A) beschriebene Produktionsmedium enthält. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 280U/min und die Luftzufuhr auf 4001/min eingestellt.
G) 5,6 I Kulturflüssigkeit, die man durch Vereinigen einer Reihe von Fermentationsansätzen nach Teil A) erhielt, wurden ohne Veränderung des pH-Wertes zentrifugiert und das tiefrote Mycel 3x mit je 200 ml Aceton und anschließend mit 200 ml Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und durch Zugabe von verd. HCI bis zum Farbumschlag nach braun angesäuert. Durch Zugabe von 500 ml Wasser trennte sich die Chloroformphase ab. Es wurden weitere 200 ml CHCI3 zugefügt und umgeschüttelt, wobei die gelbe Färbung weitgehend in die Chloroformphase überging. Ein Teil der Substanz fiel dabei als gelber Niederschlag aus. Die Chloroformphase wurde abgetrennt und beide Phasen zur Gewinnung des Niederschlages abgesaugt. Der Niederschlag wurde in Chloroform/Aceton (1:1) gelöst und durch Zugabe von Wasser die Chloroformphase abgeschieden. Beide Chloroformphasen wurden vereinigt, mit H2O gewaschen und mit Na2SO4 getrocknet. Anschließend wurde der Chloroformextrakt im Vakuum auf 30 ml eingeengt, wobei Aklanonsäure in gelborangen Nadeln ausfiel, die abfiltriert und mit Petrolether gewaschen wurden. Aus der Mutterlauge kann durch Fällung mit Petrolether eine weitere Menge an Aklanonsäure gewonnen werden. Ausbeute: 811 mg.
Zur Reinigung kann die Substanz in Chloroform-Methanol (100:10) gelöst und auf eine Säule mit KH2PO4-gepuffertem Kieselgel aufgegeben werden. Durch Elution mit dem gleichen Lösungsmittel wandert die Aklanonsäure als gelbe Zone, die aufgefangen und konzentriert wird. Dabei fällt die Substanz in Form von orangefarbenen Nadeln aus. Tabelle Ή NMR-Daten von Aklanonsäure und Aklanonsäuremonomethylester Meßfrequenz: 200MHz, Lösungsmittel: CDCI3
Aklanonsäure Aklanonsäure
monomethylester
7,83 D,D (A) 7,69(B) 7,31 D,D (C) JAB = 8Hz Jac= 1,7 Hz
| 1-H: | 7,84 D,D (A) |
| 2-H: | 7,71T(B) |
| 3-H: | 7,32 D,D (C) |
| Jab = 8 Hz | |
| Jac =1,7 Hz | |
| Jbc = 8 Hz | |
| 11-H: | 7,83 S |
| 4-0 H: | 12,7OS |
| 6-0 H: | 11,89 S |
| 7-OH: | |
| 8-H: | 6,04 S |
| CH2 (2 x 10-H) | 3,86 S |
| CH2vonC2Hs | 2,47 Q (A2) |
| CH3VOnC2H5 | 1,21T(X3) |
| ПГМ. | Jax = 7,5 Hz |
7,75 S 12,54 S 11,9OS 15,40S,va) 5,91 S 3,84 S 2,44Q(A2) 1,19T(X3) Jax = 7,5 Hz 3,71 S
a) Signal nur mit 200MHz-Gerät nachweisbar.
S, Singulett; D, Dublett; T, Triplett; Q, Quartett; v, Signal verbreitert.
Claims (2)
- Erfindungsansprüche:1. Verfahren zur Herstellung von Aklanonsäure, gekennzeichnet dadurch, daß Streptomycesspec. ZIMET 43717 unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff-, eine Stickstoff-Quelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 25 bis 370C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, kultiviert und die gebildete Aklanonsäure aus dem Mycel mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und chromatographisch gereinigt wird.
- 2. Verfahren nach Punkt 1., gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentation bei einer Temperatur von 28°C und über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26131184A DD225714B5 (de) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Verfahren zur Herstellung von Aklanonsaeure |
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| DD26131184A DD225714B5 (de) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Verfahren zur Herstellung von Aklanonsaeure |
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|---|---|
| DD225714A1 DD225714A1 (de) | 1985-08-07 |
| DD225714B5 true DD225714B5 (de) | 1994-08-25 |
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| DD26131184A DD225714B5 (de) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Verfahren zur Herstellung von Aklanonsaeure |
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- 1984-03-28 DD DD26131184A patent/DD225714B5/de not_active IP Right Cessation
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