DD213950A1 - Verfahren zur gasanalytischen selektion von effektoren mittels heterotropher zellsuspensionen - Google Patents

Abstract

Die Erfindg. "Verfahren zur gasanalytischen Selektion von Effektoren mittels heterotropher Zellsuspensionen"dient der Suche nach Pflanzenschutzmitteln u.nach Effektoren biologischer Prozesse.Sie verfolgt das Ziel, moegliuchst in einem Arbeitsgang die Ergebnisse von Tests mit heterotrophen Zellsuspensionen auszuwerten u.dabei primaere Atmungseffektoren von primaer nicht die Atmg.tangierenden Effektoren zu trennen.Das Auswertungsverfahren liefert darueber hinaus Informationen ueber Einsetzen,Verlauf u.Bestaendigkeit der Wirkungsauspraegung in Abhaengigkeit von der Dosis u. von der Einwirkungsdauer der Effektoren sowie ueber Art und Weise der Wirkungsausloesung.Die Erfindung basiert auf einem Auswertungsverfahren,das die entwicklungsbedingte Beeinflussung des respiratorischen Gaswechselumsatzes -Kohlendioxidproduktion, Sauerstoffverbrauch -substanzbehandelter heterotropher Zellsuspensionen oder Organismensuspensionen nutzt. Weiterreichende Aussagemoeglichkeiten zur Beeinflussung des respiratorischen Gaswechselumsatzes durch Effektoren sind mittels Simultananalysen beider Gasumsaetze durch Kombinationen der Analysenmethoden und anschliessender vergleichender Betrachtung moeglich. Die Fig.1 zeigt 6 Wirkbilder in Form der dosisabhaengigen,atmungsbedingten Kohlendioxidproduktionsgeschwindigkeit-Zeit-Kurven von 6 Effektoren,die praezise Aussagen hinsichtlich der Wirkspezifik erlauben.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur gasanalytischen Selektion von Effektoren mittels heterotropher Zellsuspensionen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Pflanzenschutzmittelforschung, Suche nach Regulatoren biologischer Prozesse, Haturstoffchemie, Umwelt analyse

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß der Einfluß chemischer Substanzen auf biologische Prozesse auf vielfältige Weise geprüft werden " kann« Als Indikatoren lassen sich auch Zellsuspensionen heterotroph kultivierter einzelliger Grünalgen nutzen. Eine hierfür geeignete Methode wird im Patent

"Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen", wp B ij. 2 $ ϊ

beschrieben· Verfährt man danach, so lassen sich aus einer Stichprobe von Chemikalien diejenigen selektieren, die den fundamentalen Prozeß des heterotrophen Zellwachstums, die Atmung, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen oder fördern· Substanzen, die die Atmung nicht beeinflussen, aber dennoch biochemisch wirksam sind, werden nach diesem Verfahren als biochemisch unwirksam eingestuft· Solche Substanzen müssen dann in einer Kette nachfolgender

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Tests spezifischer Zielstellung auf entsprechenden spezifischen Effekt geprüft werden, so z. B· potentielle Photosynthesehemmer in einem Autotrophtest, Effektoren des Hukleinsäurehaushaltes in einem Bfukleinsäure-Test· Danach ist es also unumgänglich, alle im "Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen" geprüften und für unwirksam befundenen Chemikalien einem erneuten Prüfungsgang zu unterwerfen. Auch die als "biochemisch wirksam" eingestuften Substanzen bilden hinsichtlich ihrer Wirkungsweise keine einheitliche Gruppe. Sie können die Atmung unmittelbar beeinflussen, also als primäre Atmungseffektoren wirken* Aber es besteht auch die Möglichkeit, daß sie nur mittelbar bzw. im Ergebnis ihrer Metabolisierung den Atmungsprozeß tangieren, während sie. ihre Hauptwirkung in anderen StoffWechselbereichen manifestieren»

, möglichst in einem Arbeitsgang die Sr-' gebnisse von Tests mit heterotrophen Zellsuspensionen auszuwerten und dabei primäre Atmungseffektoren von primär nicht die Atmung tangierenden Effektoren zu trennen. Die Erfindung basiert auf einem Auswertungsverfahren, das die optischen Eigenschaften substanzbehandelnder heterotro» pher" Zellsuspensionen oder Organismensuspensionen nutzt und deren substanzinitiierte Variation mit Hilfe der Spektralkolorimetrie, der Spektralphotometrie oder der Nephelometrie bei 2 bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich erfaßt und vergleichend betrachtet. Während mit diesem Verfahren eine Selektion der Effektoren in verschiedenen Gruben mit ähnlicher Wirksuezifik und ver-

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gleichbaren Wirkmechanismen möglich, ist, können Selektionen von Effektoren, die vorrangig den respiratorischen Gaswechselums ata, sei es die Kohlendiosidproduktion oder den Sauerstoffverbrauch, direkt oder indirekt beeinflus- ' sen, nicht vorgenommen werden«

Auch die Aufdeckung von Permeations- und Transρortproblernen von Wirkstoffen sowie Informationen über die Art und Weise der Wirkungsauslösung wie z· B· zur Sofortwirkung der Effektoren werden mit diesem Verfahren nicht ausreichend erfaßt· Daraus ergibt sich der Wunsch nach einem Verfahren, das zwar ebenfalls auf Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen beruht, dessen Auswertungsmodus jedoch neben der Selektion primärer Atmungsheiomer auch die genauere Charakterisierung primär nicht atmungsheminender Effektoren hinsichtlich ihrer Wirkspezifik in einem Arbeitsgang erlaubt·

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, für -Tests mit heterotrophen Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen einen Auswertungsmodus vorzuschlagen, der neben einer Selektion primärer Atmungseffektoren und von Effektoren, die nicht primär die Atmung tangieren, aber biologisch wirksam sind, in einem Arbeitsgang auch die Wirkspezifik besonders hinsichtlich der respiratorischen Gaswechselumsatzbeeinflussung zu charakterisieren ermöglicht,

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels eines speziellen Auswert Imgsverfahrens die in Anwendung des "Verfahrens zur Selektion biochemisch wirksamen Substanzen" selektierten Effektoren in einem geschlossenen Ar-

beitsgang als primäre Atmungseffektoren bzw, nicht primär die Atmung-tangierende, aber biologisch wirksame Effektoren zu charakterisieren, sie also zu differenzieren und gleichzeitig den Nachweis zu führen, ob sich unter den als biochemisch unwirksam eingestuften Substanzen Effektoren anderer Stoffwechselbereiche befinden· Insbesondere erlaubt die Erfindung"die sichere Identifizierung von Atmungshemmern und die Aufdeckung von Permeations- und Transportproblemen des Effektors· Das Auswertungsverfahren liefert darüber hinaus Informationen über Einsetzen, Verlauf und Beständigkeit der Wirkungsausprägung in Abhängigkeit von der Dosis und von der Einwirkungsdauer der Effektoren sowie über Art und Weise der Wirkungsauslösung wie durch die Soforthemmung der Atmung und liefert Informationen über den Wirkungsmechanismus der Effektoren· Beim "Verfahren zur gasanalytischen Selektion von Effektoren mittels heterotropher Zellsuspensionen¹¹ verfährt man zunächst grundsätzlich so, wie es das "Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen" empfiehlt, also definierte Mengen chemischer Verbindungen mit heterotroph kultivierten Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen in unmittelbaren Kontakt bringt und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur zwischen 20 ⁰C und 38 ⁰C im Dunkeln belüftet, so daß sie auf der Grundlage des sich vollziehenden Atmungsprozesses wachsen und sich entwickeln· Kontinuierlich oder zu festgelegten Zeitpunkten werden dann Proben und Vergleichskultüren oder Anteile von beiden parallel oder in definierter Polge durch Analyse des respiratorischen SauerstoffUmsatzes mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden, polarographischer und anderer elektrochemischer Meßketten, manometrischer Verfahren oder der Winklermethode und/oder des respiratorischen Kohlendiosidumsatzes mittels Infrarot-Gasanaly-

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satoren, ^C-Methode, photometrischer Methode und pH-Messungen untersucht und die dabei gewonnenen Ergebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen·

Atisfiihrungsbeispiele

1· Aasführungsbeispiel

Heterotroph kultivierte Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1 in einer Suspensionsdichte von 12 χ 10 Zellen/cnr werden mit verschiedenen konzentrierten wäßrigen oder Dimethylsulfoxid-Lösungen der zu prüfenden Substanzen A bis F beimpft und zusammen mit unbehandelten Kontrollen bei 37,5 ⁰C im Dunkeln belüftet, wobei Glukose als organische C-Quelle eingesetzt wird, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Atmung gegeben sind· Die Analyse des respiratorischen Sauerstoff- und Kohlendioxid-Umsatzes erfolgt in diesen lallen nach einer spezifisch entwickelten Meßanordnung, die durch Kopplung von kommerziell erhältlichen Infrarot- und Paramagnet-Gasanalysatoren eine gleichzeitige Bestimmung der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen des entwicklungsbedingten respiratorischen Gaswechsels an 6 Meßplätzen im offenen Gasstrom mit hoher Genauigkeit ermöglicht» Während der respiratorische Gaswechselums atz der in Nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen einer normalen Wachstumsentwicklung entspricht, werden die Kohlendioxidproduktion und der Säuerstoffverbrauch in den mit Chemikalien versetzten Chlorellasuspensionen während des Wachstums und der Entwicklung mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den AtmungsprozeS mehr oder weniger stören.

Die Ergebnisse der Analysen für die Substanzen A bis F sind in der Figur 1 zu entnehmen» Die Wirkbilder in Fi-

gur 1 werden durch Auftragungen der Respirationsgeschwindigkeit de/dt in Pikoliter pro-Stunde und Zelle - pl h Zelle" - entweder für die Kohlendiosidproduktion oder für den Sauerstoffverbrauch als Punktionen der Zeit erhalten, wobei für solche Auftragungen statt der Respirationsgeschwindigkeit auch die Konzentrationen oder die Logarithmen der Konzentrationen der respiratorischen Kohlendiosidproduktion bzw. des atmungsbedingten Säuerstoffverbrauchs in Yol-% oder in anderen Konzentrationsmaßen geeignet sind. Die mit K bezeichneten Graphen sind jeweils die Kohlendiosidproduktionsgeschwindigkeits-Zeit-Kurven der unbehandelten Kontrollen für die heterotrophe Entwicklung von der nullten bis zur achten Stunde und die mit den Ziffern 1 bis 4 bezeichneten Graphen die entsprechenden Kohlendioxidproduktionsgeschwindigkeits-Zeit-Kurven für die mit abgestuften, zunehmenden Konzentrationen der Substanzen A bis F versetzten Proben 1 bis 4· Die senkrechten Pfeile kennzeichnen die- Applikationszeitpunkte, die ineist in der Fähe der vierten Zyklusstunde liegen.

Pur die Substanz A wurde das Wirkbild Fig. 1, A gefunden, S^-ach Wirkstoffzugabe fällt die Kohlendiosidproduktionsgeschwindigkeit relativ langsam, aber konzentrat!onsabhängig ab* Diese Verbindung besitzt eine unspezifische Wirkung» d« h. sie tangiert die verschiedensten Wirkorte· Langzeitig kommt es zur Überlagerung direkter Wirkungen auf die Atmung und zu indirekten Effekten - Rückwirkungen der unmittelbaren Beeinflussung anderer Metabolismen - im Wirkbild. Die Atmung wird durch Eingriff in verschiedenste Enzymaktivitäten beeinflußt.

Ahnlich, aber von anderer Qualität ist das Wirkbild der Substanz B in Fig. 1, 3. Auch hier fällt die.Kohlendiozidproduktion relativ langsam, aber konzentrationsproportional ab* lach, ein bis zwei Stunden wird bei den kleinen Do-

sen 1 und 2 ein Reparatureffekt wirksam, so daß für die Dosis i die Kohlendioxidproduktion der Kontrolle fast wieder erreicht wird« Die starke Dosis 3 führt au einer totalen Hemmung der GOp-Produktion,

Das Wirkbild der Substanz C in Pig· 1 C zeigt, daß sofort nach der Wirkstoffapplikation die Kohlendioxidproduktionsgeschwindigkeit stark und dosisproportional abfällt, um anschließend wieder relativ stark anzusteigen. Danach stellt sich eine dosisproportionale Inhibition des entwicklungsbedingten Atinungszuwachses ein.

Die Analyse der Beeinflussung der atmungsbedingten Kohlendioxidproduktion der Substanz D zeigt das Wirkbild Pig. 1 In diesem Pail wird das entwicklungsbedingte Anwachsen der Kohlendioxidproduktionsgeschwindigkeit, abgesehen von sehr hohen Dosen, wo sich verschiedenste Wirkstoffeffekte überlagern, gegenüber der Kontrolle partiell vermindert oder völlig gehemmt.. Diese Wirksamkeitsphase dauert dosisabhängig eine oder mehrere Stunden. Danach ergibt sich eine Wirkssmkeitssteigerung infolge der Überlagerung verschiedenster direkter und indirekter Effekte· Im Wirkbild der Substanz S in Pig. 1 Ξ wird der Einfluß der Dosis auf den Verlauf der Kohlendioxidproduktions-Geschwindigkeits-Zeit-Kurven besonders deutlich· Während die geringe Dosis 1 nur eine geringe, relativ lang same Abnahme der Kohlendioxidproduktionsgeschwindigkeit verursacht, kommt es bei der vergleichsweise stärkeren Dosis 2 zunächst zu einer Blockierung des Atmungsprozesses. Der weitere Verlauf dieser Kohlendioxidproduktions-Geschwindigkeits-Zeit-Kurve dürfte Resultat der Überlagerung direkter und indirekter Effekte im Atmungsbereich widerspiegeln·

Auch die qualitativ unterschiedlichen Respirationsgeschwin digkeits-Zeit-Kurven der Substanz P in Pig» 1, P weisen

auf eine dosis abhängige Überlagerung mehrerer direkt er- und indirekter Effekte des Atmungsprozesses und indirekter Wirkungen, die aus der Konfrontation verschiedener Metabolismen resultieren. Neben den in der Pig. 1 vorgestellten Wirkbildern gibt es noch eine größere Anzahl qualitativ und quantitativ unterscheidbare Wirkungsverläufe· Durch Vergleich solcher Wirkbilder sowohl für die Beeinflussung der respiratorischen Kohlendioxidproduktion als auch des atmungsbedingten SäuerstoffVerbrauchs von neu untersuchten Substanzen, über deren herbizide Wirksamkeit bisher nichte oder weniger bekannt ist, mit einer Wirkbildkartea oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung der Wirkdaten von gut untersuchten, auch kommerziell vertriebenen Herbiziden oder Standardherbiziden erhält man konkrete Hinweise über ähnliche Wirkorte, Wirkmechanismen, Selektivität und Anwendungsmöglichkeiten solcher Effektoren»

2. Ausführungsbeispiel

Mit der Substanz G, von deren Einfluß auf Atmungsprozesse von Pflanzen bisher nichts bekannt ist, wird wie im 1· Ausführungsbeispiel verfahren« Allerdings werden weiterreichende Auswertungen der Wirkdaten für die Beeinflussung des respiratorischen Gaswechselumsatzes durch die Substanz vorgenommen. Von der Substanz G wurde der Einfluß von 3 unterschiedlichen Konzentrationen 1-3 auf den respiratorischen Gaswechselumsatz getestet und mit den Kontrollen K verglichen. Die Auswertung des Tests erfolgte durch Analyse der Kohlendioxidproduktion und des SauerstoffVerbrauchs, beide in pl h"¹ Zelle"¹.

Die Pig· 2 informiert über die Ergebnisse beider Analysen, wobei der Einfluß auf den Säuerstoffverbrauch durch gestrichelte Linien'wiedergegeben und die Applikationszeitpunkte durch Pfeile gekennzeichnet sind.

Ähnlich wie in den Wirkbildern der Substanzen A und B in der Pig. 1, A und B wird nach der Wirkstoffzugabe eine relativ langsame, aber konzentrat!onsabhängige Abnahme der . respiratorischen Gaswechselgeschwindigkeiten beobachtet«, Das weist auf eine unspezifische Wirkung auf die Atmungsprozesse durch diese Substanz hin· Obwohl der Einfluß der Substanz G auf die KohlendioxLdproduktion und den Säuerst off verbrauch in Pig. 2 vergleichbar und sehr unspezifisch sind, zeigt eine Auftragung der Respirationsquotienten RQ - RQ = Quotient aus den Konzentrationen der Kohlendioxidproduktion und des Sauerstoffverbrauchs - in Abhängigkeit von der Sinwirkzeit in Pig· 3» daß die RQ-Werte, die durch die Dosen 1 und 2 determiniert sind, zwar von den Kontrollwerten geringfügig abweichen, aber im Gegensatz zur Kontrolle kontinuierlich mit zunehmender Sinwirkzeit kleiner werden. Der Graph 3 in Pig· 3 zeigt, daß eine höhere Dosis der Substanz G zu einer Umkehrung des Verhältnisses Kohlendiosidproduktion/Sauerstoffverbrauch führt, d, tu die Kohlendiosidproduktion ist vergleichsweise stärker gehemmt als der Sauerstoffverbrauch· Weitere Hinweise zur Wirkspezifik von Substanz G erhält man bei einem Vergleich des respiratorischen Gaswechselumsatzes in Pona von Pig« 4· Sie zeigt eine Korrelation der dekadischen Logarithmen der Konzentrationen der Kohlendioxidproduktion

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und des SäuerstoffVerbrauchs, beide in pl h Zelle zueinander. Während in diesem Pail für die Kontrolle K eine lineare Punktion mit einem Anstieg von Sins gefunden wird, zeigen die Graphen für. die Dosen 1 und 2 zunächst eine dosisabhängige absolute Verringerung des Gaswechsel Umsatzes, ohne daß dabei das Verhältnis Ig a_nn /Ig C_n wesentlich verändert wird· ITach der dosisabhängigen Hemmung stagnieren zunächst der HemmungsZuwachs der Kohlendioxidproduktion und danach der HemmungsZuwachs des SäuerstoffVerbrauchs*, Dadurch kommt es zu einer Umkehrung und absoluten Zu-

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nähme des entwicklungsbedingten Gaswechselumsatzes, der sich im Vergleich zur Kontrolle auch auf ein ähnliches Verhältnis Ig o_nn /Ig C_n einstellt,

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Im Gegensatz dazu zeigt der Graph 3s daß eine stärkere Dosis der Substanz G zu einer starken Verringerung des respiratorischen GaswechselUmsatzes führt, wobei die Kohlendioxidproduktion einen stark verringerten, sich konstant einstellenden Wert erreicht und der Sauerstoffverbrauch nach anfänglichem Rückgang wieder zunimmt· Sin Vergleich der möglichen Aussagen der Figuren 2 bis 4 für die Atmungsbeeinflussung durch Substanz G verdeutlicht als Beispiel, daß die Auswertung solcher Tests durch gleichzeitige Analyse der respiratorischen Kohlendiosidproduktion und des respiratorischen SäuerstoffVerbrauchs in einem Arbeitsgang zu sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkspezifik von Substanzen führen kann· Besonders deutlich zeigen sich diesbezüglich unterschiede bei Korrelation der dekadischen Logarithmen der Konzentrationen des respiratorischen GaswechselUmsatzes zueinander in Pig· 4 und bei Auftragungen der RQ-Werte in Abhängigkeit von der Wirkdauer· Da der RQ-Wert für d.en atmungsbedingten Gaswechselumsatz unbehandelter Chlorella-Kulturen bei rund 2 liegt, ergibt sich die Möglichkeit, die an behandelten Proben gemessenen RQ-Werte mit standartisierten ?/erten zu vergleichen, also ohne unbehandelte Kontrolle arbeiten und an ihrer Stelle sogar Eichtabellen nutzen zu können·

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels heterotropher Zellsuspensionen, dadurch gekennzeichnet, daS der respiratorische Sauerstoff- und Kohlendioxid-Umsatz substanzbehandelter heterotropher Zellsuspensionen oder OrganismensusPensionen genutzt wird, um mittels substanzinitiierter Variation des respiratorischen Sauerstoff- und'Kohlendioxid-Umsatzes solcher Suspensionen die Effektoren in primäre und sekundäre Atmungseffektoren sowie in atmungsneutrale Effektoren differenzieren zu können,

   2· Verfahren nach Punkt .1, dadurch gekennzeichnet, daß als heterotrophe Zeilsuspensionen oder OrganismensusPensionen alle suspendierbaren heterotrophen Bakterien, Blaualgen und Grünalgen sowie submers gehaltene niedere und höhere mehrzellige Pflanzen verwendet werden können«

   3· Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der respiratorische SauerstoffUmsatz mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiven Elektroden, Polarographie und anderen elektrochemischen MeBketten, manometrischen Verfahren und der Winklermethode oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird·

   4· Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß der respiratorische Kohlendiosidumsata mittels Infrarot-Gasanalysatoren, C-Methode, photometrischen Methoden oder durch Kombination dieser Methoden analysiert wird·

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   5* Verfahren nach Punkt 1, 2, 3 und 4» dadurch gekennzeichnet, daß der respiratorische Sauerstoffverbrauch und die respiratorische Kohlendioxidproduktion durch Kombination der Analysenmethoden simultan analysiert werden.

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