DD262039A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper die ein epitop der nichtpolymorphen strukturen von hla-klasse ii antigenen erkennen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen ein Antigen von menschlichen Monozyten, B-Lymphozyten und allen anderen Zellen, die Klasse II-Antigene auf ihrer Oberflaeche tragen. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Art und Weise die kostenguenstige Produktion von groesseren Mengen spezifischer Antikoerper gegen ein Epitop des HLA-Klasse II-Antigens gestattet. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und ohne Aufwand handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden, die mit einem Epitop von HLA-Klasse II-Antigen reagieren, das sich auf der Membran von bestimmten menschlichen Zellen befindet, z. B. B-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen. Die Aufgabe wird geloest durch die Erzeugung des Hybridoms RoIa, dessen Kultivierung in vitro oder in vivo und Abtrennung des monoklonalen Antikoerpers RoIa.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen nichtpolymorphe Strukturen von HLA-KIasse Il-Antigenen.
-2- 262 Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen.
Köhler und Milstein (Nature 256,1975,495) haben durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridenlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind.
So sind eine Reihe von monoklonalen Antikörpern bekannt, die mit nichtpolymorphen Epitopen der HLA-Klasse Il-Antigenen reagieren.
1. BiyiA020,021,022(BRD)
2. TU 35 (Ziegler, A. et al. in: Knapp (Ed.) Leukemia Markers, New York 1981)
3. CCAntM2(USA)
4. Vl D1 (Knapp, W. et al., Leuk. Res. 6,1927 [1982])
5. Leu Anti HLA-DR (GB)
6. OKIaI (USA)
7. NEl-011 (USA)
8. BL-la/1,BL-la/4 DD-ES 230877A1
Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute den monoklonalen Antikörper RoIa produzieren.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper gegen nichtpolymorphe Strukturen von HLA-Klasse Il-Antigenen gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein. Die Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein. Sie sollen in einem einfachen Test das Vorkommen von nichtpolymorphen HLA-Klasse Il-Antigenen auf menschlichen Zellen nachweisen. Durch das Zurverfügungstellen der monoklonalen Antikörper soll der Stand der Technik bereichert werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome soll in anschließenden Verfahrensschritten ein monoklonaler Antikörper erzeugt werden, der mit nichtpolymorphen Strukturen von HLA-Klasse Il-Antigenen reagiert. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zunächst nach einem an sich bekannten Verfahren adhärente mononukleäre Zellen aus dem Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch zweifache Adhärenz an Glas werden die adhärenten mononukleären Zellen abgetrennt. Die in der vorstehend beschriebenen Art und Weise gewonnenen mononukleären Zellen tragen das Antigen an der Membran, gegen das die Antikörper gerichtet sind. Mit diesen Zellen werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Es werden 6-8 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch dreimalige Applikation des Antigens, wobei zwischen der zweiten und dritten Immunisierung mindestens 4 Wochen liegen. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden in an sich bekannter Weise Lymphozyten separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-MyelomzellenP3-x63Ag 8.563 (Kearney et al., J. Immunol. 123 [1979]) werden in RPM11640 mit 10% fetalem Kälberserum oder Rinderserum gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Science 145 [1964] 709), werden die gebildeten Hybridome von den nichtfusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Art sezemieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt dadurch, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in zahlreiche 2 ml-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern überprüft, die nur mit einem Epitop des HLA-Klasse Il-Antigens reagieren. Die Spezifität dieses Antikörpers wurde mit Hilfe des bekannten Reaktionsmusters mit menschlichen Zellen für Anti-HLA-Klasse Il-Antikörper überprüft, das sind B-Lymphozyten, Blutmonozyten und aktivierte T-Lymphozyten, nachdem ein vorläufiges Screening der Hybridom-Kulturüberstände mit adhärenten mononukleären Blutzellen vorgenommen wurde (Tab. 1). Die Testung des Reaktionsmusters erfolgt mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz. Es wurde auf diese Weise die Reaktion mit weiteren Zellen, Granulozyten,Thrombozyten, Erythrozyten und ruhenden T-Lymphozyten ausgeschlossen. Die durch diese Testung als positiv befundenen Hybridome wurden kloniert, Subklone herangezogen und zur Produktion von Rola-Antikörpern kultiviert. Das Hybridom RoIa wird vorwiegend in Kultur gezüchtet. Der Kulturüberstand wird lyophilisiert und ist damit dauerhaft lagerfähig. Eine Reinigung über Affinitätschromatografie mit Protein-A-Sepharose4B ist ebenfalls möglich. Die Anreicherung führt zu einem hochreinen Antikörper. Eine Produktion in der Ascitesflüssigkeit von Balb/c-Mäusen ist ebenfalls möglich, nachdem die Hybridomzellen in die mit Pristan-vorstimulierte Bauchhöhle injiziert werden. Das Kulturmedium ist RPMI-1640 mit dem Zusatz von 0,85g/l NaHCO3,1OmM Hepes, 5 χ 10~5M Mercaptoethanol, 106IU Penicillin, 0,2g/l Streptomycin und 10% fetalem Kälberserum oder Rinderserum. Die Kultur erfolgt bei 37°C, 5% CO2-Gehalt der Atmosphäre und hoher Luftfeuchtigkeit über 3-5 Tage.
Der nach einer der beiden Verfahrensvarianten hergestellte Antikörper RoIa weist das in der Tab. 1 angegebene Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen bzw. menschlichen Zellinien auf.
Der monoklonale Antikörper RoIa reagiert spezifisch mit einem nichtpolymorphen Epitop des menschlichen Klasse Il-Antigens, das bei der Immunregulation eine besondere Rolle spielt und dessen Bestimmung für diagnostische Zwecke und in der immunologischen Grundlagenforschung von besonderer Bedeutung ist.
Ausführungsbeispiel
Die Erfindung soll nachstehend in einigen Ausführungsbeispielen erläutert werden.
In flüssigem Stickstoff lagernde Hybridomzellen RoIa werden aufgetaut, gewaschen und in einer Zelldichte von 2—3 x 105/ml in Kulturmedium aufgenommen. Das Kulturmedium ist RPM1-1640 mit 10% fetalem Kälberserum oder Rinderserum, 0,85g/l NaHCO3,1OmM HEPES, 5 χ 10"5M Mercaptoethanol,0,6g/I Glutamin, 106IU Penicillin und 0,2g/l Streptomycin. Die aufgetauten Zellen werden zusammen mit 2 χ 104ml Maus-Peritonealexsudatzellen als Feeder-Zellen in Gewebekulturflaschen bei 370C, hoher Luftfeuchtigkeit und 5% CCVGehalt der Atmosphäre über 3-5 Tage kultiviert. Sie können durch passagieren unbegrenzt weitergezüchtet werden. Der Kulturüberstand wird nach 3-5 Tagen von zellulären Bestandteilen durch Zentrifugieren befreit und enthält den monoklonalen Antikörper RoIa. Die Konzentration des Antikörpers im Kulturüberstand ist ausreichend für normale Nachweisverfahren, wie z. B. Immunfluoreszenz. Sind höhere Konzentrationen erforderlich, kann eine Reinigung über Affinitätschromatografie mit Sepharose-Protein A erfolgen. Dieses Verfahren ergibt einen hochreinen Antikörper, der z.B. für die direkte Markierung mit z. B. FITC geeignet ist.
Kultivierte Hybridomzellen werden durch Zentrifugation gewonnen und zu 1-10 χ 106 in die Bauchhöhle von Balb/c-Mäusen injiziert.
Diese Mäuse sind mit 0,5 ml Paraffinöl oder Pristan vorstimuliert. Nach etwa 14 Tagen haben die Mäuse genügend Ascites produziert, um punktiert zu werden. Die Mäuse können in Abständen von etwa 14Tagen mehrmals punktiert werden. Die Ascitesflüssigkeit wird hochtourig abzentrifugiert und verdünnt ungereinigt oder gereinigt durch Gelchromatografie und Ammonsulfatfällung für Nachweisreaktionen eingesetzt. Der Antikörpergehalt in der Ascitesflüssigkeit ist wesentlich höher als in der Kulturflüssigkeit.
Tab. 1
Zellen Reaktion mit RoIa
(Immunfluoreszenz)*
Trombozyten -
Erythrozyten —
Granulozyten -
Monozyten +
Lymphozyten (+)
T-Lymphozyten -
akt. T-Lymphozyten +
B-Lymphozyten + NK-Zellen
Alveolarmakrophagen +
* Nachweis mit indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung von FITC-markiertem Anti-Maus-Immunglobulin
Claims (19)
- - 1 - ZbZ U3S Patentansprüche:1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die ein Epitop der nichtpolymorphen Strukturen von HLA-KIasse Il-Antigenen erkennen, dadurch gekennzeichnet, daß weibliche Balb/c-Mäuse mit humanen adhärenten mononukleären Zellen immunisiertwerden, die Milzzellen dieser hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen RoIa selektioniert werden, die Kulturflüssigkeit oder die Ascitesflüssigkeit gewonnen und der Antikörper RoIa isoliert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridomzellen RoIa kloniert und rektoniert werden und ein Subklon selektioniert wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6-8 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse verwendet werden.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3-x63-Ag8.653 eingesetzt werden.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung mit humanen adhärenten mononukleären Zellen erfolgt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vorder Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten Milzzellen vorgenommen wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen zu Milzzellen, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt die Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen durch das verwendete Kulturmedium enthalten ist. :
- 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI — 1640 verwendet wird.
- 10. Verfahren nach Anspruch 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5-10"5M Mercaptoethanol, 0,6g/l Glutamin, 106IU Penicillin und 0,2g/l Streptomycin zugesetzt werden.
- 11. Verfahren nach Anspruch 1 und 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß dem Medium 10% fetales Kälberserum oder 10% Rinderserum zugesetzt werden.
- 12. Verfahren nach Anspruch 1 und 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37°C kultiviert wird.
- 13. Verfahren nach Anspruch 1 und 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium ca. 5% beträgt.
- 14. Verfahren nach Anspruch 1 und 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann, herrscht.
- 15. Verfahren nach Anspruch 1 und 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß 3-4 Tage kultiviert wird.
- 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von der gewonnenen Kulturflüssigkeit die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper RoIa enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird, wie z. B. Affinitätschromatographie an Protein A-Sepharose B.
- 17. Verfahren nach Anspruch 1 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte oder ungereinigte Kulturüberstand durch Lyophilisieren in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
- 18. Verfahren nach Anspruch 1 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die aus Zellen des Hybridoms RoIa bestehen, erneut in Kultur genommen werden können.
- 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper RoIa bei +40C aufbewahrt wird.
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| DD30492387A DD262039A1 (de) | 1987-07-14 | 1987-07-14 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper die ein epitop der nichtpolymorphen strukturen von hla-klasse ii antigenen erkennen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD262039A1 true DD262039A1 (de) | 1988-11-16 |
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ID=5590712
Family Applications (1)
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| DD30492387A DD262039A1 (de) | 1987-07-14 | 1987-07-14 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper die ein epitop der nichtpolymorphen strukturen von hla-klasse ii antigenen erkennen |
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| DD (1) | DD262039A1 (de) |
-
1987
- 1987-07-14 DD DD30492387A patent/DD262039A1/de not_active IP Right Cessation
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