DD268976A5 - Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige schnellwirkende Humaninsulinanaloga mit geringerer Tendenz zur Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren werden zur Verfuegung gestellt. Die neuartigen Humaninsulinanaloga werden durch Substituieren eines oder mehrerer Aminosaeurereste von Humaninsulin mit natuerlich vorkommenden Aminosaeureresten gebildet. Die Aminosaeurerestsubstitutionen sind vorzugsweise hydrophiler als der natuerliche Aminosaeurerest in der entsprechenden Stellung im Molekuel. Ausserdem haben die Insulinanaloga die gleiche Ladung oder eine groessere negative Ladung bei neutralem p H als Humaninsulin. Bevorzugte Aminosaeuresubstituionen sind Asp, Glu, Ser, Thr, His und Ile, und am meisten bevorzugt werden Asp und Glu. Die erfindungsgemaessen Humaninsulinanaloga haben die Formel I. Sie koennen fuer die Herstellung schnellwirkender Insulinloesungen verwendet werden. Formel I

Description

Hierzu 5 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neuartige Humaninsulinanaloga, die durch schnellen Wirkungsbeginn bei subkutaner Injektion gekennzeichnet sind, und injizierbare Insulinlösungen, die solche Ins. ilinanaloga enthalten, sowie Verfahren zur Herstellung der neuartigen Insulinanaloga.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik Für die Behandlung von Diabetes mellitus wurde im Fachgebiet eine Vielfalt von Insulinpräparaten vorgeschlagen. Einige dieser Präparate sind schnellwirkend, andere weisen eine mehr oder minder verlängerte Wirkung auf. Schnellwirkende Insulinpräparate werden in akuten Situationen eingesetzt, zum Beispiel bei hyperglykämischem Koma,

während chirurgischer Eingriffe, in der Schwangerschaft und bei schweren Infektionen. Außerdem können mehrfache, tägliche

Injektionen von schnellwirkenden Insulinpräparaten die Kontrolle beim Diabetiker verbessern, was sich bei längerwirkendem

insulin als schwierig erwiesen hat.

In den letzten Jahren ist ein steigendes Interesse an einer Insulinbehandlung zu verzeichnen gewesen, die der Insulinsekretion

von den ß-Zellen des gesunden Organismus ähnlich ist, d. h. Zufuhr von Insulin mit den Mahlzeiten und Aufrechterhaltunp, eines

Insulingrundspiegels. Klinische Untersuchungen haben gezeigt, daß Diabetiker fast normale Insulin- und Glukosekonzentrationen erreichen können, indem täglich eine Injektion Insulin mit verlängerter Wirkung zur Abdeckung des Grundbedarfs gegeben wird und diese durch Injektionen kleinerer Mengen (Bolus) schnellwirkenden Insni'.is vor den Hauptmahlzeiten ergänzt wird. Schnellwirkende Insuline werden auch in Mischung mit Insulinen mittellanger und langer Wirksamkeit zur Behandlung von Diabetikern verwendet, die zusätzlich zu der verzögerten Wirksamkeit mittellang- und langwirkender Insuline eine stärkere Anfangswirkung benötigen. Schließlich wird schnellwirkendes Insulin in kontinuierlichen Insulinzufuhrsystemen eingesetzt. Im Zusammenhang mit subkutaner Injektion schnellwirkenden Insulins wurde eine anfängliche Absorptionsverzögerung

beobachtet (Binder, Diabetes Care, 7, Nr. 2 [1984], 188-189). Eine zu einem langsameren Einsetzen der Wirkung führende

Absorptionsverzögerung ist jedoch unerwünscht, wenn eine genaue Stoffwechselkontrolle angestrebt wird. Das Mischen von

schnellwirkenden Insulinlösungen mit längerwirkenden Insulinpräparaten kann außerdem zu verringerter

Absorptionsgeschwindigkeit des schnellwirkenden Insulins führen. Demzufolge besteht ein Bedarf an schnellwirkenden Insulinlösungen mit einem schnelleren Wirkungsbeginn bei subkutaner Injektion und verbesserter Mischbarkeit mit protrahierten Insulinpräparaten. Ein weiterer Nachteil bekannter schnellwirkender Insulinlösungen ist die Neigung des Insulins, zu fibrillieren und sich in den für

die kontinuierliche Insulinzufuhr verwendeten Insulinlösungen abzusetzen, wodurch mechanische Teile und Zuführkatheter verstopft werden.

Schließlich besteht auch ein Bedarf an alternativen Insulinpräparaten für die Behandlung von Patienten, die gegenüber

normalem Insulin resistent sind.

In der Vergangenheit wurde 6ine große Zahl von Insulinanaloga beFciirieben. Märki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360

[1979], 1619-1632) beschrieben die Synthese von Humaninsulinanaloga, die sich vom Humaninsulin im Austausch einer einzigen Aminosäure in den Stellungen 2,5,6,7,8 und 11 der Α-Kette und 5,7,13 und 16 der B-Kette entsprechend neuen

Einsichten in das komplizierte Struktur-Wirksamkeits-Verhältnis von Insulin unterscheiden. Weitere Untersuchungen führten zur Modifizierung des Hauptrezeptorbindungsgebietes in Insulin (B |22]-B [26]) mit dem Ziel, den Einfluß einer solchen Mutation auf

die Rezeptorbindungswirksamkeit zu erforschen. Die bekannten Humaninsulinanaloga werden jedoch nicht die von ihren

Erfindern gewünschten Eigenschaften aufweisen. Es ist bekannt, daß sulfatierte Insuline eine wesentlich geringere Fibrillationsneigung haben (Albisser et al., Desired Characteristics of insulin to be used in infusion pumps [Erwünschte Eigenschaften von Insulin für den Einsatz in Infusionspumpen]. In: Gueriguian J. L. et al., Hg. US Pharmacnpeial Convention, Rockwille, Maryland, S. 84-95) und eine geringe Antigenität aufweisen. Sulfatierte Insuline sind jedoch ein heterogenes Gemisch von mindestens neun unterschiedlichen Insulinderivaten, die durchschnittlich 4,5 Sulfatestergruppen pro Molekül enthalten. Sulfatierte Insuline haben außerdem eine

verminderte Insulinwirksamkeit, die etwa 20% der Wirksamkeit von natürlichem Insulin beträgt. Ein weiterer Nachteil von sulfatierten Insulinen im Vergleich mit natürlichem Insulin besteht darin, daß sie unnötigerweise Aminosäurereste enthalten, die chemisch modifiziert sind, d. h. Aminosäuren, die nicht natürlich vorkommen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger schnellwirkender Insulinlösungen mit einer oder mehreren der folgenden verbesserten Eigenschaften.

1. schnelleres Einsetzen der Wirkung bei subkutaner Injektion oder anderen Arten der Verabreichung

2. verbesserte Mischbarkeit mit protrahierten Insulinpräparaten

3. verminderte Fibrillationstendenz beim Einsatz in implantierbaren Zufuhrsystemen und

4. Verwendbarkeit für die Behandlung resistenter Patienten (geringe Affinität für bereits vorhandene Antikörper)

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neuartige Humaninsulinanaloge mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren

zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Es ist daher eine weitere Aufgabe der Erfindung, Insulinanaloga zur Verfügung zu stellen, die homogen sind, eine höhere

biologische Wirksamkeit aufweisen als sulfatierte Insuline und außerdem vorzugsweise nur natürlich vorkommende

Aminosäuren enthalten. Die Ziele der Erfindung werden mit injizierbaren wäßrigen Lösungen der nachstehend beschriebenen neuartigen Humaninsulinanaloga erreicht. Unter „Insulinanaloga" ist hier eine Verbindung mit einer Molekülstruktur zu verstehen, die der von Humaninsulin ähnlich ist,

einschließlich der Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys und B(7)Cys und zwischen A(20)Cys und B(19)Cys und einer internen

Disulfidbrücke zwischen A(6)Cys und Ad 1)Cys und mit Insulinwirksamkeit. Die Erfindung gründet sich auf die überraschende Tatsache, daß bestimmte Insulinanaloga, bei denen mindestens einer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit natürlich vorkommenden Aminosäureresten substituiert ist, die erwünschte schnelle Wirksamkeit besitzen. Nach ihrem breitesten Aspekt werden durch die Erfindung neuartige, schnellwirkende Humaninsulinanaloga zur Verfügung

gestellt, die durch Substitution eines oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit natürlich vorkommenden

Aminosäureresten, gebildet worden, weniger Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren bewirken

und bei neutralem pH die gleiche Ladung oder eine größere negative Ladung als Humaninsulin aufweisen.

Um eine verminderte Tendenz zur Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren zu schaffen, werden

bestimmte Humaninsulinreste vorzugsweise mit anderen Aminosäureresten substituiert, die hydrophiler sind als der natürliche

Aminosäurerest in der entsprechenden Stellung im Molekül. Bei bestimmten Stellungen im Insulinmolekül führt auch die Substitution mit einem größeren Aminosäurerest zu einer verminderten Neigung der Insulinmoleküle, sich zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren zu assoziieren. Spezifischer ausgedrückt, werden durch die Erfindung neuartige Insulinderivate der folgenden allgemeinen Formel I zur Verfügung gestellt:

Α-Kette

to ιι ia υ η is ι» u te 1930

9 10 11 U IJ 14 1» 18

B-Kette, I

worin die X die Aminosäurereste von Humaninsulin oder die gleichen oder unterschiedliche Aminosäurerestsubstitutionen sind, deren reine Funktion darin besteht, dem Molekül bei neutralem pH die gleiche Ladung oder eine größere negative Ladung als die von Humaninsulin zu verleihen, unter der Voraussetzung, daß sich mindestens ein X von den Aminosäureresten von

Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül unterscheidet und daß, wenn X in Stellung A(8) His oder Pho ist, X

in Stellung A(21) Asp ist, X in Stellung B (5) AIa ist, X in Stellung B(9) Leu ist, X in Stellung B (10) Asn oder Leu ist, X in Stellung

B (12) Asn ist oder X in Stellung B (26) AIa ist, sich dann mindestens eines der verbleibenden X von den Aminosäureresten von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül unterscheidet, und unter der weiteren Voraussetzung, daß ein oder

mehrere Aminosäurerest(e) von den N- und/oder C-terminalen Enden der A- und/oder B-Kette entfernt worden sein können.

Vorzugsweise ist mindestens die Mehrheit der Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler als der Aminosäurerest an der

entsprechenden Stelle im Humaninsulinmolekül, und noch besser ist es, wenn alle Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler sind als die entsprechenden Humaninsulin-Aminosäurereste.

Was die Hydrophilie betrifft, wird Bezug genommen auf: C. Frömmel, J. Theor. Biol. 111 (1984), 247-260 (Tabelle 1). Mit Bezug auf die vorstehende Formel 1 unterscheiden sich vorzugsweise nicht mehr als etwa 7 der X von dem Aminosäurerest

in der entsprechenden Stellung im Humaninsulinmolekül. Stärker bevorzugt sind 2 bis 4 Substitutionen.

Die Aminosäurerestsubstitutionen werden vorzugsweise aus der aus Asp, GIu, Ser, Thr, His und He bestehenden Gruppe

ausgewählt und sind noch besser negativ geladene Aminosäurereste, d.h. Asp und/oder GIu.

Das neuartige Humaninsulinanalogon kann vorzugsweise Asp und/oder GIu anstelle einer oder mehrerer der Hydroxyaminosäuren von Humaninsulin oder anstelle eines oder mehrerer GIn und Asn von Humaninsulin enthalten. Die neuartigen Humaninsulinanaloga können außerdem vorzugsweise Ser und/oder Thr oder Asp und/oder GIu anstelle eines

oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit einer aliphatischen und/oder aromatischen Seitenkette enthalten.

Die neuartigen Humaninsulinanaloga können auch vorzugsweise His anstelle eines oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit einer aliphatischen und/oder aromatischen Seitenkette oder anstelle einer oder mehrerer der Hydroxyaminosäuren von Humaninsulin enthalten. Bevorzugte Substitutionsstellen sind die Stellen B9, B10, B12, B26, B27 und B28, vorzugsweise B9, B12, B27 und B28, wo eine Substitution zur Erzielung einer verringerten Selbstassoziationstendenz und einer schnelleren Wirkung im Falle der Verabreichung ausreichen kann. Die Aminosäurerestsubstitution in Stellung B9 kann ausgewählt werden aus der aus Asp, Pro, GIu, Me, Leu, VaI, His, Thr, GIn, Asn, Met, Tyr, Trp und Phe bestehenden Gruppe und noch besser aus der aus Asp, GIu, Gin, Asn und His bestehenden Gruppe. Lie Aminosäurerestsubstitution in Stellung B12 kann aus der aus He und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählt werden. Die Aminosäurerestsubstitution in Stellung B10 kann aus der aus Asp, Arg, GIu, Asn und GIn bestehenden Gruppe ausgewählt

werden, und in den Stellungen B 20, B 27 und B28 sind die Aminosäurerestsubstitutionen vorzugsweise Asp oder GIu.

In den verbleibenden Stellungen de > Insulinmoleküls scheinon mindestens zwei Substitutionen (vorzugsweise in Kombination

mit den obengenannten Positionen) erforderlich, um die verbesserten Eigenschaften zu erzielen. In diesen Stellungen können

Substitutionen wie folgt vorgenommen werden: Stellung Bevorzugte Aminosäurerestsubstitutionen A8 His, GIy, Gin, GIu, Ser, Asn, Asp, Pro A 9 GIy, Asp, GIu, Thr, His, Gin, Asn, AIa, Pro A10 Leu, Pro, VaI, His, Ala, GIu, Asp, Thr, Gin, Asn A13 Pro, VaI, Arg, His, Ala, GIu, Asp, Thr, GIy, Gin, Asn, Asp

A 21 Asp, GIu

B1 GIu, Asp, Thr, Ser B 2 Arg, His, Ala, GIu, Asp, Thr, Pro, GIy, Gin, Ser, Asn B 5 GIu, Asp, Thr, Ser, Gin, Asn B14 GIu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr, GIy B16 Asp, GIu, Gin, Asn, Ser, Thr, His, Arg B17 Ser,Thr,Asn,Gln,Glu,Asp,His B18 Ser, Thr, Asn, Gin, His B 20 Gin, Ser, Asn, Asp, GIu, Arg

Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind Insulinanaloga mit Substitutionen an den folgenden Stellen: B27,B12,B9,(B27 + B9), (B27 + A21),B27 + B12),(B12 + A21),{B27 + B17), (B27 + A13),(B 27 + B16),(B27 + A10), (B27 + B28),(B27 + B26),(B27 + B10UB27 + B1),(B27 + B2),(B27 + B5),(B27 + B14),(B27 + B18),(B27 + B20), (Β12 + Β17),(Β12 + Α10),(Β12 + Α13),(Β12 + Β16),(Β12 + Β1),(Β12 + Β2),(Β12Η·Β5),(Β12 + Β10),(Β12 + Β26), (B12 + B28), (B9 + B17), (B9 + A13),(B9 + B16), (B9 + A8), (B9 + A9), (B9 + A10), (B9 + B1), (B9 + B2),(B9 + B5), (B9 + B10), (B9 + B12), (B9 + B14), (B9 + B28), (B9 + B18), (B9 + B20), (B9 + B26), (B27 + B9 + A21), (B9 + B27 + A8), (B27 +'B12 + A21), (B27 + BYi + B9),(B9 + B12 + B27 + B17),(B9 + B12 + B27 + A13),(B9 + B12 + B27 + B16)und (B12 + B16 + B17 + B27 + A10 + A13). Bevorzugte Ausführungsformen der oben angeführten Formel I sind folgende: A-Kette

1 2 3 4 β «7 β β 10 11 12 13 14 16 18 17 10 19 201

B Kette A-Kette

3 4 6 β 7 β 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20 21 22 23 24 26 20 2/ 28 29

1 2 3 4 6 β Τ| · 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20|

3 4 6 0 7 8 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20 21 22 23 24 25 20 27 20 29

B-Kette A-Kette

-COOH

1 2 3 4 (87

β 9 10 11 12 13 14 16 10 17 18 19 2o|

1 2 3 4 6 β 7 β 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20 21 22 23 24 26 20 27 20 28

B-Kette

worin die X der obigen Definition entsprechen. Unter Bezugnahme auf Formel I sind andere bevorzugte erfindungsgemäße Insulinanaloga diejenigen, bei denen X in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B12 He oder Tyr ist, X in Stellung A21 Asp und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B9 Asp ist X in Stellung A21 und in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung A8 His ist, in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B10 Asp ist, X in Stellung B28 Asp ist, oder X in Stellung B9 Asp und in Stellung B27 GIu ist. Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung werden injizierbare Lösungen mit Insulinwirksamkeit zur Verfügung gestellt. Die injizierbaren Insulinlösungen der Erfindung enthalten die oben beschriebenen Humaninsulinanaloga oder ein pharmazeutisch

annehmbares Salz davon in wäßriger Lösung, vorzugsweise bei neutralem pH. Das wäßrige Medium kann durch den Zusatz von beispielsweise Natriumchlorid und Glycerol isotonisch gemacht werden. Auch Puffer wie ein Acetat oder Citrat und

Konservierungsmittel wie m-Cresol, Phenol oder Methyl-4-hydroxybenzoat können zugesetzt werden. Die Insuliniösungen

können ferner Zinkionen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Humaninsulinanaloga können in den im Fachgebiet bislang bekannten schnellwirkenden Insulinlösungen für Humaninsulin oder Schvveineinsulin eingesetzt werden. Nachstehend wird die Herstellung der Insulinanaloga beschrieben. Nach dem Aufkommen der Rekombinant-DNS-Technologie

wurden die Möglichkeiten für die Proteintechnik enorm. Durch das sogenannte stellenspezifische

Mutationsauslösungsverfahren ist es möglich, eine Gencodierung für ein natürlich vorkommendes Protein durch Substituieren

eines oder mehrerer Codons im natürlichen Gen mit Codcn(s) für andere natürlich vorkommende Aminosäure(n) zu verändern.

Wahlweise kann das modifizierte Gen durch chemische Synthese der gesamten DNS-Sequenz durch bekannte Verfahren

hergestellt werden. Der Zweck einer solchen Manipulation eines Gens für ein natürliches Protein besteht normalerweise darin, die Eigenschaften des natürlichen Proteins in der einen oder anderen gezielton Richtung zu verändern.

Die neuartigen Insulinanploga können durch Verändern des Proinsulingens hergestellt werden, indem Codon(s) an der

entsprechenden Stelle im natürlichen Humanproinsulingen durch den (die) gewünschten Aminosäurerestsubstitute codierende

Codon(s) erse'zt werden oder indem die ganze, das gewünschte Humaninsulinanalogon codierende DNS-Sequenz synthetisiert

wird. Das neue modifizierte oder synthetische, das gewünschte Insulinanalogon codierende Gen wird dann in einen geeigneten

Expressionsvector eingesetzt, der nach Übertragung auf einen geeigneten Wirtsorganismus, z. B. E. coli, Bacillus oder eine Hefe

das gewünschte Produkt erzeugt. Das verwirklichte Produkt wird dann von den Zellen oder der Kulturlösung isoliert, je nachdem, ob das verwirklichte Produkt von den Zellen abgesondert wird oder nicht.

Die neuartigen Insulinanaloga können auch durch chemische Synthese nach Verfahren hergestellt werden, die dem von Märki et

al. (Hoppa-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 [1979], 1619-1632) beschriebenen Verfahren analog sind. Sie können auch aus separat in vitro hergestellten A- und B-Ketten, die die entsprechenden Aminosäurerestsubstitutionen enthalten, gebildet werden, wonach die modifizierten A- und B-Ketten durch Herstellen von Disulfidbrücken nach bekannten Methoden (z. B. Chance et al., in:

Rick DH, Gross E (Hg.) Peptides: Synthesis — Structure — Function. Proceedings of the seventh American peptid symposium, Illinois (Peptide: Synthese — Aufbau — Funktion. Berichte vom 7. Amerikanischen Peptidsymposium, Illinois] S.721-728)

miteinander verknüpft werden.

Die neuartigen Insulinanaloga werden vorzugsweise hergestellt, indem ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen

Formel II:

A-Kette

IO 11 11 13 M 19 16 17 16 19 JO

X IAinlQlnl X I ltuIC>· IQIy I XIX Iltul X IQIuI X I L«ul X

β 10 11 12 13 M '.δ It IT 16 19 10 11 21 13 14 16 26 27 28 2»

B-Kette, "·

worin Q_n eine Peptidkette mit η natürlich vorkommenden Aminosäureresten ist, R Lys oder Arg ist, η eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist, m 0 oder 1 ist, und die X der obigen Definition entsprechen, unter der Voraussetzung, daß die Peptidkette -Q_n-R- nicht zwei benachbarte basische Aminosäurereste enthält, mit eir.em L-Threoninester in Anwesenheit von Trypsin oder einem Trypsinderivat umgesetzt wird, woran sich die Umwandlung des gewonnenen Threoninesters des Humaninsulinanalogons in das Humaninsulinanalogon nach bekannten Methoden anschließt. Diese sogenannte „Transpeptisierungs"-Reaktion wird in US-PS Nr.4,343,898 beschrieben (auf deren Offenbarungen hierin Bezug genommen wird).

Durch die Transpeptisierungsreaklion wird die Brückenbildung -(Q_n-R)_n,- zwischen Aminosäure 29 in der B-Kette und Aminosäure 1 in der Α-Kette abgebrochen und eine Threoninestergruppe an das C-terminnle Ende von B29 Lys gekoppelt. Die Vorläufer der vorstehenden Formel Il können nach dem in EP PA Nr. 0163529 A beschriebenen Verfahren hergestellt werden, auf dessen Offenbarungen hierin Bezug genommen wird. Nach diesem Verfahren wird eins den betreffenden Vorläufer codierende DNS-Sequenz in einen geeigneten Expressionsträger eingefügt, der nach Übertragung auf Hefe in der Lage ist, die gewünschte Verbindung mit genau positionierten Disulfidbrücken zu verwirklichen und abzugeben. Das verwirklichte Produkt wird dann von der Kulturlösung isoliert.

Die Insulinanaloga können auch hergestellt werden, indem ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel I A-Kette

IO Il W 13 H IS IO 17 10 19 JO

* ICiI I K I QIuI AielQly I I¹IuI I¹InI I

» IAmIGInI » IliuICMlGlrl »IX Illui X JQIuI » IHuI X

I] N IS 16 17 10 1« 30 Jl JJ JJ 71

B-Kette,

worin V und T jeweils Lys oder Arg sind und die X der obigen Definition entsprechen, in wäßriger Lösung mit Trypsin und Carboxypeptidase B umgesetzt und das Humaninsulinanalogon aus der Reaktionslösung rückgewonnen wird. Die Vorläufer der obengenannten Formel III können nach einem Verfahren hergestellt werden, welches dem in EP PA Nr. 86302133.3 beschriebenen Verfahren analog ist und auf Hassen Offenbarungen hier Bezug genommen wird. Nach diesem \ erfahren wird eine den Vorläufer codierende DNS-Sequenz in einen geeigneten Hefeexpressionsträger eingefügt, der nach Übertragung auf Hefe zur Expression und Sekretio ί des verwirklichten Produktes mit genau positionierten Disulfidbrücken im Kulturmedium in der Lage ist.

Nach einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung der neuartigen Insulinanaloga zur Verfügung gestellt, bei dem ein Hefestamm mit einem replizierbaren Expressionsträger, der eine einen Vorläufer q«.s Insulinanalogons codierende DNS-Sequenz enthält, in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, und bei dem der Vorläufe.' aus dom Kulturmedium rückgewonnen und durch enzymatische und chemische i-vitro-Umwandlung in das neuartige Insulinanalogon umgewandelt wird.

Die Erfindung betrifft auch neuartige Vorläufer der neuartigen Insulinanaloga, solche neuartigen Vorläufer codierende DNS-Sequenzen, Expressionsträger, die solche DNS-Sequenzen enthalten, und mit solchen Expressionst -ftgern transformierte Hefestämme.

Die Erfindung betrifft auch bestimmte Ableitungen oder weitere Substitutionen der Insjilinanaloga, vorausgesetzt, daß solche Ableitungen oder weiteren Substitutionen keinen wesentlichen Einfluß auf das oben beschriebene ZgI der Erfindung haben. Es ist demzufolge möglich, einen oder mehrere der funktioneilen Gruppen In den Aminosäuraresten abzuleiten. Beispiele für eine solche Ableitung sind die an sich bekannte Umwandlung von Säuregruppen im Insulinmolekül in Ester- oder Amidgruppen, die Umwandlung von Alkoholgruppen in Alkoxygruppen oder umgekehrt, und selektive Desamidierung. Beispielsweise kann A21 Asn durch Hydrolyse im sauren Medium zu A21 Asp desamidiert werden, oder B3 Asri kann im neutralen Medium zu B3Asp desamidiert werden.

Es ist ferner möglich, die Insulinanaloga entweder durch Zusetzen oder Entfernen von Aminosäuraresten an den N- oder C-terminalen Enden zu modifizieren. Den erfindungsgemäßen Insulinanaloga können bis zu vier Aninocäurorcsto am N-terminalen Ende άει S-Keite und bis zu fünf Aminosäurereste am C-terminalen Ende der B-Kette fehlen, ohne daß sich ein bedeutender Einfluß auf die Gesamteigenschaften des Insulinanalogons ergibt. Beispiele für solche modifizierten Insulinanaloga sind diejenigen, denen der B1 Phe- oder der B30Thr-Aminosäurerest '3hlt. Es können auch an einem otter mehreren Enden der Polypeptidketten natürlich vorkommende Aminosäurereste hinzugefügt werden, vorausgesetzt, daß d.is keinen bedeutenden Ein'L'ß auf das obengenannte Ziel der Erfindung hat.

Solche Deletionen oder Additionen an den Enden der Polypeptidkette der Insulinanaloga können an den Insulinanaloga mit Aminosäuresubstitutionen entsprechend der Erfindung In vitro vorgenommen werden. Wahlweise kann das Gen für die neuartigen erfindungsgemäßen Insulinanaloga entweder durch Zusatz oder Entfernung von Codons entsprechend der zusätzlichen bzw. fehlenden Aminosäurereste an den Polypeptidkettenenden modifiziert werden.

Die für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind die in J. Biol. Chem. 243 (1963), 3558, festgelegten. Die Aminosäuren sind in der L-Konfiguration angegeben.

Gemäß Verwendung im folgenden Text bedeutet 8(1-29) eine verkürzte B-Kette von Humaninsulin aus B1 Phe bis B23Lys, und A(1-21) bedeutet die Α-Kette von Humaninsulin.

Die entsprechend der erfindungsgemäßen Praxis durchgeführte(n) Substitutionen) im Humaninsulinmolekül ist (sind) mit einem auf Humaninseln bezogenen Präfix angegeben.

Beispielsweise bedeutet B27Glu-Humaninsulin ein Humaninsulinanalogon, in dem GIu in Stellung 27 in der B-Kette fürThr eingesetzt ist. B25Glu, B9Asp-Humaninsulin bedeutet ein Humaninsulinanalogon, in dem GIu fürThr in Stellung 27 in der B-Kette eingesetzt ist und Asp für Ger in Stellung 9 in der B-Kette eingesetzt ist. B27GIu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin bedeutet einen Vorläufer für das Insulinanalogon (siehe Formel II), worin GIu in Stellung 27 in der verkürzten B-Kette (siehe oben) für Thr eingesetzt worden ist und worir die B (1-29)-Kette und die Α-Kette (A [1-21 J) durch die Peptidsequenz Ala-Ala-Lys verbunden sind. Sofern nichts anderes angegeben ist, versteht es sich, daß die B(1-19)-Kette und die A(1-21)-Kerfe durch Disulfidbrückon zwischen A(7)Cys und B (7) Cys bzw. zwischen A(20)Cys und B(19) Cys wie im Humaninsulin verbunden sind und daß die Α-Kette die interne Disulfidbrücke zwischen A(6)Cys und A (11)Cys enthält.

Wie bereits festgestellt wurde, besieht das Ziel der Erfindung darin, schnellwirkende injizierbare Insulinlösungen zur Verfugung zu stellen. Um dieses Ziel zu erreichen, gingen die Erfinder zu allererst davon aus, daß beträchtliche Unterschiede zwischen Depot- oder Bolusinsulin und Insulin im Kreislauf einschließlich selbstverständlich eines vollkommen unvermeidlichen Unterschieds in der Insulinkonzentration bestehen. Insulin liegt im Blutstrom in hochverdünmer Form, nämlich 10"" bis 1O^-8M, und in Monomerform vor, wobei etwas Insulin evtl. in Dimerform vorliegt. Das viel stärker konzentrierte Insulin, welches im B-Zellenkörnchen des Pankreas gespeichert ist und in der üblichen verabreichungsfähigen Lösung vorkommt, liegt größtenteils, wenn nicht grundsätzlich, in der inaktiven Heximerform, zum Beispiel, als das bekannte 2-Zinkhexamer vor. Humaninsulin in Lösung liegt bekanntlich in vielen molekularen Formen vor, nämlich als Monomer, Dimer, Tetramer und Hexamer (Blundell et al. in: Advances in Protein Chemistry [Fortschritte in der Proteinchemie], Academic Press, New York und London, Bd.26, S. 279-330,1972), wobei die Oligorr.erformen bei hohen Insulinkonzentrationen bevorzugt werden und de Monomerform die wirksame Insulinform ist. Tetramer und Hexamer sind keine Wirkformen, und selbst das Dimer kann inaktiv sein. Die der Erfindung zugrunde liegende Konzeption ist die Meinung des Erfinders, daß die im Fachgebiet erkannten Erscheinungen einer verzögerten Absorption (Binder, Diabetes Care [Diabetesbehandlung) 7, Nr. 2 [1984), 188-199) zum großen Teil der Zeit zuzuschreiben sind, die das Insulin benötigt, um vom Hoxamer, Tetramer und Dimer zur (aktiven) Monomerform zu dissoziieren.

Die erfindungsgemäßen Humaninsulinanaloga erreichen ihre schnelle Wirkung durch eine Molekülstruktur, die Dimer-, Tetramer-, Hexamer- oder Polymerbildung nicht leicht zuläßt, d. h. eine verminderte Tendenz zur Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren mit oder ohne Anwesenheit von Zinkionen aufweist.

Aus den erheblichen, im Insulin existierenden Unterschieden in der Aminosäuresequenz von Art zu Art wurde schon lange erkannt, daß nicht alle im Molekül vorhandenen Aminosäurereste für die Insulinwirksamkeit entscheidend sind, und daß einige der für die Insulinwirksamkeit nicht wesentlichen Aminosäuren für die physikalischen Eigenschaften des Insulinmoleküls wichtig sind. Von Meerschweincheninsulin ist bekannt, daß es sich nicht dimerisieren läßt. So können viele der Aminosäurereste im Humaninsulinmolekül ohne wesentliche Verringerung der Insulinwirksamkeit verändert werden. Die hier ins Auge gefaßten Amino&äurßsubstitutionen im Humaninsulinmolekül sind auf die Verhinderung der Bildung von Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren ohne Zerstörung der Insulinwirksamkeit gerichtet.

Die Aminosäurereste in den Stellungen in der Α-Kette und der B-Kette von Formel I, wo Substitutionen erfolgen können, sind für die Insulinwirksamkeit nicht entscheidend, aber sie sind wichtig für die Fähigkeit von Humaninsuün, Dimere, Tetramere, Hexamere oder Polymere zu bilden, oder für die Löslichkeit des Humaninsulins. Die Aminosäurerestsubstitutionen stören die Atom/Atom-Kontakte zwischen benachbarten Insulinmolekülen, die die Aggregierung zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren odor Polymeren erleichtern.

Wie für Substitutionszwecke zu erwarten, sind Veränderungen in bestimmten Stellungen im Humaninsulinmoleb'/i wirksamer als andere. Im großen und ganzen kann eine in der B-Kette vorgenommene Einzelsubstitution ausreichend sein, um die Selbstassoziationstendenz zu verringern, während mindestens zwei Veränderungen anderer Reste erforderlich sein können. Die Substitutionen in der Α-Kette dienen vorwiegend der Verbesserung der Löslichkeit des dissoziierten Moleküls. Bevorzugte Stellungen für die Durchführung von Aminosäurerestsubstitutionen sind B9, B12, B10, B26, B27 und B28 allein oder in Kombination miteinander oder zusammen mit Substitutionen an anderer Stelle im Insulinmolekül, als in Formel I angegeben. Die Substitution eines oder mehrerer negativ geladener Aminosäurereste für einen ungeladenen oder positiv geladenen Aminosäurerest erfolgt eindeutig mit der Absicht, die Ladung des Humaninsulinanalogons bei neutralem pH negativer zu machen und den isoelektrischen Punkt gegenüber Humaninsulin zu senken. Bezeichnenderweise haben die erfindungsgemäßen Humaninsulinanaloga die gleiche oder eine negativere Ladung (bei neutralem pH) und einen niedrigeren isoeiektrischen Punkt als Humaninsulin.

Im großen und ganzen erzielen 1 bis 3 Substitutionen die unmittelbaren Ziele der Erfindung, nämlich, ein schneller wirkendes Insulin zur Verfügung zu stellen, und bilden daher bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Durch Anwendung von 2 bis 3 Substitutionen kann eine verbesserte Mischbarkeit mit geschützten Insulinpräparaten erzielt werden. Es wird jedoch als vorteilhaft angesehen, daß die unmittelbaren Ziele der Erfindung auch durch eine größere Anzahl von Substitutionen als drei erreicht werden können, weil dadurch wünschenswerte Nobenziele erreicht werden können.

Insbesondere kann ein zusätzlicher Substitutionsgrad, etwa die Anwesenheit von 4 oder 5 substituierten Aminosäureresten, ein Humaninsulinanalogon ergeben, das auch weniger anfällig für Fibrillierung oder Grenzflächenpolymerisierung ist, eine Eigenschaft, die insbesondere dann wünschenswert ist, wenn die Insulinlösung für die kontinuierliche Infusion vorgesehen ist. Im großen und ganzen werden nicht mehr als 7 Substitutionen im Insulinmolekül für das erfindungsgemäße Insulinanalogon in Betracht gezogen. Bevorzugt werden 2 bis 4 Substitutionen.

Die Vorläufer der Insulinanaloga codierende Gene können durch Modifikation von die obengenannten Insulinvorläufer codierenden Genen mit Formel (II) (oder III), worin alle X die Aminosäurereste von Humaninsulin sind, durch stellenspezifische Mutationsausiösung zum Einfügen von oder Substituieren mit Codons, die die gewünschte Mutation codieren, hergestellt werden. Eine den Vorläufer des Insulinanalogons codierende DNS-Sequenz kann auch durch enzymatisch^ Synthese aus Oligonuclootiden hergestellt werden, die ganz oder teilweise dem Vorläufergen des Insulinanalogons entsprechen. DNS-Ssquenzen, die ein Gen mit dor gewünschten Mutation des Insulingens enthalten, werden dann mit Fragmenten zusammengenommen, die für den TPI-Promoter (TPI_P) (T. Alber und G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cereviae (Nucleotidsequenz des Triose-phosphatisomerasegens von Saccharomyces cerevisiae). J. MoI. Applied Genet. 1 (1982] 419-434), die MFa 1 -Führersequenz (J. Kurjan und I. Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene [MFa 1 ]: A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor [Aufbau eines Hefepheromongens [MFa »]: Ein mutmaßlicher α-Faktor-Vorläufer enthält vier Tandemkopien von reifem α-Faktor], Cell 30 [ 1982] 933-943) und die Transkriptions-Terminations-Sequenz von TPI von S. corevlslae (TPI_T) codieren. Diese Fragmente stellen Sequenzen zur Gewährleistung einer hohen Transkriptionsrate für Vorläufer codierendes Gen und auch eine Präsequenz zur Verfugung, die die Vorläuferlokalisierung in der sekretorischen Leitungsbahn und ihre eventuelle Exkretion μ das Nährmedium bewirken kann. Die Expressionseinheiten werden ferner mit dem Hefe-2p-Replikatiensursprung und einem selektierbaren Marker, LEU 2, zur Verfügung gestellt.

Während der in-vivo-Reifung von α-Faktor in Hefe werden die letzten (C-terminalen) sechs Aminosäuren des MFaI-Führerpeptius iLys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) durch die sequentielle Wirkung einer Endopeptidase, die die Lys-Arg-Sequenz erkennt,

und einer Aminodipeptidase, die die Glu-Ab-Reste entfernt, beseitigt (Julius, D. et al. Cell 32 [1983] 839-852). Zur Überwindung des Bedarfs an Hefe-Aminodipeptidase wu/de die für C-terminales GIu-AIa-GIu-AIa des MFa 1-Führers codierende Sequenz durch in-vitro-Mutationsauslösung von der MFa 1-Führersequenz entfernt, im folgenden Text bedeutet „MFa1-Führer" die ganze Führersequenz, während MFa 1-Führer (minus GIu-AIa-GIu-AIa) eine Führersequenz bedeutet, in der die C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala-Sequenz entfernt worden hit.

Ausführungsbeispiel Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. Beispiel 1 Konstruktion eines synthetischen Gens, das B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codiert Ein Hefe-Codon-optimiertes Strukturgen für E(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninstilin wurde wie folgt konstruiert. Die folgenden 10 Oligonucleotide wurden auf einem automatischen DNS-Synthesizer unter Anwendung der Phosphorarnioit- Chemie auf einer kontrollierten porösen Glasunterlage (S. L. Beaucage und M.H.Caruthers 11981) Tetrahydron Letters 22,

1859-18G9) synthetisiert.

I: AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC

35-mer II: AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA

36-mer IH: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCt

43-mer IV: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC

42-mer V: TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC

32-mer Vl: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT

34-mer VII: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTC JTTGTACCAAT

37-mer VIII: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC

37-mer IX: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT

36-mer X: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG

33-mer

Aus den oben angeführten 10 Oligonucleotiden wurden, wie in Fig. 1 angegeben, 5 Duplexe A-E gebildet. 20 pMol jedes der Duplexe A-E wurden durch öminütiges Halten bei einer Temperatur von 9O⁰C und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonucleotiden I-X gebildet. Das 33-mer (X) in Duplex E wurde nicht 5'-phosphoryliert, um während der Ligation Dimerisierung um die selbstkomplementären-Xbal-einsträngigen Enden zu vermeiden. Die fünf Duplexe wurden gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde nach Elektrophorese des Ligationsgemisches auf einem 2%igen Agarosegel als 182/ 183bp Bande isoliert.

Das gewonnene synthetische Gen wird in Fig. 1 gezoigt.

Das synthetische Gen wurde an ein 4kb Kpn 1-EcoR 1 -Fragment und ein 8kb Xba 1-Kpn 1-Fragment von pMT644 und ein 0,3kb EcoR 1-Hga1-Fragment von pKFN9 ligiert, um die folgende Struktur, TPIp-MFaI Führer-B (1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPI_T, zu erhalten.

Plasmid pMT644 enthält die DNS-Sequenz TPI„-MFa 1 Führer-B(1-29)-A(1-21 )-TPI_T, und die Konstruktion wird in der DK-PS Nr. 1 293/85 beschrieben. Die Konstruktion von Plasmid pKFN9 wird nachstehend beschrieben. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation eines geeigneten E.coli-Stammes (r~, m⁺) (MT 172) verwendet. 30 umpicillinresistente Kolonien wurden auf Platten übertragen, die minimale Mengen Medium M 9 enthielten (T. Maniatio et al., Molecular Cloning [Molekulares Cloning], Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 68), und es entstanden 8 Leu* Kolonien. Maxam-Gilbert-Sequenzierung eines ³²p-Xba 1-EcoR 1 -Fragments zeigte, daß drei Plasmide ein Gen mit der gewünschten Sequenz enthielten. Ein Plasmid pKFN 27 wurde zur weiteren Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von pKFN 27 wird in Fig. 2 gezeigt. Konstruktion von Plasmid pKFN9 Das Ziel der Konstruktion von Plasmid pKFN 9 bestand darin, ein Plasmid mit einer Hga1-Stelle unmittelbar nach der MFa 1-Führersequenz zu gewinnen. Plasmid pMT544 (dessen Konstruktion in der Dänischen PS Nr. 278/85 beschrieben ist) wurde mit Xba 1 unterbrochen, und etwa 250 Basen wurden von den 3'-Enden durch ExolliNuclease-Behandlung entfernt. Ein synthetischer 32-mer-lnsertionsprimer GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC mit einer Hga 1-Sequenz wurde zu einer teilweise einsträngigen DNS „annealed". Einedoppelsträngigezirkulare DNS wurdedurch Füllen mit Klenow-Polymerase und Ligation mit T4-Ligase hergestellt. Nach Transformation von E. coil (r~, m⁺) (MT 172) wurden Kolonien mit Gehalt an mutiertem Plasmid durch Koloniehybridisierung mit 5'-³²p-markiertem 32-mer Insertionsprimer nachgewiesen. Das Auftreten einer neuen Hga 1 -Stolle wurde mit Restriktions-Enzymunterbrcchung (EcoR 1 + Hga 1, Hind 3 + Hga 1) bestätigt. Nach Retransformation wurde ein .reiner" Mutant pKFN 9 zur weiteren Verwendung selektiert. Die Konstruktion von pKFN 9 wird in Fig. 3 veranschaulicht.

Beispiel 2 Herstellung von B27Glu-Humanlnsulln B27Glu-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B27Glu,B(1-29)-Ala-Ala-Lyi!-A(1-21)-Humanin.«ulin mit Thr-OBu¹

und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure gewonnen. Die Herstellung bestand aus folgenden Schritten:

I. Konstruktion eines B27Glu, B(1-2SJ)-AIa-AIa-Lys-A(1-21 (-Insulin codierenden Gens

Piasm'id pKFN 27 wurde in der einzigen Xba 1 -Stelle unmittelbar nach dem synthetischen Insulin-Vorläufergnn linearisiert. Um die Xba 1-Stelle durch den nachstehend beschriebenen Füllschritt nicht zu zerstören, wurde ein 19-mer Hind3-Xba 1 doppelsträngiger Linker

Xba1 Hind3

CTAGAAGAGCCCAAGACTA TTCTCGGGTTCTGATrCGA

an jedes Ende des linearisierten Plasmids ligiert. Der Linker wurde am Xba 1 einsträngigen Ende 5'-phosphoryliert, aber am

Hind3-Ende unphosphoryliert gelassen, wodurch Polymerisation des Linkers währund des Ligationsschritts und Zirku'arisierung

der DNS, siehe Fig.4, vermieden wurde.

5'-Mononucleotide wurden von den 3'-Enden der gewonnenen linearen doppelsträngigen DNS mittels Exolll-

Nucleasebehandlung entfernt. Die Exolll-Nucleasebehandlung wurde bei 23⁰C unter Bedingungen durchgeführt, bei denen etwa

250 Nucleotide von den 3'-Enden der DNS entfernt wurden (L. Guo und R. Wu (1983], Methods in Enzymology [Methoden in der

Enzymologie] 100, S.60-96). Ein 5'-phosphorylierter 25-mei Mutationsauslösungsprimer d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) wurde zur Mutationsstelle

„ annealed". Nach Füllen mit Klenow-Polymerase in Anwesenheit von T4-Ligase wurde die doppelsträngige DNS mit Xba 1 digeriert. Dann wurde Heteroduplex-Zirkular-DNS mit der Mutation in einem Strang mit T4-Ligase gebildet.

Das Ligationsgemisch wurde in für Ampicillinresistenz selektierende E.coli (r~, m⁺) (MT172) transformiert. Mutanten wurden durch Koloniehybridisierung mit dem 5'-32 p-markierten 25-mer Mutationsauslösungsprimer nachgewies en. Nach Retransformation wurde anhand der DNS-Sequenzierung eines 0,5kb Xba 1-EcoR 1 -Fragments aufgezeigt, daß Plasmid

pKFN37 aus einer der entstehenden Kolonien die gewünschte Mutation aufwies (A.Maxam und W.Gilbert [1980] Methods in

Enzymology 65,499-560). II. Transformation

S.cerevislae-Stamm MT663 (E2-7 B X E11-3C a/a, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hef9extrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Galactose, 1 % Lactat) auf einen OD₆₀ORm von 0,6 gezüchtet.

100ml der Kultur wurden durch Zentrifugieren geerntet, mit 10ml Wasser gewaschen, rezentrifugiert und in 10ml 1,2 M Sorbitol, 25mM Na₂EDTApH = - 8,0,6,7mg/ml Dithictreitol resuspendiert. Die Suspension wurde 15 Minuten bei 30°C inkubiert, zentrifugiert, und die Zellen wurden in 10ml 1,2M Sorbitol, 1OmM Na₂EDTA, 0,1 M Natriumeitrat pH = 5,8,2mgNovozym^e234 resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30°C inkubiert, die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in 10ml 1,2M Sorbitol und in 10ml CAS (1.2M Sorbitol, 1OmM CaCI₂,1OmM Tris [Tris = Tiis(hydroxymethyl)aminometan) pH = 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS resuspendiert. Für die Transformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 \ig Plasmid pKFN37 gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 1 ml 20%iges Polyethylenglyr.ol 4000,1OmM CaCI₂,10mM Tris pH = 7,5 wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde in 0,1 ml SOS (1,2M Sorbitol, 33% [Vol./Vol.] YPGaL, 6,7mM CaCI₂, 14 pg/ml Leucin) resuspendisrt und 2 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, und das Pellet wurde in 0,5 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. 6ml oberes Agar (SC-Medium von Sherman et al., [Methods in Yeast Ganerics, Cold Spring Karbor Laboratory, 1981 ], wobei Leucin ausgelassen wurde und ein Gehalt von 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar vorhanden war! wurden bei 52⁰C zugesetzt, und die Suspension wurde oben auf Platten gegossen, die das gleiche agar-verfestigte, sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 3O⁰C wurden Transformantkolonien ausgewählt, reisoliert und verwendet, um flüssige Kulturen anzusetzen. Ein solcher TransformantKFN40(- MT663/pKFN37) wurde für die weitere Charakterisierung gewählt.

III. Expression von B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lnsullnvoilaufer Hefestamm KFN40 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2% Pfipton [beides von den Difco-Laboratorien], und 2% Glucose)

gezüchtet. Eine 10-ml-Kultur des Stamms wurde bei 3O⁰C bis zu einem ODeoo von 26 geschüttelt. Nach Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, und es wurden 13,5mg/l Vorläufer gefunden.

Das Analcgon in der überstehenden Flüssigkeit wurde bei niedrigem pH auf einer Kationenaustauschersäule eingeengt, woran

sich Desorption mit einer geeigneten Pufferlösung anschloß. Die Kristallisation wurde mit einem alkoholischen Citratpuffer vorgenommen.

IV. Transpeptisierung

0,2 Mol (41,1 g) Thr-OBu', HOAC wurden in DMF gelöst, um 100 ml Lösung zu erhalten, 50ml 76,5%iges (Vol./Vol.) DMF in Wasser wurden zugesetzt, und 10g rohes B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden in dem Gemisch gelöst, das bei 12⁰C temperiert war. Dann wurde 1 g Trypsin in 25ml 0,0öM Calciumacetat zugesetzt, und nach 24 Stunden bei 12⁰C wurde das Gemisch in 21 Aceton gegeben, und die ausgefällten Peptide wurden durch Zentrifugieren isoliert und im Vakuum getrocknet. Das B27 GIu, B30Thr-O8u'-Humaninsulin wurde auf einer präparativen HPLC-Säula mit Silica-C18 als Säulenmaterial gereinigt.

V. Umwandlung In B27-Humanlnsulin

Das B27GIU, BSOThr-OBu'-Humaninsulin wurde in 100ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 400ml 47,4mM Natriumeitrat bei pH 7 gelöst. Die Peptide wurden bei pH 5,5 nach Zusatz von 2,4 ml 1M ZnCI₂ ausgefällt, durch Zentrifugieren isoliert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde durch Anionenaustauschchromatografie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt. Ausbeute: 1,7g B27GIu-Humaninsulin.

Beispiel 3 Herstellung von B9Asp-Hiimaninsulin B9Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B9 Asp, Bd- 29)-Ala-Ala-lys-A(1-21)-Humaninsulin mitThr-OBu¹ und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mitTrifluoressigsäure gewonnen. I. Konstruktion eines B 9 Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Ly5-A(1-21)-Humanlnsulin codierenden Gens

Dieses Gen wurde auf die gleiche Weise konstruiert, wie es für das B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierende Gen beschrieben wurde, und zwar durch stellenspezifische Mutationsauslösung von pKFN27, gelenkt durch einen 23-mer Mutationsauslösungsprimer d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG). Plasmid pKFN38 enthielt nachweislich die gewünschte Mutation.

II. Transformation

Plasmid pKFN38 wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2, II, in S. cerevislae-Stamm MT663 transformiert, und ein Transformant KFN41 wurde isoliert.

III. Expression von B 3Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humanlnsulln

Hefestamm KFN41 «vurde, wie in Beispiel 2, III beschrieben, auf YPD-Medium gezüchtet. 2,5mg/l Insulinanalogonvorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.

IV. Transpeptldisierung

7,4g rohes B9Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, transpeptisiert, um B9Asp, B30Thr-OBu'-Humaninsulin zu gewinnen.

V. Umwandlung

Das B9Asp, B30Thr-OBu'-Humaninsulin wurde, wie in Beispiel 2, V beschrieben, in B9Asp-Humaninsulin umgewandelt. Ausbeute: 0,83g B9Asp-Humaninsulin.

Beispiel 4 Herstellung von B9Asp, B27Glu-Humaninsulin B9Asp, B27Glu-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B9Asp, B27GluB(1-21)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin

mit Thr-OBu¹ und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure hergestellt.

i. Konstruktion eines B9Asp, B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens

Ein 367bp EcoR 1 -Hind3-Fragment von pKFN38 (siehe Beispiel 3) und ein 140bp Hind3-Xba 1 -Fragment von pKFN37 (siehe Beispiel 2) wurden an das große Xba 1 -EcoR 1 -Fragment von Plasmid pUC 13 ligiert (dieses Plasmid wurde, wie von Vieira et al.

(1982), Gene 19,259-268) für pUC8 und p'JC 9 beschrieben, konstruiert.

Das Ligationsgemisch wurde in für Ampicillinresistenz selektierende E. coil (MT172) transformiert. Plasmide wurden aus einer Reihe Transformanten hergestellt und durch Digestion mit P«t 1 und mit Hind 3 analysiert. Das 0,5 kb Xba 1 -EcoR 1 -Fragment von

einem Plasmid, das die richtigen Restriktionsenzymmuster zeigte, wurde an ein 7,8kb Xba 1 -Kpn 1 -Fragment und ein 4,3 kb

Kpn1-EcoR 1-Fragment, beide von pMT644, ligiert (beschrieben in der DK-PA Nr. 1293/84). Das Ligationsgemisch wurde in für Ampicillinresistenz selektierende E. coil (MT 172) transformiert. Plasmid pKFN43 aus einer der entstehenden Kolonien enthielt

das Gen für den gewünschten Insulinderivatvorläufer, wie es anhand von DNS-Sequenzierung eines 0,5kb Xba 1-EcoR 1-

Fragments gezeigt wurde. Die Konstruktion von pKFN 43 wird in Fig. 5 dargestellt II. Transformation

Plasmid pKFN38 wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, II, in S. cerevislae-Stamm MT663 transformiert, und ein Transformant KFN44 wurde isoliert.

III. Expression von B9Asp, B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin

Hefestamm KFN44 wurde, wie in Beispiel 2, III beschrieben, auf YPD-Medium gezüchtet. 7,3mg/l Insulinanalogonvorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.

IV. Transpeptisierung

12,7g rohes BOAsp, 327GIu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, transpeptisiert, um B9Asp, B27GIu, B30Thr-OBu'-Humaninsulin zu gewinnen.

V. Umwandlung

Das B9Asp, B 27GIu, B30Thr-OBu'-Humaninsulin wurde in B9Asp, B27Glu, B30Thr-Humaninsulin umgewandelt und, wie in Beispiel 2, V beschrieben, gereinigt. Ausbeute: 1,0gB9Asp, B27Glu-Humaninsulin.

Beispiel 5 Herstellung von A8His, B9Asp, B27Glu-Humanlnsulln A8His, B9Asp, B 27Glu-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von A8His, B9Asp, B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-

21 )-Humaninsulin mit Thr-OBu¹ und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.

I. Konstruktion eines A8Hls, B9Asp, B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humanlnsulln codierenden Gens Dieses Gen wurde durch Oligonucleotid-gelenkte Mutationsauslösung unter Anwendung eines Spalt-Duplex-Verfahrens (Y. Morinaga, T. Franceschini, S. Inouye und M. Inouye [1984], Biotechnology 2,636-639) konstruiert. Das die MFaI -Führersequenz

und den B 9Asp, B27 Glu-Humaninsulinvorläufer (Fig. 5) codierende pUC 13-abgeleitete Plasmid wurde mit Hpa I und Xba I unterbrochen. Das große Fragment wurde mit dem mit Ndel linearisierten Plasmid gemischt. Nich Wärme-Denaturierung und

Abkühlung enthielt das Gemisch Spalt-Duplexe mit einem einsträngigen »Fenster" in der dem Insulinvorläufergen (Hpal-Xba I)

entsprechenden Region. Der 37-mer mutagene Fehlanpassungs-Primer (mismatch primer) dlGAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAi) wurde zu dem Spalt-Duplex hybridisiert, woran sich Füllen mit Klenow-

Polymerase und Ligation anschlossen. Das Gemisch wurde zur Transformation von für Ampicillinresistenz selektierenden E. coil

(MT172) verwendet. Mutanten wurden durch Koloniehybridisierung mit einer 18-mer 5'-^wp-markierten Sonde d(AATGCTGTCACTCCATCT) nachgewiesen. Nach Retransformation wurde anhand von DNS-Sequenzierung eines 0,5kb

Xba l-EcoR I-Fragments gezeigt, daß ein Plasmid aus einer der entstehenden Kolonien die gewünschte Mutation enthielt. Dieses Plasmid wurde zur Konstruktion des Hefeplasmids pKFN 102, wie in Beispiel 4 für die Konstruktion von pKFN43 beschrieben,

verwendet.

II. Transformation

Plasmid pKFN 102 wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, Il in S. cerevisiae Stamm MT633 transformiert, und ein Transformant KFN109 wurde isoliert.

III. Expression von A 8 His, B 9 Asp, B 27 GIu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)Humanlnsulln

Hefestamm KFN109 wurde auf YPD-Medium, wie in Beispiel 2, III beschrieben, gezüchtet. 21,5mg/l Insulinanalogon-Vorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.

IV.-V. Transpeptislerung und Umwandlung

22,0g rohes A8His, B 9Asp, B27 GIu, B{1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninsulin wurden transpeptisiort, umgewandelt und, wie in Beispiel 2, IV-V beschrieben, gereinigt. Ausbeute: 4,0g A8HisB9AspB27Glu-Humaninsulin.

Beispiel 6

Herstellung von S12llo-Mumanlnsulln

B^lle-HumaninsulinwurdedurchTranspeptisierungvon B12lle-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-HumaninsulinmitThr-OBu'und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.

I. Konstruktion einos B12 Me, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens Ein 0,5kb EcoR 1-Xba 1-Fragment von pMT598(die Konstruktion von Plasmid pMT598 wird in EP PA Nr. 0163529 A beschrieben), das MFa1-Führer (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) codiert, wurde in mitXbai-EcoRI unterbrochene M13 mp 10 RF-Phage eingesetzt, und die entsprechende einsträngige DNS wurde von der M13 mp 10 Rekombinantphage gereinigt.

Die einsträngige Template-DNS wurde zu einem mutagenen 27-mer Primer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) und einem M13 Universal-Sequenzierungs-Primer d(TCCCAGTCACGACGT) hybridisiert. Die Primer wurden durch dNTPs und Klenow-Polymerase erweitert und durch T4 DNS-Ligase ligiert. Der mutagene Primer KFN92 wurde so gewählt, daß eine BstN 1-Stelle (die einzige im Xba 1-EcoR 1-Fragment) zerstört wurde. Daher wurde das Gemisch zur Selektion in bezug auf nichtmutiertesEcoRI-Xbai-FragmentmitBstNI und anschließend mit EcoR 1 und Xba 1 unterbrochen und an mit EcoR 1 und Xba 1 unterbrochenen pUC 13-Vector ligiert. Aus einem der gewonnenen Transformanten wurde ein Plasmid, pMT760, dem die BstN 1 -Stelle in der Insulincodierungssequenz fehlt, ausgewählt. Die gewünschte mutierte Sequenz wurde mit Hilfe der Maxam-Gilbert-DNS-Sequenzierung nachgewiesen. Plasmid pMT760 enthält eine 0,5kb EcoR 1-Xba 1-Sequenz, die dem gleichen Fragment von pMT598 (siehe oben) entspricht, abgesehen von einer Mutation bei B12 (VaI-IIe). Diese mutierte Sequenz wurde dann auf ein Hefeexpressionsplasmid gebracht, und zwar durch Ligation des 0,5 kb EcoR 1 -Xba 1 -Fragments von pMT760 an ein 7,8kb Xba 1 -Kpn 1 - und ein 4,3kb Kpn 1 -EcoR 1 -Fragment von pMT644, um pMTA zu gewinnen.

Beispiel 7

Herstellung von B12Tyr-Humanlnsul!n

B12Tyr-Humaninsulin kann durch Transpeptisierung von B12Tyr, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninsulin mit Thr-OBu¹ und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt werden.

I. Konstruktion eines B12Tyr, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humanlnsulin codierenden Gens Das Gen wurde nach einem Verfahren konstruiert, welches dem Verfahren für die Herstellung des B 121Ie, (B1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens analog ist, mit der einzigen Ausnahme, daß Primer KFN93 d(GTAGAGAGCT l CCTACAGGTGTGAGCC) anstelle von KFN 92 verwendet wurde.

II.—IV. Transformation, Expression, Transpeptisierung, Umwandlung

Die Schritte Il und III wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. In der überstehenden Flüssigkeit wurden 1,7 mg/l des Insulinanalogen-Vorläufers gefunden. Der rohe Analogonvorläufer kann transpeptisiert, umgewandelt und, wie in Beispiel 2, Vl-V beschrieben, gereinigt werden, um B 12Tyr-Humaninsulin zu gewinnen.

Beispiel 8

Herstellung von BIOAsp-Humaninsulin

B 10Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B 10Asp, B(1-29)-A!a-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninsulin mit Thr OBu* und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.

I. Konstruktion eines B10Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humar.nsulln codierenden Gens Das Gen wurde nach einem Verfahren konstruiert, welches dem Verfahren für die Herstellung des 812He, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens analog ist, mit dem einzigen Unterschied, daß Primer KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) anstelle von KFN 92 verwendet wurde.

IL-V. Transformation, Expression, Transpeptisierung, Umwandlung

Die Schritte Il und III wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. In der überstehenden Flüssigkeit wurden 36 mg/l Insulinanalogon-Vorläufer gefunden. Der rohe Analogonvorläufer wurde transpeptisiert, umgewandelt und, wie in Beispiel 2, IV-Vbeschrieben,gereinigt. Ausbeute: 7,6g BIOAsp-Humaninsulin.

Beispiel 9

Herstellung von B28Asp-Humanlnsulin

B 28Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B 28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr-OMe und Hydrolyse des gewonnenen Threoninesters bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 12 hergestellt.

I. Konstruktion eines B 28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humanlnsulin codierenden Gens Ein 0,5kb EcoR 1 -Xba 1 -Fi agment von pMT462 (die Konstruktion von Plasmid pMT462 wird in der Dänischen PA Nr. 1257/86 beschrieben), das den MFo.1-Führer (minus GIu-AIa-GIu-AIa)-B-C-A, d.h. das Humanproinsulingen, das dem modifizierten MFo.1 -Führer vorangeht, codiert, wurde in mit Xba 1-EcoR 1 unterbrochene M13 mp 10 RF-Phage eingesetzt, und die einsträngige DNS wurde von der M13 mp 10 Rekombinantphage gereinigt. Die einsträngige Template-DNS wurde zu einem mutagenen 41-mer Primer NOR 205 d(TCCACMTGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAüAAGAAGC) und einem M13 Universal-Sequenzierungs-Primer d(TCCCAGTCACGACGT) hybridisiert. Die Primer wurden durch dNTPs und Klenow-Polymerase erweitert und durch T4-DNS-Ligase ligiert.

Nach Phenol-Extraktion, Ethanolpräzipitation und Resuspension wurde die DNS mit Restriktionsenzymen Apa 1, Xba 1 und EcoR 1 unterbrochen. Nach einer weiteren Phenolextraktion, Ethanolpräzipitation und Rosuspension wurde die DNS an mit EcoR 1-Xba 1 unterbrochene pUC 13 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coil (r~ m⁺)-Stamm transformiert, und aus einer Anzahl Transformanten wurden Plasmide hergestellt. Die Plasmidpräparate wurden mit EcoR 1 und Xba 1 unterbrochen, und jene Präparate mit Banden bei 0,5 und 0,6kb wurden in E. coil retransformiert. Von der Retransformation wurde ein Transformant, der nur pU 13 mit einem 0,5 Insert beherbergt, selektiert.

Von einem der gewonnenen Transformanten wurde ein Plasmid pMT881 mit der gewünschten Mutation bei B 28 (Pro -» Asp) gewählt. Die mutierte Sequenz wurde durch Maxam-Gilbert-DNS-Sequenzierung nachgewiesen. Die mutierte Sequenz wurde dann durch Ligation eines 0,5kb EcoR 1-Xba 1-Fragments von pMT881 an ein 7,8kb Xba 1-Kpn 1 Fragment und ein 4,3kb Kpn 1-EcoR 1 -Fragment von pMT644 auf ein Hefeexpressionsplasmid pebracht, um pMTA 1 zu erhalten.

II. Transformation

Plasmid pMTA 1 wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, Ii in S. cerevisiae-Stamm MT663 transformiert, und ein Transformant MTA1 wurde isoliert.

III. Expression von B28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulln

Hefestamm MTA1 wurde, wie in Beispiel 2, III beschrieben, auf YPD-Medium gezüchtet. 7,2mg/l Insulinanalogon-Vorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.

IV. Transpeptisierung

Das rohe B28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) wurde, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, durch Substituieren von Thr-OBu' mit Thre-OMe transpeptisiert, um B28Asp, B30Thr-OMe-Humaninsulin zu gewinnen.

V. Umwandlung

Das B 28 Asp, B30Thr-OMe-Humaninsulin wurde in Wasser auf 1 % (Masse/Vol.) dispergiort und durch Zusatz von 1 η Nat:iumhydroxid gelöst, so daß sich ein pH-Wert von 10,0 ergab. Der pH-Wert wurde 24 Stunden bei 25°C konstant bei 10,0 gehalten. Das gebildete B28Asp-Humaninsulin wurde durch Zusatz von Natriumchlorid bis etwa 8% (Masse/Vol.), Natriumacetattrihydrat bis etwa 1,4% (Masse/Vol.) und Zinkacetatdihydrat bis etwa 0,01 % (Masse/Vol.) und anschließenden Zusatz von 1 η Salzsäure bis pH 5,5 ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren isoliert und durch Anionenaustauschchromatografie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt. Ausbeute: 0,2g B28Asp-Humaninsulin.

Beispiel 10 Herstellung von A21 Asp, B9 Asp, B27Glu-Humanlnsulin A21 Asp, B9Asp, B27Glu-Humaninsulin wurde durch selektive Desamidierung (Hydrolyse einer 5%igen Lösung über einen Zeitraum von 14 Tagen bei 37⁰C, pH2,5) aus B9Asp, B 27Glu-Humaninsulin hergestellt. Das desamidierte Produkt wurde durch Anionenaustauschchromatografie isoliert. Beispiel 11 Herstellung von B27Glu,A21Asp-Huinanlnsulln B27 GIu, A21 Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B 27GIu, A21 Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) mit TIuOBu⁺ und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. B 27 GluA21 AspB(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) wurde durch Desamidierung, wie in Beispiel 10 beschrieben, aus B27 GIu, ΒΠ-29)- Ala-Ala-Lys-A(1-21) (siehe Beispiel 2) hergestellt. Charakterisierung von Humaninsulinanalogon der Erfindung Ermittlung des Molekulargewichts (Gutfreund H. Biochemical Journal 42 [544] 1948). Methode: Knauer-Membran-Osmometer

Typ: 1,00

Membran: Schleicher und Schüll

Typ:R52

Lösungsmittel: 0,05 M NaCI, pH 7,5

Temperatur: 21⁰C Resultate: Alle Insulinarten wurden mit einer Konzentration von 4 mg/ml gemessen.

Tabelle 1 Insulinart Molekulargewicht

kDalton

Human-2Zn-lnsulin 36 ±2 Human-Zn-freies-lnsulin 29 + 1 Zn-freiesB27Glu-Humaninsulin 22 ±1 Zn-freies B12 Ile-Humaninsulin 17 ± 1 Zn-freiesB27Glu,A21 Asp-Humaninsulin 8±1 Zn-freiesB9Asp,B27Glu-Humaninsulin 6± 1 Zn-freies B9Asp-Humaninsulin 6±1 Zn-freies B 9Asp, B 27 GIu, A21 Asp-Humaninsulin 6 ± 1 Zn-freies B9Asp,B27Glu,A8His-Humaninsulin 9±3 BIOAsp-Humaninsulin 12 + 1 B28Asp-Humaninsulin 9±2

Aus der vorstehenden Tabelle 1 geht hervor, daß die Humaninsulinanaloga im Vergleich zu Humaninsulin sin merklich reduziertes Molekulargewicht aufweisen, was bedeutet, daß die Selbstassoziation zu Dimeren, Tetremeren und Hexameren weniger ausgeprägt ist und in einigen Fällen sogar fehlt.

Tabelle 2 Halbwertzelt und biologische Wirksamkeit

Humaninsulinanalogon	T,/2	Biologische Wirksamkeit
	(% Humaninsulin!	% Humaninsulin
		95% Übertragungsinter
*		(conf. interval)
B27Glu-Humaninsulin	78	101(83-123)
B9Asp,B27Glu-Humaninsuiin	54	110(90-139)
B12lle-Humaninsulin	78	91(80-103)
B27Glu,A21Asp-Humaninsulin	56	64(58-71)
BSAsp-Humaninsuiin	52	80(72-90)
A21A.$p,B9Asp,B27Glu-Humaninsulin	56	75(66-85)
A8His, B9Asp, B27Glu-Humaninsulin	68	116(101-135)
B 10Asp-Humaninsulin	64	104(92-118)
B 28 Asp-Humaninsulin		104(95-114)

' Zeit biv zum 50%igen Verscnwinden von der Injektionsstelle (subkutan) bei Schweinen. Methode nach Binder

1969 (Acta Pharmacol. Toxicol [Anlage 2) 27:1-87) ** Mäusebi'utglucosebestimrnung nach der Europäischen Pharmakopöe.

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die Zeit bis zum 50%igen Verschwinden der Insulinanaloga von der Injektionsstelle im Vergleich mit Humaninsulin erheblich reduziert ist.

Die biologische Wirksamkeit der Insulinanaloga ist mit der von Humaninsulin vergleichbar oder nur geringfügig verringert.

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   B-Kette I

   worin die X die Aminosäurereste von Humaninsulin oder die gleichen oder unterschiedliche Aminosäurerestsubstitutionen sind, deren reine Funktion darin besteht, dem Molekül bei neutralem pH die gleiche Ladung oder eine größere negative Ladung als Humaninsulin zu verleihen, unter der Voraussetzung, daß sich mindestens ein X von den Aminosäureresten von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül unterscheidet und daß, wenn X in Stellung A(S) His oder Phe ist, X in Stellung A(21) Asp ist, X in Stellung B (5) AIa ist, X in Stellung B (9) Leu ist, X in Stellung B (10) Asn oder Leu ist, X in Stellung B (12) Asn ist oder X in Stellung B (26) AIa ist, sich dann mindestens eines der verbleibenden X von den Aminosäureresten von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül unterscheidet, und unter der weiteren Voraussetzung, daß ein oder mehrere Aminosäurerest(e) von den N- und/oder C-terminalen Enden der A- und/oder B-Kette entfernt worden sein können, dadurch gekennzeichnet, daß

   a) ein Hefestamm mit einem replizierbaren Expressionsträger, der eine einen Vorläufer des Insulinanalogens codierende DNS-Sequenz umfaßt, in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, und der Vorläufer aus dem Kulturmedium gewonnen und durch enzymatische und chemische in-vitro-Umwandlung in das neuartige Insulinanalogen umgewandelt wird, oder

   b) ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel II,
   A-Kette

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 I

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19

   B-Kette

   20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

   worin Q_n eine Pepticlkette mit η natürlich vorkommenden Aminosäureresten ist, R Lys oder Arg ist,

   η eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist, m 0 oder 1 ist, und die X der obigen Definition entsprechen, unter

   der Voraussetzung, daß die Peptidkette-Q_n-R-nicht zwei benachbarte basische Aminosäurereste enthält, mit einem L-Threoninester in Anwesenheit von Trypsin oder eines Trypsinderivates

   umgesetzt wird, woran sich die Umwandlung des gewonnenen Threoninesters des

   Humaninsulinanalogons in das Humaninsulinanalogon nach bekannten Verfahren anschließt,

   oder

   c) ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel III

   A-Kette

   12 3 4 5 6

   J 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2(

   8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

   B-Kette

   III

   20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

   worin V und T jeweils Lys oder Arg sind und die X der obigen Definition entsprechen, mit Trypsin und Carboxypeptidase B in wäßriger Lösung umgesetzt wird und das Humaninsulinanalogon aus dem Reaktionsgemisch gewonnen wird, oder

   d) die Insulinanaloga, die die entsprechenden Aminosäuresubstitutionen enthalten, chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert werden, oder die A- und B-Ketten, die die entsprechende Aminosäuresubstitution enthalten, chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert werden, und die modifizierten A- und B-Ketten durch Herstellen von Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys und B(7)Cys und zwischen A(20)Cys und B(19)Cys und der internen A-Ketten-Brücke zwischen A(6)Cys und A(11)Cys verknüpft werder
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler sind als der Aminosäurerest von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich nicht mehr als etwa 7 der X von dem Aminosäurerest in der entsprechenden Stellung im Humaninsulin unterscheiden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresubstitutionen aus der aus Asp, GIu, Ser, Thr, His und He bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurerestsubstitutionen Asp und/oder GIu sind.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich mindestens ein X in Stellung B (9), B(10), B(12), B (26) oder B(27) oder B(28) von dem Aminosäurerest an der entsprechenden Stelle im Hurnaninsulinmolekül unterscheidet.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich mindestens ein X in Stellung B (9), B (12) oder B (27) oder B (28) von dem Aminosäurerest an der entsprechenden Stelle im Hurnaninsulinmolekül unterscheidet.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B \2 Ne oder Tyr ist, X in Stellung A21 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B9 Asp ist, X in Stellung A21 und in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung A8 His ist, in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B10 Asp ist, oderX in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist oder X in Stellung B28 Asp ist.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihnen bis zu vier Aminosäurereste am N-terminalen Ende der B-Kette und/oder bis zu fünf Aminosäurereste am C-terminalen Ende der B-Kette fehlen.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ihnen der B (D-Aminosäurerest und/ oder der B (30)-Aminosäurerest fehlt.