DD296101A5 - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers gegen 5-brom-substituiertes uridin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikoerpers (mAk) gegen 5-Brom-substituiertes Uridin (BrU). Durch Immunisierung von Maeusen mit Bromuridin-ovalbumin und Fusion der Milzzellen mit Mausmyelomzellen wird die Hybridomzellinie H-CB-BRU-1 (ZIM 0503) gewonnen und daraus der mAk CB-BRU-1. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Antikoerper; monoklonale Antikoerper, mAk; 5-Brom-substituiertes Uridin (BrU) Immunisierung; Maeuse; Hybridzellen; H-CB-BRU-1 (ZIM 0503); Medizin; Diagnostik}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (mAk) gegen 5-Brom-substituiertes Uridin (BrU). BrU gehört zur Klasse der 5-Halogen-substituierten Uridine und kann als Thymidinanalogon in Desoxyribonukleinsäure (DNS) eingebaut werden. Anwendungsbeispiele ergeben sich aus dem Einsatz des mAk zur Identifizierung der DNS-Synthese in Zellen mittels Immunfluoreszenz oder Immunperoxidasetechnik (Gratzner et al., 1976, J. Histoch. Cytoch. 24,34) oder bei der in situ-Hybridisierung zum Nachweis spezifischer DNS-Sequenzen unter Verwendung von BrU-markierten Sonden (Jirikowsky et al., 1989, Histoch., 91, 51-53).
Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische und veterinärmedizinische Diagnostik sowie die Molekularbiologie.
Die Herstellung muriner mAk ist als technisches Problem gelöst. Das Prinzip wurde erstmalig von G. Köhler und C. Milstein publiziert (Nature, 1975,256,495). Die Autoren beschrieben ein Verfahren zur somatischen Fusion Ak-bildender Zellen aus der Milz immunisierter Mäuse mit Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie für die Herstellung von Hybridomen, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale Antikörper produzieren. Dieses biotechnologische Prinzip wird (modifiziert) bis heute breit angewendet. So gelang es U.Karten und Mitarbeitern, die Methode der Elektrofusion erfolgreich für die Herstellung von Hybridomen einzusetzen (Eur. J. Cane. Oncolog. 21,1985,1392). Auch die Anwendung des Verfahrens auf die Herstellung von murinen mAk gegen BrU ist bekannt (Traincard et al., 1983, Ann. Immunol. [Inst. Past.] 134 D, 399). Für die Charakterisierung der DNS-Synthese in Zellen werden vor allem (3H)-Thymidin und andere radioaktiv markierte Precursoren eingesetzt (Taylor et al., PNAS 43 [1957], 122). Die Quantifizierung erfolgt autoradiografisch oder mittels Scintillationsanalyse. Die Methode der Autoradiografie erlaubt die Bestimmung der DNS-Synthese einzelner Zellen, ist aber aufgrund der mehrere Tage bis Wochen andauernden Exponierung für diagnostische Untersuchungen nicht geeignet. Bei der Scintillationsanalyse wird die DNS aus einer Vielzahl von Zellen extrahiert und die gesamte eingebaute Radioaktivität ermittelt. Somit ist eine Charakterisierung der Replikationsfrequenz einzelner Zellen nicht möglich. Alternativen für die Beurteilung der DNS-Synthese ergeben sich aus der Herstellung und Verwendung chemischer Analoga des Thymidins, wie 5-Brom-2-desoxyuridin.
Spezifische Antikörper gegen BrU wurden erstmals im Kaninchen von Sawicki et al. (Science, 1977,174,70) hergestellt. Die Kreuzreaktivität dieser Antikörper mit Thymidin wirkt sich dabei nachteilig für immuncytochemische Untersuchungen der DNS-Replikation aus (Gratzner et al., Exp. Cell. Res., 1975,95,98).
Im Zusammenhang mit der Etablierung und immunologischen Charakterisierung von mAk gegen BrU verweisen verschiedene Autoren auf deren spezifisches Bindungsverhalten. Danach erfolgt die Bindung des Antikörpers nur an die einzelsträngige Form der BrU-substituierten DNS (Porstmann, T. et al., J. Immunol. Meth., 1985,82,169).
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung muriner monoklonaler Ak, die für den Aufbau von empfindlichen Testsystemen zur Quantifizierung von BrU in poly-BrU-Einzelsträngen geeignet sind und die dann in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in anschließenden Verfahrensschritten mAk gegen BrU isoliert werden können. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß Mäuse mit Bromuridin-ovalbumin immunisiert werden, die Milzzellen gewonnen, mit Mausmyelomzellen fusioniert und Hybridomzellen - H-CB-BRU - selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die murinen mAk CB-BRU isoliert werden.
Im einzelnen werden Mäuse vom Balb/c-Stamm mit einem 5-Bromuridin-Ovalbumin (BrU-OVA)-Konjugat nach einem der Erfindung gemäßen Schema immunisiert. Als vorteilhaft erwieß sich die Verwendung von 8 bis 10 Wochen alten männlichen Balb/c-Mäusen. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikationen des Antigens über einen Zeitraum von 22 Wochen.
Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Mäuse zunächst mit einer Dosis von 50μg BrU-OVΑ-Maus in komplettem Freund'schen Adjuvans intraperitoneal immunisiert werden. Die letzte Immunisierung erfolgt erfindungsgemäß mit 100μg BU/OVA/Maus in Phosphatpuffer intravenös. Aus Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wird 5 Tage nach der letzten Immunisierung durch Gewebehomogenisierung eine Einzel-Zell-Suspension hergestellt.
Als Fusionspartner für diese Zellen werden Maus-Myelomzellen der Linie P3X63 Ag8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123,
548) verwendet, die in RPMM640 Zellzuchtmedium (Moore, H. J., in vitro6,99-100,1970), ergänzt mit 10%fetalem Kälberserum (FKS), kultiviert werden.
Nach dem Mischen der Zellsuspensionen (Milzlymphozyten:Myelomzellen im Verhältnis 5:1) werden die Zellen dreimal in Mannitol-Lösung gewaschen und mit zwei 6,6kV/cm (5us) Rechteckimpulsen nach bekanntem Verfahren fusioniert (Glaser et al.. Stud, biophys. 130,1989,201). Anschließend werden die Zellen in Subkulturen aufgeteilt und in einem Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-(HAT)-Selektionsrnedium (Litterfield et al., Science, 1964,145, 709) kultiviert. Damit können nicht fusionierte Zellen der Myelomlinie eliminiert und erfindungsgemäß Hybridzellen selektioniert werden, die Ak gegen BrU produzieren. Die Detektion Ak-spezifischer Zellkulturen erfolgt im ELISA. Primärzellinien mit spezifischer Ak-Produktion werden nach dem Grenzverdünnungsprinzip kloniert und subkloniert, bis mit statistischer Sicherheit Hybridoma erhalten werden, die stabil und mit bisher nicht beschriebener hoher Effizienz mAk gegen BrU sezernieren. Diese Hybridoma werden als H-CB-BRU bezeichnet.
Etabliert wurde der Hybridomklon H-CB-BRU-1. Der Klon H-CB-BRU-1 ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie (ZIM) der AdW, Berlin-Buch, unter der Nummer ZIM-0503 hinterlegt worden. Die hohe Antigenbindungsaffinität erlaubt den Einsatz der mAk zu diagnostischen und molekularbiologischen Zwecken. Die optimalen Epitope der mAk konnten hinsichtlich der Größe der poly-BrU-Stränge (η χ BrU; η = 1—10) charakterisiert werden.
Es liegen experimentelle Erfahrungen bei der Ascitesproduktion in Pristan-behandelten Balb/c-Mäusen vor. Auf diese Weise läßt sich aus der beschriebenen Hybridomkultur der mAk CB-BRU-1 in großen Mengen gewinnen. Durch verschiedene biochemische und immunchemische Verfahren lassen sich die Ak bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung einzelner Testverfahren können die Ak mit Enzymen (z. B. Peroxidase) markiert werden. Weiterhin lassen sie sich biotinilieren bzw. für Reinigungsverfahren an bestimmte Trägermaterialien koppeln.
Ausführungsbeispiele
Über einen Zeitraum von 5 Monaten werden 4 Mäuse zunächst mit jeweils 80 μΙ BrU-OVA in komplettem Freund'schen Adjuvans immunisiert. Die Boosterungen erfolgen aller 4 Wochen mit jeweils 50μg BrU-OVA in inkomplettem Freund'schen Adjuvans. Nach der letzten Immunisierung mit ЮОцд Antigen/Maus (intravenös) werden pro Tier ca. 2 x 108 Milzzellen isoliert. Diese werden durch zwei 6,6 kV/cm (5 \is) Rechteckimpulse mit 2 x 107 Myelomzellen (P3 X63 Ag 8.653) fusioniert. Nach verschiedenen Waschschritten werden die Zellen inSe-well-Flachboden-Zellkulturplatten mit 106 Milzzellen in 150цІ/Каѵііаі ausplattiert. Als Zellzuchtmedium wird RPM11640 mit 10% FKS (hitzeinaktiviert) eingesetzt. Am nächsten Tag werden 50 μΙ 4fach konzentriertes HAT-Selektionsmedium pro well zugesetzt. Nach 14 Tagen werden die Primärkulturen mit einem spezifischen ELISA hinsichtlich der Produktion spezifischer Ak gegen BrU untersucht. Es werden die Primärkulturen für die weitere Klonierung ausgewählt, deren Ak im ELISA ausschließlich mit BrU-OVA reagieren (Beispiel 3). Nach dem angegebenen Verfahren können bis zu 7% der Primärkulturen spezifische Ak produzieren. Die positiven Zellkulturen werden auf Peritonealmakrophagen der Maus nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und rekloniert. Auf diese Weise werden monoklonale Zellinien mit einer spezifischen Antikörperproduktion gegen BrU erhalten.
Die klonierte Zellinie mit spezifischer Ak-Produktion gegen BrU wird in RPM11640/10% FKS in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2-Gehalt kultiviert. Durch eine schrittweise Adaptation lassen sich diese Zellen auch in Kulturmedien mit nur 2-5% FKS-Anteil züchten. Die Zellen werden in Zellkulturflaschen vermehrt. Mit Verdünnungsraten von bis zu 1:10 kann das Kulturvolumen expandiert werden. Die Massenproduktion der Ak erfolgt in Rollerflaschen. Eine Beschreibung der In-vitro-Zellkultureigenschaften der etablierten Hybridomkultur ist in Tabelle 1 angegeben.
Die monoklonale Hybridomzellinie wird in Zellkulturflaschen (V: 275 ml; NUNCLON, Kamdtrup, Dänemark) auf eine Zellzahl von 1 x 107-2,5 x 107 vermehrt. Die Zellen werden abzentrifugiert und in Phosphat-gepufferter isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert. Je 1 ml Suspension mit einer optimierten Zellzahl wird Balb/c-Mäusen intraperitoneal appliziert, die 8 Tage vorher mit 1 ml Pristan behandelt worden waren. Nach 5-14 Tagen zeigt die Bauchschwellung den Beginn der Ascitesproduktion an. Unter den gegebenen optimalen Bedingungen für die In-vivo-Gewinnung erhält man eine Ig-Konzentration von 18,4mg/ml Ascites.
Die nach der Fusion erhaltenen Primärkulturen werden im ELISA auf spezifische Ak untersucht. Alle Kulturen werden gleichermaßen aufihre Reaktivität mit BrU-OVA, OVA und Thymidin-OVA getestet. Damit werden nur die Primärkulturen für die weitere Klonierung und Reklonierung ausgewählt, deren Ak eine Spezifität für BrU aufweisen. Mit der Bestimmung der Affinitätskonstanten dieser Klone gegenüber verschiedenen Antigenen erfolgt eine umfassende Charakterisierung des immunologischen Bindungsverhaltens dieser Ak im Hinblick auf deren Anwendungsmöglichkeiten (Tab.2).
Tab.1
Zeit (0...24)
Zell-Konzentr. (106ml)
Ak-Konzentr. (pg/ml)
Wachstum + Produktion CB-BRU1
total
relative (pg/106cells)
7. Tag (ungefüttert)
0,0 3,7 4,7 5,7 6,7 7,7 7,7
0,020 0,052 0,100 0,200 0,260 0,133 0,260
0,0 3,8 5,7 7,5 8,5 10,4 7,4
3,77 1,95 1,80 1,02 1,86
31,88 27,00 12,70 4,47 10,00
Tab.2 Affinitätskonstanten des CB-BRU-1 Ak
Antigen
Affinitätskonstante
| ATP | niedrig |
| dCTP | niedrig |
| dTTP | niedrig |
| Bru | 3,25x10"5 |
| T+2BrU | 4,10x10-" |
| T + 8BrU | 6,70x10"7 |
| T + 10BrU | 4,25 XiO'6 |
| PoIy(A) | niedrig |
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen 5-Brom-substituiertes Uridin (BrU) durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit б-Вгот-г-игіаіп-оѵаІЬитіп (BrU-OVA) und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit Zellen аегМаивтуеІотгеІІіпіеРЗХбЗНСв/ббЗ, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellinie H-CB-BRU-I (ZIM-0503) selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand der monoklonale Antikörper CB-BRU-1 isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen BrU-OVA 8 bis 10 Wochen alten männlichen Mäusen über einen Zeitraum von 22 Wochen mehrmals appliziert und die letzte Gabe des Antigens 5 Tage vor der Milzentnahme erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper CB-BRU-1 markiert, z. B. mit Peroxidase, biotiniliert und als Festphasenantikörper immobilisiert wird.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD34024890A DD296101A5 (de) | 1990-04-27 | 1990-04-27 | Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers gegen 5-brom-substituiertes uridin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD296101A5 true DD296101A5 (de) | 1991-11-21 |
Family
ID=5618185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD34024890A DD296101A5 (de) | 1990-04-27 | 1990-04-27 | Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers gegen 5-brom-substituiertes uridin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD296101A5 (de) |
-
1990
- 1990-04-27 DD DD34024890A patent/DD296101A5/de not_active IP Right Cessation
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