DD271916A1

DD271916A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen hbsag

Info

Publication number: DD271916A1
Application number: DD31560288A
Authority: DD
Inventors: Roland Grunow; Sigbert Jahn; Baerbel Porstmann; Elke Effenberger; Tomas Porstmann
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1988-05-09
Publication date: 1989-09-20
Also published as: DD271916B5

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Oberflächenantigene des Hepatitis-Virus (HBsAg). Durch Immunisierung von Mäusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzelllinie werden die Hybridomzellen H-CB-HBsA, -B, -E, -F, -93 (ZIM 0276 bis 0280) und daraus die entsprechenden monoklonalen Antikörper CB-HBsA, -B, -E, -F und -93 erhalten. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Antikörper, monoklonale Antikörper, Antigen, Hepatitis-Virus, HbsAg, Immunisierung, Mäuse, Hybridzellen, Medizin, Diagnostik}

Description

Die Hybridome werden als H-CB-HBs bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-CB-HBsA, -93, -E, -F und -B. Diese

fünf Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch, unterfolgenden Nummern registriert:

H-CB-HBsA als ZIM 0276 H-CB-HBsB als ZIM 0277

ri-CB-HBsE als ZIM 0270

H-CB-HBsH als ZIM 0279 und H-CB-HBs93 als ZIM 0280. Die Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vitro und in vivo. Im ersten Fall werden die Zellen kontinuierlich durch Erweiterung des Zellkulturvolumens bis zu einer Menge erweitert, die als Inokulom für einen geeigneten Bioreaktor ausreichend ist. In unserem Fall hat sich eine Erweiterung über Rollerflaschenkulturen

und die Verwendung eines Air-Iift-Bioreaktors als günstig erwiesen. Hierbei können im Zellkulturüberstand Antikörper in

Konzentrationen bis zu 300 μΙ/ml erreicht werden. Irn zweiten Fall werden die Zellen aus der Zellkultur auf eine Konzentration von 2-10 χ 10⁶/ml gebracht und in Pristan-

vorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nach etwa 8-24 Tagen lassen sich durch Punktionbis zu 10ml Aszitesflüssigkeit gewinnen, die bis zu 50mg/ml spezifischen Antikörper enthalten.

Auf diese Weise werden aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper CB-HBsA, CB-HBsB, CB-HBsE, CB-HBsF

und CB-HBs93 gewonnen.

Durch verschiedene biochemische bzw. immunchemische Verfahren lassen sich die Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren können die Antikörper mit Enzymen (z. B. mit Peroxidase) markiert werden. Sie können außerdem biotiniliert oder für Reinigungsverfahren an Trägermaterialien gekoppelt

werden.

• Anwendungsbeispiele

Beispiel 1

Über einen Zeitraum von 6 Monaten werden 5 Mäuse mit jeweils 50μρ/ΓηΙ gereinigtem HBsAG in komplettem Freund'schen Adjuvanz immunisiert. Die Boosterungen erfolgen alle 6 Wochen. Nach der letzten Immunisierung mit 150 Mg/ml Antigen intravenös werden 2 χ 10^s Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1500 mit 4 x 10^s Myelomzellen P3 X63Ag8/653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Zellkulturplatten mit 10⁵ Zellen/well in 100μΙ ausplattiert. Das Standardzellkulturmedium besteht aus RPM11640 mit 10% FKS. Am nächsten Tag werden 100μΙ des Doppelt konzentrierten HAT-Mediums zugesetzt. Nach einer Woche werden 50 μΙ HAT-Medium pro well zugegeben. Nach 14 Tagen werden die Primärkulturen mit einem hochspezifischen EIA hinsichtlich HBS- spezifischer Antikörper geprüft. Nach dem angegebenen Verfahren können bis zu 20% der Primärkulturen spezifische Antikörper gegen HBsAg produzieren. Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmakrophagen von der Maus (10Vwell) nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und rekloniert. Auf diese Weise werden monoklonale Zellinien mit spezifischer anti-HBsAg Antikörperproduktion erhalten.

Beispiel 2

Die klonierten Zellinien miv spezifischer Antikörperproduktion gegen HBsAg werden im Standardkulturmedium gezüchtet in einer feuchten Atmosphäre mit einem Anteil von 5% CO₂. Durch schrittweise Adaption lassen sich diese Zellen auch in Medien mit 2-5% FKS-Anteil züchten. Diese Zellen werden in Zellkulturfiaschen vermehrt. Mit Verdünnungsraten von 1:10 kann das Zellkulturvolumen erweitert werden. Die Massenproduktion der Antikörper erfolgt in Rollerflaschen mit einem Volumen von 500ml oder anschließend in einem Air-Iift-Bioreaktor mit Volumina bis zu 501.

Beispiel 3

In Zellkulturflaschen (Volumen 2!5OmI, NUNC) werden die monoklonalen Hybridome auf eine Zellmenge von 10⁷-2,5 χ 10⁷ gezüchtet. Die Zellen werden zweimal in isotonischer Phosphatpufferlösung gewaschen und anschließend in 5 ml der gleichen Lösung aufgenommen. Je 1ml dor Zellsuspension wird in 8 Tage vorher mit 1ml Pristan-behandelte Mäuue (Balb/c) Lp. appliziert. Nach etwa 8-14 Tagen wird die Aszitesproduktion anhand der Bauchschwellung bei den Mäusen sichtbar. 3-2OmI Aszitesflüssigkeit mit einem spezifischen Antikörpergehalt von 2-20mg/ml können pro Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgt nach bekannten Verfahren.

Beispiel 4 Nach dem beschriebenen Schema wurden Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen HBsAg gewonnen,

die mit H-CB-HBsA, -93, -E, -F und -B bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden für die Optimierung des Verfahrens zur

Herstellung der entsprechenen Antikörper charakterisiert (s. Tab. 1). Die Antikörperspezifitäten der durch die genannten Zellinien produzierten Antikörper sind in Tabelle 2 aufgeführt.

	Verdop	Ig-Produk-	Aszites-	Ig-Konzen-	-3- 271916
	plungs-	ton (pg/	menga/Maus	trationim
	zeit (h)	24h/10^e	bei5>:10^e	Aszites	IgB-Subtyp
		Zellen)	appl. Zellen	(mg/ml)
			(ml)
Tabelle 1: Charakterisierung der HybridomzeHinion mit monokionaler Antikörperproduktion gegen HBsAg	18	20,5	10	6,0
Klon	20	68,9	12	22,2
	36	97,0	25	3,3	IgG 2 a
	20	45,0	10	8,5	IgGI
	18	49,5	12	21,5	IgGI
	IgG 1
H-CB-HBsA	IgG 2 b
H-CB-HBsE
H-CB-HBsF
H-CB-HBsB
H-CB-HBS93

Tabelle 2: Epitopepezifitäten der monoklonslen CB-anti HBsAg¹ Antikörper

Bezeichnung

Epitopspezif ität

CB-HBsA und

CB-HBs93 CB-HBsF

CB-HBsE

CB-HBsB

Epitop auf dem S-Antigenbereich, Konformationsdeterminante

1.) Epitop auf dem S-Antigenbereich,

Konformationsdeterminanie 2.) Epitop auf dem prJi-S-Antigenbereich, Sequenzdeterminante, Aminosäurebereich

120-145

Epitope auf dem prä-G-Antigenbereich, Sequenzdeterminanten, Aminosäurebereich 120-145

Claims

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die verschiedene Strukturen des Heptatis-B-Virus-Oberflächenantigens (HBsAg) erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit HBsAg und Immortalisierung ihrer Milzlympho jyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellen H-CB-HBsA (ZIM 0276), H-CB-HBsB (ZIM 0277), H-CB-HBsE (ZIM 0278), H-CB-HBsF (ZIM 0279) und H-CB-HBs93 (ZIM 0280) selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die monoklonalen Antikörper CB-HBsA, CB-HBsB, CB-HBsE, CB-HBsF und CB-HBs93 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse an 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen durch Applikation des Antigens dergestalt vorgenommen wird, daß zunächst alle 6 Wocher, eine intraperitoneale Gabe des Antigens über einen Zeitraum von 8 bis 12 Monaten erfolgt und die letzte Gabe intravenös vorgenommen wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

D>6 Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Oberflächenantigene des Hepatites-Virus (HBsAg). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, monoklonal Antikörper herzustellen. Erstmalig haben Köhler und Milstein (Nature, 1975,256,495) durch somatische Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie Hybridome erzeugt, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale Antikörper von der Maus gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits auch monoklonale Antikörpergegen Determinanten des HBsAg erzeugt worden (A. H.Goodal, G. Janossy, H.C.Thomas, Eur. Pat. Appl. EP 0038642; A. Budkowska, M. M. Riottot, P. Dubreuil, Y. Lazizi, C.Brechot, E. Sobczak, M. A. Pelit, J. Pillot, J. Med. Virol., 1986,20,111; Y.Eda, T.Maeda,K.Nishyama, A.Tashiro,Eur. Pat. Appl.EP 0179483(CLC 12 P 21/00,Wands, J.R.,Bruns, R.R.,Carlson, H.J.,Ware, A., Men.tore, J.E., Isselbacher, K.J., Proc. Natl. Acad. Sei., 1982,79,1277-1281; Peterson, D.L., Paul, D.A., Lam, J.,Tribby, I.I.E., Achord, D.T., J. Immunol., 1984,132,920-927). Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper vom Typ CB-HBsA, -93, -E, -F und B sezernieren.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, der medizinischen Diagnostik monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum Aufbau eines Testsystems zur Erkennung von Oberflächenantigenen des Hepatitis-B-Virus geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper gogen verschiedene Determinanten des HBsAg isoliert werden können. Die Hybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigem Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar sein und für eine Reinigung ausreichend hohe Mengen an monoklonalen Antikörpern sezernieren. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Baib/c mit einem hochgereinigten HBsAg aus positiven Patientenseren (T. Porstmann et al., Dt. Gesundheitswesen, 1980,35,1587-1593) nach einem bestimmten, erfinderischen Schema immunisiert wurden. Vorteilhaft ist die Verwendung von 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Mäuse zunächst etwa alle 6 Wochen eine Dosis von 50pg des gereinigten HBsAg in komplettem Fround'schen Adjuvanz intraperitoneal über einen Zeitraum von 8-12 Monaten appliziert bekamen. Die letzte Immunisierung erfolgte mit 100-150Mg des Antigens in Phosphatpuffer intravenös.'Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurde 5 Tage nach der letzten Immunisierung in an sich bekannter Weise eine Zollsuspension hergestellt.

Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3 X63 Ag 8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123, 1548-1550) verwendet, die in einem Zellzuchtmedium RPM11640, supplemented mit 10% fetalem Kälberserum (FKS), kultiviert wurden.

Die Zellfusion wurde nach Vermischen beider Fusionspartner und ihrer Sedimentation unter Verwendung von Polyethlyenglykol induziert. Anschließend werden die Zellen in eine Vielzahl von separaten 200ul Kulturen aufgeteilt. In einen* Zellkulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält (Littlefield, Science, 1964,145,709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgeniäß Klone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgt dadurch, daß in dem zellfreien Überstand der angelegten Zellkulturen durch ein geeignetes Verfahren (z. B. einen*, spezifischen Enzymimmunoassay (ΕΙΛ)) sezernierte Antikörper gegen HbsAg nachgewiesen werden. Die Primärzellkulturen mit spezifischer Antikörperproduktion werden Moniert und sooft rekloniert, bis monoklonale Subkione erhalten werden, die stabil und in hohen Quantitäten Antikörper gegen HBsAg sezernieren.