DE68929060T2 - Synthese von 1,2-Dioxetanen und Zwischenprodukte dafür - Google Patents

Synthese von 1,2-Dioxetanen und Zwischenprodukte dafür

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Herstellung von 1,2-Dioxetanen und ihren Zwischenprodukten, die bei Assayverfahren verwendet werden können, wobei ein Glied eines spezifischen Bindungspaars mit einer optisch nachweisbaren Reaktion, die durch Enzymolyse einer enzymspaltbaren Gruppe in dem 1,2-Dioxetanmolekül hervorgerufen wird, detektiert und quantitativ bestimmt werden kann.
    • Beschreibung des verwandten Stands der Technik
  • 1,2-Dioxetane, cyclische organische Peroxide, deren Zentralstruktur ein viergliedriger Ring, enthaltend ein Paar von benachbarten Kohlenstoffatomen und ein Paar von benachbarten Sauerstoffatomen (eine Peroxidbindung), ist, sind eine bekannte Klasse von Verbindungen, wurden aber in der Vergangenheit selten verwendet. Wegen ihrer inhärenten chemischen Instabilität zeigen einige 1,2-Dioxetane eine chemilumineszierende Zersetzung bei bestimmten Bedingungen, beispielsweise bei der Einwirkung von Enzymen, wie es in der gleichzeitig anhängigen, ebenfalls Bronstein zugeordneten U. S. Patentanmeldung Serial Nr. 889 823, mit dem Titel "Method of Detecting a Substance Using Enzymatically-Induced Decomposition of Dioxetanes" und der gleichzeitig anhängigen, ebenfalls Bronstein et al. zugeordneten U. S. Patentanmeldung Serial Nr. 140 035, mit dem Titel "Dioxetanes for Use in Assays", beschrieben wird, deren Offenbarung expressis verbis auch hier gelten soll. Die Lichtmenge, die während einer solchen Chemilumineszenz emittiert wird, ist ein Maß für die Konzentration einer lumineszierenden Verbindung, die ihrerseits ein Maß für die Konzentration seines Vorläufer-1,2-Dioxetans ist. Durch Messung der Intensität und Dauer dar Lumineszenz kann die Konzentration des 1,2-Dioxetans (und somit die Konzentration der zu analysierenden Substanz, d. h. der Spezies, die an das 1,2-Dioxetanglied des spezifischen Bindungspaares gebunden ist) bestimmt werden. Die geeignete Wahl der Substituenten an den 1,2-Dioxetanring erlaubt eine Einstellung der chemischen Stabilität des Moleküls, welches seinerseits ein Mittel zur Kontrolle des Beginns der Chemilumineszenz ermöglicht, wodurch der Nutzen des chemilumineszenten Verhaltens von solchen Verbindungen für praktische Zwecke, d. h. in einem Chemilumineszenz-Immunoassay und bei einem DNA-Sondenassay, verbessert wird.
  • Die Herstellung von 1,2-Dioxetanen durch Photooxidation olefinischer Doppelbindungen ist bekannt. Es besteht jedoch ein Bedarf für eine zweckdienliche allgemeine Synthese von substituierten 1,2-Dioxetanen aus olefinisch ungesättigten Vorläufern, die sich von leicht verfügbaren oder herstellbaren Ausgangsmaterialien über leicht handhabbare Zwischenprodukte ableiten. In diesem Zusammenhang besteht ein besonderer Bedarf für ein im Handel nützliches Verfahren zur Herstellung substituierter 1,2-Dioxetane der Formel:
  • aus Vorläufern des Enolether-Typs:
  • worin T, R, Y und Z die im folgenden gegebenen Definitionen besitzen und Z Wasserstoff (wobei in diesem Fall das Dioxetan thermisch durch Brechen der Sauerstoff-Sauerstoffbindung gespalten werden kann), eine chemisch abspaltbare Gruppe, wie eine Hydroxylgruppe, eine Alkanoyl- oder Aroylestergruppe, oder eine Alkyl- oder Arylsilyloxygruppe oder eine enzymspaltbare Gruppe, enthaltend eine Bindung, die durch ein Enzym spaltbar ist, wobei eine elektronenreiche Gruppierung gebildet wird, die an einen Chromophoren Y gebunden ist, beispielsweise eine Bindung, die nach der Spaltung ein Sauerstoffanion, ein Schwefelanion, ein Amin oder ein Stickstoffanion und insbesondere ein Amidoanion, wie ein Sulfonamidoanion, ergibt, bedeutet.
  • Enolether können nach verschiedenen klassischen Verfahren, beispielsweise durch säurekatalysierte Eliminierung von Alkohol aus Acetalen [R. A. Whol, "Synthesis", S. 38 (1974)], gemäß Peterson- oder Wittig-Reaktionen von A1- koxymethylensilanen oder Phosphoranen mit Aldehyden oder Ketonen im basischen Medium [P. Magnus et al., Organometallics, 1, 553 (1982)] und durch Umsetzungen von Alkoxyessigsäuredianionen mit Ketonen, gefolgt von einer Propiolactonbildung und Eliminierung von CO&sub2; [G. Caron et al., Can. J. Chem., 51, 981 (1973)], hergestellt werden. Die O- Alkylierung von Ketonenolatanionen wird weniger oft als allgemeines präparatives Verfahren verwendet, bedingt durch die variablen Mengen der gleichzeitig gebildeten alpha-alkylierten Ketone, wobei das Ausmaß davon von dem Lösungsmittel der Base, dem Alkylierungsmittel und der Ketonstruktur abhängt (vergleiche H. O. House, "Modern Synthetic Reactions", S. 163-215 (Benjamin, 1965) und J. D. Roberts und M. C. Caserio, "Basic Principles of Organic Chemistry" (Benjamin, 1964)). Bei der Verwendung von Hexamethylphosphoramid (HMPA), einem bekannten karzinogenen Lösungsmittel, ist es höchstens möglich, Ausbeuten an O- Alkylierungsprodukt zu erhalten, die nicht über 70% lie gen. Außerdem ist die Trennung des Enolethers von dem Calkylierten Keton sehr schwierig.
  • Tetrahedron Letters, Band 28, Nr. 9, 1987, Seiten 935-938, betrifft das chemische und enzymatische Triggern von 1,2- Dioxetanen, insbesondere von Arylesterase-katalysierter Chemilumineszenz aus einem Naphthylacetat-substituierten Dioxetan.
  • EP-A-0 254 051 betrifft lichterzeugende 1,2-Dioxetane, beschrieben durch die Formel
  • worin ArOX ein Arylring, substituiert mit einer X- Oxygruppe bedeutet und A passive organische Gruppen bedeutet, die erlauben, daß das 1,2-Dioxetan Licht bildet, wenn es durch Entfernung von X getriggert wird. X ist eine chemisch labile Gruppe, die mittels eines Aktivierungsmittels entfernt werden kann. Die 1,2-Dioxetanverbindungen können unter Lichtbildung bei Raumtemperatur getriggert werden.
  • Tetrahedron Letters, Band 28, Nr. 11, 1987, Seiten 1159- 1162 betrifft ebenfalls das chemische und enzymatische Triggern von 1,2-Dioxetanen, insbesondere mit alkalischer Phosphatase katalysierter Chemilumineszenz aus einem Arylphosphat-substituierten Dioxetan.
  • Tetrahedron Letters, Band 28, Nr. 44, 1987, Seiten 5319- 5322 betrifft die Synthese von 1,2-Dioxetanen über eine Elektronentransfer-Oxygenierung. In dieser Literaturstelle wird angegeben, daß die Synthese thermisch stabiler 1,2- Dioxetane durch Umsetzung von Enolethern mit Tris-pbromphenylammoniumylhexachlorantimonat via Kettenoxygenie rungsreaktion die Bildung von Enoletherkationgruppen umfaßt.
  • Tetrahedron Letters, Band 28, Nr. 11, 1987, Seiten 1155- 1158 betrifft die Fluorid-induzierte Chemilumineszenz aus tert.-Butyldimethylsilyloxy-substituierten Dioxetanen. Insbesondere wird in dieser Literaturstelle die Herstellung von thermisch stabilen 1,2-Dioxetanen, die tert.- Butyldimethylsilyloxyarylgruppen tragen, beschrieben.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Seit den späten 60er Jahren sind Adamant-2-ylarylketone bekannt (Chem. Abst. 71: P80812V). Es finden sich jedoch in der Literatur keine Hinweise, sie zu O-alkylieren. Es wurde jetzt gefunden, daß die Reaktion dieser Ketone als Enolate mit reaktiven Alkylierungsmitteln, die "harte" Austrittsgruppen enthalten [vergleiche Fleming, I., "Frontier Orbitals and Organic Chemical Reactions", S. 40 (Wiley, 1976)], wenn sie in einem polaren, aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, 1,3-Dimethyl- 2-imidazolidinon, N-Methyl-2-pyrrolidinon und ähnlichen, oder einem Gemisch solcher Lösungsmittel durchgeführt wird, exklusiv eine O-Alkylierung ergibt. Die so erhaltenen Enolether können als zweckdienliche Zwischenprodukte bei der Synthese wasserlöslicher oder wasserverträglicher 1,2-Dioxetane verwendet werden. Solche Zwischenprodukte können zur Herstellung von Substraten verwendet werden, die mit Singulett-Sauerstoff (chemisch oder photochemisch erzeugt) unter Bildung von 1,2-Dioxetanen mit ausreichender Stabilität reagieren, die bei den darauffolgenden Assayverfahren, beruhend auf einer chemilumineszierenden Dioxetanzersetzung, nützlich sind. Dieses O-Alkylierungsverfahren gilt allgemein und ist daher auf andere Cycloalkylarylketonsubstrate ausdehnbar, die durch Reaktion des geeigneten sekundären Cycloalkylaldehyds mit einem Aryl-Grignard-Reagens, gefolgt von Oxidation des entste henden sekundären Alkohols mit Jones-Reagens, hergestellt werden können. Bevorzugt wird das Grignard-Reagens mit einem sekundären Cycloalkylnitril umgesetzt, worauf die saure Hydrolyse unter Bildung eines Retons über ein Imminsalz folgt. In allen Fällen enthalten die Ausgangsmaterialien und Produkte eine funktionelle Gruppe, die an ein sekundäres Kohlenstoffatom des Cycloalkylsystems gebunden ist, was im Falle von kondensiertem Polycycloalkyl-(beispielsweise Adamantyl-)Systemen an jeder Seite von einem Brückenkopfkohlenstoffatom flankiert ist.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neue synthetische Wege für enzymspaltbare 1,2- Dioxetanderivate zur Verfügung zu stellen.
  • Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung neuer chemischer Zwischenprodukte bei der Synthese von 1,2- Dioxetanen zur Verfügung gestellt werden.
  • Erfindungsgemäß sollen neue Zusammensetzungen, wie trisubstituierte Enoletherphosphate, die als synthetische Vorläufer für die 1,2-Dioxetane nützlich sind, wobei sich die Dioxetane enzymatisch in einer optisch nachweisbaren Reaktion zersetzen, zur Verfügung gestellt werden.
    • GENAUE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Unter den 1,2-Dioxetanen, die erfindungsgemäß hergestellt werden können, sind solche der Formel:
  • In dieser Formel bedeutet T eine stabilisierende Gruppe, die verhindert, daß sich die Dioxetanverbindung zersetzt, bevor die Bindung in dem labilen Ringsubstituenten, der an Y gebunden ist, absichtlich gespalten wird.
  • Die stabilisierende Gruppe ist eine kondensierte Polycycloalkylidengruppe, gebunden an das 3-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings über eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- oder eine Spirobindung, und besitzt zwei oder mehrere kondensierte Ringe, die je von 3 bis einschließlich 12 Kohlenstoffatome enthalten, beispielsweise eine Adamant-2-yliden- oder eine Adamant-2-ylgruppe, die zusätzlich ungesättigte Bindungen enthalten kann oder 1,2-kondensierte aromatische Ringe oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis einschließlich 12 Kohlenstoffatomen, wie tertiäre Butyl- oder 2-Cyanoethyl- oder eine Aryl- oder substituierte Arylgruppe, wie Carboxyphenyl, oder eine Halogengruppe, wie Chlor, oder eine Heteroatomgruppe, die eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkoxy- oder Aryloxygruppe mit 1 bis einschließlich 12 Kohlenstoffatomen, wie eine Ethoxy-, Hydroxyethoxy-, Methoxyethoxy-, Carboxymethoxy- oder Polyethylenoxygruppe, enthalten kann.
  • Das Symbol Y bedeutet eine lichtemittierende Fluorophorbildende, fluoreszierende Chromophorgruppe, die unter Bildung eines angeregten Energiezustandes Energie absorbieren kann, und daraus optisch nachweisbare Energie emittiert und in ihren ursprünglichen Energiezustand zurückkehrt. Irgendeine Kohlenstoffstellung in Y kann an den Dioxetanring gebunden sein.
  • Beispiele geeigneter Y-Chromophore umfassen:
  • 1) Phenylen und Phenylenderivate, beispielsweise Hydroxyphenyl, Hydroxybiphenyl, Hydroxy-9, 10-dihydrophenanthren;
  • 2) Naphthalin und Naphthalinderivate, beispielsweise 5- Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonsäure, Hydroxynaphthalin, Naphthalimide oder Hydroxynaphthalimide;
  • 3) Anthracen und Anthracenderivate, beispielsweise 9,10- Diphenylanthracen, 9-Methylanthracen, 9-Anthracencarboxyaldehyd, Hydroxyanthracene und 9-Phenylanthracen;
  • 4) Phodamin und Rhodaminderivate, beispielsweise Rhodole, Tetraethylrhodamin, Tetraethylrhodamin, Diphenyldimethylrhodamin, Diphenyldiethylrhodamin und Dinaphthylrhodamin;
  • 5) Fluorescein und Fluoresceinderivate, beispielsweise 4- oder 7-Hydroxyfluorescein, 6-Iodacetamidofluorescein und Fluorescein-5-maleimid;
  • 6) Eosin und Eosinderivate, beispielsweise Hydroxyeosine, Eosin-5-iodacetamid und Eosin-5-maleimid;
  • 7) Cumann und Cuxnarinderivate, beispielsweise 7-Dialkylamino-4-methylcumann, 4-Cyano-7-hydroxycumann und 4- Brommethyl-7-hydroxycumann;
  • 8) Erythrosin und Erythrosinderivate, beispielsweise Hydroxyerythrosine, Erythrosin-5-iodacetamid und Erythrosin-5-maleimid;
  • 9) Benzheteroazole und Derivate, beispielsweise 2- Phenylbenzoxazol, Hydroxy-2-phenylbenzoxazole, Hydroxy-2- phenylbenzthiazol und Hydroxybenzotriazole;
  • 10) Pyren und Pyrenderivate, beispielsweise N-(1-Pyren)- iodacetamid, Hydroxypyrene und 1-Pyrenmethyliodacetat;
  • 11) Stilben und Stilbenderivate, beispielsweise 6,6- Dibromstilben und Hydroxystilbene, Hydroxydibenzosuberen;
  • 12) Nitrobenzoxadiazole und Nitrobenzoxadiazolderviate, beispielsweise Hydroxynitrobenzoxadiazole, 4 -Chlor-7- nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, 2-(7-Nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)methylaminoacetaldehyd und 6-(7-Nitrobenz-2-oxa- 1,3-diazol-4-yl)aminohexansäure;
  • 13) Chinolin und Chinolinderivate, beispielsweise 6- Hydroxychinolin und 6-Aminochinolin;
  • 14) Acridin und Acridinderivate, beispielsweise N- Methylacridin, N-Phenylacridin, Hydroxyacridine und N- Methylhydroxyacridin;
  • 15) Acidoacridin und Acidoacridinderivate, beispielsweise 9-Methylacidoacridin und Hydroxy-9-methylacidoacridin;
  • 16) Carbazol und Carbazolderivate, beispielsweise N- Methylcarbazol und Hydroxy-N-methylcarbazol;
  • 17) Fluoreszierende Cyanine, beispielsweise DCM (ein Laserfarbstoff), Hydroxycyanine, 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien, 1-(4-Dimethylaminophenyl)-6-phenylhexatrien, die entsprechenden 1,3-Butadiene oder irgendein Hydroxyderivat der Diene oder Triene;
  • 18) Carbocyanin und Carbocyaninderivate, beispielsweise Phenylcarbocyanin und Hydroxycarbocyanine;
  • 19) Pyridiniumsalze, beispielsweise 4-(4-Dialkylaminostyryl), N-Methylpyridiniumsalze und Hydroxy-substituierte Pyridiniumsalze;
  • 20) Oxonole; und
  • 21) Resorofine und Hydroxyresorofine.
  • Die am meisten geeigneten Y-Chromophore sind Derivate von Benzol oder Naphthalin:
  • M&spplus; bedeutet ein Alkalimetall-, Ammonium- oder ein C&sub1;-C&sub7;- Alkyl-, Aralkyl- oder ein aromatisches quaternäres Ammoniumkation, (NR&sub4;)&spplus;, wobei R&sub4; eines oder alle von Alkyl, Aralkyl bedeutet oder einen Teil eines heterocyclischen Ringsystems bildet.
  • Das Symbol R bedeutet eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-unverzweigte oder verzweigte, substituierte oder nichtsubstituierte gesättigte oder nichtgesättigte Alkylgruppe, z. B. Methyl, Allyl oder Isobutyl; eine Heteroaralkyl- oder Aralkyl(einschließlich ethylenisch ungesättigte Aralkyl-)gruppe, z. B. Benzyl oder Vinylbenzyl; eine polynukleare (kondensierter Ring) oder heteropolynukleare Aralkylgruppe, die weiter substituiert sein kann, z. B. Naphthylmethyl oder 2-(Benzothiazol-2- yl)ethyl; eine gesättigte oder ungesättigte Cycloalkylgruppe, z. B. Cyclohexyl oder Cyclohexenyl; eine N-, O- oder S-Heteroatom-enthaltende Gruppe, z. B. 4-Hydroxybutyl, Methoxyethyl oder Polyalkylenoxyalkyl; eine Arylgruppe; oder eine enzymlabile Gruppe, die eine Bindung enthält, die durch ein Enzym spaltbar ist, um eine elektronenreiche Gruppierung, gebunden an den Dioxetanring, zu ergeben. Bevorzugt ist R eine Methyl- oder Ethylgruppe.
  • Eine oder mehrere der Komponenten T, R oder Y der Formel kann/können auch einen Substituenten enthalten, der die Wasserlöslichkeit des 1,2-Dioxetans verstärkt, wie eine Carbonsäure, Sulfonsäure oder ihre Salze, oder eine quaternäre Aminosalzgruppe.
  • R kann an Y gebunden sein, um eine fluorphorbildende Gruppe mit kondensiertem Ring zu bilden, die ihrerseits an das 4-Kohlenstoffatom des Dioxetans über eine Spiroverknüpfung gebunden ist, und die daher bei chemischer oder enzymatischer Dioxetanzersetzung zu einem angeregten Lactonfragment führt. Die benötigten Enolether werden durch intramolekulare O-Alkylierung von kondensierten Polycycloalkylarylketonenolaten durch einen anderen Substituenten erhalten, beispielsweise eine Toluolsulfonyloxyethylgruppe, in Übereinstimmung mit der hier dargelegten Verfahrensweise.
  • Y kann weiter mit einem oder mehreren elektronenabziehenden Gruppen, beispielsweise Perfluoralkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie Trifluormethyl; Alkyl- oder Arylsulfonyl, wie Methylsulfonyl; Halogen, wie Fluor oder Chlor; Cyano; Nitro; Alkoxycarbonyl, wie -COOEt; Alkanoyl, wie - COCH&sub3;; Amidosulfonyl, wie -SO&sub2;NHAr; oder mit einer oder mehreren elektronenliefernden Gruppen, wie einer verzweigten oder unverzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; einer Alkoxy- oder Aralkoxygruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, die kondensierte aromatische oder kondensierte heteroaromatische Ringe enthalten kann, die weiter mit Gruppierungen, die ein Heteroatom enthalten, substituiert sein können, beispielsweise 2-(5-Fluoresceinyl)ethoxy; eine Aryloxygruppe mit 1 bis 2 Ringen, die weiter substituiert sein kann, beispielsweise Phenoxy; eine verzweigt- oder geradkettige C&sub1;-C&sub7;-Hydroxyalkylgruppe, beispielsweise Hydroxymethyl oder Hydroxyethyl; eine Arylgruppe, die einen oder mehrere Hydroxysubstituenten oder Alkoxysubstituenten mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen enthält, beispielsweise 3,5-Diethoxyphenyl; oder eine Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Benzoxazol, Benzthiazol, Benzimidazol oder Benzotriazol, bedeuten.
  • Durch geeignete Modifizierung der T-, R- und Y-Gruppen der 1,2-Dioxetane kann die Stabilität der 1,2-Dioxetane und die Zersetzungsgeschwindigkeit der 1,2-Dioxetane variiert werden. Beispielsweise können die 1,2-Dioxetane an verschiedene Moleküle (beispielsweise Proteine oder Haptene) oder immobilisierende Träger (beispielsweise Polymermembranen) gebunden sein, und sie können ebenfalls Seitenkettengruppen von Homopolymeren oder Copolymeren darstellen.
  • Genauer umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 1,2-Dioxetanen die folgende Reaktionssequenz:
  • worin R¹ unabhängig irgendeiner der Substituenten, wie sie oben für R definiert wurden, bedeuten kann; W&supmin; ein Säureanion, wie ein Halogenid (beispielsweise ein Chlorid), bedeutet; und X und das "R-ylierungsmittel" im folgenden definiert werden.
  • Die Stufe 1, die den langsamen Angriff des aromatischen Grignard-Reagens an einem Nitril umfaßt, kann bei Rückflußbedingungen in verschiedenen Etherlösungsmitteln, wie Diethylether (34º), THF (67º) oder Ethylenglykoldimethylether (85º), durchgeführt werden. Obgleich die Reaktion zweckdienlich innerhalb eines Temperaturbereichs von 30ºC bis 85ºC durchgeführt werden kann, ergibt die Verwendung von THF bei Rückflußbedingungen eine optimale Reaktion mit Ausbeuten über 90%. Wie es dem Fachmann geläufig ist, ist die Verwendung einer analogen Organolithiumverbindung unter Ersatz des Grignard-Reagens bei dem obigen Schema möglich, es ist jedoch bekannt, daß THF und Organolithiumverbindungen (insbesondere n-Butyllithium, das Metall- Halogen-Austauschreagens) bei höheren Temperaturen unverträglich sein können. Man sollte daher auf die Methoden, die von Edwards et al., in der gleichzeitig anhängigen und dem gleichen Namen zugeordneten Patentanmeldung Serial Nr. 213 672, eingereicht 30. Juni 1988, beschrieben werden, zurückgreift. Die Reaktion eines kondensierten Polycycloaldehyds mit einer aromatischen Organolithiumgruppierung erlaubt den Aufbau einer ähnlichen Bindung in Diethylether innerhalb eines Temperaturbereichs von -60ºC bis 0ºC. Dieses Verfahren ergibt somit ein geeignetes Niedrigtemperaturgegenstück zu der Nitrilreaktion, wobei nur eine leichte ergänzende Oxidation durchgeführt werden muß, um bei dem gleichen Ketonprodukt anzukommen.
  • Stufe III wird am besten in den angegebenen Lösungsmitteln unter Verwendung von Natrium- oder Kaliumhydrid oder Kalium-tert.-butoxid als Base durchgeführt. Bei dieser Stufe werden reaktive Alkylierungsmittel verwendet, wobei ein kinetisches Produkt erhalten wird, und sie kann zweckdienlich innerhalb eines Temperaturbereichs von 0º bis 60ºC in Abhängigkeit von dem "R"-ylierungsmittel durchgeführt werden. Dimethyl- oder Diethylsulfat sind besonders nützliche und billige Reagentien, die zwischen 25ºC und 60ºC ein optimales Verhalten zeigen. Bei der Stufe IV kann die Phe noletherspaltung mit Natriumthioethoxid mit weichen Nukleophilen, wie Lithiumiodid, in Pyridin, das am Rückfluß erhitzt wird, mit Natriumcyanid in DMSO, das am Rückfluß erhitzt wird, oder Natriunisulfit in N-Methyl-2-pyrrolidinon, das am Rückfluß erhitzt wird, durchgeführt werden, wobei diese Reaktionen prinzipiell identisch sind, aber andere Nachteile vom technischen Standpunkt aus haben können.
  • Die Stufen V, VI und VII können, wie angegeben, getrennt oder in einem Vorgang durchgeführt werden. Das cyclische Phosphorichloridat wird nicht nur wegen seiner Monofunktionalität, Chemoselektivität und Enolether-verträglichen Schutzgruppenabspaltungsmöglichkeit verwendet, sondern ebenfalls wegen seiner Pseudorotation, es ist 10&sup6;fach reaktiver als die acyclischen Versionen. Wenn eine aromatische Hydroxylgruppe sterisch gehindert ist (beispielsweise in der Peristellung in einem polycyclischen aromatischen Ringsystem) oder wenn andere Substituenten den pKb oder die Nukleophilizität des Enoletheroxianions verringern, sind sinnvolle Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten möglich. In Benzol, THF, Diethylether oder DMF kann die Phosphattriesterbildung mit einer Lewis-Säure oder mit einem vorgebildeten Alkalimetallsalz mit allen angegebenen Phosphorochloridaten innerhalb eines Temperaturbereichs von -30º bis 50ºC durchgeführt werden.
  • Darauf folgen sollte, wenn ein reiner Mononatriumcyanoethylphosphatester gewünscht wird, die Ringspaltung mit Alkalicyanid in DMF oder DMSO in einem engen Temperaturbereich zwischen 15º und 30ºC durchgeführt werden. Bei einem Eintopf- oder in situ-Verfahren ist dies nicht wichtig, und der Bereich öffnet sich bis zu 60ºC am höheren Ende.
  • Es ist offensichtlich, daß man Phasenübertragungsverfahren unter Katalyse durch quaternäre Ammoniumionen oder Kronenether zur Erzeugung eines reaktiveren "nackten" Cyanids verwenden kann, und somit organische Lösungsmittel mit höherer Flüchtigkeit (beispielsweise CH&sub2;C&sub1;&sub2;) verwenden kann, wodurch die Aufarbeitung erleichtert wird. Alternativ gibt die direkte Verwendung von reinen quaternären Ammoniumcyaniden oder Sulfinaten unmittelbaren Zugang zu Phosphatzwischenprodukten oder Produkten, die assoziierte Gegenionen enthalten, und die nützlich sind, um die physikalischen Eigenschaften, wie die Löslichkeit, zu modifizieren. Solche Modifizierungen werden von den hier beschriebenen Verfahrensparametern mitumfaßt.
  • Beta-Eliminierungsverfahren an dem Cyanoethyl-substituierten Phosphatdiester können unter dem Einfluß eines großen Bereichs von Basen durchgeführt werden. Jedoch kann wäßriges Ammoniumhydroxid in großem Überschuß verwendet werden, bedingt durch die Leichtigkeit der Entfernung am Ende des Verfahrens. Die Spaltung kann innerhalb eines Temperaturbereichs von 25º bis 100ºC durchgeführt werden. Bei höheren Temperaturen muß man jedoch vorsichtig sein, um Verluste an gasförmigem Ammoniak zu vermeiden, und somit ist ein Hochdruckreaktor oder eine Bombe erforderlich. Der bevorzugte Temperaturbereich liegt bei 35º bis 55ºC, wobei das Phosphatmonoesterprodukt recht stabil ist, und wobei als geschlossenes System einfaches Glasgeschirr, das mit einem Septa mit Draht ausgerüstet ist, verwendet werden kann. Die Verwendung von Alkalimetall- oder quaternären Ammoniumhydroxiden bei dieser Stufe erfordert eine genaue Beachtung der Stöchiometrie, aber, wie oben erwähnt, können eine Vielzahl gemischter Gegenionphosphatsalze verwendet werden.
  • Obgleich chemische Verfahren für die Dioxetanbildung, beispielsweise Triethylsilylhydrotrioxid, oder Phosphitozonidquellen mit Singulett-Sauerstoff und Triarylamin- Gruppe-Kation-vermittelte Ein-Elektronoxidation in Anwesenheit von Triplett-Sauerstoff bekannt sind, ist die sensibilisierte Phötooxygenierung ein besonders zweckdienli ches und versöhnliches Verfahren, wenn reaktive Olefine als Substrate verwendet werden. Eine Vielzahl von Sensibilisierungsfarbstoffen kann mit Vorteil verwendet werden, wobei chlorierte Kohlenwasserstoffe eine bevorzugte Klasse von Lösungsmitteln sind. Die Reaktionen verlaufen schnell innerhalb eines Temperaturbereichs von -78º bis 25ºC.
  • Niedrige Temperaturen sind jedoch für diese relativ stabilen Dioxetane nicht erforderlich, und im Falle bestimmter Phosphatsalze wird die Löslichkeit verringert. Die Möglichkeit, die Gegenionen direkt über die synthetischen Methoden, die hier beschrieben werden, oder durch nachfolgende Ionenaustauschstufen zu manipulieren, erlaubt eine Flexibilität. Der bevorzugte Temperaturbereich für alle Photooxygenierungsstufen beträgt somit 0º bis 10ºC.
  • Die zuvor beschriebenen Sequenzen der Reaktionen kann Stufe bei Stufe mit Isolierung des Produkts bei jeder Reaktion durchgeführt werden. Jedoch können die Stufen VI (Alkylspaltung mit einem nukleophilen ansäuernden Anion, wie CN&supmin; oder organisches Sulfination) und die Stufe VII (Schutzgruppenabspaltung über eine Beta-Eliminierungsreaktion) mit Vorteil ohne Isolierung des Zwischenprodukt- Phosphatestersalzes durchgeführt werden. Ein solches Zwischenprodukt muß nur dann isoliert werden, wenn es gewünscht ist, seine Existenz zu bestätigen.
  • In den Stufen VI und VII der zuvor erwähnten Reaktionssequenz können das Kation M&spplus; in dem Salz, das bei der Stufe VI verwendet wird, und das Kation M&spplus; in der Base, die bei der Stufe VII verwendet wird, ein Alkalimetall- (beispielsweise Na&spplus;), ein Ammonium- oder ein C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-, Aralkyl- oder ein aromatisches quaternäres Ammoniumkation (NR&sub4;)&spplus;) sein (worin R&sub4; irgendeines oder alle von Alkyl, beispielsweise Ethyl, Aralkyl, beispielsweise Benzyl, bedeutet oder Teil eines heterocyclischen Ringsystems, beispielsweise Pyridinium, bildet), so daß die Produkte der Stufen VII und VIII wie folgt sind:
  • Zusätzlich kann das quaternäre Ammoniumkation über eine seiner quaternisierenden Gruppen mit einem polymeren Grundgerüst wie folgt:
  • verbunden sein, oder es kann selbst ein Teil eines polyquaternären Ammoniumsalzes bilden. M&spplus; kann ebenfalls eine fluoreszierende Oniumgruppierung, wie ein substituiertes Benzopyrillium- oder 2-[4-Dimethylaminostyryl]-N- methylpyridinium-Gegenion sein.
  • Innerhalb des Rahmens der zuvor beschriebenen Synthese betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
  • worin T= , R, R&sub1; und Y die oben gegebenen Definitionen besitzen, durch Umsetzung einer Verbindung der Formel:
  • worin T spirogebunden ist an das alpha-Kohlenstoffatom zu der Carbonylgruppe, mit einem Alkylierungsmittel (oder in allgemeineren Ausdrücken in Übereinstimmung mit der Defintion von R, einem "R-ylierungsmittel"), ausgewählt aus der Gruppe, die einschließt R-Sulfat, Toluolsulfonat ("Tosylat"), Methansulfonat ("Mesylat"), Trifluormethansulfonat ("Triflat") und Chlormethylether und Trialkyloxoniumsalze, in einem basischen polaren aprotischen Medium, beispielsweise einem Alkalimetallalkoxid in Dimethylsulfoxid.
  • Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
  • worin T, R und Y die oben gegebenen Defintionen besitzen, umfassend die Umsetzung einer Verbindung der Formel:
  • mit
  • worin X eine elektronegative Austrittsgruppe, wie ein Halogen (beispielsweise Chlor), bedeutet, in Anwesenheit einer Lewis-Base, wie eines tertiären Amins (beispielsweise Triethylamin), gelöst in einem aprotischen organischen Lösungsmittel, wie einer aromatischen Flüssigkeit (beispielsweise Benzol, Toluol) und Ether (beispielsweise Glym, Diglym) oder einem cyclischen Ether (beispielsweise Tetrahydrofuran ("THF")).
  • Gemäß einem Eintopfverfahren, bei dem die Synthese eines Phosphattriesters und die darauffolgende Schutzgruppenabspaltung zu einem Monoester in situ erfolgen, ist es vorteilhaft, ein Alkalimetallsalz der zuvor erwähnten Y-OH- Verbindung in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, unter Verwendung von NaH als Base (vergleiche folgendes Beispiel 8) herzustellen. Die Zugabe von Phosphorchloridat ergibt eine Lösung des Triesters, die direkt zu dem Monoester in dem gleichen Reaktionsmedium (&supmin;CN, NH&sub4;OH) umgewandelt werden kann.
  • Als Alternative zur Verwendung eines Halogenphosphats können die analogen Halogenphosphite; d. h. XPO&sub2;(CH&sub2;)&sub2;, mit der darauffolgenden Oxidation und Bestrahlung unter direkter Bildung eines Dioxetans verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft gemäß einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln:
  • oder
  • worin T, R und Y die oben gegebenen Bedeutungen besitzen, R&sup5; unabhängig irgendeiner der Substituenten, oben für R beschrieben, bedeutet, und R² und R³ je unabhängig Cyano, ortho- oder para-Nitrophenyl, ortho-, para- oder ortho, ortho'-Dinitrophenyl bedeuten, umfassend eine Reaktion mit der Verbindung der Formel:
  • worin X die oben gegebene Definition besitzt in Anwesenheit einer Lewis-Base, wie eines tertiären Amins (beispielsweise einem Trialkylamin) in einem aprotischen organischen Lösungsmittel, wie einer aromatischen Flüssigkeit (beispielsweise Benzol oder Toluol), einem Ether (beispielsweise Glym, Diglym) oder einem cyclischen Ether (beispielsweise THF).
  • Als Alternative zur Verwendung von Halogenphosphaten können die analogen Nor-Oxyverbindungen (d. h. die Halogenphosphite) verwendet werden, gefolgt von der Oxidation an dem Phosphor, Abspaltung der Schutzgruppe und Photooxida tion zu dem Dioxetan. Im Falle eines cyclischen Phosphits kann die Dioxetanbildung und die Oxidation am Phosphor gleichzeitig in Anwesenheit von ³O&sub2;/¹O&sub2;-Gemischen, die bei der Photooxidationsreaktion gefunden werden, durchgeführt werden. Bevorzugt wird die oben beschriebene Oxidation photochemisch durch Behandlung des Olefins mit Singulett- Sauerstoff (¹O&sub2;) in Anwesenheit von Licht durchgeführt. Das ¹O&sub2; addiert sich längs der Doppelbindung unter Bildung des Dioxetans.
  • Die Reaktion wird bevorzugt bei oder unter 0ºC in einem halogenierten Lösungsmittel, beispielsweise Methylenchlorid, durchgeführt. 02 kann unter Verwendung eines Photosensibilisators erzeugt werden. Als Photosensibilisatoren können polymergebundenes Rose Bengal (im Handel bekannt als Sensitox I und erhältlich von Hydron Laboratories, New Brunswick, N. J.) und Methylenblau (ein gut bekannter Farbstoff und pH-Indikator) oder TPP (vergleiche folgendes Beispiel 9) verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Dioxetane ergeben ein Verfahren zur Erzeugung von Licht in einem optisch nachweisbaren Assayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration einer bestimmten Substanz in einem Beispiel. Beispiele von solchen Assays umfassen Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen (beispielsweise Hormone, wie α- oder β-HCG, TSH, LH usw., mit Krebs assoziierte Antigene, wie AFP und CEA) (Enzym-Immunoassay); Enzymassays (beispielsweise alkalische Phosphatasen und α- oder β-D-Galactosidasen); chemische Assays zum Nachweis von Kationen, beispielsweise Natrium- oder Kaliumionen; und Nukleotid-Sondenassays zum Nachweis von beispielsweise Viren (beispielsweise HSVI, HTLV III, Hepatitisvirus, Cytomegalovirus) oder Bakterien (beispielsweise E. coli).
  • Wenn die nachweisbare Substanz ein Antikörper, ein Antigen oder eine Nukleinsäure ist, ist das Enzym, das fähig ist, die spaltbare Gruppe Z des Dioxetans abzupalten, bevorzugt an eine Substanz gebunden (d. h. eine Substanz, die spezifisch an die nachweisbare Substanz bindet), beispielsweise ein Antigen, ein Antikörper oder eine Nukleinsäuresonde. Bekannte Verfahren, beispielsweise die Carbodiimidkupplung, werden verwendet, um das Enzym an die spezifische Affinitätssubstanz zu binden. Die Bindung erfolgt bevorzugt über eine Amidverknüpfung.
  • Im allgemeinen werden die Assays wie folgt durchgeführt. Eine Probe, von der vermutet wird, daß sie eine nachweisbare Substanz (beispielsweise ein Antigen) enthält, wird mit einer gepufferten Lösung, die das Enzym gebunden an eine Substanz mit spezifischer Affinität für die nachweisbare Substanz (beispielsweise den Antikörper) enthält, behandelt. Die entstehende Lösung wird mit einer festen Phase, beispielsweise Antikörper-Bindungsperlen, behandelt, an die die andere Substanz mit der spezifischen Affinität, beispielsweise den Antikörper, gebunden ist. Nach Inkubation während einer bestimmten Zeit wird überschüssiges Enzym, das an die Substanz mit spezifischer Affinität gebunden ist, weggewaschen und ein 1,2-Dioxetan (Substrat) mit einer Gruppe Z, die durch das Enzymteil spaltbar ist, wird zugegeben. Das Enzym spaltet die Gruppe Z, wodurch Dioxetan veranlaßt wird, sich in ein Keton und Estergruppierungen zu zersetzen. Chromophor Y, der an den Ester gebunden ist, wird so angeregt und luminesziert. Die Lumineszenz wird nachgewiesen unter beispielsweise Verwendung einer Küvette oder eines Kameraluminometers als Anzeichen für die Anwesenheit der nachweisbaren Substanz in der Probe. Die Lumineszenzintensität wird gemessen, um die Konzentration der Substanz zu bestimmen.
  • Wenn die nachweisbare Substanz ein Enzym ist, ist eine spezifische Affinitätssubstanz (beispielsweise ein Antikörper) nicht erforderlich. Anstelle werden 1,2-Dioxetane mit einer Z-Gruppe, die durch das Enzym, das detektiert werden soll, spaltbar ist, verwendet. Daher umfaßt ein Assay für ein Enzym die Zugabe von 1,2-Dioxetanen zu der Enzymenthaltenden Probe und der Nachweis der entstehenden Lumineszenz als Anzeichen für die Anwesenheit und die Konzentration des Enzyms. -
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Einzelheiten, sie sollen sie jedoch nicht beschränken, und die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Modifizierungen und Variationen dieser Beispiele.
    • BEISPIEL 1 3-Methoxyphenyladamant-2-ylketon
  • Magnesiumspäne (1,64 g, 0,067 mol) werden in einen mit Flamme getrockneten Kolben unter Argon gegeben. Ein kleines Iodkristall und 7 ml trockenes Tetrahydrofuran ("THF") (frisch über Lithiumaluminiumhydrid destilliert) werden zugegeben. Eine Menge (7 ml, 0,055 mol) 3-Bromanisol wird mit einer Spritze zu der etwas gerührten Suspension des Metalls zugegeben. Eine exotherme Reaktion beginnt nach kurzem Erhitzen auf 50ºC. Der Kolben wird in einem Wasserbad bei Raumtemperatur gegeben, während THF (33 ml) in dünnem Strom aus einem Zugabetrichter zugegeben wird. Nachdem die exotherme Reaktion aufgehört hat, wird das Gemisch 45 Minuten am Rückfluß erhitzt. Eine Lösung aus 2- Cyanoadamantan (8,7 g, 0,054 mol; vergleiche "Organic Syntheses", 57, 8 (Wiley, 1977) oder von Leusen A. M. et al., J. Ora. Chem.; 42, 3114 (1977)) in 50 ml trockenem THF wird tropfenweise im Verlauf von 1,5 Stunden zu dem Grignard-Reagens, welches am Rückfluß erhitzt wird, zugegeben. Nach Erhitzen des Reaktionsgemisches auf Rückflußtemperatur über Nacht wird eine gelbe Suspension erhalten. Ether (50 ml) wird zugegeben, während der Kolben und sein Inhalt in einem Eisbad gekühlt werden. Konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (8 ml, 0,096 mol HCl) wird tropfenweise unter heftigem Rühren im Verlauf von 20 Minuten zu gegeben. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, mit Ether gewaschen und getrocknet, wobei 29 g Keteniminsalz als leicht schamottgefärbtes, nichthygroskopisches Pulver, enthaltend etwas Restmagnesium, erhalten werden. Das Salz wird in einem Geiüisch aus 90 ml Ethanol und 90 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure suspendiert und 3 Stunden am Rückfluß erhitzt, wobei während dieser Zeit das Gemisch beachtlich dünner wird. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wird der entstehende Feststoff aufgebrochen, durch Filtration abgetrennt, bis zur Neutralität gewaschen und getrocknet, wobei 13,65 g (93%ige Ausbeute, bezogen auf 2-Cyanoadamantan) des hellgrauen Ketons (Fp. 111-114ºC) erhalten werden. Die Dünnschichtchromatographie ("TLC") zeigt an, daß das Produkt für die darauffolgende Manipulierung ausreichend rein war (Rf 0,45; Whatman K5F CH&sub2;Cl&sub2; : Hexane 508 : 50). Die Umkristallisation aus Hexan ergibt die gewünschte Verbindung in Form von Prismakristallen (Fp. 113-115ºC). I. R. (CH&sub2;Cl&sub2;) 2900 cm&supmin;¹, 1670 cm&supmin;¹ (C=0), 1590 cm&supmin;¹, 1575 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,55-2,05 (m, 12H); 2,30 (s, 2H); 3,41 (s, 1H); 3,84 (s, 3H); 7,03-7,40 (m, 4H). Diese Werte bestätigen die folgende Struktur:
    • BEISPIEL 2 Methoxy- (3 -methoxyghenyl) methylenadamantan
  • Eine Menge von 3-Methoxyphenyladamant-2-ylketon (11,3 g, 0,042 mol), erhalten gemäß Beispiel 1, wurde in 90 ml Molekularsieb-getrocknetem (3 Å) Dimethylsulfoxid (DMSO) suspendiert. Zum Auflösen des suspendierten Feststoff s wurde erwärmt. Beim Kühlen auf Raumtemperatur unter Rühren bildete sich eine feine Suspension. Kalium-tert.-butoxid (8,5 g, 0,070 mol) wurde unter Argonatmosphäre zugegeben. Nach 5 Minuten wurde eine fast homogene orange Lösung erhalten, die in ein Wasserbad bei 50ºC gegeben wurde. Dimethylsulfat (4 ml, 0,042 mol) wurde tropfenweise mit einer Spritze im Verlauf von 10 Minuten zugegeben. Nach 15 Minuten weiterem Rühren wurden weitere 3,3 ml Dimethylsulfat (0,034 mol) auf gleiche Weise zugegeben. Danach wurde die farblose Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wurden 0,5 g K&sub2;CO&sub3; und 125 ml Eiswasser zugegeben, und das Gemisch wurde mit drei 50 ml Portionen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit drei Teilen Wasser, einmal mit 50 ml gesättigter wäßriger NaCl-Lösung, gewaschen und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei ein Öl erhalten wurde. Das Öl wurde in Hexan gelöst, und die entstehende Lösung wurde durch Celite filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei 11,5 g (96% Ausbeute) einer viskosen, strohgefärbten, öligen Substanz erhalten wurden. Die TLC zeigte eine saubere Umwandlung zu dem Enolether (Rg 0,68; E. Merck Al&sub2;O g-CH&sub2;Cl&sub2; : Hexane- 50 : 50) mit einer Spur an Ketonausgangsmaterial. Das Öl wurde von K&sub2;CO&sub3; (Kp. 148-150ºC, 0,25 mmHg) destilliert. Bei diesen Bedingungen trat eine geringe Gelbfärbung im Destillationskopfprodukt auf. Die I. R.-Analyse dieses Destillats zeigte eine kleine Ketonabsorptionsbande bei 1670 cm&supmin;¹. I. R. (CH&sub2;Cl&sub2;): 2900 cm&supmin;¹, 1670 cm&supmin;¹ (schwach), 1600 cm&supmin;¹, 1590 cm&supmin;¹, 1580 cm&supmin;¹, 1570 cm&supmin;¹, 1095 cm&supmin;¹, 1080 cm&supmin;¹; ¹H-NMR 60 MHz, CDCl&sub3; : δ 1,5-2,0 (m, 12H), δ 2,55 (s, 1H), δ 3,2 (s, 1H), δ 3,25 (s, 3H), δ 3,75 (s, 3H), δ 6,7-7,3 (m, 4H). Diese Werte bestätigten die folgende Struktur des Produktes:
    • BEISPIEL 3 Methoxy-(3-hydroxyphenyl)methylenadamantan
  • Eine Lösung von Methoxy-(3-methoxyphenyl)methylenadamantan (14 g, 0,049 mol), erhalten gemäß Beispiel 2, in 70 ml Molekularsieb-getrocknetem (3 Å) Dimethylformamid (DMF) wurde unter Argonatmosphäre zu einer Lösung aus Natriumthioethoxid (7,4 g, 0,88 mol) in dem gleichen Lösungsmittel gegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen in einem Eisbad unter Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 62 g NH&sub4;Cl in 200 ml Wasser abgeschreckt. Ethylacetat (120 ml) und eine geringe Menge von Eiswasser wurden zugegeben. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit 75 ml Ethylacetat abgetrennt. Der organische Extrakt wurde mit vier 100 ml Portionen Wasser, dann mit gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen und schnell über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wurde filtriert und zu einer öligen Substanz, die dann mit 50 ml Hexanen verrieben wurde, konzentriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels an einem Rotationsverdampfer setzt sich ein Feststoff ab, der mit kalten Hexanen verrieben, filtriert und mit Hexanen gewaschen wurde. Das rohe, stumpfweiße Phenolprodukt (13 g) wurde aus 5%igem MeOH in CH&sub3;CN unkristallisiert, wobei 10 g farblose prismatische Kristalle erhalten wurden (Fp. 131-133ºC). I. R. (CH&sub2;Cl&sub2;): 3580 cm&supmin;¹, 3320 cm&supmin; ¹, 2910 cm&supmin;¹, 1590 cm&supmin;¹, 1580 cm&supmin;¹, 1440 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,70-1,91 (m, 12H), 2,58 (s, ii), 3,18 (s, 1H), 3,26 (s, 3H): δ, 25 (s, 1H), 6,70-7,20 (m, 4H). Diese Werte bestätigen die folgende Struktur:
    • BEISPIEL 4 Ammoniumnatrium-3- (adamantylidenmethoxymethyl)- phenylohosphat
  • Eine Menge (1,1 g, 0,004 mol) Methoxy-(3-hydroxyphenyl)methylenadamantan, erhalten gemäß Beispiel 3, wurde in 15 ml Molekularsieb-getrocknetem (3 Å) Benzol unter Argon gelöst. Triethylamin (0,57 ml, 0,004 mol) wurde über eine Spritze zugegeben. Die gerührte Lösung wurde auf 0ºC in einem Eisbad gekühlt, und dann wurde tropfenweise 2- Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (0,37 ml, 0,004 mol) zugegeben. Nach 10 Minuten in dem kalten Bad wurde das viskose Gemisch langsam auf Raumtemperatur erwärmt und 3,5 Stunden gerührt. Das Benzol wurde im Vakuum entfernt, und 60 ml Ether wurden unter Stickstoff zugegeben. Die Suspension wurde in Inertatmosphäre filtriert, und der entstehende Feststoff wurde mit drei 20 ml Teilen Ether gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum entfernt, wobei 1,6 g Phosphattriester als farblose, viskose, ölige Substanz, die feuchtigkeitsempfindlich war, erhalten wurde. I. R. (CH&sub2;Cl&sub2;): 2900 cm&supmin;¹, 1600 cm&supmin;¹, 1575 cm&supmin;¹, 1300 cm&supmin;¹ (P = 0). Keine phenolische OH-Dehnungs- oder C=0 (1670 cm&supmin;¹)- Absorption war in dem I. R.-Spektrum vorhanden. TLC zeigte die Abwesenheit des Ausgangsmaterials. Diese Werte stimmen mit der folgenden Struktur von 3-(Adamantylidenmethoxymethyl)phenylethylenphosphat überein:
  • Die ölige Substanz, erhalten wie oben, wurde in 7 ml DMF gelöst, Natriumcyanid (0,21 g, 0,004 mol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel der entstehenden gelben Lösung wurde bei 50ºC im Vakuum abdestilliert und weiter entfernt, indem mehrere Male mit 2 ml Teilen Xylol azeotrop destilliert wurde. Der Rückstand wurde mit Ether verrieben, wobei ein Gummi erhalten wurde, der mit CH&sub2;Cl&sub2; vermischt, filtriert und im Vakuum abgestreift wurde, wobei 1,5 g hellgelber, amorpher Schaum erhalten wurde. I. R. (CH&sub2;Cl&sub2;): 2240 cm&supmin;¹ (schwach, CN), 1595 cm&supmin;¹, 1570 cm&supmin;¹, 1475 cm&supmin;¹, 1275 cm&supmin;¹ (P=0), 1235 cm&supmin;¹, 1100 cm&supmin;¹. Diese Werte stimmen mit der folgenden erwarteten Struktur von Natrium-3-(adamantylidenmethoxymethyl)phenyl-2'- cyanoethylphosphat überein:
  • Dieses Salz (1,5 g, 0,0035 mol) wurde in 5 ml Wasser gelöst. Konzentriertes Ammoniumhydroxid (5 ml) wurde dann tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende weiße Aufschlämmung wurde in einem Eisbad gekühlt und mit 30 ml Acetonitril behandelt. Das Filtrieren und das Waschen mit zwei 15 ml Teilen kaltem Acetonitril ergab 0,95 g hygroskopischen, weißen Feststoff (gesintert bei 115ºC, geschmolzen bei 130-133ºC) nach kurzem Trocknen im Vakuum. HPLC (Umkehrphase C18 - 0,1% Ammoniumacetat/CH&sub3;CN-Gradienten) zeigt einen Hauptpeak. I. R. (Nujol): 1595 cm&supmin;¹, 1575 cm&supmin;¹, 1245 cm&supmin;¹, 1200 cm&supmin;¹, 1095 cm&supmin;¹, 1080 cm&supmin;¹, 890 cm&supmin;¹. U. V. (20% MeOH-Dioxan) max. 260/mm; ε = 10.000. 1H-NMR (400 MHz, D&sub2;O): δ 1,60-1,80 (m, 12H), 2,44 (s, 1H), 2,97 (s, 1H), 3,22 (s, 1H), 4,65 (s, HOD), 6,88-7,20 (m, 4H). Diese Werte bestätigen die folgende Struktur des Produktes:
    • BEISPIEL 5 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3"-phosohoryloxy)- phenyl-1,2-dioxetannatriumammoniumsalz
  • In einem großen Kulturreagensglas wurden 0,065 g (0,00017 mol) Enoletherphosphatsalz, erhalten gemäß Beispiel 4, in 25 ml CHCl&sub3; gelöst. Eine Menge (0,210 g) Methylenblau an Silicagel (0,0026 g Farbstoff/g SiO&sub2;) wurde als Sensibili sator zugegeben. Das Reagensglas wurde in einen versilberten Dewar-Kolben, enthaltend eine 250-Watt-Hochdruck- Natriumlampe im Inneren, eines wassergekühlten Eintauchrohrs gegeben. Ein 5-Mil-Stück Kapton® (Dupont) wurde ins Innere des Tauchrohrs als UV-Filter gegeben. Eiswasser wurde durch die Vorrichtung gepumpt, um die Probentemperatur unter 10ºC zu halten. Ein kontinuierlicher Strom aus trockenem Sauerstoff wurde in den Reaktor durch ein Kapillarrohr eingeleitet. Die Gasströmung wurde so eingestellt, daß gerade eine einheitliche Suspension des Sensibilisators in fester Phase erhalten wurde. Nach 25 Minuten Bestrahlungszeit verschwand die UV-(260 nm)-Absorption des Ausgangsmaterials. Die hellgelbe Lösung wurde filtriert, eingedampft und mit 10 ml Wasser rekonstituiert. Die wäßrige Probe wurde durch ein 0,45 um Nylonfilter filtriert, und über eine Umkehrphase C18 präparative HPLC-Säule unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril-Gradienten, chromatographiert. Die Fraktionen, die schwache UV-Aborption bei 277 nm zeigten, wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei das Dioxetan als weißer, baumwollartiger, hygroskopischer Feststoff erhalten wurde.
  • Das AMPPD Na&spplus;NH&sub4;&spplus;-Salz zeigte keinen Schmelzpunkt. Stattdessen trat eine Sublimationsverdampfung zwischen 145ºC- 150ºC auf. Es verblieb ein fester Rückstand, der sich teilweise zersetzte, aber nicht unter 270ºC schmolz.
  • ¹H-NMR (D20, ppm): 0,89-1,85 (m, 12H), 2,10 (s, 1H), 2,75 (s, 1H), 3,15 (s, 3H), 4,65 (s, HOD-NH&sub4;&spplus;), 7,10&supmin;&sup7;,36 (m, 4H).
  • Z. R. (Nujol mull, cm&supmin;¹): 3120, 1970-1790 (schwach, breit- NH&sub4;&spplus;), 1640 (breit), 1600 (schwach), 1580, 1284, 1273, 1122, 980, 895.
  • Es wurde so bestätigt, daß die Struktur des Produkts wie folgt war:
    • BEISPIEL 6 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)- phenyl-1,2-dioxetandinatriumsalz
  • Methoxy-(3-phosphoryloxyphenyl)methylenadamantannatriumammoniumsalz (3,3 g) wurde in 15 ml Wasser, enthaltend einen Tropfen Pyridin, gelöst. Die Lösung wurde langsam über eine 3 cm · 25 cm-Säule aus Amberlite IR 120 (plus) Ionenaustauschharz in Pyridiniumsalzform (Aldrich Chemical Co.) geleitet. Nach der Eluierung mit destilliertem Wasser wurden die Fraktionen, die eine Absorption bei 260 nm zeigten, vereinigt und lyophilisiert. Ein Teil des entstehenden Monopyridiniumsalzes (1 g, 2,3 mmol) wurde in 100 ml CHCl3 (getrocknet über Al&sub2;O&sub3;) gelöst. Die entstehende Lösung wurde in ein großes zylindrisches Rohr gegeben und mit 5-, 10-, 15-, 20-Tetraphenyl-21H, 23H-porphin (2 mg, in 1 ml CHCl&sub3;) behandelt. Die homogene grüne Lösung wurde auf 0ºC gekühlt und mit Sauerstoffgas über ein Versprühungsrohr vorgesättigt. Das Gemisch wurde bei konstanter Sauerstoffströmung in einem versilberten Dewar-Kolben, der ebenfalls ein gekühltes Tauchrohr enthielt, gegeben, umgeben von einer 250-Watt-Natriumdampflampe, die durch eine einzige Folie (5 Mil) von DuPont Kapton®-Polyimidfilm gefiltert wurde. Die Temperatur in dem Dewar verblieb bei 0º-5ºC bei 12 Minuten Bestrahlung. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und anschließend wurden 100 ml destilliertes Wasser, enthaltend 500 mg NaHCO&sub3;, zugegeben. Die entstehende, hellrosa gefärbte Lösung wurde gekühlt und durch eine 0,45 um Teflon -Membran filtriert. Die entstehende wäßrige Lösung aus Dioxetan wurde einem CH&sub3;CN-H&sub2;O- Gradienten an einer Polystyrolchromatographiesäule unterworfen, gefolgt von einem zweiten Durchgang mit einem CH&sub3;CN-H&sub2;O-Gradienten. Die entstehende Lösung, die frei von anorganischen Salzen war, wurde lyophilisiert, wobei 800 mg granularer, schwachgelber, farbloser Feststoff erhalten wurden.
  • Dieser Feststoff zeigte keinen Schmelzpunkt. Stattdessen ergab die Zersetzung Adamantanon als Sublimationsdampf zwischen 145º-150ºC. Es verblieb ein fester Rückstand, der sich teilweise zersetzte, aber nicht unter 270ºC schmolz.
  • ¹H-NMR (D&sub2;O): δ 0,85- δ 1,75 (m, 12H umfaßt zwei Doubletts bei 0,85, 1H und 1,13, 1H), δ 2,15 (s, 1H), δ 2,75 (s, 1H), δ 3,10 (s, 3H), δ 7,10-δ 7,35 (m, 4H).
  • ³¹P-NMR (D&sub2;O; p. p. m. vs H&sub3;PO&sub4;) δ 1,53, Singulett. ¹³C-NMR (400 MHz, D&sub2;O, p. p. m.): 25,52, 25,68, 31,13, 31,55, 32,13, 32,61, 32,98, 34,20, 35,68, 50,31, 98,49 (Dioxetan), 113,61 (Dioxetan), 120,95 (breit, niedrige Intensität), 121,54, 122,10 (breit, niedrige Intensität), 129,37, 134,56, 154,29.
  • Wenn der Versuch wiederholt wurde (300 MHz in D&sub2;O bei 30ºC) verschärften sich die verbreiterten Linien und wurden intensiver, bezogen auf die Linie, die zwischen ihnen auftrat. Die verschärften Resonanzen traten bei 120,65 und 121,99 ppm auf. Dieses Verhalten ist ein klares Anzeichen für eine eingeschränkte Rotation der aromatischen Gruppe.
  • I. R. (Nujol mull): 1600 (schwach), 1580 cm&supmin;¹, 1285 cm&supmin;¹, 1275 cm&supmin;¹, 1120 cm&supmin;¹ (breit), 980 cm&supmin;¹, 895 cm&supmin;¹.
    • BEISPIEL 7 6-Methoxynaphth-2-yl-adamant-2'-ylketon
  • Magnesiumspäne (1,1 g, 0,045 mol) wurden in einem flammengetrockneten Kolben unter Argon zusammen mit einem Iodkristall und 5 ml trockenem THF gegeben. Die Suspension wurde auf 45ºC erhitzt, während eine Lösung aus 2-Brom-6- methoxynapthalin (7,13 g, 0,03 mol) in 25 ml trockenem THF tropfenweise zugegeben wurde. Nach Beginn der exothermen Reaktion wurde der Kolben in ein Wasserbad bei Raumtemperatur eingetaucht. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten am Rückfluß erhitzt. Eine Lösung von 2-Cyanoadamantan (4,85 g, 0,03 mol) wurde tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben. Die entstehende goldbraune Lösung wurde über Nacht am Rückfluß erhitzt, in einem Eisbad gekühlt und mit 30 ml Ether verdünnt. Konzentrierte HCl (5 ml, 0,06 mol) wurde dann tropfenweise unter Rühren zugegeben. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert, mit Ether gewaschen, getrocknet, in einem Gemisch aus 35 ml Methoxyethanol und 30 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure supendiert und am Rückfluß 5 Stunden erhitzt. Der Feststoff wurde abfiltriert, während die Suspension noch warm war, dann mit Wasser gewaschen. Das rohe Keton (7,3 g) wurde als stumpfweißes Pulver erhalten. TLC (Rf 0,39; Whatman K5F, CH&sub2;Cl&sub2; : Hexane 40 : 60) zeigte ein Hauptprodukt an. Die Umkristallisation aus 150 ml Ethylacetat ergab 5 g schamottgefärbte Nadeln (Fp. 173-75ºC). I. R. (CH&sub2;Cl&sub2;): 2900 cm&supmin;¹, 1665 cm&supmin;¹,(C=0), 1620 cm&supmin;¹, 1475 cm&supmin;¹, 1190 cm&supmin;¹, 1165 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,56-2,11 (m, 12H), 2,36(s, 2H), 3,58 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 7,10-8,26 (m, 6H). Die Struktur des Produkts wurde bestätigt als:
    • BEISPIEL 8 Dinatriummethoxy-[(7-phosphoryloxy)naphth-2-yl]methylenadamantan
  • Natriumhydrid (50% in Mineralöl, 240 mg, 6 mmol) wurden unter Argonatmosphäre zu Methoxy-[(7-hydroxy}naphth-2 - yl]methylenadamantan (1,45 g, 4,5 mmol), gelöst in siebgetrocknetem DMF (15 ml), gegeben. Die Ausgangsverbindung stammt von Edwards et al., in der gleichzeitig anhängigen und dem gleichen Namen zugeordneten U. S. -Anmeldung Serial Nr. 213 672, eingereicht 30. Juni 1988, Beispiel I. Die Lösung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, um eine vollständige Natriumnaphthoxidbildung zu gewährleisten und dann auf 0ºC abgekühlt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 540 ul (5,87 mmol) 2-Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (Fluka) tropfenweise zu der Suspension gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 15 Minuten erwärmt, wobei Methoxy-[7-(2-oxo-1, 3,2- Dioxaphospholan-2-oxy)-naphth-2-yl]methylenadamantan ge bildet wurde. Im Vakuum getrocknetes Natriumcyanid (648 mg, 13,2 mmol) wurde als Pulver unter Argon zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt, um die in situ-Ringöffnung des cyclischen Phosphatesters zu bewirken. Nach Beendigung der Reaktion gemäß TLC-Analyse (Silicagel, 20% EtOAc/Hexane und 30% MeOH/EtOAc) der Reaktionsprodukte wurde das Lösungsmittel im Vakuum unter mä- Bigem Erwärmen abgestreift. Das rohe Mononatriummethoxy- [(7-[2-cyano-ethyl]phosphoryloxy)naphth-2-yl]methylenadamantan wurde in 7M NH&sub4;OH (10 ml) gelöst und 15 Stunden bei 40ºC gerührt. Beim Fortschreiten der Reaktion präzipitierte das Produkt als hellgelber Gummi. Die wäßrige Lösung, die noch gewünschtes Naphthylphosphat enthielt, wurde abgezogen und zu einem braunen Pulver nach der Zugabe von 564 mg (6,7 mmol) NaHCO&sub3; lyophilisiert. Das gefriergetrocknete Pulver und das gummiartige Präzipitat wurden zusammen in minimalem MeOH gelöst, und nach Zugabe von Acetonitril präzipitierten Flocken aus gelbbraunen Kristallen. Der Niederschlag wurde auf einem Büchner-Filter gesammelt, mit Acetonitril gewaschen und getrocknet. Durch Eindampfen des Filtrats zu einem geringen Volumen, gefolgt von der Zugabe von CH&sub3;CN, fiel weiteres Naphthylphosphat aus, welches gesammelt und wie oben beschrieben gewaschen wurde. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um das gesamte rohe Phosphat aus dem Filtrat zu entfernen. Der getrocknete Kristallkuchen wurde durch präparative HPLC unter Verwendung eines CH&sub3;CN/H&sub2;O-Gradienten durch eine Polystyrolsäule (PLRP-5, Polymer Laboratories) gereinigt. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei 572 mg (28%) Dinatriunmethoxy-[{7-phosphoryloxy)naphth-2-yl]methylenadamantan als weißes, flockiges Pulver erhalten wurden.
  • ¹H-NMR (D&sub2;O, ppm): 1,60-1,83 (12H, m), 2,46 (1H, d, J = 0,97 Hz), 3,02 (1H, br, s), 3,22 (3H, s), 7,20 (1H, d, J = 8,43 Hz), 7,29 (1H, d, J = 9,28 Hz), 7,51 (1H, s), 7,65 (1H, s), 7,72 (2H, m).
  • ³¹p-NMR (D&sub2;O, 85% H&sub3;PO&sub4; std., p. p. m.): 0,99 (1P).
    • BEISPIEL 9 Dinatrium-3-(2' -spiroadamantan)-4-methoxy-4-(7"- phosphoryloxy)naphth-2"-yl-1,2-dioxetan
  • Eine Lösung aus Dinatriummethoxy-[(7-phosphoryloxy)naphth- 2-yl]methylenadamantan (18,8 mg, 0,042 mmol) und 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H, 23H-porphin (TPP, 20 ul einer 2%igen Lösung in CHCl&sub3;, auf das Gewicht bezogen) in 2% MeOH/CHCl&sub3; (10 ml) wurde mit einer 250 W Hochdrucknatriumlampe bei 10ºC bestrahlt, während ein Sauerstoffstrom durch die Lösung geführt wurde. Ein 5 mil. dickes Stück von Kapton®-Polyimidfilm (DuPont), das zwischen die Lampe und das Reaktionsgemisch gegeben wurde, filterte die unerwünschte UV-Strahlung aus. Analytische HPLC (UV-Detektor bei 254 nm) zeigte vollständige Dioxetanbildung nach 10,5 Minuten langer Bestrahlung. Die Reaktion war gefolgt von UV-Spektroskopie mit Absorption bei 255 nm, aufgrund der konjugierten Vinylgruppe, die bei der Photooxygenierung verschwand. Das Dioxetan zeigte eine Haupt-UV-Absorption bei 230 nm. Nach Abdampfen des Chloroforms bei 0ºC wurde der Rückstand in Eiswasser gelöst, durch ein 0,46 u Filter gegeben und durch präparative HPLC auf einer Polystyrolsäule mit einem Acetonitril/Wassergradienten getrennt. Die Fraktionen wurden eingefroren und bei 0ºC lyophilisiert, wodurch man 12,1 mg (60%) des Dinatriumphosphatdioxetans als weißes, flockiges Pulver erhielt.
  • ¹H-NMR (D&sub2;O, p. p. m.): 0,69 (1H, d), 0,98 (1H, d), 1,34-1,80 (10H, m), 2,11 (1H, d, J = 1,35 Hz), 2,77 (1H, d, J = 1,96 Hz, 3,08 (3H, s), 7,31-7,98 (6H, m).
  • Diese Werte bestätigen die Struktur wie folgt:
  • 9,5 ul einer 0,4 mM-Lösung des obigen Dioxetans in einem pH 9 Carbonatpuffer (0, 05M) wurden · zu 490 ul des gleichen Puffers in einem Reagensglas gegeben. Diese Lösung wurde mit 4 · 10&supmin;¹&sup4; mol dialysierter alkalischer Phosphatase (Biozyme; ALPI-11G) in 5 ul entionisiertem Wasser behandelt. Das Reagensglas wurde in ein Luminometer (Turner 20E) bei 29ºC gegeben, um eine konstante grüne Lichtemission während 60 Minuten nachzuweisen.

Claims (24)

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel
worin T eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, R eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet und M&spplus; ein Alkalimetall-, Ammonium- oder ein C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-, Aralkyl- oder ein aromatisches quaternäres Ammoniumkation (NR&sub4;)&spplus; bedeutet, worin R&sub4; irgendeines oder alle von Alkyl, Aralkyl bedeutet oder Teil eines heterocyclischen Ringsystems bildet, umfassend die folgenden Stufen:
(i) Umsetzung einer Verbindung der Formel T-CN, worin T die oben gegebene Definition besitzt, mit einer Verbindung der Formel BrMg-Y-OR¹, worin R¹ eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, gefolgt von der Behandlung mit einer Säure HW unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen und W ein Halogenid bedeutet,
(ii) Oxidation der bei der Stufe (i) erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iii) Umsetzung der gemäß Stufe (ii) oben erhaltenen Verbindungen mit einem R-ylierungsmittel in einem basischen, polaren, aprotischen Medium in Anwesenheit eines Alkalimetalloxids unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, R und R1 die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iv) Durchführung einer phenolischen Etherspaltung der Verbindung, erhalten gemäß Stufe (iii) oben mit Natriumthioethoxid, Lithiumiodid, Natriumcyanid oder Natriumsulfid unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(v) Umsetzung der Verbindung, die bei der Stufe (iv) oben erhalten wurde, mit
worin X Halogen bedeutet, in Anwesenheit einer Lewis-Base in einem aprotischen organischen Lösungsmittel unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(vi) Umsetzung der Verbindung, erhalten gemäß Stufe (v) oben mit MCN, worin M die oben gegebene Definition besitzt, unter Bildung einer Verbindung der Formel
(vii) Umsetzung der bei der Stufe (vi) oben erhaltenen Verbindung mit
NH&sub4;&spplus;OH&supmin;
unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und N die oben gegebenen Definitionen besitzen, und
(viii) Oxygenierung der bei der Stufe (vii) oben erhaltenen Verbindung unter Herstellung einer Verbindung der Formel
2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel
worin T eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, R eine C&sub1;- C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet und M&spplus; ein Alkalimetall-, Ammonium- oder C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-, Aralkyl- oder ein aromatisches quaternäres Ammoniumkation (NR&sub4;)&spplus; bedeutet, worin R&sub4; irgendeines oder alle von Alkyl, Aralkyl sein kann, oder einen Teil eines heterocyclischen Ringsystems bildet, umfassend die folgenden Stufen:
(i) Umsetzung einer Verbindung der Formel T-CN, worin T die oben gegebene Definition besitzt, mit einer Verbindung der Formel BrMg-Y-OR¹, worin R¹ eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppe, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, gefolgt von Be handlung mit einer Säure HW unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen, und W ein Halogenid bedeutet,
(ii) Oxidation der bei der Stufe (i) oben erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iii) Umsetzung der bei der Stufe (ii) oben erhaltenen Verbindung mit einem R-ylierungsmittel in einem basischen, polaren, aprotischen Medium in Anwesenheit eines Alkalimetalloxids unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, R und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iv) Durchführung einer phenolischen Etherspaltung bei der in der obigen Stufe (iii) erhaltenen Verbindung mit Natriumthioethoxid, Lithiumiodid, Natriumcyanid oder Natriumsulfid unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(v) Umsetzung der bei (iv) oben erhaltenen Verbindung mit einer Verbindung der Formel
worin X ein Halogenatom bedeutet, unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen, und Oxidation der erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(vi) Umsetzung der bei der obigen Stufe (v) erhaltenen Verbindung mit MCN, worin M die oben gegebene Definition besitzt, unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und M&spplus; die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(vii) Umsetzung der bei der obigen Stufe (vi) erhaltenen Verbindung mit
NH&sub4;&spplus;OH&supmin;
unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und M&spplus; die oben gegebenen Definitionen besitzen, und
(viii) Oxygenierung der bei der Stufe (vii) oben erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel
worin T eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, R eine C&sub1;- C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet und M ein Alkalimetall-, Ammonium- oder C&sub1;-C&sub7;-Alkyl-, Aralkyl- oder ein aromatisches quaternäres Ammoniumkation (NH&sub4;)&spplus; bedeutet, worin R&sub4; irgendeines oder alle von Alkyl, Aralkyl sein kann, oder einen Teil eines heterocyclischen Ringsystems bildet, umfassend die Stufen (i) bis (vii), wie in den Ansprüchen 1 und 2 definiert, und zusätzlich
(viii) Oxygenieren einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und M&spplus; die oben gegebenen Definitionen besitzen, gefolgt von einem Ionenaustausch von NH&sub4;&spplus; für M&spplus;,
oder Unterwerfen der Verbindung der Formel
dem Ionenaustausch zum Ersatz von NH&sub4;&spplus; mit M&spplus; unter Bildung einer Verbindung der Formel
gefolgt von Oxygenierung.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und M&spplus; die in Anspruch 1 gegebenen Definitionen besitzen, umfassend die folgenden Stufen:
(i) Umsetzung einer Verbindung der Formel T-CN, worin T die oben gegebene Definition besitzt, mit einer Verbindung der Formel BrMg-Y-OR¹, worin R¹ eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, gefolgt von der Behandlung mit einer Säure HW unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen, und W&supmin; ein Halogenid bedeutet,
(ii) Unterwerfen der Verbindung, erhalten gemäß Stufe
(i) , der Oxidation unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iii) Umsetzung der bei der obigen Stufe (ii) erhaltenen Verbindung mit einem R-ylierungsmittel in einem basischen, polaren, aprotischen Medium in Anwesenheit eines Alkalimetalloxids unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, R und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iv) phenolische Etherspaltung der bei der Stufe (iii) oben erhaltenen Verbindung mit Natriumthioethoxid, Lithiumiodid, Natriumcyanid oder Natriumsulfid unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(v) Umsetzung der bei der obigen Stufe (iv) erhaltenen Verbindung mit einer Verbindung der Formel
worin X ein Halogenatom bedeutet gegebenen R² und R³ je unabhängig Cyano, Nitrophenyl, Dinitrophenyl, Arylsulfonyl oder Alkylsulfonyl bedeuten, unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R, R2 und R3 die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(vi) Behandlung der Verbindung, erhalten gemäß Stufe (v) mit M&spplus;OH, worin M&spplus; die oben gegebene Definition besitzt, unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und M&spplus; die oben gegebenen Definitionen besitzen, und
(vii) Oxygenierung der bei der obigen Stufe (vi) erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und M&spplus; die in Anspruch 1 gegebenen Definitionen besitzen, umfassend die folgenden Stufen:
(i) Umsetzung einer Verbindung der Formel T-CN, worin T die oben gegebene Definition besitzt, mit einer Verbindung der Formel BrMg-Y-OR¹, worin R¹ eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, gefolgt von einer Behandlung mit einer Säure HW unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R1 die oben gegebenen Definitionen besitzen und W ein Halogenid bedeutet,
(ii) Oxidation der bei der Stufe (i) erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iii) Umsetzung der bei der Stufe (ii) oben erhaltenen Verbindung mit einem R-ylierungsmittel in einem basischen, polaren, aprotischen Medium in Anwesenheit eines Alkalimetalloxids unter Herstellung einer Verbindung der Formel
worin T, R und R¹ die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(iv) phenolische Etherspaltung der bei der Stufe (iii) oben erhaltenen Verbindung mit Natriumthioethoxid, Lithiumiodid, Natriumcyanid oder Natriumsulfid unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y und R die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(v) Umsetzung der bei der obigen Stufe (iv) erhaltenen Verbindung mit
worin X ein Halogenatom bedeutet und R&sup5; unabhängig irgendeiner der oben für R definierten Substituenten sein kann, unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und R&sup5; die oben gegebenen Definitionen besitzen,
(vi) Oxygenierung der bei der obigen Stufe (v) erhaltenen Verbindung unter Bildung einer Verbindung der Formel
worin T, Y, R und R&sup5; die oben gegebenen Definitionen besitzen, und
(vii) Hydrolyse der bei der obigen Stufe (vi) erhaltenen Verbindung in Anwesenheit von M&spplus;OH unter Erhalt einer Verbindung der Formel
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß T= Adamant-2-yliden bedeutet, T- Adamant-2-yl bedeuet, R Methyl oder Ethyl bedeutet, YOR¹
bedeutet, das R-ylierungsmittel Dimethyl- oder Diethylsulfat ist, das Alkalimetallalkoxid Kalium-tert.-butoxid ist, und daß das polare aprotische Lösungsmittel Dimethylsulfoxid ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ Methyl bedeutet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß T = Adamant-2-yliden bedeutet, R Methyl oder Ethyl bedeutet und YOH
bedeutet, die Lewis-Base ein tertiäres Amin ist und das aprotische organische Lösungsmittel eine aromatische Flüssigkeit ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lewis-Base Trialkylamin ist und daß das aprotische organische Lösungsmittel Benzol ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, weiter umfassend die Verwendung einer Polycycloalkylidenverbindung einer Verbindung der Formel
worin M&spplus; ein Alkalimetallkation bedeutet, in Abwesenheit einer Lewis-Base, in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid.
11. Verbindung der Formel
worin T- eine Polycycloalkylgruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet, W&supmin; ein Halogenid bedeutet und R¹ eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet.
12. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß T Adamant-2-yl bedeutet, W&supmin; ein Halogenanion bedeutet und YOR¹
bedeutet.
13. Verbindung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß W&supmin; ein Chloridion und R¹ Methyl bedeutet.
14. Verbindung der Formel
worin T- eine Polycycloalkylgruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet und R¹ eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet.
15. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß T Adamant-2-yl bedeutet und YOR¹
bedeutet.
16. Verbindung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ Methyl bedeutet.
17. Verbindung der Formel
worin T = eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet und R eine C&sub1;-C&sub2;&sub0;- Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet.
18. Verbindung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß T = Adamant-2-yliden bedeuet, R Methyl oder Ethyl bedeutet und Y oder bedeutet.
19. Verbindung der Formel
worin T = eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet, R eine unverzweigte oder verzweigte, unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub1;&sub2;- Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, R&sup4;
bedeutet und M&spplus; ein Alkalimetall-, Ammonium- oder quaternäres Ammoniumkation bedeutet.
20. Verbindung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß T= Adamant-2-yliden bedeutet, R Methyl oder Ethyl bedeutet, M&spplus; Na&spplus; bedeutet und Y
bedeutet.
21. Verbindung der Formel
worin T= eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, R eine C&sub1;- C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet und Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet.
22. Verbindung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß T= Adamant-2-yliden bedeutet, R Methyl oder Ethyl bedeutet und Y
bedeutet.
23. Verbindung der Formel
worin T = eine Polycycloalkylidengruppe bedeutet, R eine C&sub1;- C&sub2;&sub0;-Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylgruppe bedeutet, Y ein fluoreszierendes Chromophor bedeutet und R² und R³ je unabhängig Cyano, Nitrophenyl, Dinitrophenyl, Alkylsulfonyl oder Arylsulfonyl bedeuten.
24. Verbindung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß T Adamant-2-yliden bedeutet, R Methyl bedeutet und R² und R³ Cyano bedeuten.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004565A (en) * 1986-07-17 1991-04-02 The Board Of Governors Of Wayne State University Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
US4931569A (en) * 1988-09-14 1990-06-05 Tropix, Inc. Purification of stable water-soluble dioxetanes
US6022964A (en) * 1989-07-17 2000-02-08 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5362916A (en) * 1989-09-06 1994-11-08 Tropix, Inc. Synthesis of mercaptaryl or hydroxyaryl enol ether alkali metal salts
CA2035029C (en) * 1989-09-06 2001-12-18 Applied Biosystems, Llc Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
US5225584A (en) * 1989-09-06 1993-07-06 Tropix, Inc. Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
CA2141451C (en) * 1992-07-31 2003-10-07 John S. Pease Photoactivatable chemiluminescent matrices
KR0148439B1 (ko) * 1994-03-11 1998-11-02 마사까쓰 마쓰모또 1,2-디옥세탄 유도체
US5631167A (en) * 1995-07-31 1997-05-20 Bayer Corporation Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence
US5777135A (en) * 1995-07-31 1998-07-07 Lumigen, Inc. Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions
US5783381A (en) * 1995-10-19 1998-07-21 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
AU5237699A (en) * 1998-07-28 2000-02-21 Tropix, Inc. Benzothiazole dioxetanes
US6660529B2 (en) * 1998-07-28 2003-12-09 Pe Corporation Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
EP1185710A2 (de) * 1999-04-16 2002-03-13 Zymetx, Inc. Verfahren zum nachweis von viren, das viralisch-codierte enzymen und chemilumineszentsubstraten verwendet
US20040038241A1 (en) * 2000-07-26 2004-02-26 Martin Glennsbjerg Spatially resolved enzyme-linked assay
EP1342724B1 (de) * 2002-03-08 2016-01-06 Tosoh Corporation 1,2-dioxetan derivate und diese gebrauchende reagenzien
JP4259229B2 (ja) 2003-08-28 2009-04-30 東ソー株式会社 １，２−ジオキセタンの化学発光方法および化学発光用組成物
JP2012140330A (ja) * 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp 水溶性リン酸エステルの精製方法
SI2892900T1 (en) 2012-09-10 2018-01-31 Principia Biopharma Inc. Pyrazolopyrimidine compounds as kinase inhibitors
DE102012109026A1 (de) * 2012-09-25 2014-03-27 Eads Deutschland Gmbh Detektionsvorrichtung und Detektionsverfahren zur automatischen Bestimmung von Biomasse
US11198785B2 (en) 2017-10-13 2021-12-14 Mitsubishi Engineering-Plastics Corporation Polycarbonate resin composition
JP7007862B2 (ja) * 2017-10-31 2022-01-25 アークレイ株式会社 化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キット

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909557A (en) * 1955-09-07 1959-10-20 Bayer Ag Thiophosphoric acid esters and their production
NL6716437A (de) 1967-12-02 1969-06-04
US3711556A (en) 1968-06-13 1973-01-16 Du Pont 2-(bis(p-substituted phenyl)methylene)adamantanes
GB1497109A (en) * 1975-10-29 1978-01-05 Beecham Group Ltd Naphthalene derivatives
JPS57159499A (en) * 1981-03-26 1982-10-01 Fuji Photo Film Co Ltd Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method
JPS62176941A (ja) * 1986-01-28 1987-08-03 Sumitomo Electric Ind Ltd 光フアイバ
JPS639377A (ja) * 1986-06-30 1988-01-16 Sony Corp マルチチヤンネル録画装置
US5707559A (en) * 1986-07-17 1998-01-13 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds
US4983779A (en) 1986-07-17 1991-01-08 The Board Of Governors Of Wayne State University Process for the preparation of vinyl ethers
JPH0521918A (ja) * 1991-07-11 1993-01-29 Nippon Cement Co Ltd セラミツクス回路基板用導電パターン形成用粉末組成物
JP3217396B2 (ja) * 1991-08-16 2001-10-09 オリンパス光学工業株式会社 顕微鏡の粗微動機構
JPH0723989B2 (ja) * 1992-08-03 1995-03-15 ビソーディスプレイ株式会社 スクリーン装置
JPH0733346A (ja) * 1993-07-20 1995-02-03 Hitachi Building Syst Eng & Service Co Ltd エレベータの着床制御装置
DE4423811C1 (de) * 1994-07-06 1996-01-18 Fraunhofer Ges Forschung Hydrolysierbare und polymerisierbare Silane, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
JPH02724A (ja) 1990-01-05
US6417380B1 (en) 2002-07-09
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CA1341210C (en) 2001-03-27
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JPH0476997B2 (de) 1992-12-07
GR1000118B (el) 1991-06-28
EP0368946B1 (de) 1994-09-14
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ES2012941A6 (es) 1990-04-16
JP3280342B2 (ja) 2002-05-13

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