JPH0372489A - １，２―ジオキセタン化合物 - Google Patents

１，２―ジオキセタン化合物

Info

Publication number
JPH0372489A
JPH0372489A JP2033597A JP3359790A JPH0372489A JP H0372489 A JPH0372489 A JP H0372489A JP 2033597 A JP2033597 A JP 2033597A JP 3359790 A JP3359790 A JP 3359790A JP H0372489 A JPH0372489 A JP H0372489A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
formula
buffer
added
assay
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2033597A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0521918B2 (ja
Inventor
Irena Y Bronstein
イレーナ・ワイ・ブロンスタイン
Brooks Edwards
ブルックス・エドワーズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tropix Inc
Original Assignee
Tropix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tropix Inc filed Critical Tropix Inc
Publication of JPH0372489A publication Critical patent/JPH0372489A/ja
Publication of JPH0521918B2 publication Critical patent/JPH0521918B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C41/00—Preparation of ethers; Preparation of compounds having groups, groups or groups
    • C07C41/01—Preparation of ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/28—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the hydroxylic moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group
    • C07C67/29—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the hydroxylic moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group by introduction of oxygen-containing functional groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D321/00—Heterocyclic compounds containing rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D317/00 - C07D319/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6551—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring
    • C07F9/65512—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6571—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6574—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/65742—Esters of oxyacids of phosphorus non-condensed with carbocyclic rings or heterocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/56—Ring systems containing bridged rings
    • C07C2603/58—Ring systems containing bridged rings containing three rings
    • C07C2603/70—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/74—Adamantanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、１，２−ジオキセタン分子中の酵素によって
切断しうる基の酵素性分解によってもたらされる光学的
に検出可能な反応を用いて特異的結合対の一員を検出し
且つ定量化しうる検定法に用いるａ用な１，２−ジオキ
セタン類並びにその中間体に関する。
［従来の技術〕 １．２−ジオキセタンとして知られる４員環の有機ペル
オキシドは既知化合物であるが、これまでめったに利用
されたことのない化合物群である。
それらの化合物固有の化学的不安定性ゆえに、いくつか
の１．２−ジオキセタンはある種の条件下で（例えば酵
素の作用により）化学発光分解を示し、このことは“ジ
オキセタンの酵素性分解を用いる物質の検出法”と題す
る係属中の米国特許出願第８８９８２３号に開示されて
いる（これらの技術内容は参照によりここに引用される
）。このような化学発光の間に放出される光線の量は発
光物質の濃度の尺度であり、ひいてはその前駆物質（す
なわち１．２−ジオキセタン）の濃度の尺度である。
従って、発光の強度および持続時間を測定することによ
って、１．２−ジオキセタンの濃度（それゆえに検定す
べき物質、すなわち特異的結合対の１．２−ジオキセタ
ン員子に結合した物質、の濃度）を求めることができる
。１，２−ジオキセタン環の置換基を適当に選択すると
、その分子の化学的安定性を調節することができ、ひい
ては化学発光の開始をコントロールすることができ、そ
れにより実施目的のための、例えば上記出願明細書中に
ある化学発光イムノアッセイにおける、この種の化合物
の化学発光作用の有用性を高めることができる。
オレフィン性二重結合の光酸化による１、２−ジオキセ
タンの製造は知られている。しかしながら、容易に入手
しうる出発物質から扱いやすい中間体を経て誘導される
オレフィン性不飽和前駆物質からの置換１．２−ジオキ
セタン類の便利な一般的合戊法の必要性が存在する。こ
れに関連して、次式： （式中、ＲはＣ−Ｃ４アルキルであり；Ｍはアルカリ金
属またはアンモニウムである）の置換１．２−ジオキセ
タンをエノールエーテル型前駆物質： Ｒ から製造するための商業的にｈ゛用な方法の必要性が特
に存在する。
エノールエーテル化合物はいくつかの古典的方法、例え
ばアセタールからのアルコールの酸触媒除去（Ｒ，＾、
　Ｗｈｏｌ、　５ｙｎｔｈｅｓ１ｓ、　ｐ、３８（１９
７４））、塩基性媒体中でのアルコキシメチレンシラン
またはホスホランとアルデヒドまたはケトンとのピータ
ーソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）またはウィッチヒ（ＷＨｔ
ｉｇ）反応（Ｍａｇｎｕｓ、　Ｐ、ら、　Ｏｒｇａｎｏ
ｍｅｔａｌｌｉｃｓ、ｌ、　５５３（１９８２））、お
よびアルコキシ酢酸ジアニオンとケトンとの反応それに
続くプロピオラクトンの形成およびＣ０２の除去（Ｃａ
ｒｏｎ、　Ｇ、　ら、　Ｃａｎ。
Ｊ、　Ｃｈｅｗ、、　５１．９８１（１９７３））によ
り製造することができる。ケトンエノラートアニオンの
Ｏ−アルキル化は可変量の付随して形成されるα−アル
キル化ケトンゆえに（その程度は溶媒、塩基、アルキル
化剤およびケトンの構造に左右される）、一般的製造法
としてあまり用いられない（１１，０゜１ｌｏｕｓｃ、
　’Ｍｏｄｅｒｎ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｒａａｃｔｌ
ｏｎｓ　　ｐ、１６３−２１５　（Ｂｃｎｊａｍｌｎ、
　１９８５）　；およびＪ、　Ｄ、　Ｒｏｂｅｒｔｓお
よびＭ、　Ｃ，Ｃａ５ｃｒ１ｏ、“Ｂａ５１ｃ　Ｐｒ１
ｎｃ１ｐｌｃｓ　ｏｆＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｌｓｔ
ｒｙ”　（Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　１９６４）を参照され
たい）。発癌性溶媒として知られるヘキサメチルホスホ
ルアミド（ＨＭＰＡ）を使用する場合は、よく見積もっ
ても、Ｏ−アルキル化生成物の収率は７０％以下である
。その上、Ｃ−アルキル化ケトンからのエノールエーテ
ルの分離は非常に退屈な作業である。
アダマント−２−イル−アリールケトンは１９６０年代
の末期から知られているが（Ｃｈｅｗ、　Ａｂｓｔ、　
７１　：Ｐ８０８１２Ｖ）、それらをＯ−アルキル化す
る試みは文献に全く報告されていない。今や、極性非プ
ロトン性溶媒のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で
のエノラートとしてのこれらのケトンと“ハード（ｈａ
ｒｄ）”な離脱基を含む反応性アルキル化剤（Ｆｌｅｍ
ｉｎｇ、　Ｉ　、　、“Ｆｒｏｎｔｉｅｒ　０ｒｂｉｔ
ａｌｓ　ａｎｄＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　
Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　　、　　ｐ、４０　　（Ｗｉｌｅ
ｙ。
１９７Ｂ）を参照されたい）との反応はもっばらＯ−ア
ルキル化をもたらすことが見出された。このようにして
得られたエノールエーテルは１，２−ジオキセタン合成
における白“利な中間体として使用される。この種の中
間体はシングレット酸素（化学的または光化学的に発生
される）と反応して化学発光ジオキセタン分解に基づく
検定法において有用な十分に安定性のある１、２−ジオ
キセタンをもたらす物質を製造するために使用される。
このＯ−アルキル化法は一般的であり、それ故に他のシ
クロアルキルアリールケトン物質にも応用できる。この
シクロアルキルアリールケトンは適当な第ニジクロアル
キルアルデヒドとアリールグリニヤール試薬との反応、
および得られた第二アルコールのジョーンズ試薬による
酸化によって合成することができる。好ましくは、グリ
ニヤール試薬は第ニジクロアルキルニトリルと反応させ
、続いて酸加水分解してイミン塩を形成させる。すべて
の場合において、出発物質および生成物はシクロアルキ
ル系の第二炭素原子、縮合ポリシクロアルキル（例えば
アダマンチル）系の場合には、両側にブリッジヘッド（
ｂｒｌｄｇｅｈｅａｄ）炭素原子が存在する第二炭素原
子、に結合された官能基を合釘する。
発光を用いた従来の検定方法として代表的なものは、■
標識酵素としてＰＯＤを用い、基質としてＨ２０２及び
ルミノールを用いるＥＩＡ法、■アクリジンエステルを
標識体として用い、Ｈ２Ｏ２で発光させるＣＬＥＩＡ法
が知られている。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の方法の■の場合、低濃度のりガン
ト測定に対して定量性がなく、■の場合はラベル体自体
の増幅ができない等の欠点を有していた。そのため、高
感度の測定を目指すにはより多くの光量をもった測定法
の開発が望まれていた。
本発明は上述の如き従来方法の欠点を克服し得た。
すなわち、本発明の目的は、１．２−ジオキセタンの化
学発光分解に基づく検定法および該検定法においてＧ用
な１．２−ジオキセタン類を提供することである。
他の目的は、いくつかの１，２−ジオキセタンの合成に
おいて有用な中間体を提供することである。
さらに他の目的は、光学的に検出しうる反応において酵
素により分解されるある秤の１．２−ジオキセタンの合
成前駆物質として有用な新規化合物を提供することであ
る。
本発明のこれらの目的および他の目的並びにそれらの利
点は、以後の説明および特許請求の範囲を参照すること
により十分に理解されるであろう。
［課題を解決するための手段］ 前記の目的は、本発明に従って次式で表される１、２−
ジオキセタン類によって達成される：（式中、ＲはＣ１
−Ｃ４アルキルであり；Ｍはアルカリ金属またはアンモ
ニウムである）本発明の１．２−ジオキセタンは以下の
ように製式中、Ｒ１は独立してＲについて先に定義した
置換基のいずれかであり得；Ｗ−はハロゲンイオン（例
えば塩素イオン）のような酸アニオンであり；そしてＸ
および“Ｒ化剤″は以下で定義する通りである。
前記の反応式はそれぞれの反応生成物を単離しながら段
階的に実施される。しかしながら、段階Ｖｌ　（ＣＮ−
または有機スルフィネートイオンのような求核酸性化ア
ニオンによるアルキル基切断）および段階■（β−説離
反応を経る脱保護）は中間体のリン酸エステル塩を単離
することなく一６利に行われ、この種の中間体はその存
在を確認するときのみ単離する必要がある。
前記の反応式の段階■および■において、段階■で用い
られる塩のカチオンＭ　および段階■で用いられる塩基
のカチオンＭ　はアルカリ金属イオン（Ｐ７＋１えばＮ
ａ　　）またはアンモニウムイオンである。こうして段
階■および■の生成物は次の通りである。
Ｒ さらに、第四アンモニウムカチオンは以下のようにその
四級化基の１つを介してポリマー主鎖へ結合することが
でき： 致するより一般的な用語では″Ｒ化剤”）とを、塩基性
、極性、非プロトン性媒体（例えばジメチルスルホキシ
ド中のアルカリ金属アルコキシド）中で反応させること
によって Ｒ あるいはそれ自体がポリ第四アンモニウム塩の一部であ
り得る。
前記の合成経路内に、次式： （式中ＲおよびＲ１は先に定義した通りである）で表さ
れる化合物が得られる。
本発明は次式： で表される化合物と、Ｒ−サルフェート、トルエンスル
ホネート（トシレート）、メタンスルホネート（メシレ
ート）、トリフルオロメタンスルホネート（トリフレー
ト）、およびクロロメチルエーテル並びにトリアルキル
オキソニウム塩より成る群から選ばれるアルキル化剤（
Ｒの定義と合で表される化合物と次式： （式中Ｘはハロゲン（例えばクロロ）のような電気陰性
離脱基である）で表される化合物とを、液状芳香族化合
物（例えばベンゼン、トルエン）、エーテル（例えばグ
リム、ジグリム）または環状エーテル（例えばテトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）のような非プロトン性有機溶媒中
に溶解した第三アミン（例えばトリエチルアミン）のよ
うなルイス塩基の存在下で反応させることによって得ら
れる次式： わるべきものとして、類似のハロホスフィツトすなわち
ＸＰＯ（ＣＨ２）２を使用しその後酸化および照射をす
ることにより、直接ジオキセタンを形成することもでき
る。
他の面において、本発明は、上式： ％式％ で表される化合物と式ＭＣＮとを反応させることにより
合成される次式： ％式％ （式中Ｒは先に定義した通りである）で表される化合物
を包含する。ハロホスフェートの使用に代（式中、Ｒお
よびＭは先に定義した通りである）の化合物を包含する
。
上述の酸化は光存扛下にオレフィンを一重項酸実施する
ことが好ましい。　０２は二重結合して下記のようにジ
オキセタンを形成することができる： Ｒ０ 反応は一７８℃、ハロゲン化溶媒（例、塩化メチレン）
中で実施することが好ましい。　０２は光増感剤を用い
て発生させることができる。光増感剤としては高分子結
合ローズベンガル〔センシトックスＩ　（Ｓｅｎｓｌｔ
ｏｘ　　Ｉ　）として市販されておりハイトロン研究所
（Ｈｙｄｒｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎｅｗ
Ｂｒｕｎｓｖｉｃｋ、　Ｎ、　Ｊ、）から入手可能〕お
よびメチレンブルー（有名な色素かつｐｔ＋指示薬）な
どを使用することができる。好適な増感剤はローズベン
ガルである。
本発明の１，２−ジオキセタン化合物は光の発生方法に
使用できる。この方法は試料中の特定の物質の存在また
は濃度を求めるために視覚的検定方法として利用するこ
とができる。上記の１．２−ジオキセタン類はこれらの
検定法のいずれにも使用しうる。こうした検定法の例に
は、抗体または抗原（例、αまたはβ−ｈＣＧ、ＴＳＨ
，ＬＨ等のホルモン、ＡＦＰ、ＣＥＡのような癌関連抗
原）を検出する免疫検定法（酵素免疫測定法）；酵素検
定法（例、アルカリホスファターゼ）；カリウムまたは
ナトリウムイオンなどを検出する化学検定法；オヨびウ
ィルス（例、Ｈ８ＶＩ、ＨＴＬＶ■もしくはサイトメガ
ロウィルス）または細菌（例、大腸菌）などを検出する
ヌクレオチドプローブ法が含まれる。
検出される物質が抗体、抗原または核酸である場合には
、ジオキセタンの （以下Ｚ基と略す） を９ノ断可能な酵素、すなわち酸性又はアルカリ性ホス
ファターゼが、検出される物質に特異的な親和性を有す
る物質（すなわち検出される物質に特異的に結合する物
質）（例、それぞれ抗原、抗体、または核酸プローブ）
に結合することが好ましい。
酵素を特異的親和性物質に結合させるために常法（例、
カルボジイミドカップリング）が使用される；結合はア
ミド結合を介することが好ましい。
一般的に検定法は下記のように実施することができる。
検出される物質を含む試料と、検出される物質（例えば
抗原）に特異的親和性を有する物質（例えば抗体）に結
合した酵素を含む緩衝液に接触させ更に特異的親和性を
有するもう一つの物質（例えば抗体）を結合した固相（
例えば抗体結合のビーズ）に接触させる。一定時間イン
キュベーションした後過剰の特異的親和性を有する物質
に結合した酵素を洗い流し、その酵素部分によって切断
されうる２基を有する１、２−ジオキセタン類（基質）
を添加する。酵素は２基を切断してジオキセタンを２つ
のケトン（またはＸ基が水素の場合はアルデヒドとケト
ン）に分解する；ケうして励起されて発光する。この発
光はキュベツトまたはカメラルミノメータ−などを用い
て、試料中に検出される物質が存在することの指標とし
て検出される。物質の濃度を求めるために発光強度を測
定することができる。
検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性物
質（例えば抗体）は不必要である。その代わりに検出さ
れる酵素によって切断されうるＺ基を有する１、２−ジ
オキセタン類（その酵素の基質）を使用する。そこで、
酵素の検出法は、酵素−含ｈ゛試料への１，２−ジオキ
セタン類の添加、および酵素の存在と濃度の指標として
得られる発光の検出を含むものである。
［実　施　例］ 以下に本発明の詳細な説明するために実施例が記載され
るが、本発明は何らそれらに限定されず、その要旨を逸
脱しない範囲での修飾および変法を含むものと思われる
。
参考例　１ ３−メトキシフェニルアダマント−２−イルケトン マグネシウム削り屑（１，６４ｇ、　０．０６７モル）
をアルゴン雰囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。
ヨウ素の小さい結晶および乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）（水素化アルミニウムリチウム上で新たに蒸留し
たもの）７ｍｌを加えた。一定量（７ｍｌ、　０．０５
５モル）の３−ブロモアニソールを注射器から穏やかに
撹拌した金属懸濁液に加えた。
５０℃で短時間加熱後発熱厚応が始まった。フラスコを
室温の水浴に入れ、その間ＴＨＦ　（３３ｍｌ）を滴下
ロートから細流として添加した。発熱反応がおさまった
後、この混合物を４５分間還流した。その還流しつつあ
るグリニヤール試薬へ乾燥ＴＨＦ５０ｍｌ中の２−シア
ノアダマンタン（８，７ｇ　、　０．０５４モル；　　
”Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”　、　５７．
８　（Ｗｉｌｅｙ。
１９７７）またはｖａｎ　Ｌｅｕｓｅｎ、　Ａ、　Ｍ、
ら、　Ｊ、　Ｏｒｇ。
Ｃｈｅｗ、、　　４２．３１１４　（１９７７）を参照
されたい）の溶液を１．５時間にわたって滴下した。こ
の反応混合物を還流温度で一晩加熱した後、黄色の懸ｒ
４液を得た。フラスコとその内容物を水浴中で冷却して
いる間に、エーテル（５０ｍｌ）を加えた。濃塩酸（８
ｍｌ、　０．０９６モルＨＣｊ７）を激しく撹拌しなが
ら２０分間にわたり滴下した。沈殿物を濾過により１１
し、エーテルで洗い、乾燥してケテンイミン塩２９ｇを
若干の残留マグネシウムを含む淡黄色の非吸湿性粉末と
して得た。この塩をエタノール９０ｍ１と濃塩酸９０ｍ
１との混合物中に懸濁し、３時間還流した。その間に混
合物はかなり薄くなった。水浴で冷却後、得られた固形
物を砕き、濾過により分離し、中性になるまで洗浄し、
乾燥して薄い灰色のケトン１３．６５ｇ　（２−シアノ
アダマンタンに基づいて収率９３％）を得た（融点１１
１〜１１４℃）。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はこの生成物がその
後の撮作によって十分な純度であることを示した（Ｒｆ
Ｏ，４５；　Ｋ５Ｆ−ＣＨ２ＣＤ　２　：ヘキサン５０
　：　５０）。ヘキサンから再結晶してプリズム品とし
て表題化合物を得た（融点１１３〜ｃｍ’　（Ｃ＝Ｏ）
　、　１５９０ｃｍ−’、　１５７５ｃｍ−’により生
成物の構造が次式の通りであることを確認した。
参考例　２ メトキシ（３−メトキシフェニル）メチレンアダマンク
ン 参考例１に従って製造した一定ｉ　（ＩＬ、３ｒ。
０．０４２モル）の３−メトキシフェニルアダマント−
２−イルケトンをモレキュラーシーブ乾燥（３人）ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳ　Ｏ）　９０ｍ１に懸濁した
。懸濁固体を溶解するために加熱した。
撹拌しながら室温へ冷却すると、微細な懸濁液が得られ
た。カリウムｔ−ブトキシド（８，５Ｋ。
０．０７０モル）をアルゴン雰囲気下に加えた。５分後
、はとんど均質な橙色の溶液が得られ、これを５０℃の
水浴に入れた。硫酸ジメチル（４ｍｌ　。
０．０４２モル）を注射器から１０分間にわたって滴下
した。さらに１５分撹押した後、追加の硫酸ジメチル（
３，３ｍｌ、　０．０３４モル）を同じやり方で加えた
後、無色の溶液を室温で一晩撹拌した。水浴で冷却後、
Ｋ２ＣＯ３０，５ｇおよび氷水１２５ｍ１を加え、この
混合物を５０ｍ１ずつの酢酸エチルで３回抽出した。
合わせた有機画分を水で３回、飽和ＮａＣ，Ｑ水溶液５
０ｍ１で１回洗い、Ｋ２ＣＯ３上で乾燥した。溶媒を真
空除去して油状物を得た。その油状物をヘキサンに溶か
し、得られた溶液をセライトを通して濾過し、真空濃縮
して粘稠性のある淡黄色の油状物１１．５ｇ　（収率９
６％）を得た。ＴＬＣは微量のケトン出発物質を含むエ
ノールエーテル（ＲＯ，６８；　Ｉ、、　Ｍｃｒｃｋ　
Ａｎ　２０３　　ＣＨ２ＣＮ　２　：ヘキサン５０　：
　５０）へのきれいな転化を示してい−ｔ　　　　　　
　−１ １５９０ｃｍ　　、　１５８０ｃｍ　　、　１５７０ｃ
ｍ−１，１０９５ｃｍ−’、　１０８１０８Ｏ’　；　
’ＨＮＭＲ（ＣＤ　ＣＨＩ　３　）　：δ１．５−２（
ａ＋。
１２１１）、　　δ２．５５（ｓ、ＩＩＩ）、　　δ３
．２（ｓ、１ｌＩ）　、　　δ３．２５（ｓ。
３１Ｄ　、　　δ８．７５（ｓ、３１１）、および６６
．７−７．３（■、４１１）。
これらのデータにより、この生成物の構造が次式の通り
であることを確認した。
参考例　３ メトキシ（３−ヒドロキシフェニル）メチレンアダマン
タン モレキュラーシープ乾燥（３人）ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）７０ｍｌ中の参考例２に従って製造したメト
キシ（３−メトキシフェニル）メチレンアダマンタン（
１４ｇ、　０．０４９モル）の溶液を、アルゴン雰囲気
下で同じ溶媒中のナトリウムチオエトキシド（７，４ｇ
、　０．８８モル）の溶液に加えた。
この混合物を３時間還流した。撹拌しながら水浴で冷却
後、この反応を水２００ｍ１中のＮＨ４Ｃｌ２ｇで停止
させた。酢酸エチル（１２０ｍｌ）および少量の氷水を
加えた。水層を分離し、酢酸エチル７５ｍ１で抽出した
。有機抽出物を１００　ｍｌずつの水で４１！！１１次
に飽和Ｎ　ａ　ＣＤ　（１００ｍｌ）で洗い、すばやく
Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４上で乾燥させた。この溶液を濾過
し、濃縮して油状物を得、それをヘキサン５０ｍ１で摩
砕した。回転蒸発器で溶媒を除去すると固体が残り、そ
れを冷へキサンで細かくすりつぶし、濾過し、ヘキサン
で洗った。粗製の灰白色フェノール系生成物（１３ｇ）
は５％Ｍ　ｅ　ＯＨＣＨｓ　ＣＮから再結晶して無色プ
リズム状結晶１０ｇを得た（融点１３１−１３３℃）。
Ｉ　Ｒ（ＣＨ２ＣＤ　２）　：　３５８０−１　　　　
−１　　　　−１　　　　−１ｃｍ　　、　３３２０ｃ
ｍ　　、　２９１０ｃｍ　　、　１５９０ｃｍ　　、　
１５８０ｃｍ−’１４４０ｃｍ’により生成物の構造が
次式の通りであることを確認した。
実施例　１ 参考例３に従って製造したメトキシ（３−ヒドロキシフ
ェニル）メチレンアダマンタン（１，１ｇ。
０．００４モル）をアルゴン雰囲気下でモレキュラーン
ーブ乾燥（３人）ベンゼン１５ｍ１に溶解した。トリエ
チルアミン（０，５７ｍ１．０．００４モル）を注射器
から加えた。この撹拌溶液を水浴で０℃に冷却し、２−
クロロ−２−オキソ−１，３−ジオキサホスホラン（０
，３７ｍ１．０．００４モル）を滴下した。水浴中でＬ
Ｏ分後、粘稠な混合物を室温へ徐々に温め、３．５時間
撹拌した。ベンゼンを真空除去し、アルゴン下でエーテ
ル６０ｍ１を加えた。この懸濁液を不活性雰囲気下で濾
過し、得られた固形物を２０ｍ１ずつのエーテルで３回
洗った。消液を真空除去してリン酸トリエステル１．６
ｇを粘稠な無色の油状物１ １６００ｃｍ　　、　１５７５ｃｍ−１，１３００ｃｍ
−’　（Ｐ＝０）　、フェノール性ＯＨの伸縮またはＣ
＝　０　（１６７０ｃｍ−’）の吸収はＩＲスペクトル
に存在しなかった。ＴＬＣで出発物質のないことを確認
した。これらのデータは３−　（アダマンチリデンメト
キシメチル）フェニルエチレンホスフェートの下記構造
と一致した。
上記の油状物はＤＭＦ７ｍｌに溶解し、ＤＭＦ中のシア
ン化ナトリウム＜０．２Ｌｇ：、　０．００４モル）を
加え、この混合物を室温で２４時間撹拌した。得られた
黄色の溶液を５０℃で真空除去し、２ｍｌずつのキシレ
ンで数回追い出し、残留物をエーテルで摩　　時間の減
圧乾燥後に吸湿性の白色固体（１１５℃で微砕してガム
を得、そのガムをＣＨＣ１に取り、　　結し、１３０〜
１３３℃で融解する）　０．９５ｇを得た。
２ 真空除去して淡黄色の非晶質発泡体１．５ｇを得た。　
　ＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８−０，１％酢酸アンモニウム／
１５９５ｃｍ−１，１５７０ｃｍ−’、　１４７５ｃｇ
ｎ−’、　１２７５ｃｇｎ−’　（Ｐ＝０）　、　１２
３５ｃｍ　　、　１１００ｃｍ−１゜これらのデータは
ナ１ トリウム３−　（アダマンチリデンメトキシメチル）フ
ェニル−２′−シアノエチルホスフェートの予測された
下記構造と一致した。
ＣＨ３ＣＮ勾配）は１つの主要なピークを示した。
ＩＲ（ヌジョール）　　：　１５９５ｃｍ　　、　１５
７５ｃｍ−’、　１２４５１ ａｍ　　　１２００ｃｍ−１１０９５ｃｍ−１１０８０
ｃｍ−’　　８９０ｃｍ−’１ ＵＶ（２０％Ｍ　ｅ　ＯＨ−ジオキサン）λ１Ｉｌａｘ
２６０／ｎｍ；ε＝１０．００（１，これらのデータに
より生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
この塩（１，５ｇ　、　０．００３５モル）は水５ｍｌ
に溶解した。次いで、濃水酸化アンモニウム（５ｍｌ　
）を滴下した。この溶液を室温で一晩撹拌した。
得られた白色スラリーを水浴中で冷却し、アセトニトリ
ル３０ｍ１で処理した。濾過し、１５ｍ１ずつの冷アセ
トニトリルで２回洗浄して、短実施例　２ ラム塩 大きい培養試験管中で、実施例１に従って製造したエノ
ールエーテルホスフェート塩０．０６５ｇ（０，０００
１７モル）をＣＨＣＩＩ！　３２５ｍ１に溶解した。シ
リカゲル上のメチレンブルー（シリカゲル１ｇ当たり染
料０．００２６ｇ）　０．２１０ｇを増感剤として加え
た。試験管は水冷した浸漬ウェルの内部に２５０ワツト
の高圧ナトリウムランプを含む銀めっきしたデユワ−フ
ラスコに入れた。−枚の５ミルカプトン（Ｋａｐｔｏｎ
；　ＤｕＰｏｎｔ社）をＵＶフィルターとしてウェルの
内部に置いた。この装置に氷水をポンプで送り、試料の
温度を１５０℃以下に保った。乾燥酸素の連続流を毛細
管を通して反応容器に送った。気体流は固相増感剤の均
一懸濁液を維持するように調節した。２５分の照射時間
後、出発物質のＵ　Ｖ　（２６０ｎｍ）吸収が消失した
。淡黄色溶液を濾過し、蒸発させ、水１０ｍ１で再調製
した。この水性試料は０．４５ミクロンのナイロンフィ
ルターを通して濾過し、逆相Ｃ１８分離用ＨＰＬＣカラ
ムでクロマトグラフにかけ、水／アセトニトリル勾配で
溶出した。２７７ｎｍで弱いＵＶ吸収を示す各画分を合
わせ、凍結乾燥してジオキセタンを白色の綿状吸湿性固
体として得た。この固体は融点を示さずに１４５°〜１
５０℃で分解してアダマンタノンを生成して昇華し、部
分的に分解して残留した固体は２７０℃以下では融解し
ない。’ＨＮＭＲ（Ｄ２０゜ｐｐａ＋）　：　０．８９
−１．８５（ｍ、１２１１）　；　２．１０（ｓ、１１
１）　；　３．１５（ｓ。
４＋１）。ＩＲ（ヌジョールマル、　ｃｍ−１）　：　
３１２０゜１９７０−１７９０　（弱い１幅広−ＮＨ４
）　、１６４０（幅広）。
１８００　（弱い）　、　１５８０．１２８４．１２７
３．１１２２．９８０゜８９５゜この生成物の構造は上
記ＩＲおよびＮＭＲスペクトルにより次式の通りである
と確認した。
実施例　３ ルー１，２−ジオキセタン、ジナトリウム塩メトキシ（
３−ホスホリルオキシフェニル）メチレンアダマンタン
ナトリウムアンモニウム塩＜３．３ｆ）をＩＦＪのピリ
ジンを含何する１５ｍ１の水に溶解させた。この溶液（
該化合物をピリジニウム塩の形で含む）をアンバーライ
トｌＲ１２０（プラス）イオン交換樹脂（アルドリッチ
ケミカル社製）の３　ｃｍ　Ｘ　２５ｃｍのカラムにゆ
っくり通した。蒸留水でこのカラムを溶出すると、２８
０ｎｍに吸収を示すフラクションが得られ、これらをい
っしょにして凍結乾燥した。得られたモノピリジニウム
塩（１ｇ、２．３ミリモル）の１部を１００＋ｎｌのＣ
Ｈ（Ｊ１３（Ａｇ２０３で乾燥）に溶解した。得られた
溶液を大きなシリンダー状の試験管に入れ、５，１０，
１５゜２０−テトラフェニル−２１１Ｊ、２３Ｈ−ポル
フィン（２ｍｇ、　　１ｍｌ　　ＣＨＣｐ　ｓ中）で処
理した。得られた均一な緑色の溶液を０℃に冷却し、ス
パージャ−管を通して酸素ガスで前辺って飽和した。こ
の混合物を銀デユワーフラスコ中で一定の０２流下に照
射した。このフラスコはデュポンのカプトン（Ｋａｐｔ
ｏｎ）ポリイミドフィルムの単一シート（５ミル）で露
光された２５０ワツトナトリウム蒸気ランプの周りを囲
む冷却された浸漬壁をも含んでいる。デユワ−フラスコ
中の温度は、１２分間の照射の間００〜５℃に維持され
た。溶媒を真空で除去し、続いて５００■のＮ　ａ　　
ＨＣＯａを含有する１００ｍ１の蒸留水を添加した。得
られた淡いピンク色の溶液を冷却し、０．４５ミクロン
のテフロン膜を通して濾過した。得られたジオキセタン
の水溶液を、ポリスチレンカラム中ＣＨ３−ＣＮ−０，
５％Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ勾配を使用した調製用逆相ＨＰＬ
Ｃに付した。続いて２回目は、ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２ｏ勾配
を使用してカラムに通した。得られた溶液（無機塩を含
まない）を凍結乾燥して８００ｍｇの粒状のかすかに黄
色がかった白色固体を得た。この固体は融点を示さずに
１４５’〜１５０℃で分解してアダマンタノンを生成し
て昇華し、部分的に分解して残留した一体は２７０℃以
下では融解しない。
轟ＨＮＭＲ（Ｄ　２０）　　：　　δ０．８５−　δ１
．７５（＋ｇ、１２１１）：δ２．１５（ｓ、１ＩＩ）
　；δ２．７５（ｓ、１ＩＩ）　；δ３．１０（ｓ、３
１１）　；δ７．１０−δ７．３５（ｍ、４１１）。Ｉ
Ｒ（ヌジョールマル）　　：　１６００ｃｍ−１（弱い
）　、１５８０ｃｍ−’、１２８５ｃｍ−’１２７５ｃ
ｍ−（、ｌ１２０ｃｍ−’　（幅広）　、９８０ｃｍ−
’、８９５ｃｍ−を使用例　１ ビーズ形式ｈＣＧ検定（血清または尿）抗ｈＣＧ抗体被
覆ビーズおよび抗ｈＣＧ抗体：アルカリ性ホスファター
ゼコンジュゲートはハイブリチク・タンデム・アッセイ
・キット（ｌｌｙｂｒｉｔｃｅｈ　Ｔａｎｄｃｇ　Ａｓ
５ａｙ　Ｋｉｔ）から得られた。
以下に実施例３で合成した１、２−ジオキセタン（ＡＭ
ＰＰＤ）ジナトリウム塩（以下の使用例ではこの塩をＡ
ＭＰＰＤと略記した。）をアルカリホスファターゼの基
質として用いた場合のｈＣＧの検定を示した。比較のた
め、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として比色定量検
定した。
１、ビーズから過剰の緩衝液を吸い取った後、各試験管
（１２ｘ７５１１１１）に１個のビーズを入れた。
２、各試験管に抗ｈＣＧ抗体ホスファターゼコンジュゲ
ート１００μＱを加えた。
３、各試験管に試料ｔＯＯμｇを加えた。別の試験管に
以下のものを準備した： ａ）対照ゼロ試料（男性の血清または尿）ｂ）　２５ｍ
　Ｉ　Ｕ／ｍｌ　　ｈ　ＣＧ標品（血清または尿）Ｃ）
　２００ｍ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ　　ｈ　ＣＧ標品（血清また
は尿）ｄ）患者試料（血清または尿） ４、混合後、試験管にカバーをかぶせて３７℃で９０分
間インキュベートした。
５、コンジュゲートおよび試料を含む反応液を吸引除去
した。
６、ビーズを０．１％ツイーン２０を含むリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７，４）　２．０ｍｌで３回洗った。
比色定量検定 ７゜ ８、０．１　Ｍグリシン、 １ｍＭ　　Ｍｇ（、Ｑ２ （ｐＩＩｌＯ，４）中の１−ｇ／ ｍｌ　　ｐ−ニトロフエ 化学発光検定 ？、　０．０５Ｍ炭酸塩、 １１１ＭＭｇＣρ２ （ｐＨ９，５）で１回 洗った。
８、０．０５Ｍ炭酸塩、 １ｅＭ　　ＭｇＣＮ２ （ｐＨ９，５）中の０．４ ｓ＋Ｍ　　ＡＭＰＰＤ ニル−ホスフェート２５０μＱを加えた。
（ＰＮＰＰ）２００μｇ を加えた。
９、室温で３０分インキュ　９．３０℃で２０分インベ
ートした。　　　　　　　キュベートした。
１０、発色を止めるべく１０゜ ０．１Ｍグリシン、ＩＯ ａ＋Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ９，５）１．５ｍｌ
を加えた。
１１、分光光度計で４０５ｎｍ　　１１．ターナ−２０
Ｅルミでの吸光度を測定　　　ノメーターで６試した。
　　　　　　　　　　駅前の発光の１０秒間積分値を測
定 した。
１２、両検定のデータはｈＣＧの各濃度でのシグナルを
ゼロｈＣＧでのシグナルで割った値をｈＣＧの濃度に対
してプロットした。代表的なデータを第１図に示す。こ
こでＰＮＰＰは比色定量検定を、そしてＡＭＰＰＤは化
学発光検定を表す。化学発光検定は比色定量検定よりも
４倍以上高感度であった。
使用例　２ 市販のタンデムＩＣ０Ｎ　　ＩＩ検定キットを使用した
。緩衝液および抗体はすべてこのキットの中に含まれて
いるものを使用し、アルカリホスファターゼの基質は実
施例３で合成したジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）を使用し
た。
方法 １、被検試料として使用するために、対照陰性（雄）尿
で希釈した０、　　５．１０．５０ｍ　Ｉ　Ｕ／ｍｌの
ｈＣＧ標品を用意した。
２、ＩＣ０Ｎメンプラン容器の中央に、１度５滴の試料
を滴下した。
３、各容器のψ央に３滴の酵素抗体コンジュゲートを加
えた。
４゜１分インキュベートした。
５、装置にハイプリチクＩ　ＣＯＮ洗液洗液２金ｌえ、
排出させた。
６、０．１Ｍ　＋−リス、１　ａ＋Ｍ　　Ｍ　ｇ　（、
Ｑ　２　（ｐＨ９，８）中の０，１％Ｂ　Ｓ　Ａ　５０
０μＱを加えた。排出させた。
？、　５０μｙ：／　ｍｌ　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ　１０
．１％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣ１２を含む０．１Ｍ　トリ
ス緩衝液（ｐＨ９，８）、２００μＱを加えた。
８、ＩＣ０Ｎ膜をとり出し１枚のマイラーに移行させ、
フィルムを露光すべく暗箱に入れた（ポラロイド型６１
２）。
９、フィルムを３０秒間露光した。代表的な検定の結果
を第２図に示す。陽性試料では強い化学発光が３０秒の
反応時間内に起こった。
使用例　３ アルカリ性ホスファターゼの検定 アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。
成分 緩衝液：　０．０５Ｍ炭酸塩、１ｔａＭ　　ＭｇＣ１２
（ｐＨ１９，５〉 基　質：　０．４ｍＭ濃度の３−（２’−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキ
シ）フェニル−１，２−ジオキセタンジナトリウム塩（
ＡＭＰＰＤ） アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中１．１６８μｇ／
ｍｌのアルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試
験管内で次の最終酵素濃度となるように行った： ４．１７ＸｌＯへ１１Ｍ　　　１．６７Ｘ１０−１５Ｍ
８．３４ＸｌＯＭ　　　ｇ、３４Ｘ１０”　Ｍ１２ １２ １．６７Ｘ　ｔｏ　　　Ｍ　　　４．１７Ｘ　１０”　
Ｍ１３ ３．３４ＸｌＯＭ　　　２．０９Ｘ１０”　Ｍ６．６８
　Ｘ　１０”　Ｍ １．３４Ｘ　１０”−’　Ｍ ３．３４Ｘ　１０−１５Ｍ 手順： 上記濃度のアルカリ性ホスファターゼを含みさらに０．
４ｄＡＭＰＰＤを含む２通りの試験管は３０℃で２０分
インキュベートした。インキュベーション後、ターナ−
２０Ｅルミノメータ−で３０秒間の発光積分量を測定し
た。アルカリ性ホスファターゼの検出限界を表１に示す
。第３図には、０．４ｓＭＡＭＰＰＤを用いたアルカリ
性ホスファターゼの検出データを示す。発光は１ｏ（４
〜１０”　Ｍ酵素の間で直線状であった。
表　　　　■ １、緩衝液７０．０５Ｍ炭酸塩、１ｍＭ　　ＭｇＣ１）
２、ｐＨ＝９．５゜温度：３０℃。化学発光化合物濃度
：　０．４ｍＭ。
２、かっこ内の数字は表示濃度でのバックグラウンドレ
ベルの倍数である。
使用例　４ 検定 アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。
成分 緩衝液７０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、１ｆｌ１Ｍ　Ｍｇ
Ｃｇ２（ｐＨ９，５） 基　質：　０．４ａ＋Ｍ濃度の３−（２’−スピロアダ
マンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオ
キシ）フェニル−１，２−ジオキセタンジナトリウム塩
（ＡＭＰＰＤ） アルカリ性ホスフγターゼ：緩衝液ψｔ、ｉｅｓμｇ／
ｍｌの原液 条件： １、緩衝液のみ（対照） ２６緩衝液＋ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）３、緩
衝液子ＢＳＡ−フルオレセイン（ＢＳＡ対フルオレセイ
ンの比１：３） ４、ｇ衝液十ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチル
−アンモニウムクロライド））（ＢＤＭＱ）５、緩衝液
＋ＢＤＭＱ＋フルオレセイン　（ＢＤＭＱｌ　ｍｌと混
合したフルオレセインジナトリウム塩０．０１■） アルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管中
で次の最終酵素濃度となるように行った：ここで条件２
〜５の緩衝液以外のエン／＼ンサー成分は系全体の０．
１重量％存在する。
４．１７ＸｌＯＭ　　　　１．６７ＸｌＯ−１５Ｍ１１ ８．３４Ｘ１０　　　Ｍ　　　　８．３４Ｘ１０−１６
Ｍ１２ １．６７ＸｌＯＭ　　　　４．１７Ｘ１０”　Ｍ１２ ３．３４Ｘ　１０　　　Ｍ　　　　２．０９ｘ　１０−
１６Ｍ１３ ６、ｆ３８ＸｌＯ”　Ｍ　　　　１．ＯＸＩＯ”　Ｍｌ
、３４ＸｌＯＭ　　　　５．ＯＸｌ０−１７Ｍ１４ ３．３４Ｘ１０　　　Ｍ　　　　２．５　Ｘｌ０−１７
Ｍ１５ 手順： いろいろな条件において、上記各種濃度のアルカリ性ホ
スファターゼに０．４ｍＭ　　ＡＭＰＰＤを加えた２通
りの試験管を３０℃でインキュベートした。
条件１．４および５は２０分インキュベートし、条件２
および３は９０分インキュベートした。
インキュベーション後、ターナ−２０Ｅルミノメータ−
で３０秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性ホスフ
ァターゼの検出限界に対するＢＳＡ。
ＢＤＭＱおよびフルオレセインの効果を第４図および表
Ｈに示す。第４図中−口−は上記条件１、−一一■−−
−は条件２、−一一〇−−−は条件３、−一−・−−−
は条件４、−一−Δ−一一は条件５を各々示す。
表　　　■ 添加 なし ０．１％ＢＳＡ バックグラウンドの ２倍のカウント量を 示すアルカリ性ホス ファターゼの濃度 １．０刈ｏ−１４Ｍ ９．５ＸｌＯ″″１５Ｍ アルカリ性ホスファ ターゼの最低検出濃度 １．８７Ｘ１０−１５Ｍ（１，１２）’８．３４刈０−
１６Ｍ（１，０６） ０．１％ＢＤＭＱ ４、ＯＸｌｏ−１５Ｍ １．００刈０”　Ｍ（１，０７） ｌ、かっこ内の数字は表示濃度でのバックグラウンドレ
ベルの倍数である。
使用例　５ 膜：ジーン・スクリーン・プラス社（ＧｅｎｅＳｃｒｅ
ｅｎ　Ｐｌｕｓ）、の陽性荷電したナイロン膜緩衝液：
変性緩衝液：０．５Ｍ　　ＮａＯＨ中和緩衝液：　０．
４Ｍ　　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２，０） 負荷緩衝液：変性緩衝液　１部 中和緩衝液　１部 膜湿潤緩衝液：　０．４Ｍ　トリス（ｐＨ７，５）膜プ
レハイブリダイゼーション緩衝液：最終濃度 ０．５ｍｌ　　１００ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液　　
　５％０．５ｍｌ　　１０％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　　　　　　
　　０．５％２．５ｍｌ　　２０ＸＳＳＰＥ　　　　　
　　　５％２．０■　変性、超音波処理サケ　　２００
μｇ／ｍｌ精子ＤＮＡ ｄＨ２０ ０ｍｌ 膜パイブリダイ５−シ”′緩衝液”最終濃度０．５ｍｌ
　　１００　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’ｓ溶液　　　　
５％０．５ｍｌ　　１０％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　　　　　　　
　　　　Ｏ，５％２．５ｍ１　２０ｘＳＳＰＥ　　　　
　　　　　　　５％２．０■　　サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　
　　　　　２００μｇ／　ｍ１２．０ｍｌ　　５０％硫
酸デキストラン　　　ｌＯ％ｄＨ２０ ０ｍｌ 洗浄緩衝液！＝ ＩＸｓｓＰＥｌｏ、１％　ＳＤＳ ２０ｍｌ　　２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ ４ｍｌ　　１０％　ＳＤＳ ３７６ｍｌ　　ｄｄＨ２０ ００ｍ１ 洗浄緩衝液■：洗浄温度に予備加温した０、１×Ｓ　Ｓ
　Ｐ　Ｅｌｏ、１％　ＳＤＳ ２ｍｌ　　２０ｘＳＳＰＥ ４ｍｌ　　１０％　ＳＤＳ ００ｍ１ （加温） 洗浄緩衝液■： ０．ｌｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅｌｏ、１％ ２０ｍ１　２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ ４ｍｌ　　１０％　ＳＤＳ ３９４ｍＭ　　ｄｄ　Ｈ２０ ＳＤＳ ００ｍ１ 洗浄緩衝液■： ３１Ｍ　　）リスーＨＣρ（ｐＨ９，５）０．８ｍＭ　
　ＩＭ　　トリズマ塩基（Ｔｒｉｚｓ＋ａ　Ｂａ５ｅ）
１９９．４ｍＭ　　ｄｄＨ２０ ２００，０ｍ１ １００Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液：分子ｆ１４０に
のポリビニルピロリドン（ｐｖｐ−４０）２ｇおよびフ
ィコール２ｇを６５℃以上の沸点以下の温度で溶解した
。この溶液を約４０℃に冷却し、ＢＳＡ２ｇを加え、ｄ
ｄＨ２０で最終容量を１００ｍ１とした。アリコートに
分けて、−２０℃で貯蔵した。
２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ ２ＯＸＳＳＣ（全量１００ｍ１） ３、ＯＭ　塩化ナトリウム　　　　１７．４ｇ０．３Ｍ
　クエン酸ナトリウム　　　８．８ｇ容量を１ｏＯｃｎ
ｌとなし、０．４５μｓニトロセルロースフイルターを
通して濾過し、室温で貯蔵した。
２０ＸＳＳＰＥ ２０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　（ｐＨ７，４）　（全量ＩＩ
）３．６Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｆ１　　　　　　２１０．２
４ｇ２００１Ｍ　　リン酸ナトリウム　　２３ｇ二塩基
性５．９２ｇ−塩基性 ２０ａＭ　　ＥＤＴＡ　　　　　　７．４４ｇ溶解し、
５Ｎ　　ＮａＯＨでｐＨ７，４に調整し、容量をＩｎと
し、０．４５ｕＩＭニトロセルロースフィルターを通し
て濾過した。
　ｘＴＥ １ｘＴＥ緩衝液　　　１０１Ｍトリス（ｐＨ７、０）ｌ
ｓ＋Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ オートクレーブ処理 方法： １、膜を湿潤緩衝液で１５分間前もって湿らせた。
２、　ＪＩＢを真空マニホールド装置に挿入した。
３、ＤＮＡ試料（既知コピー数のＨ３ＶＩ　　ＤＮＡを
含む）５０μｇを変性緩衝液２００μＱに加えることに
よりＤＮＡ試料を変性した。室温で１０分インキユヘー
トシた。水冷したψ和緩衝液２５０μｇを加え、変性Ｄ
ＮＡを氷上に保持した。
４、各ウェルに負荷緩衝波２００μＱを加え、膜を通し
て吸引した。
５６各ウエルに変性ＤＮＡ試料を加え、膜を通して吸引
した。
６、ステップ４を繰り返した。
７、マニホールドを解体し、膜を取り出した。
８、ＵＶトランスイルミネーターを使ってＤＮＡを膜へ
５分間ＵＶ固定した。
９、膜をプレハイブリダイゼーション緩衝液中７０℃で
１時間インキュベートした。
１０、膜ハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したＨ８
ＶＩに特異的なアルカリ性ホスファターゼ標識５ＮＡＰ
プローブを加えた。７０℃で３〜５時間インキュベート
した。
１１、膜をハイブリダイゼーション緩衝液から取り出し
、洗浄緩衝液Ｉ　４００ｍ１中室温で撹拌しながら１０
分間インキュベートした。
１２、洗浄緩衝液ＩＩ　４００ｍ１で５０℃、３０分洗
浄した。
１３、洗浄緩衝液ｍ　４００ｍ１で室温、１０分洗浄し
た。
１４、洗浄緩衝液ＴＶ　２００ｍ１で室温、１０分洗浄
した。
１５、膜を１枚のＷｈａｔ■ａｎブロッティングペーパ
ー上に置いた。
１６、３００μｇ／ｍｌ　　ＡＭＰＰＤを含む０．１Ｍ
　トリス、１ｍＭ　　ＭｇＣｆ　２　（ｐ１１９．８）
　２ｍＭを加え、膜を通過させた。
１７、その膜を１枚のマイラーへ移行させ、その後８１
２型ポラロイドフイルムを含む暗箱へ入れた。
１８、フィルムを３０分露光した。代表的な結果を第５
図に示す。ここで第５Ａ図は６０μｇ／ｍｌＡＭＰＰＤ
での結果を示し、第５Ｂ図は３００μｇ／ｍｌ　　ＡＭ
ＰＰＤで（７）結果、そして第５Ｃ図は３００ｘ／ｍｌ
　　ＡＭＰＰＤでの初めの３０分の反応後の結果を示す
。
使用例　６ 抗ＡＦＰ抗体被覆ビーズおよび抗ＡＦＰ抗体：アルカリ
ホスファターゼコンジュゲートはハイブリチク・タンデ
ム・アッセイ・キットから得られた。
１９各試験管に試料２０μｇを加えた。試料は０．２５
゜５０、１００．および２００＋ｎｇ／　ｍｌ　　Ａ　
Ｆ　Ｐであった。
２、各試験管に１個のビーズを入れた。
３、各試験管に抗ＡＦＰ抗体アルカリホスファターゼコ
ンジュゲート２００μＱを加えた。
４、ラックを振って試験管の内容物を混合した。
５、試験管にカバーをかけた。
６６３７℃で２時間インキュベートした。
７、抗体および試料を吸引除去した。
８ｏ　ビーズをリン酸緩衝溶液〈ρ１１７．４）中の０
．１％ツイーン２０　２．０ｍＭで３回洗った。
比色定量検定 ９゜ １０、０．１Ｍグリシン、 １回Ｍ　　　ＭｇＣａ　２ （ｐｌｌｌｏ、４）中の１回ｇ／ ｍｌ　ｐ−ニトロフェ ニル−ホスフェート （ＰＮＰＰ）２００μｇ を加えた。
１１、室温で３０分インキュ ベートした。
１２、発色を止めるべく ０．１Ｍグリシン、１０ ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＪＩ９．５）１．５ｍｌ
を加えた。
１３、分光光度計で４１０ｎ＊ での吸光度を読み 化学発光検定 ９、０．０５Ｍ炭酸塩、 Ｉ　ＩＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１２ （ｐＨ９，５）で１回 洗った。
１０、０．０５Ｍ炭酸塩、 Ｉ　ＩＭＭ　ｇ　Ｃ、Ｑ　２ （ｐＨ９，５）中の０．４ ｍＭＡＭＰＰＤ ２５０μＱを添加した。
１１、３０℃で２０分イン キュベートした。
１２゜ １３、ターナ−ルミノ メータ−で各試験 取った。　　　　　　　　管の１０秒間積分を読み取っ
た。
１４、両検定のデータはＡＦＰの各濃度でのシグナルを
ゼロＡＦＰでのシグナルで割った値をＡＦＰの濃度に対
してプロットした。第６図に示すように、比色定量検定
の結果はＰＮＰＰＩＩＩＩ線で表され、そして化学発光
検定の結果はＡＭＰＰＤＩｌｌＩ線で表される。後者の
検定は前者の検定の約１０倍の感度であることが分かる
。
使用例　７ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）検定 物質： 被分析体捕獲用の１／８インチビーズを、マウスモノク
ローナル抗ＴＳＨ−β抗体で被覆した。
マウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体はアルカリ性ホスフ
ァターゼと結合させて、検出用抗体（抗体酵素コンジュ
ゲート）として使用した。
ＴＳＨはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号８０９３
９Ｂから得られ、ＢＳＡ（Ｖ型−脂肪酸不含）はＳｉｇ
ｍａ社カタログ番号Ａ　６００３から得られた。
被検液および抗体酵素コンジュゲートに用いた緩衝液は
０．１Ｍ　）リス−ＨＣＮ、１ｍＭＭｇＣＲ２および２
重量％Ｂ　Ｓ　Ａ　（ｐＨ７，５）である。
基質緩衝液は０．１Ｍトリス、０．１ｍＭ　　ＭｇＣ１
２（ｐＨ９，５）および基質ＡＭＰＰＤ（５０■／ｍｌ
）を含んでいた。
手順： ＴＳＨ含有被検溶液（１５μｍ２）は抗体酵素コンジュ
ゲート溶液１３５μＱと混合した。この溶液に上記のよ
うに被覆した１／８インチビーズ２個を加え、２３℃で
２時間インキュベートした。その後、ビーズを０．１Ｍ
　）リス（ｐ１１７．５）で４回洗い、反応試験管へ移
した。上記の基質を含む緩衝液２００μｇを試験管に加
えた。２０分インキュベーション後、ベルトールド・ク
リニルマット・ルミネッセンス・アナライザー（Ｂｅｒ
ｔｈｏｌｄ　Ｃ１１ｎ１１ｕｓａｔＬｕｓ１ｎｅｓｃｅ
ｎｃｏ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使って１０秒間のカウン
ト数として発光量を記録した。
第７図（下記表■のデータのプロットである）は所定の
ＴＳＨ濃度に対する発光強度を示す。１μＵ　／　ｍｌ
と８μＵ／ｍＩのＴＳＨの間で直線性を示した。
表　　　　■ ０．２５ ０．４９ １、ｌ 比較のために、ＢＳＡの不存在下で同じくＴＳＨ検定を
行った。第８図に示すように、ＢＳＡ含有試料（ｔｉｌ
ｌ線Ａ）はＢＳＡを含まない試料（曲線Ｂ）よりも所定
のＴＳＨ濃度に対して強い発光強度を示した。
使用例　８ ビーズ形式による癌胎児性抗原（ＣＥＡ）検定抗ＣＥＡ
被覆ビーズおよび抗ＣＥＡ抗体：アルカリ性ホスファタ
ーゼコンジュゲートはノ＼イブリテク・タンデム・アッ
セイ・キットのものを使用した。
１、各試験管に試料２０μＱを加えた。試料は０゜２．
５．　５．１０．２０および５０μｇ／　ｍｌ　　ＣＥ
　Ａの標準を使用した。
２、各試験管に１個のビーズを入れた。
３、各試験管に抗ＣＥＡ抗体酵素コンジュゲート２００
μ２を加えた。
４、ラックを振って試験管の内容物を混合した。
５、試験管にカバーをかけた。
６．３７℃で２時間インキュベートした。
７、反応液を吸引除去した。
８、ビーズを０．１％ツイーン２０を含むリン酸緩衝溶
液（ｐ１１７．４）　２．０ｍｌで３回洗った。
９、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、１ｄＭｇＣρ２（ｐＨ
９，５）で１回洗った。
１０．０．４ｄ　　ＡＭＰＰＤを含有する０、０＆Ｍ炭
酸ナトリウム、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２２　（ｐＨ９，５
）　　２５０μＱを加えた。
１１、３０℃で２０分インキュベートした。
１２、ターナ−２０Ｅルミノメータ−で各試験管の発光
を１０秒間の積分値としてカウントした。
１３、ｃＥＡの各濃度でのシグナルをゼロＣＥＡでのシ
グナルで割った値をＣＥＡの濃度に対してプロットした
。ＡＭＰＰＤを用いたＣＥＡ検定の代表的データを第９
図に示す、Ｏｎｇ／　ｍｌと２０μｇ／ｍ１のＣＥ、Ａ
ｆｉ度の間で直線性を示した。
使用例　９ ヒト黄体ホルモン（ｈＬＨ）の検定 直径約３−一のナイロン膜（ボールイムノダイン（Ｐａ
ｌｌ　ｌ−ｍｕｎｏｄｙｎｅ）製、孔サイズ０．４５ミ
クロン）を、リン酸塩緩衝液中に固相用の捕捉モノクロ
ーナル抗ＬＨ抗体（メディックス（Ｍｅｄｉｘ）より市
販、カタログ＃　Ｌ　−４６１−０９）　１　ｕｇ／ｍ
ｌの溶液５μＱで感作した。続いて、上記膜をｐｕｔ、
ｓのリン酸塩緩衝液添加生理塩水中２％カゼイン溶液で
ブロックした。次いでこの膜を第１０図に示した装置（
プロッティングペーパー層を含む）にセットした。
第１Ｏ図中ａはプレフィルタ−カップを示し；ｂはプレ
キシグラストップを示し；Ｃはポールイムノダインメン
ブレム（孔サイズ０．４５μ）を示し；ｄはポリプロピ
レンアセテートの羽毛状層を示し；ｅはプロッティング
ペーパーを示し；ｆはプレキシグラスを示す。
使用された検出抗体は、メディックスより市販のマウス
モノクローナル抗ＬＨ抗体（カタログ＃Ｌ　−４６１−
０３）を用いた。この抗体を、グルタルアルデヒドカッ
プリング法（Ｖｏｌ　Ｉｅｒ、＾ａｔ、　ａｌ。
Ｂｕｌｌ、　Ｗｏｒｌｄ　）ｌｅａｌｔｈ　Ｏｒｇ、、
　５３．５５　（１９７Ｂ））によリアルカリ性ホスフ
ァターゼ（バイオザイム（Ｂｌｏｚｙｓｅ）より市販、
カタログ＃ＡＬＰ　Ｉ　−１１Ｇ）と結合させて抗ＬＨ
抗体アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートを調製し
た。
方法 ５０μＱの上記検出抗体コンジュゲートを下記濃度のｈ
ＬＨ溶液２００μｇを含有する試験管に添加した：ｈＬ
Ｈ濃度（ｎｇ／ｍｌ　（Ｐ　Ｂ　Ｓ　））各試験管の内
容物を捕捉抗体（前述）であらかじめ感作しておいた４
枚のナイロン膜に加えた。
５分間インキュベーション後、プレフィルタ−カップを
取り除き、上記膜を、リン酸塩緩衝酸添加生理塩水中０
．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０溶１皮４００
μＱで洗った。続いて、０．０５Ｍ炭酸塩、１ａ＋ＭＭ
ｇＣρ　、０．１重量％Ｂ　Ｓ　Ａ　（１）１１９．５
）中０．４ｍＭ（３−（２’−スピロアダマンタン）−
４−メトキシ−４（３′−ホスホリルオキシ）フェニル
−１，２−ジオキセタンジナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）
溶液工００μＱを加えた。上記ナイロン膜をタイプ６１
２ポラロイドインスタント白黒フイルムを入れたカメラ
ルネミノメーターに入れ、１分間露光した。
フィルムに画像形成した検定結果を第１１図に示す。
次に、上記画像の反射濃度を、トビアスＲＢＰポータプ
ル白黒反射デンシトメーター（Ｔｏｂ　１ａｓＲＢＰ　
Ｐｏｒｔａｂｌｅ　Ｂｌａｃｋ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　
ＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎＤｃｎｓｌｔｏｍｃｔｃｒ）　　
（ペンシルバニア州１８９７４−０３４７アイビ一ラン
ド私書箱２６９９インダストリアルドライブ５０のトビ
アスアソシエーツ（ＴｏｂｆａｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ
）製）を使用して測定した。反射濃度をＬＨ濃度に対し
てプロットして第１２図に示すようなｈＬＨについての
標準曲線を得た。
【図面の簡単な説明】
第１図は基質としてＰＮＰＰおよびＡＭＰＰＤを用いた
ｈＣＧ検定の結果の比較を示す図であり；第２図はタン
デムＩＣ０Ｎ　　ｎ　　ｈＣＧ検定の結果を示す写真で
ある； 第３図は０．４ｍＭ　　ＡＭＰＰＤを用いたアルカリ性
ホスファターゼ検定の結果を示す図であり；第４図はウ
シ血清アルブミンおよび／または螢光物質の存在下にア
ルカリ性ホスファターゼ検定を行なった結果を示す図で
あり； 第５Ａ図はｆ３０ｕｇ／　ｍｌ　　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ
を用いたＨ８ＶＩ　　ＤＮＡプローブ検定の結果を示す
写真であり、第５Ｂ図は３００μｇ／　ｍｌ　　Ａ　Ｍ
　Ｐ　Ｐ　Ｄでの結果を示す写真であり、そして第５Ｃ
図は３００μｇ／ｍｌ　　ＡＭＰＰＤでの初めの３０分
の反応の後の結果を示す写真であり； 第６図は基質としてＡＭＰＰＤおよびＰＮＰＰを用いた
ＡＦＰ検定の結果の比較を示す図であり；第７図は基質
としてＡＭＰＰＤを用いたＴＳＨ検定の結果を示す図で
あり； 第８図はＢＳＡの存在下および不在扛下でのＴＳＨ検定
の結果の比較を示す図であり；第９図は基質としてＡＭ
ＰＰＤを用いたＣＥＡ検定の結果を示す図であり； 第１０図はｈＬＨ検定に使用した装置の構成を示す図で
あり； 第ｉｔ図はｈＬＨ検定に使用したフィルム上の画像を示
す写真であり； 第１２図はｈＬＨ検定に使用したｈＬＨＬＨ濃度準曲線
を示す図であり、縦軸は反射濃度である。 矛　１　図 ｈＣＧ掛丸 遍１ｊζＬＴの　ＰＮＰＰおＪひ−ＡＭＰＰＤ〜【較（
外４名） ｈ　ＣＧ、　ｍｌ（Ｊ／ｍｌ 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　２ 上Ｊオのスオ：、、、）−６ 戸も・Ｅ生村架、 第 習 Ａ’ＦＰ。 ｎｑ／ｍｌ 第 ７ 図 Ｌ’Ｉｎ７ＡＭＰＰｏ＞Ｍ（Ｊ　ＴＳＨ＊７１丁５日ｒ
　ｍＵ／ｍ！ 第 口 １質とＬ７ＡＭＰｌ）ｐ表甲（・るＣＥＡ擾疋ＣＥＡ、
　ｎｇ／ｍ！ ＬＨ怪定 揖画： 図面の浄書（内容に変更なし） Ｋう０４　Ｙ９イ７’６１２７ｉ　ｎｙＡＩ：ａａｆｆ
ｊ＊Ｌｆ＝ｈＬＨ扮史の赫累 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、１１ 手 続 ？＋［ｉ 正 書（力匍 平成 ２年 ち月、？ｚ日 平成２年特許願第３３５９７号 ２、発明の名称 １゜ ２−ジオキセタン化合物及びその中間体３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物。 ２、Ｒはメチルである請求項１の化合物。 ３、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物。 ４、Ｒはメチルである請求項３の化合物。 ５、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物。 ６、Ｒはメチルである請求項５の化合物。 ７、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルである）の化合物
    。 ８、Ｒはメチルである請求項７の化合物。
JP2033597A 1987-12-31 1990-02-14 １，２―ジオキセタン化合物 Granted JPH0372489A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14019787A 1987-12-31 1987-12-31
US140197 1987-12-31

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63185319A Division JPH0731201B2 (ja) 1987-12-31 1988-07-25 化学発光による測定法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4324674A Division JPH0651708B2 (ja) 1987-12-31 1992-11-11 １，２−ジオキセタン化合物の中間体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0372489A true JPH0372489A (ja) 1991-03-27
JPH0521918B2 JPH0521918B2 (ja) 1993-03-25

Family

ID=22490169

Family Applications (9)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63185319A Expired - Lifetime JPH0731201B2 (ja) 1987-12-31 1988-07-25 化学発光による測定法
JP1501800A Expired - Lifetime JP3025280B2 (ja) 1987-12-31 1989-01-03 １，２‐ジオキセタン類およびその中間体の合成
JP2033597A Granted JPH0372489A (ja) 1987-12-31 1990-02-14 １，２―ジオキセタン化合物
JP2033599A Pending JPH03139298A (ja) 1987-12-31 1990-02-14 化学発光による酵素測定方法
JP2033598A Granted JPH03123791A (ja) 1987-12-31 1990-02-14 １，２―ジオキセタン化合物の製造方法
JP4324674A Expired - Lifetime JPH0651708B2 (ja) 1987-12-31 1992-11-11 １，２−ジオキセタン化合物の中間体
JP5026654A Expired - Lifetime JPH0733346B2 (ja) 1987-12-31 1993-02-16 １，２−ジオキセタン化合物製造用中間体
JP11112353A Pending JPH11335342A (ja) 1987-12-31 1999-04-20 １，２―ジオキセタン類の中間体
JP11234599A Expired - Lifetime JP3280342B2 (ja) 1987-12-31 1999-04-20 １，２−ジオキセタン類の中間体の合成

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63185319A Expired - Lifetime JPH0731201B2 (ja) 1987-12-31 1988-07-25 化学発光による測定法
JP1501800A Expired - Lifetime JP3025280B2 (ja) 1987-12-31 1989-01-03 １，２‐ジオキセタン類およびその中間体の合成

Family Applications After (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2033599A Pending JPH03139298A (ja) 1987-12-31 1990-02-14 化学発光による酵素測定方法
JP2033598A Granted JPH03123791A (ja) 1987-12-31 1990-02-14 １，２―ジオキセタン化合物の製造方法
JP4324674A Expired - Lifetime JPH0651708B2 (ja) 1987-12-31 1992-11-11 １，２−ジオキセタン化合物の中間体
JP5026654A Expired - Lifetime JPH0733346B2 (ja) 1987-12-31 1993-02-16 １，２−ジオキセタン化合物製造用中間体
JP11112353A Pending JPH11335342A (ja) 1987-12-31 1999-04-20 １，２―ジオキセタン類の中間体
JP11234599A Expired - Lifetime JP3280342B2 (ja) 1987-12-31 1999-04-20 １，２−ジオキセタン類の中間体の合成

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6417380B1 (ja)
EP (2) EP0582317B1 (ja)
JP (9) JPH0731201B2 (ja)
AU (1) AU2945189A (ja)
CA (1) CA1341210C (ja)
DE (2) DE68918230T2 (ja)
ES (1) ES2012941A6 (ja)
GR (1) GR1000118B (ja)
IL (1) IL88798A (ja)
MX (1) MX14411A (ja)
NZ (1) NZ227525A (ja)
WO (1) WO1989006226A1 (ja)
ZA (1) ZA889659B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019082428A (ja) * 2017-10-31 2019-05-30 アークレイ株式会社 化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キット

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004565A (en) * 1986-07-17 1991-04-02 The Board Of Governors Of Wayne State University Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
US4931569A (en) * 1988-09-14 1990-06-05 Tropix, Inc. Purification of stable water-soluble dioxetanes
US6022964A (en) * 1989-07-17 2000-02-08 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5362916A (en) * 1989-09-06 1994-11-08 Tropix, Inc. Synthesis of mercaptaryl or hydroxyaryl enol ether alkali metal salts
CA2035029C (en) * 1989-09-06 2001-12-18 Applied Biosystems, Llc Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
US5225584A (en) * 1989-09-06 1993-07-06 Tropix, Inc. Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
CA2141451C (en) * 1992-07-31 2003-10-07 John S. Pease Photoactivatable chemiluminescent matrices
KR0148439B1 (ko) * 1994-03-11 1998-11-02 마사까쓰 마쓰모또 1,2-디옥세탄 유도체
US5631167A (en) * 1995-07-31 1997-05-20 Bayer Corporation Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence
US5777135A (en) * 1995-07-31 1998-07-07 Lumigen, Inc. Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions
US5783381A (en) * 1995-10-19 1998-07-21 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
AU5237699A (en) * 1998-07-28 2000-02-21 Tropix, Inc. Benzothiazole dioxetanes
US6660529B2 (en) * 1998-07-28 2003-12-09 Pe Corporation Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
EP1185710A2 (en) * 1999-04-16 2002-03-13 Zymetx, Inc. Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
US20040038241A1 (en) * 2000-07-26 2004-02-26 Martin Glennsbjerg Spatially resolved enzyme-linked assay
EP1342724B1 (en) * 2002-03-08 2016-01-06 Tosoh Corporation 1,2-dioxetane derivates and reagents employing them
JP4259229B2 (ja) 2003-08-28 2009-04-30 東ソー株式会社 １，２−ジオキセタンの化学発光方法および化学発光用組成物
JP2012140330A (ja) * 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp 水溶性リン酸エステルの精製方法
SI2892900T1 (en) 2012-09-10 2018-01-31 Principia Biopharma Inc. Pyrazolopyrimidine compounds as kinase inhibitors
DE102012109026A1 (de) * 2012-09-25 2014-03-27 Eads Deutschland Gmbh Detektionsvorrichtung und Detektionsverfahren zur automatischen Bestimmung von Biomasse
US11198785B2 (en) 2017-10-13 2021-12-14 Mitsubishi Engineering-Plastics Corporation Polycarbonate resin composition

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57159499A (en) * 1981-03-26 1982-10-01 Fuji Photo Film Co Ltd Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method
JPS639377A (ja) * 1986-06-30 1988-01-16 Sony Corp マルチチヤンネル録画装置
JPS6393777A (ja) * 1986-07-17 1988-04-25 ウエ−ン・ステ−ト・ユニバ−シテイ 化学発光性１，２−ジオキセタン化合物およびその製造法と発光法
JPH0545590A (ja) * 1991-08-16 1993-02-23 Olympus Optical Co Ltd 顕微鏡の粗微動機構

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909557A (en) * 1955-09-07 1959-10-20 Bayer Ag Thiophosphoric acid esters and their production
NL6716437A (ja) 1967-12-02 1969-06-04
US3711556A (en) 1968-06-13 1973-01-16 Du Pont 2-(bis(p-substituted phenyl)methylene)adamantanes
GB1497109A (en) * 1975-10-29 1978-01-05 Beecham Group Ltd Naphthalene derivatives
JPS62176941A (ja) * 1986-01-28 1987-08-03 Sumitomo Electric Ind Ltd 光フアイバ
US4983779A (en) 1986-07-17 1991-01-08 The Board Of Governors Of Wayne State University Process for the preparation of vinyl ethers
JPH0521918A (ja) * 1991-07-11 1993-01-29 Nippon Cement Co Ltd セラミツクス回路基板用導電パターン形成用粉末組成物
JPH0723989B2 (ja) * 1992-08-03 1995-03-15 ビソーディスプレイ株式会社 スクリーン装置
JPH0733346A (ja) * 1993-07-20 1995-02-03 Hitachi Building Syst Eng & Service Co Ltd エレベータの着床制御装置
DE4423811C1 (de) * 1994-07-06 1996-01-18 Fraunhofer Ges Forschung Hydrolysierbare und polymerisierbare Silane, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57159499A (en) * 1981-03-26 1982-10-01 Fuji Photo Film Co Ltd Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method
JPS639377A (ja) * 1986-06-30 1988-01-16 Sony Corp マルチチヤンネル録画装置
JPS6393777A (ja) * 1986-07-17 1988-04-25 ウエ−ン・ステ−ト・ユニバ−シテイ 化学発光性１，２−ジオキセタン化合物およびその製造法と発光法
JPH0545590A (ja) * 1991-08-16 1993-02-23 Olympus Optical Co Ltd 顕微鏡の粗微動機構

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019082428A (ja) * 2017-10-31 2019-05-30 アークレイ株式会社 化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キット

Also Published As

Publication number Publication date
JPH02724A (ja) 1990-01-05
US6417380B1 (en) 2002-07-09
ZA889659B (en) 1989-09-27
AU2945189A (en) 1989-08-01
JPH11335342A (ja) 1999-12-07
WO1989006226A1 (en) 1989-07-13
IL88798A0 (en) 1989-07-31
JP3025280B2 (ja) 2000-03-27
JPH0641158A (ja) 1994-02-15
JP2000001450A (ja) 2000-01-07
CA1341210C (en) 2001-03-27
EP0368946A4 (en) 1990-05-14
IL88798A (en) 1996-01-31
EP0582317A3 (ja) 1994-02-23
DE68918230D1 (de) 1994-10-20
JPH0733346B2 (ja) 1995-04-12
JPH0640996A (ja) 1994-02-15
JPH0731201B2 (ja) 1995-04-10
JPH03123791A (ja) 1991-05-27
JPH0521918B2 (ja) 1993-03-25
JPH0476997B2 (ja) 1992-12-07
GR1000118B (el) 1991-06-28
EP0368946B1 (en) 1994-09-14
EP0368946A1 (en) 1990-05-23
EP0582317A2 (en) 1994-02-09
DE68918230T2 (de) 1995-03-02
DE68929060D1 (de) 1999-09-30
MX14411A (es) 1994-01-31
JPH02502916A (ja) 1990-09-13
DE68929060T2 (de) 1999-12-09
NZ227525A (en) 1992-01-29
JPH0651708B2 (ja) 1994-07-06
EP0582317B1 (en) 1999-08-25
JPH03139298A (ja) 1991-06-13
ES2012941A6 (es) 1990-04-16
JP3280342B2 (ja) 2002-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0372489A (ja) １，２―ジオキセタン化合物
JP2710155B2 (ja) １，２−ジオキセタン化合物及びそれを用いた発光方法
US6582930B1 (en) Porphyrin compounds, their conjugates and assay methods based on the use of said conjugates
US4978614A (en) Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US5573904A (en) 5(6)-Methyl substituted fluorescein derivatives
JP2866419B2 (ja) 希土類クリプテート及びその製造方法とその合成中間体とその蛍光トレーサーとしての利用方法
EP0220284B1 (en) Novel fruorescent compounds and biological diagnostic devices
JPH0718874B2 (ja) ▲蛍▼光複合体及び生物学的診断アッセイ
JPH10509456A (ja) 化学発光ジアルキル基置換１，２−ジオキセタン化合物、その製造方法およびその使用方法
KR940009534B1 (ko) 유기분자와 생물학적 분자를 위한 화학발광성 표시체인 1,2-디옥세탄 화합물
GB2041921A (en) Intermediates useful in the synthesis of chemiluminescent phthalhydrazidelabelled conjugates
US5395938A (en) Biotinylated chemiluminescent labels and their conjugates, assays and assay kits
US20230192658A1 (en) Conjugates including a detectable moiety
JPH07502045A (ja) 新規なビオチン化試薬
EP1119554A1 (en) Xanthan-ester and acridan substrates for horseradish peroxidase
JP2010117140A (ja) アナライト分析方法
JP2583327B2 (ja) 分析で使用するジオキセタン
WO2020058339A1 (en) Coumarin-based crosslinking reagents
KR19990014715A (ko) 에스에이치기 표지용 시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법
JPH08294397A (ja) 免疫学的活性物質の測定方法
USRE36536E (en) Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
JP2009287949A (ja) 抗体又は抗原の定量方法
JP3248628B2 (ja) 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法
JP3325370B2 (ja) 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法
JP5435963B2 (ja) アクリジニウムエステル化合物

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R371 Transfer withdrawn

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090325

Year of fee payment: 16

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090325

Year of fee payment: 16