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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Serratia-marcescens-Stamm,
ein Prodigiosin, und die Verwendung des Prodigiosins auf Gebieten
der Immunsuppression. Genauer gesagt, bezieht sich die vorliegende
Erfindung auf einen neuen Stamm Serratia marcescens, welcher das
Prodigiosin herstellen kann, und die Verwendung des Prodigiosins
als Immunsuppressivum.
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Stand der
Technik
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Seit
einigen Jahren werden aktiv Studien durchgeführt und Forschung dahingehend
betrieben, Immunsuppressiva zu entwickeln, die zum Studium von Immunozyten
und von Immunantworten sowie zur Behandlung von Krankheiten nützlich sind,
die eine Immunsuppression erfordern. Beispielsweise werden Immunsuppressiva
bei der Erforschung nahezu sämtlicher
Immunantworten eingesetzt, einschließlich der Zytokinbildung, der
T-Zellen-Aktivierung, der Antikörperbildung,
des Zelltods, der DNA-Synthese, der Immunozyten-Differenzierung,
der intrazellulären
Signalweiterleitung und dergleichen. Die Immunsuppressiva werden
auch zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt, die übertriebenen
Immunantworten zuzuschreiben sind, wie beispielsweise hypersensible
Immunantwort und Allergien. Außerdem
werden sie benötigt,
um übermäßige Immunantworten
nach der Transplantation von Organen wie beispielsweise der Niere,
der Leber, der Bauchspeicheldrüse, des
Rückenmarks,
des Herzens, der Haut, der Lunge und so weiter zu unterdrücken.
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Die
am meisten verwendeten Immunsuppressiva umfassen beispielsweise
Zyklosporin A, Zyklophosphamid, Rapamyzin, FK-506 und so weiter. Viele Immunsuppressiva
mit ähnlichem
oder differentem Unterdrückungsverhalten
werden nun erforscht.
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Die
zur Gattung Streptomyces oder Serratia gehörenden Mikroorganismen produzieren
rote Substanzen mit Pyrrolylpyromethen-Strukturen; als Beispiele
hierfür
können
unter anderem Prodigiosin, Metacycloprodigiocin, Prodigiosen, Methoxyprodigiosin
und Prodigiosin 25-C angeführt
werden. Von ihnen ist nun bekannt, dass sie eine antibakterielle
Wirkung sowie Anti-Malaria-Wirkung haben, und insbesondere Prodigiosin 25-C
weist eine immunsuppressive Wirkung auf.
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WO-A
95/17381 offenbart 2,2'-bi-1H-Pyrrol-Derivate
gemäß der folgenden
allgemeinen Formel
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Diese
Verbindungen weisen eine immunsuppressive Wirkung auf.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Prodigiosin als Immunsuppressivum
mit T-zellen-selektiver immunsuppressiver Wirkung herzustellen.
Dieses Ziel wird durch die Verwendung gemäß Anspruch 1 erreicht. Anspruch
2 ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel.
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Die besten
Verfahren zur Durchführung
der Erfindung
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Die
detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung folgt dem Muster
Isolation eines gewünschten
Mikroorganismus-Stamms; mykologische Charakterisierung des Stamms;
Extraktion des Prodigiosins mit einem organischen Lösungsmittel;
Purifikation des Prodigiosins durch Kieselgel-Säulenchromatographie und Dünnschichtchromatographie;
Strukturanalyse durch magnetische Kernresonanz (NMR); Gebrauch des
Prodigiosins als T-zellenselektives Immunsuppresivum.
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Keimfreie
Versuchstiere, Mäuse
BDF1 und B6C3F1, die vom Genetic Resources Center, Korean Research
Institute of Bioscience and Biotechnology des Korean Institute of
Science and Technology stammen, wurden zur Bestimmung der immunsuppressiven
Wirkung des Prodigiosins eingesetzt. Die Daten aus den ex-vivo-Versuchen
bezüglich
der immunsuppressiven Wirkung von Prodigiosin zeigen, dass eine
Menge von 300 nM Prodigiosin eine zytotoxische Wirkung aufweist,
eine Menge von unter 100 nM jedoch keine Wirkung erzielt. In den
Konzentrationen, in denen sie keine zytotoxische Wirkung haben,
kann Prodigiosin die Immunantwort von β-Lymphozyten nicht unterdrücken. Prodigiosin
hatte keinen Einfluss auf die Antikörperbildung und die Proliferation
von β-Lymphozyten,
hat jedoch eine potentiell unterdrückende Wirkung auf die Proliferation
und die Aktivität
von T-Lymphozyten.
Diese selektive Immunsuppression bei T-Lymphozyten wird nicht auf die selektive
Zytotoxizität
gegenüber
T-Lymphozyten zurückgeführt. Bei
in-vivo-Versuchen wurden dieselben Ergebnisse bezüglich Immunsuppression
erzielt wie bei den ex-vivo-Versuchen. Bei der Messung der T-Lymphozyten-Aktivität mit Hilfe
einer Abstoßungsreaktion
zwischen Transplantat und Empfänger
und einer T-zellen abhängigen
Antikörperbildungsreaktion
unterdrückte
das Prodigiosin die Immunantwort, übte jedoch keine toxische Wirkung
auf Tiere aus. Daher wird angenommen, dass die immunsuppressive
Wirkung des Prodigiosins auf die selektive Suppression der T-Lymphozyten-Aktivität zurückzuführen ist.
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Prodigiosin
25-C, ein zu Prodigiosin analoges, hinsichtlich Struktur und Molekulargewicht
jedoch hiervon unterschiedliches Immunsuppressivum, unterdrückt bekanntlich
die Proliferation von T-Lymphozyten, nicht jedoch die Proliferation
von B-Lymphozyten.
Von den T-Lymphozyten werden die CD8-T-Lymphozyten unterdrückt, nicht jedoch die CD4-T-Lmphozyten.
Im Gegensatz dazu hat das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung
eine immunsuppressive Wirkung sowohl auf die CD8-T-Lymphozyten als
auch auf die CD4-T-Lymphozyten. Diese immunsuppressive Wirkung ähnelt derjenigen
von anderen bereits vorhandenen Immunsuppressiva. Wie die im Handel
erhältlichen
Immunsuppressiva, beispielsweise Zyklosporin A, Zyklophosphamid, FK-506
und Rapamyzin unterdrückt
das Prodigiosin der Erfindung selektiv die Immunantwort von T-Lymphozyten.
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Die
bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Reaktionssysteme veranschaulichen
die Anwendung von Prodigiosin zur Grundlagenforschung in der Immunologie,
sind jedoch nicht auf eine solche bestimmte Verwendung von Prodigiosin
beschränkt.
Die derzeit eingesetzten Immunsuppressiva werden auf verschiedenen Gebieten
benötigt.
Als Erstes werden sie bei der Behandlung von Krankheiten, die eine
Immunsuppression erforderlich machen, sowie bei der Grundlagenforschung
hierfür
benötigt.
Immunsuppressive Medikamente sind zur Beseitigung der Immunantwort
nötig,
die auf die Transplantation von Organen oder Geweben folgt. Ein weiteres
Anwendungsgebiet von Immunsuppressiva ist die Grundlagenforschung
in Bezug auf Immunzellen. Dieses Gebiet umfasst Studien über Cytokine,
die Aktivierung und Differenzierung von Immunzellen und die intrazelluläre Signalweiterleitung.
Auf diesem Gebiet sind Zyklosporin A, Zyklophosphamid, FK-506 und
Ripamycin erhältlich.
Da das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung eine Wirkung hat,
die vergleichbar mit den oben genannten Immunsuppressiva ist, kann
es auf diesen verschiedenen Gebieten als Heilmittel und als Standard eingesetzt
werden.
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Das
Prodigiosin der vorliegenden Erfindung hat die folgende chemische
Formel, bei einem Molekulargewicht von 323, gemessen durch NMR.
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Anhand
der folgenden Beispiele, die zur Verdeutlichung dienen, jedoch nicht
als Einschränkung
der vorliegenden Erfindung aufzufassen sind, kann die vorliegende
Erfindung besser verständlich
gemacht werden.
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Beispiel I: Kultur eines
Serratia-marcescens-Stammes und Gewinnung von Prodigiosin
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Aus
einem Schwemmsandgebiet in Mokpo, Korea, wurden Bodenproben entnommen.
Aus den Proben wurde eine zur Gattung Serratia spp. gehörende Bakteriengruppe
isoliert und erhielt den Namen Serratia marcenscens B-1231. Sie
wurde am 19.
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September
1997 bei der Koreanischen Sammlung von Arten-Kulturen am Korean Resarch Institute
of Bioscience and Biotechnology (Koreanisches Forschungsinstitut
für Biowissenschaften
und Biotechnologie) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer
KCTC-0386BP. Um ein Immunsuppressivum zu erhalten, wurden Serratia
marcescens B-1231 62 Stunden lang bei 28°C in einem 1L-Erlenmeyer-Kolben
kultiviert, das ein Grundnährmedium
enthielt, welches aus 1 % löslicher
Stärke;
0,5 % Pharmamedia; 0,2 % Glukose; 0,1 % Ammoniumsulfat; 0,1 % Kaliumphosphat;
0,05 % MgSO4•7H2O;
0,1% Kalziumchlorid und 0,3 NaCl enthielt, bei pH 7,0. Eine gleiche
Menge Ethylacetat wurde der Kultur zugefügt, und diese wurden 30 min
lang ausreichend vermischt, um eine organische Schicht zu erhalten.
Als die organische Schicht unter verringertem Druck konzentriert
wurde, erhielt man eine rote Substanz. Diese wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie
getrennt, bei der eine Mischung aus Chloroform und Methanol als
mobile Phase eingesetzt wurde. Danach wurde eine Kieselgel-Dünnschichtchromatographie durchgeführt, um
das Zielmaterial zu reinigen.
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Beispiel II:
in vitro-Versuch über
die zytotoxische Wirkung von Prodigiosin auf Lymphozyten
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Immunzellen
wurden aus der Milz der keimfreien Tiere entnommen und in vitro
kultiviert. Die Kulturen wurden mit unterschiedlichen Mengen Prodigiosin
von 3 nM bis 30,000 nM behandelt, und die Lebensfähigkeit der
Zellen wurde vom ersten bis zum dritten Tag nach der Behandlung
gemessen. Ausgehend von der ursprünglichen Lebensfähigkeit
der Immunzellen wurde die Lebensfähigkeit der Versuchsgruppen
berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt. Wie
aus diesen Daten hervorgeht, ist die Lebensfähigkeit der behandelten Immunzellen
bei einer Konzentration von mindestens 300 nM im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe
deutlich verringert. Daher wurden Folgeversuche zur Immunwirkung
bei höchstens
100 nM durchgeführt,
um die Zytotoxizität
auszuschließen,
und nur die immunsuppressive Wirkung des Prodigiosins zu messen.
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Tabelle
1 Wirkung
von Prodigiosin auf die Lebensfähigkeit
von Immunzellen
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Beispiel III: in vitro-Versuch
zur Wirkung von Prodigiosin auf die Immunzellen-Proliferation
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Drei
Standard-Substanzen, die Lymphozyten zur Proliferation veranlassen,
wurden eingesetzt, um die Wirkung des Prodigiosins auf die Proliferation
von Lymphozyten zu messen. 5 μg/ml
Lipopolysaccharid wurden verwendet, um B-Lymphozyten zur Proliferation
anzuregen, 5 μg/ml
Concanavalin A für
T-Lymphozyten, und 5 μg/ml Kermesbeer-Mitogen
für sowohl
B- als auch T-Lymphozyten. Prodigiosin wurde zusammen mit der die Proliferation
anregenden Substanz zugegeben. Drei Tage nach Zugabe wurde die Proliferationswirkung
durch Messung der synthetisierten DNA-Menge bestimmt. Um die Zytotoxizität von Prodigiosin
auszuschließen,
wurde es in einer Konzentration von höchstens 100 nM verwendet. Die
Wirkung des Prodigiosins auf die Proliferation der Lymphozyten ist
in Tabelle 2 unten dargestellt. In Tabelle 2 bedeuten die Prozentangaben
für die
Proliferation die Proliferations-Menge der mit Prodigiosin behandelten
Lymphozyten in Bezug zu derjenigen der nicht behandelten Gruppe.
Wie dargestellt, erreicht die durch Prodigiosin in einer Menge von
30-100 nM bewirkte Suppression bei durch Concanavalin A angeregte
T-Lymphozyten 96–98
%; die Proliferation der durch Lipopolysaccharid angeregten B-Lymphozyten und der
durch Kermesbeer-Mitogen angeregten B-/T-Lymphozyten wird jedoch jeweils zu 13–19 % bzw.
45–83
% unterdrückt.
Folglich zeigen diese Daten, dass das Prodigiosin der vorliegenden
Erfindung eine potentiell immunsuppressive Wirkung hat, die selektiv
auf T-Lymphozyten ausgeübt
wird.
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Wirkung
von Prodigiosin auf die Proliferation von Immunzellen Tabelle
2
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Beispiel VI: in-vitro-Versuch
zur Wirkung von Prodigiosin auf die Immunantwort
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Der
Einfluss von Prodigiosin auf die Funktionen der Lymphozyten wurde
unter Verwendung von drei Reaktionssystemen gemessen. Als Erstes
wurde die Proliferationsfähigkeit
von B-Lymphozyten
als Reaktion auf einen Lipopolysaccharid-Stimulus ermittelt. Dazu
wurde am dritten Tag nach der Stimulation mit Lipopolysaccharid
die Antikörperbildung
der B-Lymphozyten gemessen. Wenn B-Lymphozyten mit Lipopolysaccharid stimuliert
werden, können
sie ohne Hilfe der T-Lymphozyten Antikörper bilden. Als Zweites wurde
eine gemischte Lymphozyten-Reaktion ausgelöst, um die Wirkung auf die
T-Zellen-Antwort festzustellen. Diese Reaktion benötigt keine
Hilfe von den B-Lymphozyten.
Am dritten Tag nachdem zwei Arten von Heteroimmunzellen, die sich
in ihrem Histokompatibilitätsantigen
unterscheiden, vermischt wurden, um die Aktivität der T-Lymphozyten anzuregen,
wurde die T-Zellen-Antwort
beurteilt. Als Drittes wurde die T-zellenabhängige Antikörperbildungsreaktion verwendet,
um die Wirkung von Prodigiosin auf die gleichzeitige Immunantwort
von B- und T-Lymphozyten zu beurteilen. Diese Reaktion erfordert
die gleichzeitige Funktion der B- und T-Lymphozyten. Am fünften Tag
nach Immunisierung der Lymphozyten mit den roten Blutzellen von
Schafen wurde ihre Fähigkeit
zur Antikörperbildung
bewertet.
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Die
Wirkung von Prodigiosin auf die Immunantwort von Lymphozyten wird
in Tabelle 3 unten gezeigt. Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, wird die
Immunantwort, bei der T-Lymphozyten involviert sind, bedeutend unterdrückt, die
B-Zellen-Antwort jedoch durch alle Konzentrationen hindurch überhaupt
nicht. In Tabelle 3 beziehen sich die Werte relativ zur Immunantwort
der nicht mit Prodigiosin behandelten Lymphozyten.
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Zusammen
genommen zeigen die Daten aus den Beispielen III und IV, dass das
Prodigiosin die Proliferation und die Immunantwort von T-Lymphozyten
potentiell selektiv unterdrückt.
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Tabelle
3 Wirkung
von Prodigiosin auf die Immunantwort von Immunzellen
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Beispiel V: Selektive
Zytotoxizität
von Prodigiosin gegenüber
B-, CD4-T- und CD8-T-Lymphozyten
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Durch
Messung des Mengenanteils der jeweiligen Zellen wurde untersucht,
ob die selektive Immunsuppression von Prodigiosin gegenüber T-Zellen
auf die selektive Zytotoxizität
gegenüber
T-Zellen zurückzuführen ist
oder nicht. Am dritten Tag nach Behandlung der Immunzellen mit Prodigiosin
wurde die Zahl der Zellen gezählt.
Da T-Lymphozyten aus DC4-T-Zellen (Helfer-T-Zellen) und CD8-T-Zellen (zytotoxische
T-Zellen) bestehen, wurde in diesem Beispiel der Anteil an T- und
B-Lymphozyten berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten
dargestellt. Die Daten aus Tabelle 4 zeigen, dass das Prodigiosin
keine selektive Zytotoxizität aufweist.
Daher ist erwiesen, dass die selektive Immunsuppression für T-Lymphozyten
auf die Unterdrückung der
Immunantwort, nicht aber auf Zytotoxizität, zurückzuführen ist. Zusammen mit dem
Ergebnis aus Beispiel II zeigt dieses Ergebnis auch, dass das Prodigiosin
innerhalb eines wirksamen experimentellen Konzentrationsbereichs
nicht toxisch ist.
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Tabelle
4 Zytotoxizität von Prodigiosin
gegenüber
Lymphozyten
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Beispiel VI:
in-vivo-Versuch zur Wirkung von Prodigiosin auf T-Lymphozyten
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Für die in-vivo-Beurteilung
der durch Prodigiosin hervorgerufenen Immunsuppression wurde eine
Reaktion zwischen Transplantat und Empfänger herangezogen. Die Reaktion
zwischen Transplantat und Empfänger
ermöglicht
eine Bewertung der Immunantwort der T-Lymphozyten. Am sechsten Tag
nach der Transplantation der T-Lymphozyten von BDF1-Mäusen, die
sich ihn ihrem Antigen für
Histokompatibilität
unterscheiden, wurde das Gewicht der Lymphknoten gemessen und dadurch
die Immunantwort der T-Lymphozyten auf die transplantierten Heteroantigene
festgestellt. Das Prodigiosin wurde fünf Tage lang peritonal in einer
Dosis von 30-100 mg pro kg Körpergewicht
injiziert. Als Positivkontrolle wurde Zyklophosphamid fünf Tage
lang in einer Dosis von 100 mg/kg peritonal injiziert. Das Körpergewicht
der gespritzten Mäuse
wurde gemessen, um die Toxizität
des Prodigiosins mit der des Zyklophosphamids zu vergleichen. Die
Ergebnisse werden in Tabelle 5 dargestellt, welche einen Beleg dafür darstellt,
dass das Prodigiosin potentiell die Immunantwort der T-Lymphozyten ebenso
wie die Positivkontrolle, das Zyklophosphamid, unterdrückt. Was
das Körpergewicht
anbelangt, so hatte es sich bei den Mäusen, denen Prodigiosin in
einer wirksamen Konzentration injiziert wurde, nicht verändert. Dies
zeigt, dass das Prodigiosin die Immunantwort von T-Lymphozyten unterdrückt, ohne
in vivo eine toxische Wirkung zu haben. Im Gegensatz dazu trat bei
den mit Zyklophosphamid in wirksamer Konzentration injizierten Mäusen ein
Gewichtsverlust auf, was die Toxizität der Chemikalie zeigt.
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Tabelle
5 Wirkung
von Prodigiosin auf T-Lymphozyten
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Beispiel VII: Wirkung
von Prodigiosin auf T-Lymphozyten in vivo (T-zellen-abhängige Immunantwort)
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Eine
T-zellen-abhängige
Immunantwort-Reaktion wurde verwendet, um den Einfluss von Prodigiosin auf
T-Lymphozyten in vivo zu beurteilen. Versuchstiere wurden durch
peritonale Injektion mit roten Blutzellen von Schafen immunisiert.
4 Tage nach der Immunisierung wurde die Zahl der Antikörper bildenden
Zellen gezählt.
Prodigiosin wurde täglich
peritonal injiziert. Ausgehend von der Anzahl der Antigen bildenden
Zellen bei nicht behandelten Tieren wurde der Einfluss von Prodigiosin
auf T-Lymphozyten in vivo in Prozent ermittelt. Ebenso wurde das
Gewichtsverhältnis
zwischen Milz und Körper
gemessen, um die Toxizität
von Prodigiosin auf die Tiere zu bestimmen. Als Positivkontrolle
wurde Zyklophosphamid verwendet.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 6 unten dargestellt. Wie aus den in Tabelle
6 enthaltenen Daten hervorgeht, wurde die Zahl der Antikörper bildenden
Zellen durch Behandlung mit Prodigiosin deutlich verringert, was in
Bezug auf die Immunsuppression vergleichbar ist mit der Positivkontrolle,
dem Zyklophosphamid. Berücksichtigt
man nun das Gewichtsverhältnis
zwischen Milz und Körper,
zeigte das Prodigiosin bei wirkungsvollen Konzentrationen keine
Toxizität,
wohingegen das Zyklophosphamid bei wirkungsvoller Konzentration
sehr toxisch war.
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Tabelle
6 Wirkung
von Prodigiosin auf T-zellen-abhängige
Immunantwort
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Industrielle Anwendung
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Wie
aus den Daten in den Beispielen hervorgeht, hat das Prodigiosin
der vorliegenden Erfindung eine potentiell unterdrückende Wirkung
auf die Immunantwort der T-Lymphozyten, sowohl in vivo, als auch
in vitro. Was noch besser ist, ist dass Prodigiosin in wirksamer
Konzentration keine Toxizität
aufweist. Daher kann das Prodigiosin der vorliegenden Erfindung
als Immunsuppresivum oder als Standardmittel auf verschiedenen Gebieten
eingesetzt werden, einschließlich
der Behandlung von Krankheiten, die eine Immunsuppression erforderlich
machen, und Grundlagenforschung über
die Krankheiten, die Transplantation von Organen oder Gewebe, und
die Immunzellen.
