DK170353B1 - Fremgangsmåde og apparat til immunanalyser - Google Patents

Description

DK 170353 B1

Opfindelsen angår ligand-receptorimmunanalyser. Især angår den immunanalysefremgangsmåder og først og fremmest de, der anvender monoklone antistoffer. I en anden udførelsesform angår den et apparat til udførelse 5 af sådanne analyser.

I næsten 20 år har immunanalysefremgangsmåder været sensitive diagnostiske midler til in vitro bestemmelse af et antal antigener associeret med sygdom eller andet af klinisk betydning. Oprindelig anvendte 10 man ved sådanne heterogene analyser en polyklonal antistofpræparation, der var bundet til fast fase. I sådanne analyser lader man en opløsning af mærket antigen konkurrere direkte med antigen i den prøve, der skal 15 analyseres for antistof i fast fase eller som tilsættes antistoffet i en trinvis proces. Den udstrækning det mærkede antigen er bundet til den faste fase eller kan påvises i den væskeformige fase, kan benyttes som mål for tilstedeværelse og mængde af antigen i den prøve, 20 der skal analyseres.

Senere blev immunometriske analyser, der ikke var baseret på konkurrence, mulige. I disse analyser benyttede man også en polyklonal antistofpræparation bundet til en fast fase. Man lod prøven, der eventuelt inde-25 holdt antigen, bringe i kontakt med den faste fase,· så antigenet kunne binde til antistofferne på den faste fase. Typisk lod man efter en inkubationsperiode prøven-adskille fra den faste fase, som man derefter udvaskede og inkuberede med en opløsning af yderligere polyklonale 30 antistoffer, som var blevet mærket f.eks. med et radio-nuclid, et enzym eller en fluorescerende gruppe.

Efter denne anden inkubation skilte man det mærkede antistof, der ikke var bundet, fra den faste fase, og bestemte mængden af mærket antistof i enten den væ- DK 170353 B1 2 skeformige eller, bundet til den faste fase i en antistof: antigen: antistof kombination som et mål for tilstedeværelse og/eller koncentrationen af antigen i den undersøgte prøve.

5 Senere er immunanalysefremgangsmåder blevet ændret, så de benytter monoklonale antistoffer. F.eks. * beskriver US-patent 4.376.110 to-position immunometriske analyser, der benytter par af monoklonale antistoffer, det ene bundet til en fast fase, og det andet mærket, så 10 det kan påvises. Anvendelsen af par af monoklonale antistoffer, som genkender forskellige epitopiske positioner på et antigen, har gjort det muligt samtidig at udføre immunometriske analyser, hvor inkubationerne med antigen og mærket antistof ikke kræver de mellemliggende vaske-15 trin, som tidligere fremgangsmåder krævede.

I de nævnte fremgangsmåder er antistoffet på fast fase typisk bundet til en lille kugle eller små partikler eller fæstnet til en overflade. Alle disse fremgangsmåder kræver karakteristisk en inkubationstid både 20 med den faste fase og de mærkede antistoffer og som følge heraf tager de tid, selvom de udføres samtidigt.

Det er i virkeligheden ikke ualmindeligt at det kræver adskillige timer at udføre en analyse. Derudover har nødvendigheden af at benytte tidsafmålte inkubationstrin 25 og adskillige udvaskninger med afmålte reagenser i det store og hele begrænset benyttelsen af disse fremgangsmåder til store hospitaler og store kliniske laboratorier, der benytter højt uddannet personale og raffineret udstyr til analyserne. Derfor er der stadig et behov for 30 en simpel og hurtig fremgangsmåde til at udføre immuno-analyser, som benytter et relativt simpelt apparat, så

V

sådanne analyser kan udføres hos den private læge og endog hjemme af utrænede personer, når de køber et sådant apparat. ' 35 Opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde, hvorved man simpelt og hurtigt udfører ligand-receptor- DK 170353 B1 3 analyser, f.eks. immuno- og immunometriske analyser og analyser, som udnytter hybridiseringen af nucleinsyre-oligomere, som benytter et simpelt apparat og som ikke kræver lange inkubationstider. Apparatet ifølge opfin-5 delsen indeholder som en første del en porøs del, såsom en membran eller et filter på hvilken er bundet eller fastholdt en receptor for det udvalgte stof, der skal analyseres (liganden) eller til hvilken er bundet eller fastholdt en antireceptor eller som er i stand til fra 10 analyseprøven at fraskille celler eller cellerester som liganden, der skal analyseres for, er bundet til, hvorved liganden bliver bundet til den porøse del. F.eks. er i tilfælde af immuno- og immunometriske analyser, hvor liganden er et antigen, er et antistof, fortrinsvis et 15 monoklonalt antistof, bundet til den porøse del som receptor. Apparatet indeholder yderligere som en anden del en absorberende del med kapillære passager igennem sig, i almindelighed på tværs af dets øvre og nedre overflader. Heri benyttes betegnelsen "kapillær" til at be-20 tegne et kapillarrør eller anden kanal eller gennemgangsvej som tillader væsken at passere gennem den ab--· sorberende del. Den anden del står i kapillær forbindelse med den porøse første del og er udvalgt, så den har en kapillær porestørrelse, der fører til, at væske 25 trækkes gennem første del uden brug af ydre midler, når det hydrostatiske tryk af analyseprøven og andre tilføjelser benyttet i analysen ikke er tilstrækkeligt til at få væsken til at løbe gennem første del. Den anden del kan også fungere som understøtning for første del.

30 Analysen ifølge opfindelsen består af følgende trin: Man sætter en væskeformig prøve til den porøse del, og mens væsken flyder gennem delen, vil enten receptoren, der er bundet til den porøse del binde opløselig eller suspenderet ligand i prøven med en betydelig 35 større hastighed end den man observerer, når der ikke løber væske gennem prøven, eller, hvis liganden befinder DK 170353 B1 4 sig på overfladen af cellulært materiale, vil det cellulære materiale enten blive bundet af receptoren, der sidder på den porøse del eller blive indfanget af delen, mens prøven flyder gennem. Ved en foretrukken udførel-5 sesform af opfindelsen følges tilføjelsen af prøven af tilføjelsen af en opløsning af en anden receptor for liganden; denne er mærket, så den kan påvises. F.eks. i en immunometrisk analyse for antigen benytter man en opløsning af antistof, fortrinsvis monoklonalt antistof, 10 som binder antigenet ved en epitop, som ikke vekselvirker med binding af den første receptor. Den foretrukne mærkning er med et enzym, selvom man kan mærke på andre måder f.eks. ved hjælp af et radionuclid eller ved fluorscerende mærkning. Antistoffet binder sig til anti-15 genet, der tidligere er ekstraheret fra prøven enten ved hjælp af det bundne antistof eller ved indfangning af cellulært materiale. Tilsætning af mærket antistof kan øjeblikkelig eller efter en kort inkubationstid, for at forøge følsomheden ved at tillade større binding af an-20 tigen og mærket antistof, efterfølges af et vasketrin, hvorved man fjerner ikke bundet mærket antistof. Tilstedeværelsen af mærket antistof på den porøse del kan så bestemmes og benyttes som indikation for nærværelsen af det udvalgte antigen i prøven. Hvis man benytter enzym-25 mærkning gøres dette ved tilsætning af en opløsning af. et farvedannende substrat til den porøse del, så substratet kan reagere med enzymet.

Fig. 1 er et tværsnit af et apparat til udførelse af en immunanalyse ifølge opløsningen.

30 Fig. 2 er et billede set fra oven af en porøs del anvendt i opfindelsen til at fjerne antigen fra en prøve, der skal analyseres.

Som nævnt ovenfor indeholder apparatet ifølge opfindelsen som en første del en porøs membran eller et 35 filter, til hvilken er bundet en receptor for en ligand eller en anti-receptor eller som er i stand til at fil- DK 170353 B1 5 trere cellulært materiale fra en prøve, der bliver analyseret, hvis liganden er associeret med det cellulære materiale. I det sidste tilfælde vælger man membranen eller filtret, så den har en porestørrelse, som tillader 5 denne adskillelse. Der kan bruges hvilken som helst af en stor gruppe filtre inkluderende glasfiberfiltre og filtre af forskellige syntetiske og naturlige materialer.

Når den porøse del har en receptor bundet til 10 sig, vælger man receptoren ud fra dens evne til at binde selektivt direkte med den udvalgte ligand. F.eks. kan receptoren være et antistof, hvis liganden er et antigen og med fordel et monoklonalt antistof. Hvis den udvalgte ligand er et antistof, kan receptoren være et antigen 15 eller et anti-antistof. Hvis liganden er et enzym, kan receptoren være en receptor for enzymet. Hvis liganden er en nucleinsyre, f.eks. RNA eller DNA, kan receptoren være en komplementær oligomer af DNA eller RNA. I en foretrukken udførelsesform består første del af en 20 membran eller et filter, til hvilket en antistofpræparation er bundet kovalent. Med fordel består antistofpræparat ionen af et monoklonalt antistof, selvom polyklona-le antistoffer fra antisera kan anvendes. Fremstilling af polyklonale og monoklonale antistofpræparationer er 25 nu velkendte og behøver ingen referencer her.

Materialet til den porøse del vælges blandt materialer, som receptoren eller eventuelt anti-receptoren er i stand til at binde til. I tilfælde af protein-receptorer eller anti-receptorer f.eks. antistoffer eller 30 antigener er et foretrukket materiale nylon, som besidder aminogrupperesiduer eller som af kemisk vej har fået sådanne grupper indført, som tillader et protein at blive tilkoblet. Ved den velkendte.glutaraldehydmetode. Antistoffer kan kobles til glasfibre ved hjælp af amino-35 silaner. Andre naturlige eller syntetiske materialer, som kan kobles direkte eller via mellemled til en receptor, kan også anvendes.

DK 170353 B1 6 I det foregående betones kemisk binding af receptoren eller anti-receptoren til den porøse del. Imidlertid kan i udvalgte tilfælde receptoren eller anti-receptoren være et overtræk på den porøse del eller være i 5 form af småpartikler, som er fysisk indespærret i den porøse del. Derfor vil ordet "bundet" i denne sammenhæng * omfatte enhver måde til at binde receptor eller anti-re-ceptor til den porøse del.

Anden del af apparatet er en absorberende del, 10 som har kapilære åbninger gennem sig i almindelighed på tværs af den øvre og den nedre overflade. Den anden del samles med den første på en måde, så der er direkte forbindelse mellem porerne eller åbningerne i den første del og kapilarrørene i anden del. Når en væske således 15 påsættes den første del og gennemtrænger den vil væsken blive trukket ind i den absorberende del. Som et resultat af dette kan man inducere væskegennemstrømning i første del, når man anbringer en væske på dens øvre overflade, selvom det hydrostatiske tryk af væsken er så 20 lavt, at den ikke uden hjælp ville flyde igennem første del, f.eks. ved et tryk der skulle presse den igennem eller ved et vakuum, der skulle trække den igennem.

Valget af materiale til den anden del er ikke kritisk, og man kan anvende en række fibrøse filterma-25 terialer. Et nyttigt materiale er celluloseacetatfibre.. orienteret som i et cigaretfilter. En fagmand vil kunne se at andre absorberende materialer af polyester, polyolefin eller andet kan anvendes istedet for celluloseacetat.

30 I fig. 1 vises i tværsnit en anordning, som kan benyttes med apparatet ifølge opfindelsen for at udføre i analyserne. I fig. i vises en cylindrisk beholder 10, den kan dog have andre passende former, med en øvre åbning 12, defineret ved sidevæggene 14. Beholderen kan ' 35 fremstilles af glas, plastic eller andet passende materiale. Som vist i fig. i, har beholder 10 også en nedre DK 170353 B1 7 åbning 16, i hvilken findes en prop 18, der kan fjernes, til brug for anbringelse af den porøse del 20, en cirkulær membran eller filterskive og en eventuel del 21, hvis funktion beskrives nedenfor, og som hviler på 5 det cylinderformige absorberende del 22, som også anbringes i apparatet gennem åbningen 16.

En del af beholderen 10 er indsnævret som vist i fig. 1 ved nr. 24, så der dannes en slags tragt, hvorigennem en prøve kan rettes mod del 20, og ved hjælp af 10 hvilken man kan sikre, at analysen og andre reagenser inklusive skyllemidler dirigeres direkte ned på delen 20.

Størrelsen af del 22 og følgelig rumfanget af den del af beholder 10, der ligger under indsnævringen 15 vælges med fordel således, at hele den væskemængde, der skal tilføres apparatet under en analyse, kan rummes i den absorberende del 22. Der findes ventilationshuller (ikke vist i fig. 1), f.eks. små porer i beholder 10 nær bunden, så overskudsluft kan undslippe. Eventuelt 20 kan man undlade bunden af beholder 10 og tillade væske at passere gennem delene 20 og 22 og tømme beholderen gennem bunden, men da man ønsker, at apparatet med indhold skal være let at kassere på en nem og hygiejnisk •måde, foretrækkes det at anvende en struktur som vist i 25 fig. 1.

Som tidligere bemærket kan delen 20 anvendes enten til at filtrere cellulært materiale fra en prøve eller være bæremateriale for bunden receptor for den ligand, der skal analyseres. I begge tilfælde kan man 30 tilsætte den væskeformige analyse til delen 20 gennem åbningen 12. Efter at prøven har gennemtrængt delen 20 og væsken er bleven trukket igennem denne og ned i den absorberende del 22, kan man tilsætte en opløsning af mærket receptor gennem åbning 12 til delen 20.

35 Den mærkede receptor binder så enten til liganden bundet til receptoren til delen 20 eller associeret DK 170353 B1 8 med det cellulære materiale, der er indfanget på overfladen af 20. Hvis der foreligger en immunometrisk analyse og hvis delen 20 har et monoklonalt antistof bundet til sig og det mærkede antistof også er et mono-5 klonalt antistof, udvælger man de to antistoffer, så de bindes til ikke vekselvirkende antigenbindende positio- * ner som beskrevet i US-patent 4.376.110 og ansøgning nr.

323.498, indsendt 6. juni 1981, til hvis indhold vi herved refererer fuldstændigt.

10 Det foretrækkes, at den opløselige receptor er mærket med et enzym, selvom man kan anvende andre konventionelle analysemærkninger under passende omstændigheder. F.eks. kan man anvende en fluorescerende mærkning såsom fluorescein eller phycoerythrin, eller man kan 15 anvende et radionuclid. Nyttige mærkningsmidler involverer også mikrokugler fyldt med et farvestof eller med fluorescerende partikler. Andre anvendelige mærkninger kan være liposomer eller andre små beholdere fyldt med et farvestof eller fluorescerende partikler.

20 Efter at opløsningen af den mærkede receptor er passeret gennem delen 20, tilsætter man en vaskevæske til delen 20, så ikke bundet mærket receptor kan blive skyllet bort fra delen 20 og ind i delen 22. Den indadskrånende struktur af væggene 24 tilvejebringer 25 en slags tragt, så det bliver lettere at skylle væggene med vaskevæsken, så eventuelle rester af opløsning af mærket receptor kan fjernes.

Inden tilsætning af mærket receptoropløsning og vaskevæske til delen 20 kan man benytte korte inkuba-30 tionsperioder for at opnå kraftigere binding af receptor eller ligand i opløsning, der befinder sig i mellemrummene på delen 20 og derved forøge analysens følsomhed. Vi har imidlertid fundet, at sådanne inkubationstrin enten er unødvendige eller kan nøjes med at være ' 35 meget korte, dvs. i almindelighed af størrelsesordenen 60 sekunder eller mindre. Gennemstrømningen af væske.

DK 170353 B1 9 der indeholder ligand eller bunden receptor gennem delen 20 fører til en meget hurtigere bindingshastighed end man observerer uden gennemstrømning.

Hvis receptoren er mærket med et enzym, vil man 5 efter udvaskningen til at fjerne ikke bunden receptor fra delen 20 tilsætte en opløsning af enzymsubstratet til delen 20. Hvis den udvalgte ligand er bundet enten til en receptor bundet til delen 20 eller til cellulært materiale på delen 20, vil liganden til sig have 10 bundet noget mærket receptor. Enzymet vil få substratet til at reagere, og man vil ved korrekt valg få en synlig farveændring.

Vi har fundet, at celluloseacetat anvendt som materiale til den absorberende del 22 kan binde mærket 15 receptor uspecifikt på sin øvre overflade. Der kan derfor optræde en vis farveændring ved denne overflade lige under delen 20. Por at undgå, at denne farveændring skal kunne ses gennem delen 20, kan man anbringe en adskillende del (betegnet 21 i fig. 1) af porøs poly-20 ethylen eller andet materiale, som ikke binder receptor uspecifikt mellem delene 20 og 22.

I fig. 2 vises delen 20 set ovenfra. Den stiplede linie 26 repræsenterer den ydre omkreds af det areal 28, i hvilket liganden bindes i en foretrukken 25 udførelsesform. Dette areals diameter er mindre end diameteren af den indsnævring, der dannes af væggene 24 på det snævreste sted. Når man anvender et enzym som mærkning på receptoren, kan man få følgende resultater: (1) hvis der udvikles mere farve i arealet 28 end i 30 periferien af delen 20, vil man aflæse et positivt resultat; (2) hvis der ingen farve udvikles i delen 20, vil man læse det som et negativt resultat; (3) hvis der efter vask stadig findes noget mærket receptor i delen 20, vil man se en beskeden farveændring, som er ensar-35 tet over hele den synlige overflade. Et sådan resultat må også fortolkes som negativt.

DK 170353 Bl 10 I det foregående er givet en almindelig beskrivelse af apparatet og fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Der kan med dette udføres immunanalyse på mindre end 5 minutter regnet fra indførelsen af prøven til aflæsning 5 af et positivt resultat. I et specifikt eksempel binder man et monoklonalt antistof imod human choriogonadotro- - pin (HCG), et antigen, der udvikles i urin hos gravide kvinder til en porøs nylonmembran ved hjælp af glutaraldehydfremgangsmåden og anbringer denne i en beholder 10 såsom nr. 10 i fig. 1, hvor den understøttes af en absorberende del af celluloseacetat, som den er adskilt fra ved hjælp af en skive af porøs polyethylen.

Der tilsættes urinprøver (4 ml der indeholder 0 og 50 mIU/ml af HCG) til det beskrevne apparat og disse 15 trækkes gennem delene 20 og 21 ind i det absorberende materiale 22. Derefter tilsættes tre (3) dråber af en opløsning af anden monoklonalt antistof imod HCG, til hvilket der er bundet alkalisk phosphatase. Efter en kort inkubationstid, omkring 1 minut, hvorunder denne 20 kombination trækkes gennem delen 20, tilsætter man 4 ml vand for at fjerne ikke bundet antistof fra delen 20. Efter denne tilsætning tilsætter man tre dråber af en opløsning, der indeholder indoxylphosphat, et substrat for alkalisk phosphatase. Efter to minutter var 25 ingen farve udviklet i anordningen, der blev benyttet til at analysere prøven, der ingen HCG indeholdt (0 miu/ml). Ved 50 mIU/ml HCG prøven udvikledes en tydelig blå farve i midten af skiven i løbet af 30 sekunder og i løbet af 2 minutter blev den mørkeblå. Der udvikledes 30 ingen farve i periferien af skiven. Hele analysen varede ca. fem minutter. Man må bemærke, at analysens følsomhed ? kan -tilpasses ved hjælp af variation af rumfang eller inkubationstider.

Selvom opfindelsen er blevet beskrevet med en v 35 analyse for HCG som eksempel, må man bemærke, at der kan konstrueres lignende analyser for andre antigener. Hele DK 170353 Bl 11 listen af udvalgt antigener er for lang til at give her, men antigener såsom IgE, prostatisk sur phosphatase, prostatisk specifikt antigen, α-fetoprotein, carcinoem-bryonisk antigen, leuteniserende hormon, kreatinkinase 5 MB og andre antigener i serum, plasma, urin eller andre væskeformige medier kan påvises. Derudover kan væskeformige prøver, der indeholder materiale med associerede antigener såsom antigener associeret med bakterier, parasitter, svampe eller vira omfattende f.eks. gruppe A 10 og B streptococcus, Neisseria gonorrhea, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, hepatitis B og cytomegalovirus påvises ved brug af et filter, som vil indfange cellerne eller et filter til hvilket antistof, der er specifikt 15 for antigenet er bundet som del 20. Tilsætning af en opløsning af et monoklonalt antistof, der f.eks. er mærket med et enzym, vil føre til binding af antistoffet til antigenet. Udvaskning og tilsætning af et substrat vil føre til, at farveændringen associeret med tilste-20 deværelse af det mærkede antistof på cellerne udvikles, og denne kan påvises visuelt eller ved hjælp at et instrument .

Hvis der benyttes en anden mærkning end enzymmærkning, kan man ændre fremgangsmåden. Man kan måle 25 membranens fluorescens, hvis der anvendes en fluorescerende mærkning. Hvis der anvendes en radionuclidmærkning såsom 125I, kan kan fjerne membranen og anbringe den i en tæller.

I det foregående har vi belyst anvendelsen af op-30 findelsen til trinvise immunometriske analyser med mo-noklonalé antistoffer, dvs. en immunanalyse, der benytter en første monoklonal antistofreceptor på den porøse del og en anden monoklonal antistofreceptor som er mærket. Man tilsætter først prøven til den porøse del og 35 derefter det mærkede antistof. Andre varianter af analysen er mulige. F.eks. ved en immunometrisk analyse kan DK 170353 ΒΊ 12 man blande det mærkede antistof og prøven, før de sættes til den porøse del.

Apparatet ifølge opfindelsen kan også anvendes i analyser for et antistof, som benytter et antigen som 5 første receptor på fastfase form og som benytter mærket antigen eller mærket anti-antistof som anden receptor. *

Det sidstnævnte er især brugbart til allergispecifikke analyser, hvor den første receptor er et allergen, der er bundet til den porøse del, og den anden receptor er 10 et antistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof til IgE. I andre tilfælde kan man samtidig måle IgG responsen til allergener, dvs. ved at benytte et antistof såsom et monoklonalt antistof imod IgG som anden receptor. Andre antistofprøver som kan udføres på denne måde 15 inkluderer prøver for antistoffer til herpes, rubella, hepatitis, cytomegalovirus og HTL-III.

I en anden udførelsesform for opfindelsen benytter man apparatet til at udføre konkurrerende analyser, dvs. analyser hvor ligandreceptoren er bundet til den 20 porøse del, og hvor liganden i prøven konkurrerer med en bestemt mængde mærket ligand tilsat prøveopløsningen, eller efter at prøveopløsningen er tilsat. Konkurrerende immunanalyser udføres konventionelt ved benyttelse af et antistof, f.eks. en monoklonal eller polyklonal anti-25 stofpræparation som receptor bundet til den faste fase.

Man kan tilsætte mærket antigen til prøven, før denne sættes til den porøse del. Som alternativ kan den tilsættes efter at prøven er tilsat eller samtidig dermed.

Apparatet ifølge opfindelsen kan også anvendes 30 til at påvise et enzym ved binding af enzymets receptor til den porøse del som analysereceptor. Et mærket antistof mod enzymet kan benyttes til at påvise dannelsen af et receptor-enzymkompleks på den porøse del.

Den porøse del kan også præpareres med en nu- r 35 cleinsyreoligomer som sonde-receptor for nucleinsyrema-teriale i en prøve. Sonden kan være en oligomer af DNA, DK 170353 B1 13 f.eks. komplementær til en sekvens i den aktuelle nu-cleinsyre og kan benyttes til at binde enten RNA eller DNA som ligand, efter hvad sagen drejer sig om. Påvisning af ligand-receptorkomplekset kan udføres ved brug 5 af en anden nucleinsyreoligomer, der er komplementær til en ikke-vekselvirkende region i den aktuelle nucleinsy-re, den anden oligomer er mærket, så den kan påvises.

Ved en yderligere udførelsesform af opfindelsen kan den porøse del have antireceptor bundet til sig.

10 Betegnelsen "antireceptor" skal her referere til midler, som vil binde selektivt til receptoren i et ligand-re-ceptorpar. F.eks. hvis liganden er et antigen, og receptoren er et antistof, f.eks. et muse IgG antistof (fortrinsvis et monoklonalt antistof) kan antireceptoren 15 være et antistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof imod muse IgG. I andre tilfælde kan receptoren være konjugeret med en enhed, som binder selektivt til antire-ceptoren. F.eks. kan enheden være en hapten, og anti-receptoren et antistof mod haptenen. En foretrukken hap-20 ten er fluorescein. I andre tilfælde kan antireceptoren være avidin. I dette tilfælde vil receptoren have biotin bundet til sig. I andre tilfælde kan receptoren være en oligomer af en nucleinsyre eller have en sådan oligo-. mer bundet til sig, og antireceptoren kan være et seg-25 ment af en nucleinsyre, der er komplementær til en del af receptoroligomeren, som ikke forhindrer receptorens binding til liganden. Fagmanden vil af denne beskrivelse kunne se, .at man kan anvende en stor mængde antirecep-tor:receptorkombinationer.

30 Når der benyttes en antireceptor kan man analyse re prøven på mange måder. F.eks. i en "sandwich-analyse" kan man kombinere første receptor og anden mærkede receptor med prøven, så liganden bliver bundet før den sættes til den porøse del. Eller, første receptor og 35 prøven kan kombineres før de sættes til den porøse del eller man tilsætter i rækkefølge første receptor og prø- DK 170353 B1 14 ve, hvorefter den mærkede receptor tilsættes. I sådanne ' sandwich-analyser udvælger man antireceptoren, så den binder til første receptor og ikke til den mærkede receptor.

5 Anvendelse af en antireceptor, der er bundet til den porøse del, gør det muligt at simplificere fremstil- ~ ling og præparation af den porøse del til ligand-recep-toranalyser. F.eks. hvis receptor er bundet til den porøse del, kan det være nødvendigt at ændre bindingsfrem-10 gangsmåden for at optimere bindingen af hver receptor i en række analyser. Imidlertid kan en enkel antireceptor bundet til den porøse del anvendes i en lang række analyser. Derfor vil udvikling og fremstillingsmetoder blive meget simplere, når en sådan "universel" porøs del er 15 mulig at fremstille.

i; ψ

Claims (8)

1. Apparat til brug i en ligand-receptor analyse-fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse eller 5 koncentration af en udvalgt ligand i en prøve på væskeform, kendetegnet ved at omfatte: (a) en første del, som er porøs og som er i stand til at adskille cellulært materiale med liganden associeret fra prøven på væskeform; denne første 10 del besidder en øvre og en nedre overflade, og (b) en anden del som udgøres af absorberende materiale med en overflade, over hvilken den første del er anbragt, den anden del er gennemtrængt af kapillarrør i en retning almindeligvis på tværs af 15 den overflade, over hvilken den første del er an bragt, kapillarrørene står i forbindelse med porerne i den nedre overflade af den første del på en sådan måde, at væske tilføjet til øvre overflade og som har gennemtrængt den første del vil 20 blive trukket ind i kapillarrørene i anden del.

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den porøse del er en membran eller et filter.

3. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at apparatet yderligere omfatter en 25 beholder, der indeholder første og anden del og som besidder en åbning der tillader tilførsel af analysereagenser til første dels øvre overflade.

4. Apparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at åbningen yderligere indeholder en sektion med 30 sider, der skråner indadtil, så at der herved defineres en tragt, hvorigennem de tilsatte reagenser kan føres ud på den øvre overflade af første del.

5. Apparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at beholderens bund er lukket og at beholderen be- 35 sidder afluftningsanordning, så luft fortrængt af tilsatte reagenser kan undslippe. DK 170353 B1 16

6. Fremgangsmåde til analytisk bestemmelse af en udvalgt ligand associeret til cellulært materiale kendetegnet ved at bestå af anbringelse af en væskeformig prøve, der menes at indeholde liganden på ' 5 nævnte cellulære materiale, på den øvre overflade af den porøse del ifølge krav 1, hvorved det cellulære materiale adskilles fra prøven; til denne prøve er tilsat, eller dens anbringelse på den porøse del efterfølges af tilsætning af en receptor for den udvalgte ligand mær-10 ket, så den kan påvises, fulgt af fraskillelse af ikke bundet mærket receptor, og påvisning af eventuel mærket receptor, bundet til ligand på cellulært materiale adskilt fra den væskeformige prøve af den porøse del.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg-15 n e t ved, at fraskillelsen af ikke bundet mærket receptor sker ved vask.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at den udvalgte ligand er et antigen og at receptoren et antistof herimod, fortrinsvis 20 det monoklonale antistof.