JPH0655144B2 - エリトロポエチンをコードするｄｎａ配列、組換えｄｎａベクター及び形質転換体 - Google Patents

エリトロポエチンをコードするｄｎａ配列、組換えｄｎａベクター及び形質転換体

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JPH0655144B2
JPH0655144B2 JP63065591A JP6559188A JPH0655144B2 JP H0655144 B2 JPH0655144 B2 JP H0655144B2 JP 63065591 A JP63065591 A JP 63065591A JP 6559188 A JP6559188 A JP 6559188A JP H0655144 B2 JPH0655144 B2 JP H0655144B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は驚くほど高い発現レベルを示すヒトエリトロポ
エチンのクローン化遺伝子、その組換えＤＮＡベクタ
ー、および該組換えベクターで哺乳動物細胞を形質転換
させて得られる形質転換体に関するものである。
発明の背景 エリトロポエチン（以後ＥＰＯと略す）は高等動物にお
ける赤血球の形成を促進する循環系中の糖タンパク質で
ある。例えば、カルノー(Carnot)らのCompt.Rend.,14
3：384(1906)を参照されたい。それゆえ、ＥＰＯは赤血
球形成促進因子とも呼ばれている。
ヒト赤血球の寿命は約120日間である。従って、全赤血
球の約１／120は細網内皮系で毎日破壊される。同時
に、比較的一定数の赤血球が常時赤血球レベルを維持す
るために毎日生産される〔ガイトン(Guyton)のTextbook
of Medical Physiology,p.56-60,W.B.Saunders Co.,フ
ィラデルフィア(1976)を参照〕。
赤血球は骨髄中で赤芽球の成熟および分化により生産さ
れ、ＥＰＯは未分化の前駆細胞に作用してそれらの細胞
の赤血球への分化を誘起する因子である（ガイトンの上
記文献参照）。
ＥＰＯは貧血、特に腎性貧血の臨床治療のための有望な
治療薬剤である。しかしあいにくＥＰＯは、治療剤とし
て使用するのに必要な十分量を入手することが容易でな
いため実際上の医療面において未だ普及していない。
ＥＰＯを治療薬剤として使用するためには、抗原性の問
題を考慮しなければならないだろう。従って、ＥＰＯは
ヒト由来の原料から生産されるのが好ましい。例えば、
再生不良性貧血または同様の症状をもつ患者（大量のＥ
ＰＯを排出する）からの血液もしくは尿が使用できる。
例えば、ホワイト(White)らのRec.Progr.Horm.Res.,1
6：219(1960)；エスパダ(Espada)らのBiochem.Med.，
３：475(1970)；フィッシャー(Fisher)のPharmacol.Re
v.,24：459(1972)；およびゴードン(Gordon)のVitam.Ho
rm.(N.Y.)31：105(1973)を参照されたい（これらの文献
の記載内容は明細書の一部として引用される。）。
上記のとおり、ＥＰＯは一般に高いＥＰＯレベルを示す
患者（例えば、再生不良性貧血や同様の症状をもつ患
者）からの尿を濃縮および精製することにより製造され
る。例えば、米国特許第4397840号；同第4303650号；お
よび同第3865801号の各明細書を参照されたい（これら
の特許の記載内容は明細書の一部として引用される）。
しかしながら、この種の尿の供給量は限られているた
め、ＥＰＯの実際上の使用は制限されている。このた
め、健康なヒトの尿からもＥＰＯ産物を得ることが非常
に望ましい。しかしながら、健康なヒトから採取した尿
を使用する際の１つの問題点は、そのＥＰＯ含有量が貧
血患者の尿と比較して低いということである。さらに、
健康なヒトの尿は赤血球形成に対して作用するいくつか
の阻害因子を相当に高濃度で含んでいるために、満足の
ゆく治療効果を得るには高度精製後に得られるＥＰＯを
使用しなければならないと考えられる。
ＥＰＯはヒツジの血漿から回収することもでき、この種
の血漿からＥＰＯを分離して満足すべき効力を有し、安
定な水溶性製剤が得られる。ゴールドバッサー(Goldwas
ser)のControl Cellular Dif.Develop．，パートＡ；p.
487-494,Alan R.Liss,Inc.,ニューヨーク(1981)を参照
されたい（各々の文献については明細書の一部として引
用される）。しかしながら、ヒツジＥＰＯはヒトに対し
て抗原性があると予測される。
以上に述べたとおり、ＥＰＯは有望な治療薬剤であるに
もかかわらず、天然供給源から通常の単離／精製技術で
大量生産することは困難である。
スギモト(Sugimoto)らの米国特許第4377513号明細書
は、Namalwa.BALL-1,NALL-1,TALL-1およびJBLを含めた
ヒトリンパ芽球細胞のin vivo増殖操作によるＥＰＯの
大量生産方法を開示している。
その他にも遺伝子工学技術を用いるＥＰＯの生産に関す
る報告がなされている（例えば、本出願の優先日後に国
際公開されたＷＯ85／02610号およびＷＯ85／03079号を
参照）。しかし、その生産技術の詳細や、その生産物の
化学的性質は未だに発表されていない。これとは対照的
に、本発明はヒトＥＰＯの生物学的性質を有するタンパ
ク質の大量生産を可能にする方法を提供するものであ
る。また、本発明の方法により、天然のヒトＥＰＯと化
学的に異なるかも知れないが類似の（場合によっては改
良された）性質を示すタンパク質を生産することも可能
となる。便宜上、ヒトＥＰＯの生物学的性質を示すこの
種のタンパク質は、ヒトＥＰＯと化学的に完全同一でな
いものも含めて、本明細書中で以後ＥＰＯと総称する。
発明の概要 本発明は驚くほど高いレベルのヒトＥＰＯを発現する遺
伝子のクローニング、その発現組換えＤＮＡベクターお
よび該組換えＤＮＡベクターで形質転換させて、活性ヒ
トＥＰＯをin vitroで大量に生産できる形質転換体に関
する。
以下でより詳細に説明するように、本発明者らは先ず、
再生不良性貧血患者の尿より部分精製された形で得られ
たＥＰＯを均一になるまでさらに精製し、トリプシンで
消化して特定のフラグメントを得た。これらのフラグメ
ントを精製してそのアミノ酸配列を決定した。これらの
配列に基づいてＥＰＯオリゴヌクレオチドを推定し、そ
して合成した。合成したオリゴヌクレオチドを使用して
ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、そのライ
ブラリーからＥＰＯ遺伝子を単離した。
単離されたものがＥＰＯ遺伝子であることは、アミノ酸
配列が決定された上記トリプシン消化タンパク質フラグ
メントの多くに対応する事実に基づいて証明された。さ
らに、単離された上記ゲノムクローンの一断片を使用し
て、ハイブリダイゼーション法によりヒト胎児（20週
目）ｍＲＮＡ中のＥＰＯ ｍＲＮＡを単離し、ヒト胎児
肝臓ｃＤＮＡライブラリーを作成して、ゲノムクローン
の一断片から作成されたプローブでスクリーニングし
た。750,000以上の組換え体をスクリーニングした後に
３個のＥＰＯ ｃＤＮＡクローンが得られた。これらの
クローンのうち２つが、完全なコーディング配列および
実質的な５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列を
持つことから、全長のＥＰＯ ｃＤＮＡであると決定さ
れた。これらのｃＤＮＡはＳＶ−40ウイルス由来のベク
ターに挿入し、このベクターで形質転換したサル細胞
〔ＣＯＳ−１細胞株；グラズマン(Gluzman),Cell 23：1
75-182(1981)を参照〕およびチャイニーズハムスター卵
巣細胞〔ＣＨＯ細胞株；アーラウプ(Urlaub,G.)および
カーシン(Chasin,L.A.)のProc.Natl.Acad.Sci.USA 77：
4216-4280(1980)を参照〕の両細胞内で発現させた。Ｃ
ＯＳ細胞から生産されたＥＰＯおよびＣＨＯ細胞から生
産されたＥＰＯは共にin vitroおよびin vivoにおいて
生物学的に活性なＥＰＯである。
クローン化されたＥＰＯ ｃＤＮＡは第３表に示すよう
にコーディング領域の20〜30ヌクレオチド上流にイニシ
エーターおよびターミネーターを有する14〜15アミノ酸
の興味あるオープン・リーディング・フレームを有す
る。クローン化ＥＰＯ ｃＤＮＡでトランスフェクショ
ンされた代表的な大腸菌(E.coli)サンプルは、メリーラ
ンド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託され、寄託番号ATCC 40153のもとに
入手可能である。
表の説明 第１表はヒトＥＰＯ遺伝子中の87塩基対からなるエクソ
ン部分の塩基配列を示すものであり； 第２表はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡのクローンの一つラムダ
−ＨＥＰＯＦＬ13のヌクレオチド配列から推定されたＥ
ＰＯタンパク質のアミノ酸配列を示し； 第３表はラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13中のＥＰＯ ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列およびそれから推定される第２表の
ものと同じアミノ酸配列を示し； 第４表は第４図に示すＥＰＯ遺伝子のｇＤＮＡ配列を示
し； 第５表はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡクローン，ラムダ−ＨＥ
ＰＯＦＬ６中のＥＰＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と
それから推定されるアミノ酸配列を示し； 第６表はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡクローン，ラムダ−ＨＥ
ＰＯＦＬ８中のＥＰＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と
それから推定されるアミノ酸配列を示し； 第７表は第３表と同じもので、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡク
ローン，ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13中のＥＰＯ ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
詳細な説明 本発明はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニングおよびそ
のｃＤＮＡのin vitro発現によるＥＰＯの生産に使用す
る組換えＤＮＡベクターおよびその形質転換体に関す
る。
ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡは、次のようにして得ることが可
能である。なお、明細書中で使用する(1)から(17)の数
字は、本明細書の終わりに番号順に掲載した刊行物を意
味する。
ヒトＥＰＯのゲノムクローンの単離 先ずヒトＥＰＯを以下で説明するように再生不良性貧血
に悩む患者の尿等の材料から均一に精製する。この精製
ＥＰＯをタンパク質分解酵素トリプシンで完全消化して
フラグメントを得、これらのフラグメントを逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離し、勾配画分から回収し、
そして微量アミノ酸配列分析法にかける。この分析によ
り決定される各トリプシン消化フラグメントのアミノ酸
配列は、例えば第２表および第３表において下線が施さ
れた部分に相当する。これらのうち、適当なフラグメン
ト、好ましくはＶal−Ａsn−Ｐhe−Ｔyr−Ａla−Ｔrp−
ＬysおよびＶal−Ｔyr−Ｓer−Ａsn−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg
を選んで、その配列に対応するオリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成する。前者のトリプシン消化フラグメントか
らは17ヌクレオチド長の32種類のオリゴヌクレオチドプ
ールと18ヌクレオチド長の128種類のオリゴヌクレオチ
ドプール、および後者のトリプシン消化フラグメントか
らは各々14ヌクレオチド長の48種類の２つのプールがそ
れぞれ得られる。これらのうちから、32種類の17オリゴ
ヌクレオチド（以下merと略す）プールを使用してCharo
n 4A(Ch4A)ベクター(3)中のヒトゲノムＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングする。なお、スクリーニングはウ
ー(Woo)およびオマレー（Ｏ′Malley）のin situ増幅法
(11)の変法を使用できる。スクリーニング用のフィルタ
ー調製その他の詳細は、実施例１で詳述する。
17merとハイブリダイズするファージを採取し、小グル
ープ別にプールし、そしてプローブとして14merおよび1
8merプールを使用してさらに検索する。17merおよび14m
erプールとハイブリダイズするファージをプラーク精製
し、精製ファージの塩基フラグメントをＭ13ファージベ
クター中にサブクローニングして、サンガー(Sanger)お
よびクールソン(Coulson)のジデオキシ・チェイン・タ
ーミネーション法(4)(1977)により塩基配列を決定す
る。本発明者らが得た一つのクローン中の、32種類の17
merとハイブリダイズする領域の塩基配列を第１表に示
す。このＤＮＡ配列は、オープン・リーディング・フレ
ーム内に17merプールのオリゴヌクレオチドを推論する
のに使用したトリプシン消化フラグメントを正確にコー
ドしうるヌクレオチドを含んでいた。さらに、分析結果
はこのＤＮＡ配列は、17merとハイブリダイズする領域
がスプライス受容部位と供与部位（夫々第１表中、ａお
よびｄで示される）によって境界される87bpのエクソン
内に含まれることを示した。
ＥＰＯ ｃＤＮＡクローンの単離 次に、上記で得られたＥＰＯのゲノムＤＮＡをプローブ
として、適当なヒトｃＤＮＡライブラリーからＥＰＯ
ｃＤＮＡを単離する。本発明者らの研究によれば、胎児
肝臓ｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡライブラリーが
この目的に最適であった。即ち、本発明者らは、第１表
に示す87bpエクソン部分を含む前記Ｍ13クローンから95
ヌクレオチド一本鎖を調製し、これをプローブとして用
いて、ヒト胎児（20週目）肝臓ｍＲＮＡのノーザン分析
(15)を行った。第１図に示すように、強いシグナルが胎
児肝臓ｍＲＮＡ中に検出された。そこで同じプローブを
使って胎児肝臓ｍＲＮＡからバクテリオファージラムダ
中に作られたｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした
ところ(5)、スクリーニングした250,000個の組換え体当
たり約１個の陽性クローンの頻度で、数個のハイブリダ
イズするクローンが得られた。これらのｃＤＮＡクロー
ン（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13およびラムダ−ＨＥＰＯＦ
Ｌ８と命名した）の完全なヌクレオチド配列およびそれ
から推定されたアミノ酸配列を第３表と第６表に示す。
ＥＰＯコーディング情報は非常に疎水性の27個のアミノ
酸からなるリーダー部分と、166個のアミノ酸からなる
マチュア部分を含むｃＤＮＡの５−プライム側半分の59
4ヌクレオチド内に含まれる。なお、マチュアタンパク
質のＮ末端の推定は、ゴールドバッサー(Goldwasser)
(6)、スー(Sue)およびシトコフスキー(Sytkowski)(7)、
およびヤナガワ(Yanagawa)(2)により発表された結果、
または本発明者らが別に決定した再生不良性貧血患者の
尿中に排泄されたタンパク質のＮ末端配列に基づいた。
このＮ末端（Ａla−Ｐro−Ｐro−Ａrg…）が循環中のＥ
ＰＯに見られる実際のＮ末端であるのかどうか、または
腎臓や尿中でいくつかの切断が起こるのかどうか今のと
ころ不明である。
第２表および第３表で下線を施したアミノ酸配列は、タ
ンパク質配列情報が得られたトリプシン消化フラグメン
トまたはＮ末端の部分を示す。クローン化されたｃＤＮ
Ａ配列から推定されたアミノ酸配列は、アミノ酸配列が
決定されたトリプシン消化フラグメントと正確に一致
し、単離されたｃＤＮＡはヒトＥＰＯをコードすること
が確かめられた。
ヒトＥＰＯ遺伝子の構造および塩基配列 Ｃｈ４Ａベクター(3)に組込まれたヒトゲノムＤＮＡラ
イブラリーを作製し、先に得られた２種類のＥＰＯ ｃ
ＤＮＡクローンから調製されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブ及び他の種々のプローブを用いてハイブリダイゼー
ション分析を行った。この分析により４個の独立したヒ
トＥＰＯゲノムクローン（ｇＤＮＡ）を得、またこれら
クローンのＤＮＡ挿入物の相対位置を確認して第３図に
示した。第３図に黒い線で示される約3.3kb領域内にＥ
ＰＯ遺伝子が存在することが示されている。この領域の
完全な塩基配列分析（参考例１を参照）およびｃＤＮＡ
クローンとの比較から、第４図に示されるＥＰＯ遺伝子
のイントロンおよびエクソン構造の地図を描くことがで
きた。ＥＰＯ遺伝子は５個のエクソンに分割される。エ
クソンＩの一部、エクソンII，IIIおよびIVの全部、お
よびエクソンＶの一部がタンパク質コーディング情報を
含む。エクソンＩおよびＶの残部はそれぞれ５−プライ
ムおよび３−プライム非翻訳配列をコードする。
こうして得られるクローン（本明細書中ではラムダ−Ｈ
ＥＰＯ１およびラムダ−ＨＥＰＯ２と呼ぶ２つのクロー
ンが得られた）が完全なＥＰＯゲノムクローンであると
いうことは、他のトリプシン消化フラグメントのコーデ
ィング情報を含んだ別のエクソンの塩基配列を決定する
ことにより確認できた。
ＣＯＳ細胞によるＥＰＯの発現 本発明は、単離されたＥＰＯ ｃＤＮＡを含む組換えＤ
ＮＡベクターを調製しそれを用いて哺乳動物細胞を形質
転換させ、そして活性なＥＰＯを生産する方法も提供す
る。得られたｃＤＮＡが生物学的に活性なＥＰＯをin v
itro細胞培養系において発現し得ることを確認するため
には、Gluzmanの方法でＳＯＳ細胞の形質発現実験を行
う(16)。この試験的発現に使用可能なベクターｐ91023
(B)は実施例４に示される。このベクターはアデノウイ
ルス主要後期プロモーター(major late promoter)、Ｓ
Ｖ40ポリＡ付加配列、ＳＶ40複製開始点、ＳＶ40エンハ
ンサー、およびアデノウイルスＶＡ遺伝子を含む。前記
ｃＤＮＡクローン、例えばラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13（第
７表を参照）中のｃＤＮＡ挿入物をｐ91023(B)ベクター
内のアデノウイルス主要後期プロモーターの下に連結挿
入する。本発明者らは、このようにして得られた新しい
ベクターをｐＰＴＦＬ13と命名した。
こうして構築されたベクターで、例えばＣＯＳ−１細胞
のＭ６株〔ホロビッツ(Horowitz)らのJ.Mol.Appl.Gene
t.２：147-149(1983)を参照〕をトランスフェクション
し、約24時間後に細胞を洗浄し、無血清培地に変え、そ
して約48時間後に培養上清を集める。そして、培養上清
中に放出されたＥＰＯの量をＥＰＯに関するSherwood,
J.B.らの定量的ラジオイムノアッセイを用いて試験する
(14)。この方法によれば、第８表（実施例５）に示すよ
うに、免疫学的に反応性を有するＥＰＯの発現が検出さ
れる。生産されたＥＰＯの生物学的活性も試験できる。
例えば、本発明者らは培地中のＥＰＯを２つのin vitro
バイオアッセイ（3Ｈ−チミジンおよびＣＦＵ−Ｅ
（１，８）〕および２つのin vivoアッセイ〔低酸素性
マウスおよび飢餓ラット（９，10）〕により定量化した
（実施例６の第９表を参照）。これらの結果は、生物学
的に活性なＥＰＯがＣＯＳ−１細胞で生産されることを
示している。
本発明の方法で生産されたＥＰＯがヒト尿から得られた
天然ＥＰＯと同じものであることは、ポリクローナル抗
ＥＰＯ抗体を使用するウエスターンブロッティング(Wes
tern blotting)により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で同じ移動度を有していることから証明された（実
施例７を参照）。従って、ＣＯＳ−１細胞で生産された
ＥＰＯのグリコシル化の程度は天然ＥＰＯのそれと同様
でありうる。
本発明はまた、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡの発現のために特
に好適な、他のプロモーターを含む異なるベクターを使
用した、極めて効率的なＥＰＯの生産法も開示する。そ
のようなベクターは、ＣＯＳ細胞もしくは他の哺乳動物
細胞において使用することができる。本発明の実施に有
用なこの種の他のプロモーターの例にはＳＶ40初期およ
び後期プロモーター、マウスメタロチオネイン遺伝子プ
ロモーター、トリまたは哺乳動物レトロウイルスの長い
末端繰返し配列中に見出されるプロモーター、バキュロ
ウイルスポリヘドロン遺伝子プロモーターおよびその他
のものが含まれる。本発明の実施に際して有用な他の細
胞の例にはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、Ｃ
127（サル上皮）、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＣＶ
−１（アフリカン・グリーン・モンキー腎臓）のような
哺乳動物細胞が含まれる。このように本発明の形質転換
体は、哺乳動物細胞を用いる。これは大腸菌等の微生物
に比べＥＰＯが細胞外へ分泌されるためＥＰＯの精製が
容易であること、また生物的活性に寄与する糖鎖が付加
するという利点があるためである。これらの特定のプロ
モーターおよび／または細胞はＥＰＯの発現タイミング
や発現レベルの調節、細胞に特異的な型のＥＰＯの生
産、または比較的費用がかからず容易に制御できる条件
下でのＥＰＯ生産細胞の大量増殖を可能にしうる。細胞
培養培地は一般に栄養素塩類溶液と10％ウシ胎児血清で
ある。
ＣＨＯ，Ｃ127および３Ｔ３によるＥＰＯ発現の例は実
施例９および10（ＣＨＯ）ならびに12（Ｃ127と３Ｔ
３）に示される。
実施例10のようにＣＨＯ細胞により生産された組換えＥ
ＰＯは慣用のカラムクロマトグラフィー法により精製し
た。糖タンパク質中に存在する糖の相対量は、２つの独
立した方法〔(I)レインホールド(Reinhold),Methods in
Enzymol.50：244-249-（メタノリシス）および(II)タ
ケモト(Takemoto.H.)らのAnal.Biochem.145：245(1985)
（独立したシアル酸測定を伴うピリジルアミノ化）〕で
分析された。これらの方法のそれぞれによって得られた
結果は申し分なく一致した。こうして、いくつかの測定
が行われて次の平均値を得た（この場合比較目的のため
に、Ｎ−アセチルグルコサミンを１とする）。
両方の独立した糖分析法によって有意量のフコースとＮ
−アセチルガラクトサミンが再現可能に観察されたこと
は注目に値する。Ｎ−アセチルガラクトサミンの存在は
タンパク質におけるＯ−結合グリコシル化の存在を示
す。Ｏ−結合グリコシル化の存在はさらに種々の組合せ
のグリコシド酵素による糖タンパク質の消化後のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析によっても示された。特に、酵素ペプタ
イド、Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、糖タンパク質
の全てのＮ−結合炭水化物を酵素的に除去した後、さら
に、ノイラミニダーゼ消化を行うとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析で測定したそのタンパク質の分子量はさらに減少し
た。
精製された組換えＥＰＯのin vitro生物学的活性は、ア
ミノ酸組成のデータに基づいて計算されたタンパク質定
量値を使用するクリスタル(G.Krystal)のExp.Hematol.,
11：649(1983)に記載の方法（脾臓細胞増殖バイオアッ
セイ）により検定した。複数の測定において、精製組換
えＥＰＯのin vitro比活性は200,000単位／mgタンパク
質以上であると計算された。平均値は約275,000〜300,0
00単位／mgタンパク質の範囲であった。さらに、300,00
0以上の値も観察された。この組換え物質に対して観察
されたin vivo〔赤血球増加マウス検定；カザール(Kaza
l)およびアースレブ(Erslev)のAm.Clinical Lab.Sci.,V
ol.B,p91(1975)を参照〕／in vitro活性比は0.7〜1.3で
あった。
先に示した糖タンパク質の特性と、本出願の優先日より
後の国際公開ＷＯ85／02610（1985年６月20日付）〔特
表昭61-501627（1986年８月７日付）〕に記載されてい
る組換えＣＨＯ生産ＥＰＯ物質の特性とを比較すること
は興味のあることである。上記公表公報明細書の第26ペ
ージ左下欄に記載されている対応する糖の比較分析は、
Ｎ−アセチルグルコサミン１に対してフコースおよびＮ
−アセチルガラクトサミンは、ゼロの値を、そしてヘキ
ソース類は15.09と大きな値を報告している。Ｎ−アセ
チルガラクトサミンの不在は上記国際出願に報告された
糖タンパク質中にＯ−結合グリコシルが存在しないこと
を示す。この物質と対照的に、本発明の組換えＣＨＯ生
産ＥＰＯは先に性状決定がなされたように、再現可能に
観察しうる有意量のフコースとＮ−アセチルガラクトサ
ミンの双方を含み、ヘキソース類は相対量として１／10
以下であり、そしてＯ−結合グリコシルの存在によって
差異があり、本発明で得られるＥＰＯはヒト尿から得ら
れるＥＰＯと同一か近似のグリコシル化パターンを有す
る。さらに、本発明の上記ＣＨＯ細胞由来組換えＥＰＯ
の高い比活性はそのグリコシル化パターンと直接関連し
ていると考えられる。
本発明のクローン化ＥＰＯ遺伝子の哺乳動物細胞発現に
より生産された生物学的に活性なＥＰＯは、医師や獣医
師によるヒトおよび哺乳動物種のin vivo治療に使用で
きる。活性成分の量はもちろん治療しようとする症状の
程度、選ばれた投与経路、および活性ＥＰＯの比活性に
依るであろうが、最終的には主治医や獣医により決定さ
れるだろう。主治医によって決定された活性ＥＰＯのこ
のような量は、本明細書中で“ＥＰＯ治療有効”量と呼
ばれる。例えば、ヒツジにおける慢性腎不全に伴う増殖
低下性貧血の治療において、ＥＰＯの一日の有効量は15
〜40日の間10単位／kgであることがわかった。エッシュ
バッハ(Eschbach)らのJ.Clin.Invest.74：434(1984)を
参照されたい。
活性ＥＰＯは治療しようとする症状に適する経路で投与
される。好ましくは、ＥＰＯは治療されるべき哺乳動物
の血流中に注射される。好適な投与経路は治療しようと
する症状ごとに変化する。
活性ＥＰＯは純粋な又は実質的に純粋な化合物として投
与することができるが、医薬配合物または医薬製剤とし
てそれを提供することが好ましい。
本発明を使用して得られる配合物は、上記のような活性
ＥＰＯタンパク質のほかに、１種または２種以上の薬剤
上許容される担体と他の治療成分を含有する。担体は配
合物の他の成分と共存でき且つそれを投与される者に有
害であってはならない。望ましくは、配合物としては酸
化剤やペプチドと共存できないような他の物質を含むべ
きでない。配合物は簡便には単位投与形体(unit dosage
form)で提供され、薬剤学上よく知られた方法により調
製される。全ての方法は活性成分と１種または２種以上
の補助成分を含む担体とを混合する工程を含む。一般
に、配合物は活性成分と液体担体または微細な固体担体
またはその両者とを均一にかつ緊密に混合し、その後必
要に応じてその生成物を所望配合物へ成形することによ
り作られる。
非経口投与に適する配合物は簡便には活性成分の滅菌水
溶液からなり、その際その溶液は受容者の血液と等張で
あるのが好ましい。この種の配合物は固体活性成分を水
に溶解して水溶液をつくり、その水溶液を滅菌すること
により適宜調製され、そして例えば密封アンプルやバイ
アルのような単位用量容器または多用量容器で提供され
る。
本発明で哺乳動物細胞にヒトＥＰＯを生産させるために
使用されるＥＰＯ／ｃＤＮＡにはＡＴＧコドンの後につ
ながるマチュアＥＰＯ／ｃＤＮＡ遺伝子、およびＥＰＯ
タンパク質の対立遺伝子変異体をコードするＥＰＯ／ｃ
ＤＮＡが含まれる。１つの対立遺伝子は第３〜６表に示
される。ＥＰＯタンパク質にはＥＰＯタンパク質の１−
メチオニン誘導体（Ｍet−ＥＰＯ）およびＥＰＯタンパ
ク質の対立遺伝子変異体が含まれる。マチュアＥＰＯタ
ンパク質は第２表の配列Ａla−Ｐro−Ｐro−Ａrg…から
始まる配列（最初のアミノ酸残基には番号１（第２表）
が付されている）によって示される。Ｍet−ＥＰＯは配
列Ｍet−Ａla−Ｐro−Ｐro−Ａrg…から始まる。
ＥＰＯ／ｃＤＮＡの発現の結果生成する糖タンパク質
は、形質転換体内または発現系外に存在するタンパク質
分解酵素の作用を受けることが充分考えられ、ＤＮＡ配
列から読みとられるアミノ酸配列１〜166のすべてを備
えていないことがあり得る。例えばＣ末Ａrgの脱離が、
ＣＨＯ発現ＥＰＯについて見出されている。しかし、こ
の種の糖タンパク質もin vivo活性を有しており、本発
明を使用して得られる目的物に含まれる。なお、Ｃ末Ａ
rgの脱離はヒト尿ＥＰＯについても見出されており、in
vivo活性が保持されていることが確認されている。
次の実施例は本発明を理解しやすくするためのものであ
り、本発明の真の範囲は請求の範囲によって説明され
る。ここに記載の方法において多くの修飾が本発明の精
神から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきで
ある。全ての温度は℃で表わされ未補正である。マイク
ロリッター、マイクロモル等に於けるマイクロの略号と
して「μ」を用い、それぞれ「μ」，「μｍ」として
表わす。
実施例 実施例１： ＥＰＯのゲノムＤＮＡ断片クローンの単離 ＥＰＯのゲノムＤＮＡを単離するには、ヒトゲノムＤＮ
Ａライブラリーから、適当なヌクレオチドプローブを用
いてスクリーニングする必要がある。そのプローブの配
列は、ＥＰＯのアミノ酸配列の少なくとも一部分に対応
するものでなければならない。そこで、まず、ＥＰＯを
再生不良性貧血患者の尿からミヤケらの方法〔ミヤケ(M
iyake)らのJ.Biol.Chem.,252：5558(1977)を参照〕で精
製したが、但しフェノール処理を省略しその代わりに80
℃で５分の熱処理を行ってノイラミニダーゼを失活させ
た。精製の最終工程は、0.1％トリフルオル酢酸（ＴＦ
Ａ）を含む０〜95％アセトニトリル勾配を、100分間で
使用するＣ−４Vydac HPLCカラム(The Separations Gro
up)での分画化により行った。上記勾配中のＥＰＯの位
置は、主要ピークのゲル電気泳動およびＮ末端アミノ酸
配列分析（２，６，７）により測定した。ＥＰＯは約53
％アセトニトリルで溶離され、逆相ＨＰＬＣにかけたタ
ンパク質の約40％に相当した。ＥＰＯを含む画分を次い
で100μになるまで蒸発させ、重炭酸アンモニウムでp
H7.0に調節し、２％トシルフェニルアラニルクロロメチ
ルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリプシン(Worthington)に
より37℃で18時間完全消化した。その後、トリプシン消
化物を上記と同様の逆相ＨＰＬＣにかけた。280nmおよ
び214nmでの光学密度を監視した。十分に分離した各ピ
ークの成分を乾固状態近くにまで蒸発させ、Applied Bi
osystems 480A型気相シークエネーターを使って直接Ｎ
末端アミノ酸配列分析(17)にかけた。各ピークの成分は
第２表および第３表において下線が施されているアミノ
酸配列を有することが判明した。
先に述べたように、これらのトリプシン消化フラグメン
トのうち２つがヌクレオチドプローブの合成用に選ばれ
た。配列：Ｖal−Ａsn−Ｐhe−Ｔyr−Ａla−Ｔrp−Ｌys
（第２表および第３表のアミノ酸46〜52）からは、32種
類（縮重）の17mer および128種類の（縮重）の18mer が合成された。配列：Ｖal−Ｔyr−Ｓer−Ａsn−Ｐhe−
Ｌeu−Ａrg（第２表および第３表のアミノ酸144〜150）
からは、ロイシンコドンの第１位で異なるそれぞれ48種
類（縮重）の２つの14merプール が合成された。これらのオリゴヌクレオチドプローブを
ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)およ
びガンマ32Ｐ−ＡＴＰ(New England Nuclear)を用いて
32Ｐで５−プライム末端を標識した。オリゴヌクレオチ
ドの比活性はオリゴヌクレオチド１ミリモル当り1000〜
3000Ｃｉであった。この標識プローブを使用して、バク
テリオファージラムダ中のヒトゲノムＤＮＡ（ヒト染色
体をＨaeIII／ＡluＩで切断したＤＮＡ断片）ライブラ
リー（Ｃｈ４Ａベクター使用）（ローン(Lawn)ら，３）
をウー(Woo)ら，(11)(1978)によるin situ増幅法の変法
を用いてスクリーニングした。即ち、ヒトゲノムＤＮＡ
を含む上記ファージ約3.5×105を150mmペトリ皿（ＮＺ
ＣＹＭ培地）当り6000ファージの密度でまいて、肉眼で
見える小さな（約0.5mm）プラークが形成されるまで37
℃でインキュベートした。４℃で１時間冷却後、プラー
クパターンの２通りのレプリカをナイロン膜(New Engla
nd Nuclear)に移行させ、新しいＮＺＣＹＭ平板上37℃
で一晩インキュベートした。その後、フィルターをそれ
ぞれ0.5ＮＮａＯＨ−１Ｍ ＮＡＣｌおよび0.5Ｍトリス
（pH８）−１Ｍ ＮａＣｌの薄膜上で10分間ずつ処理す
ることにより変性および中和した。フィルターを80℃で
２時間真空ベーキングした後、５×ＳＳＣ、0.5％ＳＤ
Ｓで１時間洗い、フィルター表面の細胞破砕物を湿った
ティッシュで穏やかにかき取ることにより除去した。こ
のかき取りはプローブのフィルターへのバックグラウン
ド結合を減少させた。次に、フィルターをＨ2Ｏですす
ぎ、３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ
ｌ）、10ｍＭ ＮａＰＯ4（pH6.8）、５×Denhardt′
ｓ、0.5％ＳＤＳおよび10ｍＭＥＤＴＡ中48℃で４〜８
時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、32
Ｐ−標識17merを0.1pmol／ｍの濃度で加えて48℃で72
時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼ
ーション後、フィルターを２×ＳＳＣ（0.3ＭＮａＣｌ
−0.03Ｍクエン酸Ｎａ，pH７）で室温にて十分に洗浄
し、さらに３Ｍ ＴＭＡＣｌ−10ｍＭ ＮａＰＯ4（pH
6.8）で室温にて１時間、次にハイブリダイゼーション
を行った時と同じ温度（48℃）で５〜15分間洗浄した。
増感板を使用した２日間のオートラジオグラフィー後、
約120の強いレプリカされたシグナルが検出された。
陽性ファージを拾って８プールに分け、再度ファージプ
ラークを形成させ、２枚のフィルターの各々に対しては
14merプールの１／２ずつを使用し、２枚目のフィルタ
ーに対しては17merを使用して３通りの再スクリーニン
グを行った。プラーク形成およびハイブリダイゼーショ
ンの条件は先に述べた通りであるが、14merについての
ハイブリダイゼーションは37℃で行った。オートラジオ
グラフィー後、室温にて20分間50％ホルムアミド中で17
merフィルターからプローブを除去し、そのフィルター
を52℃で18merプローブと再度ハイブリダイズさせた。
２つの独立のファージが３種のプローブ全部とハイブリ
ダイズした。これらのファージの１つ（本明細書ではラ
ムダ−ＨＥＰＯ１と呼ぶ）からのＤＮＡをＳau３Ａで完
全消化し、Ｍ13中でサブクローニングし、サンガーおよ
びクールソン，(4)のジデオキシ・チェイン・ターミネ
ーション法によるＤＮＡ配列分析のためにＭ13というベ
クター（市販品）に組込み、大腸菌に挿入し、増殖させ
た。ＥＰＯトリプシン消化フラグメント（第１表下線領
域）をコードするオープン・リーディング・フレームの
ヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を本明細
書中第１表に示す。イントロン配列は小文字で表わさ
れ、エクソン配列（87ヌクレオチド）は大文字で表わさ
れる。コンセンサススプライス受容部位(a)および供与
部位(d)と一致する配列には下線が施されている。第１
表の配列は、そのまゝ第４表の配列の一部を構成してい
る。
実施例２：ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのノーザン分析 本実施例では上記ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのライブラリー
を作成し、このライブラリー中に目的とするｍＲＮＡが
存在することを確認し、またそのｍＲＮＡのおよそのサ
イズを測定することを目的としている。
５μｇのヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラリー（20週目の
胎児肝臓から調製したもの）および成人肝臓ｍＲＮＡラ
イブラリーを0.8％アガロースホルムアルデヒドゲルに
よる電気泳動に付し、ダーマン(Derman)らのCell,23：7
31(1981)に記載の方法を用いてニトロセルロースに移行
させた。これと別に、第１表に示す配列を挿入物中に含
むＭ13テンプレートから、ノーザン分析用の95ヌクレオ
チド一本鎖プローブを作成した。その際、プライマーと
しては初めの17merプローブと同じトリプシン消化フラ
グメントから誘導された20merのものを使用した。プロ
ーブはアンダーソン(Anderson)らのPNAS,(12)(1984)に
記載された方法で作成したが、ＳmaＩ消化（74ヌクレオ
チドのコーディング配列を含む95ヌクレオチド長の目的
プローブをもたらす）後、0.1ＭＮａＯＨ−0.2Ｍ Ｎａ
Ｃｌ中セファロースＣ14Ｂカラムでのクロマトグラフィ
ーによりその95merの小さなフラグメントをＭ13テンプ
レートから精製した。このプローブ約５×106cpmを、上
記ニトロセルロースフィルターと68℃で12時間ハイブリ
ダイズさせ、68℃にて２×ＳＳＣで洗浄し、増感板を用
いて６日間感光させた。1200ヌクレオチドの単一のマー
カーｍＲＮＡ（矢印で示す）は隣接レーンで泳動させ
た。（第１図） その結果、ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラリー中に、プ
ローブとハイブリダイズする一本のバンドが見出され
た。
実施例３：胎児肝臓ｃＤＮＡの単離 前記ノーザン分析の結果、胎児肝臓のｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、この中からスクリーニング
を行えば、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡが単離できると予測さ
れた。そこで、実施例２に記載のプローブと同じ95mer
のプローブを使用し、そして標準プラークスクリーニン
グ〔ベントン・デービス(Benton Davis)のScience,(13)
(1977)を参照〕方法を使用して、胎児肝臓ｍＲＮＡ誘導
され、ベクターラムダ−Ｃｈ21Ａ〔トール(Toole)らのN
ature,(5)(1984)を参照〕中に作られた胎児肝臓ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした。その結果、１×
106個のプラークをスクリーニングした後に３つの独立
の陽性ｃＤＮＡクローン〔本明細書ではラムダ−HEPOFL
６(1350bp)、ラムダ−HEPOFL８(700bp)およびラムダ−H
EPOFL13(1400bp)と呼ぶ〕を単離した。ラムダ−HEPOFL1
3およびラムダ−HEPOFL６の完全挿入物についてはＭ13
でのサブクローニング後に塩基配列を決定した。それぞ
れの塩基配列を第７表および第５表に示す。ラムダ−HE
POFL８についても部分的に塩基配列を決定し、残りの部
分は他の２つのクローンと同じであると推定した。その
塩基配列を第６表に示す。５−プライムおよび３−プラ
イム非翻訳配列は小文字で表わされる。コーディング領
域は大文字で表わされる。
第７表（および第３表）に関して、ヌクレオチド配列の
上に示される推定上のアミノ酸配列は成熟タンパク質の
第１番目のアミノ酸を１として番号が付けられている。
推定上のリーダーペプチドはアミノ酸の略号が大文字で
示される。成熟タンパク質中のシステイン残基はさらに
ＳＨで示され、またＮ−結合グリコシル化の可能性があ
る部位は星印で示される。下線が施されているアミノ酸
は、Ｎ末端タンパク質配列決定または実施例１で述べた
ようなＥＰＯのトリプシン消化フラグメントの配列決定
により同定されたアミノ酸残基を示す。点線は明確に決
定し得なかったトリプシン消化フラグメントのアミノ酸
配列中の残基を示す。ｃＤＮＡクローンのラムダ−HEPO
FL６、ラムダ−HEPOFL８およびラムダ−HEPOFL13はメリ
ーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに寄託され、それぞれ寄託番号ATCC 4
0156,ATCC 40152およびATCC 40153として入手可能であ
る。
参考例１：ＥＰＯ遺伝子のゲノム構造 本発明者等はＥＰＯゲノムＤＮＡの構造および塩基配列
も明らかにした。実施例３で得た３種類のＥＰＯ ｃＤ
ＮＡクローンから調製されたオリゴヌクレオチドおよび
種々のプローブを用いてヒトゲノムＨaeIII／ＡluＩラ
イブラリー（ＣｈＡ４ベクター使用）をスクリーニング
を行い、４個の独立したゲノムクローンを得た。これら
４個の独立したゲノムクローン（ラムダ−ＨＥＰＯ１，
２，３および６）の相対的な大きさおよび位置は、第３
図において重複する線によって示されることが判明して
いる。太くて濃い3.3kbの線がＥＰＯ遺伝子の存在する
部分である。既知制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位
置とスケール(kb)も示されている。次に、ＥＰＯ遺伝子
を含む領域は、この領域の一連の欠失を生じさせる特異
的エキソヌクレアーゼIIIを使用して、両鎖から完全に
塩基配列が決定された。ＥＰＯ ｍＲＮＡをコードする
５つのエクソンとイントロンの構造の模式図を第４図に
示す。エクソンＩの正確な５−プライム境界は今のとこ
ろ不明である。それぞれのエクソンのタンパク質コーデ
ィング部分は黒く塗りつぶされている（この領域の完全
なヌクレオチド配列は既に第４表に示した）。第４図に
おいて、各エクソンの既知範囲は垂直線で示される。エ
クソンＩの一部、エクソンII,IIIおよびIVの全部、およ
びエクソンＶの一部がタンパク質コーディング情報を含
む。エクソンＩおよびＶの残部はそれぞれ５−プライム
および３−プライム非翻訳配列をコードする。ゲノムク
ローンのラムダ−ＨＥＰＯ１、ラムダ−ＨＥＰＯ２、ラ
ムダ−ＨＥＰＯ３およびラムダ−ＨＥＰＯ６はメリーラ
ンド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託され、それぞれ寄託番号ATCC 4015
4,ATCC 40155,ATCC 40150およびATCC 40151として入手
可能である。
実施例４：ベクターｐ91023(B)の作成 形質転換用ベクターとしてカウフマン(Kaufman)らのMo
l.Cell Biol．，２：1304(1982)に記載のpAdD 26SVpA
(3)を用いた。このベクターの構造は第５Ａ図に示す。
簡単に述べれば、このプラスミドはアデノウイルス（Ａ
ｄ２）主要後期プロモーターの転写制御下にあるマウス
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ遺伝子を含
む。５−プライムスプライス部位はアデノウイルスＤＮ
Ａ中に示され、３−プライムスプライス部位（免疫グロ
ブリン遺伝子から誘導される）はＡｄ２主要後期プロモ
ーター(major late promoter)とＤＨＦＲコーディング
配列の間に存在する。ＳＶ40初期ポリＡ部位はＤＨＦＲ
コーディング配列から下流に存在する。pAdD 26SVpA(3)
の原核生物由来部分はpSVOd〔メロン(Mellon)らのCell,
27：279(1981)を参照〕から由来し、哺乳動物細胞内で
複製を阻害することが知られているｐＢＲ322配列を含
まない〔ラスキー(Lusky)らのNeture,293：79(1981)を
参照〕。
pAdD 26SVpA(3)は第５Ａ図および第５Ｂ図に示すように
プラスミドpCVSVL２へ変換した。pAdD 26SVpA(3)はその
中の２個のＰstＩ部位の一方を欠失させることによりプ
ラスミドpAdD 26SVpA(3)(d)に変換した。この変換は１
個のＰstＩ部位のみが切断された線状プラスミドのサブ
集団を得るために酵素活性を弱めたＰstＩで部分消化
し、続いてクレノウ(Klenow)で処理し、連結して環状化
し、そしてＳＶ40のポリＡ配列の３−プライム側に位置
するＰstＩ部位の欠失についてスクリーニングすること
により達成された。
次いで、pAdD 26SVpA(3)(d)に、以下のようにしてアデ
ノウイルス３分節系(tripartite)リーダーおよびウイル
ス関連遺伝子（ＶＡ遺伝子）を挿入した。即ち、最初
に、pAdD 26SVpA(3)(d)をＰvuIIで切断して、３分節系
リーダーからなる３つの要素の３−プライム部分内で開
環した線状分子を作った。次に、pJAW43〔ゼイン(Zain)
らのCell,16：851(1979)を参照〕をＸhoＩで消化し、ク
レノウで処理し、ＰvuIIで消化し、そして第３番目のリ
ーダーの第２部分を含む140bpフラグメントをアクリル
アミドゲル（トリス−ホウ酸緩衝液中６％；マニアチス
らの上記文献参照）による電気泳動により単離した。そ
の後、この140bpフラグメントをＰvuIIで消化したpAdD
26SVpA(3)(d)へ連結した。この連結生成物を用いて大腸
菌をテトラサイクリン耐性へと形質転換し、140bpフラ
グメントとハイブリダイズする32Ｐ標識プローブを使用
するグルンスタイン(Grunstein)−ホグネス(Hogness)法
によりコロニーを選択した。ポジティブにハイブリダイ
ズするコロニーからＤＮＡを調製して、再構成されたＰ
vuII部位が第２および第３アデノウイルス後期リーダー
に特異的な140bp ＤＮＡ挿入物の５−プライム側にあ
るかあるいは３−プライム側にあるかについて試験し
た。正しい向きのＰvuII部位は140bp挿入物の５−プラ
イム側に存在する。このプラスミドは第５Ａ′図にｐＴ
ＰＬとして示される。
次に、ｐＴＰＬにＳＶ40エンハンサーを含むＳＶ40のＡ
vaIIＤフラグメントを挿入するため、第５Ｂ図に示すよ
うにＳＶ40 ＤＮＡをＡvaIIで消化し、ＰｏｌＩのクレ
ノウフラグメントで両末端を平滑にし、これらのフラグ
メントにＸhoＩリンカーを連結し、ＸhoＩで消化してＸ
hoＩ部位を開き、そしてゲル電気泳動で４番目に大きい
フラグメント（Ｄフラグメントと呼ぶ）を単離した。こ
のＤフラグメントをＸhoＩ消化ｐＴＰＬに連結してプラ
スミドｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬを得た。ｐＣＶＳＶＬ２
−ＴＰＬ中のＳＶ40Ｄフラグメントの向きは、ＳＶ40後
期プロモーターがアデノウイルス主要後期プロモーター
と同じ向きで存在するものであった。
ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ内にアデノウイルス関連（Ｖ
Ａ）遺伝子を導入するために、ＶＡ遺伝子供給源として
のアデノウイルス２型Ｈind IIIＢフラグメントを含む
プラスミドｐＢＲ322を作成した。即ち、アデノウイル
ス２型ＤＮＡをＨind IIIで消化して、Ｂフラグメント
をゲル電気泳動により単離した。このフラグメントをあ
らかじめＨind IIIで消化したｐＢＲ322の中に挿入し、
第５Ｂ図に示すｐＢＲ322−Ａｄ Ｈind IIIＢを得た。
このフラグメント（アンピシリン耐性をマーカーとして
持つ大腸菌を形質転換した後、形質転換体をＨind III
Ｂプラスミドの挿入についてアンピシリン耐性を指標に
スクリーニングし、挿入された向きを制限酵素消化によ
り調べた。ｐＢＲ322−Ａｄ Ｈind IIIＢは第５Ｂ図に
示す向きでアデノウイルス２型Ｈind IIIＢフラグメン
トを含む。
第５Ｂ′図に示すように、ＶＡ遺伝子はプラスミドｐＢ
Ｒ322−Ａｄ Ｈind IIIＢをＨpaＩで消化し、ＥcoＲＩ
リンカーを付加してＥcoＲＩで消化し、続いて1.4kbフ
ラグメントを回収することにより得られる。このＥcoＲ
Ｉ接着末端をもつ1.4kbフラグメントは、次に前もって
ＥcoＲＩで消化したｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬのＥcoＲＩ
部位に連結した。得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ101
を形質転換してテトラサイクリン耐性を指標にして選別
した後、ＶＡ遺伝子に特異的なＤＮＡに対するフィルタ
ーハイブリダイゼーションによりコロニーをスクリーニ
ングした。ポジティブにハイブリダイズするクローンか
らＤＮＡを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により
同定した。得られたプラスミドはｐ91023と命名した
（第５Ｂ′図）。
続いてｐ91023に存在する２個のＥcoＲＩ部位を除去す
るため、第５Ｃ図に示すように、ｐ91023をＥcoＲＩで
完全消化して２つのＤＮＡフラグメント（一方は約７kb
であり、他方はＶＡ遺伝子を含んでおり、約1.3kbであ
る）を生成させた。両フラグメントの末端をＰolＩのク
レノウフラグメントを用いて夫々修復し、次にその２つ
のフラグメントを再度連結した。ＶＡ遺伝子を含み、ｐ
91023に類似するが２個のＥcoＲＩ部位を欠失したプラ
スミドｐ91023(A)は、ＶＡ遺伝子フラグメントを使用す
るグルンスタイン−ホグネススクリーニングにより、ま
たは慣用の制限部位分析により同定した。
さらに、ｐ91023(A)中の単一のＰstＩ部位を除き、その
代わりにＥcoＲＩ部位を入れた。即ち、ｐ91023(A)をＰ
stＩで完全消化し、ＰolＩのクレノウフラグメントで処
理して平滑末端を生成させた。ｐ91023(A)のその平滑末
端化ＰstＩ部位にＥcoＲＩリンカーを連結した。平滑末
端化ＰstＩ部位にＥcoＲＩリンカーを連結させた線状ｐ
91023(A)を非連結リンカーから分離し、ＥcoＲＩで完全
消化して再び連結させた。第５Ｃ図に示すプラスミドｐ
91023(B)を回収し、ｐ91023(A)に類似するがＰstＩ部位
の代わりにＥcoＲＩ部位を有するものを単離同定した。
プラスミドｐ91023(B)はメリーランド州ロックビルのア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れ、寄託番号ATCC 39754として入手可能である。
実施例５：ＣＯＳ−１細胞中でのＥＰＯ ｃＤＮＡの発
現例１ ｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ６およびラム
ダ−ＨＥＰＯＦＬ13：実施例３参照）を制限酵素ＥcoＲ
Ｉで処理し、ＥＰＯｃＤＮＡを含んだＥcoＲＩフラグメ
ントを取得した。次いで、この取得したフラグメントを
プラスミドｐ91023(B)のＥcoＲＩ部位に挿入した。
挿入後のプラスミドはアデノウイルス主要後期プロモー
ターの転写制御下で、ＥＰＯが発現できる構造を有する
プラスミドで有り、それぞれｐＰＴＦＬ６およびｐＰＴ
ＦＬ13と命名した。その後、それぞれのプラスミドから
の精製ＤＮＡ８μｇを用いて５×106個のＣＯＳ−１細
胞をＤＥＡＥ−デキストラン法（以下参照）によりトラ
ンスフェクションした。12時間後、細胞を洗浄し、クロ
ロキン（0.1ｍＭ）で２時間処理し、再び洗浄し、そし
て10％ウシ胎児血清を含む培地10ｍに24時間さらし
た。その培地を無血清培地４ｍに変えて48時間後に収
穫した。
免疫学的に活性なＥＰＯの生産は、シェアウッド(Sherw
ood)およびゴールドバッサー(Goldwasser)(14)により示
されるラジオイムノアッセイにより定量化した。抗ＥＰ
Ｏ抗体はジュディス・シェアウッド博士(Dr.Judith She
rwood)により提供された。ヨウ素化トレーサーは実施例
１に記載の均一なＥＰＯから製造した。検定の感度は大
体１ng／ｍである。結果を下記の第８表に示す。
ｐＰＴＦＬ13はメリーランド州ロックビルのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託
番号ATCC 39990のもとに入手可能である。
実施例６：ＣＯＳ−１細胞中でのＥＰＯ ｃＤＮＡの発
現例２ ＥＰＯ ｃＤＮＡ（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13）を実施例
５と同様の方法でｐ91023(B)に挿入し、ＣＯＳ−１細胞
をトランスフェクションして上記（実施例５）のように
収穫した。ただしクロロキン処理を省いた。
in vitroで生物学的に活性なＥＰＯは、ＣＦＵ−Ｅ源と
してマウス胎児肝臓細胞を用いるコロニー形成検定また
はフェニルヒドラジン注射マウスからの脾臓細胞を用い
る3Ｈ−チミジン取込み検定により測定した。これらの
検定の感度は大体25mU／ｍである。なお、「ＣＦＵ−
Ｅ源としてマウス胎児肝臓細胞を用いるコロニー形成検
定」は、通常、次のような方法で検定される。すなわ
ち、適当量のメチルセルロース、牛胎児血清、メルカプ
トエタノールおよび牛血清アルブミン等からなる培地に
試料を加えて、そこにマウス胎児由来の肝臓細胞を５％
ＣＯ2存在加湿下、37℃で２日間培養する。次いで、培
地中に形成されたＣＦＵ−Ｅコロニー（通常、８個以上
の細胞からなる群をコロニーという）の数を測定し、活
性既知のＥＰＯ標準液にもとづくin vitro活性値とコロ
ニー数との検量線から、試料中のＥＰＯのin vitro活性
を検定する〔Bersch and Golde,M.J.Murphy,Ed.New Yor
k：Springer-Verlag(1978)を参照〕。一方、「フェニル
ヒドラジン注射マウスからの脾臓細胞を用いる3Ｈ−チ
ミジン取り込み検定」は、一般に、次のような方法で検
定される。すなわち、フェニルヒドラジンを投与し貧血
状態にしたマウスから脾臓を取り出し、その細胞を懸濁
させる。その懸濁細胞を、αー最少必須培地（α−ＭＥ
Ｍ）に適当量の牛胎児血清、メルカプトエタノール等を
付加した培養基（例えば96穴のマイクロプレート）に加
え、さらにそこに試料を添加して５％ＣＯ2存在加湿
下、37℃で22時間培養する。次いで、その培養基に3Ｈ
−チミジンを加え（最終濃度として１uCi／well）、37
℃でさらに２時間を培養する。培養後、細胞中に取り込
まれた3Ｈ−チミジン由来の放射線量を計量し、活性既
知のＥＰＯ標準液にもとづくin vitro活性値と放射線量
との検量線より、試料中のＥＰＯのin vitro活性を検定
する〔Exp.Hematol.,11,649-660(1983)を参照〕。in vi
voで生物学的に活性なＥＰＯは低酸素性マウス法または
飢餓ラット法により測定した。これらの検定の感度は大
体100mU／ｍである。コントロール実験で得られた培
地(mock condition mediun)からの検定では活性が全く
検出されなかった。クローンＨＥＰＯＦＬ13によって発
現されたＥＰＯの結果は下記の第９表に示す〔活性は単
位／ｍで表わし、標準対照として市販の比活性の明示
されたＥＰＯ（Toyobo社製）を使用した〕。
実施例７：ＣＯＳ−１細胞からのＥＰＯのＳＤＳポリア
クリルアミドゲル分析 ＥＰＯ ｃＤＮＡ（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13）を含むベ
クターｐ91023(B)でトランスフェクションされたＣＯＳ
細胞から培地に分泌されたＥＰＯ 180ngを10％ＳＤＳ
Ｌaemlliのポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に
かけ、ニトロセルロース紙に電気移動させた〔トービン
(Towbin)らのProc.Natl.Aced.Sci.USA 76：4350(1979)
を参照〕。このフィルターは実施例５に記載されたよう
な抗ＥＰＯ抗体を用いて検索し、洗浄し、そして125Ｉ
−黄色ブドウ球菌Ａプロテインを用いて再度検索した。
その後２日間オートラジオグラフィーを行った。天然の
均一ＥＰＯは実施例１に記載されたものを使用し、ヨウ
素化前（レーンＢ）またはヨウ素化後（レーンＣ）に電
気泳動を行った（第６図参照）。使用したマーカーは35
Ｓメチオニン標識された血清アルブミン(68,000d)およ
び卵白アルブミン(45,000d)であった。
実施例８：ｐＲＫ１−４の作成 実用上の目的に適し、１つのプロモーターにより目的ｃ
ＤＮＡ，ＤＨＦＲの２つの遺伝子が支配される特徴を持
つ発現ベクターを作成するため、次に述べるフラグメン
トＡ，ＢおよびＣを連結してプラスミドＲＫ１−４を作
成した。このプラスミドは第７図の構造を持ち、特に実
用的特徴がある。
フラグメントＡは次のようにして得られた。マウスジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子に隣接するＳＶ40
初期領域プロモーター、ＳＶ40エンハンサー、小さなｔ
抗原イントロン、およびＳＶ40ポリＡ配列を含むプラス
ミドＰＳＶ２ＤＨＦＲ〔サブラマニ(Subramani)らのMo
l.Cell.Biol.，１：854-864(1981)を参照〕からＢamＨ
Ｉ−ＰvuIIフラグメントを単離した（フラグメント
Ａ）。
残りのフラグメントＢおよびＣは次のようにしてベクタ
ーｐ91023(A)（実施例４および第５Ｃ図参照）から得ら
れた：ｐ91023(A)をアデノウイルスプロモーターの近く
の単一のＰstＩ部位でＰstＩにより消化してこのプラス
ミドを線状化し、次にＰstＩ−ＥcoＲＩ部位へ変換する
ための合成フラグメントに連結して再環状化する〔もと
のＰstＩ部位にＰstＩ−ＥcoＲＩ−ＰstＩ部位を作る；
ｐ91023（Ｂ′）〕か、あるいは実施例４で述べたよう
にＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで処理してＰ
stＩ部位を破壊し、合成ＥcoＲＩリンカーに連結して再
環状化した〔もとのＰstＩ部位にＥcoＲ部Ｉ部位を作
る；ｐ91023(B)〕。得られた２つのプラスミドｐ91023
(B)とｐ91023（Ｂ′）の各々をＸbaＩおよびＥcoＲＩで
消化して２つのフラグメント（ＦおよびＧ）を得た。ｐ
91023(B)からのフラグメントＦとｐ91023(Ｂ′）からの
フラグメントＧおよびｐ91023(B)からのフラグメントＧ
とｐ91023(Ｂ′）からのフラグメントＦを連結すること
により、もとのＰstＩ部位にＥcoＲＩ−ＰstＩ部位また
はＰstＩ−ＥcoＲＩ部位のいずれかを含む２つの新しい
プラスミドを作成した。ＰstＩ−ＥcoＲＩ部位を含むプ
ラスミド（ＰstＩ部位がアデノウイルス主要後期プロモ
ーターに最も接近している：プロモーターに近接してい
る位置に目的ｃＤＮＡを挿入できるようにＰstＩサイト
が設けられている）をｐ91023(C)と命名した。
ベクターｐ91023(C)をＸhoＩで完全消化し、接着末端を
もつ得られた線状プラスミドは大腸菌のＤＮＡポリメラ
ーゼＩ大フラグメントを用いる末端修復反応により平滑
末端とした。このＤＮＡに、次のようにして作成したＳ
Ｖ40エンハンサー含有の340bp Ｈind III−ＥcoＲＩフ
ラグメントを連結した： ＳＶ40からのＳＶ40複製開始点およびエンハンサーを含
むＨind III−ＰvuIIフラグメントをプラスミドc lac
〔リトル(Littls)らのMol.Biol.Med．，１：473-488(19
83)を参照〕に挿入した。c lacベクターはc lacＤＮＡ
をＢamＨＩで消化し、接着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ
大フラグメントで修復し、そのＤＮＡをＨind IIIで消
化することにより調製した。得られたプラスミド（ｃ
ＳＶＨＰ lac）はＰvuII平滑末端を連結されたことに
よりＢamＨＩ部位を再生していた。ｃＳＶＨＰ lacか
らＥcoＲＩ−Ｈind IIIフラグメントを作り、プラスミ
ドの複製開始点を含むｐＳＶＯｄ（実施例４に示したメ
ロンらの上記文献参照）のＥcoＲＩ−Ｈind IIIフラグ
メントに連結し、得られたプラスミドｐＳＶＨＰＯｄを
選択した。その後、ＳＶ40複製開始点／エンハンサーを
含むｐＳＶＨＰＯｄの340bp ＥcoＲＩ−Ｈind IIIフラ
グメントを作り、両末端をＤＮＡポリメラーゼＩ大フラ
グメントで平滑末端とし、そして上記のＸhoＩ消化し、
平滑末端化ｐ91023(C)ベクターに連結した。
Ｈind III−ＥcoＲＩフラグメント中のＢamＨＩ部位が
ＶＡ遺伝子に最も接近するような向きをもつ得られたプ
ラスミド（ｐ91023(C)／ＸhoＩ／平滑末端プラスＥcoＲ
Ｉ／Ｈind III／平滑末端ＳＶ40複製開始点プラスエン
ハンサー）はｐＥＳ105と命名した。このプラスミドｐ
ＥＳ105をＢamＨＩとＰvuIIで、またはＰvuIIだけで消
化して、アデノウイルス主要後期プロモーターを含むＢ
amＨＩ−ＰvuIIフラグメント（フラグメントＢ）および
耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）と他の配列との間
にそのプラスミドを含むＰvuIIフラグメント（フラグメ
ントＣ）を単離した。
フラグメントＡ，ＢおよびＣを連結し、第７図に示すプ
ラスミドを単離してＲＫ１−４と命名した。プラスミド
ＲＫ１−４はメリーランド州ロックビルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番
号ATCC 39940のもとに入手可能である。
実施例９：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発現−方法Ｉ 上記実施例５のプラスミドｐＰＴＦＬ13からのＥＰＯ
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（20μｇ）を制限エンドヌクレア
ーゼＣlaＩで消化して線状化し、そしてプラスミドpAdD
26SVp(A)１（カウフマン等のMol.Cell.Biol.，２：130
4(1982)）からのＣlaＩ消化ＤＮＡ（２μｇ）〔アデノ
ウイルス主要後期プロモーターにより制御される完全な
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含む〕に連結した
〔カウフマン(Kaufman)およびシャープ(Sharp)のMol.an
d Cell Biol．２：1304-1319(1982)を参照〕。この連結
ＤＮＡを使ってＤＨＦＲ−ネガティブＣＨＯ細胞〔ＤＵ
ＫＸ−ＢＩＩ，カーシン(Chasin L.A.)およびアーラウ
プ(Urlaub G.)のPNAS 77：4216-4220(1980)を参照〕を
トランスフェクションし、２日間増殖後、少なくとも１
つのＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだ細胞をアルファ培地
（ヌクレオチドを欠き、10％透析ウシ胎児血清を補充し
たもの）で選択した。選択培地で２週間増殖後、コロニ
ーをもとの平板から採取し、１プール当り10〜100個の
コロニーから成るグループに分け、再度ヌクレオチド欠
損培地で培地上全面に増殖するまで培養した。増殖プー
ルからの培地上清をメトトレキセート（ＭＴＸ）選択に
先立ってＲＩＡでＥＰＯについて検定した。陽性のＥＰ
Ｏ生産を示したプールはメトトレキセート（0.02μＭ）
の存在で増殖させ、サブクローニングして再度検定し
た。ＥＰＯ Ｃla ４α4.02（ＭＴＸ耐性のものを精製
したもの）プールからサブクローニングされた単一のＥ
ＰＯ Ｃla４α4.02-7は0.02μＭＭＴＸを含む培地中に
460ng／ｍのＥＰＯを放出した（第10表参照）。ＥＰ
Ｏ Ｃla ４α4.02-7はＥＰＯ生産に特に適する細胞株
であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンに寄託番号ATCC CRL 8695として寄託された。一般
に、このクローンは次第に増加する濃度のＭＴＸ中で段
階的選択にかけると、さらに高レベルのＥＰＯを生産す
る細胞を生成するであろう。ＲＩＡで陰性であったプー
ルについては、メトトレキセート（0.02μＭ）の存在下
で増殖した相対培養物からのメトトレキセート耐性コロ
ニーをＲＩＡでＥＰＯについてプールごとに再び検定し
た。陽性でなかったこれらの培養物をサブクローニング
し、さらに濃度を高めたメトトレキセート中で増殖させ
た。
段階的にメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を上げて培養
する選択は、次第に増加する濃度のメトトレキセートの
存在下で細胞を培養して生存細胞を選択するというサイ
クルを繰り返すことにより達成された。各回ごとに培養
上清中のＥＰＯをＲＩＡおよびin vitro生物活性により
測定した。各段階的増幅において使用されたメトトレキ
セートの量は0.02μＭ，0.1μＭおよび0.5μＭであっ
た。第10表に示すように、0.02μＭのＭＴＸによる１回
の選択後に有意量のＥＰＯが培地中に放出された。
実施例10：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発現−方法II クローンラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13からのＤＮＡをＥcoＲ
Ｉで消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む小さなフラグメント
（ＲＩフラグメント）をプラスミドＲＫ１−４（実施例
８参照）のＥcoＲＩ部位内でサブクローニングした。次
に、このＤＮＡ（ＲＫＦＬ13）を用いてＤＨＦＲ−ネガ
ティブＣＨＯ細胞を直接（消化せずに）トランスフェク
ションし、そして上記の実施例９のようにして選択およ
び増幅を行った。
また、ＲＫＦＬ13ＤＮＡはプロトプラスト融合または微
量注射法によりＣＨＯ細胞に挿入した。プラスミドＲＫ
ＦＬ13はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号AT
CC 39989のもとに入手可能である。
好適な単一コロニークローンはメリーランド州ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託され、寄託番号ATCC CRL8695のもとに入手可能であ
る。
実施例11：ＣＯＳ−１細胞によるＥＰＯゲノムＤＮＡの
発現 ＥＰＯゲノムクローンの発現のために使用したベクター
はｐＳＶＯｄ（実施例４に示したメロンらの上記文献参
照）である。ｐＳＶＯｄからのＤＮＡはＨind IIIで完
全消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントで平滑
末端とした。ＥＰＯゲノムクローンのラムダ−ＨＥＰＯ
３はＥcoＲＩとＨind IIIで完全消化し、ＥＰＯ遺伝子
を含む4.0kbフラグメントを単離して上記のように平滑
末端とした。Ｈind III部位からポリＡシグナルをちょ
うど越えた領域までのこのフラグメントのヌクレオチド
配列は第４図および第４表に示す。ＥＰＯ遺伝子フラグ
メントをｐＳＶＯｄプラスミドフラグメント内に挿入
し、そして両方の向きの正しく構築された組換え体を単
離して確かめた。プラスミドＣＺ２−１は“ａ”の向き
（すなわちＥＰＯの５′末端がＳＶ40開始点に最も接近
する……第９Ａ図参照）でＥＰＯ遺伝子を有し、プラス
ミドＣＺ１−３はそれと反対の向き（すなわち“ｂ”の
向き……第９Ｂ図参照）である。
プラスミドＣＺ１−３およびＣＺ２−１は実施例６のよ
うにしてＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションし、培
地を収穫して免疫学的に反応性のＥＰＯについてラジオ
イムノアッセイで検定した。ＣＺ２−１からは培養上清
中に約31ng／ｍのＥＰＯが検出され、ＣＺ１−３から
は16〜31ng／ｍのＥＰＯが検出された。
なお ラジオイムノアッセイについては、次の方法にし
たがって行った。即ち、まず試料と抗血清（実施例１に
記載の均質なＥＰＯをウサギに免疫して得られた抗血
清）に125Ｉ−ＥＰＯ（実施例１に記載の均質なＥＰＯ
に常法にしたがって調整した125Ｉ−ＥＰＯ）を加え放
置する。次いで、これに第２抗体（ヤギ抗ウサギγ−グ
ロブリン）を加え、沈殿させ、全体の放射能および上清
液を除いた沈殿の放射能を測定し、全体に対する沈殿の
放射能の比率（Ｂ／Ｔ）を算出する。そして、濃度既知
のＥＰＯの標準液にもとづくＢ／Ｔ比率とＥＰＯ量との
検量線より、試料中のＥＰＯ量をもとめる（Blood,54,8
85-893(1979)を参照）。
ゲノムクローンＨＥＰＯ１，ＨＥＰＯ２およびＨＥＰＯ
６は類似の方法でＣＯＳ細胞に挿入し且つ発現させるこ
とができる。
実施例12：Ｃ127および３Ｔ３細胞による発現用プラス
ミドｐＢＰＶＥＰＯの作成 マウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下にあ
り且つ完全ウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡに結合されたＥＰ
Ｏ ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを次のようにして作
成した： ｐＥＰＯ49ｆ プラスミドＳＰ６／５（なお、プラスミドＳＰ6/5の構
築方法は、次のとおりである。まずバクテリアファージ
ＳＰ６のプロモーターを含むＢglII−ＣlaＩ約500bp断
片を、ｐＢＲ322に組込む。このプラスミドをＢal31で
処理して、プロモーターの下流にあるＣlaＩ部位より転
写開始点付近まで欠失させる。次にＨindIIIリンカーを
介して、ＳＰ６プロモーター領域およびｐＢＲ322のＢa
mＨＩ−ＳalＩ断片を含むＤＮＡ断片をｐＵＣ12に組込
み、プラスミドＳＰ6/4を得る。このプラスミドＳＰ6/4
より、プロモーター領域を含むＤＮＡを断片を切り出し
てｐＵＣ13に組込むと、プロモーターとポリリンカーが
プラスミドＳＰ6/4とは逆向きになったプラスミドＳＰ6
/5が得られる。プラスミドＳＰ6/5の構造については、
第10図に掲載する(Nucleic Acids Research,12,7035-70
56(September 25,1984)を参照）。）をPromega Biotec
から購入した。このプラスミドをＥcoＲＩで完全消化
し、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13からのＥＰＯ ｃＤＮＡを
含む1340bpＥcoＲＩフラグメントをＤＮＡリガーゼによ
り挿入した。ＥＰＯ遺伝子の５′末端がＳＰ６プロモー
ターに極めて接近している（ＢglＩおよびＨind III消
化で測定）得られたプラスミドをｐＥＰＯ495と命名し
た。なお、方向性に関して、ｐＳＰ６／５ポリリンカー
中のＢamＨＩ部位はＥＰＯ遺伝子の５′末端に直接に隣
接している。
ｐＭＭＴneoΔＢＰＶ 第８図に示すプラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo(342-12)
〔ロー(Law)らのMol.and Cell Biol.３：2110-2115(198
3)を参照〕をＢamＨＩで完全消化して、ＢＰＶゲノムを
含む約８kbの大きなフラグメントと、ｐＭＬ２複製開始
点およびアンピシリン耐性遺伝子、メタロチオネインプ
ロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ40ポリ
Ａシグナルを含む約6.5kbの小さなフラグメントの両フ
ラグメントを生じさせた。消化したＤＮＡを分離するこ
となくＤＮＡリガーゼで再び環状化し、目的とする約6.
5kbフラグメントのみを含むプラスミドをＥcoＲＩとＢa
mＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。こ
の種のプラスミドの一つをｐＭＭＴneoΔＢＰＶと命名
した。
ｐＥＰＯ15a ｐＭＭＴneoΔＢＰＶをＢglIIで完全消化した。ｐＥＰ
Ｏ495をＢamＨＩとＢglIIで完全消化して、全ＥＰＯコ
ーディング領域を含む約700bpフラグメントプラスミド
をゲル電気泳動により単離した。ＢglII消化ｐＭＭＴne
oΔＢＰＶと700bp ＢamＨＩ／ＢglIIＥＰＯフラグメン
トとを連結し、ＥＰＯｃＤＮＡを含む得られたプラスミ
ドはＥＰＯ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプロー
ブｄ（ＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣ）を使
用するコロニーハイブリダイゼーションにより同定し
た。ハイブリダイゼーション分析で陽性であったプラス
ミドのうち、ＥＰＯｃＤＮＡの５′末端がメタロチオネ
インプロモーターに最も接近する方向性のＥＰＯ ｃＤ
ＮＡをもつ１つのプラスミド（ｐＥＰＯ15a）がＥcoＲ
ＩおよびＫpnＩ消化により同定された。
ｐＢＰＶ−ＥＰＯ プラスミドｐＥＰＯ15aをＢamＨＩで完全消化して線状
化した。プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo(342-12)もま
たＢamＨＩで完全消化して、約6.5kbと８kbの２つのフ
ラグメントを得た。全ウシ乳頭腫ウイルスゲノムを含む
８kbフラグメントをゲル電気泳動により単離した。ｐＥ
ＰＯ15a／ＢamＨＩと８kbＢamＨＩフラグメントとを一
緒に連結し、ＢＰＶフラグメントを含むプラスミド（ｐ
ＢＰＶ−ＥＰＯ）は、ＢＰＶゲノムに特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブｄ（Ｐ−ＣＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡ
ＣＡＣＡ−ＯＨ）を使用するコロニーハイブリダイゼー
ションにより同定した。ｐＢＰＶ−ＥＰＯ ＤＮＡのＨ
ind III消化は、ＢＰＶゲノムの転写方向がメタロチオ
ネインプロモーター（第８図のpdＢＰＶ−ＭＭＴneo(34
2-12)を参照）の転写方向と同じであることを示した。
プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo(342-12)はメリーラン
ド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションから寄託番号ATCC 37224のもとに入手可能で
ある。
発現 ＥＰＯを発現させるために次の方法を使用した。
方法１ ＤＮＡ ｐＢＰＶ−ＥＰＯを作成し、約25μｇを使用し
て約１×106個のＣ127〔ローウィー(Lowy)らのJ.of Vir
ol.,26：291-298(1978)を参照〕および３Ｔ３細胞を標
準的なリン酸カルシウム沈殿法〔グラム(Grahm)らのVir
ology,52：456-467(1973)を参照〕によりトランスフェ
クションした。トランスフェクションの５時間後、トラ
ンスフェクション用培地を除き、グリセロールショック
(glycerol shock)を行い、洗浄し、そして10％ウシ胎児
血清を含む新しいアルファ培地を加えた。48時間後、細
胞をトリプシン処理して500μｇ／ｍの抗生物質Ｇ418
を含むＤＭＥ培地中に１：10の比で分散させ〔サザン(S
outhern)らのMol.Appl.Genet.，１：327-341(1982)を参
照〕、それらの細胞を２〜３週間インキュベートした。
次いで、Ｇ418耐性コロニーをミクロタイターウェル(mi
crotiter well)内に個々に単離し、Ｇ418の存在下で培
地全面がやや密集するまで増殖させた。その後、細胞を
洗浄し、10％ウシ胎児血清を含む新しい培地を加えて24
時間後に培地を収穫した。その生産培地を試験し、ラジ
オイムノアッセイ（実施例11記載の方法に準じる）およ
びフェニルヒドラジン注射マウスからの脾臓細胞を用い
る3Ｈ−チミジン取り込み検定（実施例６記載の方法に
準じる）によりＥＰＯについて陽性であることがわかっ
た。
方法II Ｃ127または３Ｔ３細胞を、方法Ｉで述べたように、２
５μｇのｐＢＰＶ−ＥＰＯと２μｇのｐＳＶ２neo（サ
ザンらの上記文献参照）を用いて同時トランスフェクシ
ョンした。これは大体10倍モル過剰のｐＢＰＶ−ＥＰＯ
を使用する。トランスフェクション後の手法は方法Ｉと
同じである。
方法III 方法Ｉで述べたように、Ｃ127細胞を30μｇのｐＢＰＶ
−ＥＰＯでトランスフェクションした。トランスフェク
ションおよび分散（１：10）の後、３日おきに新しい培
地と取り換えた。約２週間後にＢＰＶ形質転換細胞の斑
点が出現した。各々の斑点をミクロタイター皿の１cm径
のウェル内に別々に採置し、やや密集した単層になるま
で増殖させ、生産培地中のＥＰＯ活性または抗原性につ
いて検定した。
実施例13：ＥＰＯの精製 ＥＰＯ濃度が200μｇ／程度のＣＯＳ細胞生産培地（1
2）を0.465m2（５平方フィート）の膜を備えたミリポ
ア・ペリカン(Millipore Pellican)のような10,000分子
量で分離する限外過膜を使用して、600ｍに濃縮し
た。検定は実施例５のようにしてＲＩＡで行った。限外
過からの濃縮物はpH7.0に緩衝化した10ｍＭリン酸ナ
トリウム４に対して透析した。こうして濃縮および透
析された生産培地は全タンパク質380mg中にＥＰＯ2.5mg
を含んでいた。このＥＰＯ溶液をさらに186ｍに濃縮
し、沈殿したタンパク質を110,000×ｇで30分間遠心す
ることにより除いた。
ＥＰＯ（2.0mg）を含む上清を50％酢酸てpH5.5に調節
し、４℃で30分間攪拌し、沈殿物を13,000×ｇで30分間
遠心することにより除いた。
カルボニルメチルセファロースクロマトグラフィー ＥＰＯ200μｇ（全タンパク質24mg）を含む遠心上清（2
0ｍ）を、10ｍＭ酢酸ナトリウム（pH5.5）中で平衡化
したＣＭ−セファロース（20ｍ）を充填したカラムに
加え、同じ緩衝液40ｍで洗浄した。ＣＭ−セファロー
スに結合したＥＰＯは10ｍＭリン酸ナトリウム（pH5.
5）中のＮａＵ（0-1）の勾配100ｍで溶離した。ＥＰ
Ｏ含有画分（全タンパク質２mg中全部で50μｇ）を集
め、アミコン(Amicon)ＹＭ10限外過膜を使って２ｍ
に濃縮した。
逆相ＨＰＬＣ ＣＭ−セファロースからのＥＰＯを含む濃縮画分は、バ
イダック(Vydac)Ｃ−４カラムを使用する逆相ＨＰＬＣ
によりさらに精製した。10％溶剤Ｂ（溶剤Ａは0.1％Ｃ
Ｆ3ＣＯ2Ｈ／Ｈ2Ｏであり；溶剤Ｂは0.1％ＣＦ3ＣＯ2Ｈ
／ＣＨ3ＣＮである）で平衡化したカラムに１ｍ／分
の流量でＥＰＯを加えた。このカラムを10％溶剤Ｂで10
分間洗浄し、ＥＰＯを溶剤Ｂの直線濃度勾配（60分で10
〜70％）で溶離した。ＥＰＯ含有画分（全タンパク質12
0μｇ中ＥＰＯ約40μｇ）を集めて凍結乾燥した。凍結
乾燥ＥＰＯは0.15Ｍ ＮａＣｌを含む0.1Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（pH7.5）中で再調製し、逆相ＨＰＬＣにより再び
クロマトグラフ処理を行った。ＥＰＯ含有画分を集め、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（10％）ゲル電気泳動によ
り分析した〔ラメリ(Lameli,U.K.),Natureを参照〕。集
めたＥＰＯ画分は全タンパク質25μｇ中ＥＰＯ15.5μｇ
を含んでいた。
発明の効果 本発明はヒトエリトロポエチンの効率的生産に使用でき
るヒトエリトロポエチンのクローン化遺伝子、組換えＤ
ＮＡベクターおよび該発現形質転換体を提供するもの
で、各種貧血症の治療薬等の開発に利用できるものであ
る。
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【図面の簡単な説明】
第１図はヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡの検
出を示す電気泳動図であり； 第２図はラムダ−ＨＥＰＯＦＬ13中のＥＰＯｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列の模式図であり； 第３図は４個の独立したヒトＥＰＯゲノムクローンのＤ
ＮＡ挿入物の相対位置を示し； 第４図はヒトＥＰＯ遺伝子のイントロンおよびエクソン
構造の推定地図を示し； 第５図に含まれる各図はベクターpAdD26SVpA(3)から出
発し、本発明のＥＰＯをコードするｃＤＮＡを挿入して
発現用プラスミドを作るためのベクターｐ91023(B)を作
成するための一連の操作を示す説明図である。 第５Ａ図はベクターpAdD26SVpA(3)からベクターpAdD26S
VpA(3)(d)の作成を示し、 第５Ｂ図は引続きベクターpTPLの作成を示し、 第５Ｃ図は引続きベクターpCVSVL2-TPLの作成を示し、 第５Ｄ図は引続きベクターp91023の作成を示し、 第５Ｅ図はベクターp91023(B)の作成をそれぞれ示す図
である。 第６図は天然ＥＰＯと比較したときのＣＯＳ−１細胞で
生産されたＥＰＯのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析
を示し； 第７図はＥＰＯの発現用プラスミドpRKI-4（実施例９参
照）の模式図であり；そして 第８図は、実施例12で材料として用いたプラスミドpdＢ
ＰＶ−ＭＭＴneo(342-12)模式図である。 第９Ａ図はプラスミドＣＺ２−１を示す模式図であり、
ＥＰＯ遺伝子が“ａ”の向きであることを表わす。 第９Ｂ図はプラスミドＣＺ１−３を示す模式図であり、
ＥＰＯ遺伝子が“ｂ”の向きであることを表わす。 第10図はプラスミドＳＰ6/5を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９９９０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ８６９５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１５６ 早期審査対象出願 (72)発明者 ジャコブス・ケネス アメリカ合衆国マサチューセッツ州02160, ニュートン，ビューモント・アベニュー 151 (56)参考文献 特開 平１−55190（ＪＰ，Ａ) 特公 平２−17156（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リーダー部分とマチュア部分が下記のアミ
    ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であるエリトロポエチ
    ンをコードするｃＤＮＡ。
  2. 【請求項２】マチュア部分が下記のＤＮＡ配列である特
    許請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。
  3. 【請求項３】リーダー部分が下記のＤＮＡ配列である特
    許請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。
  4. 【請求項４】リーダー部分とマチュア部分が下記のＤＮ
    Ａ配列である特許請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ。
  5. 【請求項５】リーダー部分とマチュア部分が下記のアミ
    ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であるエリトロポエチ
    ンをコードするｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター。
  6. 【請求項６】マチュア部分が下記のＤＮＡ配列である特
    許請求の範囲第５項に記載の組換えＤＮＡベクター。
  7. 【請求項７】リーダー部分が下記のＤＮＡ配列である特
    許請求の範囲第５項に記載の組換えＤＮＡベクター。
  8. 【請求項８】リーダー部分とマチュアの部分が下記のＤ
    ＮＡ配列である特許請求の範囲第５項に記載の組換えベ
    クター。
  9. 【請求項９】プラスミドＲＫ１−４を用いて構築された
    特許請求の範囲第８項に記載の組換えＤＮＡベクター。
  10. 【請求項１０】リーダー部分とマチュア部分とからな
    り、マチュア部分が下記のアミノ酸配列をコードするＤ
    ＮＡ配列であるエリトロポチエンをコードするｃＤＮＡ
    を含む組換えベクターで哺乳動物細胞を形質転換させて
    得られる形質転換体。
  11. 【請求項１１】マチュア部分が下記のアミノ酸をコード
    するＤＮＡ配列である特許請求の範囲第10項に記載の形
    質転換体。
  12. 【請求項１２】リーダー部分が下記のアミノ酸をコード
    するＤＮＡ配列である特許請求の範囲第10項に記載の形
    質転換体。
  13. 【請求項１３】リーダー部分が下記のＤＮＡ配列である
    特許請求の範囲第12項に記載の形質転換体。
  14. 【請求項１４】リーダー部分とマチュア部分とからなる
    ＤＮＡ配列が下記のＤＮＡ配列である特許請求の範囲第
    10項に記載の形質転換体。
  15. 【請求項１５】哺乳動物細胞がＣＨＯである特許請求の
    範囲第10項に記載の形質転換体。
  16. 【請求項１６】哺乳動物細胞がＤＨＦＲ-／ＣＨＯであ
    り、組換えＤＮＡベルターがＲＫＦＬ13である特許請求
    の範囲第10項に記載の形質転換体。
  17. 【請求項１７】哺乳動物細胞がＣ127である特許請求の
    範囲第10項に記載の形質転換体。
  18. 【請求項１８】哺乳動物細胞が３Ｔ３である特許請求の
    範囲第10項に記載の形質転換体。
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