PL157926B1 - Sposób wytwarzania erytropoetyny PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania erytropoetyny PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL157926B1
PL157926B1 PL1985287787A PL28778785A PL157926B1 PL 157926 B1 PL157926 B1 PL 157926B1 PL 1985287787 A PL1985287787 A PL 1985287787A PL 28778785 A PL28778785 A PL 28778785A PL 157926 B1 PL157926 B1 PL 157926B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
epo
ctc
ccc
leu
cells
Prior art date
Application number
PL1985287787A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27418329&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL157926(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed filed Critical
Publication of PL157926B1 publication Critical patent/PL157926B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, ze hoduje sie w odpowiednim podlozu kom órki gospodarza zawierajace sekwencje D N A zasadniczo taka, jak pokazana na fig. 3B, funkcyjnie polaczona z sekwencja kontroli ekspresji i wyodrebnia sie tak wytworzona erytropoetyne z kom órek i podloza. 2. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, ze hoduje sie w odpowiednim podlozu eukariotyczne kom órki gospodarza zawierajace sekwencje DNA zasadniczo taka, jak pokazana na fig. 4C, funkcyjnie polaczona z sekwencja kontroli ekspresji i w yodrebnia sie tak wytworzona erytropoetyne z kom órek i podloza. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania erytropoetyny.
Erytropoetyna, określana w dalszej części niniejszego opisu skrótem EPO, jest glikoproteiną, która stymuluje wytwarzanie erytrocytów w organizmach wyższych. Patrz: Carnot i wsp., Compt. Rend., 143, 384 (1906). EPO czasami określa się jako czynnik stymulujący erytropoezę.
Czas życia ludzkich erytrocytów wynosi około 120 dni. Tak więc, około 1/120 część całkowitej ilości erytrocytów ulega codziennie zniszczeniu w układzie siateczkowo-śródbłonkowym. Jednocześnie, codziennie tworzona jest względnie stała ilość erytrocytów dla utrzymania przez cały czas względnie stałego ich poziomu [Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56-60, W. B. Saunders Co., Philadelphia (1976)].
Erytrocyty tworzą się na drodze dojrzewania i różnicowania się erytroblastów w szpiku kostnym, a EPO jest czynnikiem, który działa na komórki mniej zróżnicowane i indukuje ich różnicowanie się do erytrocytów (Guyton, wyżej).
EPO jest obiecującym czynnikiem terapeutycznym do klinicznego leczenia niedokrwistości, a w szczególności niedokrwistości pochodzenia nerkowego. Niestety, wykorzystanie EPO nie jest jeszcze częste w praktyce klinicznej, z powodu jej małej dostępności.
Zmierzając do zastosowania EPO jako czynnika terapeutycznego należy brać pod uwagę możliwość zaistnienia problemów związanych z antygenowością i wobec tego jest rzeczą korzystną otrzymywanie EPO z surowego materiału pochodzenia ludzkiego. I tak np., można wykorzystać krew lub mocz ludzki od pacjentów z niedokrwistością aplastyczną, lub cierpiących na podobne choroby, wydzielających duże ilości EPO. Dostępność takich surowych materiałów jest jednak ograniczona [patrz np.: White i wsp., Rec. Progr. Horm. Res., 16, 219 (1960), Espada i wsp., Biochem. Med., 3,475 (1970), Fisher, Pharmacol. Rev., 24,459 (1972) i Gordon. Vitam. Horm. (N. Y.), 31, 105 (1973)].
157 926
Otrzymywanie produktów o charakterze EPO odbywa się na ogół za pomocą zatężania i oczyszczania moczu od pacjentów wykazujących wysoki poziom EPO, takich jak pacjenci z niedokrwistością aplastyczną i podobnymi chorobami. (Patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 397 840, 4 303650 i 3 865 801). Ograniczona dostępność moczu tego rodzaju stanowi przeszkodę w praktycznym użyciu EPO i z tego powodu jest wysoce pożądane otrzymywanie produktów o charakterze EPO z moczu ludzi zdrowych, jednakże przy zastosowaniu takiego moczu problemem jest niski poziom EPO w porównaniu z moczem od pacjentów z niedokrwistością. Oprócz tego, mocz od osobników zdrowych zawiera różne czynniki hamujące, działające przeciwnie do erytropoetyny, przy czym czynniki te wykazują wystarczająco wysokie stężenie, tak, że zadawalający efekt terapeutyczny można byłoby uzyskać, w przypadku zastosowania EPO otrzymanego z moczu ludzi zdrowych, dopiero po jego daleko idącym oczyszczeniu.
EPO można także otrzymać z osocza krwi baraniej i przez wydzielenie EPO z tego osocza otrzymano preparaty wystarczająco skuteczne, stabilne i rozpuszczalne w wodzie [patrz: Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., cz. A, str. 487-494, Alan R. Lies, Inc. N. Y. (1981)]. Można jednak oczekiwać, że baranie EPO będzie wykazywać w organiźmie ludzkim antygenowość.
Tak więc, podczas gdy EPO jest pożądanym czynnikiem terapeutycznym, ' to z drugiej strony zwykłe metody wyodrębniania i oczyszczania, stosowane w przypadku naturalnych materiałów stanowiących źródło EPO, nie są odpowiednie do masowej produkcji tego związku.
Sugimoto i wsp. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4377 513 opisują sposób wytwarzania dużych ilości EPO obejmujący namnażanie in vivo ludzkich komórek limfoblastoidalnych, w tym Namalwa, BALL-1, NaLL-1, TALL-1 i JBL.
W piśmiennictwie fachowym pojawiły się doniesienia, że do wytwarzania EPO zastosowano metody inżynierii genetycznej. Jednakże nie opublikowano ujawnienia umożliwiającego wytwarzanie, ani też danych dotyczących chemicznego charakteru produktu. W przeciwieństwie do tego, niniejsze zgłoszenie przedstawia ujawnienie umożliwiające masową produkcję białek wykazujących właściwości biologiczne ludzkiej EPO. Sposobem według wynalazku można także wytwarzać białka, które pod względem chemicznym mogą się różnić od autentycznej ludzkiej EPO, tym niemniej jednak wykazują podobne, a w niektórych przypadkach polepszone właściwości. Dla wygody, wszystkie te białka wykazujące właściwości biologiczne ludzkiej EPO określa się w dalszej części opisu jako EPO, niezależnie od tego, czy są one, czy też nie są chemicznie identyczne z EPO.
Jak to opisano bardziej szczegółowo w dalszej części opisu, otrzymano EPO w postaci częściowo oczyszczonej, po czym oczyszczano ją dalej aż do uzyskania homogeniczności i trawiono trypsyną w celu wytworzenia specyficznych fragmentów. Fragmenty te oczyszczono i poddano sekwencjonowaniu. Na podstawie tych sekwencji zaprojektowano pulę sond oligenukleotydowych, dokonano ich syntezy i użyto do skriningu ludzkiego zbioru genomowego, z którego wyodrębniono gen EPO.
Gen EPO zweryfikowano na podstawie jego sekwencji DNA, którą skojarzono z wieloma fragmentami trypsynowymi uzyskanymi z sekwencjonowania. Następnie fragmentu klonu genomowego użyto do wykazania za pomocą hybrydyzacji, że można wykryć mRNA EPO w płodzie ludzkim (20-tygodniowym). Otrzymano i poddano skriningowi zbiór cDNA z wątroby płodu ludzkiego. Po skriningu ponad 750000 rekombinatów otrzymano trzy klony cDNA EPO. Stwierdzono, że dwa z tych klonów mają pełną długość, o czym można było sądzić na podstawie całkowitej sekwencji kodującej i zasadniczej sekwencji 5' i 3' nie podlegającej translacji. Doprowadzono do ekspresji tych DNA zarówno w komórkach małpich transformowanych wirusem SV-40 [linia komórkowa COS-1, Glusman, Celi, 23,175-182 (1981)], jak i w komórkach jajnika chomika chińskiego [linia komórkowa CHÓ, G. Urlaub i L. A. Chasin, Proc. Natl. Aend. Sci. USA, 77, 4216-4280 (1980)]. EPO tworzona w komórkach COS stanowi EPO biologicznie aktywną in vitro i in vivo. EPO tworzona w komórka CHO jest biologicznie aktywna in vitro. In vivo nie była ona badana.
Klon cDNA EPO ma interesującą otwartą ramę odczytu 14-15 aminokwasów (aa) oraz inicjator i terminator z 20 do 30 nukleotydów (nt) za regionem kodującym. Reprezentatywną próbkę E. celi transfekowanej klonowanym genem EPO zdeponowano w American Type Culture Collection, RockviIIe, Maryland, gdzie jest dostępna pod numerem rejestracyjnym ATCC 40153.
Figura 1 przedstawia sekwencję 87 par zasad egzonu ludzkiego genu EPO. Figura 2 - wykrycie mRNA EPO w mRNA wątroby płodu ludzkiego. Fig. 3A - sekwencję aminokwasów białka EPO wydedukowaną z sekwencji nukleotydów A-HEPOFL43. Fig. 3B - sekwencję nukleotydów w
157 926 cDNA EPO w ^-HEPOFL13 i wydedukowaną z tego sekwencję aminokwasów, co schematycznie przedstawiono na fig. 3C. Fig. 4A - względną pozycję insertów DNA czterech niezależnych ludzkich genomowych klonów EPO. Fig. 4B - mapę rzeczywistej struktury intronowej i egzonowej ludzkiego genu EPO. Fig. 4C - sekwencję DNA genu EPO przedstawionego na fig. 4B. Fig. 5A, 5B i 5C przedstawiają konstrukcję wektora 91023(B). Fig. 6 przedstawia analizę w żelu poliakryloamidowym EPO wytworzonej w komórkach COS-1 w porównaniu z natywną EPO. Fig. 7 -sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, Λ-HEPOFLó. Fig. 8 - sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, A-HEPOFL8. Fig. 9 - sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, ^-HEPOFL13. Fig. 10 - schematycznie plazmid pRKl-4, oraz Fig. 11 przedstawia schematycznie plazmid pdBPV-MMTneo (342-12).
Wynalazek dotyczy wytwarzania EPO in vitro na drodze ekspresji tych genów.
Piśmiennictwo patentowe i naukowe obfituje w doniesienia o procesach użytecznych w wytwarzaniu produktów rekombinantowych. Ogólnie, techniki te obejmują wyodrębnianie lub syntezę sekwencji żądanego genu i ekspresję tej sekwencji w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, z zastosowaniem metod zwykle dostępnych fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. Gdy dany gen zostanie wyodrębniony, oczyszczony i wprowadzony do odpowiedniego wektora przenoszącego (to jest klonowany), zapewniona zostaje też jego dostępność w dużych ilościach. Wektor, wraz z klonowanym w nim genem, zostaje wprowadzony do odpowiedniego drobnoustroju lub linii komórkowej, np. bakterii, drożdży, komórek ssaków, takich jak COS-1 (nerka małpy), CHO (jajnik chomika chińskiego) oraz linii komórek owadzich itp., w których wektor ulega replikacji w miarę namnażania się dorbnoustroju lub komórek z linii komórkowej. Z komórek tych wektor można wyodrębnić zwykłymi sposobami. Tak więc zostaje zapewnione ciągle odnawiające się źródło genu do dalszych manipulacji, modyfikacji i przenoszenia do innych wektorów lub innych loci w tym samym wektorze.
Do ekspresji często można doprowadzić za pomocą przeniesienia klonowanego genu, w odpowiedniej orientacji w ramie odczytu, do stosownego miejsca w wektorze przenoszącym, tak że translacyjne odczytanie prokariotycznego lub eukariotycznego genu daje w wyniku syntezę prekursora białkowego zawierającego sekwencję aminokwasów kodowaną przez klonowany gen związaną z Met, lub aminokońcową sekwencją zależną od genu prokariotycznego lub eukariotycznego. W innych przypadkach, sygnały inicjacji transkrypcji i translacji może zapewnić odpowiedni fragment genomowy klonowanego genu. W celu rozszczepienia prekursora białkowego, jeżeli taki jest wytwarzany, w żądanym miejscu, można użyć różnorodnych metod specyficznego rozszczepiania białek, tak, że zostaje uwolniona żądana sekwencja aminokwasów, którą można oczyszczać zwykłymi środkami. W niektórych przypadkach, białko zawierające żądaną sekwencję aminokwasów zostaje wytworzone bez potrzeby zastosowania metod specyficznego rozszczepiania i daje się również wydzielić z komórek do zewnątrzkomórkowego podłoża wzrostowego.
Wyodrębnianie genomowego klonu ludzkiej EPO.
Ludzką EPO oczyszczono do homogeniczności z moczu pacjentów dotkniętych niedokrwistością aplastyczną, jak to opisano w dalszej części opisu. Całkowite strawienie tej oczyszczonej EPO proteazą-trypsyną dostarczyło fragmentów, które rozdzielono za pomocą cieczowej chromatografii ciśnieniowej z odwróconymi fazami, odzyskano z frakcji gradientowych i poddano analizie mikrosekwencyjnej. Sekwencje fragmentów trypsynowych podkreślono na fig. 3 i bardziej szczegółowo przedyskutowano w poniższej części opisu. Dwie sekwencje aminokwasów, Val-Asn-PheTyr-Ala-Trp-Lys i Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, wybrano do zaprojektowania sond oligonukleotydowych, z czego wynikła pula oligonukleotydów o długości 17 nt i 32-krotnie zdegenerowana i pula oligonukleotydów o długości 18 nt i 128-krotnie zdegenerowana, które odpowiadały pierwszemu fragmentowi trypsynowemu, oraz dwie pule o długości 14 nt, z których każda była 48-krotnie zdegenerowana i które odpowiadały dalszemu fragmentowi trypsynowemu. 17członowej 32-krotnie zdegenerowanej puli użyto do skriningu zbioru ludzkiego genomowego DNA w wektorze Ch4A, przy zastosowaniu modyfikacji metody amplifikacji in situ Woo i O'Malley'a do otrzymywania filtrów do skriningu.
Fagi hybrydyzujące z 17-członową pulą pobrano, połączono w małe grupy i sondowano pulami: 14-członową i 18-członową. Fagi hybrydyzujące z pulami: 17-członową, 18-członową i 14-członową oczyszczono za pomocą tworzenia łysinek i fragmenty subklonowano do wektorów M13 w celu analizy sekwencji metodą didezoksy-zakończenia łańcucha Saugęra i Coulsona (1977).
157 926
Sekwencję regionu w jednym z klonów, hybrydyzującego z 32-krotnie zdegenerowaną 17-cztonową pulą, pokazano na fig. 1. Ta sekwencja DNA zawiera w otwartej ramie odczytu nukleotydy, które mogły dokładnie kodować fragment trypsynowy użyty do zaprojektowania 17-członowej puli oligonukleotydów. Dalej, analiza sekwencji DNA wykazała, że 17-członowy region hybrydyzujący zawarty był w egzonie o 87 parach zasad, związanym z potencjalnymi miejscami akceptora i donora cięcia i składania.
Pozytywne potwierdzenie tego, że te dwa klony (oznaczone w opisie jako A-HEPO1 i AHEPO2) są genomowymi klonami EPO, otrzymano za pomocą poddania analizie sekwencji dodatkowych egzonów zawierających informację dotyczącą kodowania innych fragmentów trypsynowych.
Wyodrębianie klonów cDNA EPO.
Analizę metodą Northerna (56) mRNA wątroby ludzkiego płodu (20 tygodni) prowadzono stosując jednoniciową sondę o 95 nt otrzymaną z kolnu M13 zawierającego część egzonu o 87 parach zasad opisanego na fig. 1. Jak objaśniono na fig. 2, w mRNA wątroby płodu można było wykryć silny sygnał. Dokładnej identyfikacji tego pasma jako mRNA EPO dokonano za pomocą zastosowania tej samej sondy do skriningu zbioru cDNA z bakteriofagu A, który to cDNA odpowiadał mRNA wątroby płodu (25). Otrzymano kilka hybrydyzujących klonów z częstością odpowiadającą mniej więcej jednemu pozytywnemu na 250000 rekombinantów poddanych skriningowi. Całkowitą sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów dla tych klonów (A-HEPOFL13 i A-HEPOFL8) przedstawiono na fig. 7 i 8. Informacja dotycząca kodowania EPO jest zawarta w połowie cDNA 5' o 594 nt, obejmując w wysokim stopniu hydrofobowy lider o 27 aminokwasach i dojrzałe białko o 166 aminokwasach.
Identyfikację N-końca dojrzałego białka oparto na N-końcowej sekwencji białka wydzielanego w moczu osób z niedokrwistością aplastyczną, jak przedstawiono w niniejszym opisie (fig. 1), oraz jak to opublikowali: Goldwasser, Sue i Sytkowski i Yanagawa. Nie jest obecnie wiadome, czy ten N-koniec (Ala-Pro-Pro-Arg—) reprezentuje rzeczywisty N-koniec znajdowany w EPO występującej w krążeniu, czy też w nerce lub moczu następuje rozszczepienie w pewnym stopniu.
Sekwencje aminokwasów podkreślone na fig. 3 wskazują te fragmenty trypsynowe lub część N-końca, z których otrzymano informację dotyczącą sekwencji białkowej. Wydedukowana sekwencja aminokwasów zgadza się dokładnie z fragmentami trypsynowymi, które analizowano, potwierdzając, że wyodrębniony gen koduje ludzką EPO.
Struktura i sekwencja genu ludzkiej EPO.
Względne pozycje insertów DNA i czterech niezależnych genomowych klonów ludzkiej EPO pokazanona fig. 4A. Analiza hybrydyzacji tych klonowanych DNA z sondami oligonukleotydowymi i z różnymi sondami otrzymanymi z tych dwu klas klonów cDNA EPO pozwala na umiejscowienie genu EPO w regionie o około 3,3 kilozasady pokazanym przyciemnioną linią na fig. 4A. Całkowita analiza sekwencji tego regionu (patrz przykład IV) i porównanie z klonami cDNA dało w wyniku mapę struktury intronowej i egzonowej genu EPO, pokazaną na fig. 4B. Gen EPO jest podzielony na 5 egzonów. Część egzonu I, wszystkie egzony II, III i IV oraz część egzonu V zawierają informację dotyczącą kodowania białka. Pozostałe części egzonów I i V kodują, odpowiednio, sekwencje 5' i 3' nie ulegające translacji.
Tymczasowa ekspresja EPO w komórkach COS.
W celu wykazania, że można oczekiwać ekspresji biologicznej aktywnej EPO w układzie hodowli komórkowej in vitro, przeprowadzono badania ekspresji w komórkach COS. · Wektor stosowany do tymaczasowych badań, p91023(B), opisano w przykładzie V. Wektor zawiera główny promotor późny adenowirusa, sekwencję poliadenylacji SV40, początek replikacji SV40, wzmacniacz SV40 i gen VA adenowirusa. Insert cDNA w A-HEPOFL13 (patrz fig. 8) wprowadzono do wektora p91023(B), w dół od głównego promotora późnego adenowirusa. Ten nowy wektor zidentyfikowano jako pPTFL13.
Po upływie 24 godzin od wprowadzenia tej konstrukcji do szczepu M6 komórek COS-1 na drodze transfekcji [Horowitz i wsp., J. Mol. Appl. Genet.,2,147-149(1983)], komórki te przemyto, przeniesiono do podłoża bez surowicy. 48 godzin później komórki zebrano. Następnie badano poziom uwalniania EPO do supernatantu hodowli stosując ilościowy test radioimmunologiczny dla EPO. Jak pokazano w tabeli 1 (przykład VI) nastąpiła ekspresja immunologicznie reaktywnej EPO. Badano również całkowitą aktywność biologiczną EPO tworzonej · przez komórki COS-1. W oddzielnym eksperymencie, komórki COS-1 transfekowane wektorem zawierającym cDNA EPO z A-HEPOFL13. Podłoża zebrano jak opisano powyżej. EPO w podłożach badano ilościowo
157 926 zarówno w dwóch testach biologicznych in vitro (3H-tymidyna i CFU-E/12, 29), jak i w dwóch testach in vivo (niedotleniona mysz i głodzony szczur) (patrz tabela 2, przykład VII). Badania te wykazały, że w komórkach COS-1 jest tworzona biologicznie aktywna EPO. Za pomocą nakroplenia metodą Westerna, stosując poliklonalne przeciwciało przeciw EPO. wykazano, że EPO wytworzona w komórkach COS ma tę samą ruchliwość elektroforetyczną w żelach SDS-poliakryloamidowych, co natywna EPO otrzymana z moczu ludzkiego (przykład VIII). Tak więc, rozmiary glikozylacji EPO wytworzonej przez COS-1 mogą być podobne do wykazywanego przez natywną EPO.
Można także użyć w zastosowaniu do komórek COS albo innych komórek ssaków lub komórek eukariotycznych różnych wektorów zawierających inne promotory. Przykłady tych innych promotorów użytecznych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku obejmują wczesne i późne promotory SV40, promotor genu mysiej metalotioneiny, promotor znajdowany w długich terminalnych powtórkach retrowirusów ptaków i ssaków, promotor genu polihedryny bacculowirusa i inne. Przykłady innych typów komórek użyteczynych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku obejmują E. coli, drożdże, komórki ssaków, takie jak CHO (jajnik chomika chińskiego), C127 (nabłonek małpi) 3T3 (fibroblasty mysie), CV-1 (nerka afrykańskiej małpy zielonej) oraz komórki owadów takich jak Spodoptera frugiperda i Drosophila metanogaster. Te alternatywne typy promotorów i/lub komórek mogą umożliwić regulację czasu pojawiania się lub regulację poziomu ekspresji EPO, wytwarzanie komórkowo - specyficznego typu EPO, lub wzrost komórek tworzących EPO w dużych ilościach, w warunkach łatwiejszy do skontrolowania i pociągających za sobą niższe koszty.
Układ ekspresyjny, który zachowuje dodatnie cechy ekspresji u ssaków, ale wymaga mniej _ czasu do wytworzenia wysoko ekspresyjnej linii komórkowej, jest złożony z linii komórek owadzich i wirusa DNA, który reprodukuje się w tej linii komórkowej. Wirus jest wirusem jądrowej polihedrozy. Ma on dwuniciowy kolisty genom DNA o 128 kilozasadach. Nukleokapsyd jest pałeczkowaty i stwierdzono, że może być upakowany w dwóch formach, niezamkniętej jako wirus otoczony błoną oraz w formie zamkniętej w krysztale białkowym w jądrze zakażonej komórki. Te wirusy mogą być rutynowo namnażane w hodowli komórek owadzich in vitro i można ich używać przy wszystkich rutynowych metodach stosowanych do wirusów zwierzęcych. Płynem do hodowli komórek jest typowo roztwór soli odżywczych z płodową surowicą cielęcą w ilości 10%.
In vitro wzrost wirusa jest inicjowany gdy niezamknięty wirus (NOV) wnika do komórki i przechodzi do jądra, gdzie jest replikowany. Replikacja jest jądrowa. Podczas fazy wstępnej (8-18 godzin po zakażeniu) zastosowania wirusa, w jądrze zostają zmontowane nukleokapsydy i następnie BUD przenika przez błonę plazmatyczną jak NOV, rozsiewając zakażenie w hodowli komórek. Oprócz tego, niektóre z nukleokapsydów w dalszym ciągu (18+ godzin po zakażeniu) pozostają w jądrze i zostają zamknięte w materiale białkowym. Znane są jako wielościenne ciałka wtrętowe (FIB). Ta forma nie jest zakaźna w hodowli komórkowej. Powyższy materiał jest złożony z białka znanego jako polihedryna, o masie cząsteczkowej 33 kilodaltonów. Każdy PIB ma około 1 mm średnicy i może być ich tak wiele, jak nawet 100000 PIB na jedno jądro. Tak więc, polihedryna jest tworzona późno w cyklu infekcyjnym w wyraźnie dużej ilości, tak dużej, że wynosi to nawet 25% całkowitego białka komórkowego.
Ponieważ PIB nie gra roli w cyklu replikacji in vitro, gen polihedryny można usunąć z chromosomu wirusa bez wpływu na żywotność in vitro. Przy użyciu tego wirusa jako wektora ekspresyjnego, twórcy wynalazku zastąpili region zawierający gen kodujący polihedrynę obcym DNA, który ma ulegać ekspresji, umieszczając go pod kontrolą promotora polihedryny. Daje to w wyniku fenotyp wirusa nie tworzącego PIB.
Układ ten wykorzystywało kilku badaczy. Najwybitniejszymi z nich są Pennock i wsp., oraz Smith i wsp. Pennock i wsp. (Gregory D. Pennock, Charles Shoezaker i Lois K. Miller, Molecular and Celi Biology, 3:84, str. 399-406) donieśli o wysokim poziomie ekspresji białka bakteryjnego, /5-galaktozydazy, znajdującej się pod kontrolą promotora polihedryny.
Inny wektor ekspresyjny pochodzący z wirusa polihedrozy jądrowej przedstawili Smith i wsp. [Gale E. Smith, Mas. D. Summers i M. J. Fraser, Molecular and Celi Biology, 16 maja, str, 2156-2165 (1983)]. Wykazali oni skuteczność tego wektora w ekspresji ludzkiego J-interferonu. Stwierdzono, że syntetyzowany produkt był glikosylowany i wydzielany z komórek owadzich, jak można było tego oczekiwać. W przykładzie XIV opisano modyfikacje plazmidu zawierającego gen
157 926 polihedryny z wirusa polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcHPV), które pozwalają na łatwe wprowadzenie genu EPO do plazmidu, tak, aby znalazł się on pod kontrolą transkrypcyjną promotora polihedryny. Utworzonym DNA kotransfekuje się komórki owadzie stosując go łącznie z nienaruszonym chromosomowym DNA z dzikiego typu AcHPV. W przypadku rekombinacji genetycznej zachodzi zastąpienie regionu genu polihedryny AcHPVC przez DNA z plazmidu. Powstały wirus rekombinantowy można zidentyfikować wśród potomstwa wirusa na podstawie posiadania sekwencji DNA genu EPO. Oczekuje się, że ten wirus rekombinantowy będzie wytwarzał EPO po reinfekcji komórek owadzich.
Przykłady ekspresji w komórkach CHO, C127 i 3T3 i owadzich podano w przykładach X i XI (CHO), XIII (C127 i 3T3), oraz XIV (komórki owadzie).
Biologicznie aktywnej EPO wytworzonej za pomocą prokariotycznej lub eukariotycznej ekspresji genów EPO klonowanych sposobem według wynalazku, można użyć in vivo do leczenia ssaków różnych gatunków, przez lekarzy i/lub weterynarzy. Ilość składnika czynnego będzie oczywiście zależeć od ciężkości schorzenia osobnika leczonego, wybranej drogi podawania i aktywności właściwej EPO, a ostatecznie będzie o tym decydować prowadzący kurację lekarz lub weterynarz. Tę ilość aktywnej EPO określoną przez leczącego lekarza przytacza się w niniejszym opisie jako ilość EPO „terapeutycznie skuteczną. I tak np., w leczeniu indukowanej niedokrwistości hipoproliferatywnej towarzyszczącej przewlekłej niewydolności nerek u owcy, skuteczna dawka dzienna EPO wynosi, jak stwierdzono, lOjed/kg w ciągu 15 do 40 dni. Patrz: Eschbach i wsp., J. Clin. Invest., 74, 434 (1984).
Aktywną EPO można podawać każdą drogą odpowiednią do stanu leczonego. Korzystnie EPO wstrzykuje się do krwi leczonego ssaka. Fachowcy łatwo zdadzą sobie sprawę z tego, że korzystna droga podawania będzie się różnić w.zależności od stanu leczonego.
Aczkolwiek możliwe jest podawanie aktywnej EPO jako związku czystego lub zasadniczo czystego, korzystnie podaje się ją w postaci środka lub preparatu farmaceutycznego.
Środki, zarówno do użytku weterynaryjnego, jak i dlaludzi, zawierają aktywne białko EPO, jak wyżej opisano, łącznie z jednym, lub więcej niż jednym farmaceutycznie dozwolonym jej nośnikiem, oraz, ewentualnie, z innymi dodatkami leczniczymi. Nośnik (nośniki) musi być „dozwolony w tym sensie, że jest zgodny z innymi składnikami środka i nie jest szkodliwy dla pacjenta. Jest pożądane, aby środek nie zawierał czynników utleniających i innych substancji, z którymi peptydy są, jak wiadomo, niezgodne. Dogodnie, środki można formułować w postaci dawek jednostkowych, dowolną z metod dobrze znanych w dziedzinie farmacji. Wszystkie metody obejmują stadium doprowadzania do połączenia składnika czynnego z nośnikiem, który stanowi jeden, lub więcej niż jeden składnik dodatkowy. Ogólnie, środki wytwarza się za pomocą doprowadzenia do jednolitego i dokładnego połączenia składnika czynnego z nośnikami płynnymi lub subtelnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi, względnie i z tymi i z tymi, a następnie, jeżeli jest to niezbędne, nadania otrzymanemu produktowi postaci żądanego środka.
Dogodnie, środki odpowiednie do podawania pozajelitowego zawierają jałowe roztwory wodne składnika czynnego z roztworami, korzystnie izotonicznymi z krwią pacjenta. Tego rodzaju środki dogodnie otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia stałego czynnika czynnego w wodzie, w celu wytworzenia roztworu wodnego i po wyjałowieniu roztwór ten można formułować w pojemnikach jednostkowych lub wielodawkowych, takich jak zamknięte ampułki lub fiolki.
Określenie EPO/cDNA, używane w opisie, obejmuje dojrzały gen EPO/cDNA poprzedzony kodonem ATG, oraz EPO/cDNA kodujący alleliczne wariacje białka EPO. Jeden z alleli objaśniają fig. 3A i 3B. Białko EPO obejmuje 1-metioninową pochodną białka EPO (Met-EPO) i alleliczne wariacje białka EPO. Dojrzałe białko EPO, o sekwencji przedstawionej na fig. 3A, zaczyna się sekwencją Ala.Pro.Pro.Arg..., której początek jest przedstawiony nr „1“ na fig. 3A. Met-EPO zaczynałaby się sekwencją Met.Ala.Pro.Pro.Arg....
Następujące przykłady zamieszczono w celu zrozumienia sposobu według wynalazku, którego rzeczywisty zakres wynika z załączonych zastrzeżeń. Należy rozumieć, że można dokonać modyfikacji podanych sposobów postępowania, bez odchodzenia od ducha wynalazku. Wszystkie wartości temperatury wyrażono w stopniach Celsjusza, przy czym nie są one korygowane. Symbolem mikrona lub mikro, w takich jednostkach jak mikrolitry, mikromole, jest ,,μ“, np. μϊ, pm itd.
157 926
Przykład I. Wyodręnianie genomowego klonu EPO.
EPO oczyszcza się z moczu pacjentów z niedokrwistością aplastyczną zasadniczo tak, jak to uprzednio opisano [Miyske i wsp., J. Biol. Chem., 252, 5558/1977], z tą różnicą, że eliminuje się działanie fenolem i zastępuje je działaniem ciepłym w temperaturze 80°C w ciągu 5 minut, w celu zinaktywowania neuraminidazy. Końcowym stadium oczyszczania jest frakcjonowanie na kolumnie HPLC C-4 Vydac (The Separations Group) przy zastosowaniu gradientu 0-95% acetonitrylu z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA) w ciągu 100 minut. Usytuowanie EPO w gradiencie określa się za pomocą elektroforezy w żelu i analizy N-końcowej sekwencji (21, 26, 27) głównych pików. EPO eluuje się przy około 53% acetonitrylu i stanowi około 40% białka poddanego HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje zawierające EPO odparowuje się do 100//1, doprowadza pH do wartości 7,0 za pomocą wodorowęglanu amonowego i trawi całkowicie 2% trypsyną potraktowaną TPCK (Worthington) w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C. Mieszaninę po trawieniu trypsyną poddaje się HPLC z odwróconymi fazami, jak wyżej opisano. Rejestruje się gęstość optyczną zarówno przy 280 nm jak i przy 214nm. Dobrze rozdzielone piki odparowuje się niemal do sucha i poddaje bezpośrednio analizie sekwencji N-końcowym aminokwasów stosując analizator sekwencji w fazie gazowej Applied Riosystems Model 480A. Otrzymane sekwencje są na fig. 3 podkreślone. Jak to opisano w powyższej część niniejszego opisu, dwa z tych fragmentów trypsynowych wybiera się do sond oligonukleotydowych. Na podstawie sekwencji Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminokwasy 46 do 52 na fig. 3) otrzymuje się 17-członową 32 zdegenerowaną:
A A A
TTCCANGCGTAGAAGTT i 18-członową 128-krotnie zdegenerowaną:
ΑΛΑ
CCANGCGTAGAAGTTNAC
Na podstawie sekwencji Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (aminokwasy 144 do 150 na fig. 3) otrzymuje się dwie pule 14-członowe, z których każda jest 32-krotnie zdegenerowaną:
TTGN T T TTGN T T
TACACCTAACTTCCT i TACACCTAACTTCTT które różnią się przy pierwszej pozycji kodonu leucyny. Oligonukleotydy znakuje się p przy końcu 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej (New England Biolabs) oraz 32P-ATP (New England Nuclear). Aktywność właściwa oligonukleotydów wahała się w zakresie od 1000 do 3000 Ci/mmol oligonukleotydu. Zbiór ludzkiego genomowego DNA w bakteriofagu (Lawn i wsp., 22) poddaje się skaningowi stosując modyfikację metody amplifikacji in situ Woo i wsp. (47) (1978). Około 3,5· 105 fagów nanosi się przy gęstości 6000 fagów na 150 mm płytkę Petri'ego (podłoża NZCYM) i inkubuje się w temperaturze 37°C, aż łysinki staną się widoczne, chociaż mało (około 0,5 mm). Po ochłodzeniu do temperatury 4°C w ciągu godziny, podwójne repliki układu łysinek przenosi się na nylonowe membrany (New England Nuclear) i inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C na świeżych płytkach NZCYM.
Następnie filtry poddaje się denaturacji i zobojętnieniu za pomocą położenia ich każdorazowo na 10 minut na cienkiej warstwie, odpowiednio, 0,5 N NaOH - IM NaCl i 0,5 M Tris (pH 8) - 1 M NaCI. Następnie poddaje się działaniu ciepła w temperaturze 80°C w ciągu 2 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się filtry 5 X SSC, 0,5% SDS w ciągu godziny i komórkowy debris usuwa się z powierzchni filtra za pomocą łagodnego zdrapowania wilgotną tkaniną. To zdrapywanie zmniejsza podstawowe wiązanie sondy z filtrami. Następnie filtry spłukuje się wodą i poddaje
157 926 prehybrydyzacji w ciągu 4 do 8 godzin w temperaturze 48°C w 3 M tetrametyloamoniowym, 10 mM Na3PO4 (pH 6,8), 5 X roztworze Denhardt'a, 0,52% SDS i 10 mM EDTA. Następnie dodaje się znakowaną 32p 17-członową pulę w stężeniu 0,1 pmola/ml i prowadzi się hybrydyzację w temperaturze 48°C w ciągu 72 godzin. Po hybrydyzacji filtry dokładnie przemywa się w 2 X SSC (0,3 M NaCl - 0,03 cytrynian sodowy, pH 7) w temperaturze pokojowej, a następnie w ciągu godziny w 3 M TMAC1- 10 mM Na3PC>4 (pH 6,8) w temperaturze pokojowej i wciągu 5-15 minut w temperaturze hybrydyzacji. Wykrywa się w przybliżeniu 120 silnych podwójnych sygnałów po upływie 2 dni autoradiografii z zastosowaniem ekranu wzmacniającego. Pobiera się materiały pozytywne, grupuje w pule po 8, ponownie przenosi na płytki i poddaje skriningowi, czyniąc to trzy razy, z zastosowaniem połowy 14-członowej puli na każdy z dwóch filtrów i 17-członowej na filtr trzeci. Warunki przenoszenia na płytki i hybrydyzacji oraz 17-członowa pula były takie, jak opisano w powyższej części opisu, z tą różnicą, że hybrydyzację prowadzi się w temperaturze 37°C. Po autoradiografii, sondę usuwa się z filtra z 17-członową pulą w 50% formamidzie w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej i filtry poddaje się powtórnej hybrydyzacji w temperaturze 52°C z sondą 18-czlonową. Dwa niezależne fagi hybrydyzują ze wszystkimi trzema sondami. DNA z jednego z tych fagów (oznaczonego w opisie Λ-ΗΕΡΟ1) trawi się całkowicie San3A i subklonuje do M13 w celu analizy sekwencji z zastosowaniem metody didezoksy-zakończenia łańcucha metodą Sangera i Couleona (1977).
W opisie przedstawiona jest sekwencja nukleotydów, oraz wydedukowana sekwencja aminokwasów otwartej ramy odczytu, kodująca fragment trypsynowy (region podkreślony). Sekwencje intronowe podane są małymi literami, sekwencje egzonowe (87 nt) podane są dużymi literami. Sekwencje odpowiadające zgodnym miejscom akceptora (a) i donora (d) cięcia i składania są podkreślone (patrz: fig. 4a).
Przykład II. Analiza mRNA wątroby ludzkiego płodu metodą Notherna.
5pg mRNA wątroby ludzkiego płodu otrzymanego z wątroby płodu 20-tygodniowego i mRNA wątroby dorosłego osobnika poddaje się elektroforezie w 0,8% agarozowym żelu formaldehydowym i przenosi na nitrocelulozę stosując metodę Dermana i wsp., Celi, 23, 731 (1981). Następnie przygotowuje się jednoniciową sondę z matrycy M13 zawierającej insert przedstawiony na fig. 1. Primer jest 20-członowy, otrzymany na podstawie tego samego fragmentu trypsynowego co oryginalna sonda 17-członowa. Sondę otrzymuje się, jak uprzednio opisali Anderson i wsp., PNAS (50) (1984), z -tą różnicą, że po trawieniu Smal (przy użyciu, którego wytwarza się żądaną sondę o długości 95 nt, zawierającą sekwencję kodującą o 74 nt), mały fragment oczyszcza się z matrycy Μ13 za pomocą chromatografii na kolumnie Sepharose CI4B w 0,1 N NaOH - 0,2 M NaCl. Filtry poddaje się hybrydyzacji z tą sondą (do około 5 · 106 zliczeń/min.) w ciągu 12 godzin, w temperaturze 68°C, przemywa w 2XSSC w temperaturze 68°C i eksponuje w ciągu 6 dni z zastosowaniem ekranu wzmacniającego. Pojednyczy marker stanowiący mRNA o 1200 nt (wskazany strzałką) poddaje się elektroforezie na sąsiedniej ścieżce (fig. 2).
Przykład III. cDNA otrzymany z wątroby płodu.
Otrzymuje się sondę identyczną z sondą opisaną w przykładzie II i stosuje ją do skriningu zbioru cDNA otrzymanego z wątroby płodu, przygotowanego w wektorze 3-Oh21 A [Toole i wsp., Naturę (25)(1984)] z zastosowaniem standardowego skirningu łysinek [Benton Davis, Science (54) (1978)]. Na podstawie 1 X 106 łysinek wyodrębnia się 3 niezależne pozytywne klony [oznaczone w op^e 3-HEPOFL6 (135° par zasadX 3-hepofl8 (700 par zasad) i 3-HEPOFL13 (1400 par zasad)]. Nienaruszony insert z 3-HEPOFL13 i -HEPOFL6 poddaje się analizie sekwencji po subklonowaniu do M13 (fig., odpowiednio, 9 i 7). Analizie sekwencji poddaje się jedynie część y-HEPOFL8 i zakłada się, że pozostałość jest identyczna z innymi dwoma klonami (fig. 8). Nie ulegające translacji sekwencje 5' i 3' przedstawione są małymi literami. Region kodujący przedstawiony jest dużymi literami. .
W odniesieniu do fig. 3A i 3B, wydedukowana sekwencja aminokwasów pokazana przed sekwencją nukleotydów, numerowana jest zaczynając od 1 dla pierwszego aminokwasu dojrzałego białka. Przypuszczalny peptyd liderowy jest wskazany wszystkimi „czapeczkami*’ oznaczeń aminokwasów. Reszty cysteiny w dojrzałym białku są dodatkowo wskazane przez SH, a potencjalne miejsca N-glikozylacji są wskazane przy pomocy gwiazdki. Aminokwasy podkreślone wskazują reszty zidentyfikowane na podstawie analizy sekwencji N-końca białka, albo analizy sekwencji fragmentów EPO, jak opisano w przykładzie I. Częściowe podkreślenie wskazuje te reszty w
157 926 sekwencji aminokwasów pewnych fragmentów trypsynowych, które nie mogły być określone w sposób jednoznaczny. Klony cDNA Λ-HEPOFLó, A-HEPOFL8 i A-HEPOFŁ13 zostały zdeponowane i są dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerami rejestracyjnymi, odpowiednio, ATCC 40156, ATCC 40152 i ATCC 40153.
Przykład IV. Genomowa struktura genu EPO.
Względne wielkości i pozycje czterech niezależnych klonów genomowych (Λ-ΗΕΡΟ 1,2,3 i 6) ze zbioru Haelll/Alul przedstawione są zachodzącymi na siebie liniami na fig. 4A. Linie pogrubiane wskazują pozycję genu EPO. Wskazana jest skala (w kilozasadach) i pozycje znanych miejsc rozpoznawania endonukleaz restrykcyjnych. Region zawierający gen EPO /.ostał całkowicie zanalizowany pod względem sekwencji obydwu nici przy zastosowaniu ukierunkowanych, wytworzonych przez endonukleazę III serii delecji w tym regionie. Schematyczna reprezentacja pięciu egzonów mRNA kodujących EPO jest przedstawiona na fig. 4B. Dokładna granica egzonu I po stronie 5' nie jest obecnie znana. Części egzonów kodujące białko są zaciemnione. Całkowita sekwencja regionu jest pokazana na fig. 4C. Znane granice każdego regionu są nakreślone grubymi, pionowymi kreskami. Genomowe klony Λ-ΗΕΡΟ1, Λ-ΗΕΡΟ2, Λ-ΗΕΡΟ3 i Λ-ΗΕΡΟ6 zostały zdeponowane i są dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerami rejestracyjnymi, odpowiednio, ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 i ATCC 40151.
Przykład V. Konstrukcja wektora p91023(B).
Wektor transformacyjny pAdD26SVpA(3) jest opisany przez Kaufmana i wsp., Mol. Celi. BioL.2, 1304(1982). Struktura tego wektora jest pokazana na fig. 5A. Mówiąc krótko, plazmid ten zawiera cDNA genu mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DFHR), który znajduje się pod transkrypcją kontrolną głównego promotora późnego adenowirusa 2 (Ad2). Miejsce rozszczepienia 5'jest wskazane w adenowirusowym DNA, a miejsce rozszczepienia 3' pochodzące z genu immunoglobuliny jest obecne między głównym promotorem Ad2 i sekwencją kodującą DFHR. Wczesne miejsce poliadenylacji SV40 występuje przed sekwencją kodującą DHFR. Część pAdD26SVpA(3) pochodzenia prokariotycznego otrzymana jest z pSVOd [Mellon i wsp., Celi, 27,279 (1981)] i nie zawiera sekwencji pBR322 znanych z hamowania replikacji w komórkach ssaków [Lusky i wsp., Naturę, 293, 79(1981)].
pAdD26SVpA(3) przeprowadza się w plazmid pCVSVL2 jak przedstawiono na fig. 5A. pAdD26S VpA(3) przeprowadza się w plazmid pAdD26SVpA(3)(d) przez delecję jednego z dwóch miejsc Pstl w pAdD26SVpA(3). Dokonuje się tego na drodze częściowego trawienia przy użyciu Pstl przy deficycie enzymu, tak, aby uzyskać subpopulację plazmidów liniowych, w których rozszczepione zostaje tylko jedno miejsce Pstl. Następnie działa się fragmentem Klenowa, liguje w celu przeprowadzenia ponownie w postać kolistą i dokonuje skriningu pod względem delecji miejsca Pstl zlokalizowanego przy końcu 3' w stosunku do sekwencji poliadenylacji SV40.
Trójczłonowy lider adenowirusa i wirusowe geny towarzyszące (VA) włączone są do pAdD26SVpA(3) (d) jak pokazano na fig. 5A. Najpierw pAdD26SVpA(3) (d) rozszczepia się PvuII w celu otwarcia liniowej cząsteczki w części 3' trzech elementów obejmujących trójczłonowy lider. Następnie, pJAW43 [Zain i wsp., Celi, 16, 851 (1979)], trawi się Xhol, poddaje działaniu fragmentu Klenowa, trawi PvuII, po czym wyodrębnia fragment o 140 parach zasad, zawierający drugą część trzeciego lidera, na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (6% w buforze Tris-boran, Maniatis i wsp., wyżej). Następnie fragment o 140 parach zasad liguje się do pAdD26SVpA(3) (d) trawionego PvuII. Produktu ligacji używa się do transformowania E. coli w celu nadania oporności na tetracyklinę i poddaje się następnie kolonie skriningowi sposobem Grunsteina-Hognessa z zastosowaniem sondy znakowanej 32p hybrydyzującej z fragmentem o 140 parach zasad. Z pozytywnie hybrydyzujących kolonii otrzymuje się DNA w celu sprawdzenia, czy zrekonstruowane miejsce PvuII jest 5' czy 3' we włączonym DNA i 140 parach zasad, specyficznym dla drugiego i trzeciego z późnych liderów adenowirusa. Prawidłową orientacją dla miejsca PuvII jest strona 5' insertu o 140 parach zasad. Plazmid ten jest na fig. 5A oznaczony jako pTPL.
Fragment D AvaII z SV40 zawierający sekwencję wzmacniacza SV40 otrzymuje się przez trawienie DNA SV40 przy użyciu Avall, przeprowadzenie końców w tępe przy użyciu fragmentu
Klenowa poliemrazy I, ligowanie do fragmentów łączników Xhol, trawienie Xhol w celu otworzenia miejsca Xohl i wyodrębnienie czwartego największego (D) na drodze elektroforezy w żelu.
Fragment ten liguje się następnie do pTPL przeciętego Xhol, w wyniku czego otrzymuje się
157 926 11 plazmid pCVSVL2-TPL. Orientacja fragmentu D SV40 w pCVSVL2-TPL jest taka, że późny promotor SV40 ma tę samą orientację, co główny promotor późny adenowirusa.
W celu wprowadzenia wirusowych genów towarzyszących (VA) do pCVSVL2-TPL, najpierw konstruuje się plazmid pBR322, który zawiera fragment B Hindlll adenowirusa typu 2. DNA adenowirusa typu 2 trawi się Hindlll i wyodrębnia fragment D za pomocą elektroforezy w żelu. Fragment ten wprowadza się do pBR322 trawionego uprzednio Hindlll. Po transformacji E. coli do oporności na ampicylinę, rekombinanty poddaje się skriningowi pod względem insercji fragmentu B Hindlll i jego orientację określa się za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. pBR322 - Ad Hindlll B zawiera fragment B Hindlll adenowirusa typu 2 w orientacji przedstawionej na fig. 5B.
Jak to objaśnia fig. 5B, geny VA dogodnie otrzymuje się z plazmidu pBR322 - Ad Hindll1 B za pomocą trawienia Hpal, dodania łączników EcoRI i trawienia EcoRI, a następnie odzyskania fragmentu p 1,4 kilozasady. Fragment mający lepkie końce EcoRI liguje się następnie do miejsca EcoRI w PTL uprzednio trawionego EcoRI. Po transformacji E. coli HB101 i selekcji pod względem oporności na ampicylinę kolonie poddaje się skriningowi na drodze hybrydyzacji.na filtrze DNA specyficznym dla genów VA. Z pozytywnie hybrydyzujących klonów otrzymuje się DNA i charakteryzuje za pomocą trawienia endonukleazą restrykcyjną. Powstały plazmid oznaczony jest jako p91023.
Jak to objaśnia fig. 5C, dwa miejsca EcoRI w p91023 zostały usunięte za pomocą przecięcia (całkowicie), przy użyciu EcoRI, z utworzeniem dwóch fragmentów DNA, jedengo o około 7 kilozasadach, a drugiego około 1,3 kilozasady. Ten ostatni fragment zawiera geny VA. Końce obu . fragmentów uzupełnia się za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy I i następnie łączy się te dwa fragmenty. Plazmid p91023(A), zawierający geny VA i podobny do p91023, ale z usuniętymi dwoma miejscami EcoRI identyfikuje się za pomocą skriningu metodą Grunsteina-Hognessa z fragmentem VA i za pomocą konwencjonalnej analizy miejsc restrykcyjnych.
Pojedyncze miejsce Pstl w p91023(A) usuwa się i zastępuje miejscem EcoRI. p91023(A) przecina się (całkowicie) Pstl i poddaje działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I w celu wytworzenia zrównanych końców. Łączniki EcoRI liguje się do miejsca Pstl przeprowadzonego w tępe w p91023(A). Liniowy p91023(A), z łącznikami EcoRI przyłączonymi przy miejscu Pstl przeprowadzonym w tępe, oddziela się od nie przyłączonych łączników i trawi całkowicie EcoRI, oraz ponownie liguje. Plazmid, p91023(B) jak przedstawiony na fig. 5C, odzyskuje się i identyfikuje jako wykazujący strukturę podobną do p91023(A), ale z miejscem EcoRI zamiast poprzedniego miejsca Pstl. Plazmid p91023(B) został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39754.
Przykład VI. Klony cDNA (>-HPOFL6 i ^-HPOFL13, przykład III) wprowadza się do plazmidu p91023(B) z utworzeniem, odpowiednio, pPTFLó i pPTFL 13,8 pg każdego z oczyszczonych DNA używa się następnie do transfekcji 5· 106 komórek COS z zastosowaniem metody DEAE-dekstran (poniżej). Po upływie 12 godzin komórki przemywa się i poddaje działaniu 0,1 mM Chloroąuin w ciągu 2 godzin, po czym znów przemywa i przenosi na okres 24 godzin do 10 ml porcji podłoża zawierającego płodową surowicę cielęcą w stężeniu 10%. Podłoża zmienia się na 4 ml porcje bez surowicy i zbiera po upływie 48 godzin.
Poziom wytwarzanej immunologicznie aktywnej EPO oznacza się ilościowo w teście radioimmunologicznym, jak to opisali Sherwood i Goldwasser. Przeciwciało otrzymano od dr Judith Sherwood. Jodowany wskaźnik izotopowy otrzymuje się z homogenicznej EPO opisanej w przykładzie I. Czułość testu wynosi w przybliżeniu 1 mg/ml. Wyniki są przedstawione w tabeli 1.
Tabela 1
Wektor Poziom EPO uwalnianej do podłoży (ng/ml) pPTFL13 pPTFLó
330
157 926
PTFL13 został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCc 399.
Przykład VII. cDN A EPO (A-HEPOFL13) wprowadza się do wektora p91023 (B), stosując do transfekcji komórek COS-1, i zbiera w sposób opisany w powyższej części opisu (przykład Vl), z tą różnicą, że pomija się działanie Chloroquin.
In vitro biologicznie aktywną EPO oznacza się z zastosowaniem albo testu tworzenia kolonii z komórkami wątroby płodu mysiego jako źródłem CFU-E, albo testu pobierania 3H-tymidyny, z zastosowaniem komórek śledziony myszy, której wstrzyknięto fenylohydrazynę. Czułość tych testów wynosi w przybliżeniu 25mjedn/ml. In vivo biologicznie aktywną EPO oznacza się z zastosowaniem albo testu: niedotleniona mysz, albo testu: głodzony szczur. Czułość tych testów wynosi w przybliżeniu lOOmjedn/mE Nie wykrywa się aktywności w obydwu tych testach przy zastosowaniu podłoża z warunków naśladujących właściwą hodowlę. Wyniki oznaczenia EPO wytworzonej w rezultacie ekspresji klonu HPOFL13 są przedstawione w poniższej tabeli 2, w której aktywność podana jest w jedn/ml, przy użyciu, jako standardu, handlowej, ilościowo oznaczonej EPO (Toyobo, Inc.).
Tabela 2
EPO wydzielona przez komórki COS transfekowane cDNA EPO typu I
Test Aktywność
RIA lO0njg/ml
CFU-E 2^0,5jedn/ml
3H-Thy 3,1^1,8jedn/ml
Niedotleniona mysz 1 jedn/ml
Głodzony szczur 2jedn/ml
Przykład VIII. Analiza EPO z komórek COS metodą elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym.
100 ng EPO wydzielonej do podłoża przez komórki COS transfekowane cDNA (ΛHEPOFL13) w wektorze 91023(B) (powyżej) poddaje się elektroforezie w 10% żelu SDSpoliakryloamidowy (Laemlli) i przenosi z zastosowaniem prądu elektrycznego na bibułę nitrocelulozową [Towbin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350, (1979)]. Filtr sonduje się przy użyciu przeciwciała przeciw EPO, jak opisano w tabeli 1, przemywa i ponownie sonduje białkiem A gronkowców znakowanych 125J. Filtr poddaje się autoradiografii wciągu 2 dni. Natywną homogeniczną EPO, taką jak opisana w powyższym przykładzie I, poddaje się, albo przed jodowaniem (ścieżka B), albo po jodowaniu (ścieżka C), elektroforezie (patrz Fig. 6). Do zastosowanych markerów nakżą: S-mebonina (znakowana^ atoumina surowsza (68000 daltonów) i owoatou mina (45000 daltonów).
Przykład IX. Konstrukcja RK1-4.
Wyodrębnia się fragment BamHI-PvuII z plazmidu PSV2DHFR [Subramani i wsp., Mol. Celi. Biol., 1, 854-864 (1981)] zawierającego region wczesnego promotora SV40 sąsiadujący z genem mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), wzmacniacz SV40, intron małego antygenu t i sekwencję poliadenylacji SV40 (fragment A). Pozostałe fragmenty otrzymuje się z wektora p91023(A) (powyżej) jak następuje. p91023(A) trawi się Pstl w pojedynczym miejscu Pstl blisko promotora adenowirusowego w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i albo liguje się z syntetycznymi konwertora mi Pstl do EcoRI, a następnie przeprowadza ponownie w postać kolistą [z tworzeniem miejsca PstO-EcoRI-Petl w pierwotnym miejscu Pstl, 91023(B')], albo poddaje działaniu dużego fragmentu polimerazy DNA I w celu zniszczenia miejsc Pstl, a następnie liguje się z syntetycznym łącznikiem EcoRI i przeprowadza ponownie w postać kolistą [z tworzeniem miejsca EcoRI w pierwotnym miejscu Pstl, 91023(B)]. Każdy z tych dwóch otrzymanych plazmidów, 91023(B) oraz 91023(B'), trawi się Xba i EcoRI w celu wytworzenia dwóch fragmentów (F i G). Za pomocą połączenia fragmentu F z p91023(B) z fragmentem G z p91023(B'), oraz fragmentu G z p91023(B) z fragmentem F z p91023(B') tworzy się dwa nowe plazmidy, które zawierają albo miejsce EcoRI-Pstl albo miejsce Pstl-EcoRI w pierwotnym miejscu Pstl. Plazmid zawierający
157 926 13 miejsce Pstl-EcoRI, w którym miejsce Pstl jest najbliżej głównego promotora późnego adenowirusa, został nazwany p91023(C).
Wektor p91023(C) trawi się Xhol (całkowicie) i powstający liniowy DNA z lepkimi końcami przeprowadza się w DNA z tępymi końcami za pomocą wypełniania w reakcji z dużym fragmentem polimerazy DNA I E. coli. Z tym fragmentem DNA liguje fragment Hindlll-EcoRI o 340 parach zasad, zawierający wzmacniacz SV40 otrzymany w sposób następujący.
Fragment HindIII-PvuII z SV40 zawierający początek replikacji SV40 i wzmacniacz wprowadza się do plazmidu c lac [Little i wsp., Mol. Biol. Med., 1,473-488 (1983)]. Wektor cląc otrzymuje się za pomocą trawienia DNA c lac przy użyciu BamHI, wypełnienia lepkich końców z zastosowaniem dużego fragmentu polumerazy DNA I i trawienia DNA za pomocą Hindlll. W powstającym plazmidzie (c SVHPlac) regeneruje się miejsce BamHI za pomocą ligowania z tępym końcem PuvII. Fragment EcoRI-HindIII otrzymuje się z c SVHPlac i liguje z fragmentem EcoRI-Hindlll PSVOd (Mellon i wsp., powyżej), który zawiera plazmidowy początek replikacji, po czym selekcjonuje się powstający plazmid pSVHPOd. Następnie otrzymuje się fragment EcoRI-Hindlll o 340 parach zasad z PSVHPOd, zawierający początek replikacji/wzmacniacz SV40, obydwa końce przeprowadza się w tępe za pomocą fragmentu polimerazy DNA I i liguje z wektorem p91023(c) powyżej opisanym, trawionym Xhol i z końcami przeprowadzonymi w tępe. Powstający plazmid (p91023(C)/Xho) tępe plus EcoRI(HindIII/ tępe początek SV40 plus wzmacniacz), w którym orientacja fragmentu Hindlll-EcoRI jest taka, że miejsce BamHI w tym fragmencie jest najbliższe genu VA, została nazwany pES105. Plazmid pESI trawi się BamHI i PvuII, a również samą PvuII i wyodrębnia się fragment BamHI-PvuII zawierający główny promotor późny adenowirusa (fragment B) i fragment PvuII zawierający plazmid, w którym znajduje się gen oporności (oporności na tetracyklinę) oraz inne sekwencje (fragment C). Fragmenty A, B i C liguje się i utworzony plazmid, pokazany na fig. 10, wyodrębnia się. Nazwany jest on RK1-4. Plazmid RK1-4 został zdeponowany w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, gdzie jest dostępny pod numerem rejestracyjnym ATCC 39940.
Przykład X. Ekspresja EPO w komórkach CHO - Metoda I.
20pg DNA z plazmidu pPTFL13 opisanego powyżej (przykład VI) trawi się endonukleazę restrykcyjną Ciał w celu przeprowadzenia go w postać liniową i liguje z 2//g DNA trawionego Ciał z plazmidu pAdD26SVp(A)l, który zawiera nienaruszony gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) poprzedzany przez główny promotor późny adenowirusa [Kaufman i Sharp, Mol. and Celi Biol., 2, 1304-1319 (1982)]. Tego ligowanego DNA używa się do transfekcji komórek CHO DHFR-ujemnych [DUKX-BI1, L. A. Chasin i G. Urlaub, PNAS, 77, 4216-4220 (1980)]. Po 2-dniowym wzroście selekcjonuje się komórki, do których został włączony chociaż jeden gen DHFR, w podłożach alfa bez nukleozydów, uzupełnionych dializowaną płodową surowicą bydlęcą w stężenieu 10%. Po wzorście w ciągu 2 tygodni w wybiórczych podłożach, kolonie pobiera się z oryginalnych płytek, łączy w grupy po 10-100 kolonii na pulę, ponownie przenosi na płytki i hoduje do zlewania się na podłożach alfa bez nukleozydów. Supernatanty podłoży z pul hodowanych przed selekcją z użyciem metotreksatu, bada się pod względem EPO przy wykorzystaniu RI A. Pule, które okazują się dodatnie pod względem wytwarzania EPO hoduje się w obecności 0,02 uM metotreksatu, subklonuje i ponownie bada. EPO Cla 4 4,02-7, pojednyczy subklon z puli EPO Cla 4 4,02 wydziela 460ng/ml EPO do podłoży zawierających 0,02 uM ΜΤΧ (Tabela 3). EPO ,Cla 4 4,02-7 jest linią komórkową z wyboru do wytwarzania EPO i została zdeponowana w Amercian Type Culture Collection (numer rejestracyjny ATCC CRL8695). Obecnie klon ten poddaje się stopniowej, selekcji we wzrastających stężeniach ΜΤΧ i prawdopodobnie otrzyma się komórki, które będą wytwarzać EPO nawet na wyższym poziomie. Odnośnie pul, które były negatywne w RIA, kolonie oporne na metotreksat otrzymane z hodowli duplikatowych, prowadzonych w obecności 0,02 uM metotreksatu, ponownie bada się w pulach pod względem EPO za pomocą RIA. Te hodowle, które nie są pozytywne, ponownie subklonuje się i dalej hoduje w ciągle wzrastających stężeniach metotreksatu.
Stopniowej selekcji z użyciem metotreksatu dokonuje się przez powtarzane cykle hodowania komórek w obecności wzrastających stężeń metotreksatu z selekcją komórek przeżywających. Przy każdym nawrocie EPO oznacza się w supernatancie hodowli za pomocą RIA i testów aktywności
157 926 biologicznej in vitro. Poziomy metotreksatu stosowane w każdym stopniowym wzmocnieniu wynoszą 0,02 uM, 0,1 uM i 0,5 uM. Jak pokazano w poniższej tabeli 3 po 1 nawrocie selekcji w 0,02 uM metotreksacie, do podłoży hodowlanych zostają uwolnione znaczne ilości EPO.
Tabela 3
Poziom EPO wydzielanej do podłoży
Próbka Test Uzysk w podłożu alfa Uzysk w podłożu alfa z 0,02 uM metotreksatem
Pula 4 4 RIA 17 ng/ml 50 ng/ml
Pojednycza kolonia 4 4
Klon (0,02-7) RIA — 460 ng/ml
Przykład XI. Ekspresja EPO w komórkacj CHO - Metoda II.
DNA z klonu .A-HEPOFL13 trawi się EcoRI i subklonuje się mały fragment RI zawierający gen EPO do miejsca EcoRI w plazmidzie RK-1 (patrz przykład X). Następnie DNA (RKFL13) używa się bezpośrednio (bez trawienia) do transfekcji komórek CHO DHRF-negatywnych, a selekcję i amplifikację prowadzi się jak w przykładzie X.
DNA RKFL13 wprowadza się do komórek CHO za pomocą fuzji protoplastów i mikroiniekcji. Plazmid RFKL13 został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockwille, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39989.
Tabela 4
Poziom EPO wydzielanej do podłoży
Próbka Test Uzysk w podłożu alfa Uzysk w podłożu alfa z 0,02 uM metotreksatem
Pula kolonii A RIA 3 ng/ml 42 ng/ml (pula) 150 ng/ml (klon)
3H-Thy — l,5jedn/ml
Klon pojedynczej kolonii RIA — 90 ng/ml
(0.02C-Z) 3H-Thy — 5,9jedn/ml
Pula po mikroiniekcji RIA 60 ng/ml 160 ng/ml
(DEPO-1) 3H-Thy l,8jedn/ml —
Korzystny klon pojednyczej kolonii został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC CRL8695.
Przykład XII. Ekspresja genomowego klonu EPO w komórkach COS-1.
Wektorem używanym do ekspresji genomowego klonu EPO jest pSVOd (Mellon i wsp., powyżej). DNA z pSVOd trawi się całkowicie Hindlll i końce przeprowadza się w tępe za pomocą dużego fragmentu polimerazy DNA I. Genomowy klon EPO - HEPO3 trawi się całkowicie EcoRI i Hindlll, wyodrębnia się fragment o 4,0 kilozasady zawierający gen EPO i jego końce przeprowadza się w tępe sposobem opisanym w powyższej części opisu. Sekwencję nukleotydów tego fragmentu od miejsca Hindlll do regionu będącego już za sygnałem poliadenylacji pokazano na fig.4. Fragment genu EPO wprowadza się do fragmentu plazmidu pSVod i prawidłowo skonsturowane rekombinanty w obydwu orientacjach wyodrębnia się i weryfikuje. Plazmid CZ2-1 ma gen EPO w orientacji „a“ (to jest koniec 5'jest najbliższy początkowi replikacji SV40), a plazmid CZ1-3 jest w odwrotnej orientacji (orientacja ,,b“).
Plazmidami CZ1-3 i CZ1-2 transfekuje się komórki COS-1 jak opisano w przykładzie VII.
Podłoża zbiera się i bada pod względem immunologicznie reaktywnej EPO. Około 31 ng/ml EPO wykrywa się w supernatancie hodowli CZ2-1 i 16-31 ng/ml w supernatancie hodowli CZ1-3.
Genomowe klony HEPO1, HEPO2 i HEPO6 można wprowadzić do komórek COS w celu ekspresji w podobny sposób.
157 926
Plazmidy zawierające gen EPO w takiej orientacji, że koniec 5' genu EPO znajduje się najbliżej promotora polihedryny i końca 3 genu polihedryny, identyfikuje się za pomocą trawienia Bg 1II. Jeden z tych plazmidów, o orientacji powyżej opisanej został oznaczony pIVEPO.
Ekspresja EPO w komórkach owadzich. Duże ilości plazmidu pIVEPO wytwarza się za pomocą transformowania E. coli szczep JMlOl-tgl. Plazmidowy DNA wyodrębnia się metodą klarownych lizatów (Maniatis and Fritsch, Cold Spring Harber Manuał) i dalej oczyszcza za pomocą wirowania w CsCl. DNA wirusa polihedryny Autographa californica (AcHPV) szczep L-l otrzymuje się za pomocą ekstrakcji fenolem cząstek wirusa z następującym po tym oczyszczaniem wirusowego DNA przy użyciu CsCl.
Tymi dwoma DNA kotransfekuje się komórki Spedoptera frugiperda IPLE-SP-21 [Vaughn i wsp., In Vitro, tom B, str. 213-217 (1977)] stosując metodę transfekcji z użyciem fosforanu wapnia (Petter i Miller, 1977). Na każdą płytkę z komórkami, które mają być transfekowane , używa się 1 ug DNA AcNPV typu dzikiego i 10 ug pIVEPO. Płytki inkubuje się w temperaturze 27°C w ciągu 5 dni. Następnie zbiera się supernatanty i potwierdza ekspresję EPO na drodze badania jej obecności w supernatantach za pomocą testu radioimmunologicznego oraz z wykorzystaniem badania biologicznego in vitro.
Przykład XV. Oczyszczanie EPO.
Podłoża kondycjonowane z zastosowaniem kmórek COS (121), z EPO w stężeniu do 200 ug/litr, zatęża się do objętości 600 ml, stosując membrany do ultrafiltracji z przerywaniem przy masie cząsteczkowej 10000, takie jak Millipore Pellican wyposażone w membrany o powierzchni 46,45 dcm2. Badania przeprowadza się z zastosowaniem RIA, jak to opisano w przykładzie VI. Płyn retencyjny po ultrafiltracji difiltruje się wobec 4 ml 10 mM fosforanu sodu buforowanego przy wartości pH 7,0. Zatężone i diafiltrowane podłoża kondycjonowane zawierają 2,5 mg EPO w 380 mg białka całkowitego. Roztwór EPO zatęża się dalej do 186 ml i wytrącone białka usuwa się za pomocą wirowania przy 110000 Xg w ciągu 30 minut.
Supernatant, który zawiera 2,0 mg EPO doprowadza się do pH 5 przy użyciu 50% kwasu octowego, miesza w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C i usuwa osad za pomocą wirowania przy 13000Xg w ciągu 30 minut.
Chromatografia na Carbonylomethyl Sepharose. 20 ml supernatantu po wirowaniu, zawierającego 2000 ug EPO (24 mg białka całkowitego) nanosi się na kolumnę z 20 ml CM-Sepharose, zrównoważoną 10 mM octanem sodu, przemytą 40 ml tego samego buforu. EPO, która związała się z CM-Sepharose, eluuje się 100 ml gradientu NaU(0-l)w 10 mM fosforanie sodu o pH 5,5. Frakcje zawierające EPO (w całości 50 ug w 2 mg białka całkowitego) łączy się i zatęża do 2 ml stosując membranę Amicon YM10 do ultrafiltracji.
HPLC z odwróconymi fazami. Zatężone frakcje z CM-Sepharose zawierające EPO poddaje się dalszemu oczyszczaniu za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, stosując kolumnę Vydac C-4. EPO nanosi się na kolumnę zrównoważoną 10 ml rozpuszczalnika B (rozpuszczalnikiem A jest 0,1% wodny roztwór CF3COOH, rozpuszczalnikiem B jest 0,1% roztwór CF3COOH w CF3CN) przy szybkości przepływu 1 ml/min. Kolumnę przemywa się 10% B w ciągu 10 minut i eluuje, liniowym gradientem B, EPO (10- w ciągu 60 minut). Frakcje zawierające EPO łączy się (40 ug EPO w 120 ug białka całkowitego) i liofilizuje. Liofilizowaną EPO rekonstytuuje się w 0,1 M Tris-HCl o pH 7,5 zawierającym 0,15 M NaCl i poddaje powtórnej chromatografii HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje zawierające EPO łączy się i analizuje za pomocą elektroforezy w 10% żelu SDS-poliakryloamidowym (U.K. Lameli, Naturę). Połączone frakcje EPO zawierają 15,5 ug EPO w 25 ug całkowitego białka.
157 926
Przykład XIII. Ekspresja w komórkach C127 i CHO. Konstrukcja pBPVEPO.
Plazmid zawierający sekwencję cDNA EPO pod transkrypcyjną kontrolą promotora mysiej metalotioneiny związany z całkowitym DNA bydlęcego papillomawirusa otrzymuje się w następujący sposób.
pEPO49f. Plazmid SP6/5 otrzymuje się z Promega Biotec. Plazmid ten trawi się całkowicie EcoRI i fragment EcoRI o 1340 parach zasad z >HEPOFL13 wprowadza się za pomocą ligazy DNA. Powstający plazmid, w którym koniec 5' genu EPO znajduje się najbliżej do promotora SP6 (jak stwierdzono za pomocą trawienia Bgll i · Hindlll) został nazwany pEPO49f. W tej orientacji, miejsce Bamll w poliłączniku PSP6/5 bezpośrednio przylega do końca 5' genu EPO.
pMMTneoABPV. Plazmid pdBPV-MMTneo (342-12) [Law i wsp., Mol. and Celi Biol., 3, 2110-2115 (1983)], przedstawiony na fig. 11 trawi się całkowicie BamHI w celu wytworzenia dwóch fragmentów: dużego fragmentu o długości ~8 kilozasad zawierającego genom BPV i mniejszego fragmentu o długości ~6,5 kilozasady, zawierającego początek replikacji pML2 i gen oporności na ampicylinę, promotor metalotioneiny, gen oporności na neomycynę i sygnał poliadenylacji SAV40. Trawiony DNA przeprowadza się w postać kolistą za pomocą ligazy DNA i plazmidy, które zawierają tylko fragment o 6,8 kilozasady identyfikuje się za pomocą trawienia endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI. Jeden z tych plazmidów nazwano pMNTneoABPV.
pEPO15a. ρΜΜΤηεοΔΒΡν trawi się całkowicie Bglll. pEPO49f trawi się całkowicie za pomocą BamHI i Bglll i wyodrębnia na drodze elektroforezy w żelu fragment o około 700 parach zasad, zawierający nienaruszony region kodujący EPO.
ρΜΜΤηεοΔΒΡν strawiony Bglll i fragment BamHI/Bg 1 Il EPO łączy się i powstające plazmidy zawierające cDNA EPO identyfikuje się za pomocą hybrydyzacji kolonii z sondą oligonukleotydową d/GGTCATCTGTCCCCTGTcC), która jest specyficzna dla genu EPO. Z plazmidów, które są pozytywne w analizie hybrydyzacji, jeden (pEPO15a) zawierający cDNA EPO w takiej orientacji, że koniec 5' cDNA EPO znajduje się najbliżej promotora metalotioneiny, identyfikuje się za pomocą trawienia przy użyciu EcoRI i KpnI.
pBPV-EPO. Plazmid pEPO15a trawi się całkowicie BamHI w celu przeprowadzenia go w postać liniową. Plazmid pdBPV-MMTneo(342-12) również trawi całkowicie BamHI z utworzeniem dwóch fragmentów o około 6,5 i 8 kilozasadach. Fragment o około 8 kilozasadach zawierających nienaruszony genom bydlęcego papillomawirusa, wyodrębnia się za pomocą elektroforezy w żelu. pEPO15a/BamHI i fragment BamHI o około 8 kilozasadach liguje się i identyfikuje się plazmid (pBPV-EPO), zawierający fragment BPV za pomocą hybrydyzacji kolonii z zastosowaniem sondy oligonukleotydowej d/P-CCACACCCGGTACACAOH), która jest specyficzna dla genomu BPV. Trawienie DNA pBPV-EPO przy użyciu Hindlll wskazuje, że kierunek transkrypcji w genomie BPV jest taki sam, jak kierunek transkrypcji promotora metalotioneiny (jak w pdBPVMMTneo/342-12), patrz fig. 11. Plazmid pdBPV-MMTneo/342-12) jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 37224.
Ekspresja. Do ekspresji EPO użyto następujących metod.
Metoda I. Otrzymuje się DNA pBPV-EPO i około 25 ug używa się do transfekcji 1 · 106 komórek 0127 [Łowy i wsp., J. of Virol., 26, 291-298 (1978)] lub CHO, stosując standardową metodę wytrącania fosforanem wapnia [Grahm i wsp., Virology, 52,456-467 (1973)]. Po upływie 6 godzin od transfekcji usuwa się podłoża transfekycjne, komórki poddaje się wstrząsowi glicerynowemu, przemywa i dodaje świeże podłoże alfa zawierające płodową surowicę bydlęcą w stężeniu 10%. Po upływie 48 godzin komórki trypsynizuje się i rozdziela w stosunku 1:10 w podłożu DME zawierającym 500iig/ml G418 [Southern i wsp., Mol. Appl. Genet., 1. 327-341 (1982)]. Komórki inkubuje się w ciągu 2-3 tygodni. Następnie kolonie oporne na G418 izoluje się indywidualnie w dołkach do mikromiareczkowania i hoduje prawie do zlewania się w obecności G418. Następnie komórki przemywa się, dodaje świeżych podłoży zawierających płodową surowicę bydlęcą w stężeniu 10% i zbiera porcje podłoża po upływie 24 godzin. Bada się kondycjonowanie podłoża i wykazuje, że są pozytywne pod względem EPO za pomocą testu radioimmunologicznego i testu biologicznego in vitro.
Metoda II. Komórki C127 lub CHO kontransfekuje się przy użyciu 25ug pBPV-EPO i 2ug pSYTneo (Southern i wsp., powyżej) jak opisano w Metodzie I. Jest to w przybliżeniu 10-krotny
157 926 nadmiar molowy pBPV-EPO. Po transfekcji, sposób postępowania jest taki sam, jak opisano w Metodzie I.
Metoda III. Komórki C127 transfekuje się przy użyciu 30ug pBPV-EPO sposobem opisanym w powyższej Metodzie I. Po transfekcji i rozdzieleniu (1:10) podłoża wymienia się na świeże każdorazowo co 3 dni. Po upływie mniej więcej 2 tygodni uwidaczniają się ogniska komórek transformowanych BPV. Poszczególne ogniska pobiera się oddzielnie do 1 cm dołków w płytce do mikromiareczkowania, prowadzi hodowlę prawie do zlewania się pojednyczej warstwy i bada się kondycjonowanie podłoża pod względem aktywności EPO lub antygenowości.
Przykład XIV. Ekspersja w komórkach owadzich. Konstrukcja pIVEV EPOFL13.
Plazmidowy wektor pIVEV został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39991. Wektor ten modyfikuje się w sposób następujący.
pIVEVNI. pIVEV trawi się EcoRI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową, przeprowadza końce w tępe przy użyciu dużego fragmentu polimerazy DNA I i pojedynczy łącznik Notl
GGCGGCCGCC
CCGCCGGCGG wprowadza się na drodze ligowania tępych końców. Powstający plazmid został nazwany pIVEVNI.
pIVEVSI. pIVEV trawi się Smal w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i pojedynczy łącznik Sfil.
GGGCCCCAGGGGCCC
CCCGGGGTCCCCGGG wprowadza się za pomocą ligowania tępych końców. Powstający plazmid został nazwany pIVEVSI.
pIVEVSIBgKp. Plazmid pIVEVSI trawi się KpnI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i z każdego końca usuwa się w przybliżeniu 0 do 100 par zasad za pomocą trawienia przy użyciu egzonukleazy Bal 31, dostosowanej do substratu dwuniciowego. Wszelkie powstające końce, które nie są zupełnie tępe, przeprowadza się w tępe stosowaniem dużego fragmentu polimerazy DNA I następnie wprowadza się poliłacznik
Xhol Xbal
BglUI EcoRI Cal KpnI AGATCTCGAGAATTCTAGATCGATGGTACC
TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG przez ligowanie tępych końców. Poliłącznik zostaje włączony w obydwu orientacjach. Plazmid, w którym poliłącznik zorientowany jest w ten sposób, że miejsce BgUI w poliłączniku jest najbliżej promotora genu polihedryny, nazwany jest pIVEVSIBgKp. Plazmid, w którym miejsce KpnI w poliłączniku jest najbliżej promotora genu polihedryny jest nazwany pIVEVSIKpBg. Ilości par zasad, które zostały usunięte między oryginalnym miejscem KpnI w pIVEVSI a promotorem polihedryny nie została określona. pIEIVSIBgKp został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39988.
. pIVEVSIBgKpN. pIVEVNI trawi się całkowicie KpnI i Pstl z wytworzeniem dwóch fragmentów. Większy fragment, który zawiera plazmidowy początek replikacji i koniec 3' genu polihedryny, otrzymuje się za pomocą wyodrębnienia z żelu (fragment A). pIVEVSIBgKp trawi się całkowicie za pomocą Pstl i Kpn z utworzeniem dwóch fragmentów oraz fragmentu mniejszego, zawierającego promotor genu polihedryny i poliłącznik i który otrzymuje się za pomocą wyodrębnienia z żelu (fragment B). Fragmenty A i B łączy się następnie przy użyciu ligazy DNA z utworzeniem nowego plazmidu pIVEVSIBgKpNl, który zawiera gen polihedryny z częściową delecją i do którego włączono poliłącznik, przy czym zawiera on również miejsce Notl (zastępujące zniszczone miejsce EcoRI) oraz miejsce Sfil flankujące region genu polihedryny.
pIVEPO. pIVEVSIBgKpNI trawi się całkowicie EcoRI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i wprowadza się do niego fragment EcoRI o 1340 parach zasad z A-HEPOFL13.
157 926
157 926
FIG. 11
SV 40 początek/wz mac n iacz Ad MLP
CDNA
SV 40 Pol i A
INTRON
DHFR
DHFR
SV 40 PoliA geny VA Barn HI
FIG 10
SV 40 wczesny promotor
157 926 cccggagcc ggaccggggc caccgcgccc gccctgccccg acaccgcgcc ccctggacog ccgccctctc ctccaggccc
8tggggctgg ccctgcaccg ccgegctccc cgggacgaggg ceeccggtgc
-27
HET CLY VAL HIS CLU CYS PRO
ggtcacccgg cgcgccccag gccgctgagg gaccccggcc eggegeggag ATC CCC CTC CAC CAA JL TCT CCT
AU TRP LEU TOP LEU LEU LEU SER I.EU LEU SER LEU PRO LEU CLY LEU PRO VAL LEU CLY
CCC TCC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC TCC CTC CCT CTC CCC CTC CCA CTC CTC CCC
Ala Pro Pro Arg Lcu Ilo SH Cys Aop Scr 10 *r? Val Leu Clu Arg Tyr Lcu Leu Clu Ala 20 Lys
CCC CCA CCA CCC CTC ATC TCT CAC ACC CCA CTC CTC CAC ACC TAC CTC TTC CAC CCC AAC
a Sil JO SH a 40
Clu Ala Clu Asn Ile Thr _ Tłu -£1y. - Cys Ala Clu llls Cys Scr Leu Asn Clu Asn Ile Thr
CAC CCC CAC AAT ATC ACC aacc CCC TCT CCT CAA CAC TCC ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT
50 60
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phc JŻ£ Ala -Łis. Arg Mec Clu Val Cly Cln Cln Ala
CTC CCA CAC ACC AAA CTT AAT TTC TAT CCC TCC AAC ACC ATC GAC a Δ CTC k CCC CAC CAC CCC
70 80
Val Clu Val Trp Gin Cly Lcu Ala Lcu Lcu Ser Clu Ala Val Leu Arg ciy Cln Ala Lcu
CTA CAA CTC TCC CAC ccc crc CCC CTC CTC TCC CAA CCT CTC CTC CCC ccc CAC CCC CTC
Λ 90 100
Lcu Val Λ?η Scr Ser Clu Pro Trp Glu Pro Leu Clu Leu llls Val Asp Lys Ala Val Scr
TTC CTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC CCC CTC CAC CTC CAT CTC CAT AAA ccc CTC ACT
110 120
Cly Lcu Arg Ser Lcu Thr Thr Lcu Lcu Arg. Ala Lu u cly Ala Cln Lys Clu Ala He Scr
CCC CTT CCC ACC CTC ACC act CTC CTT CCC CCT CTC CCA ccc AAC CAA CCC ATC TCC
FIG. 9
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Aln Ala Pro 130 Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phc 140 ..Arg Lys
CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCT CCT CCA CTC CCA ACA ATC ACT CCT CAC ACT TTC CCC AAA
LcU Pite Atr Val Tyr Ser Asn Phc Lcu 15U Arg \ Cly Lya Leu Lys Leu Tyr Thr Cly 160 Clu Ala
ctc nc cca CTC TAC TCC AAT TTC CTC CCC CCA AAC CTC AAC CTC TAC ACA CCC CAC CCC
SH Cys Arg Thr Tc(! ACC ACA 166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA TCA ccaggtg tgtccacctg ggcatacccs ccacctcccc caccaacatt
gcttgtgcca caccctcccc cgccactcct gaaccccgtc gaggggctct cagctcagcg ccagcctgtc
ccaeppacac tccagtgcca gcaacgncat ctcaggggcc agaggaactg tccagagagc aactctgaga
tctu.-igg.ccg ccacagggcc oocccguggg cccagogcag gaagcattca gagagcAgct tcaaactcag
Rgacagagcc atgctgggaa gacgcctgag ctcactcggc accctgcaaa ateegatgee aggacacgcc
-gsaggcea cccacctgtt ctcgcaccCA ccatcaggga caggatgacc tggagaoctt aggtggcaag
ctgtpactcc tccaggtctc- acgggcatgg gcoctccctt ggcggcaaga gcccccttga cscćggggtg
CCgggaacca cgnagncagg atggGggctg gcctctggct ctcotggggt ccaagttttg tgtattcttc
uucctcatcg acaagaactg auaccaccaa aaaoaaoaaaoa
FIG. 9 /ciąg dalszy/'
157 926
CCC&gCCg ctcgctgcgc ccctggacag ggccacccgg tgcgccgcac ccgccctctc cgcgccccag
cgcgctgtcc tcccggagcc ggaccggggc
ctccaggccc gtggggctgg ccctgcaccg
gtcgctgagg gaccecggec aggcgcggag
caccgcgccc gctctgctccg acaccgcgcc
Val Pro Asp Thr Lya
CTC CCA CAC ACC AAA
Val Clu Val Trp Cln
CTA CAA CTC TCC CAC
ALA TRP LEU TRP LEU
CCC TCC CTC TCC CTT .
Ala Pro Pio Arg Leu
CCC CCA CCA CCC CTC *
Clu Ala Clu Aan Ile CAC CCC CAC AAT ATC
LEU CTC LEU CTC SER TCC LEU CTC LEU CTC SER TCC LEU CTC PRO CCT
Ile SH Cya Asp Ser 10 Arg Va^ Leu Clu
ATC TCT CAC ACC CCA CTC CTC CAC
Thr Thr Cly SH Cys 30 Ala Clu Hle SH Cya
ACC ACC CCC TCT CCT CAA CAC TCC
Val Aso Phe Tyr 50 Ala Trp Lya Arg
CTT AAT TTC ΓΑΓ CCC TCC AAC ACC
Cly Leu Ala Leu 70 Leu Ser Clu Ala
CCC CTC CCC CTC CTC TCC CAA CCT
ccgagctccc cgggatgaggg cccccggtge
HET CLY VAL HIS CLU CYS PRO
ATC CCC CTC CAC CAA TCT CCT
LEU CLY LEU PRO VAL LEU CLY
CTC CCC CTC CCA CTC CTC CCC
20
Arg Tyr Leu Leu Clu Ala Lye
ACC TAC CTC TTC CAC CCC AAC
a 40
Ser Leu Asn Clu Asn Ile Thr
ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT
60
Het Clu Val Cly Cln Cln Ala
ATC CAC CTC CCC CAC CAC CCC
BO
Val Leu Arg ciy Cln Ala Leu
CTC CTC CCC CCC CAC CCC CTC
FIG. 8
100
Leu TTC Val CTC Asn AAC Ser TCT Ser TCC Cln CAC Pro CCC Trp TCC Clu CAC Pro CCC Leu CTC Cln CAC Leu CTC Hle CAT Val CTC Asp CAT Lya AAA Ala CCC Val CTC Ser ACT
Cly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu 110 Arg Ma Leu ciy Ma Cln Lya Clu Ma Ile 120 Ser
CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC CCT CTC CCA CCC CAC AAC CAA CCC ATC TCC
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 130 Leu Arg Thr Ile Thr Ma Asp Thr Phe Arg 140 Lye
CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCC CCT CCA CTC CCA ACA ATC ACT CCT CAC ACT TTC CCC AAA
Leu Phe Arg Val Tyr Sor Asn Phe Leu ISO Arg ciy Lya Leu Lya Leu Tyr Thr Cly Clu
CTC TTC CCA CTC TAC TCC AAT TTC CTC CCC CCa AAC CTC AAC CTC TAC ACA CCC CAC
FIG. 8 /ciąg dałaay/
gacaggaag gacgagctgj t gacagagacg tggggatgaa
ggaogctgcc ctcccacagc cacccctccc cctccccgcc cgaccctcag LU cctggccatc tgtcctagAA CYS TCT PRO CCT
ALA TRP LEU TRP LEU LEU LEU SER LEU LEU SER LEU PRO LEU CLY LEU PRO VAL LEU CLY
'ccc TGC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC TCC CTC CCT CTC CCC CTC CCA CTC CTC CCC
1 SU Ala Pro Pro Arg Lcu Ile Cy9 Asp 10 Ser Arg Val ' Leu Clu Arg Tyr Leu Leu Clu 20 Ala Lys
CCC CCA CCA CCC CTC ATC TCT CAC ACC CCA CTC CTC CAC ACC TAC CTC TTC CAC CCC AAC
P Clu Ala Clu Asn Ile Tlir Thr Cly SH 30 Sil Cya Ala Clu llle Cys Ser Leu * Aan Clu Asn 40 Ile Thr
CAC CCC CAC AAT ATC ACC ACC CCC TCT CCT CAA CAC TCC ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 50 Tyr Ala Trp Lys Arg Het Clu Val Cly Cln 60 Cln Ala
CTC CCA CAC ACC AAA CTT AAT TTC TAT CCC TCC AAC ACC ATC CAC CTC CCC CAC CAC CCC
Val Clu Val Trp Cln Cly Leu Ala 70 Leu Leu Ser Clu Ala Val Leu Arg Cly Cln 80 Ala Leu
CTA CAA CTC TCC CAC CCC CTC CCC CTC CTC TCC CAA CCT CTC CTC CCC CCC CAC CCC CTC
a Leu Val Asn Ser Ser Cln Pro Trp 90 Clu Pro Lcu Cln Leu His Val Asp Lys Ala 100 Val Ser
TTC CTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC CCC CTC CAC CTC CAT CTC CAT AAA CCC CTC ACT
Cly Leu Arg Ser Lcu Thr Thr Lcu 110 Leu Arg Ala Leu Cly Ala Cln Lys Clu Ala 120 Ile Ser
CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC CCT CTC CCA CCC CAC AAC CAA CCC ATC TCC
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 130 Pro Lcu Arg Tlir Ile Thr Ala Asp Thr Phe 140 Arg Lys
CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCT CCT CCA CTC CCA ACA ATC ACT CCT CAC ACT TTC CCC AAA
FIG. 7
150 160
Leu Phe Arg CTC TTC CCA Vel Tyr Ser CTC TAC TCC Aan Phe Leu AAT TTC CTC Arg Cly Lys CCC CCA AAC Leu Lys Leu CTC AAC CTC Tyr Thr Cly TAC ACA CCC Clu Ala CAC CCC
SU Cys Arg Thr TGC ACC ACA 166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA TCA ccaggtg tgtccacctg ggcatatcca ccacccccct ceccaacact
gcttgtgcca caccccccce cgccactcct gaaccccgtc gaggggctct eagctcagcg ccagcctgtc
ccatggacac tccagtgeca geaatgacat ctcaggggcc agaggaactg tccagagagc aactctgaga
tctaaggatg tcacagggcc aacttgaggg cccagageag gaagcattca gagageaget ttuactcag
ggacagagcc atgctgggaa gacgcctgag cccactcggc acectgcaaa atttgatgee aggacacgct
ctggaggcga tctacctgtt ttcgcaccta ccatcaggga caggatgacc tggagaactt aggtggcaag
ctgtgaetcc tccaggtctc acgggcatgg gcactccctt ggtggeaaga gcccccttga caccggggtg
gtgggaacca tgaagacagg atgggggctg gcctctggct ctcatggggt cc&igttttg tgtattcttc
aacctcettg acaagaactg aaaccaccaa aaaaaaaaaaaa
FIG. Ί /ciąg dalezy/
68000d
45000d
p 91023
I Trawienie EcoRI /fragment Kle nowa/ I Ugacja p 91^^:3(A)
Pstl/fragment Klenowa/EcoRl łącznik trawienie EcoRI/ligacja
Xhol ___Geny VA XhoIv©^SS/7° . PwiII// wzmacniacz
UO^zlorow^Gtow/ny pO2ny pfomotor ' adenowirusa \ 3’miejsce składania TETR -p 91023IB)
7.9 KB
OHFR poli A
Se 40
Hind III •Barn HI
FIG. 5C pCVSVL2-TPL
pBR322-Ad HindDIB S.trawienie Hpal ' 2.EcoRI tącznik/EcoRI trawienie/ 3.odzyskanie fragmentu 1,4 KB ligacja
-BamHI XhQl EcoRI
PvuII trójcztonowy..
lider JF Gtćrwny późny promotor
FIG.5B’
FIG. 5B
Xhol
EcoRI
Hind III
Bam Η I
Sal I ° (j. f l.częscicwc trawienie
B3™ i 2 fragment Ktenowa
Ec°RI l3-ligacJa
Hind III Bam HI Sali
Xhol
Ρνυ Π
Bam Η I FIG. 5A ggtttg(^aBt6Ba8ttEe8aaecta8acact8cccCB<:tacacaagaatae8tcteg^(^gccccaaaccatacct ggaaactaggcaaggagcaaagccagcagatcctacgcctgtggccagggccagagccIttMgggacccttgact . a · · · · ccccgggctgtgtgcat t CcagACaCCCTCT«rrCAACACTGCACCTTCAATCACAATATCACTCTCCCAGACAC ThrClyCyaAlaCluHieCyeSarIaiuAanC].uAaniaeThraal.ProAapTh αAACπΛTTATCTATCCTτCCAAGACAATCAACgt8agttccCtCCtttctttetttcctttcttttggagaat rLyaraAanlhaTyrAlaTrpLy6ArgMetClu ctcattCgcgcgccCaaι:tCCagctaagajglgaaaatgatcgacgaaag8gtaaaacggc8Cc8cagagaCgacg gteegtgcccccagaggctcacgcctataatcccaggctgagatccccga^g^tgg^g>aaattgcttgagccctc,g a^ttcagaccaaccta^cagcatagtgaggtcccccatctctacaaacatttaaaaaMttagtcaggtga^ tggtgcatggtggtagtcccagatet ttggagggcgagggciŁggaggatcgcttgagcccaggaaC^gaMC^ cagtgagctgtgatcacaccactgcactccagcctcegtgacagagtgaggccctgtctcaaaaaagaaaagaaa aaagaaaaaoaatgcaggccgtctggactacatccattattcattcactcacccacteactcattcattcattca ttcattcaaaacgtcctact:gtataccŁtctgtCtc¢CcagcccgctgcctggggctgcCgaggggcgggαggga gaccccgaaatccctcagctgactcccacagtc¢actcaccτtagCτCCCCCACC/C:CCCCTACAΛTCCTC<C:AC r^lClyClnGInALamCluralTrpCln pCCCTCCCCCTCCrCTCCGi^(^<^CTCCrCCCG^<^{C^C^^cCCCrTiTł^^^^C^(^<^i^Ak£C:CCT^CACCCC
ClyLauAlaLeuIauSarCluAlayal lAańSerSarClnProTrpClulro
CTCCACCTCCATCTCCATAAACCC^TCA^C^^^CC^J^t^t^tC^i^j^i^C^j^i^^C^^CTrCCCGICrCr^^CACCCCAC LauAlπLautlHaralT&pLysAlarβlSarClyLeuTrcSerLauChrThΓLauLeuArgAlaLeuClyAlaCln
CtcagtaccagcggacacttctccttgccctttcCgtaagaaggcgagaagggtcttgctaaggagtacaggaac tgtccgtatεccttcccttcctgtagcactcccaccacccccTgttttcccctcτgrτCTITTTCACAT'CCCCX . LyaClyAlalleSerP ^TCCACATCCCCCCTCACCTGCTCCCLCrCCCCACAATTACTTCCCCCACTTTCCCCAAAATCTTCCCACrCTACT ^roAspAlaAlaSerAlaAlaProLauA^ThrllehhrAlaAapThrfheArgLysI.eiilhaAi^yalT^S CCTTCTΓCCTCCGCAGTTACTCTCATCCGTTCTCATTGGTCCCATTCΛCCACACCCCΛCACATCTAAΛCCTACCT arAanlhaLeuArgClyLy8LeuLyβl.ΛaUcrrT^ΓClyCluA^aTy8AΓgThιrTlyTβpTrg * TAATACACCCTCACCCTTTTTTTTTTCTTTTT^^CTTCTCTCCÓATCTCCCCCAAACAACTACATTAATCACCC
CCGACGGCACACATTCCCATCCCCTGCCCCCAATTTGCTATACCTAACACAATTTTCATTTTATCTAGGTTATGA ····..·
CCAACTCTCCACACACCMCTCTGACATCTAACCATCTCACACCCCCiAMCrrCACCCCCCAGACCACCAAGCATT
ATATCAAC^CCCτCTTTTCCTCACACTGTC(:ATT^T^:AGCTTA;TTTTCTCGT.TGTT(TTTTACCCTTAT'CAATTTTTC
TTTCGATTATACCttmTTATGCCTTτCACτTCTCCCTTATTCACTT:ICT.CTGA.ATGCA.CTTACCAGTGTTT ·····» a
TCTATCGCCTTACCGCGTCCCCCCCTCCCTCCTTAGCCATACCTTA'CCCtCCCTCCCACAAATCCTTATCCAATTT
AACTATCTCCACΛΛC(TTCAr.CACTTTATCTCACATCCC(TXCACTT'CCT(TCΪCACCΪCTCTATΠCCC(TlΛTTTC ·····««
CAAACACCAπCTCTACTT<TΓ¢TATCCTATaaτrτgactctCggcttcccCgCtCtctgcggaactcciutf tccc ctggctctgtcccactccgggcagca
1500
1650
1800
1950
2100
2250
2400
2550
2700
2850
3000
3150
3300
3400
FIG. 4C agctl^^tgjgi^ct t<^<^i^j^;^cccagctactt tgcggaacc<^i^(^<^a^^cccaggcaCctcl^8aBl^ctcc(^<^<^^e^aBacc gggatgccccccaggaggtgtccgcgagcccagcccttcccagotflgcagctccgccagtcccnncggtgcgcaa ISO ccggctgcactcccctcccgcgacccagggcccgggagcagcccccatgacccacacgcacgCccgcageagccc • · · · · · · agCcagcaacccaccccaaacaaacccgtcaCgecccCgcacCgcacccgggcggcccctacccctgcacaccca 300 taacg^acacagcaecacccccacccccacccgcg^aagcaaacatgeagagaaaagccecgacccccggaaaca gcagcaacgaaccCaaaccacCCCCCCCCCTC(CTCCCCTCCCα;:CCΛCCGCCCTCTCCTCCCCCACCCαACCC 450 CCCCCACCCCCCCCCCTCTCCTCCCACACCCCGCCCCCTCCACAGCCCCCCTCTCCTCCACCCCCCTCCCCCTCG CCCTCCACCCCCGACCTTCCCCCCATCACCCaCCCCacrCTCCTCACCCCCCCCCCCCCACCTCCCTCACCCACC 600 ccc<cxACCxccccACATCCGccτGCΛCCctgogtacacgcgacacggacgctcccgcccgacaaacccca:tgct . MetGlyVelllioG . .
tcagaggggaattaccgcaacggctattggaaacca8gεggctCCgttcaagCaaaCCagacttgtaaaIUaeca 7S0 cggaacggggcacccccCgCCgcagcctcaaaacgccaacaggggcCtggggggaCccCtggccaCggcaaaaaa ctcacatgCgaaggccacacagcttgcgggttgacgggaaggaacCCtggggcgCtcCcaεgtgccagtggβcac 900 gaaCctcaCaagctgatαacct:ggcacatggagacaccacI:talCcCaaaagaggggaacaaecag(:cacaacagc attgαagtttgaaccgagaactggatgctggtαgccCgggggtggcgtgtgcacacgcaaccaggattgaatcag 1050 CgccagggngcccacaacaacaCgcatgcaCggtCggggacaggaacgaagaccCgccgcacagacgtcgccatg aaggaagcagtccttccaaacccaccctεatccatcccccaatgaatcacagcctcgctatccgttctagAATCr 1200 ggtcggtcggtgtgg.gttgtggtgtccctggtctcggtcgctctcgccgtgggactcctgcggggggcaggAc£ć ProAlarrpI.currpLcul.cuLcuSerLeuLcuSerlj5uProLL!uCGytL>uProVaai.euClyAlaProProArg CrCΛrCrCrCACΛCCCCACTCCTCCACΛACCrCCTrCrCCΛCCCCAACCACCCCCACJCTATCACCctggaccca 1350 LeuIleCy8AspScΓArcValLeuCluΛrgTyΓIIBuLLaUGuUlBg.LsCluAlaCGuJAaIlerhr c^tccccacancattccacacaacccacgatcaggccttcagggaoctaaccaaaga^aaacganccŁcgcactt
FIG. 4C
FIG.4A
FIG 4 B zasad
27aa
Lider
166aa
Produkt dojrzaty 400 600 800 1000
3'
-AAAAAAA
I I
1200 1400
Par zasad
FIG. 3C
5'
200
cccggagcc ggaccggggc caccgcgccc gccctgccccg ocaccgcgcc
ccctggaceg ccgccccccc ctccaggccc gtggggctgg ccccgcaccg ccgagcttcc cgggatgaggg cccccggcgc
-27 HET CLY VAL HIS CLU CYS PRO
ggccacccgg cgegccccag gccgccgagg gaccccggcc aggcgcggag AtC CCC CTC CAC CAA ▲ ICI CCT
ALA TRP LEU TRP LEU LEU LEU SEB LEU LEU SEB LEU PRO LEU CLY LEU PRO VAL LEU CLY
ccc icc ctc icc at ctc cre tcc CTC CTC TCC CTC CCT CTC CCC CTC CCA CTĆ CTC CCC
SH 10 20
Ala - Pro. Ara Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Clu Arg Tyr Leu Leu Clu Ala Lya
CCC CCA CCA CCC CTC ATC TCT CAC AGC CCA CTC CTC CAC ACC TAC CTC TTC CAC CCC AAC
a SU 30 SH a 40
Clu Ala Cltf „Ast. Jle Thr T hiL Clx. Cya Ale Clu Hla Cya Ser Leu Asn Clu Aan Ila Thr
CAC CCC CAC AAT ATC ACC. ACC CCC TCT CCT CAA CAC TCC ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT
50 60
Val Pro Aep Thr Lya VaV. Asn Phe .Tyr Ala JĘEŁ. Lya Arg Het Clu Val Cly Cln Cln Ala
CIC CCA CAC ACC AAA CTT AAT TTC TAI CCC TCC AAC ACC ATC CAC^ CTC CCC CAC CAC CCC
70 60
Val Clu Val Trp Cln Cly Leu Ala Leu Leu Ser Clu Ala Val Leu Arg -£łX. -Cln Ala. Leu.
CIA CAA CTC TCC CAC CCC CTC CCC CTC ao TCC CAA CCT CCC CTC CCC CCC CAC CCC CTC
a 90 100
Leu V«1 Λ5ί>_ •SfJL SPL Clq Pro Trp. jEsa Lsu Cln Leu oo Aga, LtŁ Ala Val Sar
TTC CTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC ccc CTC CAC CTC CAT CTC CAT AAA CCC CTC ACT
110 120
Cly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu ΛγΚ Ala Leu Cly Ala Cln Lya Clu Ala Ile Sar
CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC CCT CTC CCA CCC CAT. AAC CAA CCC ATC TCC
FIG . 30 A
Pro Pro Aso Ala Ala Ser Ala Ala Pro 130 Leu Arg Thr Ile Thr Ala Aap Thr Phe CAC ACT TTC 140 Ar-g Lya CCC AAA
CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCT CCT CCA CTC CCA ACA ATC ACT CCT
Leu Phc Ara Val Tyr Ser Asn Phe Leu 150 - Arg Cly Lya Leu Lya Leu Tyr Thr Cly 160 Clu Ala
CTC TTC CCA CTC TAC TCC AAT TTC CTC CCC CCA AAC CTC AAC CTC TAC ACA CCC CAC CCC
SH Cvs Ara Thr TCC ACC ACA 166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA TCA cceggtg cgtccacctg ggcacaccca ccacctcccc caccaecacc
gcttgcgcca ceccctcccc cgccaccccc gaaccccgtc gaggggcccc cagcccagcg ccagcctgcc
ccacggacac tccagtgcca gceacgacat ctceggggcc egaggaactg tccagagagc eactctgaga
cctaaggatg tcacagggcc aacttgaggg cccagagcag gaagcactca gagogeaget ttaaactcag
ggacagagcc atgctgggaa gacgcctgag ctcactcggc eccctgcaaa atttgatgee aggacacgct
ttggaggcga ttcacctgtt tccgcaccta ccatcaggga caggacgacc tggagaacct aggcggcaag
ctgtgacctc cccaggtccc acgggcatgg gcactcccct ggtggcaaga gcccccctga caccggggtg
gcgggaacca tgaagacagg atgggggctg gcctctggct cccacggggt ccaagtcttg tgtattcttc
aacctcactg ocaagaactg aoaccaccaa aaaaaaaaaaaa
FIG. 3B /ciąg dalezy/ ο
cc
α.
>C9
ΙΑ
O > w
SH s<
JS
O ►* O V
W ca « ·* W ° δ *=· >» *4 «Π ° Z? ** <
co >· o
co
X o
cc £X.
>» o
0} ►
U to b
<
O uł <
Q tfl <
J3 o
KlCMŁU I X b
O co o
oc
a.
to to b
<
>»
«X
FIG. 3A /Ciąg dalszy/
Wątroba osoby dorostej Wątroba ptodowa
-o
FIG.2 gatcctacgcctgtggccagggccagagccttcagggacccttgactccccgggctgtgtgcatttcag a
ACG GGC TGT GCT GAA CAC TGC AGC TTG AAT GAG AAT ATC
Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Łeu Asn Glu Asn Ile
ACT GTC CCA GAC ACC ΛΑΑ GTT AAT TTC TAT GCC TGG AAG
Thr Vał Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys
AGG ATG GAGgtgagttcctttttttttttttttcctttcttttggagaatctcatttgcgagcctg Arg MET Glu d attttggatgaaagggagaatgatc fig. i
Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 5000 zł.

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, że hoduje się w odpowiednim podłożu komórki gospodarza zawierające sekwencję DNA zasadniczo taką, jak pokazana na fig. 3B, funkcyjnie połączoną z sekwencją kontroli ekspresji i wyodrębnia się tak wytworzoną erytropoetynę z komórek i podłoża.
  2. 2. Sposób wytwarzania erytropoetyny, znamienny tym, że hoduje się w odpowiednim podłożu eukariotyczne komórki gospodarza zawierające sekwencję DNA zasadniczo taką, jak pokazana na fig. 4C, funkcyjnie połączoną z sekwencją kontroli ekspresji i wyodrębnia się tak wytworzoną erytropoetynę z komórek i podłoża.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki ssaków.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki 3T3.
  5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).
  6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA zawarta jest w wektorze zawierającym także DNA bydlęcego papillomawirusa.
  7. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki ssaków.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki 3T3.
  9. 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako komórki ssaków stosuje się komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).
  10. 10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA zawarta jest w wektorze zawierającym także DNA bydlęcego papillomawirusa.
PL1985287787A 1984-12-04 1985-12-03 Sposób wytwarzania erytropoetyny PL PL PL PL PL PL PL157926B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67781384A 1984-12-04 1984-12-04
US68862285A 1985-01-03 1985-01-03
US69325885A 1985-01-22 1985-01-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL157926B1 true PL157926B1 (pl) 1992-07-31

Family

ID=27418329

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1985256589A PL154180B1 (en) 1984-12-04 1985-12-03 Method of obtaining a human clone cdna exhibiting biological expressions of active erythropoetin
PL1985287787A PL157926B1 (pl) 1984-12-04 1985-12-03 Sposób wytwarzania erytropoetyny PL PL PL PL PL PL

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1985256589A PL154180B1 (en) 1984-12-04 1985-12-03 Method of obtaining a human clone cdna exhibiting biological expressions of active erythropoetin

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP0205564B2 (pl)
JP (4) JPH02104284A (pl)
KR (1) KR890001011B1 (pl)
AT (2) ATE71408T1 (pl)
AU (1) AU621535B2 (pl)
CA (1) CA1341502C (pl)
CZ (3) CZ281756B6 (pl)
DE (3) DE3585161D1 (pl)
DK (4) DK172953B1 (pl)
ES (1) ES8800049A1 (pl)
FI (2) FI104261B (pl)
GE (1) GEP19970775B (pl)
GR (1) GR852890B (pl)
HK (2) HK105693A (pl)
HU (1) HU216079B (pl)
IL (1) IL77081A (pl)
LV (2) LV10505B (pl)
MD (1) MD1639C2 (pl)
NO (1) NO304469B1 (pl)
PL (2) PL154180B1 (pl)
PT (1) PT81590B (pl)
SK (2) SK168799A3 (pl)
UA (1) UA44882C2 (pl)
WO (1) WO1986003520A1 (pl)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4677195A (en) * 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
DE3789678T2 (de) * 1986-02-27 1994-08-11 Snow Brand Milk Prod Co Ltd Herstellung von erythropoietinproduzierenden Zellen und Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin mit Verwendung dieser Zellen.
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
GB2197321B (en) * 1986-09-12 1990-10-03 Genentech Inc Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line
US4954437A (en) * 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
KR100470180B1 (ko) 1995-06-15 2005-02-04 크루셀 홀란드 비.브이. 유전자 요법에 사용할 수 있는 인간의 재조합아데노바이러스 패키징 시스템
EP0752474A1 (en) 1995-07-07 1997-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
WO1997003200A1 (en) * 1995-07-07 1997-01-30 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for cmp-n-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
DE19535571A1 (de) 1995-09-14 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
NZ337465A (en) 1997-03-18 2002-04-26 Roche Diagnostics Gmbh Pharmaceutical containing erythropoietin and iron preparations for treating haemodialysis patients or anaemias
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
PT1000154E (pt) 1997-07-23 2007-03-30 Roche Diagnostics Gmbh Identificação de linhas celulares humanas para a produção de proteínas humanas por activação endógena de genes
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
ATE341625T1 (de) * 1997-07-23 2006-10-15 Roche Diagnostics Gmbh Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
WO1999005267A1 (de) * 1997-07-23 1999-02-04 Roche Diagnostics Gmbh Identifizierung humaner zellinien zur produktion humaner proteine durch endogene genaktivierung
US6391633B1 (en) 1997-07-23 2002-05-21 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
DE69726571T2 (de) * 1997-09-01 2004-11-04 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Rekombinantes humanes Erythropoietin mit vorteilhaftem Glykosylierungsmuster
AR019025A1 (es) 1998-04-09 2001-12-26 Roche Diagnostics Gmbh Uso de eritropoyetina en bajas dosis para producir un preparado farmaceutico para el tratamiento de hemocromatosis, preparado farmaceutico combinadoutilizado segun dicho uso y envase farmaceutico unitario que contiene al referido preparado farmaceutico combinado
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
BR9905868A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
BR9905867A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
EP1274720A4 (en) 2000-04-12 2004-08-18 Human Genome Sciences Inc FUSION PROTEINS CONTAINING ALBUMIN
CA2431964C (en) 2000-12-20 2013-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
KR100505152B1 (ko) * 2001-09-10 2005-08-03 (주)가이아진 아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
JP4480398B2 (ja) 2001-12-07 2010-06-16 クルセル ホランド ベー ヴェー ウイルス、ウイルス分離株及びワクチンの製造方法
PT1463751E (pt) 2001-12-21 2013-08-26 Human Genome Sciences Inc Proteínas de fusão de albumina
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
RU2245720C2 (ru) * 2002-07-01 2005-02-10 Государственное учреждение Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии МЗ РФ Способ восполнения кровопотери при операциях на легких у больных туберкулезом
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
MXPA05002594A (es) 2002-09-11 2005-05-27 Fresenius Kabi Gmbh Derivados de polipeptidos con hidroxialquilalmidon, especialmente derivados de eritropoyetina con hidroxialquilalmidon.
ATE409048T1 (de) 2002-10-08 2008-10-15 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR101183770B1 (ko) 2003-05-09 2012-09-17 크루셀 홀란드 비.브이. Ｅ1-불멸화된 세포의 배양물 및 이로부터 생성 수율을 증가시키기 위한 동일물의 배양 방법
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
JP2007517769A (ja) 2003-09-29 2007-07-05 ウォーレン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 敗血症および癒着形成の治療および予防のための組織保護性サイトカイン
DK1699915T3 (da) 2003-12-30 2010-09-13 Augustinus Bader Anvendelse af erythropoietin til levervævsregenerering
DE102004063927A1 (de) 2004-01-23 2005-12-15 Epoplus Gmbh Co.Kg Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden
ES2390885T3 (es) 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
AR048035A1 (es) 2004-03-11 2006-03-22 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina, preparados por aminacion reductora
GB0507123D0 (en) * 2005-04-08 2005-05-11 Isis Innovation Method
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
AR053416A1 (es) * 2005-11-10 2007-05-09 Protech Pharma S A Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac
EP1978030A4 (en) 2006-01-18 2009-12-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCESS FOR REMOVING SIALIC ACID AND METHOD FOR PRODUCING ASIALOERYTHROPOIETIN
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
EP1991569A4 (en) * 2006-03-07 2009-12-23 Regenetech Inc MAMMALIAN BIOLOGICAL MOLECULES WITH NATURAL GLYCOSYLATION PRODUCED BY ELECTROMAGNETIC STIMULATION OF LIVING MAMMALIAN CELLS
EP1997505A4 (en) 2006-03-22 2013-02-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PREPARATION OF A ERYTHROPOETIN SOLUTION
WO2008019214A1 (en) 2006-08-04 2008-02-14 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Modified erythropoietin
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2095829A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 LEK Pharmaceuticals D.D. Selenium containing modifying agents and conjugates
DE102008002209A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin
DE102008002210A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin
EP2334699B1 (en) 2008-09-23 2013-09-11 F. Hoffmann-La Roche AG Purification of erythropoietin
DE102008054716A1 (de) 2008-12-16 2010-06-17 Evonik Degussa Gmbh Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO
US20100272816A1 (en) 2009-04-27 2010-10-28 Wolfgang Rudinger Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient
EA022396B1 (ru) 2009-09-23 2015-12-30 Ратиофарм Гмбх Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин
WO2017068051A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Lek Pharmaceuticals D.D. Peg-based dendron and process for producing the same
CN106906359B (zh) 2015-12-22 2018-12-11 理查德.亨威克 从硅酸盐矿物收取锂
EP3570871B1 (en) 2017-03-20 2020-11-18 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439780A (en) * 1890-11-04 Method of and apparatus for casting ingots
US3865801A (en) * 1973-06-15 1975-02-11 Atomic Energy Commission Stabilization of urinary erythropoietin using sodium p-aminosalicylate and extracting into phenol
JPS5455790A (en) * 1977-10-05 1979-05-04 Tomoyuki Tajima Production of erythropoetin
JPS5653696A (en) * 1979-10-09 1981-05-13 Ajinomoto Co Inc Isolation of erythropoietin by adsorption
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
US4419446A (en) * 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
JPS6043395A (ja) * 1983-08-19 1985-03-07 Sumitomo Chem Co Ltd エリスロポエチンの製造法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
JPS60215632A (ja) * 1984-04-12 1985-10-29 Japan Found Cancer エリスロポエチンの製造法
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
JPH062070B2 (ja) * 1988-07-06 1994-01-12 農林水産省食品総合研究所長 ▲ｏ下−▼アシルアミノ酸の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
LV10507B (lv) 1996-06-20
JPH02104284A (ja) 1990-04-17
JPH07184681A (ja) 1995-07-25
DK173254B1 (da) 2000-05-22
SK281799B6 (sk) 2001-08-06
CZ287620B6 (cs) 2001-01-17
IL77081A (en) 1999-10-28
NO304469B1 (no) 1998-12-21
DK95197A (da) 1997-08-20
ES8800049A1 (es) 1987-10-16
DE3585161D1 (de) 1992-02-20
EP0205564A1 (en) 1986-12-30
ATE71408T1 (de) 1992-01-15
CZ281756B6 (cs) 1997-01-15
ATE63137T1 (de) 1991-05-15
EP0411678B2 (en) 2000-01-12
LV10505A (lv) 1995-02-20
SK880485A3 (en) 1999-03-12
JPH0655144B2 (ja) 1994-07-27
DK172953B1 (da) 1999-10-18
EP0411678B1 (en) 1992-01-08
DK199901147A (da) 1999-08-20
LV10507A (lv) 1995-02-20
DK175826B1 (da) 2005-03-14
GR852890B (pl) 1986-04-03
AU621535B2 (en) 1992-03-19
CA1341502C (en) 2006-03-21
HUT40706A (en) 1987-01-28
KR890001011B1 (en) 1989-04-18
IL77081A0 (en) 1986-04-29
FI19992064L (fi) 1999-09-27
GEP19970775B (en) 1997-01-27
FI863044A0 (fi) 1986-07-24
EP0205564B2 (en) 2000-06-21
NO863050D0 (no) 1986-07-28
HU216079B (hu) 1999-04-28
CZ127496A3 (cs) 2000-02-16
WO1986003520A1 (en) 1986-06-19
DK368786D0 (da) 1986-08-01
AU5313486A (en) 1986-07-01
HK105593A (en) 1993-10-15
MD940371A (en) 1996-06-28
PT81590A (en) 1986-01-01
ES549539A0 (es) 1987-10-16
EP0411678A1 (en) 1991-02-06
LV10505B (en) 1996-04-20
DE3582732D1 (de) 1991-06-06
KR870700099A (ko) 1987-02-28
CZ286557B6 (cs) 2000-05-17
FI863044L (fi) 1986-07-24
FI104261B1 (fi) 1999-12-15
DK200000527A (da) 2000-03-29
DK368786A (da) 1986-08-01
CZ880485A3 (en) 1996-08-14
PL256589A1 (en) 1986-10-21
UA44882C2 (uk) 2002-03-15
SK279765B6 (sk) 1999-03-12
MD1639C2 (ro) 2001-10-31
EP0205564A4 (en) 1987-12-14
JPH02442A (ja) 1990-01-05
JPH01257480A (ja) 1989-10-13
MD1639B2 (en) 2001-03-31
NO863050L (no) 1986-07-28
EP0205564B1 (en) 1991-05-02
DE411678T1 (de) 1991-10-17
PL154180B1 (en) 1991-07-31
FI105347B (fi) 2000-07-31
HK105693A (en) 1993-10-15
DK173293B1 (da) 2000-06-13
FI104261B (fi) 1999-12-15
PT81590B (pt) 1987-10-20
SK168799A3 (en) 2001-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL154180B1 (en) Method of obtaining a human clone cdna exhibiting biological expressions of active erythropoetin
TW203100B (pl)
EP0593065B1 (en) Recombinant fibroblast growth factors
RU2129613C1 (ru) Способ получения эритропоэтина человека
JPH0144317B2 (pl)
KR930005917B1 (ko) 에리트로포이에틴의 제조방법
RU1801118C (ru) Способ получени человеческого эритропоэтина
AU604051B2 (en) Recombinant human erythropoietin
EP0594764B1 (en) Hematopoietic growth factor derived from t lymphocytes and methods of use therefor
AU5711199A (en) Method for the production of erythropoietin