JPH07184681A - ヒトエリトロポエチン活性を有する糖タンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトエリトロポエチン活性を有する糖タンパ
ク質の生産方法を提供する。 【構成】 第４表の塩基配列を含むヒトエリトロポエチ
ンをコードするゲノムＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベ
クターで形質転換された哺乳動物細胞を培養し、次いで
産生されたヒトエリトロポエチン活性を有する糖タンパ
ク質を分離することを特徴とするヒトエリトロポエチン
活性を有する糖タンパク質の生産方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は驚くほど高い発現レベル
を示すヒトエリトロポエチンのクローン化遺伝子、その
組換えＤＮＡベクター、および該組換えベクターで哺乳
動物細胞を形質転換させて得られる形質転換体に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】エリトロポエチン（以後ＥＰＯと略す）
は高等動物における赤血球の形成を促進する循環系中の
糖タンパク質である。例えば、カルノー（Ｃａｒｎｏ
ｔ）らのＣｏｍｐｔ．Ｒｅｎｄ．，１４３：３８４（１
９０６）を参照されたい。それゆえ、ＥＰＯは赤血球形
成促進因子とも呼ばれている。

【０００３】ヒト赤血球の寿命は約１２０日間である。
従って、全赤血球の約１／１２０は細網内皮系で毎日破
壊される。同時に、比較的一定数の赤血球が常時赤血球
レベルを維持するために毎日生産される〔ガイトン（Ｇ
ｕｙｔｏｎ）のＴｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｐ．５６−６０，Ｗ．Ｂ．
Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，フィラデルフィア（１９７
６）を参照〕。赤血球は骨髄中で赤芽球の成熟および分
化により生産され、ＥＰＯは未分化の前駆細胞に作用し
てそれらの細胞の赤血球への分化を誘起する因子である
（ガイトンの上記文献参照）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＥＰＯは貧血、特に腎
性貧血の臨床治療のための有望な治療薬剤である。しか
しあいにくＥＰＯは、治療剤として使用するのに必要な
十分量を入手することが容易でないため実際上の医療面
において未だ普及していない。

【０００５】ＥＰＯを治療薬剤として使用するために
は、抗原性の問題を考慮しなければならないだろう。従
って、ＥＰＯはヒト由来の原料から生産されるのが好ま
しい。例えば、再生不良性貧血または同様の症状をもつ
患者（大量のＥＰＯを排出する）からの血液もしくは尿
が使用できる。例えば、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らのＲ
ｅｃ．Ｐｒｏｇｒ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．，１６：２１９
（１９６０）；エスパダ（Ｅｓｐａｄａ）らのＢｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｍｅｄ．，３：４７５（１９７０）；フィッシ
ャー（Ｆｉｓｈｅｒ）のＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅ
ｖ．，２４：４５９（１９７２）；およびゴードン（Ｇ
ｏｒｄｏｎ）のＶｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．（Ｎ．Ｙ．）３
１：１０５（１９７３）を参照されたい（これらの文献
の記載内容は明細書の一部として引用される）。

【０００６】上記のとおり、ＥＰＯは一般に高いＥＰＯ
レベルを示す患者（例えば、再生不良性貧血や同様の症
状をもつ患者）からの尿を濃縮および精製することによ
り製造される。例えば、米国特許第４３９７８４０号；
同第４３０３６５０号；および同第３８６５８０１号の
各明細書を参照されたい（これらの特許の記載内容は明
細書の一部として引用される）。しかしながら、この種
の尿の供給量は限られているため、ＥＰＯの実際上の使
用は制限されている。このため、健康なヒトの尿からも
ＥＰＯ産物を得ることが非常に望ましい。しかしなが
ら、健康なヒトから採取した尿を使用する際の１つの問
題点は、そのＥＰＯ含有量が貧血患者の尿と比較して低
いということである。さらに、健康なヒトの尿は赤血球
形成に対して作用するいくつかの阻害因子を相当に高濃
度で含んでいるために、満足のゆく治療効果を得るには
高度精製後に得られるＥＰＯを使用しなければならない
と考えられる。

【０００７】ＥＰＯはヒツジの血漿から回収することも
でき、この種の血漿からＥＰＯを分離して満足すべき効
力を有し、安定な水溶性製剤が得られる。ゴールドバッ
サー（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ）のＣｏｎｔｒｏｌ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｄｉｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，パートＡ；
ｐ．４８７−４９４，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，ニューヨーク（１９８１）を参照されたい（各々
の文献については明細書の一部として引用される）。し
かしながら、ヒツジＥＰＯはヒトに対して抗原性がある
と予測される。以上に述べたとおり、ＥＰＯは有望な治
療薬剤であるにもかかわらず、天然供給源から通常の単
離／精製技術で大量生産することは困難である。

【０００８】スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ）らの米国特
許第４３７７５１３号明細書は、Ｎａｍａｌｗａ．ＢＡ
ＬＬ−１，ＮＡＬＬ−１，ＴＡＬＬ−１およびＪＢＬを
含めたヒトリンパ芽球細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖操作に
よるＥＰＯの大量生産方法を開示している。その他にも
遺伝子工学技術を用いるＥＰＯの生産に関する報告がな
されている（例えば、本出願の優先日後に国際公開され
たＷＯ８５／０２６１０号およびＷＯ８５／０３０７９
号を参照）。しかし、その生産技術の詳細や、その生産
物の化学的性質は未だに発表されていない。これとは対
照的に、本発明はヒトＥＰＯの生物学的性質を有するタ
ンパク質の大量生産を可能にする方法を提供するもので
ある。また、本発明の方法により、天然のヒトＥＰＯと
化学的に異なるかも知れないが類似の（場合によっては
改良された）性質を示すタンパク質を生産することも可
能となる。便宜上、ヒトＥＰＯの生物学的性質を示すこ
の種のタンパク質は、ヒトＥＰＯと化学的に完全同一で
ないものも含めて、本明細書中で以後ＥＰＯと総称す
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は驚くほど高いレ
ベルのヒトＥＰＯを発現する遺伝子のクローニング、そ
の発現組換えＤＮＡベクターおよび該組換えＤＮＡベク
ターで形質転換させて、活性ヒトＥＰＯをｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで大量に生産できる形質転換体に関する。

【００１０】以下でより詳細に説明するように、本発明
者らは先ず、再生不良性貧血患者の尿より部分精製され
た形で得られたＥＰＯを均一になるまでさらに精製し、
トリプシンで消化して特定のフラグメントを得た。これ
らのフラグメントを精製してそのアミノ酸配列を決定し
た。これらの配列に基づいてＥＰＯオリゴヌクレオチド
を推定し、そして合成した。合成したオリゴヌクレオチ
ドを使用してヒトゲノムライブラリーをスクリーニング
し、そのライブラリーからＥＰＯ遺伝子を単離した。

【００１１】単離されたものがＥＰＯ遺伝子であること
は、アミノ酸配列が決定された上記トリプシン消化タン
パク質フラグメントの多くに対応する事実に基づいて照
明された。さらに、単離された上記ゲノムクローンの一
断片を使用して、ハイブリダイゼーション法によりヒト
胎児（２０週目）ｍＲＮＡ中のＥＰＯ ｍＲＮＡを単離
し、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーを作成して、ゲ
ノムクローンの一断片から作成されたプローブでスクリ
ーニングした。７５０，０００以上の組換え体をスクリ
ーニングした後に３個のＥＰＯ ｃＤＮＡクローンが得
られた。これらのクローンのうち２つが、完全なコーデ
ィング配列および実質的な５−プライムおよび３−プラ
イム非翻訳配列を持つことから、全長のＥＰＯ ｃＤＮ
Ａであると決定された。これらのｃＤＮＡはＳＶ−４０
ウイルス由来のベクターに挿入し、このベクターで形質
転換したサル細胞〔ＣＯＳ−１細胞株；グラズマン（Ｇ
ｌｕｚｍａｎ），Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２（１
９８１）を参照〕およびチャイニーズハムスター卵巣細
胞〔ＣＨＯ細胞株；アーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．）
およびカーシン（Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．）のＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２
１６−４２８０（１９８０）を参照〕の両細胞内で発現
させた。ＣＯＳ細胞から生産されたＥＰＯおよびＣＨＯ
細胞から生産されたＥＰＯは共にｉｎ ｖｉｔｒｏおよ
びｉｎ ｖｉｖｏにおいて生物学的に活性なＥＰＯであ
る。

【００１２】クローン化されたＥＰＯ ｃＤＮＡは第３
表に示すようにコーディング領域の２０〜３０ヌクレオ
チド上流にイニシエーターおよびターミネーターを有す
る１４〜１５アミノ酸の興味あるオープン・リーディン
グ・フレームを有する。クローン化ＥＰＯ ｃＤＮＡで
トランスフェクションされた代表的な大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）サンプルは、メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションにブタペスト
条約に基づいて国際寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ ４０
１５３のもとに入手可能である。

【００１３】表の説明 第１表はヒトＥＰＯ遺伝子中の８７塩基対からなるエク
ソン部分の塩基配列を示すものであり；第２表はヒトＥ
ＰＯ ｃＤＮＡのクローンの一つラムダ−ＨＥＰＯＦＬ
１３のヌクレオチド配列から推定されたＥＰＯタンパク
質のアミノ酸配列を示し；第３表はラムダ−ＨＥＰＯＦ
Ｌ１３中のＥＰＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および
それから推定される第２表のものと同じアミノ酸配列を
示し；第４表は第４図に示すＥＰＯ遺伝子のｇＤＮＡ配
列を示し；第５表はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡクローン，ラ
ムダ−ＨＥＰＯＦＬ６中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列とそれから推定されるアミノ酸配列を示し；第６
表はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡクローン，ラムダ−ＨＥＰＯ
ＦＬ８中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示し；第７表は第３表と同
じもので、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡクローン，ラムダ−Ｈ
ＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列とアミノ酸配列を示し；第８表はＣＯＳ−１細胞で発
現したＥＰＯの定量試験の結果を示し；第９表はＣＯＳ
−１細胞から分泌されたＥＰＯの活性を示し；第１０表
はＣＨＯ細胞で発現したＥＰＯの定量試験の結果を示
し；第１１表はＣＨＯ細胞から分泌されたＥＰＯの活性
を示し；第１２表はエクソンＩからエクソンＶまでのＥ
ＰＯ遺伝子のｇＤＮＡ配列を示し；第１３表は開始コド
ン（ＡＴＧ）から終始コドン（ＴＧＡ）の直前のアミノ
酸（Ａｒｇ）をコードするＤＮＡまでのＥＰＯ遺伝子の
ｇＤＮＡ配列を示す。

【００１４】詳細な説明 本発明はヒトＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニングおよびｃ
ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現によるＥＰＯの生産に使
用する組換えＤＮＡベクターおよびその形質転換体に関
する。

【００１５】ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡは、次のようにして
得ることが可能である。なお、明細書中で使用する
（１）から（１７）の数字は、本明細書の終わりに番号
順に掲載した刊行物を意味する。

【００１６】ヒトＥＰＯのゲノムクローンの単離 先ずヒトＥＰＯを以下で説明するように再生不良性貧血
に悩む患者の尿等の材料から均一に精製する。この精製
ＥＰＯをタンパク質分解酵素トリプシンで完全消化して
フラグメントを得、これらのフラグメントを逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離し、勾配画分から回収し、
そして微量アミノ酸配列分析法にかける。この分析によ
り決定される各トリプシン消化フラグメントのアミノ酸
配列は、例えば第２表および第３表において下線が施さ
れた部分に相当する。これらのうち、適当なフラグメン
ト、好ましくはＶａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−ＬｙｓおよびＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを選んで、その配列に対
応するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。前者の
トリプシン消化フラグメントからは１７ヌクレオチド長
の３２種類のオリゴヌクレオチドプールと１８ヌクレオ
チド長の１２８種類のオリゴヌクレオチドプール、およ
び後者のトリプシン消化フラグメントからは各々１４ヌ
クレオチド長の４８種類の２つのプールがそれぞれ得ら
れる。これらのうちから、３２種類の１７オリゴヌクレ
オチド（以下ｍｅｒと略す）プールを使用してＣｈａｒ
ｏｎ４Ａ（Ｃｈ４Ａ）ベクター（３）中のヒトゲノムＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングする。なお、スクリ
ーニングはウー（Ｗｏｏ）およびオマレー（Ｏ’Ｍａｌ
ｌｅｙ）のｉｎ ｓｉｔｕ増幅法（１１）の変法を使用
できる。スクリーニング用のフィルター調製その他の詳
細は、実施例１で詳述する。

【００１７】１７ｍｅｒとハイブリダイズするファージ
を採取し、小グループ別にプールし、そしてプローブと
して１４ｍｅｒおよび１８ｍｅｒプールを使用してさら
に検索する。１７ｍｅｒおよび１４ｍｅｒプールとハイ
ブリダイズするファージをプラーク精製し、精製ファー
ジの塩基フラグメントをＭ１３ファージベクター中にサ
ブクローニングして、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）および
クールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）のジデオキシ・チェイン
・ターミネーション法（４）（１９７７）により塩基配
列を決定する。本発明者らが得た一つのクローン中の、
３２種類の１７ｍｅｒとハイブリダイズする領域の塩基
配列を第１表に示す。このＤＮＡ配列は、オープン・リ
ーディング・フレーム内に１７ｍｅｒプールのオリゴヌ
クレオチドを推論するのに使用したトリプシン消化フラ
グメントを正確にコードしうるヌクレオチドを含んでい
た。さらに、分析結果はこのＤＮＡ配列は、１７ｍｅｒ
とハイブリダイズする領域がスプライス受容部位と供与
部位（各々第１表中、ａおよびｄで示される）によって
境界される８７ｂｐのエクソン内に含まれることを示し
た。

【００１８】[表１] [表２] [表３］

【００１９】ＥＰＯ ｃＤＮＡクローンの単離 次に、上記で得られたＥＰＯのゲノムＤＮＡをプローブ
として、適当なヒトｃＤＮＡライブラリーからＥＰＯ
ｃＤＮＡを単離する。本発明者らの研究によれば、胎児
肝臓ｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡライブラリーが
この目的に最適であった。即ち、本発明者らは、第１表
に示す８７ｂｐエクソン部分を含む前記Ｍ１３クローン
から９５ヌクレオチド一本鎖を調製し、これをプローブ
として用いて、ヒト胎児（２０週目）肝臓ｍＲＮＡのノ
ーザン分析（１５）を行った。第１図に示すように、強
いシグナルが胎児肝臓ｍＲＮＡ中に検出された。そこで
同じプローブを使って胎児肝臓ｍＲＮＡからバクテリオ
ファージラムダ中に作られたｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングしたところ（５）、スクリーニングした２
５０，０００個の組換え体当たり約１個の陽性クローン
の頻度で、数個のハイブリダイズするクローンが得られ
た。これらのｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ
１３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８と命名した）の完全
なヌクレオチド配列およびそれから推定されたアミノ酸
配列を第３表と第６表に示す。ＥＰＯコーディング情報
は非常に疎水性の２７個のアミノ酸からなるリーダー部
分と１６６個のアミノ酸からなるマチュア部分を含むｃ
ＤＮＡの５−プライム側半分の５９４ヌクレオチド内に
含まれる。なお、マチュアタンパク質のＮ末端の推定
は、ゴールドバッサー（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ）
（６）、スー（Ｓｕｅ）およびシトコフスキー（Ｓｙｔ
ｋｏｗｓｋｉ）（７）、およびヤナガワ（Ｙａｎａｇａ
ｗａ）（２）により発表された結果、または本発明者ら
が別に決定した再生不良性貧血患者の尿中に排泄された
タンパク質のＮ末端配列に基づいた。このＮ末端（Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ──）が循環中のＥＰＯに
見られる実際のＮ末端であるのかどうか、または腎臓や
尿中でいくつかの切断が起こるのかどうか今のところ不
明である。

【００２０】第２表および第３表で下線を施したアミノ
酸配列は、タンパク質配列情報が得られたトリプシン消
化フラグメントまたはＮ末端の部分を示す。クローン化
されたｃＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列は、ア
ミノ酸配列が決定されたトリプシン消化フラグメントと
正確に一致し、単離されたｃＤＮＡはヒトＥＰＯをコー
ドすることが確かめられた。

【００２１】ヒトＥＰＯ遺伝子の構造および塩基配列 Ｃｈ４Ａベクター（３）に組込まれたヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーを作製し、先に得られた２種類のＥＰＯ
ｃＤＮＡクローンから調製されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ及び他の種々のプローブを用いてハイブリダイゼ
ーション分析を行った。この分析により４個の独立した
ヒトＥＰＯゲノムクローン（ｇＤＮＡ）を得、またこれ
らクローンのＤＮＡ挿入物の相対位置を確認して第３図
に示した。第３図に黒い線で示される約３．３ｋｂ領域
内にＥＰＯ遺伝子が存在することが示されている。この
領域の完全な塩基配列分析（実施例４を参照）およびｃ
ＤＮＡクローンとの比較から、第３図下部に示されるＥ
ＰＯ遺伝子のイントロンおよびエクソン構造の地図を描
くことができた。ＥＰＯ遺伝子は５個のエクソンに分割
される。エクソンＩの一部、エクソンＩＩ、ＩＩＩおよ
びＩＶの全部、およびエクソンＶの一部がタンパク質コ
ーディング情報を含む。エクソンＩおよびＶの残部はそ
れぞれ５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列をコ
ードする。こうして得られるクローン（本明細書中では
ラムダ−ＨＥＰＯ１およびラムダ−ＨＥＰＯ２と呼ぶ２
つのクローンが得られた）が完全なＥＰＯゲノムクロー
ンであるということは、他のトリプシン消化フラグメン
トのコーディング情報を含んだ別のエクソンの塩基配列
を決定することにより確認できた。

【００２２】ＣＯＳ細胞によるＥＰＯの発現 本発明は、単離されたＥＰＯ ｃＤＮＡを含む組換えＤ
ＮＡベクターを調製しそれを用いて哺乳動物細胞を形質
転換させ、そして活性なＥＰＯを生産する方法も提供す
る。得られたｃＤＮＡが生物学的に活性なＥＰＯをｉｎ
ｖｉｔｒｏ細胞培養系において発現し得ることを確認
するためには、Ｇｌｕｚｍａｎの方法でＣＯＳ細胞の形
質発現実験を行う（１６）。この試験的発現に使用可能
なベクターｐ９１０２３（Ｂ）は実施例５に示される。
このベクターはアデノウイルス主要後期プロモーター
（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４
０ポリＡ付加配列、ＳＶ４０複製開始点、ＳＶ４０エン
ハンサー、およびアデノウイルスＶＡ遺伝子を含む。前
記ｃＤＮＡクローン、例えばラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３
（第７表を参照）中のｃＤＮＡ挿入物をｐ９１０２３
（Ｂ）ベクター内のアデノウイルス主要後期プロモータ
ーの下に連結挿入する。本発明者らは、このようにして
得られた新しいベクターをｐＰＴＦＬ１３と命名した。

【００２３】こうして構築されたベクターで、例えばＣ
ＯＳ−１細胞のＭ６株〔ホロビッツ（Ｈｏｒｏｗｉｔ
ｚ）らのＪ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１４
７−１４９（１９８３）を参照〕をトランスフェクショ
ンし、約２４時間後に細胞を洗浄し、無血清培地に変
え、そして約４８時間後に培養上清を集める。そして、
培養上清中に放出されたＥＰＯの量をＥＰＯに関するＳ
ｈｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｂ．らの定量的ラジオイムノアッ
セイを用いて試験する（１４）。この方法によれば、第
８表（実施例６）に示すように、免疫学的に反応性を有
するＥＰＯの発現が検出される。生産されたＥＰＯの生
物学的活性も試験できる。例えば、本発明者らは培地中
のＥＰＯを２つのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ〔 ³
Ｈ−チミジンおよびＣＦＵ−Ｅ（１，８）〕および２つ
のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ〔低酸素性マウスおよび飢餓
ラット（９，１０）〕により定量化した（実施例７の第
９表を参照）。これらの結果は、生物学的に活性なＥＰ
ＯがＣＯＳ−１細胞で生産されることを示している。

【００２４】本発明の方法で生産されたＥＰＯがヒト尿
から得られた天然ＥＰＯと同じものであることは、ポリ
クローナル抗ＥＰＯ抗体を使用するウエスターンブロッ
ティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によ
り、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で同じ移動度を
有していることから証明された（実施例８を参照）。従
って、ＣＯＳ−１細胞で生産されたＥＰＯのグリコシル
化の程度は天然ＥＰＯのそれと同様でありうる。

【００２５】本発明はまた、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡの発
現のために特に好適な、他のプロモーターを含む異なる
ベクターを使用した、極めて効率的なＥＰＯの生産法も
開示する。そのようなベクターは、ＣＯＳ細胞もしくは
他の哺乳動物細胞において使用することができる。本発
明の実施に有用なこの種の他のプロモーターの例にはＳ
Ｖ４０初期および後期プロモーター、マウスメタロチオ
ネイン遺伝子プロモーター、トリまたは哺乳動物レトロ
ウイルスの長い末端繰返し配列中に見出されるプロモー
ター、バキュロウイルスポリヘドロン遺伝子プロモータ
ーおよびその他のものが含まれる。本発明の実施に際し
て有用な他の細胞の例にはＣＨＯ（チャイニーズハムス
ター卵巣）、Ｃ１２７（サル上皮）、３Ｔ３（マウス線
維芽細胞）、ＣＶ−１（アフリカン・グリーン・モンキ
ー腎臓）のような哺乳動物細胞が含まれる。このように
本発明の形質転換体は、哺乳動物細胞を用いる。これは
大腸菌等の微生物に比べＥＰＯが細胞外へ分泌されるた
めＥＰＯの精製が容易であること、また生物的活性に寄
与する糖鎖が付加するという利点があるためである。こ
れらの特定のプロモーターおよび／または細胞はＥＰＯ
の発現タイミングや発現レベルの調節、細胞に特異的な
型のＥＰＯの生産、または比較的費用がかからず容易に
制御できる条件下でのＥＰＯ生産細胞の大量増殖を可能
にしうる。細胞培養培地は一般に栄養素塩類溶液と１０
％ウシ胎児血清である。

【００２６】ＣＨＯ，Ｃ１２７および３Ｔ３によるＥＰ
Ｏ発現の例は実施例１０および１１（ＣＨＯ）ならびに
１３（Ｃ１２７と３Ｔ３）に示される。

【００２７】実施例１１のようにＣＨＯ細胞により生産
された組換えＥＰＯは慣用のカラムクロマトグラフィー
法により精製した。糖タンパク質中に存在する糖の相対
量は、２つの独立した方法〔（Ｉ）レインホールド（Ｒ
ｅｉｎｈｏｌｄ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．５０：２４４−２４９−（メタノリシス）および
（ＩＩ）タケモト（Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｈ．）らのＡｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４５：２４５（１９８５）
（独立したシアル酸測定を伴うピリジルアミノ化）〕で
分析された。これらの方法のそれぞれによって得られた
結果は申し分なく一致した。こうして、いくつかの測定
が行われて次の平均値を得た（この場合比較目的のため
に、Ｎ−アセチルグルコサミンを１とする）。糖 相対モル量 Ｎ−アセチルグルコサミン １ ヘキソース類： １．４ ガラクトース ０．９ マンノース ０．５ Ｎ−アセチルノイラミン酸 １＊ フコース ０．２ Ｎ−アセチルガラクトサミン ０．１ ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸は不安定であり、その値は
約０．４〜約１の範囲で変動する。 両方の独立した糖分析法によって有意量のフコースとＮ
−アセチルガラクトサミンが再現可能に観察されたこと
は注目に値する。Ｎ−アセチルガラクトサミンの存在は
タンパク質におけるＯ−結合グリコシル化の存在を示
す。Ｏ−結合グリコシル化の存在はさらに種々の組合せ
のグリコシド酵素による糖タンパク質の消化後のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析によっても示された。特に、酵素ペプタ
イド、Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、糖タンパク質
の全てのＮ−結合炭水化物を酵素的に除去した後、さら
に、ノイラミニダーゼ消化を行うとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析で測定したそのタンパク質の分子量はさらに減少し
た。

【００２８】精製された組換えＥＰＯのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ生物学的活性は、アミノ酸組成のデータに基づいて計
算されたタンパク質定量値を使用するクリスタル（Ｇ．
Ｋｒｙｓｔａｌ）のＥｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：
６４９（１９８３）に記載の方法（脾臓細胞増殖バイオ
アッセイ）により検定した。複数の測定において、精製
組換えＥＰＯのｉｎ ｖｉｔｒｏ比活性は２００，００
０単位／ｍｇタンパク質以上であると計算された。平均
値は約２７５，０００〜３００，０００単位／ｍｇタン
パク質の範囲であった。さらに、３００，０００以上の
値も観察された。この組換え物質に対して観察されたｉ
ｎ ｖｉｖｏ〔赤血球増加マウス検定；カザール（Ｋａ
ｚａｌ）およびアースレブ（Ｅｒｓｌｅｖ）のＡｍ．Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．Ｂ，ｐ９
１（１９７５）を参照〕／ｉｎｖｉｔｒｏ活性比は０．
７〜１．３であった。

【００２９】先に示した糖タンパク質の特性と、本出願
の優先日より後の国際公開ＷＯ８５／０２６１０（１９
８５年６月２０日付）〔特表昭６１−５０１６２７（１
９８６年８月７日付）〕に記載されている組換えＣＨＯ
生産ＥＰＯ物質の特性とを比較することは興味のあるこ
とである。上記公表公報明細書の第２６ページ左下欄に
記載されている対応する糖の比較分析は、Ｎ−アセチル
グルコサミン１に対してフコースおよびＮ−アセチルガ
ラクトサミンは、ゼロの値を、そしてヘキソース類は１
５．０９と大きな値を報告している。Ｎ−アセチルガラ
クトサミンの不在は上記国際出願に報告された糖タンパ
ク質中にＯ−結合グリコシルが存在しないことを示す。
この物質と対照的に、本発明の組換えＣＨＯ生産ＥＰＯ
は先に性状決定がなされたように、再現可能に観察しう
る有意量のフコースとＮ−アセチルガラクトサミンの双
方を含み、ヘキソース類は相対量として１／１０以下で
あり、そしてＯ−結合グリコシルの存在によって差異が
あり、本発明で得られるＥＰＯはヒト尿から得られるＥ
ＰＯと同一か近似のグリコシル化パターンを有する。さ
らに、本発明の上記ＣＨＯ細胞由来組換えＥＰＯの高い
比活性はそのグリコシル化パターンと直接関連している
と考えられる。

【００３０】本発明のクローン化ＥＰＯ遺伝子の哺乳動
物細胞発現により生産された生物学的に活性なＥＰＯ
は、医師や獣医師によるヒトおよび哺乳動物種のｉｎ
ｖｉｖｏ治療に使用できる。活性成分の量はもちろん治
療しようとする症状の程度、選ばれた投与経路、および
活性ＥＰＯの比活性に依るであろうが、最終的には主治
医や獣医により決定されるだろう。主治医によって決定
された活性ＥＰＯのこのような量は、本明細書中で、
“ＥＰＯの治療有効”量と呼ばれる。例えば、ヒツジに
おける慢性腎不全に伴う増殖低下性貧血の治療におい
て、ＥＰＯの一日の有効量は１５〜４０日の間１０単位
／ｋｇであることがわかった。エッシュバッハ（Ｅｓｃ
ｈｂａｃｈ）らのＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：
４３４（１９８４）を参照されたい。

【００３１】活性ＥＰＯは治療しようとする症状に適す
る経路で投与される。好ましくは、ＥＰＯは治療される
べき哺乳動物の血流中に注射される。好適な投与経路は
治療しようとする症状ごとに変化する。

【００３２】活性ＥＰＯは純粋な又は実質的に純粋な化
合物として投与することができるが、医薬配合物または
医薬製剤としてそれを提供することが好ましい。本発明
を使用して得られる配合物は、上記のような活性ＥＰＯ
タンパク質のほかに、１種または２種以上の薬剤上許容
される担体と他の治療成分を含有する。担体は配合物の
他の成分と共存でき且つそれを投与される者に有害であ
ってはならない。望ましくは、配合物としては酸化剤や
ペプチドと共存できないような他の物質を含むべきでな
い。配合物は簡便には単位投与形態（ｕｎｉｔ ｄｏｓ
ａｇｅ ｆｏｒｍ）で提供され、薬剤学上よく知られた
方法により調製される。全ての方法は活性成分と１種ま
たは２種以上の補助成分を含む担体とを混合する工程を
含む。一般に、配合物は活性成分と液体担体または微細
な固体担体またはその両者とを均一にかつ緊密に混合
し、その後必要に応じてその生成物を所望配合物へ成形
することにより作られる。

【００３３】非経口投与に適する配合物は簡便には活性
成分の滅菌水溶液からなり、その際その溶液は受容者の
血液と等張であるのが好ましい。この種の配合物は固体
活性成分を水に溶解して水溶液をつくり、その水溶液を
滅菌することにより適宜調製され、そして例えば密封ア
ンプルやバイアルのような単位用量容器または多用量容
器で提供される。

【００３４】本発明で哺乳動物細胞にヒトＥＰＯを生産
させるために使用されるＥＰＯ／ｃＤＮＡにはＡＴＧコ
ドンの後につながるマチュアＥＰＯ／ｃＤＮＡ遺伝子、
およびＥＰＯタンパク質の対立遺伝子変異体をコードす
るＥＰＯ／ｃＤＮＡが含まれる。１つの対立遺伝子は第
３〜６表に示される。ＥＰＯタンパク質にはＥＰＯタン
パク質の１−メチオニン誘導体（Ｍｅｔ−ＥＰＯ）およ
びＥＰＯタンパク質の対立遺伝子変異体が含まれる。マ
チュアＥＰＯタンパク質は第２表の配列Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ──から始まる配列（最初のアミノ酸
残基には番号１（第２表）が付されている）によって示
される。Ｍｅｔ−ＥＰＯは配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ──から始まる。

【００３５】ＥＰＯ／ｃＤＮＡの発現の結果生成する糖
タンパク質は、形質転換体内または発現系外に存在する
タンパク質分解酵素の作用を受けることが充分考えら
れ、ＤＮＡ配列から読みとられるアミノ酸配列１〜１６
６のすべてを備えていないことがあり得る。例えばＣ末
Ａｒｇの脱離が、ＣＨＯ発現ＥＰＯについて見出されて
いる。しかし、この種の糖タンパク質もｉｎ ｖｉｖｏ
活性を有しており、本発明を使用して得られる目的物に
含まれる。なお、Ｃ末Ａｒｇの脱離はヒト尿ＥＰＯにつ
いても見出されており、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が保持され
ていることが確認されている。

【００３６】次の実施例は本発明を理解しやすくするた
めのものであり、本発明の真の範囲は請求の範囲によっ
て説明される。ここに記載の方法において多くの修飾が
本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることを理
解すべきである。全ての温度は℃で表わされ未補正であ
る。マイクロリッター、マイクロモル等に於けるマイク
ロの略号として「μ」を用い、それぞれ「μｌ」，「μ
ｍ」として表わす。

【００３７】実 施 例 実施例１：ＥＰＯのゲノムＤＮＡ断片クローンの単離 ＥＰＯのゲノムＤＮＡを単離するには、ヒトゲノムＤＮ
Ａライブラリーから、適当なヌクレオチドプローブを用
いてスクリーニングする必要がある。そのプローブの配
列は、ＥＰＯのアミノ酸配列の少なくとも一部分に対応
するものでなければならない。そこで、まず、ＥＰＯを
再生不良性貧血患者の尿からミヤケらの方法〔ミヤケ
（Ｍｉｙａｋｅ）らのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５
２：５５５８（１９７７）を参照〕で精製したが、但し
フェノール処理を省略しその代わりに８０℃で５分の熱
処理を行ってノイラミニダーゼを失活させた。精製の最
終工程は、０．１％トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）を含む
０〜９５％アセトニトリル勾配を１００分間で使用する
Ｃ−４Ｖｙｄａｃ ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅ Ｓｅｐａ
ｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）での分画化により行っ
た。上記勾配中のＥＰＯの位置は、主要ピークのゲル電
気泳動およびＮ末端アミノ酸配列分析（２，６，７）に
より測定した。ＥＰＯは約５３％アセトニトリルで溶離
され、逆相ＨＰＬＣにかけたタンパク質の約４０％に相
当した。ＥＰＯを含む画分を次いで１００μｌになるま
で蒸発させ、重炭酸アンモニウムでｐＨ７．０に調節
し、２％トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン
（ＴＰＣＫ）処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏ
ｎ）により３７℃で１８時間完全消化した。その後、ト
リプシン消化物を上記と同様の逆相ＨＰＬＣにかけた。
２８０ｎｍおよび２１４ｎｍでの光学密度を監視した。
十分に分離した各ピークの成分を乾固状態近くにまで蒸
発させ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４８
０Ａ型気相シークエネーターを使って直接Ｎ末端アミノ
酸配列分析（１７）にかけた。各ピークの成分は第２表
および第３表において下線が施されているアミノ酸配列
を有することが判明した。

【００３８】先に述べたように、これらのトリプシン消
化フラグメントのうち２つがヌクレオチドプローブの合
成用に選ばれた。配列：Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（第２表および第３表のア
ミノ酸４６〜５２）からは、３２種類（縮重）の１７ｍ
ｅｒ および１２８種類の（縮重）の１８ｍｅｒ が合成された。配列：Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（第２表および第３表のアミ
ノ酸１４４〜１５０）からは、ロイシンコドンの第１位
で異なるそれぞれ４８種類（縮重）の２つの１４ｍｅｒ
プール ＴＴＣＮ Ｔ Ｔ ＴＴＣＮ Ｔ Ｔ ＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＴＣＣＴ ＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＴＣＴＴ Ｃ Ｃ が合成された。これらのオリゴヌクレオチドプローブを
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）およびガンマ³²Ｐ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いて³²Ｐで５−
プライム末端を標識した。オリゴヌクレオチドの比活性
はオリゴヌクレオチド１ミリモル当り１０００〜３００
０Ｃｉであった。この標識プローブを使用して、バクテ
リオファージラムダ中のヒトゲノムＤＮＡ（ヒト染色体
をＨａｅＩＩＩ／ＡｌｕＩで切断したＤＮＡ断片）ライ
ブラリー（Ｃｈ４Ａベクター使用）（ローン（Ｌａｗ
ｎ）ら，３）をウー（Ｗｏｏ）ら、（１１）（１９７
８）によるｉｎ ｓｉｔｕ増幅法の変法を用いてスクリ
ーニングした。即ち、ヒトゲノムＤＮＡを含む上記ファ
ージ約３．５×１０⁵ を１５０ｍｍペトリ皿（ＮＺＣＹ
Ｍ培地）当り６０００ファージの密度でまいて、肉眼で
見える小さな（約０．５ｍｍ）プラークが形成されるま
で３７℃でインキュベートした。４℃で１時間冷却後、
プラークパターンの２通りのレプリカをナイロン膜（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）に移行させ、
新しいＮＺＣＹＭ平板上３７℃で一晩インキュベートし
た。その後、フィルターをそれぞれ０．５Ｎ ＮａＯＨ
−１Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍトリス（ｐＨ８）−１
Ｍ ＮａＣｌの薄膜上で１０分間ずつ処理することによ
り変性および中和した。フィルターを８０℃で２時間真
空ベーキングした後、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１
時間洗い、フィルター表面の細胞破砕物を湿ったティッ
シュで穏やかにかき取ることにより除去した。このかき
取りはプローブのフィルターへのバックグラウンド結合
を減少させた。次に、フィルターをＨ₂ Ｏですすぎ、３
Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）、１０
ｍＭ ＮａＰＯ₄（ｐＨ６．８）、５×Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳおよび１０ｍＭＥＤＴＡ中４８
℃で４〜８時間プレハイブリダイゼーションを行った。
その後、³²Ｐ−標識１７ｍｅｒを０．１ｐｍｏｌ／ｍｌ
の濃度で加えて４８℃で７２時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターを
２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ−０．０３Ｍクエン酸
Ｎａ，ｐＨ７）で室温にて十分に洗浄し、さらに３Ｍ
ＴＭＡＣｌ−１０ｍＭ ＮａＰＯ₄ （ｐＨ６．８）で室
温にて１時間、次にハイブリダイゼーションを行った時
と同じ温度（４８℃）で５〜１５分間洗浄した。増感板
を使用した２日間のオートラジオグラフィー後、約１２
０の強いレプリカされたシグナルが検出された。

【００３９】陽性ファージを拾って８プールに分け、再
度ファージプラークを形成させ、２枚のフィルターの各
々に対して１４ｍｅｒプールの１／２ずつを使用し、２
枚目のフィルターに対しては１７ｍｅｒを使用して３通
りの再スクリーニングを行った。プラーク形成およびハ
イブリダイゼーションの条件は先に述べた通りである
が、１４ｍｅｒについてのハイブリダイゼーションは３
７℃で行った。オートラジオグラフィー後、室温にて２
０分間５０％ホルムアミド中で１７ｍｅｒフィルターか
らプローブを除去し、そのフィルターを５２℃で１８ｍ
ｅｒプローブと再度ハイブリダイズさせた。２つの独立
のファージが３種のプローブ全部とハイブリダイズし
た。これらのファージの１つ（本明細書ではランダム−
ＨＥＰＯ１と呼ぶ）からのＤＮＡをＳａｕ３Ａで完全消
化し、Ｍ１３中でサブクローニングし、サンガーおよび
クールソン、（４）のジデオキシ・チェイン・ターミネ
ーション法によるＤＮＡ配列分析のためにＭ１３という
ベクター（市販品）に組込み、大腸菌に挿入し、増殖さ
せた。ＥＰＯトリプシン消化フラグメント（第１表下線
領域）をコードするオープン・リーディング・フレーム
のヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を本明
細書中第１表に示す。イントロン配列は小文字で表わさ
れ、エクソン配列（８７ヌクレオチド）は大文字で表わ
される。コンセンサススプライス受容部位（ａ）および
供与部位（ｄ）と一致する配列には下線が施されてい
る。第１表の配列は、そのまゝ第４表の配列の一部を構
成している。

【００４０】実施例２：ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのノーザ
ン分析 本実施例では上記ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのライブラリー
を作成し、このライブラリー中に目的とするｍＲＮＡが
存在することを確認し、またそのｍＲＮＡのおよそのサ
イズを測定することを目的としている。なおヒト胎児肝
臓ｍＲＮＡライブラリーは、２０週目のヒト胎児肝臓か
ら常法により全ＲＮＡを取り出し［チャーグウィン（Ｃ
ｈａｉｒｇｗｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８：５２９４（１９７９）］、次いでオリゴｄＴセルロ
ースカラムを用いてｍＲＮＡを分離、抽出して調製した
ものである。

【００４１】５μｇのヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラリ
ー（２０週目の胎児肝臓から調製したもの）および成人
肝臓ｍＲＮＡライブラリーを０．８％アガロースホルム
アルデヒドゲルによる電気泳動に付し、ダーマン（Ｄｅ
ｒｍａｎ）らのＣｅｌｌ，２３：７３１（１９８１）に
記載の方法を用いてニトロセルロースに移行させた。こ
れと別に、第１表に示す配列を挿入物中に含むＭ１３テ
ンプレートから、ノーザン分析用の９５ヌクレオチド一
本鎖プローブを作成した。その際、プライマーとしては
初めの１７ｍｅｒプローブと同じトリプシン消化フラグ
メントから誘導された２０ｍｅｒのものを使用した。プ
ローブはアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らのＰＮＡ
Ｓ，（１２）（１９８４）に記載された方法で作成した
が、ＳｍａＩ消化（７４ヌクレオチドのコーディング配
列を含む９５ヌクレオチド長の目的プローブをもたら
す）後、０．１Ｍ ＮａＯＨ−０．２Ｍ ＮａＣｌ中セ
ファロースＣ１４Ｂカラムでのクロマトグラフィーによ
りその９５ｍｅｒの小さなフラグメントをＭ１３テンプ
レートから精製した。なお、この９５ヌクレオチド一本
鎖プローブの構造は、次記のとおりである。 gggctgtgtgcatttcagACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATAT CACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAA このプローブ約５×１０⁶ ｃｐｍを、上記ニトロセルロ
ースフィルターと６８℃で１２時間ハイブリダイズさ
せ、６８℃にて２×ＳＳＣで洗浄し、増感板を用いて６
日間感光させた。１２００ヌクレオチドの単一のマーカ
ーｍＲＮＡ（矢印で示す）は隣接レーンで泳動させた。
（第１図）

【００４２】その結果、ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラ
リー中に、プローブとハイブリダイズする一本のバンド
が見出された。

【００４３】実施例３：胎児肝臓ｃＤＮＡの単離 前記ノーザン分析の結果、胎児肝臓のｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。なお、このｃＤＮＡライ
ブラリーは次の手順によって調製した。すなわち、ヒト
胎児肝臓より常法によって分離、抽出したｍＲＮＡか
ら、逆転写酵素でｃＤＮＡを作製し、次いでＤＮＡポリ
メラーゼにより２重鎖とした。この２重鎖ｃＤＮＡをベ
クター、ラムダ−Ｃｈ２１Ａに組込んでｃＤＮＡライブ
ラリーを調製した。この中からスクリーニングを行え
ば、ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡが単離できると予測された。
そこで、実施例２に記載のプローブと同じ９５ｍｅｒの
プローブを使用し、そして標準プラークスクリーニング
〔ベントン・デービス（Ｂｅｎｔｏｎ Ｄａｖｉｓ）の
Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１３）（１９７７）を参照〕方法を
使用して、胎児肝臓ｍＲＮＡ誘導され、ベクターラムダ
−Ｃｈ２１Ａ〔トール（Ｔｏｏｌｅ）らのＮａｔｕｒ
ｅ，（５）（１９８４）を参照〕中に作られた胎児肝臓
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結
果、１×１０⁶ 個のプラークをスクリーニングした後に
３つの独立の陽性ｃＤＮＡクローン〔本明細書ではラム
ダ−ＨＥＰＯＦＬ６（１３５０ｂｐ）、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ８（７００ｂｐ）およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１
３（１４００ｂｐ）と呼ぶ〕を単離した。ラムダ−ＨＥ
ＰＯＦＬ１３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ６の完全挿入
物についてはＭ１３でのサブクローニング後に塩基配列
を決定した。それぞれの塩基配列を第７表および第５表
に示す。ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８についても部分的に塩
基配列を決定し、残りの部分は他の２つのクローンと同
じであると推定した。その塩基配列を第６表に示す。５
−プライムおよび３−プライム非翻訳配列は小文字で表
わされる。コーディング領域は大文字で表わされる。

【００４４】［表５］ ［表６］ ［表７］

【００４５】第７表（および第３表）に関して、ヌクレ
オチド配列の上に示される推定上のアミノ酸配列は成熟
タンパク質の第１番目のアミノ酸を１として番号が付け
られている。推定上のリーダーペプチドはアミノ酸の略
号が大文字で示される。成熟タンパク質中のシステイン
残基はさらにＳＨで示され、またＮ−結合グリコシル化
の可能性がある部位は星印で示される。下線が施されて
いるアミノ酸は、Ｎ末端タンパク質配列決定または実施
例１で述べたようなＥＰＯのトリプシン消化フラグメン
トの配列決定による同定されたアミノ酸残基を示す。点
線は明確に決定し得なかったトリプシン消化フラグメン
トのアミノ酸配列中の残基を示す。ｃＤＮＡクローンの
ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ６、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８およ
びラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３はメリーランド州ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ブタペスト条約に基づいて国際寄託され、それぞれ寄託
番号ＡＴＣＣ ４０１５６，ＡＴＣＣ ４０１５２およ
びＡＴＣＣ ４０１５３として入手可能である。

【００４６】実施例４：ＥＰＯ遺伝子のゲノム構造 本発明者等はＥＰＯゲノムＤＮＡの構造および塩基配列
も明らかにした。実施例３で得た３種類のＥＰＯ ｃＤ
ＮＡクローンから調製されたオリゴヌクレオチドおよび
実施例２で使用した９５ヌクレオチド一本鎖プローブを
用いて、ヒトゲノムＨａｅＩＩＩ／ＡｌｕＩライブラリ
ー（ＣｈＡ４ベクター使用）のスクリーニングを行い、
４個の独立したゲノムクローンを得た。なお、ヒトゲノ
ムＨａｅＩＩＩ／ＡｌｕＩライブラリーは、ヒト胎児肝
臓由来のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩとＡｌｕＩで部
分切断し、約１５〜２０ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、次
いでバクテリオファージラムダクローニングベクターで
あるＣｈ４Ａベクターに組込んで作製したものである。
なお、このライブラリーは実施例１で調製したものと同
じである。これら４個の独立したゲノムクローン（ラム
ダ−ＨＥＰＯ１，２，３および６）の相対的な大きさお
よび位置は、第３図において重複する線によって示され
ることが判明している。太くて濃い３．３ｋｂの線がＥ
ＰＯ遺伝子の存在する部分である。既知制限エンドヌク
レアーゼ切断部位の位置とスケール（ｋｂ）も示されて
いる。次に、ＥＰＯ遺伝子を含む領域は、この領域の一
連の欠失を生じさせる特異的エキソヌクレアーゼＩＩＩ
を使用して、両鎖から完全に塩基配列が決定された。Ｅ
ＰＯ ｍＲＮＡをコードする５つのエクソンとイントロ
ンの構造の模式図を第３図下部に示す。エクソンＩの正
確な５−プライム境界は今のところ不明である。それぞ
れのエクソンのタンパク質コーディング部分は黒く塗り
つぶされている（この領域の完全なヌクレオチド配列は
既に第４表に示した）。第３図下部において、各エクソ
ンの既知範囲は垂直線で示される。エクソンＩの一部、
エクソンＩＩ，ＩＩＩおよびＩＶの全部、およびエクソ
ンＶの一部がタンパク質コーディング情報を含む。エク
ソンＩおよびＶの残部はそれぞれ５−プライムおよび３
−プライム非翻訳配列をコードする。ゲノムクローンの
ラムダ−ＨＥＰＯ１、ラムダ−ＨＥＰＯ２、ラムダ−Ｈ
ＥＰＯ３およびラムダ−ＨＥＰＯ６はメリーランド州ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンにブタペスト条約に基づいて国際寄託され、それぞ
れ寄託番号ＡＴＣＣ４０１５４，ＡＴＣＣ ４０１５
５，ＡＴＣＣ ４０１５０およびＡＴＣＣ ４０１５１
として入手可能である。

【００４７】［表４］ ［表１２］ ［表１３］

【００４８】実施例５：ベクターｐ９１０２３（Ｂ）の
作成 形質転換用ベクターとしてカウフマン（Ｋａｕｆｍａ
ｎ）らのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３０４
（１９８２）に記載のｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）を
用いた。このベクターの構造は第４図に示す。簡単に述
べれば、このプラスミドはアデノウイルス（Ａｄ２）主
要後期プロモーターの転写制御下にあるマウスジヒドロ
葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。５−
プライムスプライス部位はアデノウイルスＤＮＡ中に示
され、３−プライムスプライス部位（免疫グロブリン遺
伝子から誘導される）はＡｄ２主要後期プロモーター
（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＤＨＦ
Ｒコーディング配列の間に存在する。ＳＶ４０初期ポリ
Ａ部位はＤＨＦＲコーディング配列から下流に存在す
る。ｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）の原核生物由来部分
はｐＳＶＯｄ〔メロン（Ｍｅｌｌｏｎ）らのＣｅｌｌ，
２７：２７９（１９８１）を参照〕から由来し、哺乳動
物細胞内で複製を阻害することが知られているｐＢＲ３
２２配列を含まない〔ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）らのＮａ
ｔｕｒｅ，２９３：７９（１９８１）を参照〕。

【００４９】ｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）は第４図お
よび第６図に示すようにプラスミドｐＣＶＳＶＬ２へ変
換した。ｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）はその中の２個
のＰｓｔＩ部位の一方を欠失させることによりプラスミ
ドｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）に変換した。こ
の変換は１個のＰｓｔＩ部位のみが切断された線状プラ
スミドのサブ集団を得るために酵素活性を弱めたＰｓｔ
Ｉで部分消化し、続いてクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処
理し、連結して環状化し、そしてＳＶ４０のポリＡ配列
の３−プライム側に位置するＰｓｔＩ部位の欠失につい
てスクリーニングすることにより達成された。次いで、
ｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）に、以下のように
してアデノウイルス３分節系（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）
リーダーおよびウイルス関連遺伝子（ＶＡ遺伝子）を挿
入した。即ち、最初に、ｐＡｄＤ ２６ＳＶｐＡ（３）
（ｄ）をＰｖｕＩＩで切断して、３分節系リーダーから
なる３つの要素の３−プライム部分内で開環した線状分
子を作った。次に、ｐＪＡＷ４３〔ゼイン（Ｚａｉｎ）
らのＣｅｌｌ，１６：８５１（１９７９）を参照〕をＸ
ｈｏｌで消化し、クレノウで処理し、ＰｖｕＩＩで消化
し、そして第３番目のリーダーの第２部分を含む１４０
ｂｐフラグメントをアクリルアミドゲル（トリス−ホウ
酸緩衝液中６％；マニアチスらの上記文献参照）による
電気泳動により単離した。その後、この１４０ｂｐフラ
グメントをＰｖｕＩＩで消化したｐＡｄＤ ２６ＳＶｐ
Ａ（３）（ｄ）へ連結した。この連結生成物を用いて大
腸菌をテトラサイクリン耐性へと形質転換し、１４０ｂ
ｐフラグメントとハイブリダイズする³²Ｐ標識プローブ
を使用するグルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）−ホ
グネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）法によりコロニーを選択し
た。ポジティブにハイブリダイズするコロニーからＤＮ
Ａを調製して、再構成されたＰｖｕＩＩ部位が第２およ
び第３アデノウイルス後期リーダーに特異的な１４０ｂ
ｐＤＮＡ挿入物の５−プライム側にあるかあるいは３−
プライム側にあるかについて試験した。正しい向きのＰ
ｖｕＩＩ部位は１４０ｂｐ挿入物の５−プライム側に存
在する。このプラスミドは第５図にｐＴＰＬとして示さ
れる。

【００５０】次に、ｐＴＰＬにＳＶ４０エンハンサーを
含むＳＶ４０のＡｖａＩＩＤフラグメントを挿入するた
め、第６図に示すようにＳＶ４０ ＤＮＡをＡｖａＩＩ
で消化し、ＰｏｌＩのクレノウフラグメントで両末端を
平滑にし、これらのフラグメントにＸｈｏＩリンカーを
連結し、ＸｈｏＩで消化してＸｈｏＩ部位を開き、そし
てゲル電気泳動で４番目に大きいフラグメント（Ｄフラ
グメントと呼ぶ）を単離した。このＤフラグメントをＸ
ｈｏＩ消化ｐＴＰＬに連結してプラスミドｐＣＶＳＶＬ
２−ＴＰＬを得た。ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ中のＳＶ４
０Ｄフラグメントの向きは、ＳＶ４０後期プロモーター
がアデノウイルス主要後期プロモーターと同じ向きで存
在するものであった。

【００５１】ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ内にアデノウイル
ス関連（ＶＡ）遺伝子を導入するために、ＶＡ遺伝子供
給源としてのアデノウイルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラ
グメントを含むプラスミドｐＢＲ３２２を作成した。即
ち、アデノウイルス２型ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化
して、Ｂフラグメントをゲル電気泳動により単離した。
このフラグメントをあらかじめＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たｐＢＲ３２２の中に挿入し、第６図に示すｐＢＲ３２
２−Ａｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢを得た。このフラグメント
（アンピシリン耐性をマーカーとして持つ大腸菌を形質
転換した後、形質転換体をＨｉｎｄＩＩＩＢプラスミド
の挿入についてアンピシリン耐性を指標にスクリーニン
グし、挿入された向きを制限酵素消化により調べた。ｐ
ＢＲ３２２−Ａｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢは第６図に示す向
きでアデノウイルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメント
を含む。

【００５２】第７図に示すように、ＶＡ遺伝子はプラス
ミドｐＢＲ３２２−Ａｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢをＨｐａＩ
で消化し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加してＥｃｏＲＩで
消化し、続いて１．４ｋｂフラグメントを回収すること
により得られる。このＥｃｏＲＩ接着末端をもつ１．４
ｋｂフラグメントは、次に前もってＥｃｏＲＩで消化し
たｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬのＥｃｏＲＩ部位に連結し
た。得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換
してテトラサイクリン耐性を指標にして選別した後、Ｖ
Ａ遺伝子に特異的なＤＮＡに対するフィルターハイブリ
ダイゼーションによりコロニーをスクリーニングした。
ポジティブにハイブリダイズするクローンからＤＮＡを
調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。
得られたプラスミドはｐ９１０２３と命名した（第７
図）。

【００５３】続いてｐ９１０２３に存在する２個のＥｃ
ｏＲＩ部位を除去するため、第８図に示すように、ｐ９
１０２３をＥｃｏＲＩで完全消化して２つのＤＮＡフラ
グメント（一方は約７ｋｂであり、他方はＶＡ遺伝子を
含んでおり、約１．３ｋｂである）を生成させた。両フ
ラグメントの末端をＰｏｌＩのクレノウフラグメントを
用いて夫々修復し、次にその２つのフラグメントを再度
連結した。ＶＡ遺伝子を含み、ｐ９１０２３に類似する
が２個のＥｃｏＲＩ部位を欠失したプラスミドｐ９１０
２３（Ａ）は、ＶＡ遺伝子フラグメントを使用するグル
ンスタイン−ホグネススクリーニングにより、また慣用
の制限部位分析により同定した。

【００５４】さらに、ｐ９１０２３（Ａ）中の単一のＰ
ｓｔＩ部位を除き、その代わりにＥｃｏＲＩ部位を入れ
た。即ち、ｐ９１０２３（Ａ）をＰｓｔＩで完全消化
し、ＰｏｌＩのクレノウフラグメントで処理して平滑末
端を生成させた。ｐ９１０２３（Ａ）のその平滑末端化
ＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩリンカーを連結した。平滑末
端化ＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩリンカーを連結させた線
状ｐ９１０２３（Ａ）を非連結リンカーから分離し、Ｅ
ｃｏＲＩで完全消化して再び連結させた。第８図に示す
プラスミドｐ９１０２３（Ｂ）を回収し、ｐ９１０２３
（Ａ）に類似するがＰｓｔＩ部位の代わりにＥｃｏＲＩ
部位を有するものを単離同定した。プラスミドｐ９１０
２３（Ｂ）はメリーランド州ロックビルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番
号ＡＴＣＣ ３９７５４（ヨーロッパ特許条約上の要求
を満たす寄託）として入手可能である。

【００５５】実施例６：ＣＯＳ−１細胞中でのＥＰＯ
ｃＤＮＡの発現例１ ｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＥＰＯＦＬ６およびラムダ
−ＥＰＯＦＬ１３；実施例３参照）をプラスミドｐ９１
０２３（Ｂ）に挿入した。挿入後のプラスミドをそれぞ
れｐＰＴＦＬ６およびｐＰＴＦＬ１３と命名した。その
後、それぞれのプラスミドからの精製ＤＮＡ８μｇを用
いて５×１０⁶ 個のＣＯＳ−１細胞をＤＥＡＥ−デキス
トラン法（以下参照）によりトランスフェクションし
た。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン（０．１ｍ
Ｍ）で２時間処理し、再び洗浄し、そして１０％ウシ胎
児血清を含む培地１０ｍｌに２４時間さらした。その培
地を無血清培地４ｍｌに変えて４８時間後に収穫した。

【００５６】免疫学的に活性なＥＰＯの生産は、シェア
ウッド（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ）およびゴールドバッサー
（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ）（１４）により示されるラジ
オイムノアッセイにより定量化した。抗ＥＰＯ抗体はジ
ュディス・シェアウッド博士（Ｄｒ．Ｊｕｄｉｔｈ Ｓ
ｈｅｒｗｏｏｄ）により提供された。ヨウ素化トレーサ
ーは実施例１に記載の均一なＥＰＯから製造した。検定
の感度は大体１ｎｇ／ｍｌである。結果を下記の第８表
に示す。

【００５７】 第 ８ 表 ベクター 培地中に放出されたＥＰＯの量（ｎｇ／ｍｌ） ｐＰＴＦＬ１３ ３３０ ｐＰＴＦＬ６ ３１ ｐＰＴＦＬ１３はメリーランド州ロックビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションにブタペスト条
約に基づいて国際寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９９９
０のもとに入手可能である。

【００５８】実施例７：ＣＯＳ−１細胞中でのＥＰＯ
ｃＤＮＡの発現例２ ＥＰＯ ｃＤＮＡ（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３）をｐ９
１０２３（Ｂ）に挿入し、ＣＯＳ−１細胞をトランスフ
ェクションして上記（実施例６）のように収穫した。た
だしクロロキン処理を省いた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生物
学的に活性なＥＰＯは、ＣＦＵ−Ｅ源としてマウス胎児
肝臓細胞を用いるコロニー形成検定またはフェニルヒド
ラジン注射マウスからの脾臓細胞を用いる ³Ｈ−チミジ
ン取込み検定により測定した。これらの検定の感度は大
体２５ｍＵ／ｍｌである。ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に
活性なＥＰＯは低酸素性マウス法または飢餓ラット法に
より測定した。これらの検定の感度は大体１００ｍＵ／
ｍｌである。コントロール実験で得られた培地（ｍｏｃ
ｋ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）からの検定で
は活性が全く検出されなかった。クローンＨＥＰＯＦＬ
１３によって発現されたＥＰＯの結果は下記の第９表に
示す〔活性は単位／ｍｌで表わし、標準対照として市販
の比活性の明示されたＥＰＯ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使
用した〕。

【００５９】 第 ９ 表 ＥＰＯ ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から分泌されたＥＰＯ 検 定 活 性 ＲＩＡ １００ｎｇ／ｍｌ ＣＦＵ−Ｅ ２±０．５Ｕ／ｍｌ³ Ｈ−Ｔｈｙ ３．１±１．８Ｕ／ｍｌ 低酸素性マウス １ Ｕ／ｍｌ 飢餓ラット ２ Ｕ／ｍｌ

【００６０】実施例８：ＣＯＳ−１細胞からのＥＰＯの
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析 ＥＰＯ ｃＤＮＡ（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３）を含む
ベクターｐ９１０２３（Ｂ）でトランスフェクションさ
れたＣＯＳ細胞から培地に分泌されたＥＰＯ１８０ｎｇ
を１０％ＳＤＳ Ｌａｅｍｌｌｉのポリアクリルアミド
ゲルによる電気泳動にかけ、ニトロセルロース紙に電気
移動させた〔トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）らのＰｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０
（１９７９）を参照〕。このフィルターは実施例６に記
載されたような抗ＥＰＯ抗体を用いて検索し、洗浄し、
そして ¹²⁵Ｉ−黄色ブドウ球菌Ａプロテインを用いて再
度検索した。その後２日間オートラジオグラフィーを行
った。天然の均一ＥＰＯは実施例１に記載されたものを
使用し、ヨウ素化前（レーンＢ）またはヨウ素化後（レ
ーンＣ）に電気泳動を行った（第９参照）。使用したマ
ーカーは³⁵Ｓメチオニン標識された血清アルブミン（６
８，０００ｄ）および卵白アルブミン（４５，０００
ｄ）であった。

【００６１】実施例９：ｐＲＫ１−４の作成 実用上の目的に適し、１つのプロモーターにより目的ｃ
ＤＮＡ，ＤＨＦＲの２つの遺伝子が支配される特徴を持
つ発現ベクターを作成するため、次に述べるフラグメン
トＡ，ＢおよびＣを連結してプラスミドＲＫ１−４を作
成した。このプラスミドは第１０図の構造を持ち、特に
実用的特徴がある。

【００６２】フラグメントＡは次のようにして得られ
た。マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子に
隣接するＳＶ４０初期領域プロモーター、ＳＶ４０エン
ハンサー、小さなｔ抗原イントロン、およびＳＶ４０ポ
リＡ配列を含むプラスミドＰＳＶ２ＤＨＦＲ〔サブラマ
ニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）らのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，１：８５４−８６４（１９８１）を参照〕から
ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを単離した（フラ
グメントＡ）。

【００６３】残りのフラグメントＢおよびＣは次のよう
にしてベクターｐ９１０２３（Ａ）（実施例５および第
８図参照）から得られた：ｐ９１０２３（Ａ）をアデノ
ウイルスプロモーターの近くの単一のＰｓｔＩ部位でＰ
ｓｔＩにより消化してこのプラスミドを線状化し、次に
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位へ変換するための合成フラグ
メントに連結して再環状化する〔もとのＰｓｔＩ部位に
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位を作る；ｐ９１０
２３（Ｂ′）〕か、あるいは実施例５で述べたようにＤ
ＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで処理してＰｓｔ
Ｉ部位を破壊し、合成ＥｃｏＲＩリンカーに連結して再
環状化した〔もとのＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲ部Ｉ部位を
作る；ｐ９１０２３（Ｂ）〕。得られた２つのプラスミ
ドｐ９１０２３（Ｂ）とｐ９１０２３（Ｂ′）の各々を
ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化して２つのフラグメン
ト（ＦおよびＧ）を得た。ｐ９１０２３（Ｂ）からのフ
ラグメントＦとｐ９１０２３（Ｂ′）からのフラグメン
トＧおよびｐ９１０２３（Ｂ）からのフラグメントＧと
ｐ９１０２３（Ｂ′）からのフラグメントＦを連結する
ことにより、もとのＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ部位またはＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位のいずれかを含
む２つの新しいプラスミドを作成した。ＰｓｔＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ部位を含むプラスミド（ＰｓｔＩ部位がアデノウ
イルス主要後期プロモーターに最も接近している：プロ
モーターに近接している位置に目的ｃＤＮＡを挿入でき
るようにＰｓｔＩサイトが設けられている）をｐ９１０
２３（Ｃ）と命名した。

【００６４】ベクターｐ９１０２３（Ｃ）をＸｈｏＩで
完全消化し、接着末端をもつ得られた線状プラスミドは
大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントを用いる
末端修復反応により平滑末端とした。このＤＮＡに、次
のようにして作成したＳＶ４０エンハンサー含有の３４
０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを連
結した：ＳＶ４０からのＳＶ４０複製開始点およびエン
ハンサーを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメン
トをプラスミドｃ ｌａｃ〔リトル（Ｌｉｔｔｌｓ）ら
のＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１；４７３−４８８
（１９８３）を参照〕に挿入した。ｃ ｌａｃベクター
はｃ ｌａｃＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、接着末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントで修復し、そのＤ
ＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製した。
得られたプラスミド（ｃ ＳＶＨＰ ｌａｃ）はＰｖｕ
ＩＩ平滑末端を連結されたことによりＢａｍＨＩ部位を
再生していた。ｃ ＳＶＨＰ ｌａｃからＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを作り、プラスミドの複製
開始点を含むｐＳＶＯｄ（実施例５に示したメロンらの
上記文献参照）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントに連結し、得られたプラスミドｐＳＶＨＰＯｄを選
択した。その後、ＳＶ４０複製開始点／エンハンサーを
含むｐＳＶＨＰＯｄの３４０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントを作り、両末端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩ大フラグメントで平滑末端とし、そして上記のＸ
ｈｏＩ消化し、平滑末端化ｐ９１０２３（Ｃ）ベクター
に連結した。

【００６５】ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント
中のＢａｍＨＩ部位がＶＡ遺伝子に最も接近するような
向きをもつ得られたプラスミド（ｐ９１０２３（Ｃ）／
ＸｈｏＩ／平滑末端プラスＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
／平滑末端ＳＶ４０複製開始点プラスエンハンサー）は
ｐＥＳ１０５と命名した。このプラスミドｐＥＳ１０５
をＢａｍＨＩとＰｖｕＩＩで、またはＰｖｕＩＩだけで
消化して、アデノウイルス主要後期プロモーターを含む
ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（フラグメント
Ｂ）および耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）と他の
配列との間にそのプラスミドを含むＰｖｕＩＩフラグメ
ント（フラグメントＣ）を単離した。

【００６６】フラグメントＡ，ＢおよびＣを連結し、第
１０図に示すプラスミドを単離してＲＫ１−４と命名し
た。プラスミドＲＫ１−４はメリーランド州ロックビル
のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにブ
タペスト条約に基づいて国際寄託され、寄託番号ＡＴＣ
Ｃ ３９９４０のもとに入手可能である。

【００６７】実施例１０：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発
現−方法Ｉ 上記実施例６のプラスミドｐＰＴＦＬ１３からのＥＰＯ
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（２０μｇ）を制限エンドヌク
レアーゼＣｌａＩで消化して線状化し、そしてプラスミ
ドｐＡｄＤ ２６ＳＶｐ（Ａ）１（カウフマン等のＭｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３０４（１９８
２））からのＣｌａＩ消化ＤＮＡ（２μｇ）〔アデノウ
イルス主要後期プロモーターにより制御される完全なジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含む〕に連結した
〔カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈ
ａｒｐ）のＭｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：
１３０４−１３１９（１９８２）を参照〕。この連結Ｄ
ＮＡを使ってＤＨＦＲ−ネガティブＣＨＯ細胞〔ＤＵＫ
Ｘ−ＢＩＩ，カーシン（Ｃｈａｓｉｎ Ｌ．Ａ．）およ
びアーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ．）のＰＮＡＳ ７
７：４２１６−４２２０（１９８０）を参照〕をトラン
スフェクションし、２日間増殖後、少なくとも１つのＤ
ＨＦＲ遺伝子を組み込んだ細胞をアルファ培地（ヌクレ
オチドを欠き、１０％透析ウシ胎児血清を補充したも
の）で選択した。選択培地で２週間増殖後、コロニーを
もとの平板から採取し、１プール当り１０〜１００個の
コロニーから成るグループに分け、再度ヌクレオチド欠
損培地で培地上全面に増殖するまで培養した。増殖プー
ルからの培地上清をメトトレキセート（ＭＴＸ）選択に
先立ってＲＩＡでＥＰＯについて検定した。陽性のＥＰ
Ｏ生産を示したプールはメトトレキセート（０．０２μ
Ｍ）の存在で増殖させ、サブクローニングして再度検定
した。ＥＰＯ Ｃｌａ ４α４．０２（ＭＴＸ耐性のも
のを精製したもの）プールからサブクローニングされた
単一のＥＰＯ Ｃｌａ ４α４．０２−７は０．０２μ
Ｍ ＭＴＸを含む培地中に４６０ｎｇ／ｍｌのＥＰＯを
放出した（第１０表参照）。ＥＰＯ Ｃｌａ ４α４．
０２−７はＥＰＯ生産に特に適する細胞株であり、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションにブタペス
ト条約に基づき、寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８６９５
として国際寄託された。一般に、このクローンは次第に
増加する濃度のＭＴＸ中で段階的選択にかけると、さら
に高レベルのＥＰＯを生産する細胞を生成するであろ
う。ＲＩＡで陰性であったプールについては、メトトレ
キセート（０．０２μＭ）の存在下で増殖した相対培養
物からのメトトレキセート耐性コロニーをＲＩＡでＥＰ
Ｏについてプールごとに再び検定した。陽性でなかった
これらの培養物をサブクローニングし、さらに濃度を高
めたメトトレキセート中で増殖させた。

【００６８】段階的にメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度
を上げて培養する選択は、次第に増加する濃度のメトト
レキセートの存在下で細胞を培養して生存細胞を選択す
るというサイクルを繰り返すことにより達成された。各
回ごとに培養上清中のＥＰＯをＲＩＡおよびｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ生物活性により測定した。各段階的増幅において
使用されたメトトレキセートの量は０．０２μＭ，０．
１μＭおよび０．５μＭであった。第１０表に示すよう
に、０．０２μＭのＭＴＸによる１回の選択後に有意量
のＥＰＯが培地中に放出された。

【００６９】 第 １０ 表 培地に放出されたＥＰＯの量 アルファ培地中０．０２μＭ 試 料 検定法 アルファ培地収量 メトトレキセート収量 ４α４プール ＲＩＡ １７ｎｇ／ｍｌ ５０ｎｇ／ｍｌ ４α４単一 コロニー クローン （．０２−７） ＲＩＡ ─ ４６０ｎｇ／ｍｌ

【００７０】実施例１１：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発
現−方法ＩＩ クローンラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３からのＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む小さなフラグメン
ト（ＲＩフラグメント）をプラスミドＲＫ１−４（実施
例９参照）のＥｃｏＲＩ部位内でサブクローニングし
た。次に、このＤＮＡ（ＲＫＦＬ１３）を用いてＤＨＦ
Ｒ−ネガティブＣＨＯ細胞を直接（消化せずに）トラン
スフェクションし、そして上記の実施例１０のようにし
て選択および増幅を行った。

【００７１】また、ＲＫＦＬ１３ＤＮＡはプロトプラス
ト融合または微量注射法によりＣＨＯ細胞に挿入した。
プラスミドＲＫＦＬ１３はメリーランド州ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにブタ
ペスト条約に基づいて国際寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ
３９９８９のもとに入手可能である。

【００７２】 第 １１ 図 培地中に放出されたＥＰＯ量 アルファ培地 アルファ培地中0.02μＭ 試 料 検定法 収 量 メトトレキセート収量 コロニープールＡ ＲＩＡ ３ng／ml ４２ng／ml（プール） １５０ng／ml（クローン） ³Ｈ−Ｔhy ─ 1.５Ｕ／ml 単一コロニークローン ＲＩＡ ─ ９０ng／ml （.02 Ｃ−Ｚ） ³Ｈ−Ｔhy ─ 5.９Ｕ／ml 微量注射プール ＲＩＡ ６０ng／ml １６０ng／ml （ＤＥＰＯ−１） ³Ｈ−Ｔhy 1.８Ｕ／ml ─ 好適な単一コロニークローンはメリーランド州ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ブタペスト条約に基づいて国際寄託され、寄託番号ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ８６９５のもとに入手可能である。

【００７３】実施例１２：ＣＯＳ−１細胞によるＥＰＯ
ゲノムＤＮＡの発現 ＥＰＯゲノムクローンの発現のために使用したベクター
はｐＳＶＯｄ（実施例５に示したメロンらの上記文献参
照）である。ｐＳＶＯｄからのＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩ
で完全消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントで
平滑末端とした。ＥＰＯゲノムクローンのラムダ−ＨＥ
ＰＯ３はＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで完全消化し、Ｅ
ＰＯ遺伝子を含む４．０ｋｂフラグメントを単離して上
記のように平滑末端とした。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からポ
リＡシグナルをちょうど越えた領域までのこのフラグメ
ントのヌクレオチド配列は第３図下部および第４表に示
す。ＥＰＯ遺伝子フラグメントをｐＳＶＯｄプラスミド
フラグメント内に挿入し、そして両方の向きの正しく構
築された組換え体を単離して確かめた。プラスミドＣＺ
２−１は“ａ”の向き（すなわちＥＰＯの５′末端がＳ
Ｖ４０開始点に最も接近する−−−第１２図参照）でＥ
ＰＯ遺伝子を有し、プラスミドＣＺ１−３はそれと反対
の向き（すなわち“ｂ”の向き−−−第１３図参照）で
ある。

【００７４】プラスミドＣＺ１−３およびＣＺ２−１は
実施例７のようにしてＣＯＳ−１細胞をトランスフェク
ションし、培地を収穫して免疫学的に反応性のＥＰＯに
ついてラジオイムノアッセイで検定した。ＣＺ２−１か
らは培養上清中に約３１ｎｇ／ｍｌのＥＰＯが検出さ
れ、ＣＺ１−３からは１６〜３１ｎｇ／ｍｌのＥＰＯが
検出された。なお、ラジオイムノアッセイについては、
次の方法にしたがって行った。すなわち、まず試料と抗
血清（実施例１に記載の均質なＥＰＯから常法にしたが
って調製した¹²⁵Ｉ−ＥＰＯ）を加え放置する。次い
で、これに第２抗体（ヤギ抗ウサギγ−グロブリン）を
加え、沈降させ、全体に対する沈降物の放射能の比率
（Ｂ／Ｔ）を算出する。そして、濃度既知のＥＰＯの標
準液にもとづくＢ／Ｔ比率とＥＰＯ量との検量線より、
試料中のＥＰＯ量を求める［シャーウッド（Ｓｈｅｒｗ
ｏｏｄ）ら、Ｂｌｏｏｄ ５４：８８５（１９７
９）］。ゲノムクローンＨＥＰＯ１，ＨＥＰＯ２および
ＨＥＰＯ６は類似の方法でＣＯＳ細胞に挿入し且つ発現
させることができる。

【００７５】実施例１３：Ｃ１２７および３Ｔ３細胞に
よる発現用プラスミドｐＢＰＶＥＰＯの作成 マウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下にあ
り且つ完全ウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡに結合されたＥＰ
Ｏ ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを次のようにして作
成した：

【００７６】ｐＥＰＯ４９ｆ プラスミドＳＰ６／５をＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ
から購入した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで完全消化
し、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３からのＥＰＯｃＤＮＡを
含む１３４０ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントをＤＮＡリガ
ーゼにより挿入した。ＥＰＯ遺伝子の５′末端がＳＰ６
プロモーターに極めて接近している（ＢｇｌＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ消化で測定）得られたプラスミドをｐＥＰ
Ｏ４９５と命名した。なお、方向性に関して、ｐＳＰ６
／５ポリリンカー中のＢａｍＨＩ部位はＥＰＯ遺伝子の
５′末端に直接に隣接している。

【００７７】ｐＭＭＴｎｅｏΔＢＰＶ 第１１図に示すプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
（３４２−１２）〔ロー（Ｌａｗ）らのＭｏｌ．ａｎｄ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１１０−２１１５（１９
８３）を参照〕をＢａｍＨＩで完全消化して、ＢＰＶゲ
ノムを含む約８ｋｂの大きなフラグメントと、ｐＭＬ２
複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子、メタロチオ
ネインプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳ
Ｖ４０ポリＡシグナルを含む約６．５ｋｂの小さなフラ
グメントの両フラグメントを生じさせた。消化したＤＮ
Ａを分離することなくＤＮＡリガーゼで再び環状化し、
目的とする約６．５ｋｂフラグメントのみを含むプラス
ミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ
消化により同定した。この種のプラスミドの一つをｐＭ
ＭＴｎｅｏΔＢＰＶと命名した。

【００７８】ｐＥＰＯ１５ａ ｐＭＭＴｎｅｏΔＢＰＶをＢｇｌＩＩで完全消化した。
ｐＥＰＯ４９５をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで完全消化し
て、全ＥＰＯコーディング領域を含む約７００ｂｐフラ
グメントプラスミドをゲル電気泳動により単離した。Ｂ
ｇｌＩＩ消化ｐＭＭＴｎｅｏΔＢＰＶと７００ｂｐ Ｂ
ａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩＥＰＯフラグメントとを連結し、
ＥＰＯｃＤＮＡを含む得られたプラスミドはＥＰＯ遺伝
子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブｄ（ＧＧＴＣ
ＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣ）を使用するコロニー
ハイブリダイゼーションにより同定した。ハイブリダイ
ゼーション分析で陽性であったプラスミドのうち、ＥＰ
Ｏ ｃＤＮＡの５′末端がメタロチオネインプロモータ
ーに最も接近する方向性のＥＰＯ ｃＤＮＡをもつ１つ
のプラスミド（ｐＥＰＯ１５ａ）がＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩ消化により同定された。

【００７９】ｐＢＰＶ−ＥＰＯ プラスミドｐＥＰＯ１５ａをＢａｍＨＩで完全消化して
線状化した。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３
４２−１２）もまたＢａｍＨＩで完全消化して、約６．
５ｋｂと８ｋｂの２つのフラグメントを得た。全ウシ乳
頭腫ウイルスゲノムを含む８ｋｂフラグメントをゲル電
気泳動により単離した。ｐＥＰＯ１５ａ／ＢａｍＨＩと
８ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとを一緒に連結し、ＢＰ
Ｖフラグメントを含むプラスミド（ｐＢＰＶ−ＥＰＯ）
は、ＢＰＶゲノムに特異的なオリゴヌクレオチドプロー
ブｄ（Ｐ−ＣＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡ−ＯＨ）
を使用するコロニーハイブリダイゼーションにより同定
した。ｐＢＰＶ−ＥＰＯＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化
は、ＢＰＶゲノムの転写方向がメタロチオネインプロモ
ーター（第１１図のｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２
−１２）を参照）の転写方向と同じであることを示し
た。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１
２）はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから寄託番号ＡＴＣＣ ３
７２２４（ＡＴＣＣカタログに掲載されている）のもと
に入手可能である。

【００８０】発 現 ＥＰＯを発現させるために次の方法を使用した。

【００８１】方 法 Ｉ ＤＮＡ ｐＢＰＶ−ＥＰＯを作成し、約２５μｇを使用
して約１×１０⁶ 個のＣ１２７（ローウィー（Ｌｏｗ
ｙ）らのＪ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，２６：２９１−２９
８（１９７８）を参照〕および３Ｔ３細胞を標準的なリ
ン酸カルシウム沈澱法〔グラム（Ｇｒａｈｍ）らのＶｉ
ｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７（１９７３）を参
照〕によりトランスフェクションした。トランスフェク
ションの５時間後、トランスフェクション用培地を除
き、グリセロールショック（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｈｏ
ｃｋ）を行い、洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含
む新しいアルファ培地を加えた。４８時間後、細胞をト
リプシン処理して５００μｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８
を含むＤＭＥ培地中に１：１０の比で分散させ〔サザン
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）らのＭｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，１：３２７−３４１（１９８２）を参照〕、それ
らの細胞を２〜３週間インキュベートした。次いで、Ｇ
４１８耐性コロニーをミクロタイターウェル（ｍｉｃｒ
ｏｔｉｔｅｒ ｗｅｌｌ）内に個々に単離し、Ｇ４１８
の存在下で培地全面がやや密集するまで増殖させた。そ
の後、細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含む新しい
培地を加えて２４時間後に培地を収穫した。その生産培
地を試験し、ラジオイムノアッセイおよびｉｎ ｖｉｔ
ｒｏバイオアッセイによりＥＰＯについて陽性であるこ
とがわかった。

【００８２】方 法 ＩＩ Ｃ１２７または３Ｔ３細胞を、方法Ｉで述べたように、
２５μｇのｐＢＰＶ−ＥＰＯと２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ
（サザンらの上記文献参照）を用いて同時トランスフェ
クションした。これは大体１０倍モル過剰のｐＢＰＶ−
ＥＰＯを使用する。トランスフェクション後の手法は方
法Ｉと同じである。

【００８３】方 法 ＩＩＩ 方法Ｉで述べたように、Ｃ１２７細胞を３０μｇのｐＢ
ＰＶ−ＥＰＯでトランスフェクションした。トランスフ
ェクションおよび分散（１：１０）の後、３日おきに新
しい培地と取り換えた。約２週間後にＢＰＶ形質転換細
胞の斑点が出現した。各々の斑点をミクロタイター皿の
１ｃｍ径のウェル内に別々に採置し、やや密集した単層
になるまで増殖させ、生産培地中のＥＰＯ活性または抗
原性について検定した。次に、ヒトＥＰＯをコードする
ｃＤＮＡでＣＯＳ細胞を形質転換して得られた粗ＥＰＯ
を用いた精製法を下記に参考例として記載する。

【００８４】参考例：ＥＰＯの精製 ＥＰＯ濃度が２００μｇ／ｌ程度のＣＯＳ細胞生産培地
（１２ｌ）を０．４６５ｍ² （５平方フィート）の膜を
備えたミリポア・ペリカン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅ
ｌｌｉｃａｎ）のような１０，０００分子量で分離する
限外濾過膜を使用して、６００ｍｌに濃縮した。検定は
実施例６のようにしてＲＩＡで行った。限外濾過からの
濃縮物はｐＨ７．０に緩衝化した１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム４ｌに対して透析した。こうして濃縮および透析さ
れた生産培地は全タンパク質３８０ｍｇ中にＥＰＯ２．
５ｍｇを含んでいた。このＥＰＯ溶液をさらに１８６ｍ
ｌに濃縮し、沈澱したタンパク質を１１０，０００×ｇ
で３０分間遠心することにより除いた。ＥＰＯ（２．０
ｍｇ）を含む上清を５０％酢酸でｐＨ５．５に調節し、
４℃で３０分間攪拌し、沈澱物を１３，０００×ｇで３
０分間遠心することにより除いた。

【００８５】カルボニルメチルセファロースクロマトグ
ラフィ− ＥＰＯ２００μｇ（全タンパク質２４ｍｇ）を含む遠心
上清（２０ｍｌ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．５）中で平衡化したＣＭ−セファロース（２０ｍ
ｌ）を充填したカラムに加え、同じ緩衝液４０ｍｌで洗
浄した。ＣＭ−セファロースに結合したＥＰＯは１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中のＮａＵ（０−
１）の勾配１００ｍｌで溶離した。ＥＰＯ含有画分（全
タンパク質２ｍｇ中全部で５０μｇ）を集め、アミコン
（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ１０限外濾過膜を使って２ｍｌに
濃縮した。

【００８６】逆相ＨＰＬＣ ＣＭ−セファロースからのＥＰＯを含む濃縮画分は、バ
イダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−４カラムを使用する逆相Ｈ
ＰＬＣによりさらに精製した。１０％溶剤Ｂ（溶剤Ａは
０．１％ＣＦ₃ ＣＯ₂ Ｈ／Ｈ₂ Ｏであり；溶剤Ｂは０．
１％ＣＦ₃ ＣＯ₂ Ｈ／ＣＨ₃ ＣＮである）で平衡化した
カラムに１ｍｌ／分の流量でＥＰＯを加えた。このカラ
ムを１０％溶剤Ｂで１０分間洗浄し、ＥＰＯを溶剤Ｂの
直線濃度勾配（６０分で１０〜７０％）で溶離した。Ｅ
ＰＯ含有画分（全タンパク質 １２０μｇ中ＥＰＯ約４
０μｇ）を集めて凍結乾燥した。凍結乾燥ＥＰＯは０．
１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）中で再調製し、逆相ＨＰＬＣにより再びクロマ
トグラフ処理を行った。ＥＰＯ含有画分を集め、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動により分
析した〔ラメリ（ｌａｍｅｌｉ，Ｕ．Ｋ．），Ｎａｔｕ
ｒｅを参照〕。集めたＥＰＯ画分は全タンパク質２５μ
ｇ中ＥＰＯ１５．５μｇを含んでいた。

【００８７】

【発明の効果】本発明はヒトエリトロポエチンの効率的
生産に使用できるヒトエリトロポエチンのクローン化遺
伝子、組換えＤＮＡベクターおよび該発現形質転換体を
提供するもので、各種貧血症の治療薬等の開発に利用で
きるものである。

【００８８】文 献 １）Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｇ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１
１：６４９−６６０（１９８３）． ２）Ｙａｎａｇａｗａ，Ｓ．，Ｈｉｒａｄｅ，Ｋ．，Ｏ
ｈｎｏｔａ，Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｒ．，Ｃｈｉｂａ，
Ｈ．，Ｖｅｄａ，Ｍ．，およびＧｏｔｏ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ，Ｃｈｅｍ．２５９：２７０７−２７１０（１９８
４）． ３）Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，
Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｂｌａｋｅ，Ｇ．，およびＭ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｃｅｌｌ １５：１１５７−（１
９７８）． ４）Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ．Ｓ．，およ
びｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａ
ｃａｄ，Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３−（１
９７７）． ５）Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｋｎｏｐｆ，Ｊ．Ｌ．，Ｗ
ｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｕｌｔｚｍａｎ．，Ｌ．Ａ．
Ｂｕｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｄ．
Ｄ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．，
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｃ．，Ｏｒｒ．Ｅ．Ｃ．，Ａｍｐ
ｈｌｅｔｔ，Ｇ．Ｗ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｗ．Ｂ．，Ｃｏ
ｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｆａｓｓ，
Ｄ．Ｎ．，およびＨｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ
３１２：３４２−３４７（１９８４） ６）Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐ
ｌ．１，５８，ｘｌｉｉ（ａｂｓｔｒ）（１９８１）． ７）Ｓｕｅ，Ｊ．Ｍ．およびＳｙｔｋｏｗｄｋｉ，Ａ．
Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ Ｕ．
Ｓ．Ａ．８０：３６５１−３６５５（１９８３） ８）Ｂｅｒｓｃｈ，Ｎ．およびＧｏｌｄｅ，Ｄ．Ｗ．，
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｒｙｔｈ
ｒｏ−ｐｏｉｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｍｕｒｐｈｙ（Ｅ
ｄ．）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ（１９７８） ９）Ｃｏｔｅｓ，Ｐ．Ｍ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ｄ．
Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ １９１：１０６５−（１９６１）． １０）Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．およびＧｒｏｓｓ，
Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３７：１
０９−１２１（１９７５）． １１）Ｗｏｏ，Ｓ．Ｌ．Ｃ．，Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ，
Ａ．，Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．，Ｃａｔ
ｔｅｒａｌｌ，Ｊ．Ｆ．およびＯ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｂ．
Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．−Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．７５：３６８８−（１９７８）． １２）Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．およびＫｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｉ．Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ，−Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：６８３６−６８４２（１９８
３）． １３）Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．およびＤａｖｉｓ，Ｒ．
Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０−１８２（１９７
７）． １４）Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｂ．およびＧｏｌｄｗａ
ｓｓｅｒ，Ｅ．Ｂｌｏｏｄ ５４：８８５−８９３（１
９７９）． １５）Ｄｅｒｍａｎ，Ｅ．，Ｋｒａｕｔｅｒ，Ｋ．，Ｗ
ａｌｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｒ
ａｙ，Ｍ．，およびＤａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．，Ｃｅｌ
ｌ ２３：７３１−（１９８１）． １６）Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ ２３：１７５
−１８２（１９８１）． １７）Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅ
ｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．，およびＤｒｅｙｅ
ｒ，Ｗ．Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２５６：７９９
０−７９９７（１９８１）．

【００８９】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ中のＥＰＯ ｍＲＮＡの
検出を示す電気泳動図である。

【図２】ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯ ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列の模式図である。

【図３】４個の独立したヒトＥＰＯゲノムクローンのＤ
ＮＡ挿入物の相対位置およびヒトＥＰＯ遺伝子のイント
ロンおよびエクソン構造の推定地図を示す。

【図４】ＥＰＯの発現用プラスミドに使用する中間的プ
ラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）の作成を示
す。

【図５】ＥＰＯの発現用プラスミドに使用する中間的プ
ラスミドｐＴＰＬの作成を示す。

【図６】ＥＰＯの発現用プラスミドに使用する中間的プ
ラスミドｐＢＲ３２２−ＡｄＨｉｎｄＩＩＩＢの作成を
示す。

【図７】ＥＰＯの発現用プラスミドに使用する中間的プ
ラスミドｐ９１０２３の作成を示す。

【図８】ＥＰＯの発現用プラスミドｐ９１０２３（Ｂ）
の作成を示す。

【図９】天然ＥＰＯと比較したときのＣＯＳ−１細胞で
生産されたＥＰＯのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析
を示す。

【図１０】ＥＰＯは発現用プラスミドｐＲＫ１−４（実
施例９参照）の模式図である。

【図１１】実施例１３で材料として用いたプラスミドｐ
ｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）の模式図であ
る。

【図１２】プラスミドＣＺ２−１を示す模式図であり、
ＥＰＯ遺伝子が”ａ”の向きであることを表す。

【図１３】プラスミドＣＺ１−３を示す模式図であり、
ＥＰＯ遺伝子が”ｂ”の向きであることを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘウィック，ロドニー・エム アメリカ合衆国マサチューセッツ州02173, レキシントン，ウッドクリフェ・ロード 16 (72)発明者 ジャコブス，ケネス アメリカ合衆国マサチューセッツ州02160, ニュートン，ビューモント・アベニュー 151

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の塩基配列を含むヒトエリトロポエ
   チンをコードするゲノムＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ
   ベクターで形質転換された哺乳動物細胞を培養し、次い
   で産生されたヒトエリトロポエチン活性を有する糖タン
   パク質を分離することを特徴とする、ヒトエリトロポエ
   チン活性を有する糖タンパク質の生産方法。