DK173375B1 - LHRH-Antagonister, deres fremstilling og lægemidler der indeholder dem - Google Patents

Description

i DK 173375 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptider, der hæmmer frigivelsen af gonadotropiner via hypofysen hos pattedyr eller mennesker uden at fremkalde ødematøse reaktioner. Især angår opfindelsen 5 analoger af hormonet, . der frigiver det luteiniserende hormon og har følgende struktur: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 salte deraf og farmaceutiske præparater og fremgangsmåder i forbindelse med disse analoger.

10 I mere end 15 år har forskere søgt efter selek tivt stærke antagonister for LHRH-dekapeptidet [M. Karten og J.E. Rivier, Endocrine Reviews, 7, 44-66 (1986)]. Den store interesse for sådanne antagonister skyldes deres nyttighed indenfor endokrinologi, gynæko-15 logi, svangerskabsforebyggelse og kræft. Et stort antal forbindelser er fremstillet som potentielle LHRH-antagonister. De interessanteste antagonister, der idag er fundet, er sådanne forbindelser, der har en modificeret LHRH-struktur.

20 Den første serie af stærke antagonister opnåedes ved indføring af aromatiske aminosyrerester i stillingerne l, 2, 3 og 6 eller 2, 3 og 6. Forbindelserne beskrives som LHRH, hvor udskiftning af de oprindelige ariinosyrerester med andre aminosyrer ved stillinger an-25' givet ved hævede tal, er markeret. De kendte antagonister omfatter: [Ac-D-Phe(4-Cl)1'2, D-Trp3'6] LHRH (D.H. Coy, et. al., i: Gross, E. og Meienhofer, J. (Eds) Peptides, Proceedings of the 6th American Peptid Symposium, 30 S. 775-779, Pierce Chem. Co., Rockville, II, 1979);

[Ac-Pro1, D-Phe(4-Cl)2, D-Nal(2)3'6] LHRH (US

patentskrift nr. 4.419.347) og [Ac- 3Pro1, D-Phe(4-Cl)2, D-Trp3'6] LHRH (J.L. Pineda, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. i56, 420, 35 1983).

Til forøgelse af antagonisternes vandopløselig-hed indførte man senere basiske aminosyrer, som f.eks.

DK 173375 B1 2 D-Arg i 6-stillingen. F.eks. [Ac-D-Phe(4-Cl)1,2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10] LHRH (ORG-30276) (D.H.Coy, et al., Endocrinology, 100, 1445, 1982); og [Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6] LHRH 5 (ORF 18260) (J.E. Rivier, et al., In: Vickery B.H., Nestor, Jr.J.J. , Hafez, E.S.E. (Eds), LHRH and Its Analogs, S. 11-22 MTP Press, Lancaster, UK 1984).

Analogerne udviser ikke kun den ventede, forbedrede vandopløselighed men også en forbedret, antagoni-10 stisk virkning. Imidlertid forårsager disse yderst stærke, hydrofile analoger med D-Arg og andre basiske sidekæder i 6-stilling, dannelse af forbigående ødemer i ansigtet og på ekstremiteterne, når de indgives i rotter i doser på 1,25 eller 1,5 mg/kg subkutant 15 (F.Schmidt, et al.. Contraception, 29, 283, 1984; J.E.Morgan, et al., int. Archs. Allergy Appl.Immun. 80, 70 (1986). Da forekomsten af ødematogene virkninger efter indgivelsen af disse antagonister rejser tvivl om deres sikkerhed ved anvendelse til mennesker og således 20 forhaler introduktionen af disse lægemidler ved klinisk brug, er det ønskeligt at tilvejebringe peptider, der er fri for disse bivirkninger.

Den foreliggende opfindelse angår LHRH-antagonister, der har en forbedret vandopløselighed og 25 de basiske peptiders høje, antagonistiske styrke og er frie for ødematogene virkninger. Disse forbindelser er meget stærkt virkende til hæmning af frigørelsen af go-nadotropiner fra hypofysen af pattedyr eller mennesker.

Forbindelserne ifølge opfindelsen har formlen 30 I:

X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2 I

hvor 35 X er en acylgruppe af ligekædede eller forgrenede alifatiske eller alicykliske carboxylsyrer med 1 til 7 DK 173375 B1 3 carbonatomer eller en carbamoylgruppe, R1 er D- eller L-Pro, D- eller L-&3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) eller D-Nal(2), 5 R2 er D-Phe eller D-Phe(4-Hl) R3 er D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(1) eller D-Nal(2), R6 er D-Cit, D-Hcl, D-Clt(Q) eller D-Hci(Q) og R10 Gly eller D-Ala,

Idet Hl er fluor, chlor eller brom, og Q er 10 Cj^Cj-alkyl, og farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

Forbindelserne med formlen I fremstilles ved kendte fremgangsmåder, f.eks. ved en ren fastfasemetode, delvis fastfasemetode eller ved klassiske opløsningsmid-15 delkoblinger. Forbindelsen med formlen I fremstilles fortrinsvis ved en kendt fastfasemetode. En sådan metode giver mellemproduktpeptider eller mellemproduktharpikser med formlen II: 20 X1-R,-R*-R*-Ser(X4J^fyr(X5)-R*e(X*)-Leu-Arg(X*)-Pro- R,0-NH-X1« ir hvor er en acylgruppe på basis af ligekædede eller for-25 grenede alifatiske eller alicycliske carboxylsyrer med 1 til 7 carbonatomer (især acetyl), t-Boc, hydrogen eller carbamoyl, X4 er en beskyttelsesgruppe for Ser-hydroxygruppen (f.eks. benzyl eller 2,6-dichlor-benzyl), 30 X5 er en beskyttelsesgruppe for den Tyr-phenolske hy-droxylgruppe (f.eks. benzyl, 2,6-dichlor-benzyl, 2-chlor(2-brom)-benzyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl), X6 er en beskyttelsesgruppe for Lys- eller Orn-35 sidekædeaminogruppen (benzyloxycarbonyl eller 2-chlor-benzyloxycarbonyl), DK 173375 B1 4 X8 er en beskyttelsesgruppe for Arg-Guanidinogruppen (N02 eller Tos), χ10 er en bæreharpiks indeholdende benzylhydryl- eller methylbenzhydrylgrupper, 5 R1 er D- eller L-Pro, D- eller L-å3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) eller D-Nal(2), R2 er D-Phe eller D-Phe(4-Hl) R3 er D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) eller D-Nal(2), 10 R*6 er D-Lys eller D-Orn, D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) eller D-Hci(Q), og R10 er Gly eller D-Ala, idet Hl er fluor, chlor eller brom.

En fremgangsmåde består f.eks. 1 omsætningen af et peptid med formlen II, hvori R*6 er D-Lys eller D-15 Orn, og X6 er hydrogen, med et cyanat eller en forbindelse, der tilvejebringer cyanat (cyanatkilde) til et peptid med formlen III:

X1-R1-R*-R*-S#r(X4)-Tyri X*Arg(X·>-Pro-R*»-NH-X1« III

20 hvori Χχ, R1 , R2 , R3, X4, X5, X8, R10 og X10 har de ovenfor angivne betydninger, og R**6 er Cit, Hci,

Cit(Q) eller Hci(Q). Fortrinsvis udføres denne reaktion, når Xx er Acyl og alle de andre grupper X er hy-25 drogen. Egnede cyanater eller cyanat-leverende forbindelser er: alkalimetalcyanater (f.eks. kaliumcyanat), N-lavere alkyl-isocyanater (N-ethyl-isocyanat). Pepti-det med formlen II fremstilles fortrinsvis ved den kendte fastfasemetode. Omsætningen med cyanater eller 30 cyanat-leverende forbindelser udføres i opløsningsmidler, fortrinsvis aprotiske midler, som f.eks. vandigt DMF, ved temperaturer mellem 0 og 50 °C, fortrinsvis 0 og 25 °C.

Fortsættelsen af denne reaktion, dvs. overføringen af 35 Orn/Lys-peptider i de tilsvarende Cit/Hci-peptider, kan let følges ved HPLC i MeCN-vandige TFA-systemer, som følge af en karakteristisk 2,6 ± 0,3 minutters stigning DK 173375 B1 5 af retentionstiden for Cit/Hci- og f.eks. Cit(ethyl)/

Hci(ethyl)-peptider i sammenligning med de tilsvarende Orn/Lys-peptider.

Peptider med formlen I, hvor X er en acylgruppe, 5 opnås direkte ved spaltning af og fjernelse af beskyttende grupper fra mellempeptidharpiksen med formlen II, hvori X1 er en acylgruppe, og R*6 er D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) eller D-Hci(Q), og peptider med formlen i, hvori X er en carbamoylgruppe, opnås udfra peptidhar-10 pikser med formlen II, hvori X1 er hydrogen eller Boc, ligeledes vil spaltning af og fjernelse af beskyttelsesgrupper med efterfølgende carbamoylering.

Et gonadotropinantagoniserende, farmaceutisk præparat tilvejebringes ved blanding af forbindelsen 15 med formlen I med en farmaceutisk acceptabel bærer, herunder mikrokugler til forsinket frigivelse.

Der tilvejebringes ligeledes en fremgangsmåde til lettelse af de komplikationer, der er et resultat af, at gonadotropinmængder, der ligger over de ønskede 20 mængder, står til fysiologisk rådighed for hypofysen ved pattedyr eller mennesker, hvilken fremgangsmåde omfatter Indgivelse af en gonadotropinantagoniserende dosis af forbindelsen med formlen I til pattedyret eller mennesket.

25 Den til definition af peptiderne anvendte nu no- menklutur stemmer overens med nomenklaturen specificeret af iUPAC-IUB-kommisionen vedrørende biokemisk nomenklatur (European J. Biochem., 1984, 138, 9-37), ifølge hvilken aminogruppen ved N-terminusen optræder 30 til venstre og carboxylgruppen ved C-terminusen optræder til højre i overensstemmelse med den sædvanlige fremstilling, udtrykket "naturlige aminosyrer" anvendes I almindelighed for naturligt forekommende aminosyrer, der findes i proteinerne og omfatter Gly, Ala, Val, 35 Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys,

Met, Phe, Tyr, Pro, Trp og His. Forkortelserne for de DK 173375 B1 6 enkelte aminosyrerester er baseret på aminosyrernes trivialnavne og er Ala, Alanin; Arg, Arginin; Cit, Citrullln; Gly, Glycin; Hci, Homocitrullin; Leu, Leu-cin; Lys, Lysin; Pal(3), 3-(3-pyridyl)-alanin; Nal(2), 5 3-(2-naphtyl)alanin; Nal(l), 3-(1-naphthyl)alanin; Orn,

Ornithin; Phe, Phenylalanin; Phe(4-Cl), 4-Chlorphenylalanin; Phe(4-F), 4-Fluor-phenylalanin;

Pro, Prolin; Ser, Serin; Trp, Tryptophan og Tyr, Tyrosin. Alle de her beskrevne aminosyrer stammer fra L-10 serien, når ikke andet er nævnt, f.eks. betyder D-Trp, D-Tryptophan og D-Nal(2) betyder 3-(2-naphtyl)-D-Alanin. D-Cit(Q) eller D-Hci(Q) betyder, at et H-atom i aminogruppen af citrulllns (homocitrullins) ureidodel er substitueret med alkyl-15 gruppen Q.

Andre anvendte forkortelser er:

AcOH Eddikesyre

AcOEt Ethylacetat 20 Ac20 Eddikesyreanhydrid

Boc- tert.Butyloxycarbonyl- DIC Diisopropylcarbodiimid DIEA Ν,Ν-Diisopropylethylamin DMF Dimethylformamid 25 HOBt l-Hydroxybenzentriazolhydrat HPLC Højtryksvæskechromatografi

MeOH Methylalkohol TEA Triethylamin DCC Dicyclohexylcarbodiimid 30 MeCN Acetonitril ipOH Isopropanol Z(2-C1) 2-Chlorbenzyloxycarbonyl DCB 2,6-Dichlorbenzy1

Tos p-Toluensulfonyl 35 TFA Trifluoreddikesyre z Benzyloxycarbonyl DK 173375 B1 7 Særligt foretrukne er LHRH-analogerne med formlen I, hvor X er acetyl eller carbamoyl, 5 R1 er D-Phe(4-Cl), D-Nal(2), Pro eller D-Phe, R2 er D-Phe(4-Cl) eller D-Phe(4-P) R3 er D-Trp eller D-Pal(3), R6 er D-Cit, D-Hci, D-Cit(ethyl), D-Hci(ethyl), og R10 D-Ala.

10 Fremstillingen af peptiderne ifølge opfindelsen udføres ved, at man fremstiller dem ved inden for peptidkemien sædvanlig fragmentkondensation af tilsvarende peptidbrudstykker eller ved inden for peptidkemien sædvandlig, trinvis opbygning, eller at man i et pep-15 tid med formlen I, hvori R6 er D-Orn eller D-Lys, omsætter D-Orn's eller D-Lys's frie aminogruppe til en ureidogruppe ved omsætning med et alkalimetalcyanat eller en cyanatleverende forbindelse eller et C1-C3-alkylisocyanat, og eventuelt acylerer det opnAede 20 peptid og/eller overfører det i amidet og eventuelt overfører det i fysiologisk acceptable syresalte.

Den trinvise opbygning udføres f.eks. ved, at man først binder den carboxyterminale aminosyre glycin eller D-alanin eller amidet deraf, hvis a-aminogruppe 25 er beskyttet, kovalent til en hertil sædvanlig, syntetisk bærer, fraspalter α-aminobeskyttelsesgruppen, til den således opnåede, frie aminogruppe binder den efterfølgende, beskyttede aminosyre via dens carboxygruppe, dernæst igen fraspalter α-aminobeskyttelsesgruppen fra 30 denne anden aminosyre, herpå binder den næste aminosyre og på denne måde skridt for skridt tilføjer de øvrige aminosyrer af peptidet, der skal syntetiseres, i den rigtige rækkefølge, og efter tilføjelse af alle amino-syrerne spalter det færdige peptid ifølge krav 1 fra 35 bæreren og eventuelt fraspalter yderligere, tilstedeværende sidefunktionsbeskyttelsesgrupper.

DK 173375 B1 θ

Ved fragmentkobling anvender man fortrinsvis den uden racemisiering forløbende azidkobling eller dicyclohexylcarbodiimid/l-hydroxybenzotrazol- eller DCC/3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin-me-5 toden. Man kan også anvende aktiverede estre af fragmenter (DCC - dicyclohexylcarbodlimid).

Til den trinvise kondensation af aminosyrer egner aktiverede estre af benzyloxycarbonyl-aminosyrer, som f.eks. N-hydroxysuccinimidester eller 10 2,4,5-trichlorphenylester og 4-nitrophenylester, sig særligt godt. Aminolysen af de to sidstnævnte estre kan meget let katalyseres af N-hydroxyforbindelser, der har en surhedsgrad omtrent lig surhedsgraden for eddikesyre, som f.eks. l-hydroxybenzotriazol.

15 Som midlertidige aminobeskyttelsesgrupper kan grupper, der kan fjernes ved hydrogenering, som f.eks. benzyloxycarbonylgrupper (* Z-gruppen), eller svagt surt fraspaltelige grupper, som f.eks. 2-(p-diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- eller 2-(3,5-dimethoxyphenyl)-20 isopropyloxy-carbonylgruppen> nævnes.

Den trinvise kondensation udføres ved syntese udfra de relevante, eventuelt på sædvanlig måde beskyttede aminosyrer på sædvanlig måde. Ligeledes er det muligt at anvende automatiske peptid-synthetisizers, f.eks.

25 Beckman model 990 peptid-synthetizer, under anvendelse af de sædvanlige i handlen tilgængelige, beskyttede aminosyrer.

Denne syntese udføres f.eks. på den hidtil sædvanlige måde udfra de tilsvarende, beskyttede aminosy-30 rer, idet man først binder den carboxyterminale aminosyre af peptidet, der skal fremstilles, hvis a-aminogruppe er beskyttet, til en hertil sædvanlig, syntetisk bærer, fraspalter a-aminobeskyttelsesgruppen, til den således opnåede, frie aminogruppe binder den 35 efterfølgende, beskyttede aminosyre via dens carboxy- gruppe, dernæst igen fraspalter a-aminobeskyttelses- DK 173375 B1 9 gruppen fra denne anden aminosyre, herpå binder den næste aminosyre, og på den måde skridt for skridt tilfejer de øvrige aminosyrer af peptidet, der skal syntetiseres, i den rigtige rækkefølge, og efter tilføjelse af 5 alle aminosyrerne spalter det færdige peptid fra bæreren og fraspalter eventuelt yderligere tilstedeværende sidefunktionsbeskyttelsesgrupper. Reaktionen til tilføjelse af aminosyrerne finder fortrinsvis sted i temperaturområdet fra 10 til 40 °C, fortrinsvis fra 20-30 10 eC, eventuelt i et hertil sædvanligt, Indifferent opløsnings- eller suspensionsmiddel (f.eks. dichlor-methan), idet der eventuelt kan tilsættes indtil 20% dimethylformamid til forbedring af opløseligheden. Som syntetisk bæremateriale kommer syntetiske polymere på 15 tale, f.eks. polystyrenharpikser i perleform (f.eks. et chlormethyleret copolymerisat af polystyren og 1% divinybenzen), der kan kvælde. Som beskyttelsesgrupper for aminogruppen i α-stilling kommer følgende f.eks. på tale: tertiære butyloxycarbonylgrupper, carbobenzoxy- 20 eller carbobenzthiogrupper (eventuelt hver gang med p-brom- eller p-nitro-benzylgruppe), trifluoracetylgrup-per, phthalylgrupper, o-nitrophenoxy-acetylgruppen, tritylgruppen, p-toluensulfonylgruppen, benzylgruppen, i benzenkernen substituerede benzylgrupper (p-brom- el-25 ler p-nitro-ben2ylgrupper) og a-phenyl-ethylgruppen. I den forbindelse henvises der også til Jesse P. Greenstein og Milton Winitz's bog Chemistry of Amino Acids,

New York 1961, John Wiley and Sons, Inc., vol. 2, f.eks. side ΘΘ3 og følgende sider, samt The Peptids, 30 vol. 2, Ed. E. Gross og J.Meienhofer, Academic from New York, tabel ill og IV. Disse beskyttelsesgrupper kommer, grundliggende også på tale til beskyttelse af yderligere, funktionelle sidegrupper (OH-grupper og NH2-grupper) i de aminosyrer, der kommer på tale.

35 Tilstedeværende hydroxygrupper (serin, threonin) beskyttes fortrinsvis med benzylgrupper og lignende DK 173375 B1 10 grupper. Yderligere ikke-a-aminogrupper (f.eks. amino-grupper i ω-stillingen; arginins guanidinogruppe) beskyttes fortrinsvis med nitrogrupper.

Bindingen af de enkelte aminosyrer til hinanden 5 udføres ved hertil kendte fremgangsmåder. Især kommer følgende på tale:

Metoder med symmetriske anhydrider (i tilstedeværelse af dicyclohexylcarbodiimid), 10 carbodiimid-metoden, carbod iimid-hyd roxybenzotri azol-metoden (se The Peptides, bind 2, Ed. E. Gross og J.

Meienhofer).

15 Til tilføjelse af arginin anvendes fortrinsvis carbodiimidmetoden, til vedhæftning af asparagin og glutamin anvendes fortrinsvis carbodiimid-hydroxy-benzotriazolmetoden (se The Peptides, bind 2, Ed.E.

Gross og J.Meienhofer). For de øvrige aminosyrer anven-20 des i almindelighed metoden med symmetriske eller blandede anhydrider.

Fremstillingen af peptider ifølge krav l, hvori R6 er D-Orn eller D-Lys (udgangsmaterialer til omsætning med cyanat) kan f.eks. udføres ved den angivne, 25 trinvise peptidopbygning eller ved fragmentkondensation.

Når man fremstiller peptider ifølge opfindelsen, hvori R6 er Cit(Q) eller Hcl(Q) anvender man fortrinsvis det tilsvarende, på den endestående ureidogruppe 30 med alkylgruppen Q substituerede Cit eller Hci ved peptidsyntesen.

Overføringen af peptiderne med formlen I i deres syreadditionssalte kan gennemføres ved omsætning af disse med syrer på i sig selv kendt måde. Omvendt kan 35 frigørelsen af frie peptider udføres ved omsætning af deres syreadditionssalte med baser.

DK 173375 B1 11

Ved fremgangsmåden drejer sig altså f.eks. om rene fastfasemetoder, om delvise fastfasemetoder, om fragmentkondensation eller om klassisk opløsningsmid-delfasesyntese. (se M. Bodanszkyf "Principles of Pepti-5 de Synthesis", Springer-Verlag, 1984).

Fremgangsmåderne til ren fastfasesyntese er f.eks. beskrevet i lærebogen "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart og J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III., 1984 (2. udgave), G. Barany og 10 R.B. Merrifield, "The Peptides", kap. 1, side 1-285, 1979) Academic Press, Inc.

Klassisk opløsningsmiddelsyntese er beskrevet udførligt i værket "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl). Syntese von Peptiden", E. Wunsch 15 (udgiver) (1974), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD.

Det er fælles for sådanne synteser, at de reaktive sidekædefunktionsgrupper på de forskellige amino-syrerester beskyttes med passende beskyttelsesgrupper, der forhindrer kemisk reaktion på disse steder, indtil 20 gruppen tilsidst fjernes. I almindelighed er beskyttelsen af en α-aminogruppe på en aminosyre eller et fragment også fælles for disse, mens helheden reagerer med carboxylgruppen, hvorefter a-aminobeskyttelsesgruppen fjernes selektivt, for at den efterfølgende reaktion 25 kan ske på dette sted. Følgelig er det fælles for disse at fremstille et mellemprodukt som et trin af syntesen, hvilket omfatter alle aminosyreresterne og passende har dets ønskede sekvens i peptidkæden, idet sidekædebeskyt-telsesgrupperne er forbundet med passende rester.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemfø res ved anvendelse af mange bærefaser. Disse bærefaser kan f.eks. omfatte benzhydrylaminharpikser (hensigtsmæssigt 2% tværbundet), p-methylbenzhydrylaminharpik-ser (hensigtsmæssigt 2% tværbundet) eller lignende.

35 I formel II: DK 173375 B1 12 X1-R*-RJ-R*-Ser(X4)-Tyr(Xs)-R** (X6)-Leu-Arg(X*)-Pro-R*°-NH-X10 11 er R1 , R2 og R3 beskrevet nærmere ovenfor, 5 Xj er hydrogen eller en acylgruppe, der er afledt af ligekædede eller forgrenede alifatiske eller alicyclis-ke carboxylsyrer med l til 7 carbonatomer, eller en α-aminobeskyttelsesgruppe a-Aminobeskyttelsesgruppen, som X ^an være' ®r en s^an, soaTer velkendt fra teknik- 10 kens stade til trinvis syntese af polypeptider. Under klassen af α-aminobeskyttelsesgrupper, der kan anvendes som Xlf kan fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) eller t-butoxycarbonyl (Boc) nævnes.

X4 kan være en passende beskyttelsesgruppe for 15 hydroxylgruppen af Ser, som f.eks. benzyl (Bzl) eller 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Den foretrukne beskyttelsesgrupper er Bzl.

X5 kan være en passende beskyttelsesgruppe for phenylhydroxylgruppe af Tyr, som f.eks. Bzl, 2-Br-Z si-20 ler 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Den foretrukne beskyttelsesgruppe er DCB.

X6 er en passende beskyttelsesgruppe for sidekæ-deaminogruppen af Lys eller Orn. Eksempler på passende sidekædeaminobeskyttelsesgrupper er benzyloxycarbonyl 25 (Z) og 2-chlorbenzyloxycarbonyl [Z-(2-Cl)].

X® er en passende beskyttelsesgruppe for guani-dinogruppen af Arg, som f.eks. nitro, Tos, methyl-(t-butylbenz)-sulfonyl, 4-methoxy-2,3,6-tri-methylbenz- sulfonyl; Tos er den foretrukkne gruppe.

30 X10 er en for amidgruppen beskyttende benzhydryl- eller methylbenzhydrylgruppe, der er indbygget i en hertil sædvanlig bæreharpiks (f.eks. 98% styren-2%-divinylbenzen-copolymerisat, som indeholder benzhydrylamin- eller methylbenzhydrylamingrupper).

35 Valget af sidekædeaminobeskyttelsesgrupper er ikke afgørende, og de vælges følgelig i almindelighed således, at de ikke fjernes under forløbet til fjernelse af α-aminobeskyttelsesgrupperne under syntesen.

DK 173375 B1 13

Peptiderne med formlen I fremstilles udfra mel-lemproduktpeptidharpikser med formlen II ved fremgangsmåder, der er kendte ifølge teknikkens stade.

Fastfasesyntesen af mellemproduktpeptidharpiksen 5 med formlen II udføres 1 det væsentlige som beskrevet af Merrifield, J.Am. Chem. Soc., 85, S. 2149 (1963). Fasefasesyntesen begynder ved den C-terminale ende af peptidet ved kobling af en beskyttet a-aminosyre til en passende harpiks. Et sådant udgangsmateriale kan f.eks.

10 fremstilles ved, at a-aminobeskyttet Gly eller D-Ala bindes til en benzhydrylaminharpiks ved en amidbinding. Sådanne bæreharpikser er almindeligt i handelen tilgængelige og anvendes i almindelighed, når det polypeptid, det ønskes at fremstilles, på C-terminalen har en a-15 carboxyamidgruppe.

Ved en udførelsesform af syntesen beskyttes de primære aminogrupper af Gly og D-Ala med et t-butoxycarbonylerende, aktivt stof, og koblingen gennemføres ved, at man anvender en vilkårlig af de kendte 20 dialkylcarbodiimidkoblingsmetoder.

Valget af et passende koblingsreagens er kendt for fagmanden. Et særligt egnet koblingsreagens er N,N'-diisopropylcarbodiimid (DIC).

Aktiverende reagenser og deres anvendelse ved 25 peptidkobling er beskrevet i M. Bodansky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984.

Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens indføres i fastfasereaktoren i omtrent 2-gange overskud, og koblingen kan udføres i et medium af 30 DMF:CH2C12 (1:1) eller CH2Cl2 alene. I tilfælde, hvor ufuldstændig kobling forekommer, gentages koblingsmetoden, inden α-aminobeskyttelsesgruppen fjernes før kobling med den næste aminosyre. Udførelsen af koblingsreaktionen i hvert trin af syntesen kontrolleres 35 fortrinsvis ved ninhydrinreaktionen, som beskrevet af E.Kaiser, et al., Anal. Biochem., 3±, 595, (1970).

DK 173375 B1 14

Efter fuldstændiggørelse af den ønskede aminosy-resekvens af peptidharpiksen med formlen II fjernes Boc-gruppen på terminusen, og der udføres om ønsket en N-terminal acylering, idet et passende acylanhydrid el-5 ler syrechlorid anvendes i et 5O-ganges overskud i et halogeneret carbonhydridopløsningsmiddel, hensigtsmæssigt eddikesyreanhydrid i methylenchlorid i 30 minutter. Mellemproduktpeptidet kan fjernes fra bæreharpiksen, idet det behandles med et reagens, som f.eks. flyd-10 ende hydrogenfluorid, der ikke kun spalter peptidet fra harpiksen men også spalter alle de øvrige sidekædebes-kyttelsesgrupper X4, X5, X®, X10 og hvis den er tilstede X6.

Hvis hydrogenchlorid anvendes til spaltningen, 15 er anisol eller M-cresol eller om ønsket methylethyl-sulfid tilstede i reaktionsbeholderen som rensemiddel.

Overføringen af peptider med formlen II, hvori R*6 er D-Lys eller D-Orn, og X6 er hydrogen, i peptider med formlen I ved hjælp af cyanat er beskrevet i det 20 foregående.

Når acylering undlades, fører behandlingen af peptidharpikser med formlen II med hydrogenchlorid til dekapeptider, der har frie omega-amino- og/eller alpha-aminogrupper og har formlen II, hvori Xlf X4, X5, 25 X®, X10 og, hvis den er tilstede, X6 er hydrogen. Disse frie peptider omdannes til peptider med formlen I, hvori X er en carbamoylgruppe, ved behandling med cyanat, hensigtsmæssigt alkalimetalcyanat, fortrinsvis ka-liumcyanat. Den sidstnævnte reaktion, dvs. omdannelsen 30 af H2N til H2N-CO-NH ved aminoterminusen af peptidet, og omdannelsen af Orn/Lys-resten til Cit/Hci-resten iagttages ved HPLC ved hjælp af MeCN-vandige TFA-blandinger p.g.a. en karakteristisk 2-3-minutters forøgelse af retentionstiden for det carbamoyliserede pep-35 tid, dvs. forbindelser med H2N-CO-NH-gruppen, i forhold til de tilsvarende forbindelser med H2N-gruppen.

DK 173375 B1 15

Alternativt og foretrukket opnås peptidet med formlen I, hvori X=acyl eller carbamoyl, direkte fra mellemproduktpeptidharpiksen med formlen II, hvori XA er acyl eller carbamoyl, og R*6 er D-Cit, D-Hci, 5 D-Cit(Q) eller D-Hci(Q) ved spaltning eller fraspalt-ning af beskyttelsesgrupper.

Skønt en ren fastfasesyntese og en delvis fast-fasesyntese af forbindelserne med formlen I ligeledes beskrives heri kan forbindelserne også fremstilles ved 10 hjælp af klassiske opløsningsmiddel fasemetoder.

De som i eksemplerne beskrevne, fremstillede, syntetiske peptider sammenlignes med to af de stærkeste, i den senere tid beskrevne LHRH-antagonister, nemlig [Ac-D-Phe(4-Cl)1'2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10]LHRH 15 (ORG-30276) (Coy, et al., Endocrinology, 100, 1445, 1982) og [Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6]LHRH (ORF 18260) (Rivier, et al., i: Vickery, B.H., Nestor, Jr., J.J. Hafez, E.S.E. (Eds.), "LHRH and Its Analogs", s, 11-22, MTP Press, Lancaster, UK, 20 1984), og det blev fastslået, at de havde samme, høje, hæmmende virkning såvel in vitro som in vivo, bortset fra at de i modsætning til kontrolpeptiderne ikke udviste ødematøse virkninger in vivo.

Den hormonale aktivitet in vitro sammenlignes 25 med superfunderede rottehypofysecellesystemer (S.Vigh og A.V. Schally, Peptides, 5 suppl. 1:241-247, 1984), ved hvilke aktiviteten af LHRH (og andre frigørende hormoner) nøjagtigt kan fastslåes, da mængden af LH (eller andre hypofysehormoner), der afgives i det ud-30 strømmende medium, ikke kun er propotional med det anvendte peptids hormonfrigivende styrke, men også let kan måles ved hjælp af velbeskrevne radioimmunotests.

Til bestemmelse af styrken af en LHRH-antagonist anvendes blandinger, der indeholder LHRH i en konstant 35 koncentration (sædvanligvis 1 nM) og anatagonisten i variende koncentrationer, til superfunderingen til be- DK 173375 B1 16 stemmelse af molekylvægtsforholdet mellem antagonisten og LHRH, ved hvilket LHRH'et blokeres fuldstændigt.

Dette forhold er ca. 5 for både peptidet ifølge den foreliggende opfindelse og sammenligningspeptidet, når 5 rottehypofysecellesystemet forinkuberes med antagonisten i 9 minutter.

Ved en in vivo-ovulationshæmningstest (A.Corbin og C.W. Beattie; Endocr. Res. Commun. 2, 1-23, 1975; D.H. Coy, et al., Endocrinology, 100, 1445, 19Θ2) 10 fastslåes det ligeledes at peptiderne ifølge opfindelsen er ligeså virksomme som kontrolantagonisten, idet 87,5-100% hæmning af ovulationen kan iagttages ved en subkutan indgivelse med en dosis på 1-3 pg/rotte for hvert peptid.

15 Ved ødemforsøget ifølge Schmidt, et al., (Contraception, 29, 283-289, 1984) kunne der imidlertid fastslåes en udpræget forskel mellem kontrolpeptiderne og peptiderne ifølge opfindelsen. Kontrolpeptiderne bevirker ødemer i ansigtet og på ektremiteterne, når de 20 indgives subkutant i rotter i doser på 1,25 eller 1,5 mg/kg. ved peptiderne ifølge opfindelsen kunne ingen sådan reaktion iagttages, når de indgaves subkutant i en dosis på 1,5 mg/kg.

Ved de gennemførte forsøg inddeltes rotterne i 25 tre grupper til hver 5 rotter pr. gruppe og pr. undersøgt forbindelse. En sammenligning udførtes med en kendt forbindelse ifølge teknikkens stade med betegnelsen ORG 30276 (N-Ac-D-p-Cl-Phe1'2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10).

30 En gang pr. dag i to på hinanden følgende dage fik grupperne injiceret LHRH-antagonister subkutant i en dosis på 1,5 mg/kg. En kontrolgruppe fik kun injiceret fortyndingsmiddel. Rotterne iagttoges i 5 timer pr. dag. Rotternes reaktion klassificeredes som følger: NR 35 ingen synlig reaktion, PR delvis reaktion: ødem i nasal- og paranasalområdet, FR fuldstændig reaktion: ødem i ansigt med ødematøse ekstremiteter.

DK 173375 B1 17

Resultaterne er sammenfattet 1 tabel 1.

Tabel i 5 LHRH 1. dag 2. dag

Antagonist NR. PR. FR. NR. PR. FR.

ORG 30276 3 7 0 0 0 1C

Kontrol 900 900 10 Eksempel I 800 8 0* 0

Eksempel III 800 800

Eksempel IV 9 0 0 9 0 0

Eksempel V 9 0 0 8 1* 0

Eksempel XX900 81*0 15 Eksempel XXI 900 900

Eksempel XXVI 800 800

Eksempel XXVII 900 900 * meget ringe ansigtsødem.

20

Alle de viste peptider er fuldstændig virksomme ved hæmning af LHRH-udskillelsen i forholdsvis fornuftige koncentrationer in vitro, skønt de fleste er noget mindre stærke end de foreliggende in vitro-25 standarder, skønt disse peptider in vivo er meget stærkere.

Dette vistes ved et forsøg over histaminfrigørelsen in vitro fra bughindemastceller udført i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Morgan et al.

30 (Int. Archs. Allergy appl. Immun. 80, 70, 1986).

In vitro-frlgørelse af histamin véd dette forsøg bedøvedes rotter med ether og 35 bughuleexsudatceller opsamledes, idet de vaskedes med 12 ml mastcellemedium (MCM) (150 mM NaCl, 3 mM KC1; 3,0 DK 173375 B1 18 mM Na2HP04, 3,5 mM KH2P04, 0,98 mM CaCl; 5,6 mM dextrose, 0,1%'s kalveserumalbumin; 0,1%'s gelatine og 10 E/ml heparin) [9], Celler fra 4 eller 5 rotter samledes, centrifugeredes ved 120 G, resuspenderedes med MCM 5 til en koncentration på 0,5 x 10® ml, og en delmængde på 1 ml anbragtes 1 12 x 75 mm polyethylen-rør. Rørene bragtes i ligevægt i løbet af 15 minutter ved 37 eC og inkuberedes alene (baggrundsfrigørelse af histamin) med 48/80 (positive kontroller) (Sigma Chemicals, St, 10 Louis, Mo.) eller med passende koncentrationer (1 ng til 10 yg/ml) af LHRH-antagonlster i 60 minutter. Reaktionen afsluttedes ved afkøling af rørene til 4 eC. Rørene centrifugeredes, supernatanterne opsamledes og opbevaredes ved -20 "c indtil undersøgelsen for histamin. Der 15 udførtes dobbeltforsøg. Det samlede cellehistamin fikseredes ved kogning i 10 minutter. Det som reaktion på antagonisterne udskilte histamin udtryktes som % af den samlede, udskilte mængde. De koncentrationer der medførte udskilles af ca. 50% af det samlede mastcelle-20 histamin (HRD50yg/ml) bestemtes for hver af antagonisterne.

For alle peptiderne fastsloges en virkning til hæmning af ovulationen hos hunlige pattedyr eller hos kvinder ved meget lave doser. Peptiderne ifølge opfin-25 delsen oparbejdes ofte i form af farmaceutisk acceptable, ikke toxixiske salte, som f.eks. syreadditionssalte. Eksempler på sådanne syreadditionssalte er hydrochlorider, hydrobromider, sulfater, pho-sphater, fumarater, gluconater, tannater, maleater, 30 acetater, citrater, benzoater, succlnater, alginater, pamoater, malater, ascorbater, tartrater og lignende.

Når det virksomme stof oparbejdes i tabletform, kan tabletterne indeholde et farmaceutisk acceptablet fortyndingsmiddel, herunder et bindemiddel, som f.eks. tra-35 gant, majsstivelse eller gelatine; sprængemidler, såsom alginsyre, og smøremidler, såsom magnesiumstearat.

DK 173375 B1 19 Når indgivelse i flydende form ønskes, kan et sødemiddel og/eller smagsstof anvendes som en del af det farmaceutisk acceptable fortyndingsmiddel, og intravenøs indgivelse gennemføres i isotoniske saltopløs-5 ninger, phosphatpufferopløsninger eller lignende.

De farmaceutiske præparater indeholder almindeligvis peptidet sammen med en sædvanlig, farmaceutisk acceptabel bærer. Normalt er dosen ca. 1 til 100 pg af peptidet pr. kg legemsvægt af værten ved intravenøs ind-10 givelse, mens de orale doser vil være højere. Generelt udføres behandlingen af forsøgspersoner med disse peptider på samme måde som den kliniske behandling med andre LHRH-antagonister.

Disse peptider kan indgives intravenøst, subku-15 tant, intramuskulært, oralt, intranasalt eller intrava-ginalt til pattedyr eller mennesker til opnåelse af en frugtbarhedshæmning og/eller -kontrol og ligeledes ved anvendelser, ved hvilke en reversibel undertrykkelse af den gonadale aktivitet er nødvendig, som f.eks ved be-20 handling af for tidlig pubertet eller under bestrålings-- eller kemoterapi, virksomme doser varierer alt efter indgivelsesform og hvilket dyr eller menneske, der skal behandles. Et eksempel på en typisk doseringsform er en fysiologisk saltopløsning med peptid, der indgives i en 25 dosis på ca. 0,1 til 2,5 mg/kg krops-eller legemsvægt.

Den orale indgivelse af peptidet kan enten ske i fast eller flydende form.

Skønt opfindelsen er beskrevet med henvisning til den foretrukne udførelsesform, er det imidlertid 30 klart, at ændringer og modifikationer, der er indlysende for fagmanden kan udføres, uden at man går uden for opfindelsens rammer som defineret 1 kravene. Substitutioner udfra teknikkens stade, der ikke væsentlig ændrer virkningen, kan ligeledes anvendes i forbindelse 35 med opfindelsen.

SP-030, SB-075 og SB-088 er dekapeptider som beskrevet nærmere nedenfor, der udviser fordelagtige virkninger: DK 173375 B1 20

Ac-D-Na 1 (2) -D-Phe (4C1) -R3-$er-Tyr- R^Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 SB-030, R3 · D-Trp, R6 D-Cit; SB-075, R3 - D-Pal, R6 - D-Cit; SB-088, R3 - D-Pal, R6 - D-Hci.

5

Af de indeholdte aminosyrebestanddele er D-Pal, D-Cit og D-Hci ikke tilgængelige i handlen. Por D-Pal er en fuldstændig syntese nødvendig, der begynder med diethylacetamidomalonat og 3-picolylchlorid og gennem-10 føres på kendt måde. D-Cit og D-Hci kan let fremstilles udfra de i handlen tilgængelige diaminosyrer, som f.eks. D-Orn, eller D-Lys.

Hvert af peptiderne udviser en høj LHRH-hæmmende aktivitet som vist nedenfor og er fuldstændig fri for 15 ødematogene bivirkninger.

Tabel I

LHRH-hæmmende aktivitet af SB-030, SB-075 og SB-088.

Peptid Hæmning af LHRH (3 nM) Ovulationahæmnings-20 med ækvimolært peptid forsøg ved 0 min. efter 2 timer Dosis (yg) %hæmning SB-030 83 58 1,5 50 3.0 100 25 SB-088 86 60 1,5 66 2.0 83 3.0 100 SB-075 89 54 1,5 75 2.0 100 30 _

Forkortelser: Aminosyrerne og beskyttelsesgrupperne forkortes som anbefalet af IUPAC IUB JCBN [Eur.

J. Biochem. 138, 9-37 (1984)]. Andre forkortelser er:

Boc20, di-t-butyldicarbonat; DCM, dichlormethan; 35 TLC/TLE, tyndtlagschromatografi/elektroforese på sili- cagelplade.

DK 173375 B1 21 SB-030 har i forhold til SB-075 og SB-088 den fordel, at den kun indeholder én usædvanlig aminosyre, nemlig D-Cit. På den anden side har såvel SB-075 som SB-088 en højere styrke og en bedre vandopløse lighed end 5 SB-030.

Iagttagelserne og forsøgene, der udførtes under fremstillingen af SB-030, SB-075 og SB-088 kan sammenfattes som følger:

Fastfasesyntesen af SB-030, SB-075 og SB-088 på 10 en benzhydrylaminharpiks under anvendelse af Boc-metoden beskrives. Denne fremgangsmåde er fuldstændig tilstrækkelig til samling af disse peptider, da den omfatter den trinvise kædeforlængelse via carboxyterminu-sen til undgåelse af væsentlig racemisering under amid-15 bindingsdannelsen og ligeledes til sikring af en let isolering af mellemproduktet, der kunne vise sig særdeles vanskelig under syntese af fragmenter med hydrofil karakter (dvs. fragment 9-10 til 5-10).

Den sædvanlige, trinvise syntese i en opløsning 20 er naturligvis også en egnet fremgangsmåde til fremstilling af disse peptider, idet en sådan fremgangsmåde dog med sikkerhed er mere arbejds- og tidsforbrugende.

UDGANGSMATERIALER.

25

Faststofbærer.

En benzhydrylaminharpiks med 1,1 mækv NH2/g (Advanced ChemTech, Louisville, KY) anvendtes. Harpikser med lavere NH2-indhold, f.eks. 0,4-0,6 mækv/g kunne 30 ligeledes anvendes, idet de imidlertid naturligvis er mindre økonomiske i brug.

Amlnosyrederivater.

De nedenfor anførte Boc-aminosyrer erhvervedes 35 fra Bachem og anvendtes uden yderligere rensning: DK 173375 B1 22

Boc-D-Ala, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu.H20,

Boc-D-Nal, Boc-D-Phe(4Cl), Boc-Pro,

Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Trp og Boc-Tyr (DCB).

5 Boc-D-Cit, Boc-D-Hci og Boc-D-Pal, der ikke kan fås i handlen, fremstilledes i overensstemmelse med litteraturen (1-4) med ubetydelige ændringer.

Boc-D-Cit 10 Trin 1, D-Cit.

D-Orn (Sigma, 98%) omdannedes til D-Cit som beskrevet (1), bortsæt fra at reaktionsblandingen af (D-Orn)2Cu og KOCN omrørtes i 2-3 timer, til hindring af aflejring af en skorpe af (D-Cit, D-Orn)Cu på beholder-15 væggen.

Renheden af D-Cit bestemtes ved hjælp af TLE (tyndtlagselektroforese) ved en pH-værdi på 6,5 under anvendelse af pyridin-eddikesyre-vand (100:4:900)-puffer og ved 30 V/cm i 45 min.

20

Trin. 2, Boc-D-Cit.

6,6 g (30 mmol) Boc20 i 15 ml acetonitril tilsattes en opløsning af 4,4 g (25 mmol) D-Cit i 25 ml vand og 12,6 ml (90 mmol) triethylamin. Blandingen om-25 rørtes i 2-3 timer. Dernæst underkastedes blandingen en TLC (tyndtlagschromatografi), idet et opløsningsmiddelsystem af ethylacetat-pyridin-eddikesyre-vand (60:10:3:6) anvendtes: Boc-D-Cit, D-Cit og Boc-D-Orn (Boc), der dannedes af D-Orn-forureningen, udviste 30 RP'er på henholdsvis 0,4, 0,0 og 0,9. Blandingen fortyndedes med 25 ml vand og ekstraheredes med diethyl-ether (2x20 ml) og ethylacetat (2x20 ml) til fjernelse af overskuddet af dicarbonat og Boc-D-Orn(Boc)-forurening. Den vandige fase surgjordes med 1 M KHS04, og 35 efter tilsætning af ca. 10 g Ka2S04 ekstraheredes fasen med ethylacetat (3x30 ml). De kombinerede ethylacetat- DK 173375 B1 23 opløsninger (omhyggeligt skilt fra det vandige lag) inddampedes i vakuum. Remanensen fortyndedes i tør dioxan og inddampedes 3 gange i vakuum. Den derved dannede, lette olie fortyndedes i 25 ml DMF og an-5 vendtes til kobling som mmol/ml af denne grundopløsning af Boc-D-Cit.

Fremstillingen af Boc-Cit under anvendelse af Boc-Azid som acyleringsmiddel og fremstillingen af det krystallinske dicyclohexylaminsalt er beskrevet 10 (2).

BOC-D-Hci

Trin 1, D-Hci.

D-Hci fremstilledes ud fra D-Lys.HCl (Sigma) analogt med D-Cit (se ovenfor under punkt 1).

15

Trin. 2, Boc-D-Hci.

6,6 g Di-tert-Butyldicarbonat fortyndet i 15 ml acetonitril tilsattes en opløsning af 25 mmol (4,73 g) D-Hci i 25 ml vand og 12,6 ml (90 mmol) triethylamin, 20 og reaktionsblandingen omrørtes i 2-3 timer. Den fuldstændige reaktion eftervistes ved hjælp af TLC, som ved Boc-D-Cit. RF-værdierne for Boc-D-Hci, D-Lys og Boc-D-Lys(Boc) var henholdsvis 0,3, 0,0 og 0,8. Reaktionsblandingen ekstraheredes med ether. Den vandige fase 25 sucgjordes med 1 M KHS04, og efter tilsætning af 10 g Na2S04 ekstraheredes den med en l:l-blanding af ethyl-acetat og n-butanol (4x30 ml). De kombinerede, organiske opløsninger tørredes over Na2S04 og inddampedes i vakuum. Remanensen tritureredes med diethylether, filt-30 reredes og vaskedes med ether, hvorefter den suspenderedes i ethylacetat og omrørtes i 2 timer ved 20*C og yderligere 2 timer ved 0°C. Det således opnåede, krystallinske materiale filtreredes fra, vaskedes med kold ethylacetat og tørredes til dannelse af ca. 3,9 g Boc-35 D-Hci med smp. på 141-142eC (dek.).

DK 173375 B1 24

Boc-D-Pal(3)

Trin 1, Diethylacetamido(3-pyridylmethyl)malonat (3).

113.0 g (60,3%) diethylacetamido(3-pyridyl-methyljmalonat opnåedes ud fra 132,0 g diethylacet- 5 amidomalonat ved hjælp af fremgangsmåden ifølge J.E.

Rivier et al. (3). Råmaterialet smeltede ved 95eC.

En lille prøve, omkrystalliseret af vand smeltede ved 104-106eC (litteratur 95eC).

10 Trin 2, N-acetyl-3-(3-pyridyl)-DL-alaninethylester (4).

61,6 g (200 npol) diethylacetamido(3-pyridyl-methyl)malonat fortyndedes i 210 ml ethanolsk NaOH i en kolbe forsynet med en prop og henstod natten over ved stuetemperatur. Den næste dag opvarmedes blandingen til 15 tilbagesvaling og holdtes ved denne temperatur i 30 min. Blandingen afkøledes dernæst til stuetemperatur og filtreredes til fjernelse af de uopløselige faststoffer. De uopløselige stoffer vaskedes med flere små portioner ethanol og kastedes bort. De kombinerede fil- 20 trater inddampedes til tørhed, og den tørre remanens krystalliseredes af yand, idet 3-5 ml H20 per gram faststof anvendtes. 3.8,0 g (160 mmol, 80%) slutudbytte af materialet. Smp. 124-126°C (litteratur 118-121eC).

25 Trin 3, N-acetyl-3-(3-pyridyl)-D-alaninethylester (3).

45.0 g (190 mmol) af den ovennævnte DL-blanding fortyndedes i 225 ml varm 4,5%’s HCl. Denne opløsning afkøledes derefter hurtigt til 25 °C til dannelse af en suspension af fine krystaller. pH-værdien indstilledes 30 til 7,2 under anvendelse af 2 N KOH, hvorefter 150 mg a-chymotrypsin tilsattes, og pH-værdien holdtes derefter ved 6,8-7,2 under dråbevis tilsætning af 2 N KOH.

Efter at der ikke hayde vist sig nogen ændring i pH-værdien i 15 min., tilsattes yderligere 50 mg a-chymo- 35 trypsin til sikring af, at hydrolysen er forløbet fuldstændig. Der viste sig ingen yderligere ændring i pH- 25 DK 173375 B1 værdien efter denne friske tilsætning af enzymet, og slut ρΗ-værdien var 7,2. Denne opløsning ekstraheres med 4x200 ml ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne kombineres, tørres over Na2S04, tørremidlet filtreres fra, 5 og opløsningsmidlet fjernes under vakuum. Remanensen omkrystalliseres af toluen (13-15 ml/g) til dannelse af et produkt af 13,0 g (55 mmol, 57%) med et smp. på 79-81*C (litteratur 122°C).

10 Trin 4, 3-(3-pyridyl)-D-alanin, D-Pal(3) (4).

13.0 g (55 mmol) N-acetyl-3-(3-pyridyl)-D-alaninethylester opvarmes natten over med 100 ml 6 N HC1 under tilbagesvaling. Opløsningsmidlet fjernes under vakuum. 15 mg ethanol tilsættes, og dette fjernes 15 i vakuum. Denne ethanolbehandling gentages yderligere 2 gange. Remanensen omkrystalliseres af 90% ethanol til opnåelse af 13,0 g (54 mmol, 98%) amindihydro-chlorid. Smp. 237-239°C (dek.) (litteratur 253-256eC).

20 Trin 5, N-Boc-3-(3-pyridyl)-D-alanin, Boc-D-Pal(3) (3).

13.0 g (54 mmol) af det ovenfor beskrevne D-Pal (3) fortyndedes i 50 ml H20. 50 ml tetrahydrofuran og 30 ml (214 mmol) triethylamin tilsattes. Denne blanding tilsattes under omrøring med 1 times mellemrum 4 x 5 g 25 portioner af Boc20 (90,7 mmol). Efter omrøring i ialt 6 timer afdrives tetrahydrofuranet under vakuum. Overskydende dicarbonat fjernes med hexan. Det vandige lag indstilles til en pH-værdi på 4 med 6 N HCL og ekstraheres dernæst med 4 x 100 ml portioner af ethylacetat.

30 Ethylacetatet kombineres og tilbageekstraheres med 2 x 5 ml portioner af den mættede saltopløsning. Der tørres over Na2S04 og filtreres, og opløsningsmidlet afdrives under vakuum. Remanensen omkrystalliseres af toluen til opnåelse af 8,4 g (31 mmol, 57%) Boc-D-Pal(3) med et 35 smp. på 141-142eC (dek.) (litteratur 135-136eC).

DK 173375 B1 26 FREMSTILLING AF PEPTIDHARPIKSEN.

I en reaktionsbeholder til manuel syntese med en kapacitet på ca. 60 ml fyldtes l g (1,1 mmol) benzhy-drylamin.HCl-harpiks. Man lod den kvælde i 2 timer i 20 ml DCM og filtrerede dernæst. Derefter tilsattes 15 ml 10% DIEA/DCM til harpiksen, der omrystedes i 2 ml og filtreredes. Den sidste behanding gentoges yderligere 2 gange. BOC-aminosyren kobledes som præfremstillet HOBt-ester, som vist i tabel 2, lidt efter lidt til denne harpiks. Trin 1-12 udgør en koblingscyclus for en aminosyrerest. Ti efter hinanden følgende cykluser vil give en dekapeptidamidharpiks med den frie D-Nal(2)-rest. Denne peptidharpiks acetyleredes som beskrevet i trin 2e og 2f og udtoges dernæst fra reaktionsbeholderen, vaskedes med DCM og n-hexan og tørredes under vakuum til dannelse af 2,9-3,0 g af den ønskede acetyl-dekapeptidamidharpiks1 med følgende strukturer: 1, Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser(Bzl)-

Tyr(DCB)-D-Cit-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARPIKS, for SB-030; 2, Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-

Tyr(DCB)-D-Cit-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARPIKS, for SB-075; 3, Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-

Tyr(DBC)-D-Hci-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARPIKS, for SB-088.

SB-088 fremstilledes i en mindre mængde (0,1866 mmol), peptidharpiksen nr. 3 og det rå HF-salt af det opnåede, _ frie dekapeptid udgjorde henholdsvis 410 mg og 200 mg.

DK 173375 B1 5 27

Tabel 2

Synteseprogram

Trin Reagens og fremgangsmåde Blandetider 1 min.

1 forberedt HOBt-Ester3, kobling 90 10 2 Ninhydrin-test (5)4, når de små kugler er middelblå eller stærkt blå gentages trin 1+2, ved let blåfarvning fortsættes med trin 2a—2f 2a MeOH {10 ml), vask 1 15 2b 10%'s DIEA/DCM (10 ml), neutralisation 2 2c MeOH (10 ml), vask 1 2d DCM (10 ml), (tre gange) vask 2 2e Acetylimidazol5, acetylering 30 2f Ninhydrid-test, når positiv, gentages 20 2d-2f 3 MeOH (10 ml), (2 gange) vask 1 4 DCM (10 ml), (3 gange) vask 2 5 50%'s TFA/DM (10 ml), fjernelse af beskyttelsesgrupper 1 25 6 50% TFA/DM (10 ml), fjernelse af beskyttelsesgrupper 30 7 ipOH (10 ml), vask 1 8 10%'s DIEA/DCM (10 ml), neutralisation 3 9 MeOH (10 ml), vask 1 30 10 10%'s DIEA/DCM (10 ml), neutralisation 3 11 MeOH (10 ml), vask 1 12 DDCM (10 ml), vask_ 2 3 bortset fra Boc-D-Cit, Boc-aminosyre-HOBT-estere 35 fremstilledes som følger: 28 DK 173375 B1 3 mmol Boc-aminosyre [dvs. (i mg) D-Ala:568, D-Pro: 646, Arg (Tos): 1286, Leu: 748, Tyr(DCB): 1321,

Ser(Bzl): 886, D-Hci-865, D-Trp: 913 eller D-Pal{3): 5 799, D-Phe(4C1): 899, D-Nal(2); 946] og 460 mg (3 mmol) H0BT.H20 opløstes 1 1 ml DMF, fortyndedes med 2 ml DCM, afkøledes til oeC og bragtes til reaktion med 0,6 ml (3,8 mmol) DIC ved 0eC i 10 min., hvorefter harpiksen vaskedes med 4x1 ml DCM. For Boc-D-Cit opløstes 10 H0Bt.H20 i 3 ml grundopløsning af Boc-D-Cit, opløsningen bragtes til reaktion som ovenfor, hvorefter harpiksen vaskedes med lxl ml DMF og 3x1 ml DCM.

4 Når det drejer sig om Cit-holdige peptid-harpikser falder testen negativt ud, når kuglerne er 15 hvide (eller svagt gule), og opløsningen farves lilla.

Den fuldstændige kobling af Boc-Arg(Tos) til Pro-resten på harpiksen kan eftervises ved anvendelse af et lsa-tinreagens (2,5 g isatin, 20 g phenol, 30 g benzyl-alkohol og 2,5 g Boc-Phe). Testen falder negativt ud, 20 når kuglerne er hvide (eller lidt gule, men ikke blå) efter 3-4 ganges vask med acetone.

5 0,34 g imidazol opløst i 2 ml DCM bragtes til reaktionen med 0,5 ml eddikesyreanhydrid ved oeC i 2 min., hvorefer harpiksen vaskedes med 3x2 ml DCM._ 25 FREMSTILLING AF DE FRIE DEKAPEPTIDAMIDER.

Spaltning og fjernelse af beskyttelsesgrupper.

Hver peptidharpiks behandledes med 3 ml M-cresol 30 og ca. 30 ml hydrogenfluorid (HF) ved 0°C i 45 min.

Efter fjernelsen af HF under højvakuum tritureredes den tilbageblevne peptidharpiks med tør diethylether, den filtreredes fra og vaskedes med diethylether, og pepti-det ekstraheredes med følgende: 35 29 DK 173375 B1 1, 50%'s eddikesyre og DMF (2-2 x 20 ml) for SB-030; 2, 50%'s eddikesyre (3 x 15 ml) for SB-075 og SB-088; 5 og skiltes fra harpiksen ved filtrering. Peptidopløsningen inddampedes under vakuum og remanensen tri-tureredes med diethylether, filtreredes, vaskedes med diethylether og tørredes til dannelse af 1,2-1,3 g 10 HF-salt af de rå dekapeptider2 med en renhed på 70-85%.

Rensning.

Det rå peptid rensedes, idet man anvendte et Beckamn Prep-350-præparativt HPLC-system. Adskillelsen 15 opnåedes på en 41,5 x 200 mm Dynamax-søjle, der var pakket med sfærisk C18-silicagel (Porestørrelse 300 A, partikkelstørrelse 12 μπι) (RAININ Inc. Co. Woburn, MA).

Rå SB-030 påførtes søjlen i en 30%’s myresyreopløsning, mens rå SB-075 og SB-088 opløstes i 30% 20 eddikesyre. Trykgradienteluering anvendtes. Opløsningsmiddel A indeholdt 0,1%'s, vandig TFA, og opløsningsmiddel B var 0,1%'s TFA 1 70%'s vandig acetonitril.

Gennemløbshastigheden var 35 ml/min. Søjleelueringen overvågedes med en UV-detektor med variable bølgelængde 25 (Beckman Type 163) ved 220 nm.

Mængderne af de rene dekapeptider og de generelt opnåede udbytter var som følger: 1, 600 mg (34%) SB-030 2, 960 mg (52%) SB-075 og 30 3, 140 mg (45%) SB-088 (se fodnote 2), med en renhed på større end 95%.

Analytisk HPLC.

HPLC-analysen udførtes med en Hewlett-Packard 35 Modeil 1090 væskechromatograf. Peptidprøven chromato- graferedes på en 4,6x250 mm W-porex 5 ym, C1Q-søjle DK 173375 B1 30 (Phenomex, Rancho Palos Verdes, CA) med en gennemløbs-hastighed på 1,2 ml/min. under anvendelse af trykgra-dienteluering med opløsningsmidlerne A og B.

5

Amlnosyreanalyse.

Peptidprøven hydrolyseredes ved 110 eC i 20 timer i evakuerede, forseglede rør under anvendelse af 4M methansulfonsyre med 0,2% 3-(2-aminoethyl)indol, og hy-10 drolysatets aminosyresammensætning bestemtes i et Beckman 6300 aminosyreanalyseapparat.

De vedlagte tabeller viser LHRH-analogernes affinitet for hypofysen eller receptorer af den menneskelige brystkræftmembran, bestemt under anvendelse af ra-15 dioaktivt mærket LHRH eller radioaktivt mærket D-Trp6-LHRH.

Målingen med radioaktivt mærket LHRH (A) viser, at SB-075 har den højeste affinitet for hypofysereceptorerne, dvs. den største evne til at fortrænge 20 LHRH, hvilket er hovedkendetegnet for LHRH- antagonister. På den anden side har SB-088 en særlig høj affinitet for receptorer af den menneskelige bryst-kræf tihémbran i begge forsøg (A+B).

25 Litteraturhenvisning: 1. J.P. Greenstein og M. Winitz: Chemistry of the Amino Acids, John Wiley + Sons, New York, NY, 1961. (Cit: 2491-2494).

2. K. Eisele: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 356, 30 845-854 (1975).

3. J.E. Rivier, J. Porter, C.L. Rivier, M. Perrin, A. Corriogan, w.A. Hook, R.P. Slraganian og w.w. vale: J. Med. Chem. 29, 1846-1851 (1986).

4. C. Hoes,J. Raap, w. Bloemhoff og K.E.T. Kerling: 35 Reel. Trav. Chim. Pay-Bas 99, 99-104 (1980), 5. J.M. Stewart og J.D. Young: Solid Phase Peptide 31 DK 173375 B1

Synthesis, 2. udgave. Pierce Chemical Company, Rockford Illionois, 19846.

Eksempel I 5

Syntesen af peptidet med formlen Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 udførtes udfra mellemproduktpeptidet Ac-D-Nal(2)-Pro-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2.

10 Dette mellemproduktpeptid opbyggedes trinsvist på en ca. 0,6 mækv NH2/g-indeholdende benzhydrylaminharpiks på en Beckman 990 synthesizer, idet man begyndte med Boc-D-Ala i overensstemmelse med den nedenfor beskrevne f remgangsmåde.

15 Kobling gennemførtes i overensstemmelse med ske ma A som følger:

Skema A

20 Reagens Blandetid (min.) 1. Boc-Aminosyre 60-90

(2-3 m mol/g harpiks) * ækv. mængde af DIC

2. MeOH (2 gange) l 25 3. CH2C12 (2 gange) 1

Fjernelse af beskyttelsesgrupper udførtes i overensstemmelse med skema B som følger: 30 35 DK 173375 B1 32

Skema B

Reagens Blandetid (min.) 4. 50%'s TFA/l%'s ethandithiol 1 CH2Cl2 5 (2 gange) 15+15 5. IpOH/1%1 s ethandiethiol 1 6. 10%'S TEA i CH2C12 2 7. MeOH 1 8. 10%'s TEA i CH2C12 2 10 9. MeOH (2 gange) 1+1 10. CH2c12 (2 9an9e ) 1 + 1

Sammenfattet anvendes Boc til beskyttelses af α-aminogruppen. Tos anvendes til beskyttelse af Arg*s 15 guanidinogruppe. DCB anvendtes som beskyttelsesgruppe for Tyr's phenolske hydroxylgruppe, og Ser's OH-gruppe beskyttes med Bzl. Et 2 til 3 ganges overskud af den beskyttede aminosyre på basis af benzhydrylaminharpik-sens NH2-indhold plus et ækvivalent af DIC i CH2Cl2 20 eller 10-50%'s DMF/CH2Cl2 alt efter Boc-aminosyrens opløselighed anvendes i 2 timer.

Den N-terminale acetylering udføres med en 50-ganges overskud af eddikesyreanhydrid i CH2C12 i 0,5 timer. Det således opnåede, beskyttede me11emprodukt-25 peptid har følgende sammensætning:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser(X4)-Tyr-{X5)-D-Lys-(X6)-Leu-Arg(X8)-Pro-D-Ala-NH-X10, hvor X4 er Bzl, og X5 er DCB, X6 er Z(2-C1), X8 er Tos og X10 er en benzhydrylgruppe indbygget i harpiksen.

30 Til spaltning af den beskyttede peptidharpiks og fjernelse af beskyttelsesgrupper behandles der med 1,4 ml m-cresol og 15 ml hydrogenflourid pr, gram peptidharpiks i 0,5 timer ved 0 8 C og 0,5 timer ved stuetemperatur. Efter eliminering af hydrogenfluoridet under 35 højvakuum vaskes peptidharpiksen med diethylether, hvorefter peptidet ekstraheres med DMF og skilles fra har- 33 DK 173375 B1 piksen ved filtrering. DMF-opløsningen koncentreres dernæst under højvakuum til et lille volumen, hvorefter den tritureres med diethylether. Det således opnåede råprodukt renses som beskrevet ovenfor ved præparativ 5 HPLC. Man opnår således det rene, frie mellemproduktpeptid med den ovenfor angivne formel, hvori X4, X5, X6, x® og X10 betegner hydrogen.

Det frie D-Lys(X6)-holdige mellemproduktpeptid omsættes dernæst ved stuetemperatur med kaliumcyanat i 10 80% vandig DMF (81 mg KCNO/ml, tid: 24 timer). Efter fjernelse af opløsningsmidlet i højvakuum udføres rensning af reaktionsprodukterne ved præparativ HPLC. Man opnår således det ønskede D-Hci-holdige peptid.

Dette således opnåede D-Hci-holdige peptid er 15 i det væsentlige rent. HPLC-analysen udføres i et Hewlett-Packard 1090A trykgradient-væskechromatografi-system på en Phenomenex (W-Pores 5C18)-søjle og med eluering med opløsningsmiddel, hvor A er: 0,1%’s TFA, B er: 0,1%'s TFA i 70%'s CH3CN med en gradient på 30-60% 20 i løbet af 30 minutter. Det ønskede peptid har en HPLC-retentionstid på 28,2 minutter.

Peptidrensningen udføres på en Beckman

Prep-350-gradient-væskechromatograf, idet en 41,4 x 250 mm Kartusche med en præpareret, omvendt Dynemax 25 C-18-fase (300A, 12 pm) med opløsningsmiddel anvendes, idet A er: 0,1%'s TFA og B er: 0,1%'s TFA i 70%'s CH3CN og trykfaldet er 45-60% på 30 minutter. Det rene peptid, der opnås i form af TFA-salt, kan om ønsket omdannes til acetatformen, nemlig ved at blive ledt gemmen 30 en AG3X (Bio-Rad)-søjle på acetatform med efterfølgende lyofilisering.

35 34

Eksempel II

DK 173375 B1

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-T rp-Ser-Ty r-D-Hc1(ethyl)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 5

Fremstillingen udføres ud fra mellemproduktpep-tidet, som i 6-stillingen i stedet for D-Hci(ethyl) indeholder aminosyren D-Lys analogt med eksempel 1 ved omsætning med N-ethyl-isocyanat (0,1 mg i 10 ml pr.

10 1 g mellemproduktpeptid) i DMF ved 0-10 "C i 10 timer.

Retentionstiden var 30,8 minutter.

Eksempel III

15 Syntesen af peptidet Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-

Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 gennemføres som beskrevet i eksempel 1. Udgangspeptidet indeholder Boc-D-Orn(Z) i 6-stillingen i stedet for det i eksempel 1 anvendte Boc-D-Lys[Z(2-Cl)]. Dette udgangspeptid 20 fremstilles analogt med eksempel l.

Retentionstid 27,8 minutter. Retentionstid for udgangspeptidet 25,5 minutter.

Eksempel IV 25

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(ethyl)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Dette peptid opnås udfra Ac-D-Nal(2)-Phe(4-Cl)-30 D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 og N-ethyl- isocyanat i DMF (0,1 mg i 10 ml pr. g mellemproduktpeptid) ved 0-10 eC analogt med eksempel III.

Reaktionstid 10 timer.

HPLC-retentionstid 30,4 minutter.

35 35

Eksempel V

DK 173375 B1

Peptidsyntesen af Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)“ D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 udføres som 5 beskrevet i eksempel I, bortset fra at Boc-D-Phe(4-Cl) indbygges i stedet for Boc-D-Nal(2) i 1-stillingen af udgangspeptidet, hvorved der som umiddelbart udgangspeptid opnås Ac-D-Phe-(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-ProD-Ala-NH2.

10 Retentionstid 26,6 minutter. Retentionstid for udgangspeptidet med Ac i l-stillingen: 24,0 minutter.

Eksempel VI

15 Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(ethyl)-

Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Udgangspeptidet Ac-D-Phe(4-Cl)-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (se eksempel V) 20 reagerer med N-ethyl-isocyanat (0,1 mg i 10 ml pr. gram udgangspeptid) ved 0-10 eC i DMF.

Reaktionstid 10 timer.

HPLC-retentionstid: 29,2 minutter.

25 Eksempel vil

Peptidsyntesen af Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 udføres som beskrevet i eksempel 1, bortset fra at Boc-D-Phe(4-Cl) 30 indbygges i stedet for Boc-D-Nal(2) i 1 stillingen og Boc-D-Orn(Z) i stedet for Boc-D-Lys[Z(2-Cl)] i 6-stillingen, således at man som umiddelbart udgangspeptid opnår Ac-D-Phe (4-Cl)-D-Phe (4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentionstid 24,0 35 minutter), der omsættes med KCNO analogt med eksempel I.

36 DK 173375 B1 HPLC-retentionstid 26,3 minutter.

Eksempel VIII

5 Ac-D-Phe-(A-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(ethyl)-

Leu-Arg-Pro-D-Ala-NK2

Udgangspeptidet Ac-D-phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-

Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (se eksempel 10 Vil) omsættes med N-ethyl-isocyant i DMF (0,1 mg i 10 ml pr. gram udgangspeptid) ved 0-10 eC i 10 timer. HPLC-rententionstid 28,6 minutter.

Eksempel IX 15

Peptidsyntesen af Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 gennemføres analogt med eksempel I. Det opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 27,4 minutter.

20

Eksempel X

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(ethyl)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 25

Udgangspeptidet Ac-D-Nal(2)-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (se eksempel IX) omsættes med N-ethyl-isocyanat I DMF (0,1 mg i 10 ml pr. gram udgangspeptid) ved 0-10 °C i 10 timer.

30 HPLC-retentionstid: 30,0 minutter.

35 37

Eksempel XI

DK 173375 B1

Ac-Pro-D-Phe (4-Cl) -D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-

Ala-NH2 5 Udgangspeptidet Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentionstid 16,8 minutter) omsættes med kaliumcyanat analogt med eksempel I. Udgangspeptidet opnås analogt med eksempel I bortset fra at Boc-Pro indbygges i stedet for Boc-D-Nal(2) i 10 l-stillingen.

HPLC-retentionstid 19,3 minutter.

Eksempel XII

15 Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(ethyl)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Udgangspept idet Ac-D-Pro-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (se eksempel XI) omsæt-20 tes med N-ethyl-isocyanat i DMF (0,1 mg i 10 ml pr. gram udgangspeptid) ved 0-10 eC i 10 timer.

HPLC-retentionstid 22 minutter.

Eksempel XIII

25

Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Udgangspeptidet Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-0rn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentionstid 16,85 30 minutter) omsættes med kaliumcyanat analogt med eksempel I. Udgangspeptidet opnås ligeledes analogt med eksempel I med den forskel, at Boc-Pro indbygges I stedet for Boc-D-Nal(2) i l-stillingen og Boc-D-Orn(Z) Indbygges i stedet for Boc-D-Lys[Z(2-Cl)] i 35 6-stillingen.

HPLC-retentionstid 18,8 minutter.

38

Eksempel XIV

DK 173375 B1

Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(ethyl)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 5 udgangspeptldet Ac-Pro-D-Phe(4-cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (se eksempel XIII) omsættes med N-ethyl-isocyanat analogt med eksempel VI.

HPLC-retentionstid 24,9 minutter.

10

Eksempel XV

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 15

Udgangspeptldet Ac-D-Phe-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentionstid 20,8 minutter) omsættes med kaliumcyanat analogt med eksempel l. Udgangspeptldet opnås analogt med eksempel 20 1, idet der dog i 1-stillingen i stedet for

Boc-D-Nal(2) indbygges aminosyreresten Boc-D-Phe.

HPLC-retentionstid 23,4 minutter.

Eksempel xvi 25

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(ethyl)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Udgangspeptldet Ac-D-Phe-D-Phe{4-Cl)-D-Trp-Ser-30 Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (se eksempel XV) omsættes med N-ethyl-isocyanat i DMF (0,1 mg i lo ml pr. gram udgangspeptid) ved 0-10 °C i 10 timer.

HPLC-retentionstid 26,0 minutter.

35 39

Eksempel xvil DK 173375 B1

Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 5

Udgangspeptidet Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentionstid 21,0 minutter) omsættes med kaliumcyanat analogt med eksempel l. udgangspeptidet fremstilles analogt med eksempel 10 I med den forskel at Boc-D-Phe indbygges i l-stillingen i stedet for Boc-D-Nal(2) og Boc-D-Orn(Z) indbygges i 6 stillingen i stedet for Boc-D-Lys[Z(2-Cl)].

HPLC-retentionstid 23,1 minutter.

15 Eksempel XVIII

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(ethyl)-leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 20 Udgangspeptidet Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-0rn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (se eksempel xvil) omsættes med N-ethyl-isocyanat i DMF (0,1 mg i 10 ml pr. gram udgangspeptid) ved 0-10 °C i 10 timer.

HPLC-retentionstid 25,4 minutter.

25

Eksempel XIX

Almen fremstilling af et peptid ifølge opfindelsen med formlen Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-30 Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2.

Dette peptid fremstilles skridt for skridt ved hjælp af en benzhydrylaminharpiks, som indeholder ca.

1,0 molækvivalenter aminogrupper pr. gram, under anvendelse af en Beckman 990 synthesizer, idet man star-35 ter udfra Boc-D-Ala. Koblingen udføres i overensstemmelse med skema A, der er angivet i eksempel I. Fjer- DK 173375 B1 40 nelsen af beskyttelsesgrupper udføres i overensstemmelse med skemaet B, der angivet i eksempel I. For de øvrige betingelser gælder de tilsvarende angivelser ifølge eksempel I.

5 Det således beskyttede mellemproduktpeptid har følgende sammensætning:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser(X4)-Tyr (X5 >-D-Hci-Leu-Arg(X8)-Pro-D-Ala-NHX10, hvori X4 - Bzl, og Xs »

Dzb, X® » Tos og X10 betegner en benzhydrylgruppe, der 10 er indbygget i harpiksen. Spaltningen af det således opnåede, beskyttede peptid udføres i overensstemmelse med eksempel I med 1,4 ml m-cresol og 15 ml hydrogenfluorid pr. gram peptidharpiks (0,5 timer ved 0 °C og 0,5 timer ved stuetemperatur). Alle øvrige forholdsreg-15 ler er som angivet i eksempel I. Det opnåede råprodukt renses ved preparativ HPLC-chromatografi. HPLC-analysen udføres i overensstemmelse med eksempel I i et Hewlett-Packard 1090A, trykgradient-væskechrooatografisystem under anvendelse af en Phenomenex-søjle under eluering 20 med følgende opløsningsmidler:

Opløsningsmiddel A: 0,1% TFA, opløsningsmiddel B: 0,1% TFA i 70% CH3CN med en gradient fra 35-75% i 30 minutter. Det opnåede dipeptid, der i 6-stillingen indeholder D-Hci, har en HPLC-retentionstid på 22,9 25 minutter. Yderligere rensning udføres på en Beckman-Prep-350-gradient-væskechromatograf i overensstemmelse med eksempel i.

Eksempel XX

30 Peptidet H2N-C0-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-,

Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 fremstilles i overensstemmelse med eksempel XIX med den forskel, at H2N-C0-D-Nal(2) indbygges i 1-stillingen i stedet for Boc-D-Nal(2), og at den N-terminale acetylering ikke 35 udføres.

HPLC-retentionstid 24,0 minutter.

41

Eksempel XXI

DK 173375 B1

Syntesen af peptidet Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 gennemføres som 5 beskrevet i eksempel XIX, bortset fra at Boc-D-Cit indbygges i 6-stilling i stedet for Boc-D-Hci. Det ønskede peptid har en HPLC-retentionstid på 22,5 minutter.

Eksempel XXII

10

Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Fremstilling i overensstemmelse med eksempel 15 XIX, bortset fra at Boc-D-Phe(4-Cl) indbygges i 1-stilling i stedet for Boc-D-Nal(2).

HPLC-retentionstid 24,0 minutter.

Eksempel XXIII

20

Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Fremstillingen udføres analogt med eksempel XIX 25 med den forskel, at Boc-D-Phe(4-Cl) indbygges i l-stillingen i stedet for Boc-D-Nal(2) og Boc-D-Cit indbygges i 6-stilling i stedet for Boc-D-Hci.

Det opnåede peptids retentionstid 20,8 minutter.

30 Eksempel XXIV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 35 Franstillingen udføres i overensstemmelse med eksempel XIX med den forskel, at Boc-Gly indbygges DK 173375 B1 42 istedet for Boc-D-Ala i 10-stillingen.

Det opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 22,4 minutter.

5 Eksempel XXV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hcl-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 10 Fremstilling udføres i overensstemmelse med eks empel XIX med den forskel, at Boc-D-Pal(3) indbygges i stedet for Boc-D-Trp i 3-stillingen.

Det opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 13,6 minutter.

15

Eksempel XXVI

Ac-D-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 20

Fremstilling udføres i overensstemmelse med eksempel XIX med den forskel, at Boc-D-Cit Indbygges i stedet for D-Hci I 6-stillingen og Boc-D-Pal(3) 1 stedet for Boc-D-Trp I 3-stillingen.

25 Det opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 13,3 minutter.

Eksempel XXVII 30

Fremstillingen af peptidet H2N-Co-Nal(2)-D-Phe-(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 gennemføres som beskrevet i eksempel XIX, med den forskel, at at Boc-D-Cit indbygges i 6-stilling i stedet 35 for Boc-D-Hci, at Boc-D-Pal(3) Indbygges i 3-stillingen i stedet for Boc-d-Trp, og at den N-terminale acetyle- DK 173375 B1 43 ring udelades. Man opnår således mellemproduktpeptidet: H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2. Det således opnåede, frie peptid omsættes dernæst med kaliumcyanid i 80%'s vandig DMF (81 mg 5 KOCN/300 mg peptid/ml) ved stuetemperatur i 24 timer.

Efter inddampning under højvakuum renses reaktionsblandingen ved preparativ HPLC. Det således opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 14,4 minutter.

10 Eksempel XXVIII

H2N-CO-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hcl-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 fremstilles analogt med eksempel XIX med den forskel, at Boc-D-Pal(3) indbygges I 15 3-still ingen i stedet for Boc-D-Trp, og at den N- terminale acetylering udelades. Man opnår mellemproduktpeptidet H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2· Det således opnåede, frie peptid omsættes dernæst med kaliumcyanat i vandigt DMF 20 (81 mg KOCN/300 mg peptidtid/ml) ved stuetemperatur i 24 timer. Efter inddampning under højvakuum renses reaktionsblandingen ved preparativ HPLC. Det således opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 14,7 minutter.

25

Eksempel XXIX

Fremstillingen af peptidet H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe (4-Cl) -D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-I.eu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 30 begynder med fremstillingen af mellemproduktpeptidet H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2. Fremstillingen af mellemproduktpeptidet gennemføres som beskrevet i eksempel xix med den forskel, at Boc-D-Orn(Z) indbygges i 6-stilling i stedet for 35 Boc-D-Hci, og at den N-terminale acetylering udelades.

Det frie peptid indeholdende D-Orn i 6-stilling omsæt- 44 DK 173375 B1 tes dernæst med kaliumcyanat i 80%'s vandig DMF (162 mg KOCN/300 mg peptid/ml) ved stuetemperatur i 24 timer.

Efter inddampning under højvakuum renses reaktionsblandingen ved preparativ HPLC. Det således opnåede peptid 5 har en HPLC-retentionstid på 23,6 minutter.

Eksempel XXX

Fremstillingen af peptidet H2N-C0-D-Nal(2)-D-10 Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 begynder med fremstillingen af mellemproduktpeptidet H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2· Fremstillingen af mellemproduktpeptidet gennemføres som beskrevet i eksempel XIX med den forskel, 15 at Boc-D-Lys[Z](2-Cl)] indbygges i stedet for Boc-D-Hci i 6-stilling, og at den N-terminale acetylering udelades. Det frie peptid, der indeholder D-Lys i 6-stilling omsættes dernæst med kaliumcyanat i 80%rs vandig DMF (164 mg KOCN/300 mg peptid/ml) ved stuetem-20 peratur i 24 timer. Efter inddampning under højvakuum renses reaktionsblandingen ved preparativ HPLC. Det således opnåede peptid har en HPLC-retentionstid på 14,0 minutter.

25 Eksempel XXXI

Tabletformulering til bukkal (f.eks. sublingal) indgivelse; 30 1. LHRH-antagonist 10,0 mg presbart sukker 86,0 mg

Calciumstearat . 4,0 mg 35 DK 173375 B1 45 2. LHRH-antagonist 10,0 mg pres bart sukker 88,5 mg

Magnesiumstearat 1,5 mg 5 3. LHRH-antangonlst 5,0 mg

Mannitol 83,5 mg

Magnesiumstlvelse 1,5 mg 4. LHRH-antagonist 10,0 mg 10 Forgelatineret stivelse 10,0 mg

Lactose 74,5 mg

Forgelatineret stivelse 15,0 mg

Magnesiumstearat, USP 1,5 mg 15 Fremgangsmåde A. LHRH-antagonist opløses i en tilstrækkelig mængde vand til dannelse et fugtigt granulat, når det blandes med sukkerbestanddelen af bæreren. Efter fuldstændig blanding tørres granulatet i en dråbeopsamlingsbeholder med en tørreenhed med fluidise-20 ret leje. Det tørre granulat gennemlyses dernæst til påvisning af eventuelle store aggregater og neddeling af disse, hvorefter det blandes med de øvrige komponenter .

Granulatet presses dernæst i en standard-25 tabletmaskine til en specifik tabletvægt.

Fremgangsmåde B. Ved denne fremgangsmåde indeholder alle formuleringer 0,01%·s gelatine. Gelatinen opløses først i det vandige granulatopløsningsmiddel, hvorefter LHRH-antagonisten tilsættes. De øvrige trin 30 er som beskrevet ved fremgangsmåde A.

35 46

Eksempel XXXII

DK 173375 B1

Langtidsvirkende, intramuskulært lnjicerbar formulering.

5

Langtidsvirkende, intramuskulært injicerbar se-samoliegel.

LHRH-antagonist 10,0 mg

Aluminiummonostearat 20,0 mg 10 Sesamolie til 10 ml

Aluminummonostearat opvarmes længe sammen med sesamolien under omrøring ved 125 eC, indtil en klar, gul, opløsning opnåes. Denne blanding steriliseres der-15 næst i et sterilisationsapparat og afkøles. LHRH-antagonisten tilsættes dernæst aseptisk ved hjælp af triturering. Særligt foretrukne LHRH-antagonister er salte med lav opløselighed, f.eks. zinksalte, zinktan-natsalte, pamoatsalte og lignende. Disse har en usæd-20 vanlig lang aktivitetstid.

Eksempel XXXIII

Langtidsvirkende, intramuskulært injicerbare, 25 bionedbrydelige polymer-mikrokapsler.

LHRH-antagonist 1% 25/75 glycoid/lactld-copolymer (copolymerisat af gly-colsyre og mælkesyre) (logaritmisk viskositettal 0,5) 30 99% 35 DK 173375 B1 47

Mikrokapsler (0-150 Ångstrøm) af den ovenstående formulering suspenderet i:

Dextrose 5,0%

Carboxymethylcellulose-natrium 0,5% 5 Benzylalkohol 0,9%

Tween 80 0,1%

Vand, renset q.w. (indtil) 100,0% 25 mg mikrokapsler suspenderes i 1,0 ml af vehiklen.

10 Eksempel XXXIV

Vandig opløsning til intramuskulær injektion LHRH-antagonist 500 mg 15 Gelatine (ikke-antigen) 5 mg

Vand til injektionsformål ad 100 ml

Gelatinen og LHRH-antagonisten opløses i injektionsvandet. Dernæst filtreres opløsningen ste-20 rilt.

Eksempel XXXV

Formulering til rektal indgivelse.

25

Supposltorievehikel til rektal Indgivelse LHRH-antagonist 5,0 mg

Witepsol Hl5 20,0 mg 30 LHRH-antagonisten blandes med det smeltede wi tepsol Hl5 og hældes i en støbeform til 2 gram.

35

Claims (15)

1. Peptid, kendetegnet ved, at det har formlen:

2. Peptid ifølge krav i, kendetegnet ved, at X er en acetyl- eller carbamoyl-gruppe, R1 er D-Nal(2), D- eller L-Pro, D-Phe eller D-Phe(4-C1),

25 R2 er D-Phe(4-Cl) eller D-Phe(4-F) og R3 er D-Trp eller D-Pal(3).

3. Peptid, kendetegnet ved, at det har formlen:

30 X1‘R1-R2-R3-Ser(X4)-Tyr(X5)-R*6(X6)-Leu-Arg(X8)-Pro-R10-NH-X10 hvor X^ er en acylgruppe på basis af ligekædede eller for-35 grenede alifatiske eller alicycliske carboxylsyrer med 1 til 7 carbonatomer eller t-Boc, hydrogen eller carbamoyl, DK 173375 B1 49 X4 er en beskyttelsesgruppe for Ser-hydroxygruppen eller hydrogen, X5 er en beskyttelsesgruppe for Tyr-phenolhydroxyl-gruppen eller hydrogen,

4. Peptid ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at 20. er acetyl, Boc eller hydrogen, X4 er benzyl, X5 er 2,6-dichlorbenzyl, X6 er benzyloxycarbonyl eller 2-chlorbenzyloxycar-bonyl,

25 X8 er p-toluensulfononyl eller nitro, X10 er en bæreharpiks indeholdende benzhydryl- eller methylbenzhydrylgrupper, R1 D-Nal(2) eller D-Phe(4-Cl), R2 er D-Phe(4-Cl),

30 R3 er D-Trp eller D-Pal(3), R10 er D-Ala.

5. Peptid ifølge et eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at X eller Xx er acetyl.

5 X6 er en beskyttelsesgruppe for Lys- eller Orn-sidekædeaminogruppen eller hydrogen X8 er en beskyttelsesgruppe for Arg-Guanidinogruppen X10 er en bæreharpiks indeholdende benzylhydryl- eller methylben2hydrylgrupper, eller hydrogen,

5 X-R,-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Prp-R10-NH2 i hvor X er en acylgruppe af ligekædede eller forgrenede alifatiske eller alicykliske carboxylsyrer med 1 til 7 10 carbonatomer eller en carbamoylgruppe, R1 er D- eller L-Pro, D- eller L-A3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) eller D-Nal(2), R2 er D-Phe eller D-Phe(4-Hl)

15 R3 er D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) eller D-Nal(2), R6 er D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) eller D-Hci(Q) og R10 er Gly eller D-Ala, idet Hl er fluor, chlor eller brom, og Q er Ci-C3-alkyl, og 20 farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

6. Peptid ifølge et eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at X eller Xx er carbamoyl . DK 173375 B1 50

7. Peptid ifølge et eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at R6 eller R*6 er D-Cit eller D-Hci.

8. Peptid ifølge krav 3, kendetegnet 5 ved, at R*6 er D-Lys eller D-Orn.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af peptider med formlen X-R,-R,-R*-Ser-Tyr-R*-Leu-Arg-Pro-R1°-NH2 I 10 hvor X er en acylgruppe af ligekædede eller forgrenede alifatiske eller alicykliske carboxylsyrer med 1 til 7 carbonatomer eller en carbamoylgruppe,

15 R1 er D- eller L-Pro, D- eller L-å3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) eller D-Nal(2), R2 er D-Phe eller D-Phe(4-H1) R3 er D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) eller D-Nal(2),

20 R6 er D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) eller D-Hci(Q) og R10 er Gly eller D-Ala, idet Hl er fluor, chlor eller brom, og Q er C1-C3-alkyl, og farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, 25 kendetegnet ved, at man fremstiller det ved inden for peptidkemien sædvanlig fragmentkondensation af passende peptidbrudstykker eller ved inden for peptidkemien sædvanlig, trinvis opbygning, eller at man i et peptid med formlen I, hvori R6 er D-Orn eller D-Lys 30 omsætter den frie aminogruppe af D-Orn eller D-Lys med et alkalimetalcyanat eller en cyanat-leverende forbindelse eller et C1-C3-alkylisocyanat til en ureidogruppe og eventuelt acylerer de opnåede peptider og/eller overfører dem i amiderne, og eventuelt overfører dem i 35 fysiologisk acceptable salte.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, man udfører den trinvise opbygning DK 173375 B1 51 ved, at man først binder den carboxyterminale aminosyre glycin eller D-alanin eller amidet deraf, hvis a-aminogruppe er beskyttet, kovalent til en hertil sædvanlig, syntetisk bærer, fraspalter a-amlnobeskyttel-5 sesgruppen, til den således opnåede, frie aminogruppe binder den efterfølgende, beskyttede aminosyre via dens carboxygruppe, dernæst igen fraspalter a-amlnobeskyt-telsesgruppen fra denne anden aminosyre, herpå binder den næste aminosyre og på denne måde skridt for skridt 10 tilføjer de øvrige aminosyrer af peptidet, der skal syntetiseres, i den rigtige rækkefølge, og efter tilføjelse af alle aminosyrerne spalter det færdige peptid ifølge krav i fra bæreren og eventuelt fraspalter yderligere, tilstedeværende sidefunktionsbeskyttelsesgrup-15 per.

10 R1 er D- eller L-Pro, D- eller L-å3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) eller D-Nal(2), R2 er D-Phe eller D-Phe(4-Hl), R3 er D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) eller D-Nal(2),

15 R*6 er D-Lys eller D-Orn, D-Cit eller D-Hci, og R10 er Gly eller D-Ala, idet Hl er fluor, chlor eller brom.

11. Forbindelse ifølge et eller flere af de foregående krav 1 til 8 til anvendelse som terapeutisk aktivt stof.

12. Lægemiddel, kendetegnet ved, at 20 det indeholder en forbindelse med den almene formel I ifølge et eller flere af de foregående krav 1 til 8 foruden sædvanlige bære- og/eller fortyndingsmidler eller hjælpestoffer.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et læge-25 middel, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen I ifølge et eller flere af de foregående krav i til 8 oparbejdes til et farmaceutisk præparat eller bringes på en terapeutisk anvendelig form med sædvanlige, farmaceutiske bærestoffer og/eller fortyn-30 dingsmldler eller hjælpestoffer.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at mængden af aktivt stof ifølge et eller flere af de foregående krav 1 til 8 ligger mellem 0,1 og 2,5 mg/kg krops- eller legemsvægt 35 pr. dag.

15. Anvendelse af forbindelser ifølge et eller flere af de foregående krav 1 til 8 til fremstilling af 52 DK 173375 B1 lægemidler. 5 10 15 20 25 30 35