DK175917B1

DK175917B1 - Subtilisinvarianter med foröget termostabilitet

Info

Publication number: DK175917B1
Application number: DK198904964A
Authority: DK
Inventors: Michael W Pantoliano; Barry C Finzel; Philip N Bryan
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1987-04-06
Filing date: 1989-10-06
Publication date: 2005-06-27
Also published as: ATE184316T1; DE3856593D1; JP2001029076A; EP0353250A1; EP0353250A4; DK496489D0; EP0916732A1; EP0916732B1; WO1988008028A1; DE3856362D1; JP3155984B2; DE353250T1; DE3856362T2; JPH02502874A; ATE371029T1; EP0353250B1; DK496489A

Description

i DK 175917 B1

Den foreliggende opfindelse angår subtilisinvarianter med forøget termostabilitet i forhold til tilsvarende vildtype-subtilisiner ved ændring af proteinernes divalente metalionbindingssteder .

5

Proteiner er lineære polymerer af aminosyrer. Da polymerisa-tionsreaktionen, der giver et protein, resulterer i tabet af et molekyle vand fra hver aminosyre, betegnes proteiner ofte som værende sammensat af aminosyre-"rester". Naturlige 10 proteinmolekyler kan indeholde så meget som 20 forskellige typer af aminosyrerester, hvoraf hver indeholder en særegen sidekæde. Sekvensen af aminosyrer i et protein definerer proteinets primære struktur.

15 Proteiner folder sig til en tredimensionel struktur. Foldningen bestemmes af aminosyresekvensen og af proteinets miljø. Proteiners bemærkelsesværdige egenskaber afhænger direkte af proteinets tredimensionelle konformation (form). Denne kon-formation bestemmer således aktiviteten eller stabiliteten 20 hos enzymer, kapaciteten og specificiteten hos bindende proteiner og de væsentlige strukturelle egenskaber hos receptormolekyler. Da et proteinmolekyles tredimensionelle struktur er så betydningsfuld, har man længe erkendt, at et middel til stabilisering af et proteins tredimensionelle struktur 25 ville være i høj grad ønskeligt.

Et proteins tredimensionelle struktur kan bestemmes på flere forskellige måder. Den måske bedst kendte måde til bestem-r melse af proteinstruktur indebærer anvendelsen af den rønt- 30 genstrålekrystallografiske teknik. En fremragende generel oversigt over denne teknik kan findes i Physical Biochemistry, K.E. Van Holde (Prentice-Hall, NJ (1971) side 221-239), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisning. 'Ved anvendelse af denne teknik er det muligt at klarlægge den 35 tredimensionelle struktur med en bemærkelsesværdig nøjagtighed. Det er også muligt at afprøve et proteins tredimensionelle struktur ved anvendelse af cirkulær dikroisme, lysspredning, eller ved måling af absorption og emission af strålingsenergi (Van Holde, Physical Biochemistry, Prentice-

I DK 175917 B1 I

I 2 I

I Hall, NJ (1971) ). Desuden kan proteinstrukturen bestemmes I

ved anvendelse af neutrondifraktionsteknik eller ved I

kernemagnetisk resonansteknik (Physical Chemistry, 4. udgave, I

I W. J. Moore, Prentice-Hall, NJ (1972)). I

I 5 I

Undersøgelsen af talrige proteiners tredimensionelle struktur I

har vist et antal mønstre, der stadig dukker op. α-spiraler, I

parallelle β-flader og anti-parallelle β-flader er de mest I

almindeligt iagttagede mønstre. En fremragende beskrivelse af I

10 sådanne proteinmønstre er givet af R. E. Dickerson et al. i: I

The Structure and Action of Proteins, H.A. Benjamin, Inc., CA I

(1969). Henføringen af hver aminosyre til et af disse mønstre I

definerer proteinets sekundære struktur. Spiralerne, fladerne I

og vendingerne i et proteins sekundære struktur sammenpakkes I

15 til dannelse af proteinets tredimensionelle struktur. Mange I

H proteiners tredimensionelle struktur kan karakteriseres ved I

at have indre overflader (rettet væk fra det vandige miljø, I

hvori proteinet normalt befinder sig) og ydre overflader (som I

er i tæt nærhed til det vandige miljø). Ved undersøgelse af I

20 mange naturlige proteiner har forskere opdaget, at hydrofobe I

rester (såsom tryptophan, phenylalanin, tyrosin, leucin, I

isoleucin, valin eller methionin) mest hyppigt findes på I

proteinmolekylernes indre overflade. I modsætning hertil I

findes hydrofile rester (såsom aspartat, asparagin, glutamat, I

25 glutamin, lysin, arginin, histidin, serin, threonin, glycin I

og prolin) mest hyppigt på proteinets ydre overflade. I

Aminosyrerne alanin, glycin, serin og threonin møder man med I

lige stor hyppighed på både de indre og de ydre proteinover- I

I flader. I

I 30 I

Proteiner findes i en dynamisk ligevægt mellem en foldet, - I

ordnet tilstand og en ufoldet, uordnet tilstand. Denne I

ligevægt afspejler delvis den indbyrdes påvirkning inden for I

I kort afstand mellem de forskellige segmenter af polypeptid- I

I 35 kæden, som har tendens til at stabilisere proteinets I

I struktur, og på den anden side de termodynamiske kræfter, som I

har tendens til at fremme tilfældig udformning af molekylet. I

Det har længe været kendt, at metalioner stabiliserer I

3 DK 175917 B1 f proteiner ved binding på specifikke steder i den tertiære struktur. Således har mange proteiner isoleret fra termofile organismer faktisk vist sig at indeholde calciumionbindingssteder. Disse steder er ansvarlige for den 5 forøgede stabilitet, som disse proteiner behøver for at ! fungere i det miljø med forhøjet temperatur, hvori de findes.

F.eks. har det vist sig, at thermolysin, en naturlig protease fra den termofile organisme Bacillus thermoproteolyticus, indeholder fire calciumbindingssteder. Ved at studere 10 calciumionafhængigheden og graden af varmeinaktivering har det været muligt at fastlægge disse steders kollektive bidrag til G for udfoldning til at være mellem 8,1 og 9,2 Kcal/mol (Vorrdouw et al., Biochemistry 15:3716-3724 (1976)).

15 F.eks. erstattede Serpersu et al., Biochemistry 26:1289-1300 (1987) carboxylatliganden i asparaginsyrerest 40 i calciumbindingsstedet i stafylokok-nuklease med et glycin, hvilket resulterede i en 7,4 gange nedsættelse af affiniteten for calciumioner. På tilsvarende måde ændrede Tsuju et al., Proc.

20 Nat'l. Acad. Sci. USA, 63:8107-8111 (1986) glyciner i nærheden af calciumbindingssløjfer i fotoproteinet aequorin til positivt ladede argininer for at forårsage en sænkning af affiniteten for metalbinding ved disse steder. Det ville imidlertid være ønskeligt at udforme proteiner med forøget 25 stabilitet ved at forøge bindingsaffiniteten for divalente metalkationer på et specifikt sted i proteinet ved hjælp af specifikke aminosyresubstitueringer.

Ved en metode til genudformning af proteiner for at forøge 30 proteinets stabilitet ændres en eller flere aminosyrerester, ^ som er i tæt nærhed til et eller flere af proteinets metal ionbindingssteder. I detaljer indebærer metoden følgende trin: 35 1. Fastlæggelse af sammenhængen mellem det strukturelle metalionbindingssted og nogle parametre for proteinstabilitet; og 2. Ændring af metalionbindingsstedet ved substituering,

DK 175917 B1 I

indsættelse eller udtagning af aminosyrerester i tæt nærhed I

til dette sted, således at den indbyrdes elektrostatiske I

tiltrækningskraft mellem aminosyrerne og metalionen forøges. I

5 Ved identificering af metalionbindingsstedet til korrelation I

med en parameter for proteinstabilitet kan man analysere den I

tredimensionelle struktur hos et protein af interesse eller

en evolutionært beslægtet variant. Den tredimensionelle I

struktur kan opnås ud fra publicerede kilder eller bestemmes I

10 ved kendte metoder til røntgenstrålekrystallografi. I

Ved ændring af metalionbindingsstedet ved substituering, I

indsættelse eller udtagning af aminosyrerester kommer I

følgende trin i betragtning ved metoden: I

15 I

(a) udvælgelse af aminosyrer til substitution, indsættelse I

eller udeladelse så tæt som muligt ved metalionbindingsste- I

det, men uden at indføre sterisk hindring; I

20 (b) foretrukken udvælgelse til substitution, indsættelse I

eller udeladelse af de aminosyrer, som ikke er bevaret i I

evolutionært beslægtede homologe proteiner; I

(c) udskiftning af positivt ladede aminosyrerester, der er I

25 tæt ved den bundne metalion, med uladede eller negativt I

ladede aminosyrerester; og I

(d) foretrukken anvendelse af computerassisteret kurvetegning I

til simulering af indføring af de nye aminosyrerester. I

30 I

Opfindelsen angår subtilisiner, der er blevet ombygget til at I

have forøget stabilitet ved hjælp af disse metoder. I

I det følgende gives en kort beskrivelse af tegningen. I

35 I

Fig. 1 viser en røntgenstrålestruktur af subtilisin BPN' i I

stereo med en opløsning på 1,3Å. De to calciumbindingssteder I

er mærket CaA og CaB. I

5 DK 175917 B1

Fig. 2 viser detaljeret strukturel information for calcium A-bindingsstedet (CaA) i stereo.

Fig. 3 viser detaljeret strukturel oplysning om calcium B-5 bindingsstedet (CaB) i stereo.

Fig. 4 viser calciumionafhængighed for hastigheden af varmeinaktivering af subtilisin ved 65°C. Resultaterne for subtilisin 7172 er angivet med (▲) og for vildtypesubtilisin 10 BPN' med (). {·) angiver effekten af MgCl2 på subtilisin BPN'. De fuldt optrukne linier repræsenterer teoretiske titreringskurver for enkelte metalionbindingssteder med den viste affinitet (K^).

15 Fig. 5 viser Calciumionafhængighed for varmeinaktiveringshastigheden for subtilisin 7148 ved 65°C.

Definitioner 20 Følgende definitioner anvendes ved beskrivelse af nærværende opfindelse.

Protein 25 En heteropolymer fremstillet af levende celler og sammensat af aminosyrer. Et typisk protein omfatter 100 til 1000 aminosyrer. Den nøjagtige aminosyresekvens bestemmer proteinets struktur og funktion.

30 Aminosyre

En af de tyve naturligt forekommende forbindelser, som er proteiners byggestene. De naturlige aminosyrer forkortes sædvanligvis til tre bogstaver eller til et bogstav i i 35 overensstemmelse med tabel 1. Aminosyrerne er forbundet i j hoved og hale til dannelse af en lang hovedkæde. Hver type j aminosyre har en afvigende sidegruppe.

DK 175917 B1 I

Tabel 1. Aminosyrenavne og forkortelser. I

Aminosyre Trebogstavskode Enke1tbogstavskode I

Alanin Ala A I

Arginin Arg R I

Asparaginsyre Asp D I

Asparagin Asn N I

Cystein Cys C I

Glutaminsyre Glu E I

Glutamin Gin Q I

Glycin Gly G I

Histidin His Η I

Isoleucin Ile I I

Leucin Leu L I

Methionin Met Μ I

Phenylalanin Phe F I

Prolin Pro P I

Serin Ser S I

Threonin Thr T I

Tryptophan Trp W I

Tyrosin Tyr Y I

Valin Val V I

Atomnavne I

5 Alle aminosyrer har de samme atomer i hovedkæden og afviger I

kun i sidekæderne. Hovedkædeatomerne er et nitrogenatom, to I

carbonatomer og et oxygenatom. Det første atom er nitrogen- I

atomet, der simpelt er betegnet N. Det næste atom er et car- I

bonatom, der betegnes a-carbon. Sidegrupper er bundet til I

10 dette a-carbon. α-carbonatomet er forbundet til carbonylcar- I

bonatomet, der betegnes C. C er forbundet med carbonyloxygen- - I

atomet (betegnet 0) og til N i den næste rest. Sidegruppeato- I

merne har fået navne sammensat af symbolet for grundstoffet I

(C, O, N, S) , et græsk bogstav (or, β, γ, δ, ε, ζ og η) og I

15 eventuelt et arabisk tal, hvis sidegruppen er forgrenet. I

Fri energi I

7 DK 175917 B1

En termodynamisk mængde, der beskriver systemers adfærd i dynamisk ligevægt. Symbolet G repræsenterer Gibbs frie energi.

5 Indbyrdes elektrostatisk tiltrækning

Den indbyrdes elektrostatiske tiltrækning defineres ud fra Coulombs lov: 10 ΔΕ = Za Zb e2/Deff rab hvor ΔΕ er den energiforandring, der fremkommer ved at bringe to ladninger, a og b, der i starten ligger uendeligt fra hinanden, til en vis afstand, rab. Za og Zb er det respektive antal af enhedsladninger,· og e er en ladningsenhed. Når lad-15 ningerne a og b har modsat fortegn, er den indbyrdes coulom- biske påvirkning tiltrækkende. Når den positive ladning er en - divalent metalion og de negative ladninger kommer fra et monster af punkter i et proteins struktur, må den samme energi, der er involveret i denne indbyrdes tiltrækning overvin-20 des, for at udfolde proteinet. Dette betyder, at den frie energi fra metalionbinding adderes til den samlede frie energi forandring til udfoldning, åGu, hvilket således gør sidstnævnte parameter mere positiv og forskyder ligevægten mod den foldede tilstand.

25

Metalionbindingssted

Et strukturelt segment eller segmenter af polypeptidkæde foldet på en sådan måde, at det giver den korrekte geo-30 metriske og elektrostatiske udformning til binding af en divalent metalion. Dette er det fysiske arrangement af proteinatomer omkring en bundet metalion.

Proteinstabilitet

Protein defineres her ud fra G for udfoldning. Jo større åG, jo mere forskydes ligevægten foldet « ufoldet mod den foldede tilstand. Man kan opnå en vurdering af AGU ud fra midterpunk- 35

DK 175917 B1 I

tet for overgangen til den ufoldede tilstand, Tm, målt ved I

skanderingskalorimetri. Alternativt kan man måle den kine- I

tiske stabilitet for et protein ud fra varmeinaktiverings- I

hastigheden. I

Den foreliggende opfindelse angår subtilisinvarianter frem- I

stillet ved en fremgangsmåde til ombygning af proteiners I

tertiære struktur for at forøge stabiliteten hos deres kor- I

rekt foldede og biologisk og/eller katalytisk aktive til- I

10 stand. Fremgangsmåden viser hvorledes man kan forøge den I

indbyrdes elektrostatiske påvirkning mellem proteiner og I

divalente metalkationer for at forøge bindingskonstanten for I

metalionbinding. Den forøgede elektrostatiske tiltrækning I

mellem proteinet og metalionen som målt ved en stigning i den I

15 frie dissociationsenergi, ågei, hvilket direkte kan over- I

sættes til en stigning i den frie energi for udfoldning, I

(AGU), for det protein, der er interesse for, hvorved der I

opnås en forøget stabilitet for den foldede proteinstruktur. I

20 Ledetråden ved udformning af ændringen af metalionbindings- H

stedet ved udskiftning, fjernelse eller indsættelse af amino- H

syrerester, er Coulombs lov: H

ΔΕ = Za Zfc e2/Deff rab (ligning 1) I

25 I

hvor ΔΕ, målt i Kcal/mol, er forandringen i energi for et sy- I

stem, som består af to punktvise ladninger, a og b, idet de I

bringes sammen som en funktion af deres afstand eller adskil- I

lelse, raj-,· Za og Z^ er de respektive antal af enhedsladnin- I

30 ger; e er en enhed af elektronisk ladning (4,8032 x 10"10 - I

esu); og D er dielektricitetskonstanten. I tilfælde af et I

divalent metalkationbindingssted gælder Za = 2+. Hvis Zj-, er I

en ladning med det modsatte fortegn er den indbyrdes påvirk- I

ning en tiltrækning, og systemets energi nedsættes. Men hvis 35 fortegnet for Z^ er positivt, så bliver den indbyrdes påvirk-

ning frastødende og systemets energi forøges. Det skal bemær- I

kes, at for naturlige systemer som proteiner, hvor ladninger- I

9 DK 175917 B1 ne ikke er punktformige ladninger, er der en grænse for hvor lille rab kan blive, før det resulterer i steriske problemer.

Den nedre grænse for rah har derfor vist sig at være i størrelsesordenen fra 2 til 3Å for lavmolekylære modelmetalion-5 komplekser.

Det specielle tilfælde, hvor den indbyrdes elektrostatiske påvirkning er mellem en metalion og negativt ladede eller dipolære ligander, har været grundigt undersøgt og forstås ved 10 anvendelse af den elektrostatiske krystalfeltteori (CFT), der først blev forklaret af H. Bethe i 1929. Denne teori behandler den indbyrdes påvirkning mellem metalionen og ligander som et rent elektrostatisk problem, hvor liganderne behandles som punktformige ladninger (eller punktformige dipoler).

15 Denne teori forklarede ikke på passende måde den kovalente natur af visse indbyrdes påvirkninger mellem metal og ligand og er blevet modificeret til den afpassede krystal feltteori (ACFT) eller ligandfeltteorien (LFT) for at give plads til kovalens (Cotton & Wilkinson, Advanced Inorganic Chemistry,

20 Interscience, John Wiley pub., N.Y. 3. udgave (1972)). I

tilfælde, hvor den relevante divalente metalion er i form af gruppe-II-metaller, dvs. Mg2 + , Ca2 + , Sr2 + og Ba2 + , virker CFT imidlertid ganske udmærket til forudsigelse af geometri, affinitet (¾) og andre fysisk-kemiske parametre hos disse 25 metalionkomplekser. Grunden til at CFT virker udmærket i disse tilfælde, skyldes den kendsgerning, at d-elektronkreds-banerne, der er ansvarlige for kovalensen hos overgangsmetalionkomplekser, er tomme hos divalente gruppe-II-metalioner, hvilket i høj grad forenkler fastlæggelsen af sammenhæng 30 mellem forsøgsresultater og teorien.

En hovedkilde til usikkerhed som man møder ved indbyrdes elektrostatisk påvirkning hos proteiner er dielektricitetskonstanten. Den varierer uensartet i afhængighed af afskærm-35 ningseffekter og ladningseffekter. Der er gjort mange forsøg på at simulere den effektive afskærmning (eng: screening) (dielektricitetsværdi) hos elektrostatiske ladninger inden i de tertiære strukturer hos foldede proteiner (Matthew, Ann,

DK 175917 B1 I

Rev. Biophys. Chem., 14:387-417 (1985)). Selv de mest

sofistikerede modeller har imidlertid en fejl af størrelses- I

ordenen 5 Kcal/ mol (mere end 3 pKa-enheder), når man for- I

søger at beregne de iboende pKa-værdier hos ioniserbare 5 grupper inden i proteiner (Russell & Warshel, J. Nol. Biol., 185:389-404 (1985)). Ikke desto mindre forventes indbyrdes

elektrostatiske påvirkninger at være signifikante over I

forholdsvis lange afstande, selv med moderat afskærmning I

(screening), og variere omvendt med den lineære afstand. I

10 I

De ovenfor beskrevne elektrostatiske kræfter er også invol- I

veret i indbyrdes påvirkninger mellem uladede, men polære I

molekyler, men energien for den indbyrdes påvirkning er mere I

kompliceret end mellem enkelte ioner. Energiudtrykket for I

15 sådanne indbyrdes påvirkninger varierer også generelt omvendt I

med afstanden mellem sådanne molekyler, opløftet til en I

potens på sædvanligvis mere end 1 men mindre end 6 I

(Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, I

Freeman & Co., N.Y. (1984)). Dette skyldes dipolers polarise- I

20 ringsevne, når de er i nærheden af elektriske felter, dvs. I

gruppe-II-metaller, M2+. Det er således lettere at forudsige I

resultater med ladede ioner. Af disse grunde foretrækkes det I

at anvende gruppe-II-metaller, M2+, og ladede sidegrupper på I

aminosyrerester; COO" i Asp og Glu; NH^+ i Lys- og amino- I

25 enden, og guanidiniumkationgruppen i Arg. I

I subtilisinvarianter ifølge opfindelsen kan et metalionbin- I

dingssted i et protein forstærkes for at forøge affiniteten I

for divalente metalioner. I almindelighed omfatter metoderne I

30 følgende trin: I

A) Fastlæggelse af sammenhæng mellem det strukturelle I

metalionbindingssted og nogle parametre for proteinstabilitet I

35 Denne parameter kan være varmeinaktiveringshastigheden opnået I

ud fra kinetiske forsøg ved forhøjede temperaturer og varie- I

rende koncentrationer af metalion. Alternativt kan man I

anvende termodynamiske målinger af smeltetemperaturen, Tm I

11 DK 175917 B1 (udvundet ved kalorimetri eller en anden fysisk fastlæggelse af udfoldningsovergangen). Disse målinger muliggør ikke blot en fastlæggelse af den grad, hvormed man med held kan påvirke stabiliteten i en ønsket retning, men gør det også muligt at 5 fastlægge dette steds affinitet for divalente metalioner.

Ved identificering af metalionbindingsstedet til fastlæggelse af sammenhængen med en parameter for proteinstabilitet kan man analysere den tredimensionelle struktur hos det omhand-10 lede protein eller en evolutionært beslægtet variant. Den tredimensionelle struktur kan opnås ud fra publicerede kilder eller bestemmes ved røntgenstrålekrystallografiske metoder.

Andre metoder til opnåelse af strukturel oplysning kan indbefatte cirkulær dikroisme, lysspredning, måling af absorption 15 og emission af strålingsenergi, neutrondiffraktion og magnetisk resonans.

B) Ændring af metalionbindingsstedet ved substitution, indsættelse eller udtagelse af en eller flere aminosyrerester 20 i tæt nærhed til stedet, således at den elektrostatiske tiltrækning mellem aminosyrerne og metalionen forøges

Disse aminosyreforandringer kan indføres i det klonede, sekvensbestemte gen for proteinet ved teknikken til mutagenese 25 in vitro med stedsdirigeret oligonukleotid. Denne metode er beskrevet i detaljer i Bryan et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci.

USA 83:3743-3745 (1986).

Kriterierne for udvælgelse af aminosyrer i tæt nærhed af den 30 bundne metal ion til substitution, indsættelse eller udtagning ved stedsdirigeret mutagenese er følgende: Vælg aminosyrer til substitution, indsættelse eller udtagning så tæt som muligt ved den bundne metalion, men uden at ind-35 føre sterisk hindring. Der udvælges aminosyrer til substitution, indsættelse eller udtagning, som vil optimere afstanden og geometrien for de elektrostatiske tiltrækningskræfter ved bindingsstedet.

DK 175917 B1 I

(a) Ved substituering af aminosyrer bør der gives præference I

for forandring af de aminosyrer, der ikke er bevaret i evolu- I

tionært beslægtede homologe proteiner. Bevarede aminosyrer i I

evolutionært beslægtede homologe proteiner vil sædvanligvis I

5 indikere, at disse bevarede aminosyrer er gunstige for pro- I

teinet og bør bibeholdes. Omvendt bør man vurdere aminosyre- I

substitutioner i metalionbindingsstedets område, som er I

forskellige (variable positioner) i det protein, der skal I

ændres og i evolutionært beslægtede proteiner. Hvis således H

10 f.eks. det protein, der skal ændres, indeholder en neutral H

rest i bindingsområdet og et beslægtet protein indeholder en I

Asp eller Glu (negativt ladet), bør der gives høj prioritet I

til udskiftning af den neutrale rest med Asp eller Glu. I

15 (b) Ved indsættelse og/eller udtagning af aminosyrerester bør I

der gives præference til de aminosyrer, der vil optimere af- H

standen og geometrien for en indbyrdes ligand-påvirkning. I I

almindelighed indebærer det skabelse af en radius mellem I

aminosyren eller aminosyrerne og metalionen, der ligger så I

20 tæt som muligt ved 2,5 Å, og som kan opnås uden at skabe I

sterisk hindring. Hvis f.eks. en position, når den forandres H

til Asp eller Glu ikke er i den optimale tilstand (2,5 Å) fra I

metalionen, kan indføring af en indsættelse eller en udtag- I

ning i nærheden deraf gøre det muligt, at Asp eller Glu kom- I

25 mer tættere på den afstand, som har vist sig at være optimal. I

(c) Positivt ladede rester, der er tæt ved den bundne metal- I

ion, bør ændres til neutrale eller negativt ladede rester. I

Positivt ladede rester kan også simpelthen udtages. Neutrale I

30 eller negativt ladede rester kan indsættes. Kombinationer af I

indsættelser, udtagninger og substitueringer hører også med I

til fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Da den divalente I

metalion har en positiv ladning, vil ændring af positivt I

ladede rester til neutrale eller negativt ladede rester I

35 forøge metalionbindingsstedets affinitet. I

Kandidat-aminosyresubstitutioner udvalgt ved de ovenfor givne I

kriterier kan derefter simuleres på et grafisk computersystem I

med høj opløsning, såsom Evans Sutherlands Model PS330 I

13 DK 175917 B1 sammenkoblet med en computer med passende udformning, såsom VAX 11/780. Et sådant grafisk system gør det muligt at foretage den foreslåede forandring grafisk og afprøve, hvorvidt der er eventuelle nærliggende steriske problemer, som den nye 5 aminosyrerest vil indføre, under den antagelse at der ikke er nogen bevægelse af hovedkædeatomerne i polypeptidfoldningen.

De kriterier, der anvendes ved sådan analyse er som følger: a) Måling af de indbyrdes atomafstande mellem de fleste af 10 atomerne i den foreslåede rests sidekæde med de fleste af atomerne, der er de nærmeste naboer dertil i proteinstrukturen .

b) Hvis der er nogen alvorlig overtrædelse af van der Waals 15 radierne hos nogle af atomerne eller alvorlig elektrostatisk frastødning mellem nogle af de negative ladninger, kan man dreje en eller flere af bindingerne i forsøg på at reducere disse effekter. Hvis enten a) eller b) giver en struktur uden alvorlige overskridelser af van der Waals radier eller elek-20 trostatiske frastødninger, kan man indføre den foreslåede forandring i proteinet ved hjælp af stedsdirigeret mutagene-se. Hvis alvorlige overtrædelser af van der Waals radier eller elektrostatiske frastødninger fortsat er til stede giver man forandringen en lav prioritet i den forsøgsmæssige 25 bedømmelse.

Proteiner, der kan genudformes i overensstemmelse med disse metoder indbefatter sådanne, der har +-metalbindingssteder.

Størstedelen af proteiner med divalente metalionbindingsste-30 der er enzymer med calciumionbindingssteder, selv om der kendes enzymer med andre divalente metalionbindingssteder. Udvælgelsen af proteinerne, der skal genudformes, vil naturligvis afhænge af den endelige påtænkte anvendelse af det ombyggede protein. Det bemærkes endvidere, at som anvendt i 35 nærværende beskrivelse og krav betyder betegnelsen protein også proteinfragmenter, såsom polypeptider.

Den største klasse af naturligt forekommende proteiner

DK 175917 B1 I

udgøres af enzymer. Hvert enzym katalyserer generelt en I

forskellig type kemisk reaktion og er sædvanligvis høj spe- H

cifik i dets funktion. Selvom der kan være mindre variationer H

i den nøjagtige type af naturligt forekommende enzym inden H

5 for en given organismeart, er enzymer af en specifik type H

produceret af organismer af samme art generelt i det I

væsentlige identiske med hensyn til substratspecificitet, I

varmestabilitet, aktivitetsniveauer under forskellige betin- I

gelser (f.eks. temperatur og pH), oxidationsstabilitet og H

10 lignende. Sådanne egenskaber hos naturligt forekommende H

enzymer eller "vildtype"-enzymer er ikke nødvendigvis I

optimeret til anvendelser uden for enzymets naturlige miljø. H

Det kan således være ønskeligt at ændre en naturlig egenskab H

hos et enzym for at optimere en bestemt egenskab hos enzymet H

15 til en specifik anvendelse eller til anvendelse i et speci- I

fikt miljø i overensstemmelse med opfindelsen. H

Fortrinsvis anvendes disse metoder til at mutere serinprotea- I

ser for at forøge bestemte egenskaber, navnlig varmestabili- I

20 tet. En protease er en katalysator til spaltning af peptid- H

bindinger. En serinprotease er et enzym, som har en essentiel H

serinrest på det aktive sted, og som katalyserer hydrolyse af H

peptidbindinger. Serinproteaser kan inhiberes med phenyl- H

methansulfonylfluorid og med diisopropylfluorphosphat. Et H

25 subtilisin er en serinprotease fremstillet af grampositive H

bakterier eller svampe. Disse serinproteaser kan indbefatte, H

men er ikke begrænset til, sådanne fra Bacillus-arter, såsom H

subtilisin BPN' fra Bacillus amyloliquefaciens, subtilisin I

Carlsberg fra Bacillus licheniformis, subtilisin DY fra H

30 Bacillus DY, subtilisin amylosacchariticus fra Bacillus H

amylosacchariticus og mesentericopeptidase. Svampeproteaser, I

såsom protease K, thermomycolase og thermitase fra Thermo- H

actinomyces vulgaris kan også forstærkes i overensstemmelse H

med opfindelsen lige som pattedyrsproteaser fremstillet i en H

35 bakterievært. H

Andre foretrukne proteiner, der kan omformes ved metoden, H

indbefatter sådanne proteiner, der har svage divalente metal- H

ionbindingssteder. Eksempler på sådanne proteiner indbefatter H

15 DK 175917 B1 α-amylase, glucoseisomerase, thermolysin og neutral protease.

I vildtypeproteiner er det divalente metal generelt calcium, selvom der kendes bindingssteder med andre divalente metaller. (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Proper-5 ties, Freeman & Co., N.Y. (1984)).

Aminosyresubstitutionerne, udeladelserne og indsættelserne kan gennemføres ved stedsdirigeret (dvs. oligonukleotid) mutagenese. Stedsdirigeret mutagenese er velkendt inden for 10 fagområdet og er beskrevet i detaljer i Bryan et al., Proc.

Nat'1. Acad. Sci. USA, 83:3743-3745 81986).

Yderligere anvendes i en anden udførelsesform regionaldirigeret tilfældig mutagenese in vitro til ændring af en eller 15 flere aminosyrerester i de sløjfer, der er ansvarlige for metalionbinding i det protein, der har interesse. Den foretrukne procedure til tilfældig mutagenese in vitro er beskrevet i detaljer i US patentansøgning nr. 828.545 og PCT ansøgning nr. PCT/US87/00348. Nye varianter fremkaldt ved 20 denne procedure kan sorteringsanalyseres eller udvælges for at finde de varianter, der udviser den ønskede parameter eller forøget proteinstabilitet. Disse sorterede eller udvalgte varianter kan derefter yderligere karakteriseres først ved genetiske manipulationer for at identificere 25 ændring eller ændringer af en eller flere aminosyrerester.

Desuden kan disse sorterede eller udvalgte varianter identificeres ved kinetisk og termodynamisk karakterisering af stabilitet. Endelig kan disse variantproteiner krystalliseres, og man kan opnå røntgenstrålekrystalstrukturer ved 30 høj opløsning for fuldstændigt at fastlægge sammenhængen mellem den forøgede stabilitet og kendte proteinstrukturelle oplysninger.

For yderligere at forøge stabiliteten hos disse variantpro-35 teiner kan man gennemføre yderligere modifikationer med hensyn til en eller flere aminosyrerester i tæt nærhed til et eller flere metalionbindingssteder i overensstemmelse med de tidligere beskrevne metoder.

DK 175917 B1 I

Forud for mutation af et gen, der koder for et enzym af I

interesse, vil man i almindelighed først isolere genet fra I

dets naturlige kilde og klone det i en kloningsvektor. Alter- H

nativt kan man isolere mRNA, der er transkriberet fra genet I

5 af interesse, fra kildecellen og omdanne det til cDNA ved I

omvendt transkription til indsættelse 1 en kloningsvektor. En I

kloningsvektor kan være en fag eller et plasmid og indbe- I

fatter sædvanligvis en replikon til autonom replikation af H

vektoren i en mikroorganisme, som er uafhængig af mikroorga- I

10 nismens genom. En kloningsvektor indbefatter med fordel en I

eller flere faenotypiske markører, såsom DNA, der koder for I

antibiotikaresistens, som en hjælp til udvælgelse af I

mikroorganismer, der er transformeret med vektoren. I

15 Procedurer til indsættelse af DNA eller cDNA i en vektor til I

kloningsformål er velkendt inden for fagområdet. Disse proce- I

durer indbefatter generelt indsættelse af det gen, der har I

interesse, i et åbnet restriktionsendonukleasested i vektoren I

og kan indebære tilsætning af polymere desoxynukleotidhaler I

20 til genets ender og kobling af genet til de åbnede ender af I

en kloningsvektor med komplementære polymere haler. I

Et gen, som man ønsker at ændre ved stedsdirigeret mutagenese I

kan være ti 1 stede i en" ekspressionsvektor. En ekspres- H

25 sionsvektor falder sædvanligvis ind under definitionen af en H

kloningsvektor, da en ekspressionsvektor sædvanligvis indbe- H

fatter en typisk kloningsvektors bestanddele, nemlig en eller

flere replikoner som defineret ovenfor og en eller flere fæ- H

notypiske markører til udvælgelsesformål. Yderligere indbe-

30 fatter en ekspressionsvektor kontrolsekvenser, der koder for I

en promotor, operator, ribosombindingssted og translations- I

igangsætningssignal. Til ekspression under direktion af

kontrolsekvenserne er et målgen, der skal behandles ifølge I

opfindelsen, operativt bundet til kontrolsekvenserne i en I

35 korrekt aflæsningsramme. En ekspressionsvektor, der indehol- I

der den DNA-sekvens, der skal være målet, kan være en fag I

eller et plasmid, hvor plasmider foretrækkes. I

Ved anvendelse af disse metoder er der blevet skabt subti- I

17 DK 175917 B1 lisin 7172 med en udskiftning eller substitution af aminosyren Pro 172 med Asp. Som vist på fig. 4 har det nye subti-lisin 7172 en fem-foldig stigning i affiniteten for calcium i forhold til vildtypesubtilisin BPN'. Der er også skabt subti-5 lisin 8312, hvor aminosyren Pro 172 er substitueret med Glu. Subtilisin 8312 viste sig at være lige som subtilisin 7172.

Der er også skabt subtilisin 7148 med udskiftning af Gly 131 med Asp. Fig. 5 viser, at det nye subtilisin 7148 har en to-foldig stigning i affiniteten for calcium i forhold til vild-10 typesubtilisin BPN'. Som omtalt i eksemplerne menes det, at forskellen i bindingsstyrken skyldes afstandene mellem substitutionerne og bindingsstedet, i 7172 og 8312 er den 5Å og i 7148 er den 10Å fra den divalente metalkation.

15 Disse metoder er tænkt til at være nyttige til stabilisering af mange forskellige slags proteiner under forskellige betingelser. F.eks. anvendes mikrobielle serinproteaser som en aktiv ingrediens i vaskeaktive formuleringer til forøgelse af vaskeevnen. Subtilisinlignende proteaser anvendes for tiden i 20 vaskeaktive midler for at forbedre fjernelsen af proteinpletter, såsom blod og mælk, fra snavsede klæder. Disse vaskeaktive midler kan ofte fremvise tilstande med hensyn til pH, temperatur, koncentration af frie metalioner og detergentindhold {hydrofobicitet), som er ugunstig for den korrekt folde-25 de tilstand hos enzymer, dvs. subtilisinlignende proteaser. Således giver den. foreliggende opfindelse subtilisinenzymer med forøget stabilitet, som vil kunne anvendes til disse anvendelser.

30 Specielt kan subtilisinenzymer ifølge opfindelsen anvendes som et additiv til vaskemidler, såsom flydende detergenter, navnlig citratbaserede flydende detergenter, der anvendes til rengøring af tekstil. Subtilisinenzymerne ifølge opfindelsen er mere varmestabile end vildtypesubtilisin og taber således 35 ikke aktiviteten så hurtig som vildtypen, når de opbevares i opløsning med detergenter, eller når man udsætter dem for høj varme under brug ved rengøring. Ved anvendelse af subtilisinenzymerne ifølge opfindelsen som additiv i vaskemidler forbedres fjernelsen af proteinpletter på tekstiler. Mængden af

DK 175917 B1 I

subtilisinenzym, der kan anvendes som et additiv til vaske- I

midler, er velkendt inden for fagområdet, eller kan let fast- I

lægges ved rutineforsøg. Det optimale område for enzymkoncen- I

tration vil naturligvis være forbundet med enzymets pris og I

5 det omfang af rengøring, der behøves. Typisk vil mængden af I

subtilisinenzym, der sættes til et vaskemiddel, være fra ca. I

2000 til ca. 4000 Alkaline Delft units/g (AOU/g) af vaskemid- I

let. I

10 De følgende eksempler gives for at belyse opfindelsen og skal I

ikke forstås son begrænsende. I

EKSEMPEL I I

OMBYGNING AF SUBTILISIN BPN' I

En røntgenstrålekrystallografisk struktur af subtilisin BPN' I

ved en opløsning på 1,3 Å er vist på fig. 1. Der blev fundet I

to metalionbindingssteder i de modsatte ender af det kugle- I

formede protein. Det ene sted er placeret i nærheden af NH2- I

20 enden og er mærket calciumsted A, da dette sted viste sig med

præference at binde calciumioner, selv i nærværelse af EDTA I

ved 4°C. Et mere detaljeret billede af dette sted er vist på I

fig. 2. Syv proteinafledte oxygenligander er arrangeret I

omkring sted A med en omtrentlig oktaederisk geometri, dersom I

25 man betragter de to oxygenligander i Asp 41 som et sted. Tre I

af disse ligander er hovedkæde-carbonyloxygenatomer, som I

stammer fra Ile 79, Val 81 og Leu 75. De øvrige fire stammer I

fra sidekædeatomerne i Asp 41, Gin 2 og Asn 77. Alle syv har I

en gennemsnitlig oxygen-calcium-afstand på 2,4 Å. I

30 I

Det andet metalbindingssted er mærket calciumsted B og er H

placeret ca. 20 Å fra sted A. Det andet sted er placeret i en I

spalte afgrænset af to segmenter af polypeptidkæden. Det I

første segment bidrager med tre hovedkæde-carbonyloxygenato- I

35 mer som ligander: Gly 169, Tyr 171 og Val 174 (se fig. 3), og I

det andet segment bidrager med et yderligere hovedkædeoxygen- I

atom (Glu 195) sammen med et oxygenatom afledt fra en side- I

kæde-carboxylatgruppe (Asp 197). To vandmolekyler afrunder I

DK 175917 B1 - 19 koordinationskuglen med syv medlemmer. Da dette sted er placeret på overfladen, er det mere udsat for opløsningsmidler end stedet A. Den gennemsnitlige afstand mellem kation og oxygenligand er også længere i sted B (2,9 Å mod 2,4 Å i sted 5 A). I tabel II vises de faktiske calcium-ligand-afstande i de to steder.

Tabel II. Afstande mellem kation og ligand* fra en røntgenstrålemodel med 13 Å opløsning.

10

Calciumsted A Calciumsted B

Rest Ligand Afstand Rest Ligand Afstand

Gln-2 OE1 2,37 Å Gly-169 0 2,66 Å

Asp-41 ODI 2,42 Å Tyr-171 0 2,97 Å

Asp-41 0D2 2,52 Å Val-174 O 2,66 Å

Leu-75 O 2,29 Å Glu-195 O 3,00 Å

Asn-77 ODI 2,41 Å Asp-197 ODI 2,84 Å

Ile-79 0 2.29 Å Vand 1 0 2,71 Å

Val-81 0 2,37 A Vand 2 O 2,97 Å

Middel 2,39 Å Middel 2,89 Å ♦Ligand defineres som de atomer, som er i metalionens første koordinationskugle, og som har formelle negative eller partielle negative ladninger.

15

De kemiske egenskaber i disse to steder er så forskellige som deres strukturer måtte antyde. F.eks. blev et enkelt krystal af vildtypesubtilisin gennemvædet i 24 timer i 5 mM EDTA nær 4°C, og der blev opsamlet diffraktionsdata med en opløsning 20 på 2,0 Å. Difference-Fourier-analyse [F(naturlig)-F(EDTA)] viste, at der ikke var sket nogen ændring i sted A. Dette resultat er i overensstemmelse med metalionanalyse af vild-typeproteinet efter udtømmende dialyse mod en mM opløsning af EDTA (20 mM Hepes) ved 4°C. Under disse betingelser viste det 25 sig, at proteinet stadig binder 0,45 mol calcium per mol enzym. Resultater svarende til dette er blevet rapporteret af Voordouw et al., Biochemistry, 15:3716-37 (1976} som bestemte 1¾ for calciumbinding til subtilisin BPN' til at være mindre

DK 175917 B1 I

20 I

end for EDTA (¾ 10-11) ved 25°C. for calciumbinding til I

dette sted har ved de i forbindelse med nærværende ansøgning foretagne forsøg vist sig at være mellem 10-8 og 10"12 nær

60°C bedømt ved differentialskanderingskalorimetri i nærvæ- I

5 relse af forskellige metalionchelater. I

De kemiske egenskaber ved calciumstedet B er noget anderle- · I

des. F(naturlig)-F(EDTA)-difference-Fourier-analyse viste en I

omlejring af ionmiljøet ved sted B efter behandling af I

10 krystallet med 5 mM EDTA. Fortolkning af denne differenselek- I

trondensitet sammen med iagttagelser gjort med andre subtili- I

sinkrystalpræparater har ført til den antagelse, at calcium- I

ionerne ved sted B let kan erstattes med mindre monovalente I

kationer, såsom natrium. Denne udskiftning ledsages af en I

15 lille forskydning i ionpositionen og en omlejring af opløs- I

ningsmiddel omkring ionen, således at koordinationstallet I

reduceres fra 7 til 5. Binding af andre monovalente kationer I

(K+ og Tl+) er også rapporteret af Drenth et al., Eur. J. I

Biochem., 26:177-181 (1972). I

20 I

Tegn på et svagt calciumbindingssted kom først ud fra kine- I

tiske varmeinaktiveringsforsøg gennemført som en funktion af I

koncentrationen af fri calciumion. Efterhånden som calcium- I

koncentrationen forøgedes over 0,1 mM, blev det iagttaget, at I

25 halveringstiden for varmeinaktiveringsgraden ved 65°C steg I

fra ca. 1 minut til ca. 200 minutter ved calciumionkoncentra- I

tioner på 100 mM til 300 mM (se fig. 4). Disse resultater vi- I

ste sig at passe tæt til en teoretisk titreringskurve for et I

bindingssted, som har en på 32 mM for en enkelt calcium- I

30 ion. Andre gruppe-II-metalioner, såsom Mg2+, Ba2 + og Sr2+ I

blev afprøvet på lignende måde. De førstnævnte to metalioner I

viste sig at være ineffektive til stabilisering af subtilisin I

i det samme koncentrationsområde som vist på fig. 4. Derimod

viste det sig, at Sr2+-ioner forøger enzymets varmestabili- I

35 tet, men den højere koncentration, som er nødvendig for at I

opnå en effekt, antydede en betydeligt svagere affinitet for I

dette sted. Den koncentration af SrCl2, der er nødvendig for I

21 DK 175917 B1 at give en lige så god stabilitet som med CaCl2, er ca. 20 gange højere, hvilket antyder en 1¾ for binding af Sr2+ liggende i området 0,7 M. Disse resultater med gruppe-II-metal ionerne er typiske for calciumbindingssteder i pro-5 teiner (Stuart et al., Nature, 324:84-87 (1986)) og reflekterer en selektivitet på basis af størrelsespræference. Ionradiusen for Mg2 + , 0,78 Å (Ladd radius; Cotton & Wilkinson,

Advanced Inorganic Chemistry, Interscience, John Wiley, N.Y.

3. udgave (1972)), synes at være for lille, og ionradiusen 10 for Ba2 + , 1,43 Å, synes at være for stor. Ionradiusen for

Sr2+, 1,27 Å, er der plads til, men ionradiusen for Ca2+, 1,06 Å, ses at passe bedst. Et tilsvarende resultat blev fundet af Holguin (Arch. Biochem. Biophys., 251:9-16 (1986)) for renset Ca-ATPase»fra sarcoplasmisk reticulum.

15

Det er også muligt at måle effekten af den frie calciumion-koncentration på varmestabiliteten hos subtilisin BPN' ved anvendelse af differentialskanderingskalorimetri (DSC).

Forøgelse af calciumionkoncentrationen til over 0,1 mM får 20 midtpunktet for den varmefremkaldte udfoldningsovergang, Tm, til at stige fra ca. 69,5°C for det isolerede protein, hvor det binder 1 mol calcium/mol protein, til ca. 80°C for proteinet i nærværelse af 150 mM CaCl2.

25 Det næste trin, der var nødvendig at tage, var at fastlægge sammenhængen mellem resultaterne i fig. 4 og et af de to strukturelle steder, der blev identificeret ved røntgenstrålekrystallografi. I lyset af hele den tilgængelige kemiske og fysiske information, der er beskrevet ovenfor, var det muligt 30 at udnævne calciumsted B som den mest sandsynlige kandidat, der er ansvarlig for den svage calciumbinding, der vises på fig. 4 for vildtypesubtilisin BPN'.

Ved anvendelsen af de ovenfor skitserede regler for udvælgel-35 sen af de aminosyrerester, der skal ændres, blev det besluttet at ændre Pro 172 til Asp. Pro 172 er en del af den ene af de sløjfer, der omfatter calciumstedet B. Den efterlavede j i

DK 175917 B1 I

22 I

carboxylatkæde er ca. 5 Å fra den bundne metalion. Denne I

særlige aminosyrerest er noget variabel i beslægtede subtil i- I

sinsekvenser (den foreligger som en Asp-rest i subtilisin I

Carlsberg). Endelig viste simulering på en grafisk skærm, at I

5 den ville passe uden at overskride van der Waals radier. I

Forandringen blev indført ved stedsdirigeret mutagenese i det I

væsenllige som beskrevet ovenfor og af Bryan et al., Proc. I

Nat'l. Acad. Sci. USA, 83:3743-3745 (1986) (som inkorporeres I

heri ved henvisning), og den nye stamme af B. subtilis inde- I

10 holdende det ændrede subtilisin-gen blev betegnet GX7172. I

Variantproteinproduktet af dette gen blev renset og analyse- I

ret for forøget metalionbinding og stabilitet. Resultaterne I

er vist på fig. 4 og sammenlignet med resultaterne for vild- I

typeproteinet (det nye protein er mærket 7172) . I

15 I

Calciumionkoncentrationens betydning for halveringstiden (tM) I

for varmeinaktivering af subtilisin 7172 er tydeligt forskudt I

mod lavere calciumionkoncentrationer. Den teoretiske titre- I

ringskurve, der bedst kan tilnærmes resultaterne, er kurven I

20 for et enkelt sted med = 6 mM. Det ses således, at ændring I

af Pro 172 til Asp forøger B-stedets affinitet for calcium I

ca. 5 gange i forhold til vildtypen. Størrelsen af denne I

forandring, ΔρΚ = 0,7, er i overensstemmelse med teoretiske I

betragtninger for indføring af en negativ ladning ca. 5 Λ fra I

25 en metalkation, når man tager de kendte vanskeligheder i I

betragtning, der normalt er forbundet med anvendelsen af I

elektrostatisk teori på proteiner. En yderligere underbygning

for dette tankeeksperiment kommer fra mutageneseforsøg med I

stafylokok-nuklease, hvor det viste sig, at ændring af car- I

30 boxylatliganden Asp 40 til Gly forårsagede en 8-foldig ned- I

sættelse af calciumbinding i det svage calciumsted (K^ =1 - I

mM) i dette protein (Serpersu et al., Biochemistry 26:1289- I

1300 (1987)). Disse resultater giver derfor overbevisende I

bevis for, at det svage calciumbindingssted målt ved varme- I

35 inaktivering svarer til calcium-B-stedet, der er identifi- I

ceret ved røntgenstrålekrystallografi. Desuden demonstrerer I

disse resultater tydeligt muligheden for at stabilisere sub- I

tilisin BPN' i nærværelse af faldende koncentrationer af cal- I

23 DK 175917 B1 cium ved at forøge stedets metalbindingsaffinitet. Det ekstrapolerede resultat af fortsat ændring af sted B er den endelige forskydning af titreringskurven således, at 1¾ er så lille, at ingen overskydende metalion (eller drastisk reduce-5 rede mængder) vil være nødvendig for at fremkalde den stabilitet, der ses ved 100 mM Ca for vildtypeproteinet.

Ud over ændring af Pro 172 til Asp blev Pro 172 også forsøgt ændret til Glu. Varmeinaktiveringshastighedens calciumafhæn-10 gighed blev også undersøgt for denne nye variant (8312), og resultaterne viste sig at være næsten identiske med resultaterne for subtilisin 7172.

Aminosyrerne ved calcium-A-stedet blev også ændret for at 15 forøge varmestabiliteten. I stamme 8347 blev Asn 76 ændret til Asp. I stamme 8364 blev Ser 78 ændret til Asp. I stamme 8374 blev disse mutationer, Asn 76 til Asp og Ser 78 til Asp, kombineret ved oligonukleotiddirigeret mutagenese. Som vist i tabel III er calciumbindingsaffiniteten hos 8374 forøget på 20 additiv måde i forhold til hver mutation alene. Alle tre stammer viste forøget stabilitet i forhold til vildtype (BPN') og i forhold til subtilisin Carlsberg.

Yderligere kan der foretages ændringer i calcium B-bindings-25 stedet i kombination med dem, der foretages i calcium A-bin-dingsstedet for at forøge stabiliteten. Således kan der f.eks. fortages mutation af Asn 76 til Asp og Pro 172 til Asp (eller Glu). Yderligere eksempler ville indbefatte Asn 76 til Asp, Ser 78 til Asp, Pro 172 til Asp (eller Glu) og Gly 131 30 til Asp; Asn 76 til Asp og Gly 131 til Asp; Ser 78 til Asp og Gly 131 til Asp; Ser 38 til Asp og Pro 172 til Asp (eller Glu); og Ser 78 til Asp, Gly 131 til Asp og Pro 172 til Asp (eller Glu).

DK 175917 B1 I

24 I

Tabel III. Stabilitet i citratbaserede detergenter ved 37°C I

En2ym Forandringer Halveringstid I

(timer) I

Vildtype {BPN') Π 7 I

GX 8347 Asn 76 til Asp 30 I

GX 8364 Ser 78 til Asp 24 I

GX 8374 Asn 76 til Asp og -80 I

Ser 78 til Asp I

Subtilisin Carlsberg 82 ændringer 12 I

EKSEMPEL II I

Indsættelse og/eller udtagning af aminosyrerester

Ved siden af substituering af aminosyrerester kan der fore-

tages indsættelser og/eller udtagninger af aminosyrerester i I

nærheden af det bindingssted, der har interesse i et yder- I

ligere forsøg på at påvirke de elektrostatiske kræfter ved I

10 dette sted. Dette kan overvejes som en metode til at optimere I

afstanden og geometrien for ligandpåvirkninger. F.eks. kan I

man foretage en indsættelse mellem rest 172 og 173 i den ene I

af de sløjfer, der omfatter calcium-B-stedet i subtilisin I

7172 for at flytte Asp i rest 172 tættere til det bundne I

15 metal således, at det kan blive en formel eller "rigtig" I

ligand og muligvis fortrænge et af de bundne vandmolekyler. I

Ved eftersøgning i Brookhaven Protein Data Bank for peptidse- I

kvenser med en konform struktur, som passer til dele af I

20 sløjfen i subtilisin BPN' fra rest 168 til rest 175 blev der I

fundet flere sekvenser, som passede godt ved resterne 170-171 I

og resterne 173-174, men som havde en ekstra aminosyrerest I

indsat. Alle disse peptider havde hovedkæden deformeret på en -I

måde, som ville tillade, at sidekæden i resten 172 ville I

25 vippe mere mod calciumbindingsstedet. Carbonyloxygenatomerne, I

som binder til calcium, var ikke signifikant forstyrret i I

denne computersimulering. Hvis de indsatte rester skulle være I

en Asp eller en Glu ville man igen opnå en anden lejlighed I

til yderligere at påvirke dette steds indbyrdes elektrostati- I

30 ske påvirkning. I

25 DK 175917 B1

En aminosyreudtagning kan også forårsage et mere favorabelt miljø for metalionbinding ved at ændre den indbyrdes ladningsafstand og geometrien hos naboresterne.

5

EKSEMPEL III

Stabilitetsforøgelse under anvendelse af tilfældig mutagenese 7142-varianten af subtilisin blev fremstillet og identifice-10 ret ved en metode med tilfældig mutagenese, hvor hele subti-lisingenet blev udsat for mutagene midler. (Se US patentansøgning nr. 828.545 og PCT ansøgning nr. PCT/US87/00348). I dette særlige tilfælde var det mutagene middel natriumbisul-fit, og filteranalysen identificerede dette protein som en 15 stabil mutant. DNA-sekvensbestemmelse viste, at subtilisin 7142 havde to aminosyreforandringer: Gly 131 til Asp og Ala 116 til Thr. Disse forandringer blev derpå indført individuelt ved stedsdirigeret mutagenese for at undersøge de fysiske egenskaber ved de individuelle aminosyresubstitutioner.

20 Forandringen af Gly 131 til Asp alene viste sig at være eneansvarlig for den iagttagede stabilisering. Denne nye variant blev betegnet subtilisin 7148. Forandringen af Ala 115 til Thr viste sig ikke at have nogen virkning på varmeinaktive-ringshastigheden. Ved at forandre Gly 131 til Glu kan resul-25 taterne for varme inaktiveringshastighedens calciumafhængighed være lige som med aminosyresubstitution til Asp.

Når subtilisin 7148 blev analyseret for kinetisk stabilitet ' som funktion af calciumionkoncentrationen, viste den sig at 30 have en svagt forøget affinitet for calcium ioner, som vist på fig. 5. I dette tilfælde viste resultaterne sig bedst at være tilpasset til en teoretisk titreringskurve for et enkelt bindingssted med en 1¾ på 15 mM. Denne iagttagede tofoldige forøgelse af metalionaffinitet, eller ΔρΚ = 0,33, har en 35 udmærket sammenhæng med røntgenstrålekrystallografiske resultater for subtilisin 7142. 1,8 Å opløsningskrystalstrukturen for subtilisin 7142 viser, at carboxylatgruppen i den nye rest Asp 131 er ca. 10 Å fra metalionen ved calcium-B-stedet.

i

DK 175917 B1 I

H

Således er størrelsen af den iagttagede stigning i metalion- H

affinitet ca. det, som man ville forvente i lyset af denne H

ændring i afstanden mellem ladninger. Thomas et al., Nature, H

318:375-376 (1985) iagttog f.eks. en forskydning på 0,29+0,04 H

5 i pKa for His 64 i subtilisin BPN' efter ændring af Asp 99 H

til Ser, som ligger 14 Å borte. Hvis endvidere indføring af H

en negativt ladet rest 5 Å borte fra metalionen bundet i cal- H

cium B-stedet forårsager en ΔρΚ = 0,7, så er dette fuldstaen- H

digt i overensstemmelse med teorien (ligning 1) om, at indfø- H

10 ring af en negativt ladet gruppe 10 Å fra stedet giver en ΔρΚ H

=0,33.

Mutationerne Gly 131 til Asp og Pro 172 til Asp blev kombine- H

ret ved oligonukleotiddirigeret mutagenese til frembringelse H

15 af stamme 8331. Calciumbindingsaffiniteten hos 8331 er for- H

øget på additiv måde. H

Regionaldirigeret tilfældig mutagenese in vitro kan anvendes H

til at ændre subtilisin BPN' til opnåelse af forøget varme- H

20 stabilitet. Ved denne særlige anvendelse af tilfældig muta- H

genese udsættes kun den del af subtilisingenet, der koder for H

aminosyreresterne i de sløjfer, der er ansvarlige for metal- H

ionbinding, for mutagenese. Metoderne, der anvendes til til- I

fældig mutagenese, er dem, der er beskrevet i US patentan- H

25 søgning nr. 828.545 og PCT ansøgning nr. PCT/US87/00348. I

I subtilisin BPN' omfattes calcium-B-stedet af kun to korte H

strækninger af polypeptidkæde (resterne 169-174 og 195-197). I

På grund af dette er det forholdsvis hensigtsmæssigt at an-

30 vende denne region specielt som mål for tilfældig mutagenese H

in vitro. Dette blev udført ved at skabe genkendelsessteder . H

for restriktionsendonukleaser i det klonede subtilisin-gen H

ved sekvensflankering af de to målområder. F.eks. anvendtes

der til målretning mod resterne 169 til 174 i sløjfen i B- I

35 stedet oligonukleotiddirigeret mutagenese for at skabe et I

Xhol-spaltningssted ved rest 162 og et Bgll-sted ved rest I

176. Ved at drage nytte af redundansen i den genetiske kode H

blev disse restriktionssteder indført uden at ændre den af H

genet specificerede aminosyresekvens. Tilfældige mutationer H

27 DK 175917 B1 blev skabt i målregionen ved at spalte genet med Xhol og Bgll og derefter ligere syntetiske DNA-fragmenter ind i det mellemrum, der var skabt i genet af de to restriktionsenzymer.

DNA-fragmenter syntetiseredes på en sådan måde, at forandrin-5 ger i forhold til den naturlige DNA-sekvens forekom tilfældigt. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde kan syntesen af DNA-indsættelsen kontrolleres således, at der sker mutationer med en hvilken som helst hyppighed fra meget lille variation fra den naturlige sekvens til en fuldstændig tilfældig se-10 kvens.

* L "· ---- 11 ' 1 11

Claims

27 I PATENTKRAV I

1. Subtilisinvariant med forøget termostabilitet i forhold I til den tilsvarende vildtypesubtilisin, kendetegnet I ved, at man har ændret aminosyresekvensen ved et I metalionbindingssted således at den elektrostatiske I tiltrækning mellem aminosyrerester ved metalionbindingsstedet I 10 og metalionen forøges i forhold til tiltrækningen i den I tilsvarende vildtypesubtilisin. I

2. Subtilisinvariant ifølge krav 1,kendetegnet I ved, at ændringen er en substitution af en positivt ladet I 15 aminosyre med en neutral eller negativt ladet aminosyre. I

3. Subtilisinvariant ifølge krav 1,kendetegnet I ved, at ændringen er en substitution af en neutral aminosyre I med Asp eller Glu. I

20 I

4. Subtilisinvariant ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at ændringen er en udtagning af en positivt ladet I aminosyre. I

5. Subtilisinvariant ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at ændringen er en indsættelse af en neutral eller I negativt ladet aminosyre. I

6. Subtilisinvariant ifølge et vilkårligt af kravene 1 til . I 30 5, I

35 I 28 i DK 175917 B1 kendetegnet ved, at vildtypesubtilisinen er subtilisin BPN1, subtilisin Carlsberg, subtilisin DY , subtilisin amylosacharitricus eller mesentericopeptidase.

7. Vaskemiddel, kendetegnet ved, at det indeholder en subtilisinvariant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6. e