ES2139736T5 - Productos de masa refrigerables fermentados con levadura. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA COMPOSICIONES DE MASA FERMENTADAS CON LEVADURA, Y METODOS PARA FABRICARLAS. LA COMPOSICION DE LA MASA Y EL TIPO DE LEVADURA UTILIZADO EN LA MISMA, SON ELEGIDOS PARA LIMITAR LA ACCION DE FERMENTACION TOTAL DE LA LEVADURA CONTROLANDO LA CANTIDAD DE SUSTRATO DE LA MASA FERMENTABLE POR LA LEVADURA, O INACTIVANDO LA LEVADURA A ALTA TEMPERATURA. LAS COMPOSICIONES DE MASA HECHAS DE ACUERDO CON LA INVENCION, PUEDEN FERMENTARSE A TEMPERATURAS ELEVADAS, Y AL MISMO TIEMPO SER ALMACENADAS EN UN CONTENEDOR HERMETICO A TEMPERATURAS DE REFRIGERACION DURANTE PERIODOS DE TIEMPO PROLONGADOS. EN UNA INCORPORACION PREFERIDA, LA LEVADURA UTILIZADA EN LA MASA, ES SUSTANCIALMENTE INCAPAZ DE FERMENTAR CARBOHIDRATOS DE LA MASA, Y UNA CANTIDAD PREDETERMINADA DE CARBOHIDRATOS QUE NO SON DE LA MASA FERMENTABLES POR LA LEVADURA (POR EJ. GALACTOSA), SE AÑADE A LA MASA PARA PROPORCIONAR LA CANTIDAD DESEADA DE SUSTANCIA IMPERMEABILIZADORA. UNA LEVADURA DIPLOIDE ES TAMBIEN PROPORCIONADA CON LA PROPIEDAD AÑADIDA DE SER INACTIVA A BAJA TEMPERATURA.

Description

Productos de masa refrigerables fermentados con levadura.

La presente invención trata de productos de masa refrigerables útiles en la preparación de productos comestibles cocidos al horno. En concreto, la invención proporciona masas fermentadas con levadura que pueden almacenarse durante períodos de tiempo prolongados a temperaturas de refrigeración.

En la actualidad, se dispone de una gran variedad de productos de masa refrigerables para obtener numerosos productos diferentes cocidos al horno. Dichas masas refrigeradas van desde masas para galletas y panes hasta panecillos dulces y pan de maíz. Estos productos de masa son bastante populares entre los consumidores porque son muy cómodos y fáciles de utilizar. La mayoría de estos productos se venden en estado prefermentado, de forma que puedan abrirse para extraer la masa, y ésta pueda cocerse al horno inmediatamente. El envasado y la venta de masas en estado prefermentado evita que los consumidores se vean en la necesidad de realizar una cuidada fermentación de la masa durante un período de tiempo prolongado antes de cocerla al horno.

Al elaborar productos de masa refrigerables, se sitúan porciones debidamente dimensionadas de masa sin fermentar en recipientes individuales. Seguidamente, se fermenta la masa dentro del recipiente, por ejemplo manteniendo la masa a temperatura elevada, provocando su dilatación. La masa seguirá fermentándose hasta que se alcance una presión interna positiva aproximada de 15-20 psi (libras por pulgada; la mayoría de estos recipientes reventará o explotará si la presión interna del recipiente es muy superior a unas 40 psi. Es deseable que puedan almacenarse los productos a temperaturas de refrigeración durante al menos dos semanas, y a poder ser incluso hasta unos meses, sin degradación significativa de la calidad de la masa o riesgo apreciable de ruptura de los recipientes.

Un inconveniente de los productos de masa refrigerables de que se dispone actualmente en el mercado reside en que dichas masas no suelen poder fermentarse con levadura. Cuando se utiliza levadura en una masa, las células de la levadura tienden a seguir creciendo, o al menos a seguir metabolizándose, aun a temperaturas de refrigeración. Así pues, la levadura sigue produciendo dióxido de carbono durante todo el tiempo de almacenaje, salvo que la masa se guarde en estado congelado. Aunque permitir que la levadura fermente durante todo el tiempo de exposición de la masa puede servir si se pretende que la masa se utilice inmediatamente, el almacenaje prolongado (por ejemplo unas dos semanas o más) en un recipiente cerrado no servirá, porque se acumulará rápidamente presión en el recipiente, reventándolo. Si se colocara una masa fermentada con levadura en un recipiente normal de producto de masa, lo normal sería que el recipiente no resistiese más de unos dos días. Además, la actividad continua de la levadura, más allá del grado deseado de fermentación, puede incidir negativamente en las propiedades organolépticas y reológicas de la masa, elaborándose unos productos finales cocidos inaceptables.

Hasta la fecha, los fabricantes de masas refrigerables han tenido que sustituir la levadura por agentes químicos de fermentación, como por ejemplo bicarbonato sódico o similares. Estos agentes químicos de fermentación suelen consistir en una mezcla de ácido de fermentación y una base de fermentación, reaccionando las partes de ácido y base para generar dióxido de carbono, con lo que se levanta la masa. Una de las principales ventajas de dichos agentes de fermentación reside en que su comportamiento se basa en una reacción química previsible, pudiendo controlarse así fácilmente el volumen de dióxido de carbono producido para fermentar la masa. Finalizada la reacción química de los agentes de fermentación, cesa la producción de dióxido de carbono.

Aunque un producto de masa fermentado químicamente puede almacenarse durante períodos de tiempo prolongados a temperaturas de refrigeración, el producto final cocido al horno, obtenido cociendo la masa en el horno, es manifiestamente inferior a un producto preparado con una masa fermentada con levadura. Los productos preparados a base de masas fermentadas con levadura son ampliamente reconocidos por su sabor, aroma y textura superiores a los elaborados con agentes químicos de fermentación. Los fabricantes comerciales de masa suelen añadir ingredientes al sólo objeto de simular masas fermentadas con levadura. Así, los fabricantes suelen añadir aroma de levadura, tales como cultivos de levadura pasteurizada e inactiva, a la masa fermentada químicamente. Aun con estos aditivos, los productos cocidos al horno y elaborados a base de masas fermentadas químicamente, carecen del sabor y el aroma característico de la masa fermentada con levadura, y siguen exhibiendo una textura relativamente
pobre.

Otros han intentado resolver los inconvenientes asociados al almacenaje de masas fermentadas con levadura, guardando las masas a temperaturas de congelación en lugar de temperaturas de refrigeración. Las masas congeladas fermentadas con levadura pueden producir productos cocidos al horno manifiestamente mejores que las masas fermentadas químicamente refrigeradas. La levadura deviene inactiva al congelarse, evitando así los inconvenientes asociados a la evolución continua de dióxido de carbono a temperaturas de refrigeración.

No obstante, las masas congeladas no son sencillamente tan cómodas como los productos de masa refrigerados previa fermentación. Mientras que dichas masas refrigeradas pueden cocerse al horno nada más extraerse del recipiente, las congeladas han de descongelarse antes de cocerse al horno. Además, como la masa fermentada no sobrevive muy bien a la congelación, las masas congeladas suelen tener que fermentarse después de descongelarse y antes de meterse al horno. Esto puede demorar aun mas la cocción de la masa. El consumidor ha de dedicar más tiempo siguiendo el proceso de fermentación para evitar una fermentación excesiva de la masa, procurando meter la masa en el horno para su cocción en el momento justo. Dichas masas congeladas no sólo exigen más atención que los productos de masa refrigerados, sino que exigen que el consumidor planifique con la debida antelación para que pueda descongelarse y fermentarse la masa y se obtengan los productos cocidos al horno en el momento deseado.

En una solicitud de patente europea publicada (Patente Europea Publicada 0 442 575, publicada el 21 de agosto de 1991), Gist-Brocades describe una composición de masa que utiliza un concepto de limitación de substrato. De acuerdo con esta descripción, se fermenta una masa con una levadura negativa de maltosa (una levadura que no puede fermentar la maltosa), congelándose la masa. Según Gist-Brocades, la masa puede descongelarse, fermentarse y cocerse al horno en cualquier momento en un mismo día, sin tener que estar encima del tiempo de fermentación. No obstante, el antecedente de Gist-Brocades no prevé el almacenaje de esta masa a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo dos semanas o más.

Dado que los consumidores prefieren las características "recién hechas" de los productos de masa, muchos fabricantes venden masa prefermentada en estado tanto congelado como refrigerado. Por "masa prefermentada" entiéndase una en la que se ha permitido que el agente de fermentación en la masa genere suficiente dióxido de carbono para levantar la masa hasta un volumen deseado, por ejemplo sometiendo la masa a temperaturas aumentadas. La fermentación de la masa antes de su distribución a los consumidores obvia la necesidad de que éstos fermenten cuidadosamente la masa durante un periodo de tiempo prolongado antes de su cocción.

Se describen ejemplos de composiciones de masa refrigerada en Yong y col., Patentes EE.UU. nos. 4.381.315 y 4.383.336; y Atwell, Patente EE.UU. no. 4.526.801. Las masas refrigeradas se preparan combinando los ingredientes de la masa e incorporando un agente de fermentación, opcionalmente situando la masa en envases, fermentando la masa y seguidamente almacenándola a temperaturas de refrigeración, es decir entre unos 0°C y unos 12°C.

Las masas refrigeradas suelen envasarse antes de almacenarse, y pueden envasarse antes de fermentarse la masa, en cuyo caso ésta se fermenta en un envase cerrado hasta que el volumen de la masa llena y cierra el envase. De forma alternativa, puede envasarse la masa en un envase flexible tras fermentarse, en cuyo caso se incorpora un medio de estanqueidad al envase en que se haya envasado la masa para que éste quede básicamente estanco. En esta descripción, se utilizará en adelante la expresión "recipiente" al hablar tanto de envases rígidos como flexibles.

En función del producto, la temperatura de almacenaje y demás aspectos, el tiempo de exposición mínimo aceptable de las masas refrigeradas producidas comercialmente puede ser de hasta 90 días. A temperaturas de refrigeración, la levadura convencional sigue produciendo dióxido de carbono, con lo que sigue levantándose la masa y siguen reaccionando los ingredientes de la masa, aun después de envasarse la masa en un recipiente cerrado para su almacenaje. Como la levadura convencional continúa produciendo dióxido de carbono a temperaturas de refrigeración, se produce un exceso de fermentación, que se traduce en cambios negativos en la reología de la masa. Estos cambios inciden negativamente en el sabor, aroma, la textura y otras propiedades organolépticas del producto hecho o cocido al horno, y preparado a base de la masa.

Si se envasa la masa en un recipiente cerrado para almacenarse a temperaturas de refrigeración, la producción continua de dióxido de carbono por la levadura convencional se traduce en un aumento continuo de la presión en el interior del recipiente. Finalmente, la presión interna del recipiente aumenta hasta tal punto que éste revienta. Esta ruptura puede producirse con una levadura convencional a la semana o menos, lo que queda muy por debajo del tiempo de exposición mínimo aceptable para la mayoría de masas refrigerables producidas comercialmen-
te.

La WO-A-9301724 describe la utilización de una levadura sensible a temperaturas bajas en masas refrigerables para impedir dicha producción de dióxido de carbono a temperaturas de refrigeración. No obstante, se ha comprobado ahora la insuficiencia de esto porque el fabricante rara vez puede controlar las temperaturas a que se almacenan las masas. Así pues, surge el problema del almacenaje en un comercio de la masa envasada, a temperaturas suficientemente altas para activar la levadura sensible a temperaturas bajas, con lo que se produce dióxido de carbono y revientan finalmente los envases, estropeándose su contenido.

Las harinas de trigo utilizadas en la mayoría de instalaciones comerciales de elaboración de masa contienen del orden del 5 por ciento en peso (% en peso) de almidón dañado. Las alfa y beta amilasas (inherentes a la harina de trigo) convierten dicho almidón en maltosa, entre otros azúcares. La maltosa y algunos de los demás azúcares que produce la acción de la amilasa pueden metabolizarse por muchas cepas de levadura.

La WO-A-9301724 describe el uso en una masa refrigerable de una cepa de levadura que no fermenta la maltosa, que se denomina "negativa de maltosa" o simplemente "MAL-". Dicha levadura suele poder fermentar otros tipos de azúcares, como por ejemplo la sacarosa o la dextrosa. Suelen bastar unos 100-200 ml. De CO_{2} por 100 gramos de masa a 32°C para su fermentación. La cantidad total de azúcar fermentable en la masa se ajusta intentando limitar el volumen de gas dióxido de carbono que produce la fermentación de todo el suministro de azúcares fermentables.

La EP-A-0388262 se refiere a una levadura diploide con una elevada capacidad para fermentar masa de pan sin azúcar. La EP-A-0197497 se refiere a una levadura panaria incapaz de fermentar la sacarosa. La EP-A-0196233 se refiere a una masa resistente a la congelación que comprende harina, agua y una levadura capar de fermentar la maltosa y resistir la congelación.

Se ha comprobado ahora que los productos de masa elaborados con esta masa, colocando la masa en envases de masa refrigerable espiroarrollados normales mantienen presiones internas aceptables, por ejemplo inferiores a unas 20 psi, durante unos 25 días. No obstante, la masa empieza a generar dióxido de carbono nuevamente después de unos 25 días. Esta renovada actividad de la levadura en la masa se estima suficiente para generar suficiente dióxido de carbono, para la ruptura de los envases utilizados, que tenderían a fallar a unas 40 psi, después de unos 50-55 días.

No se ha determinado de manera concluyente por qué la levadura vuelve a tener actividad después de dejar prácticamente de fermentar, según parece. No obstante, un factor que se cree contribuye a generar dióxido de carbono adicional, y a la consiguiente rotura de los envases, es un cambio en los hidratos de carbono presentes en la masa. Según lo indicado anteriormente, las alfa y beta amilasas, inherentes a las harinas de trigo, actúan sobre los hidratos de carbono presentes en la masa, sobre todo en la harina. Con el tiempo, las amilasas descomponen los oligosacáridos que la levadura no puede fermentar, como por ejemplo maltosa y maltotriosa, en azúcares que la levadura sí puede fermentar. Así pues, se anticipa que, aun en el caso de que la levadura utilizada en dicha composición de masa fuera realmente negativa de maltosa, el perfil cambiante de los hidratos de carbono de la masa puede presentar azúcares fermentables por la levadura. Así pues, la masa podría seguir generando dióxido de carbono, y provocarla ruptura de los envases.

Por tanto, un producto de masa realizado con levadura MAL- y una cantidad limitada de maltosa inicial en la composición, puede servir para almacenarse a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo más cortos, con un período de almacenaje del orden de unos 30 días o menos. Cuando se almacenan dichos productos de masa durante períodos de tiempo bastante superiores, probablemente empiecen a fallar los envases. Aunque puede servir un tiempo de exposición de 30 días para algunas aplicaciones, se espera que el tiempo de exposición de los productos de masa refrigerados actuales sea de 90 días o más a temperaturas de refrigeración. Así pues, esta realización MAL- de la invención puede tener una utilidad limitada tan sólo en el comercio, limitándose su uso comercial a mercados institucionales, como por ejemplo panaderías dentro de comercios y similares, donde puede considerarse en todo caso aceptable un tiempo de exposición anticipado de 30 días.

Así pues, lleva necesitándose desde hace tiempo en la industria una masa fermentada con levadura capaz de almacenarse a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados. Sin embargo, hasta la fecha, los productores comerciales no han podido preparar y vender masas refrigerables fermentadas con levadura, adecuadas para una producción comercial a gran escala, y con un tiempo de exposición prolongado, a pesar del potencial económico evidente de dicho producto. Al parecer, los inconvenientes asociados a la generación continua de dióxido de carbono por la levadura han impedido dicho producto.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para preparar masas refrigerables con levadura y productos de masa realizados con la misma. Según otro aspecto, la invención proporciona una composición de masa refrigerable fermentada con levadura, un producto de masa que comprende masa refrigerable en un recipiente, y un producto cocido al horno elaborado a partir de dicha masa refrigerable. De acuerdo con un aspecto de la invención, se mezcla una cepa de levadura previamente seleccionada con harina y agua, y posiblemente otros ingredientes, para formar una masa. Se eligen la levadura y la composición de masa de forma que la cantidad total de hidrato o hidratos de carbono que puede fermentar la levadura en la masa sea limitada.

La levadura no puede prácticamente fermentar los hidratos de carbono naturales de la harina utilizada en la masa, incorporándose a la masa un hidrato de carbono no natural, como por ejemplo la galactosa, seleccionándose su cantidad para aportar el volumen de dióxido de carbono deseado. Esto a su vez impide la generación de suficiente dióxido de carbono para reventar un recipiente de masa cerrado, aunque la temperatura de la masa se eleve de forma accidental.

En una realización que no se ajusta a la invención, la levadura es capaz de fermentar determinados azúcares naturales del sistema de la masa, presentes de forma natural en cantidades tan sólo limitadas. Estos azúcares deberían estar presentes de forma natural en una cantidad no superior y preferiblemente inferior a la necesaria para generar el volumen de CO_{2} necesario para fermentar la masa, con el azúcar adicional que sea necesario para fermentar la masa suministrada, añadiendo cantidades de dicho azúcar a la composición de la masa.

En una de estas realizaciones que no se ajustan a la invención, la levadura no puede prácticamente fermentar ningún hidrato de carbono natural de la masa, salvo la fructosa. La concentración de fructosa en el trigo es inicialmente aproximadamente inferior al 0,1 por ciento en peso (% en peso). Mediante la acción de diversas enzimas capaces de descomponer la sacarosa disacárida del trigo en monosacáridos de glucosa y fructosa, puede aumentar con el tiempo la concentración de fructosa en la levadura. Sin embargo, la concentración de fructosa en la mayoría de sistemas de masa con una base de trigo es inferior a la necesaria para generar los 100-200 ml. de CO_{2} por 100 g. de masa necesarios para fermentar la masa en grado adecuado. Se incorpora fructosa adicional a la masa para generar el grado de fermentación deseado.

El método también puede incluir los pasos adicionales de situar la masa resultante en un recipiente presurizable y calentar la masa dentro del recipiente hasta una temperatura elevada para fermentarla. Una vez fermentada la masa en el recipiente, se reduce la temperatura de la masa en el recipiente hasta temperaturas de refrigeración, almacenándose la masa a temperaturas de refrigeración durante un período de tiempo prolongado. Un método según esta realización puede asimismo comprender el paso consistente en extraer la masa del recipiente y cocerla al horno para obtener un producto hecho en el horno.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una levadura diploide utilizada en la elaboración de masas refrigerables con levadura y productos de masa elaborados a partir de las mismas. Este aspecto de la invención proporciona una composición de masa refrigerable fermentada con levadura.

La levadura diploide según este aspecto de la invención, que en adelante se denominará levadura "GAL+", no puede apenas fermentar los hidratos de carbono naturales de la harina de trigo. En una composición de masa de la invención, la levadura no puede apenas fermentar los hidratos de carbono naturales de la harina utilizada en la masa, incorporándose a la masa un hidrato de carbono no natural, como por ejemplo la galactosa, en una cantidad seleccionada para aportar el volumen deseado de dióxido de carbono. De este modo, puede limitarse el volumen máximo de dióxido de carbono que puede generar la levadura, lo que a su vez impide la generación de dióxido de carbono suficiente para reventar el envase de masa cerrado, aunque se eleve la temperatura de la masa accidentalmente.

De acuerdo con otra realización de este aspecto de la invención, la levadura no puede apenas fermentar los hidratos de carbono naturales de la harina de trigo, y es sensible a temperaturas bajas. En esta memoria, una levadura "sensible a temperaturas bajas" (o simplemente levadura "lts") se activa a temperaturas elevadas en presencia de un substrato fermentable, pero deviene prácticamente inactiva, es decir deja prácticamente de producir dióxido de carbono, a temperaturas de refrigeración. Así pues, puede decirse que la levadura de esta realización concreta de la invención es tanto "GAL+" como "lts".

Un método de acuerdo con la invención comprende preparar una masa con harina, agua, galactosa y levadura GAL+/lts, y almacenar la masa a temperaturas de refrigeración durante un período de tiempo prolongado. El método también puede incluir los pasos adicionales de situar la masa resultante en un recipiente presurizable y calentar la masa dentro del recipiente hasta una temperatura elevada para fermentarla. Una vez fermentada la masa en el recipiente, se mantiene la temperatura de la masa en el recipiente a temperaturas de refrigeración, preferiblemente durante un período de tiempo prolongado. Un método según esta realización puede asimismo comprender el paso consistente en extraer la masa del recipiente y cocerla al horno para obtener un producto hecho en el horno.

Se describe una masa que comprende harina, agua y una levadura capaz de fermentar el substrato disponible a temperaturas por debajo de un umbral de temperatura de inactivación, pero que se inactivará prácticamente si se calienta hasta una temperatura prácticamente igual o superior al umbral de temperatura de inactivación. Es deseable que este umbral de temperatura de inactivación sea superior a la temperatura ambiente e inferior a una temperatura a la que empiece a cocerse o hacerse la masa, pasando a ser un producto hecho en lugar de una masa.

De acuerdo con un método según esta descripción, se forma una masa mezclando harina, agua y levadura. Se permite la fermentación de esta composición de masa, calentándose seguidamente hasta una temperatura como mínimo igual de elevada que el umbral de temperatura de inactivación de la levadura, prácticamente inactivando la levadura, es decir con lo que la levadura es prácticamente incapaz de fermentación a casi cualquier temperatura. Seguidamente, puede almacenarse la masa a temperaturas de refrigeración sin fermentación adicional significativa de la masa.

Esta descripción proporciona asimismo una levadura sensible a la temperatura, muy indicada para utilizarse como agente de fermentación en composiciones de masa refrigeradas. Esta levadura tiene un umbral de temperatura de inactivación por encima del que la levadura queda prácticamente inactivada, por ejemplo mediante su conversión en aerobio obligado. Una vez calentada por encima del umbral de temperatura de inactivación, la levadura permanecerá básicamente inactiva prácticamente a cualquier temperatura, si se mantiene en un ambiente prácticamente anaerobio. En otra realización, la levadura es sensible a temperaturas tanto extremamente altas como extremamente bajas. Aunque esté presente una cantidad limitada de oxígeno en el ambiente, la levadura seguirá prácticamente inactiva a temperaturas de refrigeración debido a su sensibilidad a las temperaturas bajas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que ilustra el ritmo de generación de dióxido de carbono en función del tiempo, de una levadura GAL+ en una composición de masa mantenida a 30°C;

La Figura 2 muestra el volumen total de dióxido de carbono generado en la muestra de la Figura 1;

La Figura 3 es un gráfico que muestra el volumen total de dióxido de carbono que generan cuatro composiciones de masa que difieren en cuanto a la naturaleza de los hidratos de carbono no naturales incorporados a la masa;

La Figura 4 ilustra el ritmo de evolución del dióxido de carbono de las masas mostradas en la Figura 3;

La Figura 5 traza la presión medida de la lata en función del tiempo para dos masas fermentadas químicamente, una con levadura GAL+ y otra sin;

Las Figuras 6 y 7 muestran la presión de la lata en función del tiempo, para tres muestras de masa con cantidades diferentes de azúcar no natural incorporado a su composición;

La Figura 8 ilustra el crecimiento de las levaduras D3083 y RD308.3 en tres medios diferentes en función de la absorbencia;

La Figura 9 es una representación esquemática del proceso de glicolisis, que muestra los pasos de reacción correspondientes a la utilización de diversos azúcares en la fermentación;

La Figura 10 es un gráfico que muestra el volumen total de dióxido de carbono que generan unas composiciones de masa fermentadas con levadura PGI-/G6PDH- con azúcares diferentes;

La Figura 11 ilustra el ritmo de evolución de dióxido de carbono para las masas mostradas en la Figura 10;

La Figura 12 traza la presión medida de la lata en función del tiempo para dos composiciones de masa, una masa con fructosa y la otra con sacarosa;

La Figura 13 ilustra la presión medida de la lata en función del tiempo para masas fermentadas con levadura GAL+ diploide de la invención;

La Figura 14 ilustra el tamaño de colonia correspondiente a las cepas de levadura GAL+/lts de la invención en función del tiempo, a unos 30°C;

La Figura 15 ilustra el tamaño de colonia correspondiente a las cepas de levadura GAL+/lts de la invención en función del tiempo, a unos 12°C; y

La Figura 16 ilustra el crecimiento anaerobio de células cdc 19 después de incubarse a temperatura elevada.

Descripción pormenorizada de las realizaciones preferentes

De acuerdo con la presente invención, se prepara un producto de masa en donde se eligen la composición de la masa y la levadura que se utiliza en la misma de forma que limiten de manera eficaz y controlable la acción de fermentación de la levadura, controlando la cantidad de substrato fermentable por la levadura en la masa. Se conocen en la técnica cepas de levadura que no fermentan determinados hidratos de carbono; a menudo, dos cepas diferentes de la misma especie de levadura son incapaces de fermentar los mismos azúcares. Así pues, puede utilizarse una cepa de levadura en una composición de masa que únicamente sea capaz de fermentar determinados azúcares. Controlando la cantidad total de dichos azúcares en la composición de masa, puede regularse la cantidad de fermentación.

Según lo indicado anteriormente, la mayoría de levaduras generan dióxido de carbono, aun a temperaturas de refrigeración. Si el substrato de azúcar fermentable por la levadura es limitado, cesará prácticamente la generación de dióxido de carbono al agotarse el azúcar. Así pues, bien permitiendo que la levadura metabolice los azúcares fermentables en la masa durante un período determinado de tiempo antes de enlatarse, bien controlando el contenido de azúcar en la masa, la generación de dióxido de carbono por la levadura puede acabarse prácticamente cuando se alcance un volumen predeterminado dado, con independencia de la temperatura de la masa. Así pues, puede impedirse que el volumen total de dióxido de carbono generado en el recipiente alcance un nivel suficiente para aumentar la presión interna y reventar el recipiente.

Según lo indicado anteriormente, el problema que surge con la utilización de levadura MAL- en masas refrigerables es que la maltosa es descompuesta por las enzimas naturales de la harina, en azúcares más sencillos, que metaboliza la levadura.

La gran mayoría de azúcares presentes en la mayoría de harinas se metabolizan por la levadura al descomponerse en glucosa o fructosa, o ambas, y ambos azúcares siguen metabolizándose por la levadura. Se describe un modo de superar el problema de la generación de dióxido de carbono mediante la fermentación de azúcares grandes que la levadura descompone en unidades más pequeñas fermentables por la levadura, mediante la utilización de levadura incapaz de metabolizar la glucosa. Así pues, esta levadura no puede fermentar una de las unidades más pequeñas en las que puede descomponerse un azúcar mayor. De este modo, se limita prácticamente el substrato de la levadura a fructosa y precursores de la misma, limitando así en gran parte la producción de dióxido de carbono.

Se describe una levadura incapaz de metabolizar tanto la glucosa como la fructosa. De este modo, se bloquean las dos vías de fermentar azúcares naturales de la mayoría de harinas y sus subproductos, con lo que la levadura es prácticamente incapaz de fermentar azúcares naturales de la harina. La producción de dióxido de carbono puede controlarse por tanto de manera cuidada mediante la incorporación medida de un azúcar, no natural en la harina, que puede metabolizar la levadura.

De acuerdo con la presente invención, adecuada para un almacenaje sensiblemente más largo a temperaturas de refrigeración, la cepa (o las cepas) de levadura que se utiliza en la masa no puede apenas fermentar los hidratos de carbono naturales de la harina. Cuando las masas utilizan harina de trigo, estos hidratos de carbono incluyen azúcares como maltosa, sacarosa, glucosa, fructosa y diversos oligosacáridos compuestos de estos azúcares. Por supuesto, si se utilizaran otras harinas, podría haber alguna variación de los azúcares naturales de dicha harina.

Se ha comprobado que la utilización de una levadura impide de hecho que la levadura fermente hidratos de carbono en la masa, bien inicialmente presentes en la composición de la masa, bien derivados de la acción de las alfa y beta amilasas en los hidratos de carbono presentes inicialmente en la masa. Puede incorporarse a la masa una cantidad predeterminada de un hidrato de carbono no natural, fermentable por la levadura, para aportar el grado deseado de fermentación. Una vez consumido el substrato, parece que cesa prácticamente la actividad de fermentación de la levadura, impidiendo que continúe la generación de dióxido de carbono y evitando un exceso de fermentación de la masa. Se ha comprobado que las composiciones de masa de acuerdo con esta realización de la invención, pueden utilizarse para preparar productos de masa capaces de almacenarse durante períodos de tiempo superiores a 90 días, sin reventar o explotar.

El hidrato de carbono que puede fermentarse por la cepa de levadura en la presente masa puede ser prácticamente cualquier hidrato de carbono que no aparezca de forma natural en la harina. Es preferible, sin embargo, que este hidrato de carbono sea un azúcar o un oligosacárido. Por ejemplo, el azúcar no natural puede ser galactosa o lactosa, un disacárido de glucosa y galactosa.

En una realización especialmente preferida, la levadura es capaz de fermentar galactosa, que no aparece de forma natural en las harinas de trigo, aunque es prácticamente incapaz de fermentar azúcares naturales de la harina de trigo; esta levadura se denomina seguidamente levadura "galactosa positiva" o "GAL+". Esta levadura GAL+ se mezcla con harina, agua y galactosa para formar una masa. Se selecciona la cantidad de galactosa en la masa para limitar la actividad de la levadura de forma que no se fermente la masa más allá del grado deseado. Según lo indicado anteriormente, en la mayoría de los casos, bastan unos 100-200 ml. de dióxido de carbono por cada 100 gramos de masa a 32°C para fermentar la masa. En su virtud, debería elegirse el porcentaje en peso de galactosa en la composición de masa de forma que no genere más de unos 200 ml. de dióxido de carbono por cada 100 gramos de masa a 32°C. La cantidad de galactosa necesaria para generar este volumen de dióxido de carbono habrá de determinarse caso por caso, ya que la cantidad puede variar en función de las diferentes cepas de levadura.

Dada la presente descripción, los versados en la materia estarán perfectamente capacitados para producir levaduras que no puedan prácticamente fermentar los hidratos de carbono naturales de la harina, pero sí otros hidratos de carbono. Dichas levaduras pueden producirse siguiendo métodos normalizados de cruce de cepas de levadura, aislando cepas adecuadas con las propiedades deseadas y similares. Estos tipos de técnicas comunes las han descrito, por ejemplo, Sherman y col., en Methods in Yeast Genetics, incorporándose a la presente lo preconizado en este antecedente por remisión. De interés concreto en la publicación de Sherman y col. es el Apartado III, titulado "Making Mutants", que aparece en las páginas 273-369 de este antecedente.

Lobo y Maitra preconizan un método de conversión de una cepa negativa de hexoquinasa de S. Cerevisiae negativa de glucoquinasa (es decir, un método de elaboración de una cepa de levadura GAL+) utilizando técnicas normalizadas en "Physiological Role of Glucose-Phosphorylating Enzymes in Saccharomyces Cerevisiae", Archives of Biochemistry and Biophysics 182, 639-645 (1977), incorporándose a la presente lo preconizado en este antecedente por remisión. De acuerdo con ese método, la cepa negativa de hexoquinasa se mutageniza con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina en un medio de peptona-extracto de levadura (YEP) con 50 mM de galactosa libre de glucosa, aislándose un mutante negativo de glucoquinasa mediante replicación en placas de una placa de galactosa de YEP a una placa de glucosa de YEP, como una colonia negativa de glucosa. El genotipo del mutante, que se determina mediante un análisis genético independiente, es hxk1 hxk2 glk1, en donde hxk1 y hxk2 representan genes que codifican hexoquinasas P1 y P2, respectivamente, y glk1 el determinante genético de la síntesis de glucoquinasa.

Aunque Lobo y Maitra preconizan un método adecuado para elaborar una levadura para su utilización conforme a la presente invención, los versados en la materia comprenderán que existen otros métodos. Los versados en la materia también comprenderán que pueden elaborarse mediante métodos conocidos otras cepas de levadura prácticamente incapaces de fermentar hidratos de carbono naturales de una harina concreta, aunque capaces de fermentar hidratos de carbono no naturales, distintos de la galactosa.

Ejemplo 1

Con el fin de comprobar la capacidad de una levadura GAL+ para fermentar hidratos de carbono naturales de un sistema de masa común, se prepara una composición de masa con levadura GAL+. Esta fórmula de masa contiene 870,75 g. (58,05% en peso) de harina de trigo, 529,80 g. (35,32% en peso) de agua, 58,20 g. (3,88% en peso) de la premezcla de gluten de trigo utilizada en el Ejemplo 1, 11,25 g. (0,75% en peso) de sal y 28,50 (2,00% en peso) de levadura. La levadura utilizada en este experimento es una cepa GAL+ de Saccharomyces Cerevisiae, denominada D308.3; esta levadura es del genotipo \alpha hxk1 hxk2 glk1 ade1 trp1 his2 met4. Esta levadura está a disposición del público en Yeast Genetic Stock Centre, Laboratorio Donner, del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de California, Berkeley (YGSC); en la Séptima Edición del catálogo de YGSC de 15 de marzo de 1991, esta cepa de levadura figuraba con el número de lote D308.3. Esta cepa de levadura también se depositó en la American Type Culture Collection, con domicilio en 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU. (ATCC), el 5 de marzo de 1993, con el número ATCC 74211.

Se utilizan colonias aisladas de la levadura D308.3 de placas de agar de galactosa sólida para inocular seis matraces de cultivo de 50 ml. con peptona-extracto de levadura líquido ("YEP") y galactosa. Se incuban las muestras durante unas 20 horas a unos 30°C, utilizándose seguidamente para inocular seis muestras en matraz de un litro, también con YEP y galactosa. Se incuban estas matraces de 1 L durante unas 24 horas a 30°C, incubándose seguidamente a unos 24°C durante unas 20 horas.

Se recolecta seguidamente esta levadura utilizando un rotor GSA, que puede adquirirse comercialmente de Sorval Instruments. Se llenan los recipientes de muestra para su utilización con el rotor GSA de forma que el peso total de la muestra, la tapa y el recipiente sean de unos 300 g. Se centrifuga el recipiente de muestra a unas 2.500 rpm durante 20 minutos, decantándose inmediatamente el fluido sobrenadante. Se añade al envase demuestra agua destilada suficiente para elevar el peso total de la muestra, la tapa y el envase hasta 300 g., agitándose el recipiente para volver a poner la pelota de levadura en suspensión. Se vuelve a centrifugar seguidamente el recipiente de muestra a 2.500 rpm durante 20 minutos, decantándose nuevamente el fluido sobrenadante.

Se combinan la pasta de levadura lavada y agua para formar una suspensión acuosa espesa. Dicha suspensión acuosa espesa se mezcla con los demás ingredientes en una mezcladora Hobart de superficie. Se mezcla la masa a la 1ª velocidad durante 30 segundos, mezclándose seguidamente a la 2ª velocidad durante entre unos 4 y unos 5 minutos. Se introducen dos muestras de 100 g. (Al y A2 en las Figuras 1 y 2) y dos muestras de 50 g. (A3 y A4 en las Figuras 1 y 2) en la máquina de prueba Risograph^{TM}. La máquina Risograph^{TM} puede adquirirse comercialmente de Sheldon Manufacturing, Inc. para la detección del volumen de gas, por ejemplo dióxido de carbono, que genera una muestra y el ritmo al que se genera dicho gas. Se incuban las muestras a unos 30°C durante unas 17 horas (1.000 minutos). Los resultados de estas pruebas con Risograph se muestran en las Figuras 1 y 2.

En la Figura 1, puede observarse cómo se genera de manera bastante rápida dióxido de carbono en todas estas muestras durante los primeros 40-50 minutos, tras lo cual el ritmo de evolución decae hasta llegar a cero, aproximadamente. Aunque el ritmo de generación de dióxido de carbono parece haber fluctuado entre ritmos ligeramente positivos y negativos, parece que las muestras generan muy poco o nada de dióxido de carbono a partir de unos 120 minutos desde el inicio de la incubación hasta el final del experimento.

Asimismo, aunque el ritmo de generación de dióxido de carbono es apreciable al comienzo del experimento, cabría constatar que el volumen total de dióxido de carbono generado en esta muestra no es superior a unos 7 ml.; este resultado se aprecia mejor en la Figura 2. De acuerdo con lo indicado anteriormente, para una correcta fermentación de la masa, suelen considerarse necesarios entre unos 100 y unos 200 ml. de dióxido de carbono/100 g. de masa. No obstante, el volumen de dióxido de carbono generado en estas muestras sin galactosa cae muy por debajo de esos límites. El indicio de la generación de unos 7 ml. de gas en estas muestras puede de hecho atribuirse principalmente, e incluso en su totalidad, a la dilatación del espacio libre de los recipientes de muestra de la Risograph^{TM} al calentarse los recipientes para su incubación. Es decir, parece probable que las muestras de masa no generan dióxido de carbono perceptible en este experimento.

Así pues, puede decirse que la levadura D308.3 utilizada en este Ejemplo es prácticamente incapaz de fermentar, o metabolizar de otro modo, los hidratos de carbono naturales de este sistema de masa. Así pues, se cree que la cepa D308.3 de levadura puede denominarse correctamente GAL+, según el significado del término en la presente, cuya levadura es un ejemplo de una levadura adecuada para ser utilizada en la presente invención. No obstante, según lo indicado anteriormente, el versado en la materia podrá preparar otras levaduras GAL+, así como otras levaduras capaces de fermentar sólo hidratos de carbono no naturales de la harina en la masa, a la luz de la presente descripción.

Ejemplo 2

Para probar la capacidad de respuesta de la levadura GAL+ utilizada en el Ejemplo 1, se preparan cuatro composiciones de masa diferentes, con diversos hidratos de carbono no naturales. Cada una de las cuatro masas incluye 290,25 g. de harina, 176,60 g. de agua, 3,50 g. de sal y 12,00 g. de la levadura D308.3 GAL+ utilizada en el Ejemplo 1. Las fórmulas de las cuatro masas diferentes varían en la naturaleza del resto de ingredientes añadidos. En una muestra de control, no se añaden otros ingredientes; en una segunda muestra, se incluyen 5,00 g. de galactosa; en una tercera muestra, se aportan 10,00 g. de lactosa; y en la muestra final se incluyen 20,00 g. de lecha desecada y desgrasada (NFDM), utilizada como un ingrediente aromatizante en algunas masas y que suele contener algo de lactosa y hasta cantidades pequeñas de galactosa.

Se cultiva una pasta de levadura, recolectándose prácticamente del mismo modo expuesto en el Ejemplo 1. Se prepara por cada una de las muestras una suspensión acuosa espesa con el agua, añadiéndose la suspensión acuosa espesa al resto de ingredientes en una mezcladora Hobart de superficie. Se mezcla a continuación cada muestra a la 1ª velocidad durante unos 30 segundos, seguido por una mezcla a la 2ª velocidad durante unos 4 minutos. Se colocan dos muestras de 100 g. de cada una de las composiciones de masa en tarros de muestras de la máquina Risograph^{TM} nada más mezclarse, manteniéndose en dicha Risograph^{TM} a unos 28°C durante unas 20 horas. Las Figuras 3 y 4 muestran el volumen total de dióxido de carbono que se genera y el ritmo de evolución del dióxido de carbono, respectivamente, de cada una de las muestras.

En las Figuras 3 y 4, puede apreciarse que sólo la composición de masa que incluye galactosa genera volúmenes perceptibles de dióxido de carbono. La muestra testigo, con lactosa, y la muestra con NFDM, generan menos de unos 10 ml. de dióxido de carbono durante un período de unas 20 horas. Asimismo, la práctica totalidad de la generación de dióxido de carbono medida para las masas sin galactosa se genera en la primera o en las dos primeras horas de incubación. Este ligero cambio del volumen de gas en los tarros de muestra de la máquina Risograph^{TM} puede atribuirse totalmente a la dilatación térmica del espacio libre de los tarros de muestra, según lo explicado anteriormente. En su virtud, las muestras que no contienen galactosa no natural muy posiblemente no generan cantidad alguna significativa de dióxido de carbono durante el transcurso de esta prueba.

Los resultados de este experimento demuestran que la levadura D308.3 puede metabolizar galactosa, aunque es prácticamente incapaz de fermentar ningún hidrato de carbono natural de la harina en la composición de la masa. También se desprende que esta levadura es prácticamente incapaz de fermentar lactosa "directa" o lactosa en una leche desecada y desgrasada. Durante el transcurso del experimento, la masa con galactosa parece seguir generando dióxido de carbono, lo que indica que no se agota toda la galactosa. Asimismo, al finalizar las 20 horas de incubación, la masa de galactosa ha generado algo más de 100 ml. de dióxido de carbono, y al parecer la generación de dióxido de carbono sigue después de finalizado el experimento.

La galactosa con masa constituye aproximadamente un 1,0% en peso de galactosa (5,00 g. de galactosa/487,35 g. de masa total). En base a los resultados de este experimento, parece que un 1% en peso de galactosa es más que suficiente para generar los 100-200 ml. de dióxido de carbono por 100 g. de masa. La experimentación adicional usando recipientes compuestos espiroarrollados normalizados, con capacidad aproximada de 250 c.c., como los utilizados comúnmente en el envasado de masas refrigeradas comerciales, ha demostrado que basta entre un 0,5% en peso y un 1,0% en peso de galactosa para generar suficiente dióxido de carbono para alcanzar una presión interna de unas 10-20 psi. Así pues, en la preparación de un producto de masa refrigerable de la invención, la masa situada en el recipiente incluye oportunamente entre un 0,5% en peso y un 1,0% en peso de galactosa.

Ejemplo 3

Se incorpora la levadura D308.3 a un producto de masa fermentado químicamente para comprobar si la presencia de levadura GAL+ incide en la integridad del recipiente, si no se añade galactosa a la masa. Se preparan dos partidas de una masa con la levadura D308.3 y dos partidas separadas de masa fermentada químicamente. Las masas fermentadas químicamente tienen la fórmula siguiente: unos 1.590 g. (56% en peso) de harina, 947 g. (33,43% en peso) de agua, 110 g. (3,9% en peso) de la premezcla de gluten de trigo del Ejemplo 1, 89,2 g. (3,15% en peso) de aromatizantes de levadura, 42,5 g. (1,5% en peso) de glucono delta lactona (GDL), 32,0 g. (1,13% en peso) de bicarbonato sódico, y 21,3 g. (0,75% en peso) de sal. Las dos partidas de masa con levadura tienen una fórmula muy similar, sustituyéndose los aproximadamente 947 g. (33,4% en peso) de agua por unos 890 g. (31,4% en peso) de agua y unos 56,7 g. (2,00% en peso) de levadura D308.3.

Se mezcla primero el agua en cada una de estas partidas con los ingredientes aromatizantes, antes de incorporarse la harina y la mezcla de gluten a un plato mezclador McDuffy. En las partidas con levadura, se prepara una suspensión acuosa espesa de levadura con el agua antes de incorporarse a la suspensión los ingredientes aromatizantes. Se mezclan los ingredientes a una 1ª velocidad durante unos 30 segundos, seguido de una mezcla a una 2ª velocidad durante unos 5 minutos. Se añaden seguidamente la sal y los agentes de fermentación (GDL y bicarbonato) a la masa, mezclándose la mezcla a una 1ª velocidad durante unos 30 segundos y a una 2ª velocidad durante unos 2,5 minu-
tos.

Se preparan láminas con cada partida de masa, de un grosor aproximado de ¼ de pulgada (unos 0,64 cm), enrollándose para producir un "tronco" largo de masa. Se divide cada tronco de masa en una serie de muestras, con un peso aproximado de 210 g., encerrándose cada muestra en una lata compuesta espiroarrollada normal con una capacidad de 250 c.c. Seguidamente, se fermentan estos productos de masa a unos 32-35°C hasta que se alcanza una presión interna de unas 10-15 psi en los envases. Tras esta fermentación, se transfieren los productos de masa a un almacenaje refrigerado a unos 4°C.

La Figura 5 traza la presión medida de la lata, es decir la presión interna del recipiente, en función del tiempo. En la Figura 5, puede apreciarse que no parece existir apenas diferencia entre la presión en el producto de masa, con la masa normal fermentada químicamente, y el producto de masa que contiene la masa fermentada químicamente con la levadura GAL+.

Se realizan diversas otras mediciones físicas con las diferentes muestras para comparar la masa normal fermentada químicamente con la masa adicionada de levadura. Las mediciones físicas comparadas incluyen la retención de agua, el pH, y el contenido en azúcar. Las muestras de las masas también se cuecen en el horno a unos 375°F (163°C) durante unos 20 minutos. Se comparan el volumen concreto así como el aspecto, aroma y demás propiedades sensoriales de los productos cocidos resultantes. Aparte del volumen específico algo inferior de la muestra con la levadura GAL+, no parece que existan apenas diferencias entre estas dos composiciones de masa.

Ejemplo 4

Se prueba la relación entre el contenido en galactosa de la masa y las presiones internas resultantes de los productos de masa con la masa de acuerdo con la invención. Se preparan cuatro partidas diferentes, difiriendo las partidas únicamente por la cantidad de galactosa añadida. Cada composición de masa contiene unos 870,75 g. (58,05% en peso) de harina de trigo, 529,80 g. (35,32% en peso) de agua, 58,20 g. (3,88% en peso) de la premezcla de gluten de trigo utilizada en el Ejemplo 1, 11,25 g. (0,75% en peso) de sal y 28,50 g. (2,00% en peso) de levadura D308.3. Asimismo, una partida contiene unos 5,92 g. (0,5% en peso) de galactosa, otra contiene unos 7,40 g. (0,63% en peso) de galactosa, una tercera contiene unos 8,87 g. (0,75% en peso) de galactosa, y la partida final contiene unos 11,83 g. (1,00% en peso) de galactosa.

Se cultiva y recolecta la levadura D308.3 prácticamente del mismo modo que el expuesto anteriormente en el Ejemplo 2. Al formar partidas de masa con el 0,5% en peso al 1,0% en peso de galactosa, se mezcla la pasta de levadura con el agua y la galactosa en una matraz de cultivo de 1 L, incubándose en la matraz durante aproximadamente 1 hora a unos 30°C, agitándose a la vez la matraz. Seguidamente, se añade esta suspensión acuosa espesa a un plato de mezcla McDuffy, mezclándose con el resto de ingredientes a la 1ª velocidad durante unos 30 segundos, y a continuación a la 2ª velocidad durante otros 7 minutos, aproximadamente. Se preparan las partidas de 0,63% en peso y 0,75% en peso de manera ligeramente diferente, al no incubarse la levadura, el agua y la galactosa antes de mezclarse con el resto de ingredientes. En cambio, se prepara una suspensión acuosa espesa con estos tres ingredientes en una Hobart de superficie, mezclándose a la 2ª velocidad durante tan sólo unos 4 minutos, con un gancho de masa.

Una vez mezcladas las masas, se colocan dos muestras de 50 gramos de cada partida de masa en tarros de muestra de la máquina Risograph^{TM} a unos 28-30°C. Se enrolla la masa seguidamente, dividiéndose en muestras de 210 gramos, y envasándose en un recipiente de masa refrigerable normalizado, según lo expuesto antes en el Ejemplo 3. Se incuba el producto de masa resultante a unos 35°C durante unas tres horas, almacenándose posteriormente a unos 4°C.

Las Figuras 6 y 7 ilustran las presiones de lata de las muestras en función del tiempo, promediándose entre sí las presiones de lata de las muestras de cada partida para generar estas trazas. Puede apreciarse que la presión última de la lata de la muestra suele ser proporcional a la cantidad de galactosa en la masa. Si bien la muestra con un 0,63% en peso de galactosa tiene una presión de lata de unas 5-6,5 psi, la masa de 0,75% en peso tiene presiones aproximadas de 9-10,5 y la presión en la masa con un 3% en peso de levadura y un 1% en peso de galactosa genera una presión máxima ligeramente inferior a 16 psi. Así pues, parece que la presión deseada en un recipiente de la invención puede controlarse bastante fácilmente, simplemente en función de la cantidad de galactosa incorporada a la masa - una vez agotada la galactosa, la masa dejará prácticamente de producir dióxido de carbono.

Ejemplo 5

Es posible que la levadura D308.3 afecte negativamente al atractivo sensorial de las masas cocidas con dicha levadura, dado que el producto cocido final exhibe un color ligeramente alejado del blanco. Aunque el resto de calidades organolépticas de la masa son ejemplares, unas masas sin esta ligera decoloración probablemente atraigan más a los consumidores. Se determina que la decoloración de la masa muy probablemente se deba a la incapacidad de la levadura D308.3 para producir adenina, con lo que la levadura desarrolla un tono rosáceo o rojizo al cultivarse en un medio sin complemento de adenina. Se supone que esta decoloración de la levadura puede atribuirse a una acumulación de metabolitos tóxicos para la levadura (aunque no así para los humanos).

Se aislan cepas de reversión espontánea de la levadura D308.3 que no necesitan adenina para metabolizarse, denominándose en la presente levadura RD308.3. En primer lugar, se forma una pasta concentrada de la levadura D308.3 reduciendo la levadura mediante centrifugado en un rotor, según lo explicado en el Ejemplo 1. Se diluye seguidamente esta pasta de levadura con un tampón monobásico de fosfato de potasio (unos 43 mg. de KH_{2}PO_{4} añadidos a un litro de agua destilada, con el pH ajustado aproximadamente a 7,2 con NaOH) extendiéndose sobre un medio "de defecto de adenina" (ADO), es decir un medio que no contiene adenina complementaria, a una concentración aproximada de 1 x 10^{7} unidades de formación de colonia (CFU)/ml. El medio ADO contiene, por cada litro de agua destilada, aproximadamente: 6,7 g. de una base de nitrógeno de bactolevadura con aminoácidos, 20 g. de galactosa y 20 g. de bactoagar, 2 g. de una "mezcla de defecto" que contiene alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glútamina, ácido glutámico, glicina, histidina, inositol, isoleucina, leucina, lisina, metionina, ácido para-aminobenzóico, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, uracilo y valina. (Prácticamente la misma fórmula preconizada por Rose y col. en el Apéndice A de Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual (1990), que se incorpora a la presente por remisión, en las páginas 179-180, aunque dicha fórmula utilizaba glucosa en lugar de galactosa.)

Se incuban estas placas ADO a unos 25°C durante unos 4 días, aislándose las colonias de la levadura que no precisan adenina. La identificación de estas colonias se simplifica enormemente por el hecho de que las cepas no reversibles tienden a tener un tono rosáceo o rojizo mientras que las colonias reversibles son blanquecinas. Se vuelve a disponer la levadura aislada en placas en un medio ADO fresco, incubándose básicamente en idénticas condiciones. Se aislan de nuevo las colonias de cepas reversibles de la levadura de cualquier cepa arrastrada involuntariamente en el primer aislamiento, repitiéndose la disposición en placas e incubación por última vez. Aunque se cree que el versado en la materia estaría perfectamente capacitado para preparar dicha levadura a la luz de la presente descripción, dicha cepa resultante de levadura RD308.3 se depositó en la ATCC el 5 de marzo de 1993, con el número ATCC 74212, estando esta cepa a disposición del público de la ATCC.

Se preparan dos muestras, una muestra con la levadura D308.3 original y la otra con la levadura RD308.3. Se preparan estas muestras mezclando una colonia aislada (aproximadamente una lanceta) de la levadura deseada con unos 5 ml. de YEP/galactosa (que contiene unos 10 g. de extracto de bactolevadura, 20 g. de bactopeptona y unos 20 g. de galactosa por 1 litro de agua destilada), incubándose durante unas 12-15 horas a unos 30°C. (La fórmula del medio de YEP/galactosa es prácticamente la misma que la fórmula de YEP/glucosa preconizada en la página 177 del Apéndice A de Methods in Yeast Genetics, salvo que la glucosa en esa fórmula se sustituye por galactosa en este medio.) Los resultados de titulación indican una población de unos 48\pm2 x 10^{5} CFU/ml. por cada cepa. Por cada una de las muestras resultantes, se añaden unos 100 :1 de la muestra a tres porciones separadas de 5 ml. de medio, uno de cuyos medios comprende sólo YEP, el otro YEP y glucosa y el tercero YEP más galactosa.

Se mide la absorbencia de cada muestra resultante en función del tiempo, ilustrándose gráficamente en la Figura 8. El comportamiento de crecimiento de las levaduras D308.3 y RD308.3 parece ser básicamente el mismo para los tres medios de crecimiento. Además, parece que ambas levaduras pueden metabolizar galactosa fácilmente, aunque sólo pueden crecer ligeramente en YEP o YEP/glucosa. También interesa constatar que tanto la cepa D308.3 como la RD308.3 crecen algo menos en YEP/glucosa que en YEP solamente. Esto demuestra además la práctica incapacidad de estas levaduras para metabolizar glucosa.

Se comparan los marcadores auxotróficos adenina, histidina, metionina y triptófano como complementos de crecimiento de las cepas D308.3 y RD308.3 mediante técnicas normalizadas. La levadura D308.3 no puede crecer en medio mínimo de galactosa salvo que estén presentes dichos complementos de crecimiento, pero la levadura RD308.3 puede crecer únicamente con la incorporación de histidina, metionina y triptófano.

Así pues, la única diferencia significativa constatada entre los marcadores auxotróficos de estas dos cepas es que la levadura D308.3 necesita complementarse con adenina, lo que no sucede con la levadura RD308.3. Así pues, se cree que la levadura RD308.3 se comportará básicamente según lo descrito anteriormente en relación con la levadura D308.3 al añadirse a la masa, aunque debería prácticamente eliminarse la ligera decoloración de los productos cocidos asociados a las masas que contienen la levadura D308.3.

La Figura 9 es una representación esquemática del proceso de glicolisis. De forma bien conocida en la técnica, se descomponen diversos azúcares en ácido pirúvico mediante glicolisis, pudiendo utilizarse el ácido pirúvico resultante por la levadura para generar dióxido de carbono mediante fermentación en un ambiente anaerobio.

Según lo ilustrado esquemáticamente en la Figura 9, la glucosa puede convertirse en glucosa 6-fosfato mediante quexoquinasa (HXK9 o glucoquinasa (GLK). Esta glucosa 6-fosfato puede seguidamente convertirse en fructosa 6-fosfato por una de dos vías. En la vía glicolítica normal, se convierte glucosa 6-fosfato en fructosa 6-fosfato mediante la acción de fosfoglucoisomerasa.

En una vía alternativa de conversión de glucosa 6-fosfato en fructosa 6-fosfato, se convierte primero la glucosa 6-fosfato en 6-fosfogluconolactona mediante la acción de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), también denominada zwishcenferment (ZWF). Mediante la vía del fosfato de pentosa, también denominada derivación de pentosa fosfato, esta 6-fosfogluconolactona puede convertirse en fructosa 6-fosfato.

En la realización descrita anteriormente, en la que la levadura prácticamente no puede fermentar azúcares naturales de los sistemas de masa, la mutación de la levadura no puede apenas generar hexoquinasa (HXK) ni glucoquinasa (GLK). En la ilustración esquemática de la Figura 9A, puede apreciarse que esto impide la conversión de glucosa o fructosa en fructosa 6-fosfato. Dada la práctica incapacidad de la levadura para convertir glucosa o fructosa en fructosa 6-fosfato, la glucosa y fructosa no suelen poder convertirse en ácido pirúvico, con lo que no pueden utilizarse efectivamente por la levadura para producir CO_{2}.

En la representación esquemática de la Figura 9A, puede apreciarse que la galactosa puede convertirse en glucosa 1-fosfato a través de la acción de la galactoquinasa. Esta glucosa 1-fosfato puede convertirse seguidamente en glucosa 6-fosfato mediante la acción de la fosfoglucomutasa. Esta glucosa 6-fosfato puede convertirse en fructosa 6-fosfato, y seguidamente en ácido pirúvico según lo indicado anteriormente, mediante fosfoglucoisomerasa (PGI) o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Así pues, la levadura de la realización descrita anteriormente puede utilizar galactosa mediante la acción de galactoquinasa, aunque se inhabilitan las vías para la glicolisis de glucosa y fructosa debido a la falta de hexoquinasa y glucoquinasa.

Otra realización de la presente invención proporciona un método de formación de una masa que puede almacenarse a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados, sin generar volúmenes significativos de dióxido de carbono. Este método puede incluir además los pasos de envasar la masa, fermentar la masa en el envase, y almacenar la masa durante un período de tiempo prolongado a temperaturas de refrigeración.

Para preparar una masa de la invención, se mezclan entre sí harina, agua, una levadura prácticamente incapaz de fermentar hidratos de carbono naturales de la harina, y una cantidad de un hidrato de carbono fermentable por la levadura, según lo expuesto anteriormente. Es deseable que la cantidad de hidrato de carbono fermentable que se incorpora a la masa, baste para aportar tan sólo el grado necesario de fermentación de la masa; añadir un exceso de substrato fermentable podía traducirse en cambios adversos en la reología de la masa, debido a un exceso de fermentación. Esta cantidad se determina oportunamente caso por caso para una cepa de levadura determinada, ya que unas cepas de levadura diferentes pueden utilizar el substrato fermentable de una manera más eficaz que otras.

En una realización especialmente preferida del método de la invención, la levadura utilizada para preparar la masa es una levadura GAL+ y se incorpora una cantidad predeterminada de galactosa a la masa para aportar el grado deseado de fermentación. Esta GAL+ puede ser la levadura D308.3 o RD308.3 descrita anteriormente, si bien deberá entenderse que podrán prepararse otras levaduras GAL+ de acuerdo con la presente descripción, que también servirán de acuerdo con la invención.

Según lo indicado anteriormente, el método puede incluir asimismo los pasos de envasar la masa, fermentar la masa en el envase, y almacenar la masa a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados. Puede utilizarse prácticamente cualquier envase de masa refrigerable conocido en la técnica en este método. Por ejemplo, deberían bastar recipientes de masa espiroarrollados como los utilizados en la actualidad en productos de masa refrigerables fabricados comercialmente. Se coloca en el recipiente una cantidad de masa ligeramente inferior a la necesaria para llenar el recipiente, dejando un espacio libre en el recipiente al cerrarse.

La masa puede fermentarse a continuación en el recipiente, dilatándose hasta llenar el recipiente, purgándose todo el aire existente en el espacio libre. La fermentación sigue hasta que prácticamente se ha consumido todo el hidrato de carbono fermentable por la levadura, en cuyo momento se alcanza una presión interna de entre 15 y unas 20 psi en el recipiente. Esta fermentación puede oportunamente realizarse a una temperatura elevada, por ejemplo entre unos 30°C y unos 40°C, para permitir la fermentación de la levadura, fermentándose así la masa de forma más rápida.

Esta masa fermentada puede colocarse en almacenaje refrigerado durante períodos de tiempo prolongados, a poder ser de hasta un mínimo de dos semanas. La masa de la invención oportunamente puede almacenarse a temperaturas de refrigeración durante un mínimo de 90 días, aproximadamente, el tiempo de exposición previsto para las masas en la actualidad, según lo indicado anteriormente. Por "almacenaje refrigerado", entiéndase un almacenaje a temperaturas de entre unos 12°C y unos 0°C, y preferiblemente entre unos 4° y unos 7,2°C. Dichas temperaturas se denominan en la presente memoria "temperaturas de refrigeración".

Según lo indicado anteriormente, una realización preferente de la invención proporciona una levadura prácticamente incapaz de fermentar hidratos de carbono naturales de una harina, pero capaz de fermentar un hidrato de carbono no natural. En una primera realización especialmente preferida, esta levadura comprende una levadura diploide prácticamente incapaz de fermentar hidratos de carbono naturales de la harina de trigo, aunque capaz de fermentar un azúcar no natural como la galactosa. Esta levadura se denomina en la presente levadura GAL+ diploide.

La levadura GAL+ descrita y Ajobada en la descripción anterior sirve perfectamente para producir masas refrigerables fermentadas con levadura. Sin embargo, en un entorno de producción comercial, puede ser deseable proporcionar una levadura más estable y resistente. En las instalaciones comerciales, es posible que la cepa de levadura utilizada para la producción de masas pueda entrar en contacto con otras cepas de levadura distintas de GAL+. Si la levadura GAL+ utilizada es una haploide, es posible que la levadura GAL+ se empareje con una cepa de levadura contaminante, que afecte a la integridad de la levadura que se está utilizando. De igual forma, existe la posibilidad de que parte de la cepa de levadura GAL+ haploide revierta al tipo salvaje y sea capaz de metabolizar libremente glucosa u otros hidratos de carbono naturales de la harina.

En la producción de masa comercial, no debería resultar problemática una cierta contaminación de la levadura. No obstante, si se contamina en exceso la cepa de levadura, la levadura incorporada a la composición de la masa podría ser capaz de metabolizar hidratos de carbono naturales en grado notable. Esto podría traducirse en levaduras que se adaptan al perfil del hidrato de carbono de la masa producida, y siguen produciendo cantidades considerables de dióxido de carbono aun después de agotarse el suministro predeterminado de hidrato de carbono no natural. Esto a su vez podría producir masas con una reología inaceptable después de un tiempo de exposición prolongado y podría incluso crear presiones lo suficientemente elevadas como para que revienten los recipientes en que se envasa la masa.

Así pues, es deseable contar con una levadura que sea menos sensible a la contaminación y ofrezca una probabilidad menor de revertir al tipo salvaje que utiliza glucosa. Se cree que una levadura GAL+ diploide de la invención es más resistente y menos sensible a la contaminación, y ofrece una probabilidad menor de revertir al tipo salvaje.

Ejemplo 7

En un intento por proporcionar una cepa de levadura resistente para su utilización en las instalaciones comerciales de elaboración de masa, se ha creado una cepa GAL+ diploide. Tanto la cepa D308.3 como la RD308.3 son levaduras GAL+ haploides de tipo "\alpha" y por tanto no pueden emparejarse entre sí para formar una cepa diploide adecuada. Así pues, se crea una cepa de levadura GAL+ de tipo "a" para emparejarse con una cualquiera o ambas de las levaduras D308.3 y RD308.3.

Se utilizan las siguientes cepas para crear la levadura diploide GAL+ deseada:

Cepa	Genotipo
XA83-5B	a lts8 lis2 leu1
D308.3 (trp+)	\alpha hxk1 hxk2 glk1 ade1 his2 met14*
RD308.3	\alpha hxk1 hxk2 glk1 trp 1 his2 meta14
YM3270	\alpha zwf1:: URA3 ura3-52 his3-200 ade2-101 lis2-801 tril-501

La cepa de levadura XA83-5B está a disposición del público en YGSC bajo la misma denominación. La YM3270 se adquiere del Dr. Mark Johnston, de la Universidad de Washington, Universidad de Medicina de San Luis, Missouri, EE.UU. Se ha comprobado que estas cepas de levadura son útiles en el actual protocolo de emparejamiento porque la levadura XA83-5B permite la generación de un haploide GAL+ con un tipo de emparejamiento a y la levadura YM3270 es útil en la realización de pruebas para confirmar que la levadura resultante se trata efectivamente de un tipo de emparejamiento a. No obstante, se cree y así debería comprenderse, que podrían haberse utilizado en su lugar otras levaduras de un tipo a. Esto sucede especialmente en el caso de la levadura YM3270, que se utiliza simplemente para determinar el tipo de emparejamiento de una levadura generada según lo expuesto a continuación.

La levadura D308.3 (trp+) utilizada en este experimento es una reversible espontánea de la levadura D308.3 descrita anteriormente, y está a disposición del público en la ATCC con el número ATCC 74211. Se determina que la levadura D3089.3 depositada necesita un complemento de triptófano para crecer a un ritmo adecuado. Esta levadura D308.3 (trp+) (también denominada a continuación levadura D308.3') es una reversible espontánea de la D308.3 depositada que no necesita un complemento de triptófano para su crecimiento adecuado. La levadura D308.3' se aisla de un modo análogo al procedimiento descrito anteriormente en el Ejemplo 5 para aislar la levadura RD308.3. En concreto, se obtiene una pasta concentrada de la levadura D308.3, extendiéndose en un medio "de defecto de triptófano" (es decir un medio que no contiene complemento de triptófano) a una concentración del orden de unos 1 x 10^{7} a unos 1 x 10^{8} CFU/ml. La fórmula del medio de defecto de triptófano es prácticamente la misma que la del medio de defecto de adenina del Ejemplo 5, sustituyendo al triptófano de esa formulación por adenina, de forma que prácticamente no hay triptófano en el medio.

Se incuban estas placas de defecto inoculadas, aislándose unas colonias de la levadura que crecen en el medio de defecto, sin precisar un complemento de triptófano para su crecimiento. Se colocan estas cepas reversibles aisladas en placas nuevamente en un medio de defecto de triptófano, incubándose, y aislándose colonias en crecimiento de la placa. Nuevamente, se disponen muestras de estas colonias aisladas en placas en el medio de defecto de Triptófano, aislándose por última vez para eliminar prácticamente toda la levadura no reversible de las colonias aisladas. Estas colonias aisladas constituyen la levadura D308.3' utilizada en el presente Ejemplo 8.

La levadura haploide GAL+ de tipo a se crea mediante un cruce de la levadura XA83-5B, que es una levadura de tipo a, con una levadura RD308.3. El cruce se realiza conforme a un protocolo derivado de Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, citado e incorporado por remisión anteriormente, en sus páginas 53-59, del modo siguiente:

Se disponen levadura XA83-5B y RD308.3 en placas de agar de YEP+galactosa separadas utilizando un lanceta estéril para disponer las cepas en sus placas respectivas en una serie de líneas paralelas separadas por unos 7 mm. Se permite la incubación de estas placas a unos 30°C durante unas 24 horas.

Se realiza una impresión de la cepa XA83-5B de tipo a en una almohadilla de placas de replicación. Se imprime esta impresión en una placa fresca que incluye un medio de YEP+galactosa (un 1% en peso aproximado de extracto de bactolevadura, un 2% en peso aproximado de bactopeptona, un 2% en peso aproximado de bactoagar, y un 2% en peso aproximado de galactosa, siendo el resto agua destilada). Se realiza una impresión de la cepa RD308.3 de tipo \alpha. Se imprime la segunda almohadilla de replicación en la misma placa de YEP+galactosa utilizada para la impresión anterior, aunque con una orientación general perpendicular a la primera impresión, produciendo un esquema de cepas de levadura que se asemeja a un tablero de ajedrez. Esta placa de YEP+galactosa de doble impresión se incuba a unos 30°C durante unas 24 horas.

Se imprime la placa de YEP+galactosa preparada de este modo en una placa de medios mínimos de dextrosa sintética. Los medios mínimos de dextrosa sintética incluyen unos 6,7 g. de base de nitrógeno de bactolevadura sin aminoácidos, unos 20 g. de bactoagar y unos 20 g. de glucosa en 1 litro aproximado de agua destilada. Dicho medio mínimo se preconiza en Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, citado anteriormente, en sus páginas 178-179. Se incuban estas placas de medios mínimos de dextrosa sintética durante unas 24 horas a unos 30°C.

Se puntúa el crecimiento en las intersecciones del "tablero de ajedrez", disponiéndose en una placa de medios mínimos de dextrosa sintética fresca para aislar las colonias diploides (cruzadas) de las colonias haploides. Las colonias diploides aisladas en la placa de medios mínimos de dextrosa sintética se dispone en estrías sobre una placa de medios de esporulación, incubándose durante unos 4-5 días a unos 30°C. Los medios de esporulación contienen unos 10 g. (1% en peso) de acetato de potasio, aproximadamente 1,0 g. (0,1% en peso) de extracto de bactolevadura, unos 0,5 g. (0,05% en peso) de galactosa, unos 20 g. (2,0% en peso) de bactoagar, siendo el resto unos 1.000 ml. de agua destilada.

Se recoge una lanceta llena aproximada de células de levadura de la placa de esporulación, combinándose con unos 300 microlitros de agua destilada y unos 15 microlitos de glusulasa en un tubo de microfugio Eppendorf^{TM}. Se mezcla ésta solución mediante torbellino, incubándose a unos 30°C durante unos 30 minutos. Se sonifica la muestra incubada brevemente para separar los grupos de esporas. Se disponen diluciones en serie de unos 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6} de la muestra sonificada en placas petri de cristal de YEP+galactosa.

Seguidamente, se exponen estas diluciones en serie a vapores de éter etílico de una manera adaptada de "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Guthrie and Fink editors, en Methods of Enzymology, vol. 194, páginas 146-147 (1991), incorporándose a la presente por remisión lo preconizado en la misma. En este proceso, se sitúa un trozo de papel filtrante de 4 mm. x 4 mm. en la tapa invertida de cada placa petri con una de las diluciones en serie. En una campana ventilada, se añaden 0,75 ml. de éter etílico a cada papel filtrante, situándose las tapas y diluciones en una cámara de cristal junto con un frasco con 10 ml. de éter etílico para mantener elevada la presión de vapor en la cámara.

Se cierra herméticamente la cámara, incubándose las muestras durante unos 15 minutos a temperatura ambiente, en cuyo momento se añade una porción adicional de 0,75 ml. de éter etílico a cada cuadrado de papel filtrante. Se vuelven a incubar estas muestras en la cámara de cristal a temperatura ambiente durante 15 minutos, tras lo cual se extraen las muestras de la cámara, permitiéndose que permanezcan en atmósfera abierta con la tapa de cada muestra entreabierta durante unos 30 minutos.

Se aislan unas 287 colonias de levadura GAL+ haploide putativa de estas placas de dilución de 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6}. Se dispone cada uno de estos haploides putativos en placas-rejilla de YEP+galactosa y en placas-rejilla de YEP+glucosa, incubándose a unos 30°C durante unas 48 horas, para determinar cuáles de las cepas putativas aisladas XA83-5B x RD308.3 pueden crecer en el medio enriquecido con galactosa, aunque no así en el medio que contiene glucosa. Se determina que 50 de estas 287 colonias son GAL+ por su capacidad para crecer bien en galactosa y su incapacidad general para crecer en glucosa. Se aislan seguidamente estos haploides GAL+, disponiéndolos en estrías en placas de YEP+galactosa frescas.

Se determina el tipo de emparejamiento de cada uno de estos haploides GAL+ intentando emparejar muestras de estas levaduras con la levadura YM3270 indicada anteriormente. Dado que la levadura YM3270 es de un tipo \alpha, tan sólo las cepas de tipo a de las levaduras GAL+ aisladas podrán emparejarse con la levadura YM3270. Así pues, se identifican de este modo las cepas GAL+ capaces de emparejarse con las levaduras D308.3' y RD308.3, siendo ambas del tipo \alpha, para producir el diploide deseado de la invención.

El procedimiento utilizado para determinar la capacidad de emparejamiento es análogo al procedimiento de emparejamiento explicado anteriormente, utilizado para cruzar las cepas RD308.3 y XA83-5B. Para emparejar las cepas GAL+ aisladas y la levadura YM3270, se disponen tres líneas generalmente paralelas de cada una de las tres cepas diferentes de levaduras GAL+ en una placa petri única de YEP+galactosa (formándose un total de nueve estrías por placa petri). Se preparan una serie de dichas placas petri de forma que se disponen muestras de cada una de las cepas GAL+ aisladas en una placa petri. Se disponen seis líneas generalmente paralelas de la levadura YM3270 en un medio de YEP+galactosa. Tanto las muestras de GAL+ como la placa YM3270 se incuban a unos 30°C durante unas 24 horas.

Las cepas GAL+ y la cepa YM3270 se replican en una serie de placas con una orientación generalmente perpendicular, configurando un esquema de tablero de ajedrez, según lo explicado anteriormente en relación con el anterior protocolo de emparejamiento. Se disponen estas cepas en placas en medios de defecto de uracilo completo de dextrosa sintética en lugar de en los medios mínimos de dextrosa sintética utilizados en el emparejamiento anterior. Los medios de defecto de uracilo completo de dextrosa sintética contienen unos 6,7 g. de una base de nitrógeno de bactolevadura prácticamente sin aminoácidos, unos 20 g. de glucosa, unos 20 g. de bactoagar, y unos 2 g. de una "mezcla de defecto", siendo el resto unos 1.000 ml. de agua destilada. La "mezcla de defecto" contiene unos 0,5 g. de adenina, unos 4,0 g. de leucina, unos 0,2 g. de ácido para-aminobenzóico, y unos 2,0 g. cada una de alanina, arginina, asparagina, ácido apártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, inositol, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

Se incuban estas placas en forma de tablero de ajedrez a unos 30°C durante unas 24 horas, puntuándose su crecimiento. Al haberse determinado que la cepa de levadura YM3270 necesita complemento de uracilo para su crecimiento, la disposición de la levadura en placas en el medio de defecto de uracilo permite eficazmente que las levaduras diploides emparejadas se separen de las colonias haploides. De las 50 colonias GAL+ aisladas, únicamente se comprueba que seis son cepas haploides viables de tipo a, en base a su capacidad para emparejarse con una levadura YM3270 de tipo \alpha mediante complemento auxotrófico en los medios de defecto de uracilo.

Seguidamente, se determinan los marcadores auxotróficos de las seis cepas GAL+ identificadas por ser del tipo a, determinándose a continuación las cepas D308.3' y RD308.3 usando técnicas conocidas. En concreto, se disponen muestras de cada una de estas seis cepas en una serie de placas con medios diferentes. Los medios de todas las placas incluyen unos 6,7 g. de una base de nitrógeno de bactoagar, prácticamente sin aminoácidos, unos 20 g. de glucosa, unos 20 g. de bactoagar y unos 2 g. de una "mezcla de defecto", siendo el resto unos 1.000 ml. de agua destilada. La fórmula general de la "mezcla de defecto" es de unos 0,5 g. de adenina, unos 4,0 g. de leucina, unos 0,2 g. de ácido para-aminobenzóico, y unos 2,0 g. cada una de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, inositol, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, uracilo y valina.

Las formulaciones de los medios varían entre sí porque cada "mezcla de defecto" que se incorpora al medio deja fuera una de entre isoleucina, triptófano, lisina, adenina, histidina o metionina, pero incluye el resto de ingredientes de la fórmula. Se incuban estas series de placas a unos 30°C durante unas 24 horas, inspeccionándose su crecimiento visualmente. Aunque se utilizan medios de defecto en este protocolo, debería comprenderse que podría utilizarse cualquier medio reconocido para determinar los marcadores auxotróficos. Se determinan los siguientes marcadores auxotróficos para cada una de las seis cepas GAL+ de tipo a:

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{143mm}En este cuadro, el símbolo  + 
indica que la cepa crece en los medios  de defecto identificados, el
símbolo  -  indica que al parecer la cepa no  crece bien en los
medios de defecto identificados, y el símbolo  +/-   indica que
esta cepa al parecer crece en los medios de defecto  identificados,
aunque necesita la incorporación de met al emparejarse  con cepas de
RD308.3 o D308.3' mediante complemento auxotrófico,  según lo
descrito a continuación. Aunque el versado en la materia podrá 
preparar fácilmente otras cepas de levadura GAL+/lts de acuerdo con
la  presente descripción, para mayor comodidad, se depositó la cepa
de  levadura GAL+ no. 33 en la ATCC el 4 de marzo de
1994.\end{minipage} \cr}

En base a estas determinaciones auxotróficas, se emparejan los números de cepa GAL+ de tipo a 6, 33, 44, 46 y 50 con la cepa madre RD308.3 mientras que la cepa GAL+ de tipo a número 11 se empareja con la cepa D308.3'. Posteriormente, se utiliza el mismo protocolo de emparejamiento descrito anteriormente para emparejar las cepas RD308.3 y XA83-5B en el emparejamiento de las presentes cepas. No obstante, en este protocolo de emparejamiento, los medios mínimos de galactosa sintética utilizados para aislar las colonias diploides resultantes de sus haploides madres se complementan con aminoácidos del modo siguiente:

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{142mm}*al parecer, los diploides necesitan
un complemento de met para  crecer aunque la cepa parece ser
heterocigota respecto de la mutación que precisa
met.\end{minipage} \cr}

Se prueba cada una de estas seis cepas diploides para comprobar si siguen siendo GAL+, en el sentido de poder crecen en galactosa, aun siendo prácticamente incapaces de crecer en glucosa. Se dispone un inoculado pesado (por ejemplo del orden de unos 10^{7} CFU/ml.) de cada diploide y las cepas RD308.3 y D308.3' en placas de YEP+galactosa y YEP+glucosa. Los seis diploides y ambos haploides RD308.3 y D308.3' crecen bien en el medio de galactosa, aunque no demuestran apenas crecimiento en el medio de glucosa.

Dada la presente descripción, los versados en la materia podrán claramente preparar una levadura diploide GAL+ de la invención. Debería entenderse que el procedimiento experimental descrito antes sólo es uno de entre la gran variedad de métodos posibles para alcanzar este fin, y otros medios eficaces para preparar diploides GAL+ de la invención serán obvios para los versados en la materia, a la luz de lo preconizado en la presente. Por ejemplo, podrían seleccionarse levaduras de partidas distintas a las utilizadas en el presente ejemplo, el emparejamiento de cepas de levadura podría realizarse de otras formas conocidas, y los marcadores auxotróficos podrían determinarse por otros medios conocidos.

Se cree que la cepa de levadura GAL+ diploide de la presente invención será tanto más activa como más resistente a la reversión y contaminación que cualquiera de las cepas haploides RD308.3 y D308.3'. Dicha actividad y resistencia mejoradas deberían proporcionar una cepa de levadura GAL+ mucha más valiosa en las instalaciones comerciales de elaboración de masa que cualquiera de las levaduras haploides RD308.3 o D308.3'.

Ejemplo 9

Se han comprobado las propiedades de los diploides GAL+ producidos en el Ejemplo 8 relacionadas con el uso de la levadura en la fermentación de masa refrigerable de acuerdo con la invención. Se cree que los genotipos de los seis diploides GAL+ producidos en el Ejemplo 8, así como los de las cepas RD308.3 y D308.3', son los siguientes, en base a los genotipos de las cepas madre:

3

En primer lugar, se prueba la capacidad de cada una de las cepas de levadura relacionadas anteriormente para utilizar determinados hidratos de carbono. Se añade una lanceta de cada cepa de levadura a un frasco separado de 300 ml. que contiene unos 50 ml. de medio líquido de YEP+galactosa, aproximadamente con la misma fórmula expuesta anteriormente. Se incuban estos frascos a unos 30°C durante unas 18 horas, agitándose a la vez. Se introducen unos 100 :1 de la muestra incubada en tres probetas de 10 ml. por cada una de las muestras incubadas, una de cuyas probetas por cada muestra contiene unos 5 ml. de YEP, otra contiene unos 5 ml. de YEP+dextrosa y la tercera contiene unos 5 ml. de YEP+galactosa. Las fórmulas de estos medios también son prácticamente iguales a las expuestas anteriormente para medios similares. Se prepara un conjunto de tres probetas testigo, situando unos 5 ml. de YEP, YEP+dextrosa o YEP+galactosa en cada una de las tres probetas sin añadir levadura.

Se mide la absorbencia de cada una de las probetas resultantes a 600 nm. antes de y durante la incubación a unos 30°C. Se mide la absorbencia de las probetas con medio YEP o YEP+dextrosa durante un período de unas dos semanas, midiéndose la absorbencia de las probetas con YEP+galactosa durante unas 100 horas de incubación, tanto con agitación como sin agitación de las probetas.

Se comprueba que cada una de las cepas GAL+ a/\alpha diploides salvo a/\alpha GAL+ no. 50 crece de forma visiblemente más rápida que la cepa de levadura RD308.3 en el medio de galactosa. La D308.3', RD308.3 y cepa a/\alpha GAL+ números 6, 11, 33 y 44 crecen menos tanto en medio YEP como en YEP+glucosa. La cepa de levadura a/\alpha GAL+ no. 50 crece bien en el medio de galactosa, aunque no visiblemente mejor que la cepa RD308.3. Las cepas a/\alpha GAL+ no. 44 y a/\alpha GAL+ no. 50 también parecen empezar a crecer en el medio de YEP+glucosa después de unos 12 días de incubación. Aunque el motivo de esta aparente incapacidad de utilizar la glucosa no se entiende claramente, se supone que bien estas cepas revierten espontáneamente a la utilización de glucosa, bien las muestras utilizadas en las pruebas están contaminadas con otro organismo.

Se prueba la capacidad de las seis cepas a/\alpha GAL+ diploides para revertir a la utilización de glucosa, añadiendo en primer lugar una lanceta de las cepas de levadura para separar volúmenes de 10 ml. de YEP+galactosa, incubando estas muestras a unos 30°C durante unas 20 5 horas, con agitación. Se preparan tres placas separadas de YEP+glucosa mediante la extensión de 100 :1 de la muestra en cada una de las tres placas de la muestra. También se extienden diluciones en serie de 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6} de cada muestra en placas similares de YEP+galactosa.

Se incuban estas placas, dejándose constancia del número de 0 colonias reversibles observadas en cada una de las seis cepas en sus placas de YEP+glucosa respectivas. Se comparan estas tasas con el número total de colonias reales dispuestas en las placas en comparación con las diluciones en serie de las placas de YEP+galactosa. Se conoce bien en la materia esta técnica de determinar la frecuencia de reversión. 5 Las tasas de reversión de estas muestras determinadas de este modo son las siguientes:

Cepa de Levadura	Frecuencia de Reversión (no. de reversibles por 106 CFU)
a/\alpha GAL+ no. 6	0,10
a/\alpha GAL+ no. 11	0,04
a/\alpha GAL+ no. 33	0,03
a/\alpha GAL+ no. 44	0,03
a/\alpha GAL+ no. 46	0,09
a/\alpha GAL+ no. 50	0,01
\alpha RD308.3	0,23

Así pues, la frecuencia a la que revierten las cepas de levadura diploides de la invención a la utilización de glucosa es notablemente inferior a la frecuencia de reversión de la haploide madre RD308.3. Así pues, parece que las levaduras diploides de la invención posiblemente sean más estables que la levadura RD308.3 de la invención, al menos en cuanto a la reversión a la utilización de glucosa.

Se valoran estas cepas diploides en sistemas de masa para determinar su utilidad en la fermentación de una masa refrigerable de acuerdo con la invención. En primer lugar, se cultivan las cepas de levadura inoculando frascos de cultivo de 300 ml. con unos 50 ml. de medio líquido de YEP+galactosa con una colonia aislada de levadura, preparándose dos frascos inoculados por cada cepa de levadura. Se incuban dichos frascos a unos 30°C durante unas 48 horas, agitando a la vez los frascos. Se añaden seguidamente estas muestras incubadas a frascos separados de 2 litros que contienen unos 1.000 ml. de medio líquido de YEP+galactosa, incubándose unos frascos mayores a unos 30°C durante unas 24 horas antes dé recolectarse en forma de pasta, según lo expuesto anteriormente en el Ejemplo
1.

Se prepara una masa a partir de cada cepa de levadura diploide, así como la levadura RD308.3. Cada masa contiene: unos 758 g. (56,1% en peso) de harina de trigo, unos 49,0 g. (3,5% en peso ) de premezcla de gluten de trigo, unos 498 g. (35,6% en peso) de agua, unos 14 g. (1,0% en peso) de sal, 35 g. (2,5% en peso) de pasta de levadura, unos 14 g. (1,0% en peso) de galactosa y unos 4,2 g. (0,3% en peso) de alimento de levadura. El alimento de levadura utilizado en esta fórmula puede adquirirse comercialmente de Red Star Universal Foods Corporation, de Milwaukee, Wisconsin, EE.UU., bajo la denominación "Alimento Normal de Levadura". Se combinan el agua, la galactosa y el alimento de levadura, mezclándose con la pasta de levadura en un plato de mezcla McDuffy^{TM} a la 1ª velocidad durante unos 30 segundos, seguido de una mezcla a la 2ª velocidad durante unos 6 minutos.

Se colocan muestras de 50 gramos de las masas producidas de este modo en un tarro de muestra Risograph^{TM}, recogiéndose los datos de evolución de gases de las muestras, al incubarse a unos 30°C durante unas 42 horas. Las muestras de masa de 50 g. fermentadas con las cepas diploides números 33, 46 y 50 y la muestra fermentada con la levadura RD308.3 generan cada una unos 90-100 ml. de CO_{2} durante el transcurso de la prueba, lo que queda dentro de los 100-200 ml. de CO_{2}/100 g. de masa que se estiman necesarios para una correcta fermentación de la masa. La muestra fermentada con la levadura a/K GAL+ no. 44 genera tan sólo unos 65 ml. de CO_{2}. Las cepas diploides números 33 y 46 parecen generar CO_{2} algo más rápidamente que la levadura haploide RD308.3. Las cepas diploides números 6 y 11 generan gas a un ritmo menor que la RD308.3, aunque no se entiende aún la razón que explica este menor ritmo, en vista de las pruebas de cultivo líquido. Las cepas números 44 y 50 parecen generar gas algo más lentamente que la cepa haploide madre.

La masa que queda después de tomarse las muestras Risograph, se enrollan en láminas con un grosor aproximado de un cuarto de pulgada, cortándose en trozos rectangulares con un peso aproximado de 250 g. Se enrollan estos trozos en forma de tronco, colocándose en latas de masa espiroarrolladas con una capacidad de 250 g. También se colocan en dichas latas trozos similares de masa normal fermentada químicamente, como la utilizada en operaciones comerciales de masa refrigerada. Se fermentan las masas enlatadas a unos 100°F (unos 38°C) hasta que la presión en la lata alcanza unas 15-20 psi. Seguidamente, se almacenan estas muestras de masa fermentada en las latas a unos 4°C, realizándose un seguimiento de la presión de las latas en función del tiempo.

La masa fermentada con levadura RD308.3 tarda unas tres horas en fermentarse dentro de la lata en la medida deseada. Todas las masas fermentadas con las levaduras diploides, salvo la a/\alpha GAL+ no. 6, se fermentan algo más rápidamente que la levadura RD308.3, y la masa con a/\alpha GAL+ no. 33 tarda tan sólo unas 2,5 horas, y la masa fermentada con a/\alpha GAL+ no. 46 tan sólo unas dos horas y cuarto. La masa fermentada con levadura a/\alpha GAL+ no. 6 tarda bastante más, siendo su tiempo de fermentación superior a 5 horas.

La Figura 13 traza las presiones medidas en las muestras de masa enlatadas en función del tiempo. La línea superior ilustra las presiones de la lata correspondientes a la muestra fermentada con la levadura a/K GAL+ no. 33, mientras que la línea inferior (con puntos de datos ilustrados por casillas vacías) representa las presiones medidas para la muestra de masa fermentada químicamente. Las mediciones de presión de la lata para ambas muestras se iniciaron después de fermentarse las masas en las latas, con lo que la presión inicial oscila entre 15 y 20 psi en ambas muestras.

La presión en ambas latas permanece prácticamente constante durante el período de un mes ilustrado en la Figura 13, pudiendo compararse favorablemente el comportamiento de la masa fermentada con la levadura de la invención, con el de la muestra fermentada químicamente. Dado que las trazas de ambas muestras permanecen generalmente planas durante las cuatro semanas en que se recogen las mediciones, no hay motivo para creer, que las presiones en los envases alcanzarían una fase crítica dentro de tiempo de exposición previsto de 90 días de las masas comerciales refrigeradas. Así pues, parece que la levadura GAL+ diploide de la presente invención sirve para elaborar masas que puedan almacenarse a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados.

Según lo indicado anteriormente, una levadura de acuerdo con otra realización de la invención es incapaz prácticamente de fermentar hidratos de carbono naturales de la harina de trigo y a la vez sensible es a temperaturas bajas. Según lo explicado en la solicitud pendiente con ésta con el número de serie 07/829.453, incorporándose a la presente lo preconizado en la misma por remisión, las levaduras sensibles a temperaturas bajas (levaduras "lts") se caracterizan por el hecho de comportarse de manera fundamentalmente "normal" a temperaturas elevadas, quedando prácticamente inactivas o latentes a temperaturas de refrigeración.

Al producir una levadura GAL+/lts de la invención, se empareja una levadura GAL+ de la invención, descrita anteriormente, con una levadura sensible a temperaturas bajas, para producir una levadura GAL+/lts. Las levaduras sensibles a las temperaturas bajas comprenden oportunamente mutaciones genéticas de cepas de levadura normales. Se cree que las cepas de levadura normales contienen un porcentaje dado de dichas células de levadura, pudiendo aislarse estos mutantes lts de la levadura mediante uno de una diversidad de métodos.

Por ejemplo, pueden aislarse mutantes sensibles al frío de la levadura mediante enriquecimiento suicida de tritio, según lo descrito por Littlewood y Davies en "Enrichment for Temperature-Sensitive and Auxotrophic Mutants in Saccharomyces cerevisiae by Tritium Suicide", Mutat. Res. Vol. 17, páginas 315-322 (1973), incorporándose a la presente lo preconizado en dicha publicación por remisión. En este proceso de enriquecimiento por suicidio de tritio, se sitúa una cepa de levadura, preferiblemente S. Cerevisiae, en un medio de cultivo a temperaturas normales para seguidamente reducirse la temperatura hasta temperaturas de refrigeración. Una vez alcanza la levadura la temperatura inferior, pueden suministrarse al cultivo uridina tritiada o aminoácidos tritiados. Las células que permanecen activas a dichas temperaturas inferiores incorporan dichos precursores y son matadas por el tritio. Sin embargo, los mutantes sensibles a temperaturas bajas presentes en la muestra de levadura, no incorporan la uridina ni los aminoácidos porque permanecen básicamente inactivos a la temperatura inferior. En su virtud, los mutantes lts preferentemente sobreviven al almacenaje a temperaturas reducidas.

Algunos investigadores en el campo de la genética han estudiado determinadas propiedades de estas levaduras. Por ejemplo, Ursic y Davies informan de los resultados de determinados estudios en "A Cold-Sensitive Mutant of Saccharomyces cerevisiae Defective in Ribosome Processing", Molec. Gen. Genet. 175, 313-323 (1979), y Singh y Manney comentan los resultados de sus pruebas en "Genetic Analysis of Mutations Affecting Growth of Saccharomyces cerevisiae at Low Temperature", Genetics, 77:651-659 (agosto de 1974); lo preconizado en estos artículos se incorpora a la presente por remisión.

Parece que existe un número relativamente grande de genes en la levadura capaces de mutar para impedir el crecimiento de la levadura a temperaturas bajas. No obstante, a los efectos de la presente invención, no parece ser vital cuáles de estos genes se ven afectados en el mutante utilizado. El factor importante en la selección de una levadura es que ésta permanezca activa a temperaturas elevadas, como por ejemplo a temperatura ambiente, y sin embargo devenga prácticamente inactiva y cese prácticamente la producción de dióxido de carbono a temperaturas de refrigeración. Pueden adquirirse ocho ejemplos adecuados de dichas levaduras lts de la ATCC, bajo los números de depósito ATCC 74124 a ATCC 74131.

La práctica inactividad de la levadura lts a temperaturas de refrigeración permite que se fermente la masa de forma previsible hasta un grado deseado a temperaturas elevadas, y seguidamente conservarse la masa fermentada a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados. Dicho almacenaje prolongado no alterará de manera significativa el volumen de la masa fermentada con levadura lts porque la levadura está inactiva y no genera un volumen significativo de dióxido de carbono adicional. Esto permite a un fabricante de masa comercial fermentar la masa de manera controlable, situándola en un recipiente cerrado para su venta a los consumidores en una fecha posterior. Siempre que la masa se almacene a temperaturas de refrigeración hasta su venta, no debería aumentar considerablemente con el tiempo la presión en el recipiente. Aunque se caliente la masa temporalmente por encima de las temperaturas de refrigeración, como por ejemplo durante su transporte o almacenaje indebido, si vuelve a enfriarse, debería pararse la acción de fermentación que estimulan las temperaturas elevadas y la levadura debería volver a quedar inactiva.

Se cree que las levaduras GAL+/lts de la invención son superiores al menos a la cepa GAL+ haploide pormenorizada anteriormente para su uso en un sistema de masa refrigerada. Las características de sensibilidad a temperaturas bajas de la levadura GAL+/lts proporciona un mecanismo de seguridad para limitar la producción de un exceso de dióxido de carbono si se contamina la cepa. En concreto, se cree que la sensibilidad de la levadura a temperaturas bajas hará que la levadura sea prácticamente inactiva a temperaturas de refrigeración aunque la levadura seguiría de otro modo produciendo dióxido de carbono.

Por ejemplo, si parte de la levadura revierte y utiliza glucosa de manera más fácil, la sensibilidad de la levadura a temperaturas bajas debería limitar cualquier efecto negativo de esta contaminación, prácticamente parando la generación de dióxido de carbono cuando una masa fermentada con esta levadura se almacena a temperaturas de refrigeración. De forma alternativa, si la integridad de la cepa de levadura no se ve comprometida pero se utiliza de manera accidental un exceso de substrato fermentable (por ejemplo exceso de galactosa) en la composición de la masa, la levadura GAL+/lts debería prácticamente cesar la producción de dióxido de carbono durante el almacenaje refrigerado de la masa, aunque pueda seguir existiendo un exceso de substrato fermentable.

Ejemplo 10

En el Ejemplo 8, se empareja la cepa de levadura XA83-5B con la cepa de levadura RD308.3 para producir levaduras diploides. Aunque la cepa de levadura RD308.3 es una levadura GAL+, se ha determinado previamente que la levadura XA83-5B es una cepa sensible a temperaturas bajas.

Según lo indicado anterior en el Ejemplo 8, de las 287 colonias de levadura haploides GAL+ putativas aisladas de las placas de dilución en serie, se identifican 50 cepas como GAL+ por su capacidad para crecer en un medio enriquecido con galactosa, aunque son prácticamente incapaces de crecer en un medio con glucosa. En el Ejemplo 8, se emparejan seis de estas cepas que se han determinado ser del tipo a con la cepa madre RD308.3 o cepa D308.3'.

En el presente experimento, se añade una lanceta de cada una de las GAL+ haploides del Ejemplo 8 a probetas estériles de 10 ml. con unos 5 ml. de YEP+galactosa. Se incuban estas muestras inoculadas a unos 30°C, con agitación, durante unas 24 horas, para cultivar las cepas. Se utilizan seguidamente dos muestras (unos 100 :1 por muestra) de cada una de estas muestras incubadas durante 24 horas para inocular probetas separadas estériles de 10 ml. con unos 5 ml. de YEP+galactosa. Esto produce 50 pares de probetas inoculadas.

Se incuba una probeta inoculada a unos 30°C mientras se incuba la otra probeta de cada pareja a unos 12°C. Se realizan mediciones de absorbencia a unos 600 nm. para cada una de las probetas incubadas a 30°C durante varios días (es decir, hasta que todas las muestras parecen alcanzar la fase de registro). También se mide la absorbencia de las muestras incubadas a 12°C a unos 600 nm., realizándose las mediciones después de unos 10 y unos 30 días de incubación.

Todas las cepas de levadura parecen crecer bien, según indica la tasa de aumento de absorbencia, al incubarse a unos 30°C. No obstante, de las 50 cepas de levadura GAL+ probadas, cinco cepas parecen crecer poco o nada, según indica el escaso o nulo aumento en la absorbencia, al incubarse a unos 12°C. Así pues, parece que estas cinco cepas son sensibles a temperaturas bajas, según la definición que de este término se utiliza en la presente. Estas cepas GAL+/lts aparentes se denominan GAL+/lts no. 8, GAL+/lts no. 17, GAL+/lts no. 21, GAL+/lts no. 26 y GAL+/lts no. 48.

El versado en la materia estará perfectamente capacitado para preparar otras cepas de levadura GAL+/lts de acuerdo con la presente descripción. No obstante, y para mayor comodidad, se depositó la cepa de levadura GAL+/lts no. 8 en la ATCC el 4 de marzo de 1994.

Para confirmar la sensibilidad a temperaturas bajas de estas cinco cepas de levadura, se comparan los ritmos de crecimiento de unas colonias de estas levaduras a 30°C y 12°C con las cepas madre RD308.3 y XA83-5B. Se disponen siete filas generalmente paralelas, cada una con cuatro colonias de una de estas siete cepas, en placas-rejilla de agar de YEP+galactosa duplicadas. Para formar las filas, se utilizan palillos estériles para transferir una colonia de la levadura. Se preparan dos de estas placas, incubándose una placa a unos 30°C y la otra a unos 12°C.

Las colonias que se obtienen con esta disposición en placas tienen un diámetro inicial aproximadamente igual al del palillo con el que se transfieren, y se realizan mediciones de los diámetros de las colonias en las dos placas de diferente incubación con el tiempo. Las Figuras 14 y 15 ilustran los datos de los diámetros de las colonias correspondientes a las cepas de levadura GAL+/lts no. 8, GAL+/lts no. 17, GAL+/lts no. 21, GAL+/lts no. 26, GAL+/lts no. 48, RD308.3 y XA83-5B para la placa incubada a unos 30°C y la incubada a unos 12°C, respectivamente.

Se miden visualmente los diámetros con un micrómetro digital y, como quiera que el palillo utilizado para transferir las muestras crea una ligera huella. en las placas de agar, resulta bastante difícil obtener mediciones fiables por debajo de un diámetro de 1 mm. Se promedian las mediciones correspondientes a las cuatro colonias en la fila dedicada a una cepa de levadura, para obtener las mediciones que se ilustran en ambos gráficos.

En la Figura 14 se observa cómo las seis cepas ilustradas de levadura crecen razonablemente bien durante el transcurso de la prueba, oscilando las colonias desde unos 3,5 mm. hasta unos 7,5 mm. después de transcurridos unos 9 días de incubación a unos 30°C. La levadura RD308.3 crece más rápidamente mientras que todas las cepas a baja temperatura crecen algo más lentamente. Las cepas GAL+/lts no. 21 y GAL+/lts no. 17 crecen al mismo ritmo aproximado que la levadura XA83-5B, y las cepas GAL+/lts no. 8 y GAL+/lts no. 48 crecen algo más lentamente.

La Figura 15 representa los ritmos de crecimiento de las mismas levaduras a unos 12°C. El ritmo de crecimiento de la levadura RD308.3 es algo más lento que el ilustrada en la Figura 12 correspondiente a una incubación a 30°C, aunque esta cepa de levadura parece sin embargo crecer bastante bien a la menor temperatura. La levadura XA83-5B y las cepas GAL+/lts no. 8 y GAL+/lts no. 26 demuestran algo de crecimiento mensurable durante la prueba de 20 días, aunque el tamaño máximo de colonia de cualquiera de estas tres levaduras nunca supera unos 2 mm. Parece existir un salto bastante pronunciado en el diámetro de la colonia después de una semana aproximada de incubación, aunque, según lo indicado anteriormente, resulta bastante difícil medir los diámetros de las colonias con precisión por debajo de un 1 mm. aproximadamente. Se cree que estas colonias crecen a un ritmo bastante constante, aunque lento, en lugar de experimentar un brote repentino de crecimiento desde los 6 días de incubación y la siguiente medición realizada después de unos 9 días de incubación.

Se cree que la temperatura de 12°C a la que se incuban estas levaduras es aproximadamente el límite superior del umbral de sensibilidad a temperaturas bajas de la cepa de levadura XA83-5B, lo que podría explicar el ligero aunque apreciable crecimiento de esta cepa a 12°C.

Sin embargo, las otras tres cepas de levadura GAL+/lts no exhiben crecimiento mensurable alguno cuando se incuban a 12°C. Esto indica que, sorprendentemente, las levaduras GAL+/lts no. 17, GAL+/lts no. 21 y GAL+/lts no. 48 tienen una sensibilidad aun mayor a temperaturas bajas que la cepa madre XA83-5B. Estas tres cepas de levadura también crecen aproximadamente igual de bien a unos 30°C que su madre sensible a temperaturas bajas.

Supuesto que estas cepas de levadura también parecen ser prácticamente incapaces de fermentar hidratos de carbono naturales de la harina de trigo, parece que las levaduras GAL+/lts no. 17, GAL+/lts no. 21 y GAL+/lts no. 48 están especialmente indicadas para utilizarse en una composición de masa refrigerable de la invención. Así pues, en base a la evaluación expuesta anteriormente, éstas serían las cepas preferidas de las obtenidas con el presente emparejamiento.

La presente descripción preconiza cómo seleccionar o aislar cepas de levadura GAL+ y lts, al menos un método de emparejamiento de dichas levaduras, y métodos para probar las cepas de levadura resultantes para aislar y evaluar las cepas GAL+/lts obtenidas de este modo. Dado lo preconizado en la presente, el versado en la materia estará perfectamente capacitado para preparar y probar cualquier número de levaduras GAL+/lts.

Otra realización de la presente invención proporciona un método de elaboración de una masa que puede almacenarse a temperaturas de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados, sin generar volúmenes significativos de dióxido de carbono. Este método puede incluir asimismo unos pasos consistentes en envasar la masa, fermentar la masa en el envase y almacenar la masa durante un período de tiempo prolongado a temperaturas de refrigeración.

Para elaborar una masa de la invención, se mezclan entre sí harina, agua, una levadura prácticamente incapaz de fermentar hidratos de carbono naturales de la harina, y una cantidad de hidrato de carbono fermentable por la levadura, según lo descrito anteriormente. Sería deseable que la cantidad de hidrato de carbono fermentable añadida a la masa bastase para aportar tan sólo el grado necesario de fermentación de la masa; la incorporación de un exceso de substrato fermentable podría provocar cambios negativos en la reología de la masa debido a un exceso de fermentación. Esta cantidad se determina oportunamente caso a caso para una cepa de levadura determinada, dado que las cepas de levadura diferentes pueden utilizar el substrato fermentable de una manera más eficaz que otras. Si se desea, pueden añadirse a la masa ingredientes aromatizantes adicionales, tales como sal, cantidades adicionales de azúcares naturales de la harina, o gluten de trigo, hasta alcanzar un sabor deseado en el producto final cocido al horno que se produce con la masa.

En una realización especialmente preferida del método de la invención, la levadura utilizada para elaborar la masa es una levadura GAL+, añadiéndose una cantidad predeterminada de galactosa a la masa para aportar el grado deseado de fermentación. Esta levadura GAL+ podría ser la D308.3, D308.3' o RD308.3 que se han descrito anteriormente, aunque como se comprenderá, podrán prepararse otras levaduras GAL+ de acuerdo con la presente descripción, que también servirán de acuerdo con la invención.

Según lo indicado anteriormente, el método podrá incluir unos pasos adicionales consistentes en envasar la masa, fermentar la masa en el recipiente, y almacenar la masa a temperaturas de refrigeración durante un período de tiempo prolongado. Prácticamente cualquier envase de masa refrigerable conocido en la técnica podrá utilizarse en este método. Por ejemplo, deberían servir los recipientes de masa espiroarrollados como los utilizados en la actualidad para productos de masa refrigerables elaborados comercialmente. Se coloca en el recipiente una cantidad de masa algo inferior a la necesaria para llenar el recipiente, dejando un espacio libre en el recipiente al cerrarse.

Seguidamente, puede fermentarse la masa en el recipiente, dilatándose hasta llenarlo y purgar todo el aire del espacio libre. La fermentación continúa hasta que prácticamente se ha consumido todo el hidrato de carbono fermentable por la levadura, en cuyo momento se alcanza una presión interna aproximada de entre 15 y 20 psi en el recipiente. Esta fermentación puede llevarse a cabo oportunamente a una temperatura elevada, por ejemplo entre unos 30°C y unos 40°C, para permitir la fermentación de la levadura, fermentando así la masa más rápidamente.

Esta masa fermentada puede situarse seguidamente en un almacenaje refrigerado durante períodos de tiempo prolongados, oportunamente de hasta un mínimo de unas dos semanas. La masa de la invención es oportunamente capaz de almacenarse a temperaturas de refrigeración durante un mínimo de unos 90 días, el tiempo de exposición esperado de las masas actuales, según lo explicado anteriormente. Por "almacenaje refrigerado" entiéndase un almacenaje a temperaturas del orden de 12°C a 0°C, y preferiblemente entre unos 4°C y unos 7,2°C. Dichas temperaturas se denominan en la presente memoria "temperaturas de refrigeración".

Se describen asimismo composiciones de masa en las que la levadura es sensible a la temperatura. Si se calientan por encima de un umbral de temperatura de inactivación de la levadura, las capacidades de producción de dióxido de carbono de la levadura en ambientes básicamente anaerobios prácticamente se inactivan, fundamentalmente a todas las temperaturas. Mediante un control eficaz de los parámetros de producción y de las capacidades de producción de dióxido de carbono de la levadura, puede controlarse la fermentación de las composiciones de masa por la levadura.

Según lo explicado anteriormente, aun a temperaturas de refrigeración, la levadura convencional puede seguir produciendo dióxido de carbono. Si la producción de dióxido de carbono se inactiva prácticamente, calentando la composición de masa por encima del umbral de temperatura de inactivación de la levadura, puede controlarse la cantidad de fermentación una vez la masa alcanza un volumen predeterminado, con independencia de las posteriores condiciones de temperatura a que se exponga la composición de masa.

Las composiciones de masa refrigerada descritas emplean cepas de levadura sensibles a la temperatura, que normalmente funcionan a temperaturas inferiores a su umbral de temperatura de inactivación. Por ejemplo, una levadura podría ser capaz de fermentar el substrato en la levadura a temperatura ambiente, aproximadamente, y seguir fermentando substrato a temperaturas por debajo del umbral de temperatura de inactivación. Sin embargo, una vez calentada la levadura por encima del umbral de temperatura de inactivación, pierde su capacidad para producir el dióxido de carbono necesario para fermentar la masa. Se ha comprobado sorprendentemente que, utilizando una levadura sensible a la temperatura, las composiciones de masa pueden fermentarse de forma anaerobia hasta una volumen predeterminado, calentándose seguidamente hasta al menos el umbral de temperatura de inactivación, para prácticamente inactivar las capacidades de producción de dióxido de carbono de la levadura. En algunas composiciones de masa, puede realizarse la fermentación de la masa a la vez que se calienta la masa hasta el umbral de temperatura de inactivación. La composición de masa puede seguidamente almacenarse, por ejemplo a temperaturas de refrigeración, durante períodos de tiempo prolongados, sin los inconvenientes asociados a un exceso de producción de dióxido de carbono y degradación de la reología de la masa por la levadura convencional durante el almacenaje.

La composición de masa refrigerable de la invención puede colocarse opcionalmente en un recipiente para su almacenaje a temperaturas de refrigeración. Dicho recipiente es conocido por los versados en la materia y podría incluir las latas espiroarrolladas compuestas. Se sitúa la masa sin fermentar en la lata, cerrándose a continuación, y fermentándose hasta alcanzar una presión interna de unas 15-20 psi, llenando así todo el volumen de la lata con la masa. La masa crea un cierre hermético en dicho recipiente, llenando los respiraderos y dejando el ambiente interno de la lata prácticamente anaerobio. Entre los ejemplos de dichas latas espiroarrolladas compuestas adecuadas para masa refrigerada están las descritas en las patentes siguientes, incorporándose a la presente lo preconizado en las mismas por remisión: Culley y col., Patente EE.UU. no. 3.510.050; Reid, Patente EE.UU. no. 3.972.468; y Thornhill y col., Patente EE.UU no. 3.981.433.

Se forma un recipiente alternativo a partir de un material de envasado flexible, como por ejemplo una película polimérica, dejándose el ambiente interno del recipiente prácticamente anaerobio. Un método para dejar el ambiente interno prácticamente anaerobio consiste en cerrar el recipiente herméticamente mediante un vacío o en un ambiente de gas inerte. De forma alternativa, puede añadirse un gas al envase, eliminando prácticamente el oxigeno del recipiente, antes de cerrarlo.

La composición de masa refrigerada de la presente invención puede almacenarse alternativamente sin un recipiente, a temperaturas de refrigeración, directamente después de cesar la fermentación.

La formulación de la composición de masa no es crítica; puede utilizarse prácticamente cualquier masa que contenga harina, agua y una levadura de acuerdo con la invención. En el cuadro I figura un ejemplo de una formulación de composición de masa apta para utilizarse en la presente invención:

Cuadro I

Ingrediente	Peso Porcentual de la Masa
harina	54,53-57,93
agua	34,71-35,45
premezcla de gluten*	3,88-3,91
dextrosa	0,99
Sal	0,75
levadura sensible a la temperatura	1,00
\begin{minipage}[t]{128mm}*La premezcla de gluten comprende aproximadamente un 75% de gluten de trigo vital; un 21,9% de gluten duro superior; harina de ingredientes enriquecidos; un 2,5% de goma de xantano; y un 0,616% de premezcla de azodicarbonamida.\end{minipage}

La levadura sensible a la temperatura utilizada en una realización de la presente invención puede ser cualquier integrante de la especie Saccharomyces cerevisiae, que tiene un umbral de temperatura de inactivación, es decir que se inactiva prácticamente si se calienta hasta una temperatura superior a un determinado umbral. Oportunamente, el umbral de temperatura de inactivación de la levadura no es superior a uno 43°C, a cuya temperatura la masa convencional elaborada con harina de trigo comienza a cocerse. (En la presente, el término "masa" o "composición de masa" se refiere a masa sin cocer, mientras que una masa cocida al horno se denomina "masa cocida al horno", "producto cocido al horno" o similar.)

Por otra parte, si el umbral de temperatura de inactivación de la levadura está por debajo de la temperatura ambiente, elaborar la masa en una instalación comercial podría ser muy difícil porque toda la zona de producción tendría que mantenerse por debajo de esa temperatura con el fin de permitir que la levadura fermentase la masa antes de inactivarse. Así pues, en una realización preferente, el umbral de temperatura de inactivación de una levadura utilizada en una masa de la invención oscila entre unos 25°C y unos 43°C.

También se ha comprobado que calentar una masa por encima de los 40°C durante un período de tiempo considerable puede deteriorar la masa, debido a la posible desactivación y desnaturalización del gluten de la harina de trigo, estimulándose asimismo a temperaturas superiores el crecimiento de microorganismos dañinos naturales de la harina de trigo. Según lo explicado pormenorizadamente a continuación, se permite que la levadura fermente la masa antes de calentarse por encima del umbral de temperatura de inactivación. La fermentación se produce más rápidamente a temperaturas elevadas, por ejemplo a unos 30-40°C, de lo que sucede a temperatura ambiente o inferior; podría decirse que la actividad de la levadura, y por ende el ritmo de fermentación, se correlaciona más o menos positivamente con la temperatura.

Así pues, sería oportuno en un entorno de producción comercial, que se pudiera calentar la masa por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo hasta unos 30°C o más, sin superar el umbral de temperatura de la levadura, y dejarla prácticamente inactiva. Así, en una realización especialmente preferida de la invención, el umbral de temperatura de inactivación de la levadura oscila oportunamente entre unos 25°C y unos 40°C, y oportunamente entre unos 30°C y unos 40°C.

Es deseable que dicha levadura sensible a la temperatura entre en una parada del ciclo celular al exponerse a temperaturas superiores a su umbral de temperatura de inactivación. Los solicitantes han descubierto que una vez se produce una parada del ciclo celular inducido por la temperatura, la levadura tiende a convertirse en aerobios obligados y pasa a ser prácticamente incapaz de tener un crecimiento anaerobio fermentativo. Los solicitantes han descubierto asimismo que pueden usarse estas características para controlar eficazmente la fermentación de la masa y que la masa con dicha levadura sensible a la temperatura pueda almacenarse en condiciones de refrigeración durante períodos de tiempo prolongados.

Mediante el uso de levadura sensible a la temperatura en composiciones de masa, puede fermentarse la masa hasta el volumen deseado a temperaturas inferiores al umbral de temperatura de inactivación, tras lo cual puede inactivarse prácticamente la levadura, sometiendo la masa, y por tanto la levadura en la misma, a temperaturas superiores al umbral de temperatura de inactivación de la levadura. La masa preparada de este modo puede refrigerarse durante periodos de tiempo prolongados, sin los riesgos de un exceso de fermentación y ruptura del recipiente opcional mediante una fermentación excesiva de la composición de masa. Tras la inactivación de la masa, permitir una variación de las temperaturas de la composición de masa, aun a temperaturas por debajo de los niveles de umbral, no tiene ningún efecto medido sobre la práctica inactivación de las capacidades fermentativas de la levadura. Estas características de la levadura hacen que resulte especialmente indicada para su transporte y almacenaje cuando pueden producirse grandes fluctuaciones de temperatura, que podrían incidir negativamente en la masa fermentada con una levadura convencional no sensible a la temperatura. El producto obtenido mediante la cocción de esta composición de masa refrigerada puede definirse como un producto panano, al fermentarse con levadura y disponer de las calidades organolépticas asociadas a productos de masa fermentados con levadura.

Dada la presente descripción, los versados en la materia estarán perfectamente capacitados para producir levaduras que puedan prácticamente inactivarse mediante su tratamiento térmico a elevadas temperaturas. Dichas levaduras pueden producirse mediante métodos normalizados de cruce de cepas de levadura, aislando cepas adecuadas con las propiedades deseadas y similares. Estos tipos de técnicas comunes las describen, por ejemplo, Sherman y col. en Methods in Yeast Genetics, incorporándose a la presente lo preconizado en este antecedente por remisión. De interés especial en Sherman y col. es el Apartado III, titulado "Making Mutants", que figura en las páginas 273-369 de este antecedente.

Un procedimiento de creación y aislamiento de dichos mutantes ha sido preconizado por Hartwell y col. en "Genetic Control of the Cell Division Cycle Mutant in Yeast: V. Genetic Analysis of cdc Mutants", Genetics 74: 367-286 (junio de 1973), incorporándose lo preconizado en la misma a la presente por remisión. Según lo descrito en ese artículo, Hartwell y col. trataron una cepa de levadura con un genotipo a ade1 ade2 ura1 tir1 his7 lis2 gal1, identificado como cepa A364A, con un mutágeno conocido, a saber bien N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanadina o etilmetano sulfonato. Se aislaron los mutantes resultantes sensibles a la temperatura con una temperatura permisiva de unos 23°C y una temperatura de crecimiento restrictivo de unos 36°C. De estos mutantes sensibles a la temperatura, se aislaron mutantes de ciclo de división celular, identificando los criterios morfológicos de estos mutantes y seleccionando las colonias mutantes en las que el 80% o más de las células mostraban una morfología uniforme.

Tras este procedimiento, Hartwell y col. identificaron casi 150 mutantes cdc diferentes. Los estudios complementarios demostraron que estos mutantes definían 32 grupos complementarios, definiéndose 30 de esos grupos por mutaciones únicas en genes nucleares (según lo determinado mediante técnicas normalizadas de análisis genético). Una de estas cepas que se ha comprobado que funciona bien, demostró una mutación estructural en el gen de quinasa piruvata, aunque ha de comprenderse que pueden existir otras mutaciones termosensibles que pueden funcionar bien con la presente invención.

Se ha esclarecido un posible mecanismo de inactivación térmica para la cepa S. cerevisiae cdcl9, que puede adquirirse de Yeast Genetic Stock Centre del Laboratorio Donner, del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de California, Berkeley (YGSC) y depositada también en la American Type Culture Collection, con domicilio en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD (ATCC), el 5 de marzo de 1993, con el número ATCC 74213. La vía de fermentación de la cepa de levadura cdc 19 se inactiva prácticamente tras su exposición a temperaturas superiores al umbral de temperatura de inactivación, debido a una mutación de la levadura, que se traduce en una enzima de quinasa piruvata lábil térmicamente. Pueden identificarse los mutantes con una mutación en el gen quinasa piruvata mediante técnicas de análisis morfológico o genético.

Si la composición de masa que contiene la levadura sensible a la temperatura se somete a temperaturas superiores al umbral de temperatura de inactivación, la quinasa piruvata pasa a ser inactiva estructuralmente, y la levadura se convierte en aerobios obligados, incapaces prácticamente de cualquier fermentación anaerobia hasta que se reanude la biosíntesis de quinasa piruvata. En la cepa cdc 19, se reanuda la biosíntesis de quinasa piruvata cuando i) existe presencia de oxígeno y puede ocurrir una biosíntesis de nuevo de quinasa piruvata, o ii) la mutación genética revierte al tipo salvaje. Dichas reversiones suelen ocurrir sólo cuando está creciendo la levadura. En la Figura 16, donde el crecimiento anaerobio de dicha levadura sensible a la temperatura se observa a 25°C después de una incubación de 0-4 horas a 40°C, una vez expuestas las células cdc 19 a temperaturas superiores a su umbral de temperatura de inactivación, puede observarse cómo, en condiciones anaerobias, la levadura pierde su capacidad para crecer y revierte al tipo salvaje.

La inactivación térmica de la levadura cdc 19 prácticamente elimina cualquier producción adicional de dióxido de carbono en condiciones anaerobias a todas las temperaturas en cuestión (por ejemplo, entre unos 0°C, al congelarse la masa, y unos 45°C, al cocerse la masa). Esto hace que la levadura resulte especialmente indicada para composiciones de masa refrigerada.

La levadura sensible a la temperatura utilizada en las composiciones descritas, según lo expuesto anteriormente, puede ser cualquier integrante de la especie S. cerevisiae con un umbral de temperatura de inactivación superior y que prácticamente deviene inactiva a temperaturas de refrigeración. Puede obtenerse esta levadura mediante el emparejamiento de una levadura sensible a temperaturas bajas con una levadura sensible a temperaturas altas, por ejemplo. Existen numerosas cepas de levadura que llevan mutaciones sensibles a temperaturas bajas. A los efectos de la presente invención, no se cree vital la elección de la utilizada de estas cepas mutantes, siempre que las características exigidas de práctica inactividad a temperaturas de refrigeración y de actividad de fermentación prácticamente normal a temperaturas elevadas, es decir superiores a las de refrigeración, se cumplan en la cepa concreta elegida.

A veces, se encuentran mutantes sensibles a temperaturas bajas en cepas de levadura normales. El aislamiento de estos mutantes sensibles a temperaturas bajas podrá lograrse mediante una serie de métodos que conocen los versados en la materia. Un método de aislamiento es el protocolo de enriquecimiento por "suicidio de tritio" que describen Littlewood y Davies en "Enrichment for Temperature Sensitive and Auxotrophic Mutants in Saccharomyces cerevisiae by Tritium Suicide", Mutation Research Volumen 17, páginas 315-322 (1973), incorporándose a la presente lo preconizado en la misma por remisión.

En este protocolo, se sitúa en primer lugar una cepa de levadura en un medio de cultivo a una temperatura permisiva normal, seguido por una reducción de la temperatura hasta una de refrigeración (no permisiva). Se complementa el cultivo con uridina tritiada o aminoácidos tritiados. Las células de levadura que permanecen activas a estas temperaturas incorporan los precursores de tritio y son matadas por el tritio. Las células inactivas a estas temperaturas inferiores no incorporan los precursores tóxicos y pueden sobrevivir a las temperaturas bajas por su sensibilidad a temperaturas bajas.

El versado en la materia estará perfectamente capacitado para producir una levadura sensible a temperaturas bajas de acuerdo con este proceso de suicidio de tritio. No obstante, las siguientes cepas de levadura que devienen prácticamente inactivas a temperaturas de refrigeración está a disposición del público en la ATCC: "lts1" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74121), "lts2" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74125), "lts3" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74126), "lts4" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74127), "lts5" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74128), "lts6" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74129), " lts7" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74130), y " lts8" S. cerevisiae (Denominación No. ATCC 74131).

Puede realizarse el emparejamiento de una cepa de levadura sensible a temperaturas altas con una cepa de levadura sensible a temperaturas bajas por cualquier medio conocido de producción de mutantes haploides en la levadura. Se deriva uno de estos protocolos de Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, páginas 53-59 (1990), incorporándose lo preconizado en la misma a la presente por remisión.

Los solicitantes han descubierto que combinando las propiedades de una cepa de levadura sensible a temperaturas altas con una cepa de levadura sensible a temperaturas bajas, se produce una cepa de levadura mutante con características que hacen que sea excelente para su uso como agente de fermentación en composiciones de masa refrigeradas. Combinando las sensibilidades a temperaturas altas y bajas en la levadura, ésta no sólo puede inactivarse elevando la temperatura de la composición de masa por encima del umbral de temperatura de inactivación, sino que también se elimina la posibilidad remota de que algunas células de levadura no se inactiven y sigan generando dióxido de carbono a temperaturas inferiores, como por ejemplo temperaturas de refrigeración, introduciendo en la cepa de levadura una sensibilidad al crecimiento a temperaturas bajas.

Se ha esclarecido un mecanismo posible para la sensibilidad al crecimiento a temperaturas bajas en levaduras sensible a temperaturas bajas para "lts8" S. cerevisiae (indicada anteriormente). La mutación que realiza esta cepa hace que la levadura sea incapaz de cualquier síntesis proteínica a temperaturas inferiores, como por ejemplo temperaturas de refrigeración. Así pues, esta levadura no puede crecer por debajo de su umbral de temperatura de inactivación.

La combinación de las características de la levadura sensible a temperaturas altas y bajas hace que la biosíntesis de quinasa piruvata sea muy improbable después de elevarse la temperatura de la levadura en la composición de masa por encima de su umbral de temperatura de inactivación, seguido por una refrigeración, lo que inactiva de forma prácticamente total toda la síntesis proteínica como consecuencia de la mutación sensible a temperaturas bajas. Al inactivarse prácticamente la quinasa piruvata, y no poder sintetizarse de nuevo la quinasa piruvata por la levadura en cantidades significativas, se elimina prácticamente todo el crecimiento fermentativo anaerobio, sin que la levadura produzca ningún volumen significativo de dióxido de carbono. Así pues, la mutación sensible a temperaturas bajas de la levadura cumple una función de seguridad - si se permite accidentalmente que entre en contacto algo de oxígeno con la levadura (es decir, si el recipiente de masa fermentada con esta levadura permite la entrada de aire), la levadura seguirá siendo prácticamente incapaz de producir dióxido de carbono.

De acuerdo con un método de elaboración de una composición de masa conforme a la presente invención, se mezcla la levadura sensible a la temperatura con agua y un producto de harina, como por ejemplo trigo molido, en proporciones adecuadas para formar una masa que resulte adecuada para cocer. También pueden añadirse ingredientes adicionales necesarios para alcanzar una textura o un sabor deseado en el producto de masa cocido final durante esta mezcla. Se conocen estos ingredientes en la técnica e incluyen sal, azúcares, gluten de trigo, acondicionadores de masa y otros aromatizantes. Deberían mezclarse todos estos ingredientes entre sí a conciencia para asegurar una composición de masa uniforme; se conocen medios muy diversos para mezclar masa en la técnica, sin que sea necesario pormenorizarlos en la presente.

Una vez mezclada la masa, debería permitirse que la levadura generara dióxido de carbono para fermentar la masa. Esta fermentación puede realizarse a cualquier temperatura adecuada. No obstante, si se utiliza la levadura descrita anteriormente, sensible a temperaturas bajas, debería realizarse la fermentación a temperaturas superiores a las de refrigeración, ya que la levadura permanece prácticamente inactiva a dichas temperaturas. Al objeto de reducir el tiempo de producción en una instalación comercial, podría ser oportuno calentar la masa hasta una temperatura superior a la ambiente para acelerar la producción de dióxido de carbono. Así pues, podrá calentarse la masa para su fermentación, aunque debería procurarse que se mantuviera por debajo del umbral de temperatura de inactivación en la mayor parte de la masa al objeto de impedir la inactivación de la levadura antes de finalizar la fermentación. En una realización, que se ha comprobado que funciona bien utilizando la levadura cdc 19 descrita a continuación, con un umbral de temperatura de inactivación de unos 36°C, se realiza la fermentación a una temperatura que oscila entre unos 30°C y unos 35°C.

Una vez fermentada la masa hasta un grado predeterminado, puede elevarse la temperatura de la masa hasta el umbral de temperatura de inactivación, o mejor aún por encima del mismo. No se calentará la masa hasta una temperatura uniforme instantáneamente; tendería a existir un gradiente de temperatura en la masa debido al bajo coeficiente de transferencia térmica de las masas, estando la parte exterior de la masa a una temperatura más próxima a la ambiente que la parte interna de la masa. La masa se calienta oportunamente con la lentitud necesaria o se mantiene a una temperatura en el umbral de temperatura de inactivación o por encima del mismo, lo suficiente como para asegurar que la mayor parte de la levadura en la masa, y a poder ser toda ella, alcance el umbral y se inactive prácticamente.

La levadura resultante puede almacenarse seguidamente a temperaturas de refrigeración durante un período de tiempo prolongado sin generar un volumen adicional significativo de dióxido de carbono. En la presente, por temperaturas de refrigeración entiéndase entre unos 0°C y unos 12°C, prefiriéndose el intervalo de temperaturas entre unos 4°C y unos 7,2°C. La masa puede almacenarse a dichas temperaturas hasta unos 90 días o más, que es el tiempo de exposición mínimo aceptable para la mayoría de masas refrigerables producidas comercialmente, sin deterioro indebido de la calidad.

De acuerdo con otra realización del presente método, se envasa la masa en un recipiente como el descrito anteriormente. Es preferible situar la masa en el recipiente antes de su fermentación, fermentándola en el recipiente. En las actuales instalaciones comerciales de envasado que utilizan latas espiroarrolladas, se sitúa la masa en el envase, y se fermenta hasta que la presión interna en la lata alcanza unas 15-20 psi. De acuerdo con la presente invención, se sitúa la masa en el envase, permitiéndose que se fermente hasta que la presión interna del envase alcanza unas 15-20 psi, en cuyo momento se calienta la masa por encima del umbral de temperatura de inactivación, para prácticamente inactivar la levadura. El producto de masa envasado puede seguidamente almacenarse a temperaturas de refrigeración durante un período de tiempo prolongado.

Según lo indicado anteriormente, pueden existir gradientes de temperatura en la masa que produzcan un desfase temporal entre un cambio de temperatura ambiente y un cambio en la temperatura del centro de la masa. El perfil de temperatura del proceso de fermentación e inactivación debería diseñarse para tener en cuenta dicho desfase temporal. En algunos casos, el desfase temporal puede bastar para permitir que se fermente la masa a una temperatura elevada y a la vez calentar la masa hasta un umbral de temperatura de inactivación de la levadura. En dicha realización del presente método, el perfil de temperatura del tratamiento térmico puede ser suave, es decir sin exhibir una demarcación brusca entre los pasos de fermentación e inactivación.

Ejemplo 11 Preparación de Levadura Sensible a Temperaturas Altas y Bajas

Se cruza una cepa de levadura sensible a temperaturas altas, es decir prácticamente inactivada a temperaturas elevadas, con una levadura sensible a temperaturas bajas, es decir una levadura que se inactiva prácticamente a temperaturas bajas, si bien capaz de mantener la capacidad de fermentar substratos a temperaturas superiores. La levadura sensible a temperaturas altas es una cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae denominada cdc19 y depositada en la ATCC el 5 de marzo de 1993 con el número ATCC 74213. Esta cepa concreta de levadura tiene un umbral de temperatura de inactivación de unos 36°C, deviniendo un aerobio obligado si se calienta hasta dicha temperatura o una superior.

La cepa de levadura sensible a temperaturas bajas utilizada es la levadura lts8 depositada en la ATCC con el número de depósito ATCC 74131, según lo indicado anteriormente. La cepa mutante de levadura lts8 es representativa de muchas cepas de levadura conocidas sensibles a temperaturas bajas, que se comportan de forma prácticamente normal a temperaturas elevadas, pudiendo por ejemplo fermentar el substrato disponible a temperatura ambiente o superior, siendo prácticamente inactivas a temperaturas de refrigeración.

La cepa de levadura mutante sensible a temperaturas altas y bajas se obtiene emparejando la cepa mutante sensible a temperaturas altas cdc19 con la cepa mutante sensible a temperaturas bajas lts8. El protocolo utilizado para emparejar estas cepas se deriva de Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, páginas 53-59 (1990), del modo siguiente:

Se dibujan seis líneas básicamente paralelas en una hoja blanca de cartulina. Por cada una de las cepas cdc19 y lts8, se coloca una placa de YEPD (YEP más dextrosa) sobre el dibujo rayado. Utilizando una lanceta estéril, se forman estrías de las cepas sobre sus placas respectivas utilizando las líneas paralelas como guía, permitiéndose su incubación a unos 25°C durante unas 24 horas.

Se realiza una impresión de la cepa cdc 19 sobre una almohadilla de placa de replicación. Se imprime esta impresión en una placa de YEPD fresca. Utilizando una almohadilla de placa de replicación fresca, se realiza una impresión de la cepa lts8 sensible a temperaturas bajas. Se imprime la segunda almohadilla de replicación en la misma placa de YEPD utilizada para la anterior impresión, si bien con una orientación generalmente perpendicular a la primera impresión, produciendo un dibujo de cepas de levadura que se asemeja a un tablero de ajedrez. Se incuba esta placa de YEPD de impresión doble a unos 25°C durante toda la noche (es decir unas 12-15 horas).

Se imprime la placa de YEPD preparada de este modo en una placa de medio mínimo de dextrosa sintética (SD) que contiene unos 6,7 g. de base de nitrógeno de bactolevadura sin aminoácidos, unos 20 g. de glucosa y unos 20 g. de bactoagar por litro de agua destilada. Se incuba la placa de SD durante unos dos días a unos 25°C. Se puntúa el crecimiento en las intersecciones del "tablero de ajedrez", poniéndose en una placa de SD fresca para aislar las colonias diploides (cruzadas) de las haploides. Las colonias diploides aisladas en la placa de SD se disponen en estrías en una placa de medio de esporulación (según la formulación siguiente), incubándose durante días a unos 25°C: unos 10 g. (1% en peso) de acetato de potasio, aproximadamente 1,0 g. (0,1% en peso) de extracto de bactolevadura, unos 0,5 g. (0,05% en peso) de glucosa, unos 20 g. (2,0% en peso) de bactoagar, siendo el resto unos 1.000 ml. de agua destilada.

Se recoge una lanceta llena aproximada de células de levadura de la placa de esporulación, combinándose con unos 300 microlitros de agua destilada y unos 15 microlitros de glusulasa en un tubo de microfugio Eppendorf^{TM}. Se mezcla esta solución mediante torbellino, incubándose a unos 30°C durante unos 30 minutos. La muestra incubada se sonifica brevemente para separar los grupos de esporas. Se disponen diluciones en serie de unos 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6} de la muestra sonificada en placas en YEPD, almacenándose a unos 25°C durante unos dos días.

Se preparan tres placas de replicación a partir de cada una de las placas de dilución 10^{-5} y 10^{-6}, almacenándose una de las tres placas de cada dilución a unos 12°C, otra a unos 25°C y la tercera placa de cada dilución a unos 38°C. Se incuban estas placas durante 4 días a sus temperaturas respectivas. Las colonias haploides cdc19xlts8 sólo deberían crecer a 25°C, ya que su sensibilidad a temperaturas altas impide prácticamente un crecimiento a 38°C, y su sensibilidad a temperaturas bajas reducirá el ritmo de crecimiento de la levadura a unos 12°C.

El ritmo de crecimiento de la cepa cdc19, la cepa lts8 y la cepa cdc19 x lts8 producida según lo indicado anteriormente, se compara a unos 12°C, unos 25°C y unos 38°C. La levadura cdc19 puede crecer bien tanto a unos 12°C como a unos 25°C, sin que pueda prácticamente crecer a unos 38°C. La levadura lts8 puede crecer a las tres temperaturas, aunque se espera que esto se deba a que la cepa lts8 prácticamente no cesa su actividad hasta que la temperatura cae por debajo de unos 10°C. No obstante, el crecimiento de la levadura 1ts89 a unos 12°C es menos vigoroso que el de la cepa cdc19. La levadura cdc 19 x lts8 crece mínimamente a unos 12°C, bastante bien a unos 25°C y prácticamente no puede crecer a unos 38°C.

Aunque se ha descrito la presente invención en relación con las realizaciones preferentes, la invención no se limita a las realizaciones descritas en la presente salvo en la medida en que dichas limitaciones se encuentren en las reivindicaciones que se acompañan.

Claims (12)

1. Producto de masa refrigerable fermentado con levadura, que comprende harina, agua, levadura prácticamente incapaz de fermentar ningún hidrato de carbono natural de la harina, y un hidrato de carbono fermentable por dicha levadura.

2. El producto de masa de la reivindicación 1, en donde se elige la cantidad de hidrato de carbono fermentable por la levadura para aportar un máximo de 200 ml. de CO_{2} por 100 g. de masa cuando la levadura ha metabolizado la práctica totalidad del hidrato de carbono.

3. El producto de masa de la reivindicación 1 o 2, que además comprende un recipiente con una cavidad cerrada, disponiéndose la masa en dicha cavidad.

4. Levadura para fermentar una masa refrigerable que incluye una harina de trigo, que comprende una levadura dotada de las siguientes características:

a) prácticamente incapaz de fermentar ningún hidrato de carbono natural de la harina;

b) capaz de fermentar galactosa sin complemento de adenina.

5. La levadura de la reivindicación 4, en donde la levadura es una levadura diploide.

6. La levadura de la reivindicación 4 o 5, que además ofrece la siguiente característica:

c) deviene prácticamente inactiva a temperaturas que oscilan entre 0°C y 12°C.

7. La levadura de la reivindicación 6, en donde la levadura deviene prácticamente inactiva a temperaturas que oscilan entre 4°C y 7,2°C.

8. Composición de masa refrigerable que comprende harina de trigo, agua y una levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 4a7.

9. Método de producción de un producto de masa refrigerable, que comprende los siguientes pasos:

a) mezclar harina, agua, levadura prácticamente incapaz de fermentar ningún hidrato de carbono natural de la harina, y un hidrato de carbono fermentable por dicha levadura;

b) colocar dicha masa en un recipiente y fermentar la masa en el recipiente; y

c) almacenar dicha masa fermentada en dicho recipiente a temperaturas de refrigeración durante un mínimo de dos semanas.

10. El método de la reivindicación 9, en donde se elige la cantidad de levadura y azúcar fermentable por la levadura mezclada para formar la masa, para aportar un máximo de 200 ml. de CO_{2} por 100 g. de masa.

11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde se fermenta la masa calentando la masa en el recipiente hasta una temperatura elevada.

12. El método de la reivindicación 9, 10 u 11, en donde se fermenta la masa hasta que se desarrolla una presión interna que oscila entre 69 y 128 Kpa (10 y 20 psi) en el recipiente.