ES2183256T5 - Dispositivo para la deteccion de reacciones de amplificacion de acidos nucleicos. - Google Patents

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN INSTRUMENTO PARA CONTROLAR UNA REACCION DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, QUE INCLUYE UN PRODUCTOR DE CICLOS TERMICO QUE PRESENTA UN SOPORTE ADAPTADO PARA ACOGER UNO O MAS VOLUMENES DE REACCION DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS; Y UN SISTEMA OPTICO ADAPTADO PARA SER ACOPLADO DE FORMA OPTICA A UNO O MAS VOLUMENES DE REACCION DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS ACOGIDOS POR EL SOPORTE.

Description

Dispositivo para la detección de reacciones de amplificación de ácidos nucléicos.
La presente invención se refiere a un instrumento para monitorizar reacciones de amplificación de ácidos nucleicos y, en particular, a un instrumento para llevar a cabo métodos de detección de un ácido nucleico diana en una muestra y para monitorizar el incremento de un ADN de doble hebra durante la amplificación de un ácido nucleico diana en una muestra.
Los nuevos métodos para la amplificación y detección simultáneas de ácido nucleico incrementan la velocidad y la precisión de los métodos de detección previos y eliminan la necesidad de procesar la muestra después de la amplificación. En una realización preferida, el método proporciona una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa y utiliza agentes cuya fluorescencia es incrementada después de unirse a ADN de doble hebra. Los métodos proporcionados en la presente tienen numerosas aplicaciones, particularmente en los campos de biología molecular, diagnóstico médico y ciencias forenses.
Los métodos de detección de ácidos nucleicos descritos ofrecen las ventajas de velocidad y simplicidad sobre los métodos previos para detectar ácidos nucleicos amplificados. Las técnicas de detección de ácidos nucleicos en general son particularmente útiles en los ensayos de diagnóstico médico. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.358.535 describe un método para detectar patógenos depositando una muestra (por ejemplo, sangre, células, saliva, etc.) sobre un filtro, lisando las células y fijando el ADN mediante desnaturalización química y calentamiento. Posteriormente, se añaden sondas de ADN marcadas y se deja que hibriden con el ADN de la muestra fijado. Una hibridación indica la presencia de ADN del patógeno.
La detección de ácidos nucleicos utilizando sondas oligonucleotídicas se ha convertido en un método estándar para la detección de dianas específicas. Se han descrito numerosas modificaciones del método, incluyendo el cultivo de las células u organismos diana in situ sobre el filtro, incrementando la cantidad de ácido nucleico diana disponible para la detección. Generalmente, estos métodos requieren que la muestra de ADN esté unida no covalentemente a un soporte sólido tal como nitrocelulosa o nailon y posteriormente que hibride con una sonda marcada especifica de la diana.
La sensibilidad y la especificidad de los métodos de detección de ácidos nucleicos fue mejorada enormemente por la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es un proceso para amplificar ácidos nucleicos e implica la utilización de dos cebadores oligonucleotídicos, un agente para la polimerización, un molde de ácido nucleico diana y ciclos sucesivos de desnaturalización del ácido nucleico e hibridación y extensión de los cebadores para producir un número grande de copias de un segmento de un ácido nucleico particular. Con este método, segmentos de ADN genómico de una sola copia pueden ser amplificados más de 10 millones de veces con una especificidad y una fidelidad muy elevadas. Los métodos de PCR están descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.683.202.
Métodos para detectar productos de PCR están descritos particularmente en la Patente de EE.UU. Nº 4.683.195. Esos métodos requieren una sonda oligonucleotídica capaz de hibridar con el ácido nucleico diana amplificado. EP Nº 237.362 describe también un método de detección basado en PCR denominado "transferencia de manchas inversa", en el cual la sonda, en lugar del ADN amplificado, está fijada a la membrana. De acuerdo con el método, la diana, en lugar de la sonda, es marcada para hibridación. Estos métodos requieren etapas separadas de amplificación, captura y detección y requieren generalmente varias horas para ser completados. En el método de transferencia de manchas inversa, se prefieren reactivos específicos de la diana que sean estables durante su almacenamiento.
Métodos alternativos para detectar ácidos nucleicos amplificados describen la amplificación y el marcaje simultáneos de un ácido nucleico diana. Los métodos requieren que al menos un cebador de la amplificación esté marcado. El cebador de la amplificación puede estar marcado con, por ejemplo, un radioisótopo para la detección directa del producto amplificado o marcado con un reactivo adecuado para capturar el producto sobre un soporte sólido para su detección posterior.
Otros medios de detección incluyen la utilización de hibridación de polimorfismos de la longitud de fragmentos, de sondas oligonucleotídicas alelo específicas (ASO) (Saiki y col., 1986, Nature 324:163), o la secuenciación directa mediante el método didesoxi utilizando ADN amplificado en lugar de ADN clonado. El método de polimorfismo de la longitud de fragmentos detecta inserciones y deleciones entre cebadores de PCR, teniendo como resultado productos de PCR de longitudes diferentes, detectables mediante clasificación por tamaños. Los métodos ASO son útiles para detectar variaciones de secuencias alélicas. En un ejemplo de hibridación con ASO, el ADN amplificado es fijado a un filtro de nailon mediante, por ejemplo, irradiación UV en una serie de "transferencias de manchas", y se deja posteriormente hibridar con una sonda oligonucleotídica bajo condiciones rigurosas. La sonda puede estar marcada con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP) y es detectada por la presencia de un precipitado azul después del tratamiento con reactivos de oxidación adecuados.
Se conoce además un método de ensayo alternativo para detectar ácidos nucleicos amplificados. El proceso emplea la actividad nucleasa 5' a 3' de una polimerasa de ácido nucleico para cortar oligonucleótidos hibridados marcados de dúplex hibridados y liberar fragmentos oligonucleotídicos marcados para su detección. El método es adecuado para detectar productos de PCR y requiere un par de cebadores y una sonda oligonucleotídica marcada que tenga un extremo 3'-OH bloqueado para impedir la extensión por la polimerasa.
Debido a la enorme amplificación posible con el proceso de PCR, pequeños niveles de contaminación de ADN procedentes de muestras con niveles elevados de ADN, moldes control positivo, o de amplificaciones previas, pueden tener como resultado un producto de PCR incluso en ausencia de ADN molde añadido expresamente. Higuchi y Kwok, 1989, Nature 339:237-238 y Kwok y Orrego, en Innis y col., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, describen métodos y precauciones particulares para practicar la PCR con un mínimo de contaminación cruzada. Como la posibilidad de introducir ADN contaminante en una muestra incrementará a medida que aumenta el número de etapas de manipulación requeridas para la preparación, procesamiento y análisis de la muestra, seria preferible minimizar la manipulación de la muestra, particularmente una vez que se ha completado la reacción de amplificación.
Se han descrito varios agentes para marcar ácidos nucleicos, sondas o dianas, con el fin de facilitar la detección del ácido nucleico diana. Las marcas adecuadas pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo o actividad enzimática e incluyen, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente ^{32}P y ^{125}I) reactivos electrón-densos, enzimas y ligandos que tengan parejas de unión especifica.
El marcaje se consigue mediante varios medios, tal como la modificación química de un cebador o de una sonda para incorporar una marca o la utilización de agentes polimerizantes para incorporar un nucleósido trifosfato modificado en un producto de extensión. Los agentes intercalantes se unen no covalentemente a las bases superpuestas de los ácidos nucleicos, y como resultado la fluorescencia del agente aumenta o se desplaza hacia una longitud de onda diferente. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.582.789 describe varios restos intercalantes que incluyen psoralén.
Los colorantes fluorescentes son adecuados para detectar ácidos nucleicos. Por ejemplo, el bromuro de etidio es un agente intercalante que presenta una fluorescencia incrementada cuando se une a ADN de doble hebra, más que cuando está libre en solución (Sharp y col., 1973, Biochemistry 12:3055). El bromuro de etidio puede ser utilizado para detectar ácidos nucleicos de hebra sencilla y de doble hebra, aunque la afinidad del bromuro de etidio por ácido nucleico de hebra sencilla es relativamente baja. El bromuro de etidio se utiliza rutinariamente para detectar ácidos nucleicos después de una electroforesis en gel. Después del fraccionamiento por tamaños en una matriz de gel apropiada, por ejemplo agarosa o acrilamida, el gel es embebido en una solución diluida de bromuro de etidio. El ADN es visualizado posteriormente examinando el gel bajo luz UV (Maniatis y col., 1982 eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory).
Se han descrito métodos alternativos basados en fluorescencia para detectar ADN. Por ejemplo, Morrison y col., 1989, Anal. Biochem. 183:231-244, describen un método con dos sondas para detectar ADN diana. Una sonda está marcada con fluoresceína, la otra sonda, complementaria a la primera, está marcada con un amortiguador de la emisión de fluoresceína. Se deja que las sondas hibriden con ADN desnaturalizado que contiene la secuencia diana, y se determina el nivel de fluorescencia. La fluorescencia aumenta hasta el punto de que la sonda con fluoresceína se une al ADN complementario no marcado, en lugar de a la sonda complementaria de amortiguación.
Mabuchi y col., 1990, Nucl. Acids Res. 18(24):7461-7462, describen un método para detectar fragmentos de ADN basado en el contenido de AT del segmento de ácido nucleico. Se utilizan dos fluorocromos para teñir ADN fraccionado por tamaños en un gel de agarosa. Se utilizan las propiedades de unión selectiva de los diferentes fluorocromos para las regiones ricas en AT con el fin de distinguir los fragmentos de ADN sometidos a electroforesis.
La Patente de EE.UU. Nº 4.257.774 describe la unión directa de intercalantes fluorescentes al ADN, por ejemplo sales de etidio, daunomicina, mepacrina y naranja de acridina, así como 4'6-diamidino-a-fenilindol para cuantificar el ADN. Se utiliza polarización de fluorescencia para la caracterización de compuestos no fluorescentes que se unen al ADN que compiten con los colorantes que se unen al ADN.
Oser y Valet, 1990, Angew. Chem. Int. Engl. 29(10):1167, describen un esquema de detección de ácidos nucleicos que requiere dos sondas oligonucleotídicas complementarias a sitios adyacentes en una diana. Las sondas están marcadas diferencialmente con un salicilato o con un ligando DTPA que lleva un emisor de fluorescencia, Tb^{III}. La hibridación de ambas sondas a la diana proporciona una proximidad estérica de las dos marcas, teniendo como resultado un incremento medible de la fluorescencia de Tb^{III}. Las sondas modificadas son preparadas específicamente para cada diana que va a ser detectada.
EP Nº 070.685 describe la utilización de sondas polinucleotídicas marcadas con fluorescencia en ensayos de hibridación de polinucleótidos. De acuerdo con el método, las sondas son preparadas uniendo restos de un absorbente-emisor particular a los extremos 3' y 5' de fragmentos de ácido nucleico. Los fragmentos son capaces de hibridar en posiciones adyacentes sobre un ADN diana, de tal manera que, si se hibridan ambos fragmentos, la proximidad de los restos absorbente y emisor tiene como resultado una fluorescencia del emisor detectable.
De acuerdo con estos métodos, el colorante fluorescente es introducido en el ADN diana después de que se hayan completado todas las reacciones de polimerización del ácido nucleico in vitro. Los efectos inhibidores de los agentes intercalantes sobre las polimerasas de ácidos nucleicos han sido descritos en numerosas publicaciones (por ejemplo, Kornberg, 1974, DNA Synthesis, W.H. Freman y Co., San Francisco; Richardson, 1973, J. Mol. Biol. 78:703-714).
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Los colorantes que se unen al ADN son útiles como antibióticos debido a los efectos inhibidores sobre los procesos de replicación del ácido nucleico que resultan de la unión del agente al molde. EP Nº 169.787 describe la utilización de agentes intercalantes para bloquear la replicación del virus de la influenza o del virus herpes. Kornberg (supra) describe varios agentes que se unen al ADN, intercalantes o no intercalantes, y describe cómo cada compuesto inhibe la replicación del ácido nucleico. En la página 227, Kornberg describe específicamente que el bromuro de etidio inhibe la replicación del ADN.
Un aparato para la amplificación y detección simultáneas de ácidos nucleicos diana proporcionaría ventajas sobre los métodos anteriores de detección. Tal aparato minimizaría los problemas de contaminación de la muestra inherentes a cualquier proceso que implique una serie de etapas de manipulación para discernir un resultado positivo o negativo de un ensayo. Eliminando las etapas de manipulación y procesamiento de la muestra, un aparato para la amplificación y detección simultáneas de ácidos nucleicos diana incrementaría la velocidad y la precisión de los métodos actuales de diagnóstico. La presente invención aborda y resuelve estas necesidades.
La presente invención proporciona un aparato para monitorizar una reacción de amplificación de un ácido nucleico a lo largo de múltiples ciclos térmicos, que comprende:
(a) un ciclador térmico capaz de calentar y enfriar alternativamente, en un recipiente de reacción, una mezcla de una reacción de amplificación que contiene un ácido nucleico diana, reactivos para la amplificación del ácido nucleico y un agente detectable que se une al ácido nucleico; y
(b) un sistema opcional que incluye un detector operable para detectar una señal óptica relacionada con la cantidad de ácido nucleico amplificado en la mezcla de reacción a lo largo de un periodo de múltiples ciclos, sin abrir el recipiente de reacción una vez que se ha iniciado la reacción de amplificación.
El instrumento de acuerdo con la invención es adecuado para la realización de un método para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, método que comprende las etapas de: (a) provisión de una mezcla para una reacción de amplificación que contiene una muestra, un agente que se une a ADN, donde dicho agente se caracteriza porque proporciona una señal detectable cuando está unido a un ácido nucleico de doble hebra, señal que es distinguible de la señal proporcionada por dicho agente cuando no está unido, y reactivos para la amplificación; (b) determinación de la cantidad de señal producida por la mezcla de la etapa (a); (c) tratamiento de dicha mezcla bajo condiciones para amplificar el ácido nucleico diana; (d) determinación de la cantidad de dicha señal producida por la mezcla de la etapa (c); y (e) determinación de si ha tenido lugar la amplificación.
La invención es particularmente adecuada para la práctica de métodos de amplificación por PCR en los que un incremento neto de ADN de doble hebra tiene como resultado un cambio de la potencia de la señal o del tipo de señal. En una realización preferida, el agente que se une a ADN es un colorante fluorescente que se une a ADN, tal como bromuro de etidio, y la señal es fluorescencia.
La Figura 1 demuestra la fluorescencia incrementada de la mezcla de PCR debido a la amplificación de un ADN diana especifico en presencia de bromuro de etidio. El experimento está descrito con detalle en el Ejemplo II.
La Figura 2 demuestra la especificidad de diana del presente método de detección e ilustra algunos de los aspectos cuantitativos de la invención. Los detalles del experimento se proporcionan en el Ejemplo IV.
La Figura 3 demuestra la utilización de la presente invención para cribado genético. El experimento está descrito con detalle en el Ejemplo V.
Las Figuras 4A y 4B se refieren al ensayo homogéneo cuantitativo descrito en el Ejemplo VII. La Figura 4A demuestra que el incremento de la fluorescencia en las muestras positivas es mayor de dos desviaciones estándar de la media de las muestras negativas. La Figura 4B describe gráficamente un método de sustracción del fondo para medir fluorescencia.
Las Figuras 5A y 5B demuestran los resultados de un sistema de amplificación y detección homogéneo, automatizado, en linea, de acuerdo con la presente invención según se demuestra en el Ejemplo VIII. La Figura 5A muestra un registro impreso de fluorescencia procedente de una PCR que no contiene ADN diana y sirve como control negativo. La Figura 5B es un registro impreso de fluorescencia procedente de una PCR que contiene la diana apropiada y muestra la monitorización continua de la PCR y el incremento concurrente del producto de la PCR.
La presente invención proporciona métodos mejorados para detectar ácidos nucleicos y es especialmente adecuada para ser utilizada junto con procesos de amplificación. Los métodos mejorados no requieren ni una sonda oligonucleotídica ni un cebador para la amplificación marcado. Los métodos permiten la monitorización de la acumulación de producto mientras transcurre la reacción de amplificación. La invención permite también la cuantificación específica de la diana. Estos métodos son adecuados para ser utilizados en formatos automatizados.
Los métodos descritos ofrecen grandes mejoras sobre los métodos anteriores para detectar ácidos nucleicos amplificados. De acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos amplificados son detectados sin abrir el recipiente de reacción una vez que se ha iniciado la reacción de amplificación, y sin ninguna etapa adicional de tratamiento o manipulación después de la reacción. Antes de la presente invención, los métodos de detección de ácidos nucleicos requerían un tercer reactivo oligonucleotídico como sonda, o una serie de etapas de manipulación y de larga duración para la detección de la diana, por ejemplo, la captura del producto sobre un soporte sólido, etapas que se realizan después de la amplificación. En algunos procedimientos se requieren etapas de captura y de hibridación de las sondas. La presente invención elimina la necesidad de utilizar un reactivo sonda hibridante o un procedimiento de captura para detectar la diana amplificada. En un escenario clínico, los métodos de la invención ofrecen velocidad, simplicidad y una oportunidad disminuida de contaminación cruzada entre las muestras, particularmente entre muestras amplificadas y no amplificadas. Además, los presentes métodos ofrecen medios para la detección, monitorización y cuantificación automatizadas de los productos de amplificación durante el proceso de amplificación y una vez que se ha completado la reacción de amplificación.
Los presentes métodos requieren un agente detectable capaz de unirse a ADN de doble hebra. El agente de unión detectable puede ser un colorante fluorescente u otro cromóforo, un enzima o un agente capaz de producir una señal, directa o indirectamente, cuando está unido a ADN de doble hebra. El agente puede caracterizarse también por unirse a ADN de hebra sencilla o a ARN. Solamente es necesario que el agente sea capaz de producir una señal detectable cuando está unido a un ácido nucleico de doble hebra que sea distinguible de la señal producida cuando el mismo agente está en solución o unido a un ácido nucleico de hebra sencilla.
En una realización, el agente que se une a ADN es un agente intercalante. Según se utiliza en la presente, un agente intercalante es un agente o resto capaz de insertarse no covalentemente entre pares de bases superpuestos en la doble hélice del ácido nucleico. Los agentes intercalantes, tales como el bromuro de etidio, fluorescen más intensamente cuando están intercalados en ADN de doble hebra que cuando están unidos a ADN de hebra sencilla, a ARN, o están en solución. Otros agentes intercalantes presentan un cambio en el espectro de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hebra. Por ejemplo, la actinomicina D fluoresce roja cuando se une a ácidos nucleicos de hebra sencilla y verde cuando se une a un molde de doble hebra. Si la señal detectable aumenta, disminuye o es desplazada, como es el caso con actinomicina D, cualquier agente intercalante que proporcione una señal detectable que sea distinguible cuando el agente está unido a ADN de doble hebra o no está unido, es adecuado para practicar la invención descrita. Por ejemplo, se ha descrito la interacción entre ADN y otro psoralén fotorreactivo, 4-aminometil-4-5'-8-trimetilpsoralén (AMT) (Johnson y col., 1981, Photochem. & Photobiol. 33:785-791). De acuerdo con la referencia, la absorción a longitudes de onda largas y la fluorescencia, disminuyen ambas después de la intercalación de AMT en la hélice de ADN.
Son también adecuados agentes que se unen al ADN no intercalantes. Por ejemplo, Hoechst 33258 (Searle y Embrey, 1990, Nuc. Acids Res. 18(13):3753-3762) presenta una fluorescencia alterada con una cantidad creciente de la diana. Hoechst 33258 es un miembro de una clase de compuestos que se unen al ADN referidos comúnmente como "agentes que se unen a las hendiduras". Este grupo incluye fármacos como la distamicina, netropsina y otros. Estos compuestos reconocen y se unen a la hendidura menor del ADN dúplex.
De acuerdo con la presente invención, un agente que se une al ADN produce una señal detectable directamente o indirectamente. La señal es detectable directamente, tal como por fluorescencia o absorbancia, o indirectamente a través de un resto de una marca sustituida o de un ligando de unión unido al agente que se une al ADN. Para la detección indirecta es adecuado cualquier resto o ligando que sea afectado de manera detectable por la proximidad a ADN de doble hebra.
De acuerdo con la invención, el agente de unión detectable está presente en la reacción de amplificación durante el proceso de amplificación. Cuando transcurre la amplificación, el agente produce una señal detectable. Ni el agente ni la señal impiden que tenga lugar la amplificación. En consecuencia, el agente puede ser añadido a la mezcla de reacción antes de la amplificación o mientras transcurre la reacción. Por ejemplo, el agente es incluido en un tampón de amplificación que contiene reactivos apropiados tales como sales y agentes tamponantes. De esta manera, no es necesario añadir separadamente el agente de unión a la reacción de amplificación. Para la práctica de la presente invención es adecuado cualquier agente de unión a ADN, siempre que en presencia de ese agente un incremento neto de la cantidad de ADN de doble hebra presente se refleje en un cambio de la intensidad de la señal que sea detectable directamente o indirectamente. En una realización preferida, la señal detectable es fluorescencia.
El término "ensayo de detección homogéneo" es utilizado en la presente especificación para describir la invención reivindicada. Para facilitar su comprensión, se proporciona la definición siguiente. Un ensayo de detección homogéneo se refiere a un método de amplificación y detección acopladas, en el que el proceso de amplificación genera una señal detectable y se minimiza o elimina la necesidad de tratamiento y manipulación posterior de la muestra para detectar el producto amplificado.
El presente ensayo homogéneo es adecuado para ser utilizado junto con sondas oligonucleotídicas. Por ejemplo, en una realización la utilización de una sonda oligonucleotídica, específica para detectar una secuencia diana particular, está incluida en la reacción de amplificación además del agente de unión al ADN de la presente invención. La sonda, marcada con un amortiguador y un fluoróforo, hibrida con el ácido nucleico diana amplificado. En presencia de un agente para la polimerización capaz de actividad nucleolítica 5' a 3', el fluoróforo y el amortiguador, cuando están unidos a la diana, son separados por la degradación de la sonda con la polimerasa. La fluorescencia de la sonda no unida es detectablemente distinta de la fluorescencia de la sonda unida e hidrolizada posteriormente. De este modo, la fluorescencia del agente de unión a ADN hace posible detectar que ha tenido lugar la amplificación, y la fluorescencia de la sonda hibridada indica la amplificación específica de la diana. Siempre que la amplificación sea detectable sin abrir el recipiente de reacción, o sin etapas posteriores de procesamiento una vez que se ha iniciado la amplificación, el método está dentro de la presente definición de un ensayo homogéneo.
El término "sistema de reacción de amplificación" se refiere a cualquier medio in vitro para multiplicar las copias de una secuencia de ácido nucleico diana. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, PCR, reacción en cadena de la ligasa de ADN (LCR), Q ARN replicasa y sistemas de amplificación basados en la transcripción de ARN (TAS y 3SR).
El término "amplificación", que se refiere típicamente a un incremento exponencial del ácido nucleico diana, está siendo utilizado en la presente para describir incrementos lineales y exponenciales del número de una secuencia de ácido nucleico diana seleccionada.
El término "mezcla de reacción de amplificación" se refiere a una solución acuosa que contiene los diferentes reactivos utilizados para amplificar un ácido nucleico diana. Estos incluyen enzimas, tampones acuosos, sales, cebadores de la amplificación, ácido nucleico diana y nucleósidos trifosfato. Dependiendo del contexto, la mezcla puede ser una mezcla de reacción de amplificación completa o incompleta.
Los sistemas descritos posteriormente son practicados de manera rutinaria por los expertos en la técnica relevante. Han sido descritos con detalle por otras personas y están resumidos a continuación. Esta invención no está limitada a ningún sistema de amplificación particular. A medida que se desarrollen otros sistemas, esos sistemas pueden beneficiarse de la práctica de esta invención. Un estudio reciente de sistemas de amplificación fue publicado en Bio/Technology 8:290-293, Abril de 1990. Los cuatro sistemas siguientes se describen a continuación con el fin de proporcionar una comprensión de la amplitud de la presente invención.
La amplificación de ADN por PCR está descrita en las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.683.195 y 4.683.202. Métodos para amplificar y detectar ácidos nucleicos por PCR utilizando un enzima termoestable están descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.965.188.
La amplificación de ADN por PCR implica ciclos repetidos de desnaturalización del ADN por calor, hibridación de dos cebadores oligonucleotídicos a secuencias que flanquean el segmento de ADN que va a ser amplificado, y extensión de los cebadores hibridados con ADN polimerasa. Los cebadores se hibridan a hebras opuestas de la secuencia diana y están orientados de tal manera que la síntesis de ADN por la polimerasa transcurre a través de la región entre los cebadores, duplicando eficazmente la cantidad del segmento de ADN. Además, como los productos de extensión son también complementarios y capaces de unirse a los cebadores, cada ciclo sucesivo duplica esencialmente la cantidad de ADN sintetizada en el ciclo previo. Esto tiene como resultado la acumulación exponencial del fragmento diana específico, en una proporción de 2^{n} aproximadamente por ciclo, donde n es el número de ciclos.
En la realización descrita, se prefiere la ADN polimerasa Taq aunque no es éste un aspecto esencial de la invención. La polimerasa Taq, una polimerasa termoestable, es activa a temperaturas elevadas. Métodos para la preparación de Taq están descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.889.818. Sin embargo, pueden utilizarse también en PCR otras ADN polimerasas termoestables aisladas de otras especies de Thermus o de especies que no son de Thermus (por ejemplo, Thermus thermphilus o Thermotoga maritima,) así como ADN polimerasas no termoestables tales como la ADN polimerasa de T4, ADN polimerasa de T7, ADN polimerasa I de E. coli o el fragmento Klenow de E. coli.
Según se utiliza en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando está hibridado a un molde de ácido nucleico bajo condiciones en las que se inicia la síntesis de un producto de extensión del cebador, esto es, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfato diferentes y una ADN polimerasa en un tampón apropiado ("tampón" incluye pH, fuerza iónica, cofactores, etc.) y a una temperatura adecuada.
Los nucleósidos-5'-trifosfato utilizados en el proceso de extensión, típicamente dATP, dCTP, dGTP y dTTP, están presentes en una concentración total que oscila típicamente desde 400 \muM a 4,0 mM durante la reacción de extensión, aunque preferiblemente la concentración está entre 500 \muM y 1,5 mM.
La elección de los cebadores para ser utilizados en PCR determina la especificidad de la reacción de amplificación. Los cebadores utilizados en la presente invención son oligonucleótidos, normalmente desoxirribonucleótidos de varios nucleótidos de longitud, que pueden ser extendidos de una manera especifica del molde por la reacción en cadena de la polimerasa. El cebador es suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente de polimerización y contiene típicamente 10-30 nucleótidos, aunque ese número exacto no es critico para la aplicación del método con éxito. Las moléculas de cebadores cortas requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos hibridos con el molde suficientemente estables.
Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos utilizando el método del triéster de Matteucci y col., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191. Alternativamente, puede preferirse la síntesis automatizada en, por ejemplo, un sintetizador de ADN Biosearch 8700 que utiliza la química de las cianoetil fosforamiditas.
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Para que tenga lugar la extensión del cebador, este cebador debe hibridarse al molde de ácido nucleico. No todos los nucleótidos del cebador deben de hibridarse al molde para que tenga lugar la extensión. La secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleótidos no complementarios puede unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria al molde. Alternativamente, bases no complementarias pueden ser intercaladas en el cebador, con la condición de que la secuencia de cebador tenga complementariedad suficiente con el molde para que tenga lugar la hibridación y permita la síntesis de una hebra de ADN complementaria.
Los sistemas de amplificación tales como la PCR requieren un ácido nucleico diana en un tampón compatible con los enzimas utilizados para amplificar la diana. El ácido nucleico diana puede ser aislado de una variedad de materiales biológicos, incluyendo tejidos, fluidos corporales, heces, esputo, saliva, células vegetales, cultivos bacterianos y similares.
En general, el ácido nucleico de la muestra será una secuencia de ADN, muy comúnmente ADN genómico. Sin embargo, la presente invención puede ser también practicada con otros ácidos nucleicos tales como ARN mensajero, ARN ribosómico, ARN vírico o ADN clonado. Las muestras adecuadas de ácido nucleico incluyen ADN o ARN de hebra sencilla o de doble hebra para utilización en la presente invención. Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán que cualquiera que sea la naturaleza del ácido nucleico, el ácido nucleico puede ser amplificado sencillamente realizando modificaciones apropiadas y bien reconocidas del método que esté siendo utilizado.
Para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, la secuencia debe ser accesible a los componentes del sistema de amplificación. En general, esta accesibilidad es asegurada aislando los ácidos nucleicos de una muestra biológica bruta. Se conocen en el oficio una variedad de técnicas para extraer ácidos nucleicos de muestras biológicas, por ejemplo, las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Arrand, Preparation of Nucleic Acid Probes, en pp. 18-30, Nucleic Acid Hybridation: A Practical Approach, Ed. Hames and Higgins, IRL Press, 1985; o en PCR Protocols, Capítulos 18-20, Innis y col. ed., Academic Press, 1990.
El proceso de PCR se lleva a cabo muy habitualmente como un proceso automatizado con un enzima termoestable. En este proceso, la mezcla de reacción es sometida a ciclos a través de un rango de temperaturas desnaturalizantes, un rango de temperaturas para la hibridación de los cebadores y un rango de temperaturas para la extensión. Una máquina adaptada específicamente para ser utilizada con un enzima termoestable está descrita de forma más completa en EP Nº 236.069, y está disponible comercialmente.
La LCR está descrita en la Publicación de Patente PCT Nº WO 89/09835. El proceso implica la utilización de ligasa para unir segmentos oligonucleotídicos que se hibridan al ácido nucleico diana. La LCR tiene como resultado la amplificación de una molécula diana original y puede proporcionar millones de copias del ADN producto. Por consiguiente, la LCR tiene como resultado un incremento neto del ADN de doble hebra. Los presentes métodos de detección son aplicables a LCR, así como a PCR. La LCR requiere una sonda oligonucleotídica para detectar el ADN producto. Cuando se utiliza junto con los métodos descritos para detectar los productos de amplificación, la etapa de la sonda es innecesaria, y el resultado de la LCR es detectable inmediatamente.
Otro esquema de amplificación aprovecha la utilización de la replicasa del bacteriófago Q\beta de ARN. En este esquema de amplificación, un genoma del bacteriófago recombinante modificado con una secuencia especifica para la secuencia diana, es hibridado inicialmente con el ácido nucleico a analizar. Después del enriquecimiento de los dúplex formados entre la sonda del bacteriófago y el ácido nucleico de una muestra, se añade replicasa de Q\beta, la cual, después de reconocer el genoma recombinante retenido, comienza a producir un gran número de copias.
El sistema Q\beta no requiere secuencias cebadoras y no hay etapa de desnaturalización por calor como con los sistemas de amplificación PCR y LCR. La reacción tiene lugar a una temperatura, típicamente 37ºC. El molde preferido es un sustrato de la replicasa de Q\beta, ARN de la variante media 1. Se consigue un incremento muy grande de los moldes mediante la utilización de este sistema. Una revisión de este sistema de amplificación puede encontrarse en la Solicitud de Patente Internacional Nº de Publicación WO 87/06270 y en Lizardi y col., 1988, Bio/Technology 6:1197-1202.
El sistema 3SR es una variación de un sistema de amplificación basado en la transcripción in vitro. Un sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS) implica la utilización de cebadores que codifican un promotor para producir copias de ADN de una hebra diana y la producción de copias de ARN a partir de las copias de ADN con una ARN polimerasa. Ver, por ejemplo, el Ejemplo 9B de la Patente de EE.UU. Nº 4.683.202 y EP Nº 310.229. El sistema 3SR es un sistema que utiliza tres enzimas para llevar a cabo una replicación isotérmica de los ácidos nucleicos diana.
El sistema comienza con una diana de ARN de hebra sencilla a la que se une un cebador de ADN ARN de T7. Por extensión del cebador con transcriptasa inversa se forma un ADNc, y el tratamiento con ARNasa H libera el ADNc del heterodúplex. Se une un segundo cebador al ADNc y se forma un ADNc de doble hebra mediante tratamiento con ADN polimerasa (esto es, transcriptasa inversa). Uno o ambos cebadores codifica un promotor, esto es, el promotor para la ARN polimerasa de T7, de tal manera que el ADNc de doble hebra es un molde de transcripción para la ARN polimerasa de T7.
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Los ADNcs competentes para la transcripción producen copias de ARN antisentido de la diana original. Los transcritos son convertidos posteriormente por la transcriptasa inversa en ADNc de doble hebra que contiene promotores de doble hebra, opcionalmente en ambos extremos en una orientación de repetición invertida. Estos ADNs pueden producir ARNs que pueden volver a entrar en el ciclo. Una descripción más completa del sistema 3SR puede encontrarse en Guatelli y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 y EP Nº 329.822. El sistema TAS está también descrito por Gingeras y col., en Innis y col. eds., 1990, PCR Protocols, Academic Press, San Diego.
Las realizaciones de la invención ejemplificadas en la presente describen el proceso para detectar ácidos nucleicos amplificados junto con PCR. Por consiguiente, cuando se utiliza en un método basado en PCR, el agente de unión a ADN está caracterizado como un agente que no impedirá la hibridación de los cebadores, la extensión de los cebadores a lo largo de un molde complementario ni la separación de las hebras de un dúplex de ADN.
En el proceso descrito en la presente, se proporciona una muestra que contiene, o es sospechosa de contener, una secuencia oligonucleotídica particular de interés, el "ácido nucleico diana". La diana puede ser ARN o ADN o un hibrido ARN/ADN. La diana puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. La preparación de la diana se llevará a cabo de una manera apropiada para el proceso de amplificación particular que vaya a ser aplicado. Por ejemplo, en un método de PCR en el que el ácido nucleico diana es ARN de hebra sencilla, tal como ARNm, la diana puede ser transcrita primeramente de manera inversa a ADNc, antes de la amplificación.
Los métodos para transcribir ARN de manera inversa a ADNc son bien conocidos y están descritos en Maniatis y col., supra. Alternativamente, los métodos preferidos para la transcripción inversa utilizan ADN polimerasas termoactivas. La presente especificación describe que los agentes intercalantes no impiden la actividad ADN polimerasa. Por consiguiente, el presente método proporciona un ensayo de detección homogéneo de dianas de ARN así como de dianas de ADN.
En otra realización de la presente invención, se utilizan cebadores anidados (Mullis y col., 1986, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 51:263). Este método puede ser preferido cuando la cantidad de ácido nucleico en una muestra es extremadamente limitada, por ejemplo, cuando se utilizan muestras de archivo incluidas en parafina. Cuando se utilizan cebadores anidados, el ácido nucleico es amplificado primeramente con un conjunto de cebadores externo. Esta reacción de amplificación está seguida por una segunda ronda de ciclos de amplificación utilizando un conjunto de cebadores interno. Los Ejemplos VI y VII describen modificaciones de métodos con cebadores anidados que proporcionan resultados superiores sin necesitar la manipulación adicional de la muestra requerida por la utilización de cebadores anidados en rondas sucesivas de ciclos de amplificación.
De acuerdo con la presente invención, la producción de productos de amplificación puede ser monitorizada mientras transcurre la reacción. Puede utilizarse un aparato para detectar la señal generada por el agente de unión, con el fin de detectar, medir y cuantificar la señal antes, durante y después de la amplificación. Por supuesto, el tipo de señal particular puede dictar la elección del método de detección. Por ejemplo, en una realización preferida de la invención, se utilizan colorantes fluorescentes que se unen al ADN para marcar los productos de la PCR. Los colorantes se intercalan en, o se unen a, los productos de PCR de doble hebra y, por consiguiente, la fluorescencia resultante aumenta a medida que se eleva la cantidad de ADN de doble hebra. La cantidad de fluorescencia puede ser cuantificada mediante medición utilizando un espectrofluorímetro con o sin apertura del recipiente de la PCR. Los Ejemplos VII y VIII demuestran este aspecto de la invención.
En el Ejemplo VIII la fluorescencia de la muestra control positivo estaba muy por encima de las medidas del fondo. Como la producción de la señal fue medida sin tener que abrir el tubo de reacción, este método de detección es fácilmente adaptable a un formato automatizado en el que la señal es monitorizada a lo largo de todo el proceso de amplificación. El Ejemplo VIII muestra un método de detección de PCR en línea, automatizado: se utilizó un cable de fibra óptica para introducir luz de excitación directamente en un tubo de PCR en un bloque de calentamiento/enfriamiento. Se utilizó la misma fibra óptica para hacer volver de nuevo las emisiones fluorescentes al espectrofluorímetro, en el que se leyó el valor.
En los métodos preferidos para PCR, la reacción de amplificación se lleva a cabo como un proceso automatizado. Un termociclador actualmente disponible utiliza un bloque calefactor capaz de contener hasta 48 tubos de reacción. Por consiguiente, pueden llevarse a cabo 48 reacciones de amplificación simultáneamente. La presente invención permite la detección de los productos de PCR en las 48 muestras, sin manipular las muestras, abrir los tubos o interrumpir la reacción de los ciclos. Un sistema óptico adecuado lleva la luz de excitación desde la fuente al tubo de reacción y mide la luz de emisión de cada tubo. Por ejemplo, múltiples cables de fibra óptica leen simultáneamente todos los tubos de PCR que experimentan la termociclación. Sin embargo, se necesita solamente un único fluorímetro para leer la fluorescencia de los tubos de reacción, ya que cada fibra óptica puede ser leída rápidamente una a la vez, por ejemplo, durante el marco de tiempo del mantenimiento de una temperatura determinada de la PCR. Alternativamente, será obvio para una persona experta en la técnica que tal sistema de detección no está limitado necesariamente a una máquina termocicladora particular o a un número de recipientes de reacción. Sin embargo, la descripción del termociclador de 48 pocillos sirve para demostrar este aspecto de la presente invención.
Siempre que los pocillos, o tubos, de reacción estén cerrados herméticamente a la luz para impedir que fuentes de luz externas influyan sobre la detección de la fluorescencia, cualquier sobreplaca, tapón de tubo o tapa de aparato que contenga o pueda ser unido a una sonda de fibra óptica es adecuado. En la realización de la invención en el Ejemplo VIII, las tapas de los tubos de reacción fueron retiradas para acomodar la fibra óptica. Sin embargo, la utilización de un recipiente de reacción que tenga una tapa clara o translúcida elimina la necesidad de insertar el cable en el tubo. Será obvio que son deseables los tubos de reacción capaces de acomodar un cable de fibra óptica, sin que el cable entre en contacto físicamente con los componentes de la reacción de amplificación. En un espectrofluorímetro capaz de calentar y enfriar una superficie o un recipiente, no se requiere una fibra óptica. La fibra óptica es solamente necesaria cuando el termociclador y el espectrofluorímetro están instalados independientemente.
Un esquema de detección análogo es adecuado en un formato de microvaloración de 96 pocillos. Este tipo de formato es frecuentemente deseable en los laboratorios clínicos para un cribado de muestras a gran escala, por ejemplo, para un análisis genético tal como la selección por anemia de células falciformes o por el virus del SIDA en procedimientos de cribado de bancos de sangre. La presente invención es adecuada para este tipo de análisis y elimina la necesidad de los numerosos procedimientos de lavado y extracción que se requieren con procedimientos de ensayo "en pocillos" conocidos tales como los formatos de tipo ELISA u otros métodos basados en la densidad óptica (Kolber y col., 1988, J. of Immun. Meth. 108:255-264; Huschtscha y col., 1989, In Vitro Cell and Dev. Biol. 25(1):105-108; Voller y col., 1979, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VA.).
Los presentes métodos de detección permiten también la medida de fluorescencia directa utilizando un aparato similar a un lector de placas de ELISA, pero diseñado para excitar y medir fluorescencia. Por ejemplo, la máquina CytoFluor^{TM} 2300 fabricada por Millipore es adecuada en tal método. Es apropiada para "leer" la placa de microvaloración antes y después de los ciclos térmicos para determinar la fluorescencia de fondo. Alternativamente, un aparato que proporcione una determinación continua de fluorescencia es útil para monitorizar el incremento del producto de PCR durante la reacción de amplificación.
En otra realización de la invención, después de la amplificación, el tamaño del producto amplificado es determinado sin la utilización de una sonda o de métodos de fraccionamiento por tamaño tales como HPLC o electroforesis en gel. La invención es particularmente útil para determinar si ha tenido lugar la amplificación y distinguir simultáneamente el producto diana amplificado de, por ejemplo, ADN del cebador-dímero y ADN de alto peso molecular.
En una realización preferida de la invención, el agente de unión detectable es un colorante fluorescente intercalante. Los presentes ejemplos describen que en la mezcla de la reacción de amplificación se incluye bromuro de etidio. El bromuro de etidio, igual que otros colorantes que se unen al ADN, tales como acridinas, proflavina, naranja de acridina, acriflavina, fluorocoumarina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, homidio, mitramicina, polipiridilos de rutenio y antramicina, presenta emisiones de fluorescencia alteradas cuando está unido a ADN de doble hebra. En una reacción de amplificación, se genera una gran cantidad de ADN de doble hebra a partir de un molde inicial. Por consiguiente, cuando esto ocurre en presencia de un colorante fluorescente intercalante, tiene como resultado un incremento neto de la fluorescencia dependiente de ADN. La especificidad de la diana de la PCR y la utilización de controles positivos y negativos apropiados asegura que un incremento detectable de la fluorescencia es debido a la presencia del ácido nucleico diana amplificado.
La presente especificación incluye varios ejemplos que demuestran varios aspectos del ensayo de detección homogéneo. Las realizaciones particulares describen que el bromuro de etidio está presente en la PCR a una concentración de 0,53 a 1,27 \muM, aunque es también adecuada una concentración de 0,08 \muM (0,03 \mug/ml) a 40,6 \muM (16 \mug/ml); sin embargo, se prefiere una concentración de bromuro de etidio en la mezcla de PCR en el rango de 0,15 \muM (0,06 \mug/ml) a 20,3 \muM (8 \mug/ml). Será fácilmente obvio para aquellas personas con experiencia habitual en la técnica cómo determinar una concentración adecuada de agentes de unión a ADN alternativos mediante ajuste empírico. Una concentración adecuada de agente es cualquier cantidad que proporcione una señal que sea distinguible cuando haya tenido lugar un incremento neto de ADN de doble hebra en una reacción de amplificación. Por consiguiente, la concentración preferida de agente incluida en la mezcla de reacción de amplificación puede variar dependiendo de la cantidad de ADN de doble hebra no diana (esto es, ADN genómico de fondo), del número de copias y de la cantidad de la diana, de la cantidad y de la fluorescencia de los cebadores de la amplificación y del agente particular utilizado. Por ejemplo, puede ser apropiada una curva estándar que utilice una cantidad conocida de la diana y varíe la cantidad de agentes de unión. El colorante fluorescente es añadido a la mezcla de PCR antes de comenzar los ciclos de temperatura. Un colorante fluorescente adecuado no impide que tenga lugar la reacción de amplificación. Será obvio para una persona con experiencia habitual en la técnica el determinar la idoneidad de cualquier colorante nuevo en el método. El Ejemplo I demuestra que la amplificación por PCR tiene lugar en presencia de cantidades detectables de bromuro de etidio.
El espectro de emisión del bromuro de etidio tiene el pico a 650 nm para el bromuro de etidio no unido y a 611 nm cuando el agente está unido a ADN de doble hebra. Sin embargo, como los espectros de emisión del bromuro de etidio unido y no unido tienen picos distintos, emitiendo el etidio unido a una longitud de onda más baja, la discriminación entre el etidio unido y no unido es incrementada detectando la emisión a una longitud de onda distinta de la de los picos que sea inferior a la del pico para el etidio unido. En la realización descrita en el Ejemplo VII, la emisión de fluorescencia de la muestra fue detectada a 570 nm. En el Ejemplo VIII, la longitud de onda de excitación fue fijada a 500 nm y la detección de la emisión fue fijada a 570 nm.
No es esencial que la longitud de onda de detección o excitación sea optimizada para la práctica de la invención. Por ejemplo, en el Ejemplo II, una caja de luz UV con una longitud de onda de excitación a 300 nm y detección por fotografía a través de un filtro rojo, es adecuada. Un espectrofluorímetro, dependiendo de las características de la máquina particular utilizada, ofrece la oportunidad de fijar la longitud de onda de excitación y emisión, así como la amplitud de banda. Será obvio para una persona con experiencia habitual en la técnica cómo determinar las posiciones de las longitudes de onda y de la amplitud de banda para un agente de unión a ADN particular a detectar. Por tanto, aunque cada agente tenga un espectro de fluorescencia discreto, un amplio rango de longitudes de onda de detección es adecuado para practicar la invención, según se ejemplifica en la presente. Se encuentran una directrices generales en, por ejemplo, The Merck Index, eds. Budavari y col., 1989, Merck Co. Inc. Rahway, NJ, en el que se describen en cada entrada las longitudes de onda de emisión máximas para agentes fluorescentes particulares unidos y no unidos a ADN helicoidal. De manera similar, el Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, Catálogo, 1990, de Haugland, es una referencia adecuada para describir agentes de unión a ADN útiles en la presente invención.
En general, se prefiere, pero no es esencial, que la ADN polimerasa sea añadida a la mezcla de reacción de PCR después de que se hayan añadido el cebador y el molde. Alternativamente, por ejemplo, el enzima y el cebador son añadidos al final o el tampón de PCR o el molde más el tampón son añadidos al final. Es generalmente deseable que al menos un componente que sea esencial para la polimerización no esté presente hasta el momento en el que estén presentes ambos, el cebador y el molde, y el enzima pueda unirse a, y extender, el sustrato cebador/molde deseado.
Los métodos para reducir los efectos de la contaminación cruzada de las reacciones de amplificación requieren la introducción de bases no convencionales en el producto amplificado y la exposición de la contaminación a un tratamiento enzimático y/o fisicoquimico que haga eficazmente que el producto sea incapaz de servir como molde para amplificaciones posteriores. El ensayo de detección homogéneo descrito en la presente es adecuado junto con métodos de esterilización. Estos métodos incrementan la precisión y la fiabilidad de los resultados de la amplificación eliminando etapas, y minimizando de este modo la manipulación del producto, lo cual reduce la contaminación. El método de esterilización proporciona una garantía adicional de la eliminación de la contaminación con el molde.
Preferiblemente, el agente que se une a ADN es estable durante su almacenamiento y puede ser incluido como un componente en un tampón reactivo para PCR. Por tanto, la invención proporciona nuevos reactivos adecuados para comercialización en un formato de kit. Tal reactivo puede contener una solución del agente de unión a ADN en un kit para detectar ácidos nucleicos por PCR. Alternativamente, el reactivo podría contener un agente de unión a ADN así como otros componentes del tampón de PCR tales como Tris-HCl, KCl y MgCl_{2}, cada uno en una concentración apropiada para llevar a cabo la PCR. En una realización, un kit incluye un tampón que contiene bromuro de etidio a una concentración adecuada para proporcionar, en una reacción de amplificación, una concentración final de bromuro de etidio en el rango de 0,15 \muM a 20,3 \muM. El tampón puede contener adicionalmente cualquiera de, o todos, los reactivos siguientes: Tris-HCl, pH 8,0-8,3; KCl y MgCl_{2} cada uno en la concentración apropiada para la amplificación por PCR. Se prevé también que los kits para detectar ácidos nucleicos amplificados incluyan cualquiera de los siguientes: un agente para polimerización, dNTPs, cebadores apropiados y un molde control positivo.
La Patente de EE.UU. Nº 4.683.202 describe métodos para preparar y utilizar cebadores para PCR que tengan secuencias no complementarias añadidas al extremo 5'. Estas "colas" son útiles para crear sitios de restricción particulares o para otros fines, ya que durante la PCR la secuencia de la cola no complementaria se incorpora al producto de PCR de doble hebra. Secuencias de colas particulares proporcionan dianas de unión para colorantes específicos. Por ejemplo, Hoechst 33258 (Searle y Embrey, 1990, Nuc. Acids Res. 18:3753-3762) se une preferencialmente a pares de bases A-T. Un cebador de PCR sintetizado con una larga cola 5' rica en A-T, proporciona un producto de PCR relativamente rico en A-T en comparación con el ADN genómico. Utilizando Hoechst 33358 el producto de PCR rico en A-T tiene una fluorescencia incrementada con relación al ADN genómico y, por consiguiente, es útil para incrementar la potencia de la señal en presencia de ADN genómico.
De manera similar, DAPI forma un complejo fluorescente con ADN rico en A-T (Kapuseinski y Szer, 1979, Nuc. Acids Res. 6(112):3519). En contraste, la Actinomicina D forma un complejo fluorescente con ADN rico en G-C (Jain y Sobell, 1972, J. Mol. Biol. 68:21). Por tanto, la presente invención es adecuada para monitorizar la cantidad de dos ácidos nucleicos diana distintos en un recipiente de reacción, mediante la inclusión de dos fluorocromos en la mezcla de reacción durante la amplificación. Solamente es necesario que un fluorocromo tenga especificidad de secuencia y que esa secuencia esté incluida en la cola (esto es, en el extremo 5') de un cebador para uno de los dos ácidos nucleicos diana. El espectro de emisión de cada fluorocromo se determina separadamente durante y/o después de la amplificación con un espectrofluorímetro. Por tanto, la invención es particularmente útil para comparaciones cuantitativas de dos dianas de ácido nucleico diferentes en la misma muestra y como tal puede ser útil para determinar el grado de, por ejemplo, una infección o una enfermedad si una diana es una secuencia presente en todas las células y la otra está presente en un patógeno.
Agentes similares con propiedades de unión distintas permiten métodos de PCR múltiples para detectar varias dianas en una muestra sin abrir nunca el recipiente de reacción una vez que se ha iniciado la reacción de amplificación. Los colorantes fluorescentes que se unen al ADN pueden tener cada uno diferentes espectros de emisión y excitación. En un entorno clínico, colorantes de unión a ADN diferentes que tienen diferentes especificidades de secuencia de ADN son útiles para indicar la presencia de distintas dianas.
La presente invención es adecuada junto con métodos que utilizan un estándar interno para determinar la cantidad relativa de una diana o para cuantificar con precisión la cantidad de diana presente antes de la amplificación.
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En otra realización, la presente invención proporciona un medio para determinar la integridad de una muestra de ADN. Por ejemplo, los análisis forenses implican a menudo muestras que contienen una diana parcialmente degradada, tal como una muestra de archivo. La capacidad para monitorizar la generación de un producto de PCR, demostrada en el Ejemplo VIII, permite la comparación del perfil de amplificación de una muestra de ADN con respecto a un producto de PCR pequeño y a un producto de PCR grande, en reacciones separadas. Si no hay degradación, la monitorización del incremento de ADN de doble hebra muestra que ambas reacciones alcanzan una meseta en el mismo ciclo aproximadamente. Si hay degradación, el producto pequeño alcanzará la meseta antes que el fragmento grande debido a la presencia de más moléculas diana intactas.
Será obvio para aquellas personas con experiencia habitual en la técnica que el ensayo de detección homogéneo proporcionado en la presente es adecuado para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, cribado genético, identificación humana forense, detección de patógenos y cuantificación, monitorización medioambiental o marcaje y rastreo de materiales con ácido nucleico.
En una realización, la señal detectable es fluorescencia. La fluorescencia es adecuada para ser utilizada en métodos cualitativos así como cuantitativos. La detección cualitativa puede realizarse sencillamente y rápidamente mediante inspección visual de los tubos de reacción por exposición a luz UV. Este tipo de ensayo rápido, altamente sensible, es deseable como un método de selección rápido por la presencia de un patógeno o de una secuencia génica particular causante de, o asociada con, un estado de enfermedad. La presente invención proporciona medios para rebajar costes mediante una preselección más/menos por la presencia de cualquier miembro de un grupo de dianas. Las amplificaciones de muchas de tales dianas diferentes permitiría esto si puede esperarse que la mayoría de las muestras sean negativas, por ejemplo, la monitorización medioambiental para sistemas de detección de patógenos. La PCR múltiple es un proceso para incluir varios pares de cebadores distintos en una reacción de amplificación (Gibbs y col., 1989, en PCR Technology, ed. Erlich, Stockton Press, NY). Un ensayo de detección homogéneo que utiliza múltiples pares de cebadores para analizar un amplio rango de dianas potenciales, es seguido posteriormente por procedimientos de tipificación más complejos solamente en las muestras positivas. Esta preselección ahorra el coste de la realización del procedimiento de tipificación más complejo en las muestras negativas y/o de la realización de ensayos repetidos en muestras negativas.
Los presentes métodos para la detección homogénea de ácidos nucleicos diana son también adecuados para la cuantificación de una diana particular. Ya se realicen los métodos de manera automatizada o manualmente, la cuantificación puede ser llevada a cabo mediante varios medios. Por ejemplo, una dilución seriada de la muestra, en paralelo con una dilución seriada de un estándar conocido, proporciona una serie de moldes que, después de la PCR y de la detección de la señal, son adecuados para cuantificar la cantidad de material de partida en la muestra conocida. De manera similar, como la fluorescencia puede ser determinada entre ciclos durante el curso de una PCR, pueden determinarse fácilmente la fase exponencial de la PCR y el ciclo en el cual el nivel de producto alcanza la fase de meseta. Cuanto más ADN diana esté presente al inicio de la PCR, antes alcanzará la meseta la reacción, esto es, el punto en el que comienza a disminuir la tasa de acumulación del producto. Como el número de ciclos necesarios para alcanzar la meseta está relacionado directamente con la cantidad de diana presente en la muestra, la monitorización de la fluorescencia mientras está transcurriendo la PCR sirve para cuantificar pequeñas cantidades de ADN.
La invención es adecuada para detectar ácidos nucleicos amplificados en presencia de ADN genómico de doble hebra. Niveles de fondo de ADN tan elevados como 0,5 g o más no ocultarán un resultado positivo de un ensayo. El ácido nucleico diana puede ser un segmento clonado, una secuencia de repetición, tal como un gen de múltiples copias o una repetición en tándem, un gen de una única copia o un agente infeccioso presente en una concentración tan baja como una copia por 70.000 células. El molde de partida es ARN o ADN porque la PCR proporciona un incremento neto de ácido nucleico de doble hebra partiendo de cualquier ácido nucleico molde.
El ácido nucleico diana puede ser una secuencia rara, tal como una única copia de ADN del virus del SIDA en un fondo de ADN genómico humano de más de 70.000 células. En tal caso, los procedimientos para incrementar la especificidad sirven para asegurar que la amplificación proporcione una ganancia neta de ADN de doble hebra solamente en respuesta a la presencia de la secuencia diana, y que la ganancia neta sea detectable en presencia de un fondo elevado de ADN genómico. La Patente de EE.UU. Nº 4.683.195 demuestra la utilización de cebadores anidados para disminuir el fondo en la amplificación de genes de una sola copia.
El procedimiento para la amplificación anidada de la Patente de EE.UU. Nº 4.683.195 requiere un primer par de cebadores para amplificar una secuencia diana y un segundo par de cebadores para amplificar un subsegmento del producto de PCR formado de la primera reacción de amplificación. Después de la primera PCR, la mezcla de reacción es diluida 10 veces para reducir la concentración del primer par de cebadores, y el segundo par de cebadores es introducido en la mezcla de reacción. Sin embargo, como una ventaja particular de la presente invención radica en la eliminación de etapas, no son deseables las etapas adicionales de parar una reacción de amplificación para diluir la muestra y añadir un segundo par de cebadores.
Para abordar esta cuestión, se proporcionan procedimientos de amplificación anidada modificados. Los presentes métodos con cebadores anidados están muy mejorados sobre los procedimientos anteriores con cebadores anidados para amplificar ácidos nucleicos. Estos métodos proporcionan una especificidad incrementada y son aplicables en cualquier esquema de amplificación basado en PCR. Sin embargo, en la presente descripción, estos procedimientos son descritos utilizados en un ensayo homogéneo.
En un método con cebadores anidados modificado, se incluye en una reacción de PCR un tercer cebador, interno a un par de cebadores de PCR flanqueantes, para amplificar un segmento diana particular. El tercer cebador tiene una temperatura de hibridación/fusión, cuando está hibridado a su hebra diana complementaria, que es inferior a la del cebador flanqueante. Esta propiedad puede ser impartida al cebador por una longitud más corta y/o un menor contenido de G-C. Durante los primeros 15-20 ciclos de PCR, la temperatura durante la fase de extensión de cada ciclo de PCR es mantenida suficientemente elevada, esto es a 65ºC aproximadamente, para impedir que el cebador corto se hibride específicamente e inicie la amplificación. Los cebadores flanqueantes se hibridan suficientemente, de tal manera que la PCR procede normalmente a la elevada temperatura de extensión. Sin embargo, el cebador que flanquea al tercer cebador está presente a una baja concentración. En el método, antes de la meseta de amplificación, cuando el suministro del cebador limitante está casi agotado, la temperatura de hibridación es disminuida hasta 42ºC aproximadamente. A esta temperatura, el tercer cebador "entra" y procede a la amplificación de la diana durante los más o menos 15 ciclos restantes.
En un método alternativo para la amplificación con cebadores anidados, se elimina la necesidad de una baja concentración de un cebador. El cebador flanqueante es sintetizado con una cola rica en G-C. Como la secuencia de la cola del cebador no complementaria se incorpora al producto de la PCR después de dos ciclos de amplificación, la cola de G-C sirve para elevar la temperatura necesaria para desnaturalizar el producto de PCR debido a la termoestabilidad incrementada de los pares G-C frente a los pares A-T (Myers y col., 1989, en PCR Technology, ed. Erlich, Stockton Press, New York). La diferencia resultante de la temperatura de desnaturalización entre el producto de PCR anidado y flanqueante es aprovechada posteriormente para interrumpir eficazmente la amplificación del cebador flanqueante con la cola. Una vez que el producto de PCR se ha formado a partir de los cebadores flanqueantes, se disminuye la temperatura de desnaturalización, esto es, desde 96ºC hasta 86ºC, de tal manera que la temperatura es demasiado baja para la amplificación del producto de PCR flanqueante, pero es lo suficientemente elevada para permitir la amplificación del producto de PCR anidado. La temperatura de hibridación puede ser también manipulada, igual que en el método de "entrada", para iniciar la síntesis del cebador anidado cuando se desee.
Será obvio para una persona con experiencia habitual en la técnica el determinar empíricamente las temperaturas apropiadas de desnaturalización e hibridación y programar en consecuencia un termociclador. Este método del "cebador que se retira" proporciona un medio para incluir altas concentraciones del cebador flanqueante con el fin de mantener la eficacia de la PCR, y permite que la amplificación iniciada por ese cebador sea terminada durante la reacción cuando se desee. Este método particular para la amplificación con cebadores anidados está demostrado en los Ejemplos VI y VII.
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar diferentes aspectos de la presente invención. Las secuencias de los cebadores utilizados están enumeradas al final del Ejemplo VIII.
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Ejemplo I
Este ejemplo demuestra la capacidad de la PCR para proceder en presencia de bromuro de etidio.
Se llevaron a cabo dos PCRs según sigue. Cada 100 \mul de PCR contenían: 50 ng de ADN humano; Tris-HCl 10 mM, pH 8; KCl 50 mM; MgCl_{2} 4 mM; 250 \muM de cada dNTP; 2,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus Instruments, Norwalk, Conneticut); 20 picomoles de cada cebador GH26 (SEC ID Nº: 1) y GH27 (SEC ID Nº 2). El ADN humano fue purificado a partir de una linea de células B humanas. El ADN fue preparado de acuerdo con el método descrito por Maniatis (supra). Se añadió una capa sobrepuesta de aceite a cada reacción para impedir la evaporación.
Las dos PCRs se llevaron a cabo bajo condiciones idénticas excepto en que en una reacción se incluyó bromuro de etidio (Sigma) 0,15 \muM. Un termociclador adquirido a Perkin-Elmer Cetus Instruments fue programado con los parámetros de ciclación siguientes: desnaturalizar a 96ºC, mantenidos durante 1 minuto; hibridar a 55ºC, mantenidos durante 1 minuto; extender a 72ºC, mantenidos durante 1 minuto. Este perfil se repitió durante 32 ciclos. Después de la amplificación se analizaron 5 \mul de cada PCR mediante electroforesis en gel utilizando un gel de agarosa NuSieve al 3% (FMC). El gel fue teñido con bromuro de etidio mediante métodos estándar y se comparó la cantidad de producto de PCR producido en las dos reacciones. Los resultados demostraban que la cantidad de ADN amplificado producida en presencia de bromuro de etidio era indistinguible de la cantidad de producto de PCR producida en ausencia del colorante. Adicionalmente, la especificidad de la PCR, medida por la capacidad para producir fragmentos de ADN del tamaño esperado, no fue alterada.
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Ejemplo II
Este ejemplo muestra que la especificidad de la PCR es suficiente para la detección homogénea de ácidos nucleicos diana basada en fluorescencia. El experimento descrito en el Ejemplo I fue ampliado para determinar si la fluorescencia del bromuro de etidio especifica de la diana era visible fácilmente utilizando condiciones estándar de PCR. Por tanto, se prepararon cinco mezclas de reacción de 100 \mul que contenían Tris-HCl 10 mM, pH 8; KCl 50 mM; MgCl_{2} 2,5 mM; bromuro de etidio 1,27 \muM; 150 \muM de cada dNTP; 2,5 unidades de polimerasa Taq. Se incluyeron los cebadores y el ADN diana según se describe a continuación. El par de cebadores GH15 (SEC ID Nº: 3) y GH16 (SEC ID Nº: 4) son específicos para amplificar ADN diana DQ\alpha y no amplifican ADN diana DR\beta1. El ADN DQ\alpha diana fue preparado mediante amplificación del gen DQ\alpha humano según se describió en el Ejemplo I. Después de la amplificación, el producto de PCR DQ\alpha fue diluido para proporcionar \sim2 x 10^{7} copias (5 pg) de ADN amplificado por amplificación. El producto DQ\alpha fue utilizado como control positivo. El ADN diana DR\beta1 fue preparado utilizando el par de cebadores GH46 (SEC ID Nº: 5) y GH50 (SEC ID Nº: 6) para amplificar el gen DR\beta1 en una PCR utilizando ADN genómico humano. El producto de la PCR fue diluido para proporcionar \sim2 x 10^{7} copias de ADN DR\beta1 y se utilizó en la Reacción 4, siguiente, como control negativo. Las cinco mezclas de reacción contenían cebadores y diana según sigue:
Reacción 1 - Sin cebadores + diana DQ\alpha
Reacción 2 - Cebadores + diana DQ\alpha
Reacción 3 - Cebadores + diana DQ\alpha
Reacción 4 - Cebadores + diana DR\beta1
Reacción 5 - Cebadores + sin diana
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Cuando se incluyeron cebadores, se añadieron 10 pmoles de cada uno de GH15 (SEC ID Nº: 3) y GH16 (SEC ID Nº: 4). Las mezclas de Reacción 1 y 2 no fueron sometidas a ciclos de amplificación. Las Reacciones N^{os} 3, 4 y 5 fueron sometidas a 20 ciclos de amplificación. Los parámetros de los ciclos fueron 94ºC, mantenidos durante 1 minuto; 45ºC, mantenidos durante 1 minuto; y 72ºC, mantenidos durante 1 minuto.
Los tubos de reacción fueron colocados posteriormente en una caja de luz UV (300 nm) y fotografiados con exposiciones de dos segundos y medio segundo. Los resultados, mostrados en la Figura 1, demostraban la fluorescencia incrementada en la Reacción Nº 3 debido a la amplificación del ADN diana específico. Las Reacciones N^{os} 1 y 2 indicaban el nivel de fluorescencia presente antes de que tuviera lugar alguna amplificación. Las Reacciones N^{os} 4 y 5 demostraban que la fluorescencia no incrementa visiblemente en una reacción a no ser que, para el par de cebadores particulares presente en la reacción, esté también presente un molde apropiado. Las diferentes exposiciones fotográficas, según se muestra en la Figura 1, demuestran las diferencias relativas de fluorescencia.
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Ejemplo III
Se analizó la capacidad del presente método de ensayo homogéneo para detectar una diana especifica en presencia de ADN de doble hebra no diana. Este ejemplo demuestra la detección de una secuencia de ADN especifica en un fondo de ADN genómico. Se prepararon veinte mezclas de 100 \mul de PCR según sigue. Cada una contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8; KCl 50 mM; MgCl_{2} 2 mM; 2,9 unidades de polimerasa Taq; 180 \muM de cada dNTP; bromuro de etidio 1,27 \muM; 15 picomoles de RH191 (SEC ID Nº: 7) y 15 picomoles de RH192 (SEC ID Nº: 8). Los cebadores RH191 (SEC ID Nº: 7) y RH192 (SEC ID Nº: 8) derivan de los cebadores y1.1 e y1.2, que están descritos en Kogan y col., 1987, N. Engl. J. Med. 317:985-990. Estos cebadores son específicos para una secuencia humana especifica de hombres que está presente en varios miles de copias por célula masculina humana. Se prepararon quince mezclas de reacción de PCR según sigue. La muestra de ADN fue preparada a partir de sangre humana extraída de un hombre o de una mujer según se especifica para cada reacción. El ADN fue preparado de acuerdo con Maniatis, supra.
Reacciones N^{os} 1-5:
contenían 2 ng de ADN masculino humano
Reacciones N^{os} 6-10:
no contenían ADN
Reacciones N^{os} 11-15:
contenían 60 ng de ADN femenino humano
Reacciones N^{os} 16-20:
contenían 60 ng de ADN masculino humano
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Las reacciones fueron todas colocadas en un termociclador de Perkin-Elmer Cetus Instruments programado para ciclos de 94º durante 1 minuto; 60ºC durante 1 minuto, para el número de ciclos indicado. Según se indica a continuación, se retiraron tubos del termociclador a diferentes ciclos para proporcionar la variación de la PCR a lo largo del tiempo para cada molde. Específicamente, para cada conjunto de cinco tubos, se realizaron 0, 17, 21, 25 y 29 ciclos de amplificación. El producto de la PCR fue detectado exponiendo los tubos a luz UV según se describió anteriormente.
Por fotografía y por inspección visual, los Tubos N^{os} 6-15 no presentaban un incremento de fluorescencia. Los Tubos N^{os} 1 y 2, las muestras de ADN masculino de 0 y 17 ciclos, tampoco presentaban un incremento de fluorescencia por detección visual. Solamente las reacciones de ADN masculino de 21, 25 y 29 ciclos fluorescían bajo luz UV, y la cantidad de fluorescencia aumentaba al incrementar el número de ciclos. Los resultados con los Tubos N^{os} 16-20 fueron similares, excepto en que se observó un incremento de la fluorescencia hacia los 17 ciclos. Esto es consistente con la presencia de más copias de la secuencia de ADN diana presentes en la muestra antes de la amplificación.
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Ejemplo IV
Para la medida cuantitativa de la fluorescencia de bromuro de etidio específica de la diana, se abrieron las reacciones del Ejemplo III y se transfirió su contenido a un espectrofluorímetro (SPEX Fluorolog-2, adquirido a Spex, Edison, NJ) que fue utilizado para obtener un valor de fluorescencia cuantitativo para cada reacción. Los resultados mostrados en la Figura 2 demuestran no solamente la especificidad de la diana del método de detección, sino que ilustran también los aspectos cuantitativos de la invención. El efecto de una diana incrementada en la muestra es observable comparando la variación de la fluorescencia a lo largo del tiempo entre los moldes masculinos de 2 ng y 60 ng. A mayor cantidad de ADN diana en la muestra, antes obtiene la reacción un incremento de fluorescencia medible y alcanza finalmente un nivel meseta de fluorescencia. El momento exacto en el que la fluorescencia de la reacción comienza a aumentar de manera medible, es efectivamente una medida cuantitativa de la cantidad de diana que estaba presente antes de la amplificación.
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Ejemplo V
Este ejemplo demuestra la idoneidad del ensayo homogéneo no sólo para detectar un gen de una sola copia entre el ADN genómico humano total, sino también para discriminar entre dos alelos de ese gen con una sola copia presente en la muestra que difieren en un único nucleótido. (Métodos para la detección especifica de alelos están descritos con detalle en la Publicación de Patente Europea Nº 237.362, que se incorpora a la presente por referencia).
El gen particular que va a ser detectado es el gen de la \beta-globina. Un cambio de un solo par de bases muta un alelo de la \beta-globina de tipo salvaje a un alelo de células falciformes. En este ejemplo, se utilizaron los cebadores siguientes: RH187 (SEC ID Nº: 9), RH188 (SEC ID Nº: 10) y RH189 (SEC ID Nº: 11). El par de cebadores RH187/RH188 (SEC ID Nº: 9/SEC ID Nº: 10) amplificaba específicamente el alelo de tipo salvaje. El par de cebadores RH187/RH189 (SEC ID Nº: 9/SEC ID Nº: 11) amplificaba el alelo de células falciformes (estos cebadores derivan de BGP2, H\beta14A y H\beta14S descritos en Wu y col., 1989, PNAS (USA) 86:2757-27 60. Se prepararon seis PCRs según sigue: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; KCl 50 mM; dNTPs 748 \muM en total; 2,9 unidades de polimerasa Taq; 10 pmoles de cada cebador; MgCl_{2} 1,5 \muM; bromuro de etidio 1,27 \muM y 50 ng de ADN humano molde según sigue: un par de reacciones contenía ADN humano homozigoto para el alelo falciforme (SS); un par de reacciones contenía ADN de tipo salvaje (AA); y un par contenía ADN heterozigoto, esto es, un alelo de tipo salvaje y un alelo de células falciformes (AS).
Para cada par de reacciones, un tubo contenía cebadores específicos para el alelo de la globina falciforme y un tubo contenía cebadores para la secuencia de tipo salvaje. La única diferencia entre los conjuntos de cebadores son los nucleótidos 3' de uno de los pares de cebadores, que coinciden con la secuencia diana de células falciformes o con la secuencia diana de tipo salvaje. La temperatura de hibridación de los cebadores durante la PCR se establece de tal manera que la amplificación tendrá lugar solamente si este nucleótido 3' se aparea con el molde. Los parámetros de los ciclos fueron: 94ºC durante 60 segundos, 55ºC durante 60 segundos.
La reacción se realizó por triplicado y después de 30 ciclos de PCR, los tubos fueron colocados bajo una fuente de luz UV y fotografiados. Las fotografías se muestran en la Figura 3. Los resultados fueron según sigue:
1
Un "+" indica que la fluorescencia era fácilmente visible bajo luz UV, y cuando se midieron en un espectrofluorímetro los tubos "+" tenían una fluorescencia aproximadamente tres veces mayor que las reacciones "-". Las PCRs señaladas como "-" no cambiaron significativamente su fluorescencia como resultado de la reacción de amplificación.
Alícuotas de cada reacción fueron analizadas por electroforesis en gel. Cada reacción "+" presentaba un fragmento de ADN discreto específico. Las reacciones "-" no tenían tal fragmento de ADN por análisis en gel.
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Ejemplo VI
Se diseñó un ensayo de detección para demostrar la idoneidad de la presente invención para detectar una secuencia diana rara en un fondo de ADN de 70.000 células humanas aproximadamente. Se diseñó un procedimiento con cebadores anidados modificado, según se describió brevemente en la sección "Descripción Detallada" como un procedimiento de "retirada" de los cebadores, para incrementar la especificidad de la PCR. Este ensayo fue realizado según sigue: en los recipientes de reacción de PCR 1 a 8 se alicuotaron 50 microlitros de solución, conteniendo cada alícuota KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; MgCl_{2} 2,5 mM; dNTPs 600 \muM en total; 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq (PECI); bromuro de etidio 1,27 \muM; 0,5 \mug de ADN de una linea celular humana; el par de cebadores RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH176 (SEC ID Nº: 13), cada cebador a 0,2 \muM; y el cebador anidado RH182 (SEC ID Nº: 14) también a 0,2 \muM. Se utilizó una gota de aceite mineral para cubrir las ocho soluciones con el fin de impedir la evaporación. El cebador RH176 (SEC ID Nº: 13) lleva una "cola" 5' no homóloga (a la secuencia diana) rica en G-C, que eleva la temperatura de desnaturalización necesaria para amplificar el producto de PCR producido utilizando este cebador.
Las Reacciones 1-4 se realizaron con soluciones que estaban a temperatura ambiente y que incluían los tres cebadores antes de que comenzaran los ciclos de temperatura. Las reacciones 5-8 se realizaron con la adición de los tres cebadores pospuesta hasta que estas reacciones fueron equilibradas a una temperatura de 72ºC antes de comenzar los ciclos de temperatura. Por esta razón, las Reacciones 5-8 son referidas como reacciones a las que se había dado un "inicio caliente". Las Reacciones 2-4 y 6-8 contenían también un ADN diana control positivo (adquirido a PECI) que contenía secuencias del VIH a las que eran homólogos RH171 (SEC ID Nº: 12), RH176 (SEC ID Nº: 13) y la porción 3' de RH182 (SEC ID Nº: 14). Este ADN fue diluido de tal manera que cada reacción que lo contenía tenia, de promedio, cuatro copias de la secuencia del VIH. Como este número medio de copias es pequeño, el número real de copias en una reacción dada puede variar considerablemente. Como no se añadió ADN de VIH diana a las Reacciones 1 y 5, estas reacciones sirvieron como controles negativos.
Las ocho reacciones fueron todas sometidas a ciclos térmicos según sigue: desnaturalización a 96ºC, mantenidos durante 1 minuto; hibridación a 64ºC, mantenidos durante 1 minuto. Este perfil fue repetido durante 29 ciclos, durante los cuales el par de cebadores flanqueantes, RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH176 (SEC ID Nº: 13), se hibridaban eficazmente y fueron utilizados en la amplificación, mientras que el cebador anidado RH182 (SEC ID Nº: 14), que no se hibrida eficazmente a 64ºC, no fue utilizado en la amplificación eficaz. Esto fue seguido por desnaturalización a 96ºC, mantenidos durante 1 minuto; hibridación a 52ºC, mantenidos durante 1 minuto. Este perfil fue repetido durante 2 ciclos, durante los cuales los tres cebadores se hibridaron eficazmente y fueron extendidos en una amplificación, de tal manera que se produjeron productos utilizando RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH176 (SEC ID Nº: 13), o bien RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH182 (SEC ID Nº: 14). Como la utilización de un tercer cebador anidado incrementa la especificidad del producto, los productos producidos utilizando RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH182 (SEC ID Nº: 14) era más probable que fueran específicos del VIH. Estos ciclos fueron seguidos por desnaturalización a 8 6ºC, mantenidos durante 1 minuto; hibridación a 52ºC, mantenidos durante 1 minuto. Este perfil fue repetido 18 veces, durante las cuales, los productos que incluían el cebador rico en GC RH176 (SEC ID Nº: 13), especifico y no especifico del VIH, no se desnaturalizaban eficazmente a 86ºC y, por tanto, no se amplificaban eficazmente, mientras que las secuencias del VIH amplificadas producidas utilizando el cebador anidado RH182 (SEC ID Nº: 14) y RH171 (SEC ID Nº: 12) se desnaturalizaban y amplificaban eficazmente.
Las ocho reacciones fueron analizadas, cuando se completaron, mediante electroforesis en gel. Se demostró que las Reacciones 2-4 y 5-8 contenían un producto del tamaño esperado (200 pb aproximadamente) como banda predominante en el gel. Las Reacciones 1 y 5, los controles negativos, no contenían tal producto. Sin embargo, pudo observarse que las Reacciones 2-4, a las que no se dio un "inicio caliente", contenían fragmentos de ADN de otro tamaño distinto del esperado. Estos otros fragmentos de ADN fueron también visibles en la Reacción 1, indicando que no derivan de secuencias del VIH. Estos otros fragmentos de ADN no fueron visibles en las Reacciones 5-8, indicando que la utilización del "inicio caliente" había incrementado la especificidad de estas reacciones.
Se realizaron ocho reacciones adicionales según se describió anteriormente, excepto en que a todas se les dio un "inicio caliente" según se describió anteriormente. El ADN control positivo fue diluido en estas ocho reacciones, numeradas de 1 a 8, de tal manera que de promedio, cada una contenía la mitad de una molécula diana de VIH. Como una molécula no puede ser dividida, esto significa que algunas reacciones contendrían una molécula diana y algunas no. Si este experimento se repitiera muchas veces, la fracción de reacciones que contienen una diana variaría considerablemente, pero la media sería la mitad aproximadamente. Aquéllas que contienen una molécula diana es muy probable que contengan una única molécula diana. Después de la finalización de las reacciones, las ocho fueron todas analizadas mediante electroforesis en gel. El resultado fue que dos de las ocho reacciones, las Reacciones números 1 y 8, presentaban un fragmento de ADN del tamaño esperado (200 pb aproximadamente) como banda predominante en el gel, sin ninguna otra banda visible que migrara en el gel excepto una banda correspondiente a los cebadores. Las Reacciones 2-6 no presentaban tales bandas ni ninguna otra banda de fragmentos de ADN.
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Ejemplo VII
Para la detección cuantitiva del producto de PCR se utilizó un espectrofluorímetro Spex Fluorolog-2 (Spex, Edison, NJ) para cuantificar el incremento neto de la fluorescencia generada en respuesta a lo que se espera que sea una sola diana de VIH en presencia de ADN genómico. El espectrofluorímetro fue utilizado de acuerdo con las especificaciones del fabricante según se describe en el Ejemplo VIII. Las reacciones de PCR descritas en el Ejemplo VI, en las que el ADN control positivo fue diluido entre ocho reacciones para que contuviera media molécula diana del VIH por reacción, fueron analizadas para determinar su fluorescencia. Veinte microlitros de cada reacción completada se añadieron a 100 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8; EDTA 0,1 mM; bromuro de etidio 1,27 \muM. La fluorescencia de estas soluciones fue medida a 570 nm. La Figura 4A demuestra gráficamente el incremento significativo de la fluorescencia de las dos muestras positivas en comparación con las dos muestras negativas. En la figura, las lineas discontinuas señalan los valores de fluorescencia a dos desviaciones estándar de distancia de la media de las muestras negativas. Las muestras PCR-positivas están ambas por encima de esta linea.
Los resultados se muestran también en la Figura 4B utilizando un método de sustracción del fondo. La fluorescencia hasta la segunda desviación estándar por debajo de la media fue sustraída de los valores detectados. La sustracción del fondo se realiza preferiblemente midiendo la fluorescencia de cada muestra al comienzo de los ciclos de PCR (preferiblemente después de la desnaturalización inicial, que reduce la proporción de ADN genómico de doble hebra) y sustrayendo ese valor de la fluorescencia de la muestra al final de los ciclos de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo VIII
El experimento siguiente demuestra la idoneidad del presente método para monitorizar una reacción de PCR y detectar el incremento neto de ADN de doble hebra debido a la amplificación. El aparato permite la detección en línea del producto de PCR.
El aparato fue montado según sigue: un fluorímetro Spex Fluorolog-2 con un accesorio de fibra óptica (Catálogo de Spex Nº 1950) fue fijado para emitir una luz de excitación a 500 nm con una amplitud de banda de \sim3,4 nm. Se utilizó un filtro de corte a 435 nm GG para excluir la luz de segundo orden (adquirido a Melles Grist, Inc.). La luz de emisión fue detectada a 570 nm con una amplitud de banda de \sim13,6 nm. Se utilizó un filtro 0G530 (corte a 530 nm) para eliminar la luz de excitación.
Se prepararon dos reacciones de PCR según se describió en el Ejemplo III utilizando los cebadores RH191 (SEC ID Nº: 7) y RH192 (SEC ID Nº: 8). Un tubo de reacción contenía 60 ng de ADN masculino humano, el otro no contenía ADN diana. Las reacciones fueron preparadas en tubos de polipropileno de 0,5 ml; sin embargo, el extremo superior de los tubos fue cortado para fijar el cable de fibra óptica. La fibra óptica fue pegada al extremo superior del tubo de reacción con epoxi. Como este aparato tenía una fibra óptica, solamente se llevó a cabo una PCR a la vez. La luz de emisión fue recogida a través de la capa superpuesta de aceite del tubo. Se construyó una "cubierta" negra alrededor del tubo y la reacción fue colocada en el termociclador. El termociclador fue programado para ciclos entre 94ºC y 50ºC durante 1 minuto cada uno, durante 30 ciclos, seguido por incubación continua a 25ºC. El fluorímetro y el termociclador fueron puestos en marcha simultáneamente. Los parámetros del fluorímetro fueron: barrido basado en el tiempo con un tiempo de integración de 5 segundos; se calculó la relación de la señal de emisión con la de la luz de excitación para controlar los cambios de la intensidad de la fuente.
La Figura 5A muestra los resultados de la reacción de PCR que no contenía ADN. La Figura 5A muestra que el termociclador comenzó a 25ºC, la fluorescencia cayó cuando la temperatura aumento a 94ºC y la fluorescencia aumentó de nuevo cuando la temperatura disminuyó a 50ºC. Este patrón fue repetido para los ciclos restantes hasta que el termociclador alcanzó de nuevo los 25ºC y la fluorescencia volvió al valor de partida aproximado.
La Figura 5B demuestra el perfil de fluorescencia de una reacción de PCR que contenía el ADN diana apropiado. La intensidad de la fluorescencia a 50ºC muestra un incremento dependiente del ciclo que refleja un incremento de la cantidad de ADN de doble hebra. Cuando el termociclador volvió a los 25ºC, una vez que se completaron los 30 ciclos, la fluorescencia aumentó hasta un valor final más de tres veces mayor que el valor de fluorescencia inicial a 25ºC.
Después de la amplificación, una alícuota de cada mezcla de reacción fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa. El análisis del gel demostró que no había producto de PCR visible en la calle que contenía una muestra del control negativo. La muestra del control positivo de PCR sometida a electroforesis mostró una clara y única banda a \sim150 pares de bases. El tamaño pronosticado del producto de PCR era de 154 pb.
Por tanto, el método en linea proporcionó un rápido análisis de la presencia o ausencia de ADN diana sin la necesidad de sondas o de etapas posteriores de procesamiento. Además, la detección continua de fluorescencia a lo largo de toda la amplificación proporciona un perfil de amplificación que refleja la cantidad de diana presente al comienzo. Si el ADN diana es, por ejemplo, una secuencia humana repetida presente en millones de copias por célula (por ejemplo, secuencias "Alu"; Nelson y Caskey en PCR Technology, ed. Erlich, 1989, Stockton Press, NY), este método de cuantificación podría ser utilizado para medir rápidamente y de manera sencilla cantidades subcelulares de ADN, lo cual es actualmente difícil de realizar sin utilizar radioisótopos.
Secuencias de los Cebadores para los Ejemplos I-VIII
2
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGCTGCAGG TGTAAACTTG TACCAG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACGGATCCG GTAGCAGCGG TAGAGTTG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGTAAACTT GTACCAG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTAGCAGCG GTAGAG 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCCCAACC CCGTAGTTGT GTCTGCA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCACTTTAT TCCAGGCCTG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGAATGGAA TGGGAACGAA TGG 
\hfill
23 
\newpage
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATAGACCAA TAGGCAGAG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCTGACTC CTGA 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCTGACTC CTGT 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGGCCAGA TGAGAGAACC AAGGGG 
\hfill
26 
\newpage
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGCAGGG CGGCGGGGGC GGGGCCGAAC CGGTCTACAT AGTCTCTAAA GGG 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCCCTGTC TTATGTC 
\hfill
17

Claims (10)

1. Un aparato para monitorizar una reacción en cadena de polimerasa (RCP) para una amplificación de un ácido nucleico a lo largo de múltiples ciclos térmicos, que comprende:
(a) un termociclador para efectuar un procedimiento automatizado de (RCP), dicho termociclador será capaz de calentar y enfriar alternativamente, en un recipiente de reacción, una mezcla de reacción de amplificación (RCP) que contiene un ADN diana, reactivos para dicha amplificación del ácido nucleico y un agente de unión al ácido nucleico detectable, y
(b) un sistema óptico que incluye un detector operable para detectar una señal óptica relacionada con la cantidad de ácido nucleico amplificado en la mezcla de reacción a lo largo de un periodo de múltiples ciclos, sin abrir el recipiente de reacción una vez que se ha iniciado la reacción de amplificación.
2. El aparato de la reivindicación 1, en el que el termociclador es capaz de calentar y enfriar alternativamente una pluralidad de recipientes de reacción, conteniendo cada uno dicha mezcla de reacción de amplificación.
3. El aparato de la reivindicación 1 ó 2, en el que el detector, para detectar la señal óptica, es operable para tomar muestras de valores de la señal óptica a lo largo de múltiples ciclos térmicos.
4. El aparato de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el detector es operable para detectar una señal óptica de fluorescencia.
5. El aparato de la reivindicación 4, en el que el detector es operable para detectar una señal óptica de fluorescencia a una longitud de onda de, o alrededor de, 570 nm.
6. El aparato de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sistema óptico incluye un cable de fibra óptica.
7. El aparato de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene además un recipiente de reacción adaptado para contener dicha mezcla de reacción de amplificación que contiene un ADN diana, reactivos para dicha amplificación del ácido nucleico y un agente de unión al ácido nucleico detectable.
8. El aparato de la reivindicación 7, que contiene una pluralidad de recipientes de reacción, adaptado cada uno para contener dicha mezcla de reacción de amplificación.
9. El aparato de la reivindicación 7 u 8, en el que el (los) recipiente(s) de reacción incluye(n) un tapón claro o translúcido acoplado ópticamente al detector.
10. La utilización de un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para monitorizar una reacción en cadena de polimerasa para una amplificación de un ácido nucleico a lo largo de múltiples ciclos térmicos.
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