ES2197914T3 - Antagonistas del fibrinogeno biciclicos. - Google Patents

Antagonistas del fibrinogeno biciclicos.

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ES2197914T3 ES95908006T ES95908006T ES2197914T3 ES 2197914 T3 ES2197914 T3 ES 2197914T3 ES 95908006 T ES95908006 T ES 95908006T ES 95908006 T ES95908006 T ES 95908006T ES 2197914 T3 ES2197914 T3 ES 2197914T3
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William Francis Huffman
Richard Mcculloch Keenan
Thomas Wen-Fu Ku
Kenneth Allen Newlander
James Martin Samanen
Irene Nijole Uzinskas
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Abstract

CIERTOS COMPUESTOS EN LA FORMULA (I) SON INHIBIDORES DE AGREGACION PLAQUETARIA EN DONDE A{SUP,1} ES NH O CH{SUB,2}; R ES H, C{SUB,1-6}ALQUILO, BENCILO O UN GRUPO DE PROTECCION DE CARBOXI; R{SUP,3} ES C{SUB,1-6}ALQUILO, AR-C{SUB,0-6}ALQUILO, C{SUB,3-7}CICLOALQUILOC{SUB,0-6}ALQUILO, O HET-C{SUB,0-6}ALQUILO; R{SUP,6} ES 4-AMIDINO-AR-N(()CH{SUB,3}())CO, [[][[]2-(()4PIPERIDINILO())ETILO[]](()N-METILO())AMINO[]]CARBONILO, (()4,4''BIPIPERIDIN-1-ILO())CARBONILO, [[]4-(()2-AMINOETILO())PIPERIDIN1-ILO[]]CARBONILO, [[][[][[]3-(()4PIPERIDINILO[]]PROPILO[]]METILAMINO[]]CARBONILO, 1-[[]4(()PIRIDILO())PIPERAZINILO[]]CARBONILO, [[][[]2-[[](()2AMINO())PIRID-4-ILO[]]ETILO[]]METILAMINO[]]CARBONILO, [[][[]2(()4-PIPERIDINILO())ETILO[]]CARBONILO[]]AMINA, [[][[]2-(()1PIPERAZINILO())ETILO[]]METILAMINO[]]-CARBONILO, O [[][[](()1,2,3,4-TETRAHIDRO-7-ISOQUINOLINILO[]]AMINO[]]CARBONILO; Y X ES H, C{SUB,1-4}ALQUILO, C{SUB,1-4}ALCOXI, C{SUB,14}ALQUILTIO, TRIFLUOALQUILO, N(()R''()){SUB,2}, CO{SUB,2}R'', CON(()R''()){SUB,2}, OH, F, CL, BR O I.

Description

Antagonistas del fibrinógeno bicíclicos.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a nuevos compuestos bicíclicos que inhiben la agregación de plaquetas, a composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos y a métodos que usan los compuestos.
Antecedentes de la invención
Se cree que la agregación de plaquetas es mediada principalmente por el receptor de fibrinógeno, o complejo receptor de plaquetas GPIIb-IIIa, que es un miembro de la familia de los receptores de adhesión denominados integrinas. Se ha encontrado que con frecuencia los ligandos naturales de los receptores integrinas son proteínas que contienen una secuencia Arg-Gly-Asp. El factor Von Willebrand y el fibrinógeno, que se considera que son ligandos naturales para el receptor GPIIb-IIIa, tienen una secuencia Arg-Gly-Asp (RGD en el código de aminoácidos de una sola letra) en su estructura primaria. Funcionalmente, estas proteínas pueden unirse y entrecruzar receptores GPIIb-IIIa en plaquetas adyacentes y así producir la agregación de plaquetas.
La fibronectina, vitronectina y tromboespondina son proteínas que contienen RGD, que también se ha demostrado que se unen a GPIIb-IIIa. La fibronectina se encuentra en el plasma y como una proteína estructural en la matriz intracelular. La unión entre las proteínas estructurales y GPIIb-IIIa puede funcionar para hacer que las plaquetas se adhieran para dañar las paredes de los vasos.
Se describen péptidos lineales y cíclicos que se unen a la vitronectina y contienen una secuencia RGD en el documento WO 89/05150 (PCT US88/04403). El documento EP 0275748 describe tetra- a hexapéptidos lineales y hexa- a octapéptidos cíclicos que se unen al receptor GPIIb-IIIa e inhiben la agregación de plaquetas. Se describen otros péptidos lineales y cíclicos, cuya descripción se incorpora aquí como referencia, en el documento EP-A-0341915. Sin embargo, las estructuras tipo péptido de dichos inhibidores a menudo plantean problemas, tales como en la distribución del fármaco, estabilidad metabólica y selectividad. Se describen inhibidores del receptor de fibrinógeno que no están construidos con secuencias de aminoácidos naturales en los documentos EP-A-0372486, EP-A-0381033 y EP-A-0478363. El documento WO 92/07568 (PCT/US91/08166) describe antagonistas del receptor de fibrinógeno que mimetizan una vuelta \gamma conformacional en la secuencia RGD formando una estructura de anillo monocíclico de siete miembros. Sin embargo, siguen siendo necesarios nuevos antagonistas del receptor de fibrinógeno (por ejemplo, inhibidores de la proteína GPIIb-IIIa) que tengan potentes efectos in vivo e in vitro y que carezcan de la secuencia de aminoácidos de la estructura de la cadena principal del péptido.
La presente invención describe nuevos compuestos de benzodiazepina bicíclicos, que son inhibidores del receptor GPIIb-IIIa e inhiben la agregación de plaquetas. Se conocen ciertas 5-fenil-1,4-benzodiazepinas como una clase de fármacos que afecta al sistema nervioso central, y se han usado como ansiolíticos. Véase, Sternbach, L.H., J. Med. Chem., 22, 2 (1979). También se ha descrito que ciertas 5-fenil-1,4-benzodiazepinas antagonizan los efectos de la colecistoquinina. Véase, Friedinger, Med. Res. Rev., 9, 271 (1989). Se describen ciertos compuestos bicíclicos que tienen actividad antagonista del fibrinógeno en los documentos WO 93/01874 (PCT/US92/08788), WO 93/00095 (PCT/US/92/05463) y WO 94/14776 (PCT/US93/12436).
Sumario de la invención
En un aspecto esta invención es un compuesto, como se describe en lo sucesivo, para inhibir la agregación de plaquetas.
Esta invención también es una composición farmacéutica para inhibir la agregación de plaquetas o formación de coágulo, que comprende un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente estable.
Esta invención comprende además el uso de un compuesto, como se describe en lo sucesivo, para preparar un medicamento para inhibir la agregación de plaquetas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la reoclusión de una arteria o vena en un mamífero, después de terapia fibrinolítica o angioplastia, que comprende administrar internamente una cantidad eficaz de un compuesto de la invención. Esta invención también es un método para tratar el ataque de apoplejía, ataques isquémicos transitorios, o infarto de miocardio.
Descripción detallada de la invención
Aunque sin pretender ligarse a ningún mecanismo de acción específico, se cree que los compuestos de esta invención inhiben la unión de fibrinógeno al receptor de fibrinógeno unido a plaquetas GPIIb-IIIa, y pueden interaccionar con otras proteínas de adhesión por antagonismo de un sitio de unión de RGD putativo.
Los compuestos de esta invención están englobados por un compuesto que es el ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético; o
ácido (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
Para describir los compuestos de esta invención, aquí se usan las abreviaturas y símbolos usados normalmente en la técnica de péptidos y química. En general, las abreviaturas de los aminoácidos siguen la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, descritas en Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984).
t-Bu se refiere al radical butilo terciario, Boc se refiere al radical t-butiloxicarbonilo, Fmoc se refiere al radical fluorenilmetoxicarbonilo, Ph se refiere al radical fenilo, Cbz se refiere al radical benciloxicarbonilo, BrZ se refiere al radical o-bromobenciloxicarbonilo, ClZ se refiere al radical o-clorobenciloxicarbonilo, Bzl se refiere al radical bencilo, 4-MBzl se refiere al radical 4-metilbencilo, Me se refiere a metilo, Et se refiere a etilo, Ac se refiere a acetilo, Alk se refiere a alquilo C_{1-4}, Nph se refiere a 1 ó 2-naftilo y cHex se refiere a ciclohexilo.
DCC se refiere a dicilohexilcarbodiimida, DMAP se refiere a 4-(dimetilamino)piridina, DIEA se refiere a diisopropiletilamina, EDC se refiere a N-etil-N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida. HOBt se refiere a 1-hidroxibenzotriazol, THF se refiere a tetrahidrofurano, DMF se refiere a dimetilformamida, NBS se refiere a N-bromosuccinimida, Pd/C se refiere a un catalizador de paladio sobre carbón, PPA se refiere a anhídrido cíclico del ácido 1-propanofosfónico, DPPA se refiere a difenilfosforil-azida, BOP se refiere a hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio, HF se refiere a ácido hidrofluórico, TEA se refiere a trietilamina, TFA se refiere a ácido trifluoroacético, PCC se refiere a clorocromato de piridinio.
Los compuestos de esta invención se preparan tratando, en cualquier orden, un compuesto de estructura:
1
en la que A^{1} es NH, X es H, R es H o un grupo protector de carboxi, R_{3} es metilo y R^{6'} es 7-(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonilo en el que el nitrógeno básico está protegido, con un reactivo, en cualquier orden:
(i)
para eliminar un grupo protector de amino de R^{6'}; y si es necesario,
(ii)
eliminar un grupo protector de carboxi de CO_{2}R; y
(iii)
formar una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
R^{6} es ilustrativo de R^{6'}, en el que el grupo piperidinilo está protegido con un grupo benciloxi, t-butoxicarbonilo o trifluoroacetilo.
Los compuestos de fórmula (IV) generalmente se preparan haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (XI) con un compuesto de fórmula (XII):
2
en las que A^{1} es NH y R^{3} es metilo, con cualesquiera grupos funcionales reactivos protegidos, R es H o un grupo protector de carboxi, L^{1} es CO_{2}H.
L^{1} y L^{2} son grupos funcionales que son capaces de reaccionar para formar un enlace amida. L^{2} es un grupo nitrógeno básico, tal como el nitrógeno de un grupo piperidinilo. Por ejemplo R^{6``}-L^{2} es 4-(4-piperidinil)piperidina, en el que el nitrógeno básico no reactivo del grupo piperidinilo está protegido con un grupo protector de amino.
Los compuestos de fórmula (XI) son benzodiazepinas y se preparan por métodos generales conocidos en la técnica, tales como los descritos en los documentos WO 93/00095 (PCT/US/92/05463) y WO 94/14776 (PCT/US93/12436) que se incorporan aquí como referencia. Los compuestos de fórmula (XII) en general contienen dos centros básicos de los cuales uno está protegido, y también son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO 94/14776.
Reactivos de acoplamiento, tal como se usa aquí, indican reactivos que se pueden usar para formar enlaces amida. Los métodos de acoplamiento típicos usan carbodiimidas, anhídridos y ésteres activados, y haluros de ácido. Son típicos reactivos tales como EDC, DCC, DPPA, PPA, reactivo BOP, HOBt, N-hidroxisuccinimida y cloruro de oxalilo.
Los métodos de acoplamiento para formar enlaces amida en general son conocidos en la técnica. Los métodos de síntesis de péptidos expuestos en general por Bodansky et al., The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984, Ali et al. en J. Med. Chem., 29, 984 (1986) y J. Med. Chem., 30, 2291 (1987) son ilustrativos en general de la técnica y se incorporan aquí como referencia.
La síntesis en solución para formar enlaces amida se lleva a cabo usando métodos convencionales usados para formar enlaces amida. Típicamente, la amina o anilina se acopla por su grupo amino libre a un sustrato ácido carboxílico adecuado usando un agente de acoplamiento carbodiimida adecuado, tal como N,N'-dicilohexilcarbodiimida (DCC) o EDC, opcionalmente en presencia de catalizadores tales como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y dimetilamino-piridina (DMAP). También son adecuados otros métodos, tales como la formación de ésteres activados, anhídridos o haluros de ácido, del carboxilo libre de un sustrato ácido adecuadamente protegido, y posterior reacción con la amina libre de una amina adecuadamente protegida, opcionalmente en presencia de una base. Por ejemplo, un Boc-aminoácido o ácido Cbz-amidino-benzoico protegidos en un disolvente anhidro, tal como cloruro de metileno o tetrahidrofurano (THF), en presencia de una base, tal como N-metil-morfolina, DMAP o una trialquilamina, se trata con cloroformiato de isobutilo para formar el ''anhídrido activado``, que posteriormente se hace reaccionar con la amina libre de un segundo aminoácido o anilina protegidos.
Los grupos funcionales reactivos de las cadenas laterales de cada fragmento sintético están adecuadamente protegidos como se conoce en la técnica. Se describen grupos protectores adecuados en Protective Groups in Organic Chemistry de Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981. Por ejemplo, se puede usar el grupo Boc, Cbz, ftaloilo o Fmoc para proteger un grupo amino (o el nitrógeno de un piperidinilo) o amidino. Generalmente, se prefiere el grupo Boc para proteger un grupo amino. Se puede usar un éster de metilo, etilo, t-Bu, cHex, bencilo, bencilo sustituido, (pivaloil)metilo o (2-metil-2-metoxipropanoil)metilo para proteger el grupo carboxilo. Se usa un grupo bencilo o grupo bencilo sustituido (por ejemplo, 4-metoxi-bencilo o 2,4-dimetoxi-bencilo) para proteger el grupo mercapto o el grupo hidroxilo. El grupo tosilo se puede usar para proteger el grupo imidazolilo, y el grupo tosilo o nitro para proteger el grupo guanidino. También se puede usar un grupo carbobenciloxi o grupo bencilo sustituidos adecuadamente para el grupo hidroxilo o grupo amino. Las sustituciones adecuadas de los grupos protectores carbobenciloxi o bencilo son orto y/o para sustitución con cloro, bromo, nitro, metoxi o metilo, y se usan para modificar la reactividad del grupo protector. Excepto para el grupo Boc, los grupos protectores del resto amino son, más convenientemente, los que no se eliminan con tratamiento ácido suave. Estos grupos protectores se eliminan por métodos tales como hidrogenación catalítica, sodio en amoniaco líquido o tratamiento con HF, como se conoce en la técnica.
Los métodos para eliminar el grupo protector del \alpha carboxi o amino son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un éster de alquilo o cicloalquilo se puede eliminar por hidrólisis básica, por ejemplo un hidróxido de metal alcalino, tal como hidróxido de sodio, potasio o litio, en un disolvente adecuado, tal como alcohol acuoso. Un éster de bencilo se elimina típicamente por hidrogenación con un catalizador de paladio. Un nitrógeno básico protegido con un grupo t-butiloxicarbonilo, o un éster de t-butilo, típicamente se elimina por tratamiento ácido, tal como ácido trifluoroacético o ácido clorhídrico, opcionalmente diluido con un disolvente, tal como cloruro de metileno y/o dioxano. El grupo benciloxicarbonilo generalmente se elimina por hidrogenación con un catalizador de paladio. Un grupo trifluoroacetilo típicamente se elimina por hidrólisis básica, tal como por tratamiento con un hidróxido de metal alcalino en un disolvente adecuado. Un método sintético útil para proteger el nitrógeno básico de un grupo piperidinilo es llevar el grupo a lo largo de la síntesis como un grupo piridinilo, que se puede reducir con catalizador de platino hacia el final de la síntesis para ''eliminar`` el grupo protector.
Las sales de adición de ácido de los compuestos se preparan de una forma patrón en un disolvente adecuado, a partir del compuesto padre y un exceso de un ácido, tal como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, maleico, succínico o metanosulfónico. La mayoría de los compuestos forman sales internas o iones híbridos que pueden ser aceptables. Las sales catiónicas se preparan tratando el compuesto padre con un exceso de un reactivo alcalino, tal como un hidróxido, carbonato o alcóxido, que contiene el catión adecuado; o con una amina orgánica adecuada. Cationes tales como Li^+, Na^+, K^+, Ca^{++}, Mg^{++} y NH_{4}^+, son ejemplos específicos de cationes presentes en sales farmacéuticamente aceptables.
Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con esto, los compuestos de esta invención se pueden usar para preparar un medicamento. Las composiciones farmacéuticas de los compuestos de esta invención preparados como se ha descrito en lo que antecede, se pueden formular como soluciones o polvos liofilizados para administración parenteral. Los polvos se pueden reconstituir por adición de un diluyente adecuado u otro vehículo farmacéuticamente aceptable antes de usarlos. La formulación líquida puede ser una solución acuosa, isotónica y tamponada. Ejemplos de diluyente adecuados son solución salina isotónica, dextrosa al 5% patrón en agua o solución de acetato sódico o amónico tamponada. Dicha formulación es especialmente adecuada para administración parenteral, pero también se puede usar para administración oral, o contenida en un inhalador o nebulizador con dosis medida para insuflación. Puede ser conveniente añadir excipientes tales como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxi-celulosa, acacia, polietilenglicol, manitol, cloruro sódico o citrato sódico.
Alternativamente, estos compuestos se pueden encapsular, formar comprimidos, o preparar en una emulsión o jarabe para administración oral. Se pueden añadir vehículos sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables para potenciar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición. Entre los vehículos sólidos se incluyen almidón, lactosa, sulfato cálcico dihidrato, terra alba, estearato magnésico o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. Entre los vehículos líquidos se incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina y agua. El vehículo también puede incluir un material de liberación sostenida tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera. La cantidad de vehículo sólido varía pero, preferiblemente, estará entre aproximadamente 20 mg y aproximadamente 1 g por unidad de dosificación. Las preparaciones farmacéuticas se preparan siguiendo las técnicas convencionales de farmacia que implican molienda, mezcla, granulación y compresión, cuando sea necesario, para formas de comprimido; o molienda, mezcla y carga para formas de cápsula de gelatina dura. Cuando se usa un vehículo líquido, la preparación estará en forma de un jarabe, elixir, emulsión o una suspensión acuosa o no acuosa. Dicha formulación líquida se puede administrar directamente p.o. o se puede cargar en una cápsula de gelatina blanda.
Para administración rectal, los compuestos de esta invención también se pueden combinar con excipientes tales como manteca de cacao, glicerina, gelatina o polietilenglicoles y moldearlos en un supositorio.
Los compuestos de esta invención se pueden usar in vitro para inhibir la agregación de plaquetas en la sangre y en productos de la sangre, por ejemplo, para almacenamiento o manipulaciones ex vivo tales como en uso para diagnóstico, terapéutico o de investigación.
Un método para inhibir la agregación de plaquetas y la formación de coágulos en un mamífero, especialmente un ser humano, comprende la administración interna de un compuesto de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las indicaciones para dicha terapia incluyen infarto de miocardio agudo (IMA), trombosis de vena profunda, embolia pulmonar, aneurisma disecante, ataque isquémico transitorio (AIT), ataque de apoplejía y otros trastornos relacionados con el infarto, y angina inestable. Los compuestos de esta invención también son útiles para prevenir la reestenosis de una arteria o vena en un mamífero después de angiolastia. Es probable que respondan a dicho tratamiento los estados crónicos o agudos de hiperagregabilidad, tales como coagulación intravascular diseminada (CID), septicemia, choque quirúrgico o infeccioso, trauma postoperatorio y posparto, cirugía de bypass cardiopulmonar, transfusión de sangre incompatible, desprendimiento de la placenta, púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), veneno de serpiente y enfermedades inmunes. También se cree que estos compuestos son útiles para la terapia adjunta después de angioplastia. Además, los compuestos de esta invención pueden ser útiles en un método para prevenir estados metastáticos, prevenir o tratar infecciones fúngicas o bacterianas, inducir inmunoestimulación, tratar depranocitosis, y prevenir o tratar enfermedades en las que la reabsorción ósea es un factor, tal como la osteoporosis.
Los compuestos de esta invención también se puede administrar favorablemente con otros agentes que inhiben la agregación de plaquetas. Por ejemplo, los compuestos de esta invención se pueden administrar con compuestos de la clase de inhibidores de ciclooxigenasa, antagonistas de tromboxano, inhibidores de la tromboxano-sintetasa, heparinas, inhibidores de trombina, inhibidores/antagonistas del receptor ADP y ticlopidina. Ejemplos de dichos agentes son aspirina, warfarina y clopidogrel.
El compuesto se administra por vía oral o parenteral al paciente, de forma que la concentración de fármaco en el plasma sea suficiente para inhibir la agregación de plaquetas, u otra indicación. La composición farmacéutica que contiene el compuesto se administra con una dosis entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 50 mg/kg de una forma coherente con el estado del paciente. Para terapia aguda, se prefiere la administración parenteral. Para estados persistentes de hiperagregabilidad, es más eficaz una infusión intravenosa del compuesto en dextrosa al 5% en agua o solución salina normal, aunque una inyección de bolo intramuscular puede ser suficiente.
Para estados crónicos, pero no críticos, de agregabilidad plaquetaria, es adecuada la administración oral de una cápsula o comprimido, o una inyección de bolo intramuscular. El compuesto se administra de una a cuatro veces diarias con un nivel de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 mg/kg para lograr una dosis diaria total de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 200 mg/kg/día.
Un método para inhibir la reoclusión o reestenosis de una arteria o vena después de terapia fibrinolítica comprende la administración interna de un compuesto de esta invención y un agente fibrinolítico. Se ha encontrado que la administración de un compuesto en terapia fibrinolítica previene la reoclusión completamente o prolonga el tiempo para la reoclusión.
Cuando se usa en el contexto de esta invención, la expresión agente fibrinolítico se pretende que signifique cualquier compuesto, sea un producto natural o sintético, que directamente o indirectamente produce la lisis de un coágulo de fibrina. Los activadores del plasminógeno son un grupo conocido de agentes fibrinolíticos. Entre los activadores del plasminógeno útiles se incluyen, por ejemplo, anistreplasa, uroquinasa (UK), prouroquinasa (pUK), estreptoquinasa (SK), activador tisular del plasminógeno (tPA) y mutantes, o variantes de éstos, que retienen la actividad activadora del plasminógeno, tales como las variantes que se han modificado químicamente, o en las que se han añadido, suprimido o sustituido uno o más aminoácidos, o en las que se han añadido, suprimido o alterado uno más dominios funcionales, tal como por combinación del sitio activo de un activador del plasminógeno con el dominio de unión de la fibrina de otro activador del plasminógeno o molécula de unión de fibrina. Otras variantes ilustrativas incluyen moléculas de tPA en las que se han alterado uno o más sitios de glicosilación. Entre los activadores del plasminógeno preferidos están las variantes de tPA en los que la secuencia de aminoácidos primaria se ha alterado en el dominio del factor de crecimiento, para aumentar así la semivida en el suero del activador del plasminógeno. Describen variantes del factor de crecimiento de tPA, por ejemplo, Robinson et al., documento EP-A-0297589 y Browne et al., documento EP-A-0240334. Otras variantes incluyen proteínas híbridas, tales como las descritas en los documentos EP 0028489, EP 0155387 y EP 0297882, todos los cuales se incorporan aquí como referencia. La anistreplasa es una proteína híbrida preferida para usar en esta invención. Los agentes fibrinolíticos se pueden aislar de fuentes naturales, pero normalmente se producen por métodos tradicionales de ingeniería genética.
Se describen formulaciones útiles de tPA, SK, UK y pUK, por ejemplo, en los documentos EP-A-0211592, EP-A-0092182 y patente de EE.UU. 4.568.543, todos los cuales se incorporan aquí como referencias. Típicamente, el agente fibrinolítico se puede formular en una solución acuosa, tamponada e isotónica, tal como acetato o adipato de sodio o amonio tamponado a pH 3,5 a 5,5. También se pueden usar excipientes adicionales tales como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxi-celulosa, acacia, polietilenglicol, manitol, y cloruro sódico. Dicha composición se puede liofilizar.
La composición farmacéutica se puede formular tanto con el compuesto de esta invención como con el agente fibrinolítico en el mismo envase, pero se prefiere la formulación en diferentes envases. Cuando se proporcionan ambos agentes en forma de solución pueden estar contenidos en un sistema de infusión/inyección para la administración simultánea o de manera sucesiva.
Entre las indicaciones para dicha terapia se incluyen infarto de miocardio, trombosis de vena profunda, embolia pulmonar, ataque de apoplejía y otros trastornos relacionados con el infarto. El compuesto se administra justo antes, al mismo tiempo, o justo después de la administración parenteral de tPA u otro agente fibrinolítico. Puede resultar conveniente continuar el tratamiento con el compuesto durante un buen periodo de tiempo después de verificar la reperfusión, para inhibir de forma máxima la reoclusión posterapia. La dosis eficaz de tPA, SK, UK o pUK puede ser de 0,5 a 5 mg/kg y la dosis eficaz del compuesto puede ser de aproximadamente 0,1 a 25 mg/kg.
Para la administración conveniente del inhibidor y el agente fibrinolítico al mismo tiempo o en tiempos diferentes, se prepara un kit que comprende un solo envase, tal como una caja, vasito u otro envase, botellas individuales, bolsas, viales u otros envases que cada uno tiene una cantidad eficaz del inhibidor para administración parenteral, como se ha descrito antes, y una cantidad eficaz de tPA, u otro agente fibrinolítico, para administración parenteral, como se ha descrito antes. Dicho kit puede comprender, por ejemplo, ambos agentes farmacéuticos en envases separados o en el mismo envase, opcionalmente como tapones liofilizados, y envases de soluciones para reconstituir. Una variación de esto, es incluir la solución para reconstituir y el tapón liofilizado en dos cámaras de un solo envase, que se puede hacer que se mezclen antes de usar. Con dicha disposición, el agente fibrinolítico y el compuesto se pueden empaquetar por separado, tal como en dos envases, o liofilizar juntos en forma de un polvo y suministrarlos en un solo envase.
Cuando se proporcionan ambos agentes en forma de solución, se pueden poner en un sistema de infusión/inyección para administración simultánea o de manera sucesiva. Por ejemplo, el inhibidor de la agregación de plaquetas, puede estar en forma para inyección i.v., o en una bolsa de infusión unida en serie, mediante un tubo, al agente fibrinolítico en una segunda bolsa de infusión. Usando dicho sistema, un paciente puede recibir una infusión o inyección de tipo bolo inicial, del inhibidor, seguido de una infusión del agente fibrinolítico.
La actividad farmacológica de los compuestos de esta invención se evalúa por su capacidad para inhibir la unión de ^{3}H-SK&F 107260, un antagonista de RGD-fibrinógeno conocido, al receptor GPIIb-IIIA; su capacidad para inhibir la agregación de plaquetas in vitro, y su capacidad para inhibir la formación de trombo in vivo.
Inhibición de la unión a GPIIb-IIIa mediada por RGD
La inhibición de la unión a GPIIb-IIIa mediada por RGD se demostró evaluando la capacidad de los compuestos para inhibir la unión de ^{3}H-SK&F 107260, un antagonista de RGD-fibrinógeno conocido, al receptor GPIIb-IIIA, de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 93/00095 (PCT/US/92/05463).
Inhibición de la agregación de plaquetas
La inhibición de la agregación de plaquetas se demostró siguiendo el procedimiento descrito en el documento WO 93/00095 (PCT/US/92/05463).
Los compuestos de esta invención en general inhiben la agregación de plaquetas humanas estimulada por ADP con CI50 menor que 0,1 \muM. El compuesto del Ejemplo 3 tiene una CI50 entre 0,2 y 11 \muM.
Para evaluar la estabilidad de los compuestos frente a las proteasas del plasma, los compuestos se incubaron durante 3 h (en lugar de 3 min) en el PRP antes de añadir el agonista.
Inhibición in vivo de la agregación de plaquetas
La inhibición in vivo de la formación de trombo se demuestra registrando los efectos sistémicos y hemodinámicos de la infusión de los compuestos en perros anestesiados, de acuerdo con los métodos descritos por Aiken et al., Prostaglandins, 19, 629 (1980). Alternativamente, la inhibición de la formación de trombo y la biodisponiblidad se pueden medir por el método descrito por Nichols et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 270, 614 (1994).
Los siguientes ejemplos no se pretende que limiten de ninguna forma el alcance de esta invención, sino que se proporcionan para ilustrar como preparar y usar los compuestos de esta invención. Muchas otras realizaciones serán fácilmente evidentes y estarán disponibles para los expertos en la técnica.
Ejemplos
En los Ejemplos, todas las temperaturas están en grados centígrados. Los espectros de masas se llevaron a cabo usando bombardeo de átomos rápidos (FAB) o ionización por electropulverización (ES). Los puntos de fusión se midieron en un aparato de punto de fusión capilar Thomas-Hoover, y no están corregidos.
La RMN se registró a 250 MHz usando un espectrómetro Bruker AM 250, salvo que se indique otra cosa. Los desplazamientos químicos se dan en ppm (\delta) a campo bajo del tetrametilsilano. Las multiplicidades de los espectros de RMN se indican como: s = singlete, d = doblete, t = triplete, c = cuartete, m = multiplete, dd = doblete de dobletes, dt = doblete de tripletes etc., y an indica una señal ancha. J indica la constante de acoplamiento de RMN en Hertzios.
Celite® es un coadyuvante de filtración compuesto de sílice de diatomeas lavada con ácido, y es una marca registrada de Mansville Corp., Denver, Colorado. Florosil® es un soporte cromatográfico de silicato magnésico, y es una marca registrada de Floridon Co., Pittsburgh, Pensilvania. Se usaron placas de capa fina de gel de sílice Analtech GF y gel de sílice EM para la cromatografía en capa fina. Tanto la cromatografía ultrarrápida como por gravedad se llevaron a cabo en gel de sílice Merck 60 (malla nº 230-400). ODS se refiere a un soporte cromatográfico de gel de sílice derivatizada con octadecilsililo. AN/W-TFA indica un sistema de eluyente isocrático del porcentaje indicado de acetonitrilo en agua con TFA al 0,1%. Apex-ODS 5 \mu indica un soporte de gel de sílice derivatizado con octadecilsilano, que tiene un tamaño de partículas nominal de 5 \mu, hecho por Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ® es un soporte cromatográfico ODS y es una marca registrada de YMC Co. Ltd. Kyoto, Japón. PRP-1® es un soporte cromatográfico polímero (estireno-divinilbenceno) y es una marca registrada de Hamilton Co., Reno, Nevada.
Preparación 1 Preparación de ácido (R,S)-7-[[[4-(aminoiminometil)fenil] -metilamino]carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-2-(2-feniletil) -1H-2-benzacepina-4-acético a) 3-Bromo-4-metilbenzoato de t-butilo
Se añadió gota a gota dimetilacetal de la dimetilformamida (48 ml, 200 mmoles) en 15 min a una suspensión de ácido 3-bromo-4-metilbenzoico (85%; 10,75 g, 42,5 mmoles) en tolueno (100 ml) a 70ºC. La reacción se agitó a 70-80ºC durante 0,5 h adicionales, después se enfrió, se lavó secuencialmente con agua y bicarbonato sódico al 5%, y se secó (sulfato sódico). La mezcla se filtró por una almohadilla de gel de sílice, y la almohadilla de filtración se lavó con tolueno. El filtrado se concentró para dar el compuesto del título (8,0 g, 69%) en forma de un aceite amarillo. TLC (tolueno) R_{f} 0,68.
b) 3-Bromo-4-(bromometil)benzoato de t-butilo
Una mezcla del compuesto de la Preparación 1 (a) (1,36 g, 5 mmoles), N-bromosuccinimida (0,98 g, 5,5 mmoles), y peróxido de benzoilo (61 mg, 0,25 mmoles) en tetracloruro de carbono (25 ml), se calentó a reflujo. Después de 4 h, la mezcla se enfrió y filtró, y el filtrado se concentró. El material resultante se usó sin purificación. TLC R_{f} 0,39 (acetato de etilo:hexano 5:95).
c) 3-Bromo-4-[[(2-feniletil)amino]metil]-benzoato de t-butilo
Se disolvió el compuesto de la Preparación 1 (b) en éter seco (25 ml), y se añadió fenetilamina (1,9 mI, 15 mmoles). La adición era ligeramente exotérmica, y la reacción se volvió turbia. La reacción se agitó a t.a. toda la noche, después se diluyó con éter (75 ml) y se lavó secuencialmente con bicarbonato sódico al 5% y salmuera (25 ml). El secado (MgSO_{4}), concentración, y cromatografía en gel de sílice (acetato de etilo/hexano al 33%), dieron el compuesto del título (1,26 g, 65%) en forma de un aceite amarillo pálido. TLC R_{f} 0,42 (acetato de etilo;hexano 30:70).
d) 3-Bromo-4-[[[N-(2-feniletil)-N-t-butoxicarbonil]amino]metil]benzoato de t-butilo
Se añadió dicarbonato de di-t-butilo (845 mg, 3,88 mmoles) todo de una vez a una solución del compuesto de la Preparación 1 (c) (1,26 g, 3,23 mmoles) en cloroformo (16 ml) a t.a. La reacción se agitó a t.a. durante 5 h, y después a reflujo durante 0,5 h. La concentración y cromatografía (gel de sílice, acetato de etilo/hexano al 10%) dieron el compuesto del título (1,57 g, 99%) en forma de un aceite incoloro que solidificó a vacío. TLC R_{f} 0,49 (acetato de etilo:hexano 10:90).
e) 3-Metoxicarbonil-4-[[5-(t-butoxicarbonil)-2-[[N-(2-feniletil) -N-t-(butoxi-carbonil)]amino]metil]-fenil]-2-butenoato de metilo y 3-metoxicarbonil-4-[[5-(t-butoxicarbonil)-2-[[N-(2-feniletil) -N-t-butoxicarbonil)]amino]metil]fenil]-3-butenoato de metilo
Una mezcla del compuesto de la Preparación 1 (d) (1,34 g, 2,73 mmoles), itaconato de dimetilo (648 mg, 4,10 mmoles), acetato de paladio (II) (30,7 mg, 0, 14 mmoles), tri-o-tolilfosfina (83,2 mg, 0,27 mmoles), trietilamina seca (0,76 ml, 5,46 mmoles) y acetonitrilo seco (27 ml), se desoxigenó por un ciclo de vaciado/purgado con argón, y después se calentó a reflujo en atmósfera de argón. Después de 6 h, la reacción se enfrió, y se añadió más acetato de paladio (II) (30,7 mg, 0,14 mmoles) y tri-o-tolilfosfina (83,2 mg, 0,27 mmoles). La mezcla se desoxigenó mediante tres ciclos de vaciado/purgado con argón, y después se calentó a reflujo en atmósfera de argón toda la noche (16,5 h). La reacción se concentró, y el residuo se disolvió en éter y se lavó con agua y salmuera. El secado (MgSO_{4}), concentración, y cromatografía (gel de sílice, acetato de etilo/hexano al 15%; después acetato de etilo/hexano al 40%) dieron el compuesto del título bruto en forma de un aceite amarillo. El residuo se volvió a cromatografiar (gel de sílice, acetato de etilo/hexano al 25%) para dar el compuesto del título (1,36 g, 88%) en forma de un aceite amarillo claro. Este material se usó sin separación de los productos de reacción isómeros.
f) 3-Metoxicarbonil-4-[5-(t-butoxicarbonil)-2-[[[N-(2-feniletil) -N-t-butoxicarbonil]amino]metil]-fenil]butanoato de metilo
El compuesto de la Preparación 1 (e) (1,18 g, 2,08 mmoles) se disolvió en metanol anhidro (21 ml), y se añadió hidróxido de paladio (II) sobre carbón (0,21 g). La mezcla resultante se agitó a t.a. en atmósfera de H_{2} (3,29 kg/cm^{2}), y después se filtró a través de Celite®. El filtrado se concentró y se volvió a someter a las mismas condiciones de reacción. Después de otras 5,5 h, la mezcla se filtró como antes, y el filtrado se concentró para dar el compuesto del título (1,13 g, 95%) en forma de un aceite incoloro.
g) (R,S)-7-Carboxi-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-2-(2-feniletil) -1H-2-benzazepina-4-acetato de metilo
Se añadió TFA (11 ml), todo de una vez, a una solución turbia del compuesto de la Preparación 1 (f) (1,30 g, 2,28 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (11 ml) a 0ºC en atmósfera de argón. La solución amarillo claro resultante se calentó a t.a., se agitó durante 2 h y se concentró. El residuo se concentró una vez de 1,2-dicloroetano para separar el TFA residual y dar el 3-metoxicarbonil-4-[5-carboxi-2-[[N-(2-feniletil)amino]metil]fenil]butanoato de metilo en forma de un aceite verde pálido.
El aceite se disolvió en metanol anhidro (11 ml), y la solución se enfrió a 0ºC en atmósfera de argón. Se añadió metóxido sódico/metanol 1,0 M (11 ml, 11 mmoles) recién preparado, y se quitó el baño de hielo. La solución amarilla se dejó calentar a t.a. durante 5 min y se calentó a reflujo en atmósfera de argón. Después de 3 h, la reacción se enfrió con hielo y se hidrolizó con ácido acético glacial (1,3 ml, 22,8 mmoles). La reacción se diluyó con acetato de etilo (100 ml) y se lavó con agua. Las capas acuosas combinadas se volvieron a extraer con acetato de etilo, y las capas de acetato de etilo combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO_{4}), y se concentraron hasta un residuo verde pálido. La cromatografía (gel de sílice, metanol/cloroformo/(ácido acético al 0,1%) al 10%) dio el compuesto del título en forma de una espuma amarilla. La cristalización en metanol que contenía un poco de cloroformo dio el compuesto del título (528,2 mg, 61%) en forma de un sólido de color hueso, p.f. 214-216ºC; TLC R_{f} 0,49 (metanol:cloroformo 10:90).
h) (R,S)-7-[[[4-[N-(Benciloxicarbonil)-aminoiminometil]fenil]metilamino] carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-2-(2-feniletil)-1H-2-benzazepina-4-acetato de metilo
El compuesto de la Preparación 1 (g) (117,9 mg, 0,31 mmoles) se refluyó con cloruro de tionilo (3 ml) durante 15 min y la solución amarilla se concentró. El residuo se concentró en tolueno seco (3 ml) para separar el cloruro de tionilo residual, y el material resultante se disolvió en CH_{2}Cl_{2} seco (0,5 ml). La solución se añadió gota a gota en 1-2 min a una solución de 4-(metilamino)-(N-benciloxicarbonil)benzamidina (263 mg, 0,93 mmoles) y piridina anhidra (0,125 ml, 1,55 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} seco (10 ml) a 0ºC en atmósfera de argón. La mezcla amarilla resultante se calentó a t.a. y se agitó durante 0,5 h, se diluyó con acetato de etilo, y se lavó con bicarbonato sódico al 5%. El secado (sulfato sódico), concentración, y cromatografía (gel de sílice, acetato de etilo/tolueno al 10%) dieron el compuesto del título (174,8 mg, 87%) en forma de un aceite ligeramente amarillo. TLC R_{f} 0,45 (tolueno:acetato de etilo 9:1).
i) (R,S)-7-[[[4-(Aminoiminometil)fenil]metilamino]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-2-(2-feniletil)-1H-2-benzazepina-4-acetato de metilo
Se añadió cuidadosamente paladio sobre carbón al 10% (58 mg, 0,054 mmoles) a una solución del compuesto de la Preparación 1 (h) (174,8 mg, 0,27 mmoles) y TFA (0,021 mI, 0,27 mmoles) en acetato de etilo/metanol (1:1, 9 ml), y la mezcla se agitó enérgicamente en atmósfera de hidrógeno (presión de balón). Después de 1,5 h, la mezcla se filtró a través de Celite®, y la almohadilla de filtración se lavó bien con acetato de etilo y metanol. La concentración dio el compuesto del título.
j) Ácido (R,S)-7-[[[4-(aminoiminometil)fenil]metilamino]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-2-(2-feniletil)-1H-2-benzazepina-4-acético
El compuesto de la Preparación 1 (i) se disolvió en metanol (9 ml), y se añadió hidróxido sódico 1,0 N (0,81 ml, 0,81 mmoles). La solución se agitó a t.a. toda la noche, y después se concentró. El residuo se disolvió en agua/acetonitrilo (3 ml), se enfrió a 0ºC, y se acidificó con TFA (0,21 ml, 2,7 mmoles). La solución ligeramente amarilla se concentró, y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida de fase inversa (gel de sílice C18, AN/W-TFA al 25%). La concentración y liofilización dieron el compuesto del título (123 mg, 67%) en forma de un polvo incoloro.
Los siguientes Ejemplos ilustran la forma de preparar compuestos farmacológicamente activos y composiciones de la invención.
Ejemplo de referencia 1
Preparación de ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -4-[2-(ciclohexil)etil]-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético a) (R,S)-7-Carboxi-4-[2-(ciclohexil)etil]-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-1H- 1,4- benzodiazepina-2-acetato de metilo
Una solución de (R,S)-7-carboxi-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-4-(2-feniletil) -1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo (1,2 mmoles) y ácido clorhídrico 0,6 N (4,0 ml) en metanol (50 ml) se trató con óxido de platino (120 mg) y se hidrogenó (3,15 kg/cm^{2}), y la mezcla se filtró y concentró para dar el compuesto del título.
b) (R,S)-7-[(N-(t-Butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -[2-(ciclohexil)etil]-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-4-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
El compuesto del Ejemplo de referencia 1 (a) (2,0 mmoles) disuelto en DMF (30 ml) se trató con EDC (2,2 mmoles) y 1-HOBT (285 mg, 2,1 mmoles). Esta mezcla se trató con N-(t-butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidina (2,4 mmoles), se agitó a t.a. durante 48 h, se concentró, y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar el compuesto del título.
c) (R,S)-7-[(4,4'-Bipiperidin-1-il)carbonil]-4-[2-(cicIohexil)etil] -2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
El compuesto del Ejemplo de referencia 1 (b) (0,56 mmoles) se disolvió en una mezcla de CH_{2}Cl_{2} (25 ml) y TFA (5 ml). Después de 1 h, la mezcla se concentró para dar el compuesto del título.
d) Ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-4-[2-(ciclohexil)etil] -2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
El compuesto del Ejemplo de referencia 1 (c) (0,3 mmoles) se suspendió en acetona (2 ml) y se trató con hidrato de hidróxido de litio (25 mg) en agua (2 ml). La mezcla se agitó toda la noche, se trató con metanol y se añadió hidrato de hidróxido de litio adicional (5,5 mg) en dos porciones en 9 h. La mezcla se concentró y el residuo acuoso se neutralizó con ácido clorhídrico y se concentró. El residuo se puso en el frigorífico toda la noche y se filtró. La torta de filtración se lavó con agua fría, acetona y éter para dar el compuesto del título. Análisis de [C_{30}H_{44}N_{4}O_{4}.2,5(C_{2}HF_{3}O_{2}).2(H_{2}O)] calculado: C, 49,70; H, 6,02; N, 6,62. Encontrado: C, 49,43; H, 6,02; N, 6,62.
Ejemplo 2 Preparación de ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético a) 3-Metil-4-nitrobenzoato de t-butilo
Se añadió ácido 3-metil-4-nitrobenzoico (500 g, 2,76 moles) a piridina (1,25 litros) y se agitó hasta que se disolvió. Se añadió cloruro de bencenosulfonilo (609 g, 3,45 moles) rápidamente mientras se mantenía la temperatura interna a <30ºC con un baño de hielo. Se formó un precipitado hacia el final de la adición, y se añadió piridina (500 ml) para mejorar la agitación. La mezcla se agitó durante 30 min y se añadió gota a gota t-butanol (523 ml) en 30 min a <30ºC. La mezcla se agitó durante 2 h, se disolvió en hexano:acetato de etilo (4:1, 2,5 litros) y la mezcla resultante se extrajo con agua. La fase orgánica se concentró para dar un aceite amarillo claro, el cual cristalizó al enfriar para dar el compuesto del título (635 g, 97%). P.f. 56-58ºC.
b) 3-Bromometil-4-nitrobenzoato de t-butilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (a) (635 g, 2,68 moles) en tetracloruro de carbono (6 litros) se agitó y se trató con N-bromosuccinimida (476,5 g, 2,68 moles). La mezcla se irradió y se calentó a reflujo con 3 proyectores situados debajo del nivel de la solución. Se añadió peróxido de benzoilo (6 g) en cuatro porciones mientras la mezcla se calentaba a reflujo, y la última porción se añadió cuando empezó el reflujo después de 2 h. La mezcla se irradió a reflujo durante 12 h, se enfrió, se dejó reposar varias horas, se filtró y se concentró hasta un aceite marrón (870,7 g). El aceite se recogió en hexano (3 litros) y éter (500 ml) (hirviendo), se filtró y el filtrado se concentró parcialmente por ebullición. La solución resultante se dejó reposar toda la noche y el sólido cristalino de color hueso que se formó se filtró, se lavó con hexano y se secó para dar el compuesto del título (396,6 g, 46,8%). P.f. 80-83ºC; ^{1}H RMN (250 MHz) \delta 4,5 (2H); TLC R_{f} 0,7 (gel de sílice, acetato de etilo/hexano 1:9). El filtrado dio una segunda cosecha al reposar (73 g). P.f. 61-65ºC.
c) 3-(Metilamino)metil-4-nitrobenzoato de t-butilo
Se añadió metilamina acuosa al 40% (623 ml) a dimetilformamida (2,5 litros) agitada a -5ºC en un baño de acetona/hielo. Se añadió gota a gota una solución del compuesto del Ejemplo 2 (b) (238 g, 0,753 moles) en acetato de etilo (600 ml) en 1 h, mientras se mantenía la temperatura interna entre 0ºC y -5ºC. La mezcla de reacción amarillo claro se agitó durante 30 min adicionales y se diluyó con un volumen igual de agua. Se añadió hexano, la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con hexano. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua y se concentraron para dar el compuesto del título (217,8 g) en forma de un aceite amarillo brillante.
d) 3-[N-(t-Butoxicarbonil)-(metilamino)-metil]-4-nitrobenzoato de t- butilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (c) (0,753 moles) en acetato de etilo (1 litro) se agitó y se trató con dicarbonato de di-t-butilo (180,8 g, 0,828 moles) el cual se añadió en porciones. Se produjo una reacción vigorosa con evolución de gas rápida que cesó después de la adición final del dicarbonato. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min adicionales, y se extrajo con carbonato sódico acuoso al 4% y con agua. La fase orgánica se concentró para dar un aceite amarillo claro, el cual se disolvió en hexano y se enfrió en un baño de hielo seco/acetona para iniciar la cristalización. La mezcla se almacenó en el frigorífico, se filtró y se secó para dar el compuesto del título (129 g, 47%) que se usó en la siguiente etapa. P.f. 56-58ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 8,05 (2H, s), 7,95 (1H, s), 4,8 (2H, d), 2,9 (2H, s), 1,6 (9H, s), 1,5 (9H, s); HPLC t_{R} 27 min (Zorbax RX C_{18}, gradiente, 4,6 X 150 mm, A: metanol B: agua-TFA al 0,1%, metanol 50-90% durante 40 min, detección UV a 210 nm).
e) 4-Amino-3-[N-(t-butoxicarbonil)-(metilamino)metil]benzoato de t-butilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (d) (129 g, 0,352 moles) en acetato de etilo/metanol (1:1, 1,5 litros) se trató con Pd/C al 10% (40 g) humedecido con acetato de etilo, en atmósfera de argón en una botella de hidrogenación. La botella se purgó con hidrógeno y se agitó hasta que se absorbió la cantidad teórica de hidrógeno. La mezcla se filtró a través de Celite® y el filtrado que contenía el compuesto del título se usó en la siguiente etapa.
f) (E/Z)-3-[N-(t-Butoxicarbonil)(metilamino)metil] -4-[2-(1,4-dimetoxi-1,4-dioxo-2-butenil)amino]benzoato de t-butilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (e) (118,3 g, 0,352 moles) en metanol:acetato de etilo (1,5 litros) se agitó a t.a. en atmósfera de argón y se añadió gota a gota acetilendicarboxilato de dimetilo (50 g, 0,352 moles) en 30 min, y la mezcla se calentó a reflujo durante 16 h. La mezcla se enfrió y se añadió acetilendicarboxilato de dimetilo (6,0 ml, 0,0488 moles) en una porción. La mezcla de reacción se calentó a reflujo 2,5 h. La solución resultante que contenía el compuesto del título se enfrió y se usó en la siguiente etapa.
g) (R,S)-3-[N-(t-Butoxicarbonil)-(metilamino)-metil] -4-[2-(1,4-dimetoxi-1,4-dioxobutil)amino]benzoato de t-butilo
Una solución del Ejemplo 2 (f) (\sim168 g, 0,352 moles) en acetato de etilo:metanol (1,5 litros) se añadió a Pd/C al 10% (20 g) humedecido con acetato de etilo en atmósfera de argón en una botella de hidrogenación. La mezcla se agitó en atmósfera de hidrógeno y se calentó a 48ºC hasta que se absorbió la cantidad teórica de hidrógeno, se enfrió, se ventiló, se filtró a través de Celite®, y el filtrado se concentró para dar el compuesto del título (173,4 g) en forma de un aceite amarillo. HPLC t_{R} 18,9 min (Zorbax RX C18, 4,6 X 150 mm, 1 ml/min, gradiente, A: metanol B: agua-TFA al 0,1%, metanol 50-90% en 40 min, detección UV a 210 nm).
h) (R,S)-4-[2-(1,4-Dimetoxi-1,4-dioxobutil)amino]-3-[(metilamino)metil] -benzoato
Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (g) (0,348 moles) en diclorometano (500 ml) se añadió en 30 min a una solución agitada de TFA (684 ml) y diclorometano (1550 ml); la temperatura interna era entre 18ºC-25ºC. La solución se agitó toda la noche a t.a. y se concentró para dar el compuesto del título (254,6 g) en forma de un aceite marrón. HPLC t_{R} 19 min (columna Zorbax RX C_{18}, 4,6 X 150 mm, gradiente, 1 ml/min, A: metanol B: agua-TFA al 0,1%, metanol 10-60% en 50 min, detección UV a 210 nm).
i) (R,S)-7-Carboxi-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiaze- pina -2-acetato de metilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (h) [112,7 g (0,348 moles) con TFA (141,9 g)] en metanol (2 litros) se enfrió entre 0ºC y -5ºC y se agitó en atmósfera de argón. Se añadió metóxido sódico en metanol (al 25%; 396 ml, 1,94 moles) en 2 h, manteniendo la temperatura interna entre 0ºC y -5ºC. Después de la adición, se dejó que la temperatura subiera lentamente y la mezcla se agitó durante 45 min. Se añadió ácido acético glacial (42 ml) a la mezcla de reacción seguido de agua (1,5 litros). Se empezó a formar un precipitado cristalino y el pH de la mezcla se ajustó a 4,5 por adiciones cuidadosas de ácido clorhídrico 12 N. La mezcla se agitó unos min, se filtró y el precipitado se lavó con agua y se secó a vacío para dar el compuesto del título. (77,6 g, 76%). ^{1}H RMN (250 MHz, DMSO_{d6}) \delta 7,5 (2H, m), 6,5 (2H, m), 5,5 (1H, d), 5,2 (1H, m), 3,9 (1H, d), 3,6 (3H, s), 2,9 (3H, s), 2,9-2,6 (2H, m); p.f. 276-277ºC, HPLC t_{R} 23,2 min (Zorbax RX C_{18}, 4,6 x 150 mm, 1 ml/min, gradiente, A: metanol B: agua-TFA al 0,1%, metanol 10-60% en 50 min, detección UV a 210 nm); Análisis (C_{14}H_{16}N_{2}O_{5}) calculado: C, 57,53; H, 5,52; N, 9,58. Encontrado: C, 57,27; H, 5,41; N, 9,17; p.f. 280-280,5ºC (desc.).
j) (R,S)-7-[[1'-(t-Butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidin-1-il]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
El uso del procedimiento del Ejemplo de referencia 1 (b), pero sustituyendo el (R,S)-7-carboxi-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-4-(2-ciclohexiletil) -1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo por el compuesto del Ejemplo 2 (i), dio el compuesto del título.
k) (R,S)-7-[(4,4'-Bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
El uso del procedimiento del Ejemplo de referencia 1 (c), excepto sustituyendo el compuesto del Ejemplo de referencia 1 (b) por el compuesto del Ejemplo 2 (j), dio el compuesto del título.
l) Ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4- metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
El uso del procedimiento del Ejemplo de referencia 1 (d), excepto sustituyendo el compuesto del Ejemplo de referencia 1 (c) por el compuesto del Ejemplo 2 (k), y sustituyendo el hidróxido de litio por hidróxido sódico, dio el compuesto del título. Análisis [C_{23}H_{32}N_{4}O_{4}.2(C_{2}HF_{3}O_{2})].2,5(H_{2}O)] calculado: C, 46,22; H, 5,46; N, 7,99. Encontrado: C, 46,33; H, 5,45; N, 7,97.
Ejemplos 3-4
Preparación del ácido (R)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético; y ácido (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético a) El compuesto del Ejemplo 2 (j) se separó por HPLC quiral para dar los siguientes compuestos:
3 (a) (R)-7-[[1'-(t-butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidin-1-il]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo. [\alpha]_{D} +140 (c 1, CH_{3}OH); HPLC t_{R} 12,9 min (Chiralcel OD, 21,2 x 250 mm, 10 ml/min, metanol, detección UV a 325 nm).
4 (a) (S)-7-[[1'-(t-butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidin-1-il]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo. [\alpha]_{D} -142,5 (c 1, CH_{3}OH); HPLC t_{R} 15,1 min (Chiralcel OD, 21,2 x 250 mm, 10 ml/min, metanol, detección UV a 325 nm).
b) El uso del procedimiento del Ejemplo 2 (k), excepto sustituyendo el compuesto del Ejemplo 2 (j) por los compuestos del Ejemplo 3 (a) y 4 (a), dio los siguientes compuestos:
3 (b) (R)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo. HPLC t_{R} 14,3 min (Ultrasphere C_{18}, 4,6 x 250 mm, 1,5 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo B: agua-TFA al 0,1%, acetonitrilo 5-60% en 20 min, detección UV a 220 nm).
4 (b) (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo. HPLC t_{R} 14,61 min (Ultrasphere C_{18}, 4,6 x 250 mm, 1,5 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo B: agua-TFA al 0,1%, acetonitrilo 5-60% en 20 min, detección UV a 220 nm).
c) El uso del procedimiento de Preparación 1 (j), excepto sustituyendo el compuesto de la Preparación 1 (i) por los compuestos del Ejemplo 3 (b) y 4 (b), dio los siguientes compuestos:
3 (c) ácido (R)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético: [\alpha]_{D} +92,4 (c 0,5, CH_{3}OH); EM(ES) m/e 429 [M+H]^{+}; 427 [M-H]^{-}; HPLC t_{R} 12,7 min (Ultrasphere C_{18}, 4,6 x 250 mm, 1,5 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo B: agua-TFA al 0,1%, acetonitrilo 5-60% en 20 min, detección UV a 220 nm); análisis (C_{23}H_{32}N_{4}O_{4}.4,5CF_{3}CO_{2}H.3,33H_{2}O) Calculado: C, 37,44; H, 4,16; N, 5,29. Encontrado: C, 37,43; H, 3,81; N, 5,20.
4 (c) ácido (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético: [\alpha]_{D} -105,9 (c 0,6, CH_{3}OH); EM(ES) m/e 429 [M+H]^{+}; 427 [M-H]^{-}; HPLC t_{R} 12,6 min (Ultrasphere C_{18}, 4,6 x 250 mm, 1,5 ml/min, gradiente, A: acetonitrilo B: agua-TFA al 0,1%, acetonitrilo 5-60% en 20 min, detección UV a 220 nm); Análisis (C_{23}H_{32}N_{4}O_{4}.3CF_{3}CO_{2}H.1,25H_{2}O) Calculado: C, 43,92; H, 4,77; N, 7,06. Encontrado: C, 44,09; H, 5,001; N, 7,29.
Ejemplo 5 Preparación de ácido (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético a) Ácido 4-fluoro-3-metilbenzoico
Una solución de bromuro de 4-fluoro-3-metilfenilmagnesio en THF (1,0 M, 250 ml, 250 mmoles) se añadió en una corriente en 5 min a una mezcla de hielo seco (10 g) en THF seco (250 ml), y la reacción se dejó calentar a t.a. y se concentró. El residuo se repartió entre agua (500 ml) y éter (250 ml), y las capas se separaron. La capa acuosa se lavó con éter (2 x 250 ml), y se acidificó a pH 1 con ácido clorhídrico concentrado. La mezcla resultante se enfrió en un baño de hielo y se filtró. El sólido se lavó con agua y se secó para dar el compuesto del título (25,92 g, 67%) en forma de un sólido de color hueso: ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,90-8,02 (m, 2H), 7,09 (t, J=8,9 Hz, 1H), 2,34 (d, J=1,7 Hz, 3H); IR (cloroformo) 3400-2300 (ancho), 1694 cm^{-1}; EM(ES) m/e 155 [M+H]^{+}; m/e 153 [M-H]^{-}.
b) 4-Fluoro-3-metilbenzoato de t-butilo
Se burbujeó isobutileno en una suspensión del compuesto del Ejemplo 5 (a) (3,08 g, 20 mmoles) en éter anhidro (15 ml) en una botella de presión a -78ºC, para dar un volumen de reacción de 50 ml. Se añadió gota a gota ácido trifluorometanosulfónico (0,09 ml, 1 mmol), y el recipiente se cerró herméticamente y se calentó a t.a. Después de 4 h, la reacción se enfrió y el recipiente se abrió. Se añadió bicarbonato sódico acuoso al 5%, y la mezcla se agitó en un baño de agua caliente para eliminar el exceso de isobutileno. Se añadió éter y las capas se separaron. La capa de éter se lavó con bicarbonato sódico al 5% y con salmuera, y se secó (MgSO_{4}). La concentración dio el compuesto del título (3,83 g, 91%) en forma de un aceite amarillo que se usó sin purificación adicional. TLC (tolueno) R_{f} 0,73; ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,77-7,89 (m,2H), 7,01 (t, J=8,9 Hz, 1H), 2,30 (d, J=1,8 Hz, 3H), 1,59 (s, 9H); IR (CCl_{4}) 1715, 1369, 1296, 1258, 1167, 1124, 1117, 1105 cm^{-1}; EM(ES) m/e 443 [2M+Na]^{+}, 421 [2M+H]^{+}, 211 [M+H]^{+}, 155 [M+H-C_{4}H_{8}]^{+}.
c) 4-Fluoro-3-(metilaminometil)benzoato de t-butilo
Una mezcla del compuesto del Ejemplo 5 (b) (3,83 g, 18,22 mmoles), N-bromosuccinimida (3,57 g, 20,24 mmoles), peróxido de benzoilo (0,22 g, 0,91 mmoles), y tetracloruro de carbono (90 ml), se calentó a reflujo. Después de 16 h, la reacción se enfrió en un baño de hielo, se filtró, y el filtrado se concentró. El residuo se pasó por una almohadilla corta de gel de sílice la cual después se lavó con acetato de etilo:hexano al 20%, y el filtrado se concentró. El residuo se disolvió en THF (90 ml), y se añadió rápidamente metilamina acuosa al 40% (7,9 ml, 91,1 mmoles). La reacción se agitó toda la noche y se concentró. El residuo se diluyó con éter y se lavó secuencialmente con hidróxido sódico 1,0 N, agua, y salmuera. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se concentró, y el residuo se cromatografió (gel de sílice, metanol al 10% en acetato de etilo:cloroformo 1:1) para dar el compuesto del título (2,58 g, 59%) en forma de un aceite amarillo: TLC R_{f} 0,49 (gel de sílice, metanol al 10% en acetato de etilo/cloroformo 1:1); ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,97 (dd, J=7,3, 2,3 Hz, 1H), 7,90 (ddd, J=8,4, 5,2, 2,3 Hz, 1H), 7,07 (t ap., 1H), 3,83 (s, 2H), 2,46 (s, 3H), 1,59 (s, 9H); IR (CCl_{4}) 1714, 1368, 1297, 1248, 1164, 1106 cm^{-1}; EM(ES) m/e 240 [M+H]^{+}, 184 [M+H-C_{4}H_{8}]^{+}.
d) (S)-4-Fluoro-3-[[[4-metoxi-1,4-dioxo-2- [[benciloxicarbonil]amino]butil] -metilamino]metil]benzoato de t-butilo
Se añadió diciclohexilcarbodiimida (453,9 mg, 2,2 mmoles) a una solución del compuesto del Ejemplo 5 (c) (478,6 mg, 2 mmoles), éster \beta-metílico del ácido N-Cbz-L-aspártico [J. Am. Chem. Soc., 79, 5697 (1957); J. Am. Chem. Soc., 85, 2483 (1963)] (618,8 mg, 2,2 mmoles), e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (297,3 mg, 2,2 mmoles) en dimetilformamida anhidra (5 ml) a t.a. Después de 24 h, la mezcla se diluyó con éter (25 ml) y se filtró. El filtrado se concentró, y el residuo se diluyó con éter (50 ml) y se lavó con agua (2 x 10 ml) y salmuera (10 ml). El secado (MgSO_{4}), concentración y cromatografía (gel de sílice, hexano:acetato de etilo 2:1) dieron el compuesto del título (0,87 g, 87%) en forma de un aceite incoloro: TLC R_{f} 0,44 (gel de sílice, hexano:acetato de etilo 2:1); ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) mezcla de rotámeros de la amida; \delta 7,75-8,00 (m, 2H), 7,15-7,45 (m, 5H), 7,00-7,15 (m, 1H), 5,72-5,92 (m, 1H), 4,91-5,25 (m, 3H), 4,45-4,63 (m, 2H), 3,66 (s, 3H), 3,13 y 2,89 (2 x s, 3H), 2,58-2,94 (m, 2H), 1,56 (s, 9H); IR (CCl_{4}) 3415, 3260, 1736, 1716, 1652, 1497, 1368, 1296, 1252, 1207, 1163, 1117,1109 cm^{-1}; EM (ES) m/e 1027 [2M+Na]^{+}, 1005 [2M + H]^{+}, 503 [M+H]^{+}, 447 [M+H-C_{4}H_{8}]^{+}.
e) (S)-4-fluoro-3-[[[4-metoxi-1,4-dioxo-2-aminobutil]metilamino]metil] -benzoato de t-butilo
Una mezcla del compuesto del Ejemplo 5 (d) (0,87 g, 1,73 mmoles), Pd/C al 10% (184 mg, 0,17 mmoles), y metanol (17 ml) se agitó a t.a. en atmósfera de hidrógeno (3,5 kg/cm^{2}). Después de 1,5 h, la reacción se filtró a través de Celite® y se concentró. La cromatografía (gel de sílice, metanol al 10% en acetato de etilo:cloroformo 1:1) dio el compuesto del título (579,8 mg, 91%) en forma de un aceite incoloro: TLC R_{f} 0,50 (gel de sílice, metanol al 10% en acetato de etilo:cloroformo 1:1). ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) mezcla de rotámeros de la amida; \delta 7,80-8,05 (m, 2H), 7,02-7,18 (m, 1H), 4,55-4,88 (m, 2H), 4,15-4,28 (m, 1H), 3,71 y 3,70 (2 x s, 3H), 3,11 y 2,95 (2 x s, 3H), 2,76 (dd, J=16,3, 5,4 Hz, 1H), 2,48-2,67 (m,1H), 1,74 y 1,57 (2 x s, 9H); IR (CCl_{4}) 3380, 1735, 1717, 1653, 1370, 1298, 1253, 1164, 1112 cm^{-1}; EM(ES) m/e 369 [M+H]^{+}, 313 [M+H-C_{4}H_{8}]^{+}.
f) (S)-(-)-2,3,4,5-Terahidro-7-(t-butoxicarbonil)-4-metil-3-oxo-1H -1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 5(e) (416,1 mg, 1,13 mmoles) y 2,6-di-t-butilpiridina (0,51 mI, 2,26 mmoles) en dimetilsulfóxido anhidro (5,7 ml), se calentó en atmósfera de argón en un baño de aceite a 120-125ºC. Después de 17,5 h, la reacción se enfrió en hielo-agua y se diluyó con agua. La mezcla se extrajo con acetato de etilo, y las capas de acetato de etilo combinadas se lavaron con agua y salmuera. El secado (MgSO_{4}), concentración y cromatografía (gel de sílice, acetato de etilo:hexano 3:2) dieron el compuesto del título (221,8 mg, 56%) en forma de un sólido prácticamente incoloro. TLC R_{f} 0,41 (acetato de etilo/hexano 3:2); [\alpha]_{D} -202,7º (c 1,0, CH_{3}OH); ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,68 (dd, J=8,5, 1,8 Hz, 1H), 7,59 (d, J=1,8 Hz, 1H), 6,50 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,44 (d, J=16,4 Hz, 1H), 5,08-5,16 (m, 1H), 4,54 (d an, J=4,5 Hz, 1H), 3,76 (d, J=16,4 Hz, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,08 (s, 3H), 3,00 (dd, J=16,0, 6,9 Hz, 1H), 2,67 (dd, J=16,0, 6,3 Hz, 1H), 1,57 (s, 9H); IR (cloroformo) 3560-3240 (an), 1731, 1695, 1663, 1610, 1369, 1302, 1252, 1171, 1146, 1134 cm^{-1}; EM(ES) m/e 719 [2M+Na]^{+}, 697 [2M+H]^{+}, 349 [M+H]^{+}.
g) (S)-(-)-7-Carboxi-2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzo- diazepina -2-acetato de metilo
Una solución del compuesto del Ejemplo 5 (f) (176,4 mg, 0,506 mmoles) en diclorometano anhidro (2,5 ml) se enfrió a 0ºC y se desoxigenó mediante tres ciclos de vaciado/barrido con argón. Se añadió gota a gota TFA (2,5 ml) en 3 min, y la solución resultante se agitó durante 2 h, y durante este tiempo la temperatura subió a +15ºC. La reacción se concentró (20ºC) y el residuo se volvió a concentrar en tolueno (35ºC) para eliminar cualquier TFA residual y dar el compuesto del título.
h) (S)-(-)-7-[1-[1'-(t-Butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidinil]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
Se disolvieron el compuesto del Ejemplo 5 (g), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (82 mg, 0,607 mmoles), y 4-(t-butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidina (163 mg, 0,607 mmoles) en dimetilformamida anhidra (2,5 ml), y la solución se enfrió a 0ºC en atmósfera de argón. Se añadió diisopropiletilamina (0,18 ml, 1,01 mmoles), seguido de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (116 mg, 0,607 mmoles), y la reacción se calentó a t.a. Después de 21 h, la reacción se concentró y el residuo se repartió entre agua y cloroformo. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con cloroformo. El secado (MgSO_{4}), concentración y cromatografía (gel de sílice, metanol al 10% en acetato de etilo:cloroformo 1:1) dieron el compuesto del título (215,4 mg, 78%) en forma de una espuma amarilla: TLC R_{f} 0,50 (metanol al 10% en acetato de etilo:cloroformo 1:1): [\alpha]_{D} -140,2º (c 1,0, CH_{3}OH); ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,08-7,15 (m, 2H), 6,52 (d, J=8,3 Hz, 1H), 5,44 (dd, J=16,4 Hz, 1H), 5,06 (t, J=6,6 Hz, 1H), 3,90-4,80 (m an, 4H), 3,75 (s, 3H), 3,73 (d, J=16,4 Hz, 1H), 3,08 (s, 3H), 2,99 (dd, J=15,8, 6,6 Hz, 1H), 2,56-2,93 (m, 5H), 1,60-1,83 (m, 4H), 1,46 (s, 9H), 1,08-1,42 (m, 6H); IR (CCl_{4}) 3290, 1735, 1689, 1669, 1610, 1436, 1426, 1365, 1286, 1173 cm^{-1}; EM(ES) m/e 1085 (2M+H)^{+}, 565 [M+Na]^{+}, 543 [M+H]^{+}, 502, 487 [M+H-C_{4}H_{8}]^{+}.
i) Ácido (S)-(-)-7-[1-[4,4'-bipiperidinil]-carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro -4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
Usando el procedimiento del Ejemplo 4 (b)-(c), el compuesto del Ejemplo 5 (h) se convirtió en el compuesto del título.
Ejemplo 6 Preparación de ácido (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético a) Ácido 4-fluoro-3-cianobenzoico
A una mezcla de 3-fluoro-5-metilbenzonitrilo (13,5 g, 0,1 moles), bromuro de tetrabutilamonio (1,61 g, 5 mmoles), y trihidrato de cloruro de rutenio (III) (0,261 g, 1 mmol) en diclorometano (150 ml), se añadió una solución de hipoclorito sódico (645 ml, 0,45 moles) que después se neutralizó a pH 9 con ácido sulfúrico al 20%. La mezcla de reacción se agitó y se mantuvo a pH 9 por adición de solución de hidróxido sódico al 20% a t.a. Después de 3 h, la fase acuosa se separó y se neutralizó a pH 2 con ácido sulfúrico al 20%, y el sólido que se formó se filtró para dar el compuesto del título (3,4 g, 20%). P.f. 177-8ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 7,35 (t, J=8,70 Hz, 1H), 8,38 (m, 1H), 8,42 (m, 1H).
b) 4-Fluoro-3-cianobenzoato de t-butilo
A una solución agitada del compuesto del Ejemplo 6 (a) (100 mg, 0,6 mmoles) en tolueno (20 ml) a 80ºC, se añadió una solución del di-t-butil-acetal de la N,N-dimetilformamida (1 ml, 4 mmoles) en tolueno (2 ml) en 10 min. La mezcla de reacción se calentó durante 1 h, se enfrió, se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico, se secó (MgSO_{4}), y se concentró para dar el compuesto del título (70 mg, 52%), EM(ES) m/e 222 [M+H]^{+}, ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,60 (9H, s), 7,29 (t, J=8,62 Hz, 1H) 8,25 (m, 1H), 8,28 (m, 1H).
c) Éster \beta-metílico del ácido N-[[2-ciano-4-t-butoxicarbonil]fenil]-L-aspártico
Una mezcla del compuesto del Ejemplo 6 (b) (6 g, 27 mmoles), hidrocloruro del éster \beta-metílico del ácido L-aspártico (6,1 g, 33 mmoles), y bicarbonato sódico (8,37 g, 100 mmoles) en agua (20 ml) y dimetilsulfóxido (80 ml) se calentó a 72ºC durante 24 h. La mezcla de reacción se diluyó con ácido clorhídrico diluido enfriado con hielo, y se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se extrajeron con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico fría. Los extractos básicos se combinaron, se acidificaron a pH 2 con ácido clorhídrico diluido, y se extrajeron con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO_{4}), y se concentraron para dar el compuesto del título (7,1 g, 75%), EM(ES) m/e 349 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,57 (s, 9H), 3,01 (m, 2H), 3,75 (s, 1H), 4,64 (m, 1H),5,77 (d, J=8,49 Hz, 1H), 6,71 (d, J=8,93 Hz, 1H), 8,02 (dd, J=8,93, 1,85 Hz, 1H), 8,08 (d, J=1,89 Hz, 1H).
d) Éster \beta-metílico del ácido N-[[2-formil-4-t- butoxicarbonil]fenil] -L-aspártico
El compuesto del Ejemplo 6 (c) (7,0 g, 20 mmoles) se disolvió en ácido acético (65 ml) y se puso en una botella de hidrogenación. Después de enfriar, se añadieron níquel Raney® húmedo (14 g), agua (65 ml) y piridina (65 ml). La mezcla resultante se purgó de oxígeno con argón durante 0,5 h, y se agitó en atmósfera de hidrógeno (3,5 kg/cm^{2}) a 60ºC durante 5 h. La mezcla se desgasificó, se filtró y el filtrado se trató azeotrópicamente con tolueno a 50ºC con alto vacío. El aceite residual se recogió en acetato de etilo (300 ml) y se lavó con ácido clorhídrico diluido frío, se secó (MgSO_{4}), y se concentró para dar el compuesto del título en forma de un sólido amorfo naranja claro (5,9 g, 84%), EM(ES) m/e 352 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,59 (s, 9H), 3,00 (m, 2H), 3,74 (s, 1H), 4,77 (m, 1H), 6,73 (d, J=8,88 Hz, 1H), 8,03 (d, J=8,85 Hz, 1H), 8,20 (d, J=2,12 Hz, 1H), 9,20 (d, 1=8,31 Hz, 1H), 9,88 (s, 1H).
e) Éster \beta-metílico del ácido N-[[2-(N-metil)aminometil-4-t-butoxicarbonil]fenil]-L-aspártico
Una solución del compuesto del Ejemplo 6 (d) (5,9 g, 16,7 mmoles) en acetato de etilo (100 ml) en una botella de hidrogenación se purgó de oxígeno con argón durante 0,5 h. Se añadieron óxido de platino (0,6 g), MgSO_{4} anhidro (5,9 g, 49 mmoles), y una solución de metilamina (3,2 M en metanol, 150 ml, 480 mmoles). La mezcla resultante se agitó en una atmósfera de hidrógeno (3,5 kg/cm^{2}) durante 5 h, y se dejó reposar durante 18 h a t.a. Después de añadir ácido acético (75 ml) enfriando, la mezcla se agitó otra vez en atmósfera de hidrógeno (3,5 kg/cm^{2}) durante 2 h, y se filtró. El filtrado se concentró y se trató azeotrópicamente con tolueno, y el residuo se desalificó por una columna XAD-2 (350 g) eluyendo con agua (1,5 litros) seguido de acetonitrilo:agua al 50%. Se recogieron dos fracciones (300 ml), se concentraron y el residuo se liofilizó para dar un polvo de color hueso. El polvo se disolvió en diclorometano (200 ml), se concentró y el residuo se trató azeotrópicamente con tolueno, y se secó para dar el compuesto del título (5,2 g, 85%). EM(ES) m/e 367 [M+H]^{+}.
f) (S)-7-(t-Butoxicarbonil)-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-4-metil-1H -1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
A una solución del compuesto del Ejemplo 6 (c) (5,2 g, 14,2 mmoles) y trietilamina (2,0 ml, 14,4 mmoles) en diclorometano (250 ml) a t.a. en atmósfera de argón, se añadió hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio (6,5 g, 14,7 mmoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche a t.a., y se lavó con una solución enfriada con hielo de ácido clorhídrico diluido, agua, bicarbonato sódico al 5%, salmuera saturada, y después se secó (MgSO_{4}). La solución se filtró, se concentró, y el residuo se cromatografió (gel de sílice, acetato de etilo:hexano al 40%) para dar el compuesto del título (1,1 g, 22%). EM(ES)m/e 349,2 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,57 (s, 9H), 2,67 (dd, J=15,93, 6,30 Hz, 2H), 3,00 (dd, J=15,93, 6,77 Hz, 2H), 3,08 (s, 3H), 3,75 (s, 1H), 3,76 (d, J=16,44 Hz, 1H), 4,51 (d, J=4,61, 1H), 5,11 (m, 1H) 5,45 (d, J=16,44 Hz, 1H), 6,50 (d, J=8,44 Hz, 1H), 7,55 (d, J=1,88 Hz, 1H), 8,20 (dd, J=8,48 1,88 Hz, 1H); [\alpha]_{D} -225,1º (c 1, CH_{3}OH).
g) (S)-7-Carboxi-2,3,4,5-tetrahidro-3-oxo-4-metil-1H-1,4-benzodiazepina -2-acetato de metilo
A una solución del compuesto del Ejemplo 6 (f) (160 mg, 0,46 mmoles) en diclorometano (5 ml) se añadió cloruro de hidrógeno:dioxano 4 M (5 ml, 20 mmoles) a t.a. en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó durante 18 h. La suspensión se concentró para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color hueso.
h) (S)-7-[(4-t-Butoxicarbonil-4'-bipiperidin)-1-ilcarbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato de metilo
El compuesto del Ejemplo 6 (g), 1-hidroxibenzotriazol (75 mg, 0,55 mmoles), y 4-t-butoxicarbonil-4'-bipiperidina se disolvieron en dimetilformamida anhidra (2,5 ml). Se añadió diisopropiletilamina (0,16 ml, 0,92 mmoles), seguido de hidrocloruro de 1-(dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (105 mg, 0,55 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche a t.a. en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se repartió entre agua helada (50 ml) y acetato de etilo (30 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO_{4}), se concentraron y el residuo se cromatografió (gel de sílice, metanol:diclorometano al 2%) para dar el compuesto del título. (162 mg, 59%). EM(ES) m/e 599,0 [M+H]^{+}; ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,45 (s, 9H), 1,20 (m, 6H), 1,70 (m, 4H), 2,66 (dd, J=16,08, 6,04 Hz, 2H), 2,81 (s an, 4H), 2,98 (dd, J=16,08, 7,31 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,71 (d, J=16,44 Hz, 1H), 3,73 (s, 1H), 3,76 (d, J=16,44 Hz, 1H) 4,13 (s an, 4H), 5,07 (m, 1H) 5,45 (d, J=16,44 Hz, 1H), 6,52 (d, J=8,51 Hz, 1H), 7,09 (m, 2H); [\alpha]_{D} -139,3º (c 1,CH_{3}OH).
i) ácido (S)-7-[1-[4,4'-Bipiperidinil]carbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4- metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
Usando el procedimiento del Ejemplo 4 (b-c), el compuesto del Ejemplo 6 (h) se convirtió en el compuesto del título.
Ejemplo 7 Preparación de ácido (S)-7-[[4,4'-bipiperidin-1-il]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético a) Ácido (S)-7-[[1'-(t-butoxicarbonil)-4,4'-bipiperidin-1-il]carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
El compuesto del Ejemplo 4 (a) (2,85 g, 5,3 mmoles) se recogió en metanol:THF 1:1 (30 ml), se purgó con argón, se enfrió y se trató con hidróxido sódico 1 N (6,3 ml, 6,3 mmoles). La solución resultante se agitó a t.a. durante 16 h en atmósfera de argón. La solución se concentró, se diluyó con agua (10 ml), y se ajustó a pH 5 con ácido acético 1 M (papel de tornasol). La solución se filtró y el sólido se secó a vacío para dar el compuesto del título (2,46 g, 87%).
b) Ácido (S)-7-[[4,4'-bipiperidin]-1-ilcarbonil]-2,3,4,5-tetrahidro-4- metil -3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
El compuesto del Ejemplo 7 (a) (1,46 g, 2,77 mmoles) se trató con cloruro de hidrógeno 4 M en dioxano (30 ml) durante 1 h en atmósfera de argón. La solución se concentró y el residuo se recogió en agua y se ajustó a pH 9 (papel de tornasol) con hidróxido amónico concentrado, y la solución resultante se cargó en una columna XAD-2 (3 x 7,5 cm). La columna se eluyó con agua seguido de acetonitrilo:agua al 50%. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron para dar el compuesto del título (910 mg, 77%) que se recristalizó en acetona acuosa. P.f. (contracción 193) 218-220ºC; ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO_{d6}) \delta 1,0-3,9 (m, 26H), 6,5-8,5 (m, 5H); EM (ES) m/e 429,2 [M+H]^{+}, HPLC k' 5,37 (VyDac C_{18}, 4,5 x 250 mm, gradiente A: acetonitrilo B: agua-TFA al 0,1%, acetonitrilo 5%-60%en 20 min, detección UV a 220 nm); [\alpha]_{D} -180,3º (c 1, MeOH); Análisis (C_{23}H_{32}N_{4}O_{4}.2,33 H_{2}O) calculado: C, 58,71; H, 7,81; N, 11,91. Encontrado: C, 58,67; H, 7,79; N, 11,80.
Ejemplo 8 Preparación de ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
El uso del procedimiento del Ejemplo 7, excepto sustituyendo el compuesto del Ejemplo 4 (a) por el compuesto del Ejemplo 2 (j), dio el compuesto del título en forma de un sólido cristalino. P.f. (contracción 193ºC) 219-220ºC; EM(ES) m/e 429 [M+H]^{+}; HPLC k' 6,5 (Ultrasphere ODS, 4,5 x 250 mm, gradiente, A: acetonitrilo B: agua-ácido trifluoroacético al 0,1%, acetonitrilo 5-60% durante 20 min, detección UV a 220 nm).
Ejemplo 9 Preparación de (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acetato sódico
El compuesto del Ejemplo 8 (10 mg, 0,023 mmoles) se recogió en agua (1 ml) y se añadió hidróxido sódico 1 M (0,024 ml, 0,024 mmoles). La solución resultante se liofilizó y el polvo se cristalizó en acetona acuosa para dar el compuesto del título en forma de un sólido cristalino (2 mg). P.f. 220-230ºC [contracción 204ºC].
Lo anterior ilustra la preparación y uso de esta invención. Sin embargo, esta invención no está limitada por las realizaciones precisas aquí descritas, sino que abarca todas las modificaciones dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

1. Un compuesto que es:
el ácido (R,S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
2. Un compuesto que es:
el ácido (S)-7-[(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonil] -2,3,4,5-tetrahidro-4-metil-3-oxo-1H-1,4-benzodiazepina-2-acético
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para preparar un medicamento para inhibir la agregación de plaquetas.
5. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para preparar un medicamento para tratar el infarto de miocardio, trombosis, embolia, aneurisma disecante, angina inestable, ataque isquémico transitorio, ataque de apoplejía y trastornos relacionados con el infarto, o reestenosis después de angioplastia, o para inhibir la reoclusión de una arteria o vena después de terapia trombolítica.
6. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y un agente trombolítico para preparar un medicamento para inhibir la reoclusión de una arteria o vena después de terapia trombolítica.
7. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y un agente que inhibe la agregación de plaquetas, seleccionado de un inhibidor de ciclooxigenasa, antagonista de tromboxano, inhibidor de la síntesis de tromboxano, heparina, inhibidor de trombina, inhibidor del receptor de ADP y ticlopidina, para preparar un medicamento para inhibir la agregación de plaquetas.
8. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para preparar un medicamento para inhibir la agregación de plaquetas, combinado con un agente que inhibe la agregación de plaquetas, seleccionado de un inhibidor de ciclooxigenasa, antagonista de tromboxano, inhibidor de la síntesis de tromboxano, heparina, inhibidor de trombina, inhibidor del receptor de ADP y ticlopidina.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que el agente es aspirina.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que el agente es warfarina.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que el agente es clopidogrel.
12. Un procedimiento para preparar un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, que comprende tratar un compuesto de fórmula (IV):
3
en la que
A^{1} es NH;
R es H o un grupo protector de carboxi;
R^{3} es metilo;
X es H; y
R^{6'} es 7-(4,4'-bipiperidin-1-il)carbonilo, en el que el nitrógeno básico está protegido;
con un reactivo, en cualquier orden,
(i)
para eliminar el grupo protector de amino de R^{6'}; y si es necesario,
(ii)
eliminar un grupo protector de carboxi de CO_{2}R; y
(iii)
formar una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
13. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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