ES2217306T3 - Inhibidor terapeutico de celulas musculares vasculares lisas. - Google Patents

Inhibidor terapeutico de celulas musculares vasculares lisas.

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ES2217306T3
ES2217306T3 ES96906490T ES96906490T ES2217306T3 ES 2217306 T3 ES2217306 T3 ES 2217306T3 ES 96906490 T ES96906490 T ES 96906490T ES 96906490 T ES96906490 T ES 96906490T ES 2217306 T3 ES2217306 T3 ES 2217306T3
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inhibitor
therapeutic
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Lawrence L. Kunz
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Boston Scientific Corp
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Boston Scientific Ltd Barbados
Boston Scientific Corp
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Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS PARA INHIBIR LA ESTENOSIS TRAS UN TRAUMATISMO O ENFERMEDAD VASCULAR EN UN HUESPED MAMIFERO, QUE COMPRENDEN LA ADMINISTRACION AL HUESPED DE UNA DOSIS TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DE UN CONJUGADO TERAPEUTICO QUE CONTIENE UNA PROTEINA DE UNION A MUSCULOS LISOS VASCULARES QUE SE ASOCIA DE FORMA ESPECIFICA A LA SUPERFICIE CELULAR DE LA CELULA VASCULAR DEL MUSCULO LISO, JUNTO CON UNA FORMA DE DOSIFICACION DE UN AGENTE TERAPEUTICO QUE INHIBE LA ACTIVIDAD CELULAR DE LA CELULA MUSCULAR. SE PROPORCIONAN ASIMISMO METODOS PARA LA ADMINISTRACION DIRECTA Y/O DIRIGIDA DE AGENTES TERAPEUTICOS A CELULAS VASCULARES DEL MUSCULO LISO QUE PROVOCAN UNA DILATACION Y UNA FIJACION DEL LUMEN VASCULAR INHIBIENDO LA CONTRACCION DE LA CELULA MUSCULAR LISA, CONSTITUYENDO ASI UN STENT BIOLOGICO.

Description

Inhibidor terapéutico de células musculares vasculares lisas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere en general a métodos terapéuticos que implican la introducción quirúrgica o intravenosa de moléculas de unión dirigidas a ciertas poblaciones celulares diana, tales como células musculares lisas, células cancerosas, células somáticas que requieren modulación para mejorar una patología, y células efectoras del sistema inmune, particularmente para tratar procesos tales como estenosis después de traumatismo o enfermedad vascular, cáncer, enfermedades que se derivan de la hiperactividad o hiperplasia de células somáticas y enfermedades que están mediadas por las células efectoras del sistema inmune. También se describe la introducción quirúrgica o intravenosa de agentes activos capaces de alterar la proliferación o migración, o la contracción de las proteínas del músculo liso. La invención se refiere también a la administración, directa o mediante marcado, de agentes terapéuticos a las células musculares lisas vasculares, que da como resultado la dilatación y fijación de la luz vascular (efecto de endoprótesis biológica). También se revela la administración combinada de un conjugado citocida y una forma de dosificación de liberación sostenida de un inhibidor de células musculares lisas vasculares.
Antecedentes de la invención
La angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP) se usa ampliamente como la modalidad de tratamiento primario en muchos pacientes con arteriopatía coronaria. La ACTP puede aliviar la isquemia miocárdica en pacientes con arteriopatía coronaria, reduciendo la obstrucción luminal y mejorando el flujo coronario. El uso de este procedimiento quirúrgico ha crecido rápidamente, con 39.000 procedimientos realizados en 1983, casi 150.000 en 1987, 200.000 en 1988, 250.000 en 1989, y se estima que más de 500.000 ACTPs al año antes de 1994 (1, 2, 3). La estenosis después de ACTP sigue siendo un problema significativo, con un 25% a 35% de los pacientes que desarrollan reestenosis en 1 a 3 meses. La reestenosis da como resultado morbilidad y mortalidad significativas, y necesita frecuentemente intervenciones adicionales tales como angioplastia repetida o cirugía de derivación coronaria. No se ha probado que ninguna intervención quirúrgica o tratamiento postquirúrgico (hasta la fecha) sea efectivo para evitar la reestenosis.
Los procesos responsables de la estenosis después de ACTP no se comprenden completamente, pero pueden derivarse de la interacción compleja de varios agentes y rutas biológicas diferentes. Vistas en cortes histológicos, las lesiones reestenóticas pueden tener una proliferación excesiva de células musculares lisas en las capas de la íntima del vaso (3). Se han propuesto varios mecanismos posibles para la proliferación de las células musculares lisas después de ACTP (1, 2, 4, 5).
Los compuestos que según informes suprimen la proliferación de músculo liso in vitro (4, 6, 7) pueden tener efectos secundarios farmacológicos indeseables al usarlos in vivo. La heparina es un ejemplo de tales compuestos, que según informes inhibe la proliferación de células musculares lisas in vitro, pero al usarla in vivo tiene el efecto secundario potencialmente adverso de inhibir la coagulación. Los péptidos de heparina, aunque tienen una actividad anticoagulante reducida, tienen la propiedad farmacológicamente indeseable de tener una semivida farmacológica corta. Se han hecho intentos para resolver tales problemas usando un catéter de doble globo, es decir, para la administración regional del agente terapéutico en la zona de angioplastia (p.ej., 8; pat. de EE.UU. nº 4.824.436), y usando materiales biodegradables impregnados con un fármaco, es decir, para compensar los problemas de semivida corta (p.ej., 9; pat. de EE.UU. nº 4.929.602).
Las verrucarinas y roridinas son fármacos de tricoteceno producidos como metabolitos secundarios por los hongos de suelo Myrothecium verrucaria y Myrothecium roridium. La verrucarina es un triéster macrocíclico. La roridina es un diéster macrocíclico del verrucarol (10). Como grupo, los tricotecenos están relacionados estructuralmente con las micotoxinas sesquiterpenoides producidas por varias especies de hongos, y se caracterizan por la estructura básica de 12,13-epoxitricotec-9-eno. Su actividad citotóxica hacia las células eucarióticas está relacionada estrechamente con su capacidad para unirse a la célula, para ser interiorizados, y para inhibir la síntesis proteica y macromolecular en la célula.
Al menos cinco consideraciones parecerían impedir, a primera vista, el uso de fármacos inhibidores para evitar la estenosis derivada de la proliferación excesiva de células musculares lisas. Primero, los agentes inhibidores pueden tener toxicidad sistémica que podría crear un nivel inaceptable de riesgo para pacientes con enfermedad cardiovascular. Segundo, los agentes inhibidores podrían interferir con la cicatrización de la herida vascular después de cirugía, y eso podría retrasar la cicatrización o debilitar la estructura o elasticidad de la pared del vaso recién cicatrizado. Tercero, los agentes inhibidores que matan células musculares lisas podrían dañar el endotelio circundante y/o otras células musculares lisas de la media. Las células muertas y moribundas liberan también agentes mitogénicos, que podrían estimular la proliferación adicional de células musculares lisas y exacerbar la estenosis. Cuarto, la administración de niveles terapéuticamente efectivos de un agente inhibidor puede ser problemática desde varios puntos de vista: a saber, a) puede ser necesaria la administración de un gran número de moléculas en los espacios intercelulares entre las células musculares lisas, es decir, establecer condiciones favorables para permitir que una dosis terapéuticamente efectiva de moléculas cruce la membrana celular; b) dirigir un fármaco inhibidor al compartimento intracelular apropiado, es decir, en el que se ejerce su acción, puede ser difícil de controlar; y c) puede ser difícil optimizar la asociación del fármaco inhibidor con su diana intracelular, p.ej. un ribosoma, al mismo tiempo que minimizar la redistribución intercelular del fármaco, p.ej. a las células vecinas. Quinto, debido a que la proliferación de células musculares lisas tiene lugar a lo largo de varias semanas, parecería a priori que los fármacos inhibidores se deberían administrar también a lo largo de varias semanas, tal vez continuamente, para producir un efecto beneficioso.
Como es evidente a partir de lo anterior, quedan muchos problemas por resolver en el uso de fármacos inhibidores, que incluyen los agentes citotóxicos, para tratar de forma efectiva la proliferación de células musculares lisas. Sería muy ventajoso desarrollar métodos nuevos para inhibir la estenosis debida a la proliferación de células musculares lisas vasculares después de lesión traumática de los vasos, tal como ocurre durante la cirugía vascular. Además, sería ventajosa la administración de compuestos que producen efectos inhibidores de duración prolongada en las células musculares lisas vasculares. La administración local de tales compuestos de liberación sostenida sería también útil en el tratamiento de otros procesos en los que la población de células diana es accesible mediante tal administración.
Un aspecto de la invención implica la colocación in vivo de una endoprótesis intravascular metálica, plástica o biodegradable, que comprende un agente terapéutico. También se proporcionan endoprótesis que comprenden un agente terapéutico. Una realización preferida de la invención es una endoprótesis que comprende un agente terapéutico, tal como un inhibidor citoesquelético o un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas. Un inhibidor citoesquelético preferido de la invención es una citocalasina, tal como citocalasina B o su análogo estructural que es funcionalmente equivalente. Un inhibidor citoesquelético preferido alternativo de la invención es taxol, o su análogo estructural que es funcionalmente equivalente.
Las endoprótesis pueden comprender un revestimiento biodegradable o un revestimiento no biodegradable poroso o permeable. Una realización preferida de la invención es una endoprótesis que comprende un revestimiento biodegradable o un revestimiento no biodegradable poroso/permeable, que comprende el agente terapéutico. Una realización más preferida de la invención es una endoprótesis que comprende un revestimiento biodegradable o un revestimiento no biodegradable poroso o permeable, que comprende una forma de dosificación de liberación sostenida del agente terapéutico.
En una realización alternativa, una endoprótesis, p.ej., una endoprótesis biodegradable, puede tener también el agente terapéutico impregnado en ella, es decir, en la matriz de la endoprótesis. También se contempla la utilización de una endoprótesis biodegradable impregnada con el agente terapéutico, que además está revestida con un revestimiento biodegradable o con un revestimiento no biodegradable poroso o permeable, que comprende una forma de dosificación de liberación sostenida de un agente terapéutico. Esta realización de la invención puede proporcionar una velocidad de liberación diferencial del agente terapéutico, es decir, habría una liberación más rápida del agente terapéutico desde el revestimiento, seguida de liberación retardada del agente terapéutico que está impregnado en la matriz de la endoprótesis, al degradarse la matriz de la endoprótesis.
La endoprótesis intravascular proporciona un medio mecánico para proporcionar un incremento en el área luminal de un vaso, además del proporcionado por medio de la acción de endoprótesis biológica del inhibidor citoesquelético, tal como citocalasina B o taxol, impregnado de forma liberable en ella. Además, la colocación de endoprótesis intravasculares que comprenden un agente terapéutico, que es un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas, proporciona una eficacia incrementada reduciendo o evitando la proliferación de la íntima. Esta inhibición de las células musculares lisas de la íntima y el estroma producido por el músculo liso permite la reendotelización más rápida y completa después de la colocación intervencionista de la endoprótesis vascular. La velocidad incrementada de reendotelización y estabilización de la pared del vaso después de la colocación de la endoprótesis puede reducir la pérdida de área luminal y el flujo sanguíneo disminuido, que es la causa primaria de los fracasos de las endoprótesis vasculares.
Para el tratamiento de la reestenosis de células musculares lisas vasculares, los agentes terapéuticos útiles inhiben la actividad de las células diana (p.ej., la proliferación o migración) sin matar las células diana. Las fracciones terapéuticas preferidas para este propósito son inhibidores de proteína quinasas (p.ej., estaurosporina o similares), inhibidores de migración y/o contracción del músculo liso (p.ej., citocalasinas, tales como citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D o similares), suramina, y compuestos liberadores de óxido nítrico, tales como nitroglicerina, o sus análogos o equivalentes funcionales.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es una microfotografía de células musculares lisas vasculares en una arteria de un paciente varón de 24 años de edad, con proteína de unión de músculo liso vascular unida a la superficie y membrana celulares. El paciente recibió la proteína de unión de músculo liso vascular mediante administración i.v. 4 días antes de que el tejido arterial se prepararse para histología.
La Figura 1B es una microfotografía de células musculares lisas vasculares en una arteria de un paciente varón de 24 años de edad, con proteína de unión de músculo liso vascular unida a la superficie y membrana celulares. El corte se hizo reaccionar ex vivo con IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP. Esta reacción se visualizó añadiendo 4-cloro-1-naftol. El producto de reacción del sustrato forma un precipitado púrpura o marrón oscuro insoluble en el lugar de reacción (mostrado en #2). Se usó una tinción de contraste para visualizar los núcleos celulares (mostrado en #1).
La Figura 2 representa un primer esquema del acoplamiento químico de un agente terapéutico a una proteína de unión de músculo liso vascular.
La Figura 3 representa un segundo esquema del acoplamiento químico de un agente terapéutico a una proteína de unión de músculo liso vascular.
La Figura 4A representa gráficamente los datos experimentales que muestran la unión rápida de proteína de unión de músculo liso vascular a células de ensayo de marcador positivo in vitro.
La Figura 4B representa gráficamente los datos experimentales que muestran la unión rápida de proteína de unión de músculo liso vascular a células musculares lisas vasculares in vitro.
La Figura 5A presenta gráficamente los datos experimentales que muestran la citotoxicidad indeseable incluso de niveles bajos de conjugado terapéutico (es decir, RA-NR-AN-01), y el agente terapéutico RA libre, cuando se trataron células musculares lisas vasculares durante 24 horas in vitro.
La Figura 5B presenta gráficamente los datos experimentales que muestran los efectos del conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 sobre la actividad metabólica de las células de marcador positivo y negativo. Los datos muestran la citotoxicidad inespecífica indeseable del conjugado para todas estas células en un tratamiento de 24 horas in vitro. La inespecificidad se deriva de la hidrólisis extracelular del ligando de unión, que expone a las células ensayadas al fármaco libre.
La Figura 6A representa gráficamente los datos experimentales que muestran la citotoxicidad inespecífica indeseable del conjugado terapéutico EP-NR-AN-01, para células de ensayo de marcador positivo y marcador negativo tras 24 horas de tratamiento in vitro, aunque el tratamiento de 24 horas fue seguido por un periodo de recuperación durante la noche antes de ensayar la actividad metabólica.
La Figura 6B representa los datos experimentales que muestran la citotoxicidad inespecífica del agente terapéutico EP libre sobre las células de ensayo de marcador positivo y negativo tras 24 horas de tratamiento in vitro.
La Figura 7A representa gráficamente los datos experimentales que muestran que un tratamiento corto de "pulso" de 5 minutos, es decir, en lugar de 24 horas, seguido de exposición a [3H]leucina, con agente terapéutico RA libre es inespecíficamente citotóxico, es decir, para células HT29 de control de marcador negativo, pero, por contraste, el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no es citotóxico en este tratamiento de "pulso".
La Figura 7B presenta gráficamente los datos experimentales que muestran que el agente terapéutico RA es inespecíficamente citotóxico para controlar células HT29 de control de marcador negativo, incluso en un tratamiento de "pulso" de 5' seguido de un periodo de recuperación de 24 horas antes de la exposición a [3H]leucina, pero, en contraste, el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no es citotóxico para las células.
La Figura 7C presenta gráficamente los resultados de los experimentos que muestran que el tratamiento de "pulso" de células in vitro con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 inhibe la actividad celular en células A375 de marcador positivo, según se midió mediante la síntesis proteica.
La Figura 7D presenta gráficamente los datos experimentales que muestran que el tratamiento de "pulso" de células in vitro con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibitorios duraderos sobre la actividad celular en células de marcador positivo, ya que la síntesis proteica en las células A375 no se inhibió cuando se dio a las células un periodo de recuperación durante la noche antes de la experimentación in vitro.
La Figura 8A presenta gráficamente los datos experimentales que muestran que aunque el tratamiento de "pulso" de células in vitro con agente terapéutico RA libre fue inespecíficamente citotóxico, el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibitorios duraderos sobre la actividad celular en las células musculares lisas vasculares, como se demuestra mediante la actividad metabólica en las células BO54 a las que se les dio un período de recuperación de 48 horas antes de la experimentación.
La Figura 8B representa gráficamente datos experimentales similares a los presentados en la Figura 8A, anteriormente, pero usando un segundo tipo celular de marcador positivo, a saber A375. Los datos muestran que el tratamiento de "pulso" con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibitorios duraderos sobre la actividad celular, según se midió mediante la actividad metabólica en células A375 a las que se les dio un periodo de recuperación de 48 horas antes de la experimentación.
La Figura 8C representa gráficamente resultados similares a los presentados en la Figura 8A y Figura 8B, anteriormente, pero usando un tipo celular de control de marcador negativo, a saber HT29. Los resultados muestran que el tratamiento de "pulso" con el conjugado terapéutico RA-NR-AN-01 no ejerció efectos inhibitorios duraderos sobre la actividad celular de las células de control de marcador negativo, según se midió mediante la actividad metabólica en células HT29 a las que se les dio un periodo de recuperación de 48 horas antes de la experimentación.
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La Figura 9A muestra la estenosis debida a la proliferación de células musculares lisas de la íntima, en un corte histológico de una arteria sin tratar 5 semanas después de angioplastia en un modelo animal.
La Figura 9B muestra la inhibición de estenosis en un corte histológico de una arteria tratada con conjugado terapéutico, 5 semanas después de angioplastia en un modelo animal.
La Figura 10A representa gráficamente los datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de síntesis proteica y de síntesis de ADN de suramina respecto de células musculares lisas vasculares.
La Figura 10B representa gráficamente los datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de síntesis proteica y de síntesis de ADN de estaurosporina respecto de células musculares lisas vasculares.
La Figura 10C representa gráficamente los datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de síntesis proteica y de síntesis de ADN de nitroglicerina respecto de células musculares lisas vasculares.
La Figura 10D representa gráficamente los datos experimentales que comparan la capacidad de inhibición de síntesis proteica y de síntesis de ADN de citocalasina B respecto de células musculares lisas vasculares.
La Figura 11 muestra un corte tangencial paralelo a la superficie interior de una célula muscular lisa que ésta aumentada 62.500 veces y que se caracteriza por numerosas vesículas endocíticas, varias de las cuales contienen perlas de oro revestidas de anticuerpo en proceso de ser interiorizadas por la célula in vitro.
La Figura 12 muestra una célula muscular lisa que está aumentada 62.500 veces, y que se caracteriza por una marcada acumulación de perlas de oro en los lisosomas 24 horas después de exposición in vivo de la célula a las perlas.
La Figura 13 muestra una célula muscular lisa que está aumentada 62.500 veces, y que se caracteriza por la acumulación de perlas de oro en los lisosomas in vivo.
La Figura 14 representa un estudio de respuesta a dosis in vivo del efecto de citocalasina B sobre el área luminal de arterias femorales de cerdo.
Descripción detallada de la invención
Como se usan aquí, los siguientes términos tienen los significados enunciados a continuación:
"Conjugado terapéutico" significa una proteína de unión de músculo liso vascular o de la matriz intersticial acoplada (p.ej., opcionalmente por medio de un ligador) a un agente terapéutico.
"Diana" o "marcador" se usan intercambiablemente para describir los aspectos del conjugado de la presente invención, para significar una molécula reconocida de forma específica por la proteína de unión de la matriz o del músculo liso vascular, p.ej., un antígeno, antígeno polipeptídico o carbohidrato de superficie celular (p.ej., un glicolípido, glicoproteína o proteoglicano) que se expresa en la membrana de la superficie celular de una célula muscular lisa vascular o en una estructura de la matriz.
"Epítopo" se usa para referirse a un lugar específico dentro de la molécula "diana" al que se une la proteína de unión de la matriz o del músculo liso, p.ej., una secuencia de tres o más aminoácidos o sacáridos.
"Acoplado" se usa para referirse a asociación química covalente o no covalente (es decir, hidrofóbica por medio de fuerzas de van der Waals o interacciones electrostáticas) de la proteína de unión de la matriz o del músculo liso con el agente terapéutico. Debido a la naturaleza de los agentes terapéuticos empleados, las proteínas de unión se asociarán normalmente a los agentes terapéuticos por medio de enlaces covalentes.
"Ligador" significa un agente que acopla la proteína de unión de la matriz o del músculo liso al agente terapéutico, p.ej., un acoplador químico orgánico.
"Migración" de células musculares lisas significa el movimiento de estas células in vivo desde las capas de la media de un vaso a la íntima, tal como se puede estudiar también in vitro siguiendo el movimiento de una célula desde una localización a otra (p.ej., usando cinematografía a intervalos prefijados, o un grabador de vídeo y cuenta manual de la migración de células musculares lisas fuera de un área definida en el cultivo de tejido con el tiempo).
"Proliferación", es decir, de células musculares lisas o células cancerosas, significa el incremento en el número de células, es decir, mediante mitosis de las células.
"Expresado" significa transcripción y traducción de mARN con síntesis resultante, glicosilación y/o secreción de un polipéptido por una célula, p.ej., CSPG sintetizado por una célula muscular lisa vascular o pericito.
"Tricoteceno macrocíclico" pretende significar cualquiera del grupo de micotoxinas macrocíclicas sesquiterpenoides relacionadas estructuralmente, producidas por varias especies de hongos, y caracterizadas por la estructura básica 12,13-epoxitricotec-9-eno, p.ej. verrucarinas y roridinas, que son los productos del metabolismo secundario del hongo de suelo Myrothecium verrucaria y Myrothecium roridium.
"Liberación sostenida" significa una forma de dosificación diseñada para liberar un agente terapéutico desde ella, durante un periodo de tiempo que oscila de alrededor de 3 a alrededor de 21 días. La liberación a lo largo de un periodo de tiempo más largo se contempla también como una forma de dosificación de "liberación sostenida" de la presente invención.
"Forma de dosificación" significa una formulación de agente terapéutico libre (sin marcar o sin asociarse a molécula de unión), así como formulaciones terapéuticas de liberación sostenida, tales como las que incorporan material polimérico microparticulado o nanoparticulado, biodegradable o no, capaz de unirse a una o más proteínas o péptidos de unión, para administrar una fracción terapéutica dispersada en él a una población celular diana.
"Estaurosporina" incluye estaurosporina, un inhibidor de proteína quinasa C de la siguiente fórmula,
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así como los diindolalcaloides que tienen una de las siguientes estructuras generales:
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Más específicamente, el término "estaurosporina" incluye K-252 (véase, por ejemplo, la solicitud de patente japonesa nº 62.164.626), BMY-41950 (patente de EE.UU. nº 5.015.578), UCN-01 (patente de EE.UU. nº 4.935.415), TAN-999 (solicitud de patente japonesa nº 01.149.791), TAN-1030A (solicitud de patente japonesa nº 01.246.288), RK-286C (solicitud de patente japonesa nº 02.258.724) y sus equivalentes y derivados funcionales. Los derivados de estaurosporina incluyen los descritos en las solicitudes de patentes japonesas nº 03.72.485; 01.143.877; 02.09.819 y 03.220.194, así como en las solicitudes internacionales PCT nº WO 89 07.105 y WO 91 09.034 y las solicitudes de patentes europeas nº EP 410.389 y EP 296.110. Son conocidos los derivados de K-252, un producto natural. Véase, por ejemplo, las solicitudes de patentes japonesas nº 63.295.988; 62.240.689; 61.268.687; 62.155.284; 62.155.285; 62.120.388 y 63.295.589, así como la solicitud internacional PCT nº WO 88 07.045 y la solicitud de patente europea nº EP 323.171.
"Citocalasina" incluye los metabolitos fúngicos que exhiben un efecto inhibidor sobre el metabolismo celular diana, que incluye el impedimento de la contracción o migración de las células musculares lisas vasculares. Preferiblemente, las citocalasinas inhiben la polimerización de la actina monomérica (G-actina) a la forma polimérica (F-actina), inhibiendo por ello las funciones celulares que requieren microfilamentos citoplásmicos. Las citocalasinas se derivan típicamente de fenilalanina (citocalasinas), triptófano (quetoglobosinas), o leucina (aspocalasinas), dando como resultado un grupo bencilo, indol-3-il metilo o isobutilo, respectivamente, en la posición C-3 de una fracción perhidroisoindol-1-ona sustituida (fórmula V o VI).
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La fracción perhidroisoindol contiene alternativamente un anillo carbocíclico o que contiene oxígeno, de 11, 13 ó 14 átomos, unido a las posiciones C-8 y C-9. Todas las citocalasinas naturales contienen un grupo metilo en C-5; un grupo metilo o metileno en C-12; y un grupo metilo en C-14 o C-16. Las moléculas ejemplares incluyen citocalasina A, citocalasina B, citocalasina C, citocalasina D, citocalasina E, citocalasina F, citocalasina G, citocalasina H, citocalasina J, citocalasina K, citocalasina L, citocalasina M, citocalasina N, citocalasina O, citocalasina P, citocalasina Q, citocalasina R, citocalasina S, quetoglobosina A, quetoglobosina B, quetoglobosina C, quetoglobosina D, quetoglobosina E, quetoglobosina F, quetoglobosina G, quetoglobosina J, quetoglobosina K, desoxafomina, proxifomina, protofomina, cigosporina D, cigosporina E, cigosporina F, cigosporina G, aspocalasina B, aspocalasina C, aspocalasina D y similares, así como sus equivalentes y derivados funcionales. Ciertos derivados de citocalasina se enuncian en las patentes japonesas nº 72 01.925; 72 14.219; 72 08.533; 72 23.394; 72 01.924 y 72 04.164. La citocalasina B se usa en esta descripción como citocalasina prototípica.
Como se menciona aquí, las células musculares lisas y pericitos incluyen las células derivadas de las capas de la media de los vasos y de los vasos de la adventicia, que proliferan en lugares vasculares hiperplásicos de la íntima después de lesión, tal como la causada durante ACTP.
Las características de las células musculares lisas incluyen una morfología histológica (bajo examen microscópico óptico) fusiforme con un núcleo oblongo localizado centralmente en la célula, con nucleolos presentes y miofibrillas en el sarcoplasma. Bajo examen microscópico electrónico, las células musculares lisas tienen mitocondrias delgadas y alargadas en el sarcoplasma yuxtanuclear, algunos elementos tubulares del retículo endoplásmico rugoso, y numerosos agrupamientos de ribosomas libres. Se puede localizar un pequeño aparato de Golgi cerca de un polo del núcleo. La mayoría del sarcoplasma está ocupado por miofilamentos delgados paralelos que pueden estar, en su mayor parte, orientados hacia el eje mayor de la célula muscular. Estas miofibrillas que contienen actina se pueden disponer en haces con las mitocondrias situadas entre ellas. También puede haber cuerpos densos ovales dispersos por la sustancia contráctil de la célula, con cuerpos densos similares distribuidos a intervalos a lo largo de la superficie interna de la membrana celular.
Las endoprótesis de la invención son útiles para inhibir la actividad de las células musculares lisas vasculares, para reducir, retrasar o eliminar la estenosis después de angioplastia. Como se usa aquí, el término "reducir" significa disminuir el engrosamiento de la íntima que se deriva de la estimulación de la proliferación de células musculares lisas después de angioplastia, en un modelo animal o en el hombre. "Retrasar" significa retrasar el tiempo hasta el inicio de hiperplasia visible de la íntima (p.ej., observada histológicamente o mediante examen angiográfico) después de angioplastia, y puede acompañarse también de reestenosis "reducida". "Eliminar" la reestenosis después de angioplastia significa "reducir" completamente y/o "retrasar" completamente la hiperplasia de la íntima en un paciente hasta un punto en el que ya no es necesario intervenir quirúrgicamente, es decir, para restablecer un flujo sanguíneo adecuado a través del vaso mediante angioplastia repetida, aterectomía o cirugía de derivación aortocoronaria. Los efectos de reducir, retrasar o eliminar la estenosis se pueden determinar mediante métodos rutinarios para los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, angiografía, evaluación ecográfica, representación de imágenes fluoroscópicas, examen endoscópico con fibra óptica o biopsia e histología. Los conjugados terapéuticos de la invención consiguen estos efectos ventajosos uniéndose específicamente a las membranas celulares de células musculares lisas y pericitos.
Los conjugados terapéuticos de la invención se obtienen acoplando una proteína de unión de músculo liso vascular a un agente terapéutico. En el conjugado terapéutico, la proteína de unión de músculo liso vascular realiza la función de dirigir el conjugado terapéutico a las células musculares lisas vasculares o pericitos, y el agente terapéutico realiza la función de inhibir la actividad celular de la célula muscular lisa o pericito.
Las formas de dosificación terapéuticas (de tipo de liberación sostenida) de la presente invención exhiben la capacidad de administrar el agente terapéutico a las células diana a lo largo de un periodo de tiempo sostenido. Las formas de dosificación terapéuticas de este aspecto de la presente invención pueden ser de cualquier configuración adecuada para este propósito. Las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida preferidas exhiben una o más de las siguientes características:
- estructura de polvo fluido microparticulado (p.ej., de alrededor de 0,5 micrometros a alrededor de 100 micrometros de diámetro, más preferiblemente de alrededor de 0,5 a alrededor de 2 micrometros) o nanoparticulado (p.ej., de alrededor de 1,0 nanometros a alrededor de 1000 nanometros de diámetro, más preferiblemente de alrededor de 50 a alrededor de 250 nanometros);
- estructura biodegradable diseñada para biodegradarse a lo largo de un periodo de tiempo de alrededor de 3 a alrededor de 180 días, más preferiblemente de alrededor de 10 a alrededor de 21 días, o una estructura no biodegradable para permitir que se produzca la difusión del agente terapéutico a lo largo de un periodo de tiempo de entre alrededor de 3 a alrededor de 180 días, más preferiblemente de alrededor de 10 a alrededor de 21 días;
- biocompatible con el tejido diana y el medio fisiológico local en el cual se va a administrar la forma de dosificación, que incluye los productos de biodegradación compatibles;
- facilitar una dispersión estable y reproducible del agente terapéutico, preferiblemente para formar una matriz de agente terapéutico-polímero, con la liberación de agente terapéutico activo que se produce a través de una o ambas de las siguientes vías: (1) difusión del agente terapéutico a través de la forma de dosificación (cuando el agente terapéutico es soluble en el polímero o mezcla de polímeros que forman la forma de dosificación); o (2) liberación del agente terapéutico al biodegradarse la forma de dosificación; y
- capacidad para unirse con uno o más epítopos celulares y/o de la matriz intersticial, preferiblemente con alrededor de 1 a alrededor de 10.000 enlaces de proteína/péptido de unión-forma de dosificación, y más preferiblemente con un máximo de alrededor de 1 péptido de unión-forma de dosificación por 150 angstroms cuadrados de área superficial de partícula. El número total de enlaces depende del tamaño de partícula usado. Las proteínas o péptidos de unión son capaces de acoplarse a la forma de dosificación terapéutica particulada por medio de modalidades de sándwich de ligando covalentes o modalidades no covalentes, como se enuncian aquí.
Las formas de dosificación terapéuticas de liberación sostenida nanoparticuladas de las realizaciones preferidas de la presente invención son biodegradables, y se unen a las células musculares lisas vasculares y entran en tales células primariamente mediante endocitosis. La biodegradación de tales nanoparticulados se produce a lo largo del tiempo (p.ej., 10 a 21 días) en vesículas prelisosómicas y lisosomas. Las formas de dosificación terapéuticas microparticuladas mayores preferidas de la presente invención se unen a la superficie celular diana o matriz intersticial, dependiendo de la proteína o péptido de unión seleccionado, y liberan los agentes terapéuticos para la absorción subsiguiente por la célula diana, entrando en la célula solamente algunas de las micropartículas más pequeñas mediante fagocitosis. Un profesional de la técnica apreciará que el mecanismo preciso mediante el cual la célula diana asimila y metaboliza una forma de dosificación de la presente invención depende de la morfología, fisiología y procesos metabólicos de las células.
El tamaño de las formas de dosificación particuladas terapéuticas de liberación sostenida marcadas es importante también con respecto al modo de asimilación celular. Por ejemplo, las nanopartículas menores pueden fluir con el fluido intersticial entre las células y penetrar en el tejido infundido hasta unirse con el tejido normal o neoplásico, que se ha seleccionado marcar con la proteína/péptido de unión. Esta característica es importante, por ejemplo, porque las nanopartículas siguen los canales de drenaje linfáticos desde los focos neoplásicos primarios infundidos, marcando los focos metastásicos a lo largo del tracto linfático. Las micropartículas mayores tienden a ser atrapadas intersticialmente más fácilmente en el tejido primario infundido.
Las formas de dosificación de liberación sostenida preferibles de la presente invención son microparticulados o nanoparticulados biodegradables. Más preferiblemente, las micropartículas o nanopartículas biodegradables están formadas de una matriz que contiene un polímero que se biodegrada mediante escisión aleatoria, no enzimática e hidrolítica, para liberar el agente terapéutico, formando poros dentro de la estructura particulada.
Se prefieren los polímeros derivados de la condensación de ácidos alfa hidroxicarboxílicos y sus lactonas relacionadas para el uso en la presente invención. Una fracción particularmente preferida se forma de una mezcla de poliésteres termoplásticos (p.ej., polilactida o poliglicolida) o un copolímero de componentes de lactida y glicolida, tal como poli(lactida-co-glicolida). Más adelante se muestra una estructura ejemplar, un poli(DL-lactida-co-glicolida) aleatorio, siendo los valores de x e y manipulables por un profesional de la técnica, para conseguir propiedades deseables del microparticulado o nanoparticulado.
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Otros agentes adecuados para producir formas de dosificación particuladas de la presente invención incluyen poliortoésteres y poliacetales (Polymer Letters, 18:293, 1980) y poliortocarbonatos (patente de EE.UU. nº 4.093.709), y similares.
Los particulados preferidos de matriz que contiene el polímero de ácido láctico/ácido glicólico de la presente invención se preparan mediante procesos basados en emulsión, que constituyen procesos modificados de extracción de disolvente tales como los descritos por Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112:101-116, 1985 (atrapamiento de esteroides en micropartículas);
Eldridge et al., "Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59:2978-2986, 1991 (atrapamiento de toxoides); Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6):713-720, 1991 (atrapamiento de enzimas); y Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone- Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical Science, 73(9):1294-1297, 1984 (atrapamiento de péptidos).
En general, el procedimiento para producir las formas de dosificación particuladas de la presente invención implica disolver el polímero en un disolvente de hidrocarburo halogenado, dispersar una disolución de agente terapéutico (preferiblemente acuosa) en él, y añadir un agente adicional que actúa como disolvente para el disolvente de hidrocarburo halogenado, pero no para el polímero. El polímero precipita desde la disolución de polímero-hidrocarburo halogenado sobre las gotículas de la disolución que contienen el agente terapéutico, y atrapa al agente terapéutico. Preferiblemente, el agente terapéutico se dispersa sustancialmente uniformemente dentro de la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. Después de la formación del particulado, se lava y se endurece con un disolvente orgánico. Después siguen etapas de lavado con agua y lavado con tensoactivo acuoso no iónico, antes de secar a temperatura ambiente al vacío.
A efectos de biocompatibilidad, las formas de dosificación particuladas, caracterizadas por un agente terapéutico disperso en ellas en forma de matriz, se esterilizan antes del empaquetado, almacenado o administración. La esterilización se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente para ello. Por ejemplo, se puede irradiar los particulados con radiación gamma, a condición de que la exposición a tal radiación no afecte adversamente a la estructura o función del agente terapéutico dispersado en la matriz de agente terapéutico-polímero, o de la proteína/péptido de unión unido a ella. Si el agente terapéutico o la proteína/péptido de unión se ven afectados adversamente, las formas de dosificación particuladas se pueden producir en condiciones estériles.
La liberación del agente terapéutico desde las formas de dosificación particuladas de la presente invención puede suceder como resultado de la difusión y la erosión de la matriz particulada. La velocidad de biodegradación influye directamente en la cinética de liberación del agente terapéutico. La velocidad de biodegradación es regulable mediante la alteración de la composición o estructura de la forma de dosificación de liberación sostenida. Por ejemplo, la alteración de la proporción de lactida/glicolida en las formas de dosificación preferidas de la presente invención se pueden llevar a cabo como describió Tice et al., "Biodegradable Controlled-Release Parenteral Systems", Pharmaceutical Technology, págs. 26-35, 1984; mediante la inclusión de agentes modificadores de hidrólisis de polímeros, tales como ácido cítrico y carbonato sódico, como se describió en Kent et al., "Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides", patente de EE.UU. nº 4.675.189; alterando la carga del agente terapéutico en el polímero de lactida/glicolida, siendo la velocidad de degradación inversamente proporcional a la cantidad de agente terapéutico contenida en él, y mediante selección juiciosa de un análogo apropiado de una familia común de agentes terapéuticos que exhiben potencias diferentes para alterar dichas cargas de los núcleos; y mediante la variación de tamaño del particulado, como describió Beck et al., "Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone Microcapsules: An Injectable Biodegradable Contraceptive", Biol. Reprod., 28: 186-195, 1983, o similares. Todos los métodos anteriormente mencionados para regular la velocidad de biodegradación influyen en la viscosidad intrínseca de la matriz que contiene el polímero, alterando por ello su velocidad de hidratación.
La estructura de lactida/glicolida preferida es biocompatible con el medio fisiológico de los mamíferos. Además, estas formas de dosificación de liberación sostenida preferidas tienen la ventaja de que su biodegradación forma ácido láctico y ácido glicólico, ambos productos metabólicos normales de los mamíferos.
Los grupos funcionales necesarios para la unión de la proteína/péptido de unión-forma de dosificación particulada a las partículas, se incluyen opcionalmente en la estructura del particulado, junto con las unidades poliméricas no biodegradables o biodegradables. Los grupos funcionales que son explotables para este propósito incluyen los que son reactivos con péptidos, tales como grupos carboxilo, grupos amino, grupos sulfhidrilo y similares. Las fracciones potenciadoras de unión preferidas incluyen los grupos carboxilo terminales de la matriz preferida que contiene el polímero (lactida-glicolida), o similares.
La proteína de unión de músculo liso vascular útil es un compuesto polipeptídico, peptídico o mimético (como se describe más adelante), que es capaz de unirse a una diana o marcador en un componente superficial de una célula muscular lisa vascular intacta o rota, de tal manera que permite la liberación del agente terapéutico extracelularmente en la matriz intersticial inmediata, con la subsiguiente difusión del agente terapéutico a las células musculares lisas intactas restantes, y/o la interiorización por la célula a un compartimento intracelular de la fracción entera biodegradable marcada, permitiendo la administración del agente terapéutico. Los ejemplos representativos de proteínas de unión de músculo liso vascular útiles incluyen anticuerpos (p.ej., anticuerpos monoclonales y policlonales purificados por afinidad, fragmentos F(Ac')_{2}, FAc', FAc, y Fv y/o regiones determinantes de complementariedad (RDC) de anticuerpos o sus equivalentes funcionales, (p.ej., péptidos de unión y similares)); factores de crecimiento, citoquinas, y hormonas polipeptídicas y similares; y macromoléculas que reconocen los receptores de la matriz extracelular (p.ej., receptores de integrina y fibronectina, y similares).
Otros péptidos de unión preferidos útiles para marcar la realización de la forma de dosificación de la presente invención incluyen los que se localizan en el estroma intercelular y la matriz localizada entre las células musculares lisas vasculares. Tales péptidos de unión administran el agente terapéutico al espacio intersticial entre las células diana. El agente terapéutico se libera en tales espacios intersticiales para la absorción posterior por las células musculares lisas vasculares. Los péptidos de unión preferidos de este tipo están asociados a epítopos de colágeno, glicoproteínas extracelulares tales como tenascina, fibras del retículo y elásticas y otro material de la matriz intercelular.
Los agentes terapéuticos de la invención se seleccionan para inhibir la actividad celular de una célula muscular lisa vascular, p.ej., la proliferación, migración, incremento en el volumen celular, incremento en la síntesis de matriz extracelular (p.ej., colágenos, proteoglicanos y similares), o secreción de materiales de la matriz extracelular por la célula. Preferiblemente, el agente terapéutico actúa: a) como "agente citostático" para evitar o retrasar la división celular en células en proliferación, inhibiendo la replicación del ADN (p.ej., un fármaco tal como adriamicina, estaurosporina o similares), o inhibiendo la formación de fibras fusiformes (p.ej., un fármaco tal como colchicina) y similares; o b) como inhibidor de la migración de células musculares lisas vasculares desde la pared de la media a la íntima, p.ej., un "agente antimigratorio" tal como una citocalasina; o c) como inhibidor del incremento intracelular del volumen de la célula (es decir, el volumen de tejido ocupado por una célula; un "inhibidor citoesquelético" o "inhibidor metabólico"); o d) como inhibidor que bloquea la síntesis proteica celular y/o la secreción u organización de la matriz extracelular (es decir, un "agente antimatriz").
Los ejemplos representativos de "agentes citostáticos" incluyen, p.ej., toxinas modificadas, metotrexato, adriamicina, radionúclidos (p.ej., tal como se revela en Fritzberg et al., patente de EE.UU. nº 4.897.255), inhibidores de proteína quinasas (p.ej., estaurosporina), inhibidores de enzimas específicas (tal como la enzima nuclear ADN topoisomerasa II y ADN polimerasa, ARN polimerasa, adenil guanil ciclasa), inhibidores de superóxido dismutasa, nucleotidilexotransferasa, transcriptasa inversa, oligonucleótidos antisentido que impiden la proliferación de células musculares lisas y similares, que cuando se administran en un compartimento celular a una dosis apropiada actuarán para disminuir la proliferación de una célula muscular lisa o pericito sin matar la célula. Otros ejemplos de "agentes citostáticos" incluyen los inhibidores peptídicos o miméticos (es decir, antagonistas, agonistas o inhibidores competitivos o no competitivos) de factores celulares que pueden desencadenar (es decir, en presencia de la matriz extracelular) la proliferación de células musculares lisas o pericitos: p.ej., citoquinas (p.ej., interleuquinas tales como IL-1), factores de crecimiento (p.ej., PDGF, TGF-alfa o beta, factor de necrosis tumoral, factores de crecimiento derivados de músculo liso y endoteliales, p.ej., endotelina, FGF), receptores de búsqueda (p.ej., para plaquetas o leucocitos) y receptores de la matriz extracelular (p.ej., integrinas). Los ejemplos representativos de agentes terapéuticos útiles en esta categoría de agentes citostáticos de proliferación de músculo liso incluyen: subfragmentos de heparina, triazolopirimidina (trapidil; un antagonista de PDGF), lovastatina y prostaglandinas E1 o I2.
Los ejemplos representativos de "agentes antimigratorios" incluyen inhibidores (es decir, agonistas y antagonistas, e inhibidores competitivos o no competitivos) de factores quimiotácticos y sus receptores (p.ej., quimiotaxinas del complemento tales como C5a, C5a desarg o C4a; factores de la matriz extracelular, p.ej., fragmentos de degradación de colágeno) o de proteínas citoesqueléticas intracelulares implicadas en la locomoción (p.ej., actina, elementos citoesqueléticos, y fosfatasas y quinasas implicadas en la locomoción). Los ejemplos representativos de agentes terapéuticos útiles en esta categoría de agentes antimigratorios incluyen: ácido cafeico y derivados y nilvapidina (un antagonista de calcio) y hormonas esteroideas. Los agentes terapéuticos antimigratorios preferidos son las citocalasinas.
Los ejemplos representativos de "inhibidores citoesqueléticos" incluyen colchicina, vinblastina, citocalasinas, taxol y similares, que actúan sobre las redes de microtúbulos y microfilamentos dentro de la célula.
Los ejemplos representativos de "inhibidores metabólicos" incluyen estaurosporina, tricotecenos y toxinas modificadas de difteria y ricino, exotoxina de Pseudomonas y similares. En una realización preferida, el conjugado terapéutico se construye con un agente terapéutico que es un tricoteceno simple o un tricoteceno macrocíclico, p.ej., una verrucarina o roridina. Los tricotecenos son fármacos producidos por hongos de suelo de la clase Fungi imperfecti, o se aíslan de Baccharus megapotamica (Bamburg, J.R. Proc. Molec. Subcell. Biol. 8:41-110, 1983; Jarvis & Mazzola, Acc. Chem. Res. 15:338-395, 1982). Parecen ser las moléculas más tóxicas que contienen solamente carbono, hidrógeno y oxígeno (Tamm, C. Fortschr. Chem. Org. Naturst. 31:61-117, 1974). Se ha informado que todas actúan a nivel del ribosoma como inhibidores de la síntesis proteica en las fases de iniciación, elongación o terminación.
Hay dos clases amplias de tricotecenos: los que tienen solamente una estructura central sesquiterpenoide y los que tienen un anillo macrocíclico adicional (tricotecenos simples y macrocíclicos, respectivamente). Los tricotecenos simples se pueden subdividir en tres grupos (es decir, grupos A, B y C), como se describió en las patentes de EE.UU. nºs 4.744.981 y 4.906.452 (incorporadas aquí como referencia). Los ejemplos representativos de tricotecenos simples del grupo A incluyen: escirpeno, roridina C, dihidrotricoteceno, escirpen-4,8-diol, verrucarol, escirpentriol, tetraol T-2, pentahidroxiescirpeno, 4-desacetilneosolaniol, tricodermina, desacetilcalonectrina, calonectrina, diacetilverrucarol, 4- monoacetoxiescirpenol, 4,15-diacetoxiescirpenol, 7-hidroxidiacetoxiescirpenol, 8-hidroxidiacetoxi-escirpenol (neosolaniol), 7,8-dihidroxidiacetoxiescirpenol, 7-hidroxi-8-acetildiacetoxiescirpenol, 8-acetilneosolaniol, NT-1, NT-2, HT-2, T-2 y acetil toxina T-2.
Los ejemplos representativos de tricotecenos simples del grupo B incluyen: tricotecolona, tricotecina, desoxinivalenol, 3-acetildesoxinivalenol, 5-acetildesoxinivalenol, 3,15-diacetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol (fusarenon-X), 4,15-diacetilnivalenol, 4,7,15-triacetilnivalenol y tetra-acetilnivalenol. Los ejemplos representativos de tricotecenos simples del grupo C incluyen: crotocol y crotocina. Los tricotecenos macrocíclicos representativos incluyen verrucarina A, verrucarina B, verrucarina J (satratoxina C), roridina A, roridina D, roridina E (satratoxina D), roridina H, satratoxina F, satratoxina G, satratoxina H, vertisporina, mitoxina A, mitoxina C, mitoxina B, mirotoxina A, mirotoxina B, mirotoxina C, mirotoxina D, roritoxina A, roritoxina B y roritoxina D. Además, la estructura cíclica general sesquiterpenoide de "tricoteceno" está presente también en los compuestos denominados "baccharinas" aisladas a partir de la planta superior Baccharis megapotamica, y se describen en la bibliografía, por ejemplo como reveló Jarvis et al. (Chemistry of Alleopathy, ACS Symposium Series No 268; ed A.C. Thompson, 1984, págs. 149-159).
Los ejemplos representativos de "agentes antimatriz" incluyen inhibidores (es decir, agonistas y antagonistas e inhibidores competitivos y no competitivos) de la síntesis, secreción y montaje de la matriz, reticulación organizativa (p.ej., transglutaminasas que reticulan el colágeno) y remodelado de la matriz (p.ej., después de la cicatrización de una herida). Un ejemplo representativo de un agente terapéutico útil en esta categoría de agentes antimatriz es la colchicina, un inhibidor de la secreción de matriz extracelular.
Para las realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención, los agentes terapéuticos son preferiblemente los que inhiben la actividad de las células musculares lisas vasculares sin matar las células (es decir, agentes terapéuticos citostáticos). Los agentes terapéuticos preferidos para este propósito exhiben una o más de las siguientes posibilidades: inhibir la síntesis de ADN antes de la inhibición de la síntesis proteica, o inhibir la migración de células musculares lisas vasculares a la íntima. Estos agentes terapéuticos no inhiben significativamente la síntesis proteica (es decir, no matan las células diana) y, en consecuencia, facilitan la reparación celular y la producción de matriz para estabilizar la lesión de la pared vascular causada por angioplastia, reduciendo la proliferación de las células musculares lisas.
Los agentes terapéuticos preferidos ejemplares son inhibidores de proteína quinasas, tales como estaurosporina (estaurosporina está disponible de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), citocalasinas, tales como citocalasina B (Sigma Chemical Co.) y suramina (FBA Pharmaceuticals, West Haven, Connecticut), así como nitroglicerina (DuPont Pharmaceuticals, Inc., Manuti, Puerto Rico), o sus análogos o equivalentes funcionales. Estos compuestos son citostáticos, y han demostrado ejercer inhibición en la síntesis proteica y citotoxicidad mínimas a concentraciones en las que se da una inhibición significativa en la síntesis de ADN (véase el Ejemplo 8 y las figs. 10A-10D). Se enumera un protocolo útil para identificar agentes terapéuticos útiles en las realizaciones de las formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención en el Ejemplo 8, por ejemplo. Un profesional de la técnica es capaz de diseñar protocolos experimentales sustancialmente equivalentes para hacer tal identificación para poblaciones diferentes de células diana, tales como los tipos de células diana de la monocapa adherente. Otras realizaciones de la presente invención implican agentes que son citotóxicos para las células cancerosas. Los agentes preferidos para estas realizaciones son roridina A, exotoxina de Pseudomonas y similares, o sus análogos o equivalentes funcionales. Se ha identificado una plétora de tales agentes terapéuticos, que incluyen radioisótopos y similares, y se conocen en la técnica. Además, se conocen y se emplean rutinariamente en la técnica protocolos para la identificación de fracciones citotóxicas.
Las proteínas de unión de músculo liso vascular de la invención se unen a dianas en la superficie de las células musculares lisas vasculares. Se reconocerá que las dianas específicas, p.ej., polipéptidos o carbohidratos, proteoglicanos y similares, que están asociados a las membranas celulares de las células musculares lisas vasculares, son útiles para seleccionar (p.ej., mediante clonado) o construir (p.ej., mediante ingeniería genética o síntesis química) proteínas de unión apropiadamente específicas de músculo liso vascular. Las "dianas" particularmente útiles son interiorizadas por las células musculares lisas, p.ej., al darse el recambio de antígenos constituyentes de la membrana en renovación. La interiorización por las células puede ser también mediante mecanismos que implican fagolisosomas, invaginaciones recubiertas de clatrina, redistribución o endocitosis mediada por receptor y similares. En una realización preferida, tal "diana" se ejemplifica mediante proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) sintetizados por las células musculares lisas vasculares y pericitos, y se prefiere especialmente una porción discreta (denominada epítopo aquí) de la molécula de CSPG que tiene un peso molecular aparente de alrededor de 250 kD. La diana de 250 kD es una glicoproteína N-unida que es un componente de un complejo mayor de proteoglicano de 400 kD (14). En una realización ahora preferida de la invención, se proporciona una proteína de unión de músculo liso vascular mediante el anticuerpo monoclonal NR-AN-01 (un subcultivo de NR-ML-05) que se une a un epítopo en una molécula diana de CSPG de músculo liso vascular. El anticuerpo monoclonal denominado NR-ML-05 se une según informes a un CSPG de 250 kD sintetizado por células de melanoma (Morgan et al., pat. de EE.UU. nº 4.897.255). Las células musculares lisas y pericitos también sintetizan según informes un CSPG de 250 kD, así como otros CSPGs (11). Se ha revelado un NR-ML-05 que se une a células musculares lisas (Fritzberg et al., pat. de EE.UU. nº 4.879.225). El anticuerpo monoclonal NR-ML-05 y el subcultivo NR-ML-05 nº 85-41-41-A2, congelado # A2106, se han depositado en el American Type Culture Collection, Rockville, MD, y se les ha concedido los números de acceso HB-5350 y HB-9350, respectivamente. NR-ML-05 es el origen, y equivalente estructural y funcional, del subclon NR-AN-01, revelado aquí. Se reconocerá que NR-AN-01 es sólo un ejemplo de proteína de unión de músculo liso vascular que se asocia específicamente a la diana de CSPG de 400 kD, y que también son útiles en los conjugados terapéuticos y métodos de la invención otras proteínas de unión que se asocian con esta diana y otros epítopos de esta diana (14). En el caso presente, se han seleccionado otros seis anticuerpos monoclonales murinos y dos anticuerpos monoclonales híbridos humanos, como se describe aquí, que se dirigen específicamente a CSPG de 250 kD de las células musculares lisas vasculares. Los anticuerpos también parecen ser interiorizados por las células musculares lisas después de unirse a la membrana celular. Los estudios de inmunorreactividad han demostrado también la unión de MAcs murinos al antígeno de 250 kD en 45 tejidos humanos normales y 30 neoplasias diferentes, y algunos de estos resultados se han revelado previamente (patente de EE.UU. nº 4.879.225). En esta revelación y otros estudios clínicos humanos, los MAcs dirigidos al antígeno de 250 kD de CSPG localizaron células musculares lisas vasculares in vivo. Además, se reconocerá que los residuos de aminoácidos implicados en la asociación de cinética multipunto del anticuerpo monoclonal NR-AN-01 con un epítopo antigénico de CSPG marcador (es decir, los aminoácidos que constituyen las regiones determinantes de complementariedad) se determinan mediante modelado molecular asistido por ordenador, y mediante el uso de mutantes que tienen una afinidad de unión al anticuerpo alterada. Los aminoácidos del sitio de unión y el modelo tridimensional del lugar de unión del antígeno NR-AN-01 sirven como modelo molecular para construir equivalentes funcionales, p.ej., polipéptidos cortos ("polipéptidos mínimos"), que tienen afinidad de unión por CSPG sintetizado por las células musculares lisas vasculares y pericitos.
En una realización ahora preferida para tratar la estenosis después de procedimientos quirúrgicos vasculares, p.ej., ACTP, las proteínas de unión seleccionadas, p.ej. anticuerpos o fragmentos, para el uso en la práctica de la invención tienen una afinidad de unión >10^{4} litros/mol por CSPG de 250 kD de músculo liso vascular, y también la capacidad para unirse y ser interiorizadas por células musculares lisas o pericitos.
La modelización tridimensional es útil también para construir otros equivalentes funcionales que imitan la unión de NR-AN-01 a su epítopo antigénico, p.ej., compuestos químicos "miméticos" que imitan los aspectos tridimensionales de NR-AN-01 unido a su epítopo en un antígeno diana de CSPG. Como se usa aquí, "polipéptido mínimo" se refiere a una secuencia de aminoácidos de al menos seis aminoácidos de longitud. Como se usa aquí, el término "mimético" se refiere a un polímero químico orgánico construido para conseguir la disposición espacial apropiada para unir los aminoácidos de, por ejemplo, una diana CSPG de NR-AN-01 sintetizada por células musculares lisas vasculares o pericitos.
Se reconocerá que los inventores también contemplan la utilidad de los anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpo murino "humanizado" como proteína de unión de músculo liso vascular en los conjugados terapéuticos de su invención. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal murino puede ser "hibridado" recombinando genéticamente la secuencia de nucleótidos que codifica la región Fv murina (es decir, que contiene los sitios de unión del antígeno) con la secuencia de nucleótidos que codifica una región humana de dominio constante y una región Fc, p.ej. de manera similar a la revelada en la solicitud de patente europea nº 0.411.893 A2. Se reconocerá que las moléculas de unión de músculo liso vascular humanizadas tienen la ventaja de disminuir la inmunorreactividad del anticuerpo o polipéptido en el receptor hospedador, lo cual puede ser útil para incrementar la semivida in vivo y reducir la posibilidad de reacciones inmunes adversas.
También se contemplan como péptidos de unión útiles para las formas de dosificación de liberación sostenida para el tratamiento de la reestenosis de la presente invención aquellos que localizan el estroma intercelular y la matriz localizada entre las células musculares lisas vasculares. Tales péptidos de unión administran el agente terapéutico en el espacio intersticial entre las células diana. El agente terapéutico se libera en tales espacios intersticiales para la absorción subsiguiente por las células musculares lisas vasculares. Los péptidos de unión preferidos de este tipo están asociados con epítopos de colágeno, glicoproteínas extracelulares tales como tenascina, fibras del retículo y elásticas, citoqueratina y otros componentes de la matriz intercelular. Los péptidos mínimos, compuestos químicos orgánicos miméticos, anticuerpos monoclonales humanos o humanizados y similares, que localizan el estroma y la matriz intercelular, son también útiles como péptidos de unión en esta realización de la presente invención. Tales péptidos de unión se pueden identificar y construir o aislar de acuerdo con técnicas conocidas. En las realizaciones preferidas de la presente invención, la proteína de unión de la matriz intersticial se une a un epítopo diana con una constante de asociación de al menos alrededor de 10^{-4} M.
Otras proteínas o péptidos de unión preferidos útiles en la práctica de la presente invención incluyen las fracciones capaces de localizar tejidos normales que proliferan de manera patológica, tales como los pericitos de la vasculatura intraocular implicados en la retinopatía degenerativa. El agente terapéutico se administra a las células diana para su interiorización en ellas mediante tales formas dosificación de liberación sostenida. Los péptidos mínimos, compuestos orgánicos miméticos y anticuerpos humanos o humanizados que localizan los tipos celulares normales que proliferan de manera patológica, son también útiles como péptidos de unión de la presente invención. Tales péptidos de unión se pueden identificar y construir o aislar de acuerdo con técnicas conocidas. Los péptidos de unión preferidos de estas realizaciones de la presente invención se unen a un epítopo diana con una constante de asociación de al menos alrededor de 10^{-6} M.
Los métodos de "acoplado" representativos para enlazar el agente terapéutico por medio de enlaces covalentes o no covalentes con la proteína de unión de músculo liso vascular incluyen reticuladores químicos y compuestos de reticulación heterobifuncionales (es decir, "ligadores"), que reaccionan para formar un enlace entre grupos reactivos (tales como grupos hidroxilo, amino, amido o sulfhidrilo) de un agente terapéutico y otros grupos reactivos (de naturaleza similar) de la proteína de unión de músculo liso vascular. Este enlace puede ser, por ejemplo, un enlace peptídico, enlace disulfuro, enlace tioéster, enlace amida, enlace tioéter y similares. En un ejemplo ilustrativo, los conjugados de anticuerpos monoclonales con fármacos han sido resumidos por Morgan y Foon (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor Immunology, Vol. 2, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA) y por Uhr J. of Immunol. 133:i-vii, 1984). Otro ejemplo ilustrativo en el que el conjugado contiene un agente citostático de radionúclido, patente de EE.UU. nº 4.897.255, Fritzberg et al., incorporado aquí como referencia, es instructivo en cuanto a métodos de acoplado que pueden ser útiles. En una realización ahora preferida, el conjugado terapéutico contiene una proteína de unión de músculo liso vascular acoplada covalentemente a un fármaco de tricoteceno. En este caso, el enlace covalente de la unión se puede formar entre uno o más grupos amino, sulfhidrilo o carboxilo de la proteína de unión de músculo liso vascular y a) el tricoteceno mismo; b) un ácido carboxílico de hemisuccinato de tricoteceno; c) un éster N-hidroxi succinimídico de hemisuccinato (HS) de tricoteceno; o d) complejos de tricoteceno con poli-L-lisina o cualquier portador polimérico. Los ejemplos representativos de métodos de acoplado para preparar conjugados terapéuticos que contienen un agente terapéutico de tricoteceno se describen en las patentes de EE.UU. nºs 4.906.452 y 4.744.981. Se revelan otros ejemplos que usan una hidracida para formar una unión mediante base de Schiff entre proteínas de unión y tricotecenos en la solicitud de patente en tramitación de EE.UU. nº 07/415.154.
La elección del método de acoplado estará influenciada por la elección de la proteína o péptido de unión de músculo liso vascular, proteína o péptido de unión de la matriz intersticial y el agente terapéutico, y también por propiedades físicas tales como, p.ej., la estabilidad de la duración de almacenado, y/o por propiedades biológicas tales como, p.ej., la semivida en células y sangre, la vía de compartimentalización intracelular y similares. Por ejemplo, en un conjugado terapéutico preferido ahora, los conjugados de hemisuccinato del agente terapéutico roridina A tienen una semivida en suero más larga que la de verrucarina A, y esta estabilidad incrementada da como resultado una actividad biológica significativamente incrementada.
La realización de liberación sostenida de la presente invención incluye un agente terapéutico disperso dentro de una estructura polimérica no biodegradable o biodegradable. Tal dispersión se realiza según el procedimiento descrito por Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112:101-116, 1985; Eldridge et al., "Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59:2978-2986, 1991; Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6):713-720, 1991; y Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical Science, 73(9):1294-1297, 1984.
El carácter físico y químico de la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención es susceptible de varios modos alternativos de unión a proteínas o péptidos de unión. Las formas de dosificación (de tipo de liberación sostenida) de la presente invención son capaces de unirse a proteínas/péptidos de unión a través de, por ejemplo, uniones covalentes, uniones de tipo sándwich de ligando intermedio, o absorción no covalente o atrapamiento parcial. Cuando los particulados de ácido poli(láctico/glicólico) se forman con el agente terapéutico disperso en ellos, el esqueleto de polímero sin carga se orienta tanto hacia dentro (con el agente terapéutico, casi lipofílico, contenido dentro) como hacia fuera, con la mayoría de los grupos carboxilo terminales. Estos grupos carboxilo superficiales pueden servir como lugares de unión covalente cuando se activan (mediante, por ejemplo, una carbodiimida) para grupos nucleofílicos de la proteína/péptido de unión. Tales grupos nucleofílicos incluyen grupos épsilon amino de lisina (unión amida), grupos hidroxilo de serina (unión éster) o grupos mercaptano de cisteína (unión tioéster). Las reacciones con grupos particulares dependen del pH y el estado de reducción de las condiciones de reacción.
Por ejemplo, los particulados de ácido poli(láctico/glicólico) que tienen grupos de ácido carboxílico terminales se hacen reaccionar con N- hidroxibenzotriazol en presencia de una carbodiimida hidrosoluble de fórmula R-N=C=N-R' (en la que R es un grupo 3-dimetilaminopropilo o similar, y R' es un grupo etilo o similar). Los particulados derivados de benzotriazol (es decir, fracciones que albergan imidato activado) se hacen reaccionar después con una fracción nucleofílica de la proteína/péptido, tal como una fracción épsilon amino disponible. Alternativamente, p-nitrofenol, tetrafluorofenol, N-hidroxisuccinimida o similares son útiles para formar un éster activo con los grupos carboxilo terminales de los particulados de ácido poli(láctico/glicólico) en presencia de carbodiimida. Otras fracciones nucleofílicas de la proteína/péptido de unión incluyen grupos hidroxilo de serina, tioles libres endógenos de cisteína, grupos tiol que se derivan de la reducción de puentes disulfuro de la proteína/péptido de unión usando los agentes reductores empleados comúnmente para ese propósito (p.ej., cisteína, ditiotreitol, mercaptoetanol y similares), y similares. Adicionalmente, los grupos carboxilo terminales de los particulados de ácido poli(láctico/glicólico) son activables mediante reacción con cloruro de tionilo para formar una fracción derivada de cloruro de acilo. Los particulados derivados se hacen reaccionar después con grupos nucleofílicos del péptido/proteína de unión para producir las formas de dosificación marcadas de la presente invención.
La conjugación directa de la forma de dosificación de liberación sostenida-proteína o péptido de unión puede alterar el reconocimiento de la proteína/péptido de unión por parte de la célula diana. Las técnicas de unión de tipo sándwich de ligando son alternativas útiles para conseguir la unión de forma de dosificación de liberación sostenida-proteína/péptido de unión. Tales técnicas implican la formación de una cubierta de péptido o proteína primaria, usando una proteína que no se une a la población celular diana. La proteína/péptido de unión se une después a la cubierta de péptido o proteína primaria, para proporcionar el particulado resultante con proteína/péptido de unión funcional. Un enfoque de tipo sándwich de ligando ejemplar implica la unión covalente de avidina o estreptoavidina a los particulados a través de grupos funcionales como se describió anteriormente, con respecto al enfoque de unión "directo". La proteína o péptido de unión se modifica, preferiblemente de forma mínima, con biotina funcionalizada (p.ej., a través de éster, hidracida, yodoacetal, maleimidilo activos, o grupos funcionales similares). La unión del ligando (es decir, el péptido o proteína de unión/biotina funcionalizada) a los lugares de unión disponibles de biotina de la cubierta de proteína primaria de avidina/estreptoavidina tiene lugar mediante el uso de una cantidad saturante de proteína/péptido biotinilado.
Por ejemplo, los particulados de ácido poli(láctico/glicólico) que tienen grupos ácido carboxílico terminales se activan con carbodiimida, y se hacen reaccionar consecutivamente con avidina o estreptoavidina. La proteína o péptido de unión se hace reaccionar con éster de biotinamidocaproato de N-hidroxisuccinimida a una proporción molar de 1-3 de compuesto que contiene biotina respecto de la proteína/péptido de unión, para formar una proteína/péptido de unión biotinilada. Se incuba un exceso molar de la proteína/péptido de unión biotinilada con los particulados modificados con avidina, para producir una forma de dosificación marcada de la presente invención.
Alternativamente, los grupos carboxilo del particulado se biotinilan (p.ej., mediante la activación con carbodiimida del grupo carboxilo y la reacción consecutiva con aminoalquil biotinamida). Los particulados biotinilados se incuban después con una concentración saturante (es decir, un exceso molar) de avidina o estreptoavidina para formar particulados revestidos de proteína, que tienen lugares de unión de biotina libres. Tales particulados revestidos son capaces después de reaccionar con un exceso molar de proteína de unión biotinilada formada como se describió anteriormente. Otra opción implica la unión a los particulados biotinilados de péptido o proteína de unión unida a avidina o estreptoavidina.
Además, la unión de la proteína/péptido de unión-particulado se puede conseguir mediante adsorción del péptido de unión en el particulado, que se deriva del carácter no iónico del esqueleto del polímero parcialmente expuesto del particulado. En condiciones de fuerza iónica alta (p.ej., NaCl 1,0 molar), está favorecida la unión por puentes de hidrógeno e hidrofóbica entre particulado-proteína/péptido de unión.
Además, la proteína/péptido de unión se puede atrapar parcialmente en la matriz polimérica del particulado durante su formación. En estas circunstancias, tal proteína/péptido de unión atrapada proporciona un carácter de unión selectiva residual al particulado. Se prefieren condiciones de formación del particulado suaves, tal como las empleadas por Cohen et al., Pharmaceutical Research, 8: 713-720 (1991) para esta realización de la presente invención. Tal proteína de unión atrapada es también útil en la unión a una célula diana de un particulado parcialmente degradado que ha sufrido exocitosis. Otras formas de dosificación del particulado polimérico (p.ej., formas de dosificación no biodegradables) que tienen diferentes grupos funcionales expuestos se pueden unir a las proteínas o péptidos de unión según los principios discutidos anteriormente.
Los polímeros no biodegradables ejemplares útiles en la práctica de la presente invención son poliestirenos, polipropilenos, copolímeros acrílicos de estireno y similares. Tales polímeros no biodegradables incorporan, o se pueden modificar para incorporar, grupos funcionales para la unión de la proteína/péptido de unión, que incluyen grupos de ácido carboxílico, grupos amino primarios alifáticos, grupos amino aromáticos y grupos hidroxilo.
Los grupos funcionales de ácido carboxílico se unen a la proteína o péptido de unión usando, por ejemplo, los mecanismos de reacción enumerados anteriormente para las formas de dosificación de particulado polimérico biodegradables de ácido poli(láctico/glicólico). Los grupos funcionales amino primarios se unen mediante, por ejemplo, su reacción con anhídrido succínico para formar una fracción carboxiterminal que se puede unir al péptido/proteína de unión como se describió anteriormente. Adicionalmente, los grupos amino primarios se pueden activar con bromuro de cianógeno y formar enlaces de guanidina con los grupos amino primarios de la proteína/péptido de unión. Los grupos funcionales amino aromáticos, por ejemplo, se diazotan con ácido nitroso para formar fracciones de diazonio, que reaccionan con las tirosinas de la proteína/péptido de unión, produciendo por ello un enlace diazoico entre el particulado no biodegradable y la proteína/péptido de unión. Los grupos funcionales hidroxilo se acoplan a los grupos amino primarios de la proteína/péptido de unión, por ejemplo, convirtiendo la fracción hidroxilo en un grupo funcional de ácido carboxílico terminal. Tal conversión se puede realizar por medio de reacción con ácido cloroacético, seguida de reacción con carbodiimida. Las técnicas de sándwich, adsorción y atrapamiento, discutidas anteriormente con respecto a los particulados biodegradables, son aplicables análogamente a la fijación de particulado no biodegradable-proteína/péptido de unión.
En una realización preferida, el marcado es específico para células potencialmente en proliferación que dan como resultado músculo liso incrementado en la región de la íntima de una localización vascular dañada, p.ej., después de angioplastia, p.ej., pericitos y células musculares lisas vasculares. Los aspectos de la invención se refieren a modalidades terapéuticas en las que el conjugado terapéutico de la invención se usa para retrasar, reducir o eliminar la proliferación de músculo liso después de angioplastia, p.ej., ACTP, aterectomía y ateroablación rotacional coronaria transluminal percutánea.
Las formas de dosificación de liberación sostenida de una realización de la invención pueden necesitar solamente ser administradas en una dosificación terapéutica antiproliferativa, suficiente para exponer a la forma de dosificación las capas celulares proximales (6 a 9) de las células musculares lisas de la túnica media que revisten la luz. Esta dosificación es determinable empíricamente, p.ej. a) infundiendo los vasos de sistemas de modelos animales adecuados y usando métodos de microscopía inmunohistoquímica, fluorescente o electrónica para detectar la forma de dosificación y sus efectos; y b) llevar a cabo estudios in vitro adecuados.
En un ejemplo representativo, esta dosificación terapéuticamente efectiva se consigue determinando en un cultivo tisular de células musculares lisas la dosificación de agente pericelular, que en una exposición continuada da como resultado un efecto terapéutico entre las dosis efectivas tóxica y mínima. Este nivel terapéutico se obtiene in vivo determinando el tamaño, número y concentración del agente terapéutico y la velocidad de liberación necesarios para que los particulados infundidos entre las células musculares lisas de la pared arterial mantengan esta dosificación terapéutica pericelular. La forma de dosificación debería liberar el agente terapéutico a una velocidad que se aproxima a la dosis pericelular de los siguientes agentes terapéuticos ejemplares: de alrededor de 0,01 a alrededor de 100 microgramos/ml de nitroglicerina, de alrededor de 1,0 a alrededor de 1000 microgramos/ml de suramina, de alrededor de 0,001 a alrededor de 100 microgramos/ml de citocalasina y de alrededor de 0,01 a alrededor de 10^{5} nanogramos/ml de estaurosporina.
Los expertos en la técnica reconocerán que las dosificaciones terapéuticamente efectivas deseadas de la forma de dosificación de liberación sostenida de la invención serán dependientes de varios factores, que incluyen, p.ej.: a) la afinidad de unión de la proteína de unión asociada a la forma de dosificación; b) la presión atmosférica y la duración de la infusión; c) el tiempo durante el cual la forma de dosificación administrada permanece en el lugar de actuación; d) la velocidad de liberación del agente terapéutico desde la forma de dosificación particulada; e) la naturaleza del agente terapéutico empleado; f) la naturaleza del traumatismo y/o la terapia deseada; y/o g) la localización intercelular y/o intracelular de la forma de dosificación particulada. Los profesionales expertos especializados en administrar fármacos a dosificaciones terapéuticamente efectivas (p.ej., monitorizando los niveles de agente terapéutico y observando los efectos clínicos en los pacientes), son capaces de determinar la dosificación óptima para un paciente individual basándose en la experiencia y el juicio profesional.
También se reconocerá que la selección de un agente terapéutico que ejerce su efecto intracelularmente, p.ej., sobre los ribosomas o el metabolismo del ADN, influirá en la dosis y el tiempo necesarios para conseguir una dosificación terapéuticamente efectiva, y que este proceso se puede reproducir en estudios in vitro y con animales, como los descritos en los ejemplos que se proporcionan más adelante, para determinar el intervalo de concentraciones en el que el conjugado terapéutico o la forma de dosificación se deberían administrar para conseguir los efectos de retrasar, reducir o evitar la reestenosis después de angioplastia. Por ejemplo, los conjugados terapéuticos marcados radiactivamente con emisores alfa, beta o gamma, de actividades específicas conocidas (p.ej., milicurios por milimol o miligramo de proteína), son útiles para determinar la dosificación terapéuticamente efectiva usándolos en estudios con animales y ensayos con humanos, con representación cuantitativa de imágenes o autorradiografía de cortes histológicos, para determinar la concentración de conjugado terapéutico que es necesaria para el protocolo terapéutico. Se alcanzará una dosificación terapéuticamente efectiva del conjugado terapéutico o la forma de dosificación, cuando se cumplan al menos tres condiciones: a saber, (1) el conjugado terapéutico o la forma de dosificación se distribuye en las capas de la íntima del vaso lesionado; (2) el conjugado terapéutico o la forma de dosificación se distribuye dentro del compartimento intracelular deseado de las células musculares lisas, es decir, el compartimento necesario para la acción del agente terapéutico, o el agente terapéutico liberado extracelularmente de la forma de dosificación se distribuye dentro del compartimento intracelular pertinente; y (3) el agente terapéutico inhibe la actividad celular deseada de la célula muscular lisa vascular, p.ej., la proliferación, migración, incremento de volumen celular, síntesis de la matriz, contracción celular y similares, descritos anteriormente.
Se puede administrar opcionalmente una segunda proteína no relacionada de unión de células musculares lisas vasculares a un paciente antes de la administración del conjugado terapéutico o de la forma de dosificación, para reducir la unión no específica del conjugado terapéutico o la forma de dosificación a los tejidos. En una realización preferida, la proteína de unión no relacionada puede ser un anticuerpo que no se une a lugares en el paciente por medio de unión específica a antígeno, sino que se une de una manera inespecífica, p.ej. a través de células reticuloendoteliales que se unen a un receptor Fc, unión a asialo-receptor, y mediante unión a células que expresan ubiquitina. El "bloqueador" no relacionado disminuye la unión no específica del conjugado terapéutico o la forma de dosificación, y reduce así los efectos secundarios, p.ej. la toxicidad tisular, asociados con el uso del conjugado terapéutico o la forma de dosificación. El "bloqueador" no relacionado se administra ventajosamente de 5 minutos a 48 horas, más preferiblemente de 15 minutos a una hora, antes de la administración del conjugado terapéutico o de la forma de dosificación, aunque el tiempo puede variar dependiendo del conjugado terapéutico y de la vía o método de inyección. Los ejemplos representativos de "bloqueadores" no relacionados incluyen anticuerpos que no son reactivos con tejidos y receptores humanos, o proteínas celulares o séricas preparadas a partir de fuentes animales que al ensayarse se ha comprobado que no se unen de manera específica (p.ej. con una Ka<10^{3} M^{-1}) a dianas de membranas celulares humanas.
Se reconocerá que los conjugados y las formas de dosificación de la invención no se limitan al uso en terapia después de angioplastia: más bien, la utilidad de los conjugados terapéuticos y las formas de dosificación se prescribirán por su capacidad para inhibir las actividades celulares de células musculares lisas y pericitos de la pared vascular. Así, otros aspectos de la invención incluyen conjugados terapéuticos y formas de dosificación y protocolos útiles en la intervención terapéutica temprana para reducir, retrasar o eliminar (e incluso revertir) las placas ateroscleróticas y las áreas de hipertrofia y/o hiperplasia de la pared vascular. Los conjugados terapéuticos y las formas de dosificación de la invención también tienen utilidad para la intervención temprana en los procesos preateroscleróticos, p.ej., son útiles en pacientes con alto riesgo de desarrollar aterosclerosis, o con signos de hipertensión derivada de cambios ateroscleróticos en los vasos, o estenosis del vaso debida a hipertrofia de la pared del vaso.
Por ejemplo, en otra realización de la invención, los conjugados terapéuticos y las formas de dosificación se pueden usar en situaciones en las que la angioplastia no es suficiente para abrir una arteria bloqueada, tales como las situaciones que requieren la inserción de una endoprótesis intravascular. En esta realización de la invención, se emplea una endoprótesis intravascular metálica, plástica o biodegradable, que comprende un agente terapéutico. Los agentes terapéuticos útiles incluyen inhibidores citoesqueléticos e inhibidores de la proliferación de células musculares lisas. Un inhibidor citoesquelético preferido es una citocalasina, tal como citocalasina B o un análogo suyo, que es un equivalente funcional. Otro inhibidor citoesquelético preferido de la invención es taxol o un análogo de taxol que es un equivalente funcional.
La endoprótesis comprende preferiblemente un revestimiento biodegradable o un revestimiento no biodegradable poroso o permeable, que comprende el agente terapéutico. Una realización más preferida de la invención es una endoprótesis revestida en la que el revestimiento comprende una forma de dosificación de liberación sostenida del agente terapéutico. En una realización alternativa, la endoprótesis biodegradable puede tener también el agente terapéutico impregnado en ella, es decir, en la matriz de la endoprótesis.
También es una realización de la invención una endoprótesis biodegradable con el agente terapéutico impregnado en ella, que además está revestida con un revestimiento biodegradable o con un revestimiento no biodegradable poroso que tiene la forma de dosificación de liberación sostenida del agente terapéutico dispersada en ella. Esta endoprótesis puede proporcionar una velocidad de liberación diferencial del agente terapéutico, es decir, puede haber una liberación más rápida del agente terapéutico desde el revestimiento, seguida de una liberación retrasada del agente terapéutico impregnado en la matriz de la endoprótesis, al degradarse la matriz de la endoprótesis. Preferiblemente, en esta realización de la invención, el agente terapéutico del revestimiento es una citocalasina o taxol, y más preferiblemente es citocalasina B o taxol, o sus análogos que son funcionalmente equivalentes. La endoprótesis intravascular proporciona así un medio mecánico para proporcionar un incremento en el área luminal de un vaso, además del proporcionado por medio de la acción de endoprótesis biológica del inhibidor citoesquelético, tal como citocalasina B o taxol, impregnado en ella de forma liberable.
Además, la colocación de endoprótesis intravasculares que comprenden un agente terapéutico, que es un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas, puede proporcionar una eficacia incrementada reduciendo o evitando la proliferación de la íntima. Por lo tanto, es también una realización de la invención una endoprótesis que además comprende una citocalasina para inhibir la proliferación y migración de pericitos, que se pueden transformar en células musculares lisas y contribuir al engrosamiento de la íntima. Esta inhibición de las células musculares lisas de la íntima, y del estroma producido por las células musculares lisas y los pericitos, puede permitir la reendotelización más rápida y completa después de la colocación intervencionista de la endoprótesis vascular. La velocidad incrementada de reendotelización y estabilización de la pared del vaso después de la colocación de la endoprótesis puede reducir la pérdida de área luminal y el flujo sanguíneo disminuido, que es la causa primaria de los fracasos de las endoprótesis vasculares.
Preferiblemente, en la práctica de esta realización de la invención, las micropartículas biodegradables que contienen el agente terapéutico son de alrededor de 1 a 50 micrones. Se prefiere además que las micropartículas se biodegraden a lo largo de un periodo de 30 a 120 días, liberando en la túnica media e íntima una concentración celular sostenida de aproximadamente alrededor de 0,05 \mug/ml a alrededor de 0,25 \mug/ml de citocalasina B en el citosol, proporcionando así la difusión de niveles terapéuticos de citocalasina B sin toxicidad para las células adyacentes a la superficie de contacto de la endoprótesis y la pared del vaso.
Es conocido por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica que los vasos periféricos que se usan para injertos vasculares, en otras localizaciones periféricas o en injertos de derivación aortocoronarios, fracasan frecuentemente debido a la estenosis postquirúrgica. Ya que la infusión de citocalasina B mantiene el área luminal vascular en vasos lesionados quirúrgicamente en virtud de su actividad de endoprótesis biológica, su administración en este proceso retrasará la capacidad del vaso para contraerse, dando como resultado un área luminal mayor. Además, es una ventaja de esta realización de la presente invención que la administración de citocalasina B de esta manera evitará la constricción o espasmo que ocurre frecuentemente después de que los injertos vasculares se sometan a anastomosis en sus localizaciones proximales y distales, que puede llevar a una función alterada, si no al fracaso total, de los injertos vasculares. Así, la acción de endoprótesis en el vaso producida por citocalasina B debería disminuir la incidencia de espasmos, que pueden producirse a partir de unos días hasta varios meses después de la intervención quirúrgica de injerto.
La presente invención también proporciona un método terapéutico de combinación que implica un conjugado terapéutico citocida y un agente terapéutico citostático. El conjugado citocida incluye una molécula de unión (tal como una proteína o péptido) capaz de localizar específicamente células musculares lisas vasculares, y un agente activo capaz de matar tales células. El conjugado citocida se administra, preferiblemente intravenosamente o por medio de otra vía conveniente para ello, localiza las células diana musculares lisas, y destruye las células en proliferación implicadas en acontecimientos estenóticos o reestenóticos. Esta destrucción celular provoca la liberación de mitógenos y otros acontecimientos metabólicos, que llevan generalmente, a su vez, a la proliferación de las células musculares lisas vasculares. Las formas de dosificación antiproliferativas o anticontráctiles de liberación sostenida de la presente invención se administran a continuación, preferiblemente a través de un catéter de infusión o cualquier forma de dosificación conveniente para ello. La forma de dosificación de liberación sostenida retrasa la proliferación de las células musculares lisas vasculares y/o la migración y contracción, manteniendo por ello el diámetro luminal. Esta metodología de tratamiento constituye una aterectomía biológica útil en vasos estenóticos que se derivan de la hiperplasia de células musculares lisas vasculares y similares.
Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a modalidades terapéuticas para mantener un volumen luminal dilatado después de angioplastia u otros traumatismos del vaso. Una realización de este aspecto de la presente invención implica la administración de un agente terapéutico capaz de inhibir la capacidad de contraerse de las células musculares lisas vasculares. Los agentes ejemplares útiles en la práctica de este aspecto de la presente invención son aquellos capaces de provocar que una arteria lesionada pierda el tono vascular, de forma que la tensión hidrostática vascular normal (es decir, la tensión arterial) dilata el vaso flácido hasta su diámetro fisiológico normal, o cercano a él. La pérdida del tono vascular se puede provocar mediante agentes que interfieren con la formación o función de las proteínas contráctiles (p.ej., actina, miosina, tropomiosina, caldesmon, calponina o similares). Esta interferencia puede suceder directa o indirectamente a través de, por ejemplo, la inhibición de la modulación de calcio, fosforilación u otras rutas metabólicas implicadas en la contracción de las células musculares lisas vasculares.
La inhibición de la contracción celular (es decir, la pérdida del tono vascular) puede funcionar a través de dos mecanismos para reducir el grado de estenosis vascular. Primero, la inhibición de la contracción celular durante un periodo de tiempo prolongado limita el número de células musculares lisas que migran desde la túnica media hasta la íntima, cuyo engrosamiento da como resultado la estenosis luminal vascular. Segundo, la inhibición de la contracción celular hace que la pared muscular lisa se relaje y se dilate a la tensión hidrostática vascular normal (es decir, la tensión arterial). Los agentes terapéuticos, tales como las citocalasinas, inhiben la contracción de las células musculares lisas sin detener la síntesis proteica necesaria para que se reparen las células musculares lisas lesionadas, dañadas después de angioplastia u otra cirugía o enfermedad. La síntesis proteica también es necesaria para que las células musculares lisas secreten matriz, que sujeta o retiene la luz en un estado cercano a su diámetro sistólico máximo a medida que la lesión vascular se estabiliza (es decir, un efecto de endoprótesis inducido biológicamente).
Este efecto de endoprótesis biológica no solamente da como resultado un área luminal del vaso dilatada y una velocidad de flujo sanguíneo incrementada a través del vaso, sino que también reduce significativamente la constricción elástica después de angioplastia. La constricción elástica es un cierre agudo del vaso asociado a vasoespasmo o relajación temprana de la pared muscular, debido al choque traumático que se deriva del estiramiento excesivo del vaso por un catéter con globo durante la angioplastia. Este espasmo de la túnica media que lleva a disminuciones en el área luminal puede ocurrir en horas, días o semanas tras la dilatación con globo, al restablecerse el tono de la pared muscular vascular. Las observaciones recientes durante el examen microscópico de muestras de aterectomía sugieren que la constricción elástica puede ocurrir hasta en el 25% de las intervenciones de angioplastia clasificadas como acertadas, basándose en el angiograma inicial posterior a la intervención. Debido a que la intervención de endoprótesis biológica relaja la pared arterial después de la angioplastia con globo, el médico puede eliminar el inflado excesivo y su choque traumático resultante como medio para disminuir o retrasar el espasmo o la constricción elástica del vaso. La reducción o eliminación del inflado excesivo disminuye el traumatismo de la pared muscular del vaso, reduciendo por ello los factores determinantes de la proliferación de células musculares lisas en la íntima y, por lo tanto, reduciendo la incidencia o gravedad de la reestenosis.
La endoprótesis biológica también disminuye la incidencia de la formación de trombo. En arterias femorales de cerdo tratadas con citocalasina B, por ejemplo, la incidencia de microtrombos parietales disminuyó comparado con las arterias lesionadas con globo que no se trataron con el agente terapéutico. Este fenómeno parece ser un beneficio secundario que puede derivarse del flujo sanguíneo incrementado a través del vaso lesionado, obteniéndose dicho beneficio por medio de la práctica de la presente invención.
Las citocalasinas son agentes terapéuticos ejemplares capaces de generar un efecto de endoprótesis biológica en las células musculares lisas vasculares. Se cree que las citocalasinas inhiben tanto la migración como la contracción de las células musculares lisas vasculares interaccionando con la actina. Las citocalasinas interaccionan con los extremos de la actina filamentosa para inhibir la elongación de los filamentos de actina. Las dosis bajas de citocalasinas (p.ej., citocalasina B) también alteran las redes de microfilamentos de actina. Los datos in vitro indican que después de que las células musculares lisas vasculares eliminan la citocalasina B, las células regeneran suficiente actina polimerizada para reanudar la migración en alrededor de 24 horas. Las valoraciones in vivo revelan que las células musculares lisas vasculares recuperan el tono vascular en 2 a 4 días. Es durante este período de recuperación cuando ocurre la fijación del diámetro de la luz y el efecto de endoprótesis biológica.
El agente terapéutico se puede marcar, pero preferiblemente se administra directamente al vaso lesionado después de angioplastia u otro acontecimiento traumático. El efecto de endoprótesis biológica de citocalasina B, por ejemplo, es factible usando una única infusión del agente terapéutico en la región lesionada de la pared del vaso, a una concentración de dosis que oscila de alrededor de 0,1 microgramos/ml a alrededor de 1,0 microgramos/ml.
Se ha demostrado la inhibición de la migración de células musculares lisas vasculares (desde la túnica media hasta la íntima) en el mismo intervalo de dosis (Ejemplo 11); sin embargo, es preferible una exposición sostenida del vaso al agente terapéutico, para maximizar estos efectos antimigratorios. Si las células musculares lisas vasculares no pueden migrar a la íntima, no pueden proliferar allí. De migrar las células musculares lisas vasculares a la íntima, una forma de dosificación de liberación sostenida antiproliferativa administrada consecutivamente inhibe la proliferación de la íntima. Como resultado, la forma de dosificación de liberación sostenida de la presente invención, que incorpora una citocalasina u otro agente terapéutico antiproliferativo, se puede administrar en combinación con un agente terapéutico de citocalasina libre. De esta manera, se puede conseguir el efecto de endoprótesis biológica, así como un efecto antiproliferativo o antimigratorio, en un único protocolo de administración.
Los agentes útiles en los protocolos de la presente invención son identificables, por ejemplo, según los siguientes procedimientos. Un agente potencial para la administración de agente libre (es decir, no marcado) exhibe una o más de las siguientes características:
(i)
conserva un volumen luminal dilatado después de angioplastia (p.ej., ACTP, angioplastia transluminal percutánea (ATP) o similares) u otros traumatismos, que incluyen aterectomía (p.ej., rotoblater, láser y similares), intervenciones de derivación aortocoronaria o similares; o que se deriva de enfermedad vascular (p.ej., aterosclerosis, retinopatías secundarias a estenosis vascular o atrofia, enfermedades estenóticas cerebrovasculares o similares);
(ii)
el incremento inicial del área luminal facilitado por el agente no da como resultado, o acentúa, la estenosis crónica de la luz;
(iii)
inhibe la contracción o migración de las células diana; y
(iv)
es citostático.
Preferiblemente, un agente terapéutico empleado aquí tendrá las cuatro propiedades; no obstante, la primera y la tercera son más importantes que la segunda y la cuarta para la práctica de la presente invención. Se evaluó citocalasina B, por ejemplo, para determinar la conveniencia para el uso en protocolos de agente terapéutico libre. El efecto de endoprótesis biológica de citocalasina B es realizable usando una infusión única del agente terapéutico en la región lesionada de la pared del vaso, a una concentración de dosis que oscila de alrededor de 0,1 microgramos/ml a alrededor de 1,0 microgramos/ml. Un agente útil en las realizaciones de liberación sostenida de la presente invención exhibe una o más de las siguientes características:
(i)
conserva un volumen luminal dilatado después de angioplastia (p.ej., ACTP, angioplastia transluminal percutánea (ATP) o similares) u otros traumatismos, que incluyen aterectomía (p.ej., rotoblater, láser y similares), intervenciones de derivación aortocoronaria o similares; o que se deriva de enfermedad vascular (p.ej., aterosclerosis, retinopatías secundarias a estenosis vascular o atrofia, enfermedades estenóticas cerebrovasculares o similares);
(ii)
inhibe la proliferación de las células diana (p.ej., después de 5 minutos y 24 horas de exposición al agente, los cultivos de tejido muscular liso vascular in vitro demuestran un nivel de inhibición de la absorción de ^{3}H-timidina y, preferiblemente, exhiben una inhibición relativamente inferior de la absorción de ^{3}H-leucina);
(iii)
a una dosis suficiente para inhibir la síntesis de ADN, produce solamente efectos citotóxicos morfológicos leves a moderados (p.ej., de grado 2 ó 3 en los ensayos descritos más adelante);
(iv)
inhibe la contracción de las células diana; y
(v)
es citostático.
Al identificar un agente terapéutico que exhibe uno o más de los atributos precedentes, el agente se somete a un segundo protocolo de experimentación que implica una exposición más larga de las células musculares lisas vasculares al agente terapéutico.
Un agente útil en las realizaciones de liberación sostenida de la presente invención exhibe las siguientes características:
(i) en una exposición a largo plazo (p.ej. 5 días), el agente produce el mismo o similar efecto in vitro sobre la síntesis de ADN y la síntesis proteica en un cultivo de tejido muscular liso vascular, como se describió anteriormente para las exposiciones de 5 minutos y 24 horas; y
(ii) a una dosis efectiva en el ensayo in vitro a largo plazo para la inhibición de la síntesis de ADN, el agente exhibe efectos citotóxicos morfológicos leves a moderados durante un periodo más largo (p.ej. 10 días).
La evaluación adicional de agentes antiproliferativos potenciales dentro de la presente invención se lleva a cabo en un modelo in vivo de arteria femoral de cerdo lesionada con globo. Preferiblemente, tales agentes muestran una inhibición del 50% o más de la proliferación celular en las células musculares lisas vasculares de la túnica media, como se indica mediante "marcado rápido con BRDU" de 1 hora, antes de la recogida de tejido y la evaluación histológica. Si un agente es efectivo durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la proliferación del músculo liso de la íntima un 50% o más con una exposición única, es un agente de la presente invención que no necesita la administración en forma de dosificación de liberación sostenida. A los agentes que tienen una actividad de duración más corta se les evalúa para liberación sostenida si la toxicidad sistémica y el índice terapéutico potencial parecen permitir la administración intravenosa para conseguir el 50% de inhibición, o si el agente es susceptible de administración local a las células musculares lisas vasculares con liberación sostenida a una dosis antiproliferativa efectiva. Los agentes de liberación sostenida se evalúan en una forma de dosificación de liberación sostenida para estudios de optimización de dosis y eficacia. Preferiblemente, los agentes antiproliferativos útiles en la práctica de la presente invención disminuyen la estenosis vascular cerca de un 50% en arterias femorales de cerdo lesionadas con globo y, más preferiblemente, disminuyen la estenosis vascular hasta un punto similar en las arterias coronarias de cerdo. Tales agentes son evaluables después en estudios clínicos en humanos.
La inhibición de la proliferación celular (es decir, la síntesis de ADN) es la característica primaria para la liberación sostenida de agentes. Estaurosporina, por ejemplo, exhibe una diferencia entre la absorción de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina, de forma que es citostática a las dosis administradas. Los estudios de citotoxicidad de duración más larga no indicaron que la exposición prolongada al agente terapéutico afectase adversamente a las células diana. Además, el pulso con BRDU indicó que estaurosporina inhibe la proliferación de las células diana. Sin embargo, se puede emplear alternativamente cualquier método conveniente para evaluar la capacidad de inhibir la proliferación celular. Consecuentemente, estaurosporina es efectiva para mantener un volumen luminal dilatado.
La invención se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos.
Ejemplo 1 Unión a células musculares lisas vasculares de la pared del vaso sanguíneo in vivo
La Figura 1 ilustra la unión de NR-AN-01 (un MAc IgG2b murino) a las células musculares lisas de la pared vascular de una arteria de un paciente varón de 24 años de edad, 4 días tras la administración i.v. de NR-AN-01. La Figura 1 es una microfotografía de un corte histológico tomado a través de la región de la media de una pared arterial del paciente tras la administración de NR-AN-01, en la que el corte se hizo reaccionar ex vivo con IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP. La reacción del conjugado de HRP con MAc NR-AN-01 se visualizó añadiendo 4-cloro-1-naftol o tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina como sustrato de la peroxidasa (cromógeno). El producto de reacción del sustrato forma un precipitado insoluble púrpura o marrón oscuro en el lugar de reacción (mostrado en #2, Figura 1). Se usó una tinción de contraste para visualizar el material colágeno de la matriz extracelular (mostrado en #2, Figura 1) o los núcleos celulares (#1, Figura 1). Las células musculares lisas se visualizan bajo examen microscópico como células teñidas de púrpura. Esta microfotografía demuestra la capacidad del MAc para unirse específicamente a músculo liso vascular humano in vivo, y para ser interiorizado por las células y permanecer en las células durante periodos prolongados.
Ejemplo 2 Conjugados terapéuticos que contienen agentes terapéuticos de tricoteceno
Se construyeron conjugados de NR-AN-01 y roridina A acoplando químicamente un derivado de hemisuccinato de la citotoxina de tricoteceno (como se describe más adelante) a un anticuerpo monoclonal designado NR-AN-01. Se prepararon dos conjugados, uno acoplado en la posición 2' de roridina A, y el otro en la posición 13'. Se usaron dos esquemas en esta síntesis, como se representa en la Figura 2 y la Figura 3. Después se purificó el conjugado de la roridina A sin reaccionar mediante cromatografía en columna de SEPHAROSE® PD-10 (Pharmacia; Piscataway, NJ), se analizó mediante cromatografía líquida a alta presión de exclusión por tamaño, y las fracciones de la columna se caracterizaron mediante SDS-PAGE e isoelectroenfoque (IEF), como se describe más adelante.
La Figura 2 muestra esquemáticamente el primer esquema de reacción para la síntesis de succinimidato de hemisuccinil roridina A (NHS-HS-RA) por medio de un proceso de dos etapas con los reactivos: anhídrido succínico, trietilamina (NEt_{3}) y dimetilaminopiridina (DMAP) presentes en diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) a temperatura ambiente (TA); y los reactivos N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) también en CH_{2}Cl_{2} a TA.
La Figura 3 muestra esquemáticamente el segundo esquema de reacción para la síntesis de succinimidato de hemisuccinil roridina A (NHS-HS-RA) por medio de un proceso de cinco etapas con los reactivos: cloruro de t-butildimetilsililo (TBMS-Cl) e imidazol en dimetilformamida (DMF) a temperatura ambiente (TA); anhídrido acético, trietilamina (TEA) y dietilaminopiridina en diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) a TA; anhídrido succínico, trietilamina (TEA) y dimetilaminopiridina (DMAP) en (CH_{2}Cl_{2}) a TA; y N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexil carbodiimida (DCC).
Síntesis de ácido 2' roridina A hemisuccínico (2)
Se añadieron 15 ml de diclorometano a 0,5 g (0,94 mmoles) de roridina A. A esta disolución se le añadieron con agitación 0,104 g (1,04 mmoles) de anhídrido succínico. Se añadieron a la mezcla de reacción 0,2 ml de trietilamina en 5 ml de diclorometano. A la mezcla de reacción homogénea se le añadió una cantidad catalítica de dimetilaminopiridina, y se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó cromatografía en capa fina (CH_{2}Cl_{2} : CH_{3}OH = 9,7 : 0,3 con unas gotas de ácido acético). Al final de la reacción, se añadieron 0,3 ml de ácido acético glacial, y se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo bruto seco se repartió entre agua y cloruro de metileno. Los extractos combinados de cloruro de metileno (3 x 50 ml) se secaron con sulfato sódico anhidro, se eliminó el disolvente al vacío y se secó para dar 0,575 g (96%) de una mezcla bruta de tres compuestos. La separación preparativa en HPLC C18 de la mezcla bruta en 50% de acetonitrilo-agua con 2% de ácido acético dio 0,36 g (60%) de 2 en forma de sólido blanco.
Síntesis de 2'-roridina A hemisuccinato de succinimidilo (3)
A 0,3 g (0,476 mmoles) de ácido 2' roridina A hemisuccínico en 30 ml de diclorometano se le añadieron 0,055 g (0,478 mmoles) de N-hidroxisuccinimida. Se añadieron 0,108 g (0,524 mmoles) de diciclohexilcarbodiimida a la mezcla de reacción transparente. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 6 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó CCF (CH_{2}Cl_{2} : CH_{3}OH = 9,7 : 0,3 con unas gotas de ácido acético) como disolvente de desarrollo. Se añadieron unas gotas de ácido acético glacial a la mezcla de reacción, y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se añadió diclorometano al residuo seco, y el DCU precipitado se filtró. Se eliminó el disolvente del filtrado a presión reducida para dar un sólido blanco. Del producto bruto se purificaron 0,208 g (60%) de 3 mediante HPLC preparativa en 50% de acetonitrilo con 2% de ácido acético como fase móvil.
Síntesis de 13'-t-butildimetilsilil roridina A (4)
A una disolución de 72,3 mg (0,136 mmoles) de roridina A en 0,5 ml de dimetilformamida se le añadieron 0,055 g (0,367 mmoles) de cloruro de t-butildimetilsilil y 0,025 g (0,368 mmoles) de imidazol. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó cromatografía en capa fina de gel de sílice, usando 1% de MeOH-CHCl_{3} como disolvente de desarrollo. El disolvente de la mezcla de reacción se eliminó al vacío y se secó. El producto bruto se repartió entre agua y cloruro de metileno. Se eliminó el disolvente de los extractos combinados de cloruro de metileno a presión reducida y se secó. El producto bruto se purificó mediante cromatografía por desorción súbita usando EtOAc : hexano (1:3) como disolvente de elución. Se eliminó el disolvente de los eluyentes a presión reducida para dar 0,66 g (75%) de 4 en forma de sólido.
Síntesis de 13'-t-butildimetilsilil 2' acetil roridina A (5)
A 0,1 g (0,155 mmoles) de 13'-t-butildimetilsilil roridina A en 10 ml de diclorometano se le añadieron 0,3 ml de anhídrido acético, 0,2 ml de trietilamina y unos cristales de dimetilaminopiridina, y se guardó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó CCF en 1% de metanol-cloruro de metileno como disolvente de desarrollo. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se purificó mediante una columna de gel de sílice usando 1% de metanol-cloroformo como disolvente de elución. El disolvente de los eluyentes se eliminó al vacío para dar 0,085 g (80%) de 5 en forma de sólido.
Síntesis de 2' acetil roridina A (6)
A 0,05 g (0,073 mmoles) de 2' acetil 13'-t-butildimetilsilil roridina A en 5 ml de tetrahidrofurano se le añadieron 0,3 ml de disolución de fluoruro de tetrabutil-amonio 1M en THF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó cromatografía en capa fina de gel de sílice, usando 1% de MeOH-CHCl_{3} como disolvente de desarrollo. Se eliminó el disolvente de la mezcla de reacción a presión reducida y se secó. El producto bruto se purificó mediante una columna de gel de sílice usando 1% de CH_{3}OH-CHCl_{3} como disolvente de elución. El disolvente de los eluyentes combinados se eliminó al vacío para dar 0,020 g (48%) de 6 en forma de sólido.
Síntesis de 2'-acetil 13'-hemisuccinil roridina A (7)
A 0,05 g (0,087 mmoles) de 2'-acetil roridina A en 1 ml de diclorometano se le añadieron 0,025 (0,25 mmoles) de anhídrido succínico y 35 ml de trietilamina. Se añadieron unos cristales de dimetilaminopiridina como catalizador. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó cromatografía en capa fina, usando 5% de MeOH-CH_{2}Cl_{2} como disolvente de desarrollo. Al final de la reacción se añadieron 30 ml de ácido acético glacial. Se eliminó el disolvente de la mezcla de reacción a presión reducida y se secó. El producto bruto se repartió entre agua y acetato de etilo. Se eliminó el disolvente de las fracciones de acetato de etilo a presión reducida. El producto bruto se purificó haciéndolo pasar por una columna de gel de sílice, para dar 0,039 g (66%) de 7 en forma de sólido blanco.
Síntesis de hemisuccinato de succinimidil 2'-acetil 13'-roridina A (8)
A 0,036 g (0,0050 mmoles) de ácido 2'-acetil 13'-roridina A hemisuccínico en 2 ml de diclorometano se le añadieron 0,009 g (0,09 mmoles) de N-hidroxisuccinimida. A la disolución agitada se le añadieron 0,012 g (0,059 mmoles) de diciclohexilcarbodiimida. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. Después de la conclusión de la reacción se realizó cromatografía en capa fina de gel de sílice, usando 5% de MeOH-CH_{2}Cl_{2} como disolvente de desarrollo. Se añadieron unas gotas de ácido acético glacial a la mezcla de reacción. Se eliminó el disolvente de la mezcla de reacción a presión reducida y se secó. El producto bruto se purificó mediante una columna de gel de sílice, usando 5% de MeOH-CH_{2}Cl_{2} como disolvente de elución. El disolvente de los eluyentes combinados se eliminó al vacío para dar 0,025 g (61%) de 8 en forma de sólido blanco.
Conjugación de hemisuccinato de succinimidil 2'-roridina A (3) y hemisuccinato de succinimidil 2'-acetil 13'-roridina A (8) con anticuerpo entero NR-AN-01 (MAc)
Las reacciones de conjugación se realizaron a pH 8,0 en tampón borato, en presencia de 25% de disolvente dimetilsulfóxido (DMSO) a temperatura ambiente, con mezcla lenta durante 45 minutos antes de la purificación mediante cromatografía por filtración en gel. Las proporciones molares de precursor de fármaco de tricoteceno respecto de anticuerpo fueron 25:1 y 40:1 para los análogos de 2' y 13' roridina A (3 y 8), respectivamente. La concentración de anticuerpo fue de 0,9 a 1,0 mg/ml durante la reacción de conjugación.
Una reacción típica de análogo 2' (3) con 25 mg de anticuerpo fue como sigue:
Se añadieron 10 ml de PBS y 5 ml de tampón borato (0,5 M, pH 8,0) a 4,7 ml de 5,3 mg de Ac/ml en solución salina tamponada con fosfato (es decir, PBS; NaCl 150 mM, fosfato 6,7 mM, pH 7,3). Después se añadieron gota a gota a lo largo de un periodo de 15 segundos 6,3 ml de DMSO que contenía 1,37 mg de hemisuccinato de succinimidil 2' roridina A (3), agitando lentamente la mezcla de reacción.
Purificación
Para purificar, se aplicaron alícuotas de reacción de un ml a columnas Pharmacia PD-10 Sepharose® equilibradas con PBS. El conjugado eluido se recogió en fracciones de 2,4 a 4,8 ml. Las alícuotas de conjugado purificado en PD-10 se mezclaron después y se concentraron en un concentrador Amicon PM-10 DiAflo® hasta 1,5 a 2,0 mg de Ac/ml; se filtraron de forma estéril a través de un Gelman Acrodisc® de 0,2 \mum, y se pusieron en viales de vidrio estériles con un volumen de 5 ml.
El conjugado 2' se congeló rápidamente en nitrógeno líquido, y después se almacenó a -70ºC hasta su uso. El conjugado 13' roridina A NR-AN-01 se almacenó congelado o refrigerado (es decir, 5-10ºC).
Caracterización de los conjugados
La concentración de proteína se determinó mediante ensayo de BCA usando el método de reactivo de cobre (Pierce Chemical Corp.).
La valoración del grado de modificación de anticuerpo se realizó hidrolizando primero una alícuota de conjugado en carbonato 0,2 M, pH 10,3 durante 4 horas (a temperatura ambiente para el conjugado 2' o a 37ºC para el conjugado 13'), seguido de filtración a través de una membrana PM-30. Después se analizó la roridina A en el filtrado en HPLC de fase inversa de C-18 usando una fase móvil de proporción 50:48:2 CH_{3}CN:H_{2}O:HOAc, respectivamente. Se usó un factor de corrección de 1,32 para corregir la descomposición paralela de los anillos macrocíclicos, que dan productos polares durante la hidrólisis del conjugado 13'.
Se realizó también cromatografía de exclusión por tamaño en HPLC de DuPont Zorbax® e isoelectroenfoque usando placas de gel Serva® (pH de 3 a 10). No se observó ninguna señal de agregación mediante HPLC.
El inmunoensayo de los conjugados roridina A-anticuerpo se realizó mediante ELISA competitivo usando Ac-biotinilado con detección de estreptoavidina/peroxidasa, o mediante un ensayo de unión competitiva a células usando anticuerpo marcado con ^{125}I. Alternativamente, se midió la inmunorreactividad en condiciones de saturación de antígeno en un ensayo de unión a células, en el que el anticuerpo se marcó primero con un trazador de I-125 mediante el método de la cloramina T, y después se modificó consecutivamente con precursores de 2' y 13' roridina A.
La fórmula estructural del tricoteceno se muestra a continuación:
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Ejemplo 3 Cinética de unión a células musculares lisas
Para la administración mediante catéter i.v., es deseable que los conjugados terapéuticos de la invención se administren en menos de 3 a 5 minutos, de forma que el flujo sanguíneo se pueda restablecer en el paciente. Por lo tanto, se llevaron a cabo estudios para determinar la cinética de unión de una proteína de unión de músculo liso con una Ka>10^{9} litros/mol. Debido a que las células musculares lisas vasculares humanas crecen lentamente en cultivo, y a que se descubrió que las células musculares lisas de babuino expresan el marcador de superficie celular CSPG humano, se usaron células musculares lisas arteriales BO54 de babuino y células A375 M/M humanas (melanoma; ATCC #CRL1619) que tenían el marcador de superficie CSPG en muchos de los estudios descritos en los ejemplos, más adelante.
Para los estudios cinéticos de unión, se sembraron células A375 M/M y BO54 en placas de microtitulación de 96 pocillos estériles, 2500 células/pocillo. Las placas se envolvieron en papel de aluminio, y se incubaron a 37ºC durante la noche en una atmósfera humectada de 5% CO_{2}/95% aire. Tras aproximadamente 18 horas, se sacaron las placas de incubación y se fijaron las células con 0,05% de glutaraldehído durante 5 minutos, para impedir el recambio de membrana. Después de la fijación, las placas se lavaron exhaustivamente con PBS que contenía 0,5% de Tween-20®. Se prepararon diluciones a un medio en serie de un conjugado terapéutico de NR-AN-01 que contenía roridina A, a concentraciones de proteína de 10 mg/ml a 20 ng/ml, y cada dilución se alicuotó en dos pocillos. Las placas se incubaron a 4ºC con NR-AN-01 durante 5, 15, 30 y 60 minutos, tras lo cual se eliminó la proteína no unida mediante aspiración, y se añadieron 100 ml de tampón SP (5% de suero de pollo/0,5% Tween-20® en PBS) a cada pocillo. Se eliminó el tampón SP, y se visualizó el conjugado terapéutico NR-AN-01 unido a las células añadiendo 100 ml de IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a cada pocillo; incubando a 4ºC durante 1 hora; lavando con PBS/0,05% Tween® para eliminar IgG de cabra no unido; y añadiendo sustrato cromogénico de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS) (es decir, para HRP). Tras incubar durante 30 minutos, se cuantificó la cantidad de NR-AN-01 unido a las células midiendo la absorbancia a 415 nm y 490 nm, usando un lector de placas de ELISA equipado para la recogida de datos mediante un ordenador Compaq.
La Figura 4A representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro en los que las células A375 m/m de marcador positivo se mantuvieron a 4ºC (es decir, para impedir el recambio de membrana) durante 5 minutos (cuadrados claros, Figura 4A), 15 minutos (rombos oscuros, Figura 4A), 30 minutos (cuadrados oscuros, Figura 4A) o 60 minutos (rombos claros, Figura 4A) con concentraciones diferentes de NR-AN-01 (NRAN01 \mug/ml). La unión del MAc NR-AN-01 a las células A375 se cuantificó lavando para eliminar el anticuerpo no unido, añadiendo IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP para reaccionar con el MAc unido a las células, lavando para eliminar el segundo anticuerpo de cabra no unido, y añadiendo sustrato de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS) para la peroxidasa. El desarrollo de color se monitorizó tras 30 minutos a 415 nm y 490 nm (ABS415, 490).
La Figura 4B representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro llevados a cabo de manera similar a la descrita anteriormente con respecto a la Figura 4A, pero usando células musculares lisas BO54 de marcador positivo, es decir, en lugar de las células A375 m/m.
Los resultados presentados en la Figura 4A y la Figura 4B muestran unión significativa de NR-AN-01 a células A375 y BO54 en 5 minutos a 4ºC, incluso a la dosis más baja de 20 ng/ml.
Ejemplo 4 Efectos de roridina A y conjugados RA-NR-AN-01
Los efectos de roridina A (RA) y los conjugados RA-NR-AN-01 sobre la síntesis proteica celular (es decir, mediante la incorporación de ^{3}H- leucina) y la actividad metabólica (es decir, mediante ensayo de MTT mitocondrial) se ensayaron en los experimentos detallados en el Ejemplo 5 y el Ejemplo 6, más adelante. Los estudios del Ejemplo 4 incluyen experimentos para determinar los efectos del tratamiento a largo plazo (es decir, 24 horas) con los agentes. Los estudios del Ejemplo 5 incluyen experimentos para determinar los efectos del tratamiento de "pulso" (es decir, 5 minutos) sobre las células. En ambos estudios, la especificidad celular de los efectos se evaluó incluyendo células "diana" (es decir, células que tienen el "marcador" CSPG) y células no diana. A efectos comparativos, se incluyó también RA libre (es decir, sin acoplar) en los estudios. Los efectos sobre la síntesis proteica celular o la actividad metabólica se evaluaron inmediatamente después del tratamiento, o se dio un "periodo de recuperación" (es decir, que implicaba la incubación de las células durante la noche a 37ºC) para determinar los efectos a largo plazo de los agentes sobre las poblaciones celulares.
Efectos metabólicos tras exposición de 24 horas
Aunque se sabe que los conjugados de anticuerpo monoclonal-fármaco pueden tener cierto grado de especificidad por las células que tienen antígenos marcadores al emplearlos in vivo, se ha comprobado que es más difícil en muchos sistemas demostrar la especificidad de acción in vitro, especialmente con compuestos que son lipofílicos. Por lo tanto, se llevaron a cabo los presentes experimentos, en los que se ensayaron los efectos inhibidores del conjugado NR-AN-01-roridina A sobre células diana y no diana durante 24 horas. Los resultados con RA-NR-AN-01 se compararon con el efecto de roridina A libre durante el mismo periodo de 24 horas. Se utilizó un ensayo de azul de metil-tetrazolio (MTT) modificado, con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (Sigma) para determinar la actividad metabólica celular. Se cree que este ensayo mide la actividad deshidrogenasa mitocondrial celular. Para algunos de estos estudios, se usaron líneas celulares M14 (melanoma) y BO54 (músculo liso) como células diana de marcador positivo, y se usaron células HT29 (carcinoma de colon; ATCC #HTB38) como control de especificidad de no diana. En otros estudios, se usó A375 como célula de marcador positivo. Las células HT29 y M14 se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos a una concentración de 5,0 x 10^{3} células/pocillo, y las células BO54 se sembraron a 2,5 x 10^{3} células/pocillo. Se prepararon diluciones a un medio en serie de roridina A libre y 2'RA-HS-NR-AN-01 (es decir, roridina A acoplada por medio de un agente acoplador de hemisuccinato (HS) en la posición 2' a NR-AN-01) en DMEM, en un intervalo de concentraciones de proteína de 20 mg/ml a 40 pg/ml. Se añadieron los agentes de ensayo (por duplicado) a los pocillos de microtitulación (100 ml/pocillo), y se envolvieron las placas en papel de aluminio y se incubaron a 37ºC en una atmósfera humectada que consistía en 5% CO_{2}/95% aire durante 24 horas. Tras 24 horas, se eliminó el medio (mediante aspiración), se añadió DMEM fresco (100 ml/pocillo), y se pusieron de nuevo las células a incubar durante un "periodo de recuperación" de una noche adicional (es decir, 16-18 horas). Al final del "periodo de recuperación" se determinó la actividad metabólica celular añadiendo 20 ml a cada pocillo de una disolución de MTT de 5 mg/ml. Se cubrieron las placas y se incubaron a 37ºC durante 4 horas, y después se reveló la reacción añadiendo 100 ml/pocillo de 10% SDS/HCl 0,1 N. El producto de reacción de formazano solubilizado azul oscuro se reveló a temperatura ambiente tras 16-18 horas, y se cuantificó usando un lector de placas de microtitulación de ELISA con la absorbancia a 570 nm.
La Figura 5A representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro, en los que las células musculares lisas BO54 de marcador positivo se incubaron con concentraciones diferentes de RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA; cuadrados claros, Figura 5A) o roridina A libre (RA libre; rombos oscuros, Figura 5A) durante un periodo de 24 horas, se lavaron, y después se devolvieron al cultivo durante un periodo de recuperación adicional durante la noche (d.n.) de 16-18 horas antes de ensayar la actividad metabólica en un ensayo de MTT. Las concentraciones de RA libre y RA-NR-AN-01 se expresan como la concentración calculada de roridina A (en mg/ml, trazada en una escala logarítmica) en el ensayo (es decir, en vez de mg/ml totales de proteína NR-AN-01 en el ensayo), de forma que se podrían hacer comparaciones directas. La actividad metabólica de las células en el ensayo de MTT se presenta como el porcentaje de la actividad metabólica medida en un cultivo de control sin tratar de células (es decir, % control).
La Figura 5B representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro llevados a cabo de manera similar a los descritos anteriormente con respecto a la Figura 5A, pero comparando los efectos de RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA) solamente sobre tres tipos celulares diferentes: a saber, células musculares lisas BO54 de marcador positivo (BO54-NRAN01-RA; cuadrados claros, Figura 5B); células de control HT29 de marcador negativo (HT29-NRAN01-RA; rombos oscuros, Figura 5B); y células M14 de marcador positivo (M14-NRAN01-RA; cuadrados oscuros, Figura 5B). Como se describió anteriormente con respecto a la Figura 5A, las concentraciones en el presente experimento se expresan en términos de ug/ml de roridina A. La actividad metabólica de las células se expresa de una manera similar a la de la Figura 5A, es decir, como porcentaje de la actividad medida en un cultivo de células de control sin tratar (% control).
Los resultados presentados en la Figura 5A y la Figura 5B muestran que la actividad metabólica medida en el ensayo de MTT disminuyó significativamente en todas las poblaciones de células de ensayo, incluso 16-18 horas tras una incubación de 24 horas en roridina A libre o los conjugados 2' ó 13' RA-NR-AN-01. Los efectos de los conjugados RA-NR-AN-01 parecieron ser inhibitorios de forma inespecífica para las células diana (BO54 y M14) y no diana (HT29) (figuras 5A y 5B). Los efectos inhibitorios se observaron a una concentración de roridina A libre o conjugado de roridina A de >10 ng/ml.
A efectos comparativos, se llevó a cabo un segundo estudio en el que se evaluaron los efectos de los conjugados de la exotoxina de Pseudomonas (EP) sobre las células en un protocolo similar. Para estos estudios, se trataron células diana y no diana con EP o EP-NR-AN-01 durante 24 horas, y después se les dio un "periodo de recuperación" (como anteriormente) antes de ensayar la actividad metabólica en un ensayo de MTT.
La Figura 6A representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro llevados a cabo de una manera similar a la de los descritos anteriormente con respecto a la Figura 5A, pero diseñados para estudiar los efectos metabólicos de EP-NR-AN-01 (NRAN01-EP) sobre las células, es decir, en vez de RA-NR-AN-01. Se utilizaron tres tipos celulares diferentes: a saber, células musculares lisas BO54 de marcador positivo (BO54; cuadrados claros, Figura 6A); células de control HT29 de marcador negativo (HT29; rombos oscuros, Figura 6A); y células M14 de marcador positivo (M14; cuadrados oscuros, Figura 6A). En este estudio, la concentración de conjugado se expresa en \mug/ml de proteína NR-AN-01 (trazada en una escala logarítmica), y la actividad metabólica se expresa como el porcentaje de la actividad de MTT medida en un cultivo de control sin tratar (% control).
La Figura 6B representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro llevados a cabo de una manera similar a la de los descritos anteriormente con respecto a la Figura 6A, pero diseñados para comparar los efectos obtenidos con EP libre (EP) con los obtenidos anteriormente, es decir, en la Figura 6A, con EP-NR-AN-01. Las células, condiciones de cultivo, cálculos y presentación de los resultados son los mismos que en la Figura 6A, anteriormente.
Los resultados presentados en la Figura 6A y la Figura 6B muestran que la exposición de 24 horas a EP-NR-AN-01 o EP libre fue inhibitoria de forma inespecífica para las células a concentraciones >100 ng/ml.
Aunque se juzgó que este tipo de inhibición inespecífica es de valor potencial para la aterectomía biológica, no se consideró deseable para el tratamiento de reestenosis después de angioplastia, en la que las células muertas y moribundas pueden liberar factores que estimulan la proliferación de músculo liso.
Ejemplo 5 Efectos del tratamiento de pulso sobre la actividad celular
Se llevaron a cabo estudios adicionales para evaluar los efectos sobre las células de una exposición a corto plazo, es decir, 5 minutos, a conjugados terapéuticos que contienen roridina A. En estos estudios se evaluaron tanto la actividad metabólica (medida en ensayos de MTT) como la síntesis proteica celular (medida mediante la incorporación de ^{3}H-leucina).
Efectos tras 5 minutos de exposición; síntesis proteica
Se evaluaron los efectos de una exposición de 5 minutos a roridina A libre (RA) o a un conjugado terapéutico. Se empleó roridina A-NR-AN-01 acoplados por medio de un hemisuccinilo (HS) en la posición 2' (2'RA-HS-NR-AN-01) o en la posición 13' (13'RA-HS-NR-AN-01) (en el caso de 13'RA-HS-NR-AN-01, la posición 2' de roridina A además estaba acetilada). Se diluyeron los conjugados de RA, 2' ó 13'RA-NR-AN-01 a un medio en DMEM estéril en un intervalo de concentraciones de 400 ng/ml a 780 pg/ml de roridina A (las muestras de ensayo se normalizaron todas con respecto a roridina A, de forma que se pudieran hacer comparaciones directas de los efectos a dosis comparables). Se alicuotaron las muestras (por duplicado) en placas de microtitulación duplicadas a 100 ml/pocillo, y se incubaron a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Se determinaron los efectos tanto a corto plazo como a largo plazo de las muestras de ensayo sobre células A375 de marcador positivo y HT29 de marcador negativo. Para estudiar los efectos a corto plazo, se añadieron 100 ml/pocillo de [^{3}H]-leucina (0,5 mCi/ml) inmediatamente tras el tratamiento de 5 minutos con el conjugado (o RA), y se evaluó la síntesis proteica durante un período de cuatro horas. Para determinar los efectos a largo plazo, se trataron las células durante 5 minutos, se lavaron, y después se devolvieron al cultivo para un periodo de "recuperación" de 24 horas en medio DMEM que contenía 5% NBS/5% Serum Plus® (es decir, para células A375 o HT29) o 10% FBS (es decir, para células BO54). Al final del periodo de "recuperación", se eliminó el medio de incubación (es decir, mediante aspiración) y se añadió ^{3}H-leucina (como anteriormente). En ambos casos (es decir, sea corto plazo o largo plazo) se evaluó la síntesis proteica de las células incubando las células con ^{3}H-leucina durante 4 horas a 37ºC en una cámara humectada (como anteriormente), y todos los resultados se calculan mediante comparación con células no tratadas (es decir, 100% control). Tras 4 horas se eliminó la ^{3}H-leucina, se extrajeron las células de los sustratos mediante tratamiento con tripsina, se aspiraron (usando un recolector de células PHD^{TM} (Cambridge Technology, Inc., Cambridge, MA)) y se recogieron mediante filtración con filtros de fibra de vidrio. Los filtros de fibra de vidrio se secaron y se cuantificó la radiactividad mediante espectroscopía de centelleo líquido en un contador de centelleo líquido de Beckman.
La Figura 7A representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro llevados a cabo para investigar los efectos sobre las células de control HT29 de marcador negativo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de roridina A (RA libre; cuadrados claros, Figura 7A), o conjugados 2'RA-NR-AN-01 (2'RA-NRAN01; cuadrados oscuros, Figura 7A), o 13'RA-NR-AN-01 (13'RA-NRAN01; triángulos oscuros, Figura 7A). Las concentraciones de RA libre, 2'RA-NR-AN-01 ó 13'RA-NR-AN-01 se expresan como la concentración calculada de roridina A en el ensayo (en \mug/ml, trazada en una escala logarítmica), es decir, en vez de \mug/ml totales de proteína NR-AN-01, de forma que se pueden hacer comparaciones directas de los resultados. Para estos estudios, se trataron las células durante 5 minutos, se lavaron y después se devolvieron al cultivo durante 4 horas, durante cuyo tiempo se evaluó la síntesis proteica celular añadiendo 0,5 mCi/ml de ^{3}H-leucina al medio de cultivo. Al final del período de 4 horas se recogieron las proteínas celulares y se determinó la radiactividad. Los resultados se expresan como el porcentaje de la radiactividad registrada en un cultivo de células HT29 de control (no tratadas) (es decir, % control).
La Figura 7B representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro que investigan los efectos sobre células de control HT29 de marcador negativo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de roridina A libre (cuadrados claros, Figura 7B), 2'RA-NRAN01 (cuadrados oscuros, Figura 7B), o 13'RA-NRAN01 (triángulos oscuros, Figura 7B), como se describió anteriormente con respecto a la Figura 7A, pero en los presentes experimentos se incubaron las células durante un periodo de recuperación de 16-18 horas (es decir, durante la noche; d.n.), antes de ensayar la síntesis proteica en un ensayo de síntesis proteica con ^{3}H-leucina de cuatro horas. Los resultados se presentan de manera similar a los de la Figura 7A anterior.
Los resultados presentados en la Figura 7A y la Figura 7B muestran los efectos a corto y largo plazo, respectivamente, de RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 y 13'RA-HS-NR-AN-01 sobre la síntesis proteica en las células de control HT29. Los resultados muestran una inhibición en respuesta a dosis de la síntesis proteica celular por roridina A libre, pero no por RA-NR-AN-01 en las células HT29. La inhibición provocada por RA durante los 5 minutos de incubación fue manifiesta aun después de un periodo de recuperación de 16-18 horas (Figura 7B). Por contraste, el tratamiento de células HT29 no diana con 2'RA-HS-NR-AN-01 ó 13'RA-HS-NR-AN-01 no dio como resultado una inhibición detectable de la síntesis proteica. Así, estos resultados (por contraste con los obtenidos anteriormente a lo largo de 24 horas) parecen sugerir un grado sorprendente de especificidad para la acción in vitro de los conjugados de NR-AN-01, cuando se administró el tratamiento en un "pulso" de 5 minutos. Sin embargo, también es posible que el conjugado de NR-AN-01 fuera inactivo, y por tanto se llevaron a cabo experimentos adicionales para evaluar el efecto de los conjugados sobre las células diana.
La Figura 7C representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro que investigan los efectos sobre células A375m/m de marcador positivo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de RA libre (cuadrados claros, Figura 7C), 2'RA-NR-AN-01 (cuadrados oscuros, Figura 7C), o 13'RA-NR-AN-01 (triángulos oscuros, Figura 7C), como se describió anteriormente con respecto a la Figura 7A. En los estudios presentes, las células A375 se incubaron durante 5 minutos en el agente de ensayo, se lavaron y se analizó la síntesis proteica durante las 4 horas siguientes añadiendo 0,5 mCi/ml de ^{3}H-leucina al medio de cultivo. Los resultados de los experimentos se trazan de manera similar a los descritos anteriormente, con respecto a la Figura 7A.
La Figura 7D representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro que investigan los efectos sobre células A375 m/m de marcador positivo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de RA libre (cuadrados claros, Figura 7D), 2'RA-NRAN01 (cuadrados oscuros, Figura 7D), 13'RA-NRAN01 (triángulos oscuros, Figura 7D), como se describió anteriormente con respecto a la Figura 7B. En los estudios presentes, las células A375 se incubaron durante 5 minutos en el agente de ensayo, se lavaron y se devolvieron al cultivo para un periodo de recuperación de 16-18 horas (es decir, durante la noche; recuperación d.n.), tras el cual se evaluó la síntesis proteica durante un ensayo de síntesis proteica con ^{3}H-leucina de 4 horas. Los resultados de los experimentos se trazan de manera similar a los descritos anteriormente con respecto a la Figura 7A.
Los resultados presentados en la Figura 7C y la Figura 7D muestran los efectos a corto y largo plazo, respectivamente, de RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 y 13'RA-HS-NR-AN-01 sobre la síntesis proteica en células diana A375. El tratamiento de células diana con el conjugado terapéutico 2' ó 13'RA-NR-AN-01 dio como resultado la inhibición a corto plazo de la síntesis proteica, es decir, observada inmediatamente tras el tratamiento de pulso de 5 minutos (Figura 7C). Estos hallazgos, al combinarse con los hallazgos de la Figura 7A y la Figura 7B, anteriormente, sugieren que los conjugados RA-NR-AN-01 fueron activos, y que fueron inhibitorios de forma específica para las células diana, pero no para las células no diana. De forma interesante, cuando las células diana tratadas con "pulso" se devolvieron al cultivo, no se observaron efectos inhibitorios a largo plazo (Figura 7D). Los resultados presentados en la Figura 7C y la Figura 7D demuestran otra vez que roridina A es inhibitoria de forma inespecífica para las células de ensayo (es decir, de manera similar a la Figura 7A y la Figura 7B, anteriormente), y que su efecto sobre las células es manifiesto incluso tras un periodo de recuperación de 16-18 horas. Así, los efectos específicos de los conjugados RA-NR-AN-01 sobre las células diana durante un tratamiento de "pulso" parecen ser una propiedad de la proteína de unión NR-AN-01.
Los resultados obtenidos con células musculares lisas arteriales BO54 fueron similares a los obtenidos con las células A375 anteriormente, es decir, la roridina A libre mostró una inhibición en respuesta a dosis de la síntesis proteica a corto plazo igual al 60%, 66% y 90% del control a 200 ng/ml, 100 ng/ml y 50 ng/ml; y a largo plazo los efectos sobre la síntesis proteica fueron igual al 27%, 46% y 98% del control a las mismas dosis. Por contraste, 2' ó 13'RA-NR-AN-01 mostraron solamente 10-20% de inhibición para efectos a corto o largo plazo sobre la síntesis proteica (es decir, >80% de control).
Así, los resultados muestran un efecto reversible específico a corto plazo del conjugado de roridina A y NR-AN-01 sobre las células diana cuando se administró en forma de tratamiento de "pulso". Sin embargo, ya que solamente se evaluó la síntesis proteica en estos experimentos, era posible que la actividad metabólica celular pudiera estar afectada en las células como resultado del tratamiento de "pulso". Por lo tanto, se llevaron a cabo estudios adicionales en los cuales se evaluó la actividad metabólica después del tratamiento de "pulso".
Efectos tras 5 minutos de exposición; actividad metabólica
Se llevaron a cabo ensayos de MTT 48 horas después de una exposición de 5 minutos de células diana y no diana a RA o conjugados RA-NR-AN-01. Las células diana en estos estudios incluyeron BO54 y A375, y las células no diana incluyeron células HT29. Se sembraron placas de microtitulación de 96 pocillos estériles con 2500 células/pocillo, se envolvieron en papel de aluminio y se incubaron en una cámara humectada que contenía 5% CO_{2}/95% aire durante 16-18 horas. Se prepararon diluciones a un medio en serie de roridina A (RA), 2'RA-HS-NR-AN-01 y 13'RA-HS-NR-AN-01 de 400 ng/ml a 780 pg/ml, y se dispensaron alícuotas de 100 ml de las diluciones en pocillos por duplicado. Tras 5 minutos de exposición a las muestras de ensayo, se lavaron las células para eliminar las muestras de ensayo, y se añadió medio fresco. Se dio a las células 48 horas de recuperación antes del ensayo: es decir, se incubaron las placas durante 48 horas y después se determinó la actividad metabólica celular añadiendo 20 ml/pocillo de una disolución de MTT de 5 mg/ml. Se cubrieron las placas y se incubaron a 37ºC durante 4 horas, y después se reveló la reacción como se describió anteriormente (véase el Ejemplo 4, anteriormente). El producto de reacción de formazano solubilizado azul oscuro se reveló a temperatura ambiente tras incubación de 16-18 horas. Las muestras se cuantificaron usando un lector de placas de microtitulación de ELISA con la absorbancia a 570 nm.
La Figura 8A representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro que investigan los efectos sobre células musculares lisas BO54 de marcador positivo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de roridina A (cuadrados claros, Figura 8A), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; rombos oscuros, Figura 8A), o 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; cuadrados oscuros, Figura 8A). Los experimentos se llevaron a cabo de manera similar a la descrita anteriormente con respecto a la Figura 7B, pero la actividad metabólica se ensayó mediante el ensayo de MTT, es decir, en vez de la síntesis proteica como en la Figura 7B, y también se dio a las células 48 horas para recuperarse (en vez de 24 horas, como en la Figura 7B). Los resultados de los experimentos se trazan de manera similar a la descrita (anteriormente) con respecto a la Figura 7A.
La Figura 8B representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro que investigan los efectos sobre células A375 m/m de marcador positivo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de roridina A (cuadrados claros, Figura 8B), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; rombos oscuros, Figura 8B), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; cuadrados oscuros, Figura 8B). Los experimentos se llevaron a cabo (y se trazaron los resultados) de manera similar a la descrita anteriormente con respecto a la Figura 8A.
La Figura 8C representa gráficamente los resultados de los estudios in vitro que investigan los efectos sobre células HT29 de marcador negativo de una exposición de 5 minutos a diferentes concentraciones de roridina A (cuadrados claros, Figura 8C), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; rombos oscuros, Figura 8C), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; cuadrados oscuros, Figura 8C). Los experimentos se llevaron a cabo (y se trazaron los resultados) de manera similar a la descrita anteriormente con respecto a la Figura 8A.
Los resultados presentados en las figuras 8A-8C muestran ligeras diferencias entre los diferentes conjugados RA-NR-AN-01 a las dosis más altas, pero a las dosis más bajas 2' y 13'RA-NR-AN-01 no inhibieron significativamente la actividad metabólica de las células diana (es decir, BO54 y A375) o de las células no diana (es decir, HT29) a largo plazo (es decir, 48 horas). Así, los resultados sugieren que la inhibición a corto plazo de la síntesis proteica de las células diana (figuras 7C-7D, anteriormente) no da como resultado efectos metabólicos a largo plazo en las células, medibles en ensayos de MTT. El hecho de que estos ensayos fueron capaces de detectar alteraciones metabólicas en las células, derivadas de una exposición de 5 minutos, se puso de manifiesto mediante los resultados obtenidos con roridina A libre. En este caso, la roridina A libre fue inhibitoria de forma inespecífica para los tipos celulares diana y no diana, incluso cuando las células se expusieron al agente durante sólo 5 minutos y se devolvieron después al cultivo para el periodo de recuperación de 48 horas (figuras 8A-8C).
Así, los hallazgos con roridina A libre sugieren que el ensayo de MTT fue capaz de detectar las alteraciones metabólicas inducidas durante una exposición de 5 minutos. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que los conjugados RA-NR-AN-01 pueden inhibir específicamente la actividad celular diana (es decir, la síntesis proteica) cuando se administran en un tratamiento de "pulso", y que estos efectos fueron reversibles sin efectos a largo plazo significativos sobre la síntesis proteica o la actividad metabólica celular (medidos en un ensayo de MTT). Se juzgó que estas propiedades in vitro de los conjugados RA-NR-AN-01 son muy útiles para la inhibición in vivo de la actividad de células musculares lisas. Por lo tanto, a continuación se llevaron a cabo estudios en modelos animales para evaluar los efectos in vivo de estos conjugados terapéuticos.
Ejemplo 6 Determinación de las condiciones de infusión en un modelo animal
Los conjugados terapéuticos de la invención son útiles para inhibir la estenosis después de traumatismo o enfermedad vascular. En un ejemplo ilustrativo, el traumatismo vascular que se induce durante la angioplastia se trata durante la intervención quirúrgica extrayendo el catéter usado para realizar la angioplastia, e insertando un catéter de infusión con globo en el vaso. El catéter de infusión se coloca con la abertura de instilación (o, alternativamente, una región de membrana permeable) en el área lesionada del vaso, y después se aplica presión para introducir el conjugado terapéutico. Por ejemplo, se puede usar un catéter de infusión con dos globos, y cuando se infla un globo en cualquiera de los dos lados de la localización del traumatismo, se crea un espacio de líquido que se puede llenar con un líquido de infusión adecuado que contiene el conjugado terapéutico. Se ha informado previamente que la infusión de una enzima marcadora de peroxidasa de rábano (HRP) a una presión de 300 mm Hg durante 45 segundos en arterias coronarias de perro o humanas dio como resultado la penetración de HRP en la pared del vaso (6). Sin embargo, HRP es una molécula más pequeña que NR-AN-01, y las arterias coronarias humanas y de perro son también considerablemente más pequeñas que las arterias carótidas o femorales del presente sistema de modelo de cerdo doméstico. Por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos para determinar, en un sistema de modelo de cerdo doméstico, las condiciones de infusión adecuadas para la administración de un conjugado terapéutico a las células musculares lisas vasculares de las arterias carótidas y femorales. Se monitorizaron las condiciones de administración evaluando la penetración del conjugado terapéutico en la pared vascular, y la unión específica del conjugado terapéutico a las células musculares lisas vasculares de la pared del vaso.
Usando un catéter de infusión, se infundieron las arterias coronarias y femorales de cerdos domésticos o primates no humanos con NR-AN-01 durante 45 segundos a 3 minutos a presiones múltiples en el intervalo de alrededor de 0,4 atmósferas (300 mm Hg) a 3 atmósferas. Tras la infusión, se lavaron los vasos con solución salina estéril y se prepararon para inmunohistoquímica, usando IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP para detectar la IgG de ratón NR-AN-01 en la pared del vaso. Se determinó que se consiguió la penetración completa de NR-AN-01 en estas paredes del vaso a una presión de 3 atmósferas después de 3 minutos.
También se usó inmunohistología para determinar qué sistemas de modelos animales expresan el antígeno diana para NR-AN-01. Se expusieron cortes de tejido vascular de especies animales de experimentación fácilmente disponibles a NR-AN-01, se lavaron y se hicieron reaccionar con IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP. Se comprobó que sólo los primates no humanos y cerdos comparten el antígeno diana de NR-AN-01 de 250 kD con el hombre.
Para determinar si NR-AN-01 se podría unir de una manera específica a su antígeno diana in vivo, se infundieron las arterias coronarias y femorales de cerdos domésticos con los conjugados terapéuticos usando un catéter de infusión, se lavaron los lugares de infusión con solución salina estéril, después se cerraron los lugares quirúrgicos, y se mantuvo a los animales durante 3-5 días adicionales. Al final de este tiempo, se extirparon los lugares de infusión vascular y se prepararon para inmunohistología, una vez más usando IgG anti-ratón de cabra para identificar NR-AN-01. Se identificó NR-AN-01 en la pared del vaso de arterias coronarias y femorales de cerdo 3-5 días después de la cirugía, y NR-AN-01 pareció estar asociado solamente a las células musculares lisas vasculares. Estos hallazgos sugieren que NR-AN-01 es capaz de unirse específicamente a su antígeno diana in vivo.
Ejemplo 7 Inhibición in vivo de células musculares lisas vasculares
La proliferación del músculo liso de la íntima que sigue al traumatismo inducido mediante catéter con globo es un buen modelo para evaluar la eficacia terapéutica de los conjugados para inhibir la actividad de las células musculares lisas in vivo, en respuesta a traumatismo vascular, que incluye la reestenosis después de angioplastia. Se usaron cerdos domésticos para estudiar los efectos de NR-AN-01 (es decir, denominado proteína de unión de músculo liso vascular, o simplemente PUMLV en estos estudios; y los conjugados terapéuticos con roridina A se denominan PUMLV-RA). Se han descrito previamente los eventos que siguen normalmente a la angioplastia con globo en la arteria porcina (12). En estos estudios, la dilatación de la arteria carótida usando un globo inflado en exceso (proporción globo: arteria aproximadamente 1,5:1) dio como resultado la denudación endotelial completa a lo largo de un área de 1,5-2 cm de longitud. Aunque se seleccionó esta longitud de lesión traumática en un intento de minimizar la trombosis, todavía hubo un marcado depósito de plaquetas y formación de trombo. La intervención también dio como resultado la disección a través de la lámina elástica interna hasta la media arterial, y la necrosis de las células musculares lisas de la media. El engrosamiento de la íntima debido a la proliferación de músculo liso fue aparente 7 días después de la lesión, y alcanzó un grosor medio máximo de 85 mm a los 14 días. El aspecto histológico de esta neoíntima es muy similar al tejido neoíntimo proliferativo de la reestenosis humana (13).
Se llevó a cabo un protocolo de ensayo de dosis única en cerdos domésticos con conjugados NR-AN-01-roridina A. La administración localizada de los conjugados de ensayo, es decir, por medio de un catéter en una región de vaso lesionado limitado mediante ligaduras de lazo temporales, se diseñó para reducir la toxicidad sistémica al mismo tiempo que se proporciona un alto nivel de exposición para las células musculares lisas diana. Esta vía intrarterial de administración en estudios con modelos animales simula la vía propuesta en las arterias coronarias humanas. El protocolo de ensayo se diseñó como un cribado inicial in vivo de conjugados de proteína de unión de músculo liso vascular (PUMLV) intrarteriolar, de localización específica, administrados con catéter.
También se evaluó la toxicidad del fármaco libre, es decir, los efectos patobiológicos sobre las células musculares lisas arteriolares. Se determinó la dosificación terapéuticamente efectiva del conjugado roridina A-NR-AN-01 mediante estudios in vitro, y se determinó la presión de administración intrarteriolar apropiada administrando MAc libre y conjugados de MAc a los animales, como se describió anteriormente en el Ejemplo 7.
Se usaron seis cerdos híbridos domésticos (Duroc X), cerdos de engorde destetados de aproximadamente 13,6 kilogramos de peso corporal en el experimento. Los animales se asignaron aleatoriamente al siguiente régimen de tratamiento, en el que cada cerdo tiene cuatro tratamientos diferentes divididos entre las arterias carótida y femoral derecha e izquierda, uno de los cuales es un control de PBS (tablas 1-3, más adelante).
TABLA 1
Grupo Nº Grupo de tratamiento Descripción material
1 Control, PUMLV PUMLV, 200 \mug/ml en PBS, pH 6,5
2 Control, PBS PBS, pH 6,5, en agua estéril de inyección
3 Control, Farmaco Roridina A, 2,5 \mug/ml en PBS, pH 6,5
4 Ensayo, Conjugado PUMLV-RA2' (200 \mug/ml PUMLV y 2,5 \mug/ml RA)
5 Ensayo, Conjugado PUMLV-RA13' (200 \mug/ml PUMLV y 3,1 \mug/ml RA)
6 Ensayo, Conj+RA PUMLV-RA2' (200 \mug/ml PUMLV y 2,5 \mug/ml RA) más roridina A libre
(2,5 \mug/ml)
7 Ensayo, Conj+RA PUMLV-RA13' (200 \mug/ml PUMLV y 3,1 \mug/ml RA) más roridina A libre
(2,5 \mug/ml)
Procedimiento quirúrgico
Los conjugados de ensayo y los compuestos de control se administraron como una única infusión intrarterial, en el lugar de denudación endotelial y traumatismo inducido mediante un catéter con globo. Se desgastaron las arterias carótida y femoral a lo largo de 1 cm a 2 cm de endotelio mediante paso intraluminal de un catéter con globo de oclusión de silicona Uresil Vascu-Flo® de 23 cm, tamaño 3 (femoral) y tamaño 4 (carótida) (Uresil Technology Center, Skokie, IL), suficientemente distendido con solución salina para generar una ligera resistencia. Esta técnica produjo la distensión ligera de la arteria. Después de este tratamiento, se colocaron ligaduras de lazo proximales y distales de seda 3-0, cerca de los extremos de la región desgastada, y se usó un Infant Feeding Catheter (Cutter-Resiflex, Berkeley, CA) francés de tamaño 8 unido a una jeringa de presión Inflation Pro® (USCI, C.R. Bard, Inc., Billerica, MA), para administrar los conjugados de ensayo y los compuestos de control directamente al segmento denudado, a una presión de tres atmósferas durante tres minutos. Se quitaron las ligaduras de lazo después del periodo de exposición de tres minutos, y se restableció el flujo sanguíneo arterial. En estos estudios, las ramas de las arterias femorales o carótidas se ligaron con el hilo de sutura de seda 00 necesario para conseguir la infusión presurizada en la región tratada. Se hizo una incisión en la rama distal mayor de la arteria femoral (la arteria safena), y se usó como lugar de entrada para los catéteres, que después se hicieron pasar a la arteria femoral principal. Después de este procedimiento de cateterización en la arteria femoral principal, se ligó la rama secundaria. En estos casos, se usó la ligadura o incisión para permitir la entrada de los catéteres, y la abertura se cerró después con 3 a 4 puntos de sutura de polibutéster monofilamento 5-0 (Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR).
Procedimientos de seguimiento
Después de la cirugía, se mantuvo a los cerdos en corrales interiores de 0,9 x 1,5 metros con suelos de cemento, durante los periodos de cuarentena y recuperación quirúrgica. Después se les trasladó a pocilgas interiores/exteriores durante el resto del periodo de cicatrización de cinco semanas, antes de la recogida de tejidos para histología.
Los animales se recuperaron normalmente de la cirugía sin evidencia de hemorragia o inflamación en los lugares de cirugía. Se examinó a los seis animales de 5 a 6 días tras el tratamiento con un fonendoscopio doppler, y todas las arterias de cada animal estaban abiertas. Tras el tratamiento todos los animales tuvieron apetito, actividad y aumento de peso normales.
Evaluación macroscópica patológica e histológica
Cinco semanas después de la lesión y tratamiento de las arterias, se sedó a los animales con 0,6 ml de Telazol® (hidrocloruro de tiletamina; A.H. Robins Co., Richmond, VA) y 0,5 ml de xilacina (Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA) por 13,6 kilogramos de peso corporal mediante inyección intramuscular, se les heparinizó (2 ml de heparina sódica i.v., 1000 unidades/ml), y se sacrificaron mediante pentobarbital i.v. Se extrajeron las arterias carótida y femoral derecha e izquierda, con vasos normales incluidos tanto proximalmente como distalmente del segmento tratado. Se midieron las arterias, y se anotó la localización de las ligaduras y las anormalidades macroscópicas. Las arterias se cortaron transversalmente a intervalos de 2 mm, y se dispusieron en orden en criomoldes con compuesto de O.C.T. (temperatura de corte óptima) (Tissue Tek®, Miles Laboratories Inc., Elkhart, IN) y se congelaron en nitrógeno líquido. Los bloques se dividieron en secciones de 5 micras y se tiñeron con H&E, Massons Trichrome y Movats Pentachrome para los estudios morfológicos. También se usaron las secciones para tinción inmunohistológica del músculo liso vascular.
El examen histológico de los cortes escalonados de las arterias reveló una marcada inhibición de la proliferación del músculo liso de la íntima en las regiones lesionadas y tratadas con conjugados RA-NR-AN-01 (Tabla 2). Esta inhibición fue evidente incluso en la evaluación submacroscópica de los vasos. La inhibición de la proliferación de las células musculares lisas de la íntima se produjo con evidencia histológica mínima, o sin ella, de muerte de células musculares lisas en la pared del vaso. Se proporcionan cortes transversales de una arteria lesionada en las figuras 9A y 9B.
TABLA 2 Proliferación del músculo liso de la íntima en arterias porcinas lesionadas y tratadas
Tratamiento Nº de arterias evaluadas Hipertrofia de CML de la íntima*
med. (intervalo)
Control, MAc 4 3,75 (3-4)
Control, PBS 4 4 (4)
Control, RA 2 4 (4)
Ensayo, 2'RA
(Alta presión) 1 1 (1)
(Baja presión) 1 3 (3)
Ensayo, 13'RA
(Alta presión) 1 1 (1)
(Baja presión) 1 1 (1)
*Hipertrofia de CML de la íntima: hipertrofia de células musculares lisas de la íntima graduada en una escala de 1+ (mínimo) a 4+ (máximo).
Los resultados presentados en la Figura 9A muestran (a un aumento de 160x) un corte transversal de una arteria sin tratar 5 semanas después de angioplastia. Las características histológicas dominantes de la arteria incluyen el desplazamiento del endotelio (véase #1 en la Figura 9A) fuera de la lámina elástica interna (véase #2, Figura 9A), aparentemente debido a la proliferación del músculo liso de la íntima (véase #3, Figura 9A).
Los resultados presentados en la Figura 9B muestran (a un aumento de 160x) un corte transversal de una arteria tratada 5 semanas después de angioplastia e infusión del conjugado terapéutico RA-NR-AN-01. El vaso de este corte se sometió a una agresión mecánica mayor que la del vaso mostrado en la Figura 9A, con múltiples lugares en los que se rompió la membrana elástica externa, y se observó la proliferación asociada de células musculares lisas en las capas externas de la media (es decir, véase #4 en la Figura 9B). El tratamiento con el conjugado terapéutico inhibió la hipertrofia de la íntima, como se pone de manifiesto por la falta de desplazamiento del endotelio (véase #1, Figura 9B) desde la lámina elástica interna (véase #2, Figura 9B). Sorprendentemente, este efecto inhibidor sobre las células musculares lisas de la íntima se consiguió sin inhibir la hipertrofia de las células musculares lisas de la media en las áreas en las que se rompió la membrana elástica externa (véase #4, Figura 9B).
Este es un resultado muy afortunado, porque la cicatrización de la lesión se desarrolla en el vaso tratado sin las consecuencias adversas de hiperplasia de la íntima y estenosis o necrosis de las células musculares lisas de la media.
En estos estudios histológicos, también se hicieron comparaciones de la efectividad de los conjugados de 2' y 13'-roridina A, con el hallazgo de que el conjugado 13' (es decir, 13'RA-HS-NR-AN-01) pareció ser más activo inhibiendo la hiperplasia de la íntima de células musculares lisas que el conjugado 2' (es decir, 2'RA-HS-NR-AN-01). En este estudio, la infusión a baja presión del conjugado 13' pareció inhibir la proliferación del músculo liso más efectivamente que a alta presión, y el conjugado 13' también pareció ser más efectivo que el conjugado 2'.
En la Figura 9B, el conjugado terapéutico administrado en la localización después de angioplastia dio como resultado una inhibición de aproximadamente el 95% de la hipertrofia del músculo liso, que limitó la luz del vaso sin tratar (Figura 9A). Significativamente, el conjugado terapéutico ejerció su efecto sobre las células musculares lisas que migraban desde las capas musculares lisas de la media hacia la íntima, sin afectar tampoco al endotelio, o producir ningún signo de necrosis (es decir, muerte celular) en las células musculares lisas de las capas de la media de la pared arterial. Los estudios tampoco consiguieron mostrar signos histológicos de infiltración mononuclear o fibrosis, tal como podría derivarse de los efectos tóxicos sobre la pared del vaso. Además, se observaron signos visibles de cicatrización en las capas de la íntima de los vasos tratados, y se observó crecimiento del endotelio, es decir, células endoteliales creciendo sobre la capa fina de células musculares lisas de la íntima que se encuentra entre el endotelio y la lámina elástica interna (es decir, #1 y #2, Figura 9B). Estas observaciones histológicas combinadas sugieren las características muy deseables de cicatrización de la lesión, crecimiento del endotelio y resistencia vascular mejorada después del tratamiento con un conjugado terapéutico que inhibe la hiperplasia del músculo liso en las capas de la íntima del vaso.
Ejemplo 8 Inhibición de la síntesis de ADN y de proteínas in vitro en células musculares lisas vasculares
Se ensayó la capacidad de diversos agentes terapéuticos para inhibir la síntesis de ADN y la síntesis proteica en células musculares lisas vasculares. Se llevaron a cabo ensayos de absorción de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina, y de citotoxicidad, de acuerdo con los siguientes protocolos.
Exposición de 5 minutos; absorción de ^{3}H-leucina: Se sembraron células musculares lisas vasculares a 40.000 células/ml en placas estériles de 24 pocillos a 1 ml/pocillo. Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC, 5% CO_{2}, 95% aire en una atmósfera humectada (saturación). Se incubaron diluciones logarítmicas del agente terapéutico de interés con las células musculares lisas vasculares durante 5 minutos o 24 horas. Se diluyeron las muestras de los agentes terapéuticos en medio DMEM:F-12 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) con 5% de suero bovino fetal (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y 5% de Serum Plus® (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Después de la incubación del agente terapéutico se aspiró la disolución, y se añadió 1 ml/pocillo de ^{3}H-leucina de 0,5 microcurios/ml en DMEM sin leucina (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) con 5% de Serum Plus®. Se reincubaron las placas durante la noche a 37ºC, 5% CO_{2} en una atmósfera humectada. Se graduaron las células visualmente usando un microscopio invertido, usando una escala de graduación para determinar la viabilidad y el número de células. La graduación de 1 a 3 se basa en el porcentaje de viabilidad celular y número de células, comparado con los pocillos de control, con 3=100%, 2=70%-100% y 1=0%-70%. Un registro de esta graduación ayudó a determinar el efecto citotóxico inmediato de los agentes terapéuticos. Después se aspiró el medio, y se lavó las células dos veces con TCA frío del 5%. Se añadieron 400 microlitros de NaOH 0,2 M por pocillo, y se incubaron las placas durante dos horas a temperatura ambiente en una plataforma rotatoria. Se transfirieron 200 microlitros por pocillo de la disolución de células a viales de plástico de centelleo (Bio-Rad Laboratories), y se añadieron 4 mililitros de líquido de centelleo líquido Bio-Safe® II (Research Products InterCorp., Mount Prospect, IL) antes de agitar en vórtice. Se contó la radiactividad de los viales con un contador de centelleo líquido Beckman LS2800 conectado a soporte lógico "Data Capture" de Beckman para la conversión a un fichero de Lotus 1-2-3® y análisis usando Lotus 1-2-3®.
Exposición de 5 minutos; absorción de ^{3}H-timidina: Se incubaron células musculares lisas vasculares en medio completo con 5% de FBS (Gibco) durante la noche, a 37ºC en un ambiente humectado y con un 5% de CO_{2}, en placas estériles de 24 pocillos. Se aspiró el medio de los pocillos, y se añadió medio sin suero, suplementado con factores de crecimiento (medio basal DMEM: F-12 suplementado con mezcla de factores de crecimiento, número de catálogo I1884, que contiene insulina (5 microgramos/ml), transferrina (5 microgramos/ml) y selenito sódico (5 nanogramos/ml), disponible de Sigma Chemical, St. Louis, Missouri). Se incubaron las células en este medio durante 24 horas. Para una exposición de 5 minutos al agente terapéutico, se incubaron diluciones logarítmicas del agente terapéutico con las células en medio completo. Después de 5 minutos y aspiración del medio, se añadió 1 ml/pocillo de ^{3}H-timidina de 1,0 microcurios/ml dispersada en medio completo. La exposición de 24 horas implicó la incubación de las células con 1 ml/pocillo de ^{3}H-timidina de 1,0 microcurios/ml dispersada en medio completo, y diluciones logarítmicas del agente terapéutico a ensayarse. En ambos ensayos de exposición, después se incubaron las células durante la noche a 37ºC en un medio humectado y con un 5% de CO_{2}. Se graduaron las células visualmente, en cuanto a su viabilidad y número de células. Se lavaron las células y se prepararon para su transferencia a viales de plástico de centelleo, como se describió en el protocolo de ^{3}H-leucina. Se contó la radiactividad de los viales con un contador de centelleo líquido Beckman LS2800 conectado a soporte lógico "Data Capture" de Beckman para la conversión a un fichero de Lotus 1-2-3® y análisis usando Lotus 1-2-3®.
Estos protocolos son susceptibles para su uso con otras poblaciones celulares diana, especialmente tipos celulares de la monocapa adherente.
Evaluación de la citotoxicidad morfológica-exposición pulsada: Se sembraron células musculares lisas vasculares a 4,0 x 10^{4} células/ml de medio/pocillo en una placa de cuatro pocillos preparada comercialmente (Nunc. Inc., Naperville, Illinois). Se sembraron suficientes placas para tener capacidad para dos duraciones de exposición pulsada (5 minutos y 24 horas) y para los puntos de evaluación graduales prescritos (24 horas a 128 horas). Todas las placas se pusieron por duplicado para poner de manifiesto cualquier anormalidad del ensayo. Se diluyó el agente terapéutico en el mismo medio usado en los ensayos de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina. Cada placa de cuatro pocillos se agrupó en función de su concentración a una concentración logarítmica superior (pocillo "B"), una concentración logarítmica inferior (pocillo "D") de la concentración efectiva mínima (pocillo "C"), como se determinó mediante los ensayos de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina descritos anteriormente. Como control de morfología normal, se dejó un pocillo (pocillo "A") sin tratar (solamente medio). La incubación tuvo lugar en un incubador humectado a 37ºC, 5% de CO_{2}. Después de cada uno de los dos puntos de exposición (5 minutos y 24 horas), se aspiró el medio de agente terapéutico de cada pocillo, incluyendo el pocillo sin tratar. Después se añadió un mililitro de medio fresco para sustituir el medio aspirado. A continuación se reincubó hasta que se alcanzaron los puntos de evaluación graduales. En esos puntos, se aspiró el medio y se sustituyó subsiguientemente por 1 ml de 10% de formalina tamponada neutra durante una hora, para permitir una fijación adecuada. Estas placas fijadas se tiñeron con hematoxilina (nuclear) y eosina (citoplásmico) para su evaluación morfológica y su graduación.
Resultados: Los resultados del ensayo de inhibición proteica con ^{3}H-leucina de 24 horas y el ensayo de inhibición de la síntesis de ADN con ^{3}H-timidina de 24 horas se muestran en las figs. 10A-10D para suramina, estaurosporina, nitroglicerina y citocalasina B, respectivamente. Todos los compuestos ensayados mostraron un intervalo terapéutico disponible (el área bajo la curva del ensayo de ^{3}H-leucina es mayor que el que resulta del ensayo de ^{3}H-timidina), que indica la utilidad en la práctica de las realizaciones de formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. Más específicamente, los compuestos inhibieron la capacidad de las células musculares lisas vasculares de experimentar síntesis de ADN en presencia de 5% de FBS, en mayor medida que inhibieron la síntesis proteica de las células musculares lisas vasculares. Los efectos inhibitorios de la síntesis proteica y de ADN de suramina, estaurosporina, nitroglicerina y citocalasina B durante una exposición pulsada de 5 minutos y 24 horas se muestran en la Figura 10 A-D, respectivamente.
Ejemplo 9 Unión e interiorización específicas de partículas marcadas por células musculares lisas vasculares
La capacidad de las células musculares lisas vasculares para unir e interiorizar partículas revestidas con la proteína o péptido de unión se demostró con perlas de oro revestidas con anticuerpo monoclonal (NR-AN-01) tanto in vitro como in vivo. Se incubaron cultivos de tejido de células musculares lisas vasculares (BO54), una línea celular de control de antígeno positivo (A375) y una línea celular de control de antígeno negativo (HT29) con perlas de oro de 10 nm, con un grupo revestido con NR-AN-01 y un segundo grupo de control sin revestir. Se expuso a las células a las perlas en cultivos monocapa y de suspensión de células, y la unión e interiorización se examinaron en seis lapsos de tiempo (es decir, 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 24 horas) mediante microscopía electrónica.
La Tabla 3 muestra los resultados de la experimentación, que indican que la unión a la superficie celular es específica. El sistema de graduación relativa usado en la Tabla 3 representa una valoración subjetiva de la unión de la partícula, en la que 0 = nada; 1 = mínimo; 2 = ligero; 3 = moderado; y 4 = marcado. Si los agregados de partículas se depositaron en la superficie de la monocapa de las células musculares lisas y las células de control, las partículas se interiorizaron de forma inespecífica mediante macro y micro fagocitosis. Cuando se mantuvo a las células en una suspensión celular, la interiorización inespecífica fue mínima o inexistente. Se observó adherencia inespecífica de las perlas de oro desprovistas de NR-AN-01 para la superficie de mucina producida por las células HT29, dando como resultado su modesta interiorización inespecífica. La absorción por las células musculares lisas vasculares de perlas de oro marcadas con NR-AN-01 fue muy específica en los cultivos de suspensión celular.
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TABLA 3
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TABLA 3 (continuación)
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TABLA 3 (continuación)
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La Figura 11 muestra un corte tangencial paralelo a la superficie interna de una célula muscular lisa caracterizada por numerosas vesículas endocíticas, varias de las cuales contienen perlas de oro revestidas de anticuerpo, en curso de ser interiorizadas por la célula. Estas vesículas endocíticas con partículas unidas a antígenos de la superficie celular se estimularon para fusionarse con los lisosomas a una velocidad mayor de lo esperado para el reciclado normal de la membrana de la superficie celular. La marcada acumulación resultante de las partículas interiorizadas se observó en el lapso de tiempo de 24 horas, y se muestra en la Figura 12.
También se observaron in vivo la unión a la superficie de las células musculares lisas vasculares de perlas de oro marcadas, la interiorización y concentración lisosomal. Se infundieron perlas de oro revestidas con NR-AN-01 por medio de un catéter intravascular, abierto y con el área tratada ocluida proximalmente y distalmente con ligaduras de lazo, a 3 atmósferas de presión aplicadas durante 3 minutos en la pared de una arteria femoral de cerdo inmediatamente después de traumatismo con globo. La velocidad de interiorización de las perlas varió con el grado de los daños sufridos por la célula muscular lisa vascular durante el traumatismo con globo. Las células con daños mínimos o sin ellos interiorizaron rápidamente las partículas mediante endocitosis y fagocitosis, concentrando las partículas interiorizadas en los lisosomas. Las células que murieron por el traumatismo exhibieron unión de perlas superficial. Las células que fueron dañadas por el traumatismo pero que sobrevivieron se caracterizaron por la unión de perlas superficial, con interiorización y concentración lisosómica retrasadas. La Figura 13 muestra la concentración de particulado en los lisosomas in vivo una semana después de la administración de las perlas.
Ejemplo 10 Inhibición de la síntesis in vitro de ADN y proteínas en músculo liso vascular mediante estaurosporina y citocalasina
Se ensayó la capacidad de estaurosporina y citocalasina para inhibir in vitro la síntesis de ADN y proteínas en las células musculares lisas vasculares. Se llevaron a cabo ensayos de absorción de ^{3}H-leucina y ^{3}H-timidina y de citotoxicidad, de acuerdo con los siguientes protocolos.
Células cultivadas
Las células BO54 (células musculares lisas de babuino) procedieron de explantes de células musculares lisas aórticas de babuino. Las células se desarrollaron en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium):F-12 (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) con 5% de suero bovino fetal (FBS, Gibco) y 5% de Serum Plus® (JRH Biologicals) ("medio completo"), y se congeló una porción de la siembra en nitrógeno líquido para su uso futuro en el paso siete.
Exposición de 5 minutos; ensayo de síntesis proteica
Se sembraron células musculares lisas vasculares a 40.000-50.000 células/ml y se procesaron como se describió en el Ejemplo 8, "exposición de 5 minutos; absorción de ^{3}H-leucina". Se dispersaron diluciones logarítmicas de estaurosporina (200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml, 0,2 ng/ml y 0,02 ng/ml) en medio completo. Para citocalasina B, se dispersaron diluciones logarítmicas de 20 \mug/ml, 2,0 \mug/ml, 0,2 \mug/ml 0,02 \mug/ml y 0,002 \mug/ml en medio completo. El medio completo se añadió después a los pocillos de control. Se añadió un ml/pocillo de cada dilución de agente terapéutico en pocillos cuadruplicados, y se incubó el agente de interés con las células musculares lisas vasculares durante 5 min a temperatura ambiente en una campana estéril ventilada. Después de la incubación con los agentes terapéuticos, se trataron los pocillos subsiguientemente como se describió en el Ejemplo 8, "exposición de 5 minutos; absorción de ^{3}H-leucina".
Exposición de 5 minutos; ensayo de síntesis de ADN
Se sembraron células (BO54) musculares lisas vasculares y se procesaron en placas de 24 pocillos, como se describió anteriormente en "exposición de 5 minutos; ensayo de síntesis proteica". Tras 5 min de incubación con el agente terapéutico de ensayo, se aspiró el medio y se añadió 1 ml/pocillo de ^{3}H- timidina de 1,0 \muCi/ml (en vez de ^{3}H-leucina) dispersa en medio completo. Después se incubaron las células durante la noche a 37ºC en un medio humectado, con 5% de CO_{2}. Después se determinó el efecto tóxico del agente terapéutico como se describió en el ensayo de síntesis proteica, anteriormente.
Exposición de 24 y 120 horas; ensayo de síntesis proteica
Se sembraron células (BO54) musculares lisas vasculares a 20.000 células/ml en placas de 24 pocillos estériles, y se incubaron en medio completo (1 ml/pocillo) durante la noche a 37ºC, en una atmósfera humectada (saturación) con 5% de CO_{2} y 95% de aire. Se dispersaron diluciones logarítmicas de estaurosporina (100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml y 0,01 ng/ml) secuencialmente en los dos medios, como se describe más adelante. Para citocalasina B, se dispersaron diluciones logarítmicas de 10 \mug/ml, 1,0 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 0,01 \mug/ml y 0,001 \mug/ml secuencialmente en los dos medios, como se describe a continuación:
Medio (1) = Medio completo; y
Medio (2) = DMEM (sin leucina) con 0,5 \muCi/ml de ^{3}H-leucina.
El medio (2) se usa para el periodo de incubación final de 24 horas del experimento.
Más específicamente, en el ensayo de 24 horas, cada agente terapéutico se diluyó en medio (2), como se señaló anteriormente. El medio (1) se aspiró de los pocillos, y se añadieron alícuotas de las diluciones de agente terapéutico en medio (2), por cuadruplicado a los pocillos apropiados. Después se añadió medio (2) a los pocillos de control.
En el ensayo de 120 horas, cada agente terapéutico se diluyó en medio (1), como se señaló anteriormente. El medio (1) se aspiró de los pocillos, y se añadieron alícuotas de las diluciones de agente terapéutico en medio (1) por cuadruplicado a los pocillos apropiados. Después se añadió medio (1) a los pocillos de control. Se cambió el medio cada 24 horas, y se añadió agente terapéutico fresco a los pocillos de ensayo. A las 96 h (es decir, el cuarto día), cada agente terapéutico se diluyó en medio (2), como se señaló anteriormente. El medio (1) se aspiró de los pocillos, y se añadieron alícuotas de las diluciones de agente terapéutico en medio (2) por cuadruplicado a los pocillos apropiados. Después se añadió medio (2) a los pocillos de control.
Los agentes de ensayo en ^{3}H-leucina (y controles) se incubaron durante la noche a 37ºC en una atmósfera humectada con 5% de CO_{2}. Después se determinó el efecto tóxico de los agentes terapéuticos, como se describió en "exposición de 5 minutos; ensayo de síntesis proteica", descrito anteriormente. Además, se fotografiaron los cambios en las células a cada dilución usando un microscopio Zeiss (Zeiss, Alemania Occidental) a 320X. Después se aspiró el medio, y se procesaron las células con TCA, como se describió anteriormente.
Exposición de 24 y 120 horas; ensayo de síntesis de ADN
Este ensayo se realizó según el procedimiento descrito para "exposición de 24 y 120 horas; ensayo de síntesis proteica", excepto que el medio (2) en este ensayo de síntesis de ADN de 24 y 120 h es:
Medio (2) = Medio completo con ^{3}H-timidina de 1,0 \muCi/ml.
El medio (2) se usa en la incubación final de 24 horas del experimento.
Estos ensayos de síntesis proteica y de ADN son susceptibles de ser usados con otras poblaciones celulares diana, especialmente tipos celulares de la monocapa adherente.
Resultados
Se determinó la dosis efectiva mínima (DEM) de cada agente como un porcentaje del control que se trató solamente con medio; el valor de 50% del control se eligió como referencia de citotoxicidad. En una exposición de 5 minutos, estaurosporina demostró una DEM de 100 ng/ml en el ensayo de síntesis proteica y 1 ng/ml en el ensayo de ADN. La DEM de 24 horas para estaurosporina fue 10 ng/ml en el ensayo de síntesis proteica y 1 ng/ml en el ensayo de síntesis de ADN. Ambos ensayos dieron una DEM de 1 ng/ml para una exposición de 120 horas de estaurosporina.
En una exposición de 5 minutos, citocalasina B demostró una DEM de 10 \mug/ml en el ensayo de síntesis proteica, así como en el ensayo de ADN. La DEM de 24 horas para citocalasina B fue 1,0 \mug/ml en el ensayo de síntesis proteica y 0,1 \mug/ml en el ensayo de síntesis de ADN. Ambos ensayos dieron una DEM de aproximadamente 0,1 \mug/ml durante una exposición de 120 horas a estaurosporina.
Los agentes terapéuticos citocalasina C y citocalasina D se ensayaron en exposiciones de 24 y 48 horas usando las mismas diluciones descritas para citocalasina B, anteriormente. A 24 horas, citocalasina C demostró una DEM de 1,0 \mug/ml en el ensayo de síntesis proteica y una DEM de 0,01 \mug/ml en el ensayo de síntesis de ADN. A 48 horas, citocalasina C demostró una DEM de 0,1 \mug/ml en el ensayo de síntesis proteica, y 0,01 \mug/ml en el ensayo de síntesis de ADN. La citocalasina D demostró una DEM de 1,0 \mug/ml en el ensayo de síntesis proteica de 24 horas y una DEM de 0,1 \mug/ml en el ensayo de síntesis de ADN de 24 horas. Una exposición de 48 horas a citocalasina D dio una DEM que osciló entre 0,1 y 0,01 \mug/ml en los ensayos de síntesis proteica y de síntesis de ADN.
Ejemplo 11 Inhibición de la migración de células musculares lisas vasculares
Se realizaron ensayos de rasgadura para determinar el grado de inhibición de la migración de células musculares lisas mediante citocalasina B, de acuerdo con el siguiente protocolo:
Las células musculares lisas vasculares (BO54) provinieron de explantes de músculo liso aórtico de babuino, como se describió en el Ejemplo 10. Las células se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos de fondo plano, que tienen capacidad para alrededor de 5 ml de medio. Las células musculares lisas vasculares se colocaron en la placa a 200.000 células/pocillo, y se colocaron a 37ºC en un incubador humectado con 5% de CO_{2} durante 18 horas. Después se rasgaron los pocillos con la parte estéril de una cuchilla de un solo filo que se sujetó mediante pinzas o alicates, y se puso en contacto de forma aséptica con el fondo del pocillo en un ángulo de 90º. Se eliminaron las células de un área pequeña a lo largo de la rasgadura mediante un aplicador con punta de algodón estéril mientras la cuchilla estaba en contacto con el fondo del pocillo. Tras la incubación, la presencia de células en el área "rasgada" es indicativa de migración celular a través de la línea de rasgadura. Una incubación de control mostró una migración celular significativa, y sirve como patrón con el que comparar la migración de las células expuestas al agente terapéutico.
Brevemente, se preparó una disolución de reserva de citocalasina B (Sigma Chemical Co.) en dimetilsulfóxido (DMSO) a 1 mg/ml. Se añadieron diluciones de ensayo de citocalasina B o medio de control. Cada experimento incluyó dos grupos de placas:
Grupo A: Exposición al agente de ensayo durante 1, 3, 6, 8 y 10 días solamente; y
Grupo B: Exposición al agente de ensayo durante 1, 3, 6, 8 y 10 días, seguido de un tiempo de recuperación de siete días con medio de control.
Ambos grupos de placas se fijaron (10% de formalina en PBS) y se tiñeron (0,02% de cristal violeta) al final de las exposiciones cronometradas. Las concentraciones de citocalasina B fueron 1, 0,1 y 0,01 \mug/ml, y se incluyó un control de medio negativo. Se suministró medio y fármaco frescos 3 veces por semana.
La Tabla 4 muestra los resultados de estos experimentos. En esta tabla, "M" indica grado de migración, en el
que - = sin migración; +1 = mínima; +2 = ligera; +3 = moderada; y +4 = marcada (máxima densidad; límite de inhibición de contacto celular) migración de células musculares lisas vasculares al área despejada adyacente a la rasgadura. En esta Tabla, "T" denota grado de toxicidad morfológica, en la que - = sin toxicidad; +1 = mínima; +2 = ligera; +3 = moderada; y +4 = marcada toxicidad. Los resultados de migración se expresan como "grado en el área despejada del pocillo/grado en una región no alterada del pocillo". Los valores de toxicidad representan un grado para todas las células en cada pocillo.
Los datos indican que citocalasina B inhibe la migración (+1 a +2) de las células musculares lisas vasculares en el área despejada adyacente a la rasgadura a una dosis de 0,1 \mug/ml con una toxicidad morfológica mínima solamente (- a +1). Los datos muestran también que las células tratadas (0,1 \mug/ml) recuperan la capacidad de migrar (+3 a +4) después de la eliminación del agente terapéutico, aún después de 10 días de exposición continua al agente terapéutico.
TABLA 4 Ensayo de rasgadura-migración: inhibición de la migración de células musculares lisas vasculares mediante citocalasina B
9
Ejemplo 12 Efectos citotóxicos del agente terapéutico sobre las células musculares lisas vasculares - exposición de pulso y continua
Las células musculares lisas vasculares se expusieron a un agente terapéutico en uno de dos formatos de exposición:
Exposición de pulso: El protocolo de exposición de pulso se describe en el Ejemplo 8 anterior (véase "evaluación de la citotoxicidad morfológica - exposición pulsada").
Exposición continua: Se usa la misma metodología para la evaluación de la citotoxicidad morfológica de exposición continua que para la exposición de pulso, excepto que los pocillos de ensayo se expusieron continuamente al agente terapéutico en el medio durante el período de exposición. El medio y el agente terapéutico se aspiraron de cada pocillo diariamente, incluyendo el pocillo de control sin tratar, y se reemplazaron con 1 ml de medio fresco y agente terapéutico (o solamente medio para los pocillos de control). A continuación se reincubó, hasta que se alcanzaron todos los puntos de evaluación graduales del protocolo de exposición continua a largo plazo. Estos puntos de evaluación graduales fueron a 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216 y 264 horas. En el periodo de tiempo designado, las células apropiadas se fijaron, se tiñeron y se evaluaron como en el protocolo de exposición de pulso. Los resultados de un experimento de exposición continua se muestran en la Tabla 5 para suramina, estaurosporina y citocalasina B. Los datos de 5 min y 24 h presentados en la Tabla 5 son correlativos con los datos contenidos en las figuras 10A, 10B y 10C.
10
A una dosis efectiva in vitro, citocalasina B (1 \mug/ml; una dosis efectiva anti-migración/contracción) y estaurosporina (1 ng/ml; una dosis efectiva antiproliferativa) exhibieron un grado de citotoxicidad de 1 (mínimo) y 2 (ligero), respectivamente. Estudios independientes han indicado que se prefiere un grado de 3 (moderado) o menos para un agente antiproliferativo citostático de la presente invención.
Ejemplo 13 Ensayo de BRDU in vivo; inhibición de la proliferación de células musculares lisas vasculares
Ensayo de BRDU: Se cuantificó la proliferación in vivo de músculo liso vascular midiendo la incorporación del análogo de base 5-bromo-2'-desoxiuridina (BRDU, disponible de Sigma Chemical Co.) al ADN durante la síntesis de ADN y la proliferación celular. La incorporación de BRDU se demostró histoquímicamente usando anticuerpos monoclonales anti-BRDU disponibles comercialmente. El marcado mediante pulso de 1 hora permite la evaluación del número de células que sufren división durante el periodo de pulso.
El protocolo de marcado mediante pulso de BRDU descrito anteriormente se usa como una técnica de evaluación estandarizada con estudios in vivo vasculares con cerdos. Después de los procedimientos quirúrgicos y de tratamiento (discutidos, por ejemplo, en los ejemplos 7 y 11 aquí) y un periodo de recuperación posquirúrgica, los cerdos fueron sedados y se les aplicó un pulso con BRDU 1 hora antes de la recogida de tejidos.
Brevemente, los cerdos fueron sedados con hidrocloruro de tiletamina y xilacina (como en el Ejemplo 7, "evaluación macroscópica patológica e histológica") mediante inyección intramuscular. Después se administró BRDU intravenosamente por la vena lateral de la oreja. Se administraron dos ml de BRDU a una concentración de 50 mg/ml a cada cerdo de 13,6-18,1 kg. Una hora más tarde, se sacrificaron los cerdos mediante pentobarbital administrado intravenosamente. Después se extrajeron los segmentos arteriales de ensayo (un segmento incluyó el vaso normal localizado proximalmente y, si fue posible, distalmente con respecto al segmento arterial tratado). Los segmentos arteriales se cortaron transversalmente a intervalos de 2 mm; se dispusieron en orden en criomoldes con compuesto de O.C.T. (temperatura óptima de corte) (Tissue Tek®, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN); y se congelaron en nitrógeno líquido. Los bloques se cortaron a 5 micras y se tiñeron inmunohistológicamente para detectar BRDU usando el siguiente procedimiento.
Detección de células marcadas con BRDU: Después del marcado por pulso con BRDU (1 g de BRDU disuelto en 17 ml de agua esterilizada y 3 ml de NaOH 1 N) y extracción y corte del segmento arterial de ensayo (como anteriormente), la tinción inmunohistoquímica con anticuerpo monoclonal anti-BRDU proporciona un medio visual para determinar un índice mitótico a lo largo de un periodo de tiempo especificado. El método de tinción inmunohistoquímica se realizó como sigue:
1)
Se deshidrataron cortes de 5 \mum de arteria de ensayo en acetona fría (-20ºC) durante 10 minutos;
2)
Se prepararon los cortes en portaobjetos de vidrio para microscopio, y los portaobjetos se secaron en una estufa a 37ºC durante 10 minutos;
3)
Se rehidrataron los portaobjetos en PBS durante 10 minutos;
4)
Los portaobjetos se sometieron a hidrólisis ácida de Feulgen usando HCl 1 N, en la que se precalientan dos alícuotas de HCl 1 N a 37ºC y 60ºC antes de continuar;
5)
Se enjuagaron los portaobjetos con 1 ml de HCl 1 N a 37ºC durante 1 min;
6)
Se transfirieron los portaobjetos a HCl 1 N a 60ºC durante 15 min;
7)
Se enjuagaron los portaobjetos con 1 ml de HCl 1 N a 37ºC durante 1 min;
8)
Se lavaron los portaobjetos con PBS a temperatura ambiente, usando 3 cambios de PBS a intervalos de 5 min;
9)
Los lugares de reactividad cruzada endógenos de los cortes se bloquearon con suero normal de cabra (1:25 en PBS) durante 20 min;
10)
Se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8;
11)
Se incubaron los cortes con anticuerpo anti-BRDU de ratón (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) a 10 \mug/ml durante 30 min;
12)
Se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8;
13)
Se incubaron los cortes con IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano (HRPO) (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; diluido 1:20 en PBS) y 4% de suero AB humano durante 30 min;
14)
Se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8;
15)
Se incubaron los cortes con cromógeno (3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma) a 5 mg/ml en 200 ml de PBS) y 200 \mul de H_{2}O_{2} del 30% durante 10 min;
16)
Se lavaron las placas con PBS, como en la etapa 8;
17)
Las muestras se tiñeron para contraste con hematoxilina Gill I (Gill I Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30 inmersiones);
18)
Se lavaron los portaobjetos con PBS, como en la etapa 8; se aclararon con disolución de azulado (1 gr de carbonato de litio en 500 ml de dH_{2}O); se lavaron con agua desionizada; y
19)
Después se deshidrataron las muestras de ensayo, se limpiaron y se cubrieron con un cubreobjetos.
Al final de este procedimiento, una tinción inmunohistológica positiva exhibe un color marrón en el/los lugar(es) de reactividad.
Los agentes citocidas inhibieron la absorción de BRDU respecto de un control de PBS; sin embargo, citocalasina B y estaurosporina inhibieron la absorción de BRDU (es decir, la proliferación celular) sin matar las células musculares lisas vasculares. Se asignó una graduación al número de células musculares lisas vasculares marcadas con BRDU, a un aumento de 400X, como sigue:
1 = \leq 1/campo de gran aumento (CGA);
2 = 2 a 5/CGA
3 = >5 a \leq 10/CGA; y
4 = > 10/CGA.
Tanto citocalasina B como estaurosporina inhibieron la proliferación durante 24 horas después de traumatismo con globo (grado 1), dando un grado de marcado con BRDU equivalente al de una línea base de pretraumatismo (grado 1). Los controles de PBS y anticuerpo monoclonal exhibieron un marcado de BRDU de grado 2,5 a 4 durante el mismo periodo de tiempo. A los 4 días postraumatismo, las arterias tratadas con citocalasina B o estaurosporina, así como con controles de PBS y anticuerpo monoclonal, exhibieron un grado de marcado con BRDU de 4. Las propiedades antiproliferativas no citocidas de citocalasina B y estaurosporina sugieren que estos agentes son susceptibles para formulaciones de dosificación de liberación sostenida para la reducción de la estenosis vascular.
Ejemplo 14 Acción de endoprótesis biológica de arterias de cerdo lesionadas con globo usando citocalasina B
Las arterias de cerdo lesionadas con globo que se habían tratado con citocalasina B exhibieron un área luminal mayor en los puntos postratamiento a los 4 días y 3 semanas, comparado con las arterias tratadas con otros agentes de ensayo o controles. Se evaluaron histológicamente diez arterias femorales (dos arterias obtenidas de cada uno de los 5 cerdos que se trataron según el protocolo de dosis única descrito en el Ejemplo 7). Se midió y se calculó el área luminal máximo de cada arteria a partir de imágenes microscópicas digitalizadas mediante un sistema de análisis morfométrico computerizado BQ System IV (R & M Biometrics, Inc., Nashville, TN). Este experimento se repitió con 5 cerdos adicionales (dos arterias por cerdo; dosis de citocalasina B = 0,1 \mug/ml, aplicada durante 3 min a 1 atm de presión; los mismos tiempos). Se combinaron los datos obtenidos de los dos experimentos. Se observó un incremento en el área de la luz en el punto de tratamiento post-citocalasina B de 3 semanas.
El área luminal de los segmentos lesionados y tratados con citocalasina B de las arterias se comparó también con el área luminal de la región normal sin tratar de la arteria femoral proximal al área de ensayo. Los resultados mostraron que el área de la luz en la región de ensayo fue aproximadamente dos veces mayor que el área del segmento de control normal de la misma arteria. Los agentes de control negativo, PBS y anticuerpo monoclonal NR-AN-01, no mostraron incremento o mostraron una ligera disminución en el área de la luz, comparado con el segmento de control normal de la misma arteria.
Después se llevó a cabo un estudio de respuesta a dosis de citocalasina B en 10 cerdos, después del protocolo experimental descrito en el Ejemplo 7. Brevemente, se trataron ambas arterias en 2 cerdos con una de las siguientes dosis de citocalasina B: 0,0 \mug/ml (es decir, control negativo de PBS); 0,01 \mug/ml; 0,10 \mug/ml; 1,0 \mug/ml y 10,0 \mug/ml. El agente se administró mediante catéter intraluminal a 1 atm de presión durante 3 min, y se evaluaron las arterias 3 semanas más tarde mediante el sistema de análisis morfométrico descrito anteriormente. La proporción del área luminal de la arteria tratada respecto del área luminal de la arteria normal proximal se determinó como un cambio en porcentaje del área tratado respecto del normal. Se observó un efecto de umbral significativo a dosis de 0,1 \mug/ml (\approx140% de incremento) a 1,0 \mug/ml (Figura 14). La dosis de 10 \mug/ml pareció ser tóxica para las células musculares lisas vasculares (datos no mostrados). La dosis subumbral (0,01 \mug/ml) y el control negativo (PBS) exhibieron un cambio de \pm \approx20% en el área luminal. Estos datos sugieren que citocalasina B actúa como una "endoprótesis biológica" cuando se administra a arterias lesionadas.
Ejemplo 15 Conjugación directa de anticuerpo NR-AN-01 a grupos funcionales carboxílicos de una partícula de látex
Las partículas de látex revestidas con anticuerpo (un modelo para una forma de dosificación de liberación sostenida revestida de anticuerpo) se pueden obtener usando la siguiente técnica aséptica:
Conjugación
A 4 ml de borato sódico 0,05 M, pH 8,5, que contiene 0,01% de Tween-20® (monolaurato de polioxietilen sorbitan, Sigma) se le añaden 0,5 ml de PBS que contiene 5 mg de anticuerpo monoclonal NR-AN-01. A esta disolución a temperatura ambiente se le añaden, con agitación con vórtice, 2,5 ml de una suspensión acuosa que contiene 50 mg de partículas de látex carboxiladas de 1 \mum de diámetro. Inmediatamente después, se añaden 0,5 ml de agua que contiene 100 mg de 1(3-dimetil-aminopropil)3-etil carbodiimida HCl recién disuelto, con agitación con vórtice. Después se incuba la disolución con agitación durante 1-2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye después con 50 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 6,6, que contiene 0,2% de estabilizador de gelatina (tampón fosfato/gelatina). Se centrifuga la mezcla a 40.000 x g durante 2 h a 4-10ºC. Se decanta el sobrenadante, y el sedimento se resuspende en 50 ml de tampón fosfato/gelatina usando sonicación de bajo nivel durante 10 seg. Se repite la centrifugación, y el sedimento se resuspende dos veces, seguido de resuspensión en el tampón fosfato/gelatina. Las partículas conjugadas se liofilizan después usando protocolos estandarizados y excipientes de sorbitol.
Caracterización
(a) Tamaño: La homogeneidad del tamaño de partícula se evalúa mediante anisotropía con láser o, para partículas mayores que 1 \mum, mediante examen microscópico.
(b) Evaluación de la unión específica: La unión específica a células musculares lisas se determina mediante examen histológico de cortes con micrótomo de tejido o sedimentos de células, tras incubación de los conjugados de proteína/péptido con partículas conjugadas, con o sin proteína/péptido bloqueador incluido en la mezcla de incubación. Las técnicas de detección preferidas incluyen ensayos con segundo anticuerpo (es decir, Ig anti-ratón) o ensayos competitivos (es decir, detección de radiación mediante centelleo conjuntamente con conjugados de proteína/péptido marcados radioisotópicamente).
(c) Evaluación del grado de modificación de proteína/péptido: Esta determinación se realiza revistiendo las partículas de látex con anticuerpo marcado radioisotópicamente, seguido de detección de la radiactividad asociada a las partículas revestidas.
La caracterización de las partículas revestidas de anticuerpo se describe en la Tabla 6.
TABLA 6 Caracterización de partículas de látex revestidas de NR-AN-01
Diámetro de partículas Proporción de Ac/partícula \mug de Ac unido/5 mg de látex Ac por partícula
1,2 \mum 40.000 42 3520
1,2 \mum 84.000 66 5470
0,4 \mum 32.000 99 3160
0,4 \mum 64.000 140 4550
0,1 \mum 932 140 65
El efecto de agregación de partículas del pH durante la conjugación con anticuerpo se presenta en la Tabla 7.
TABLA 7 Efecto del pH durante la conjugación de anticuerpo - agregación de partículas
11
* Usando tampón MES (pH 5,5), fosfato (pH 7,0) o borato (pH 8,5) 50 mM, como se describió.
** Evaluado mediante examen microscópico, en una escala de 0-100%.
Estos datos sugieren que las proteínas o péptidos se pueden conjugar directamente con las formas de dosificación de liberación sostenida de la presente invención. Más específicamente, los particulados de ácido poli(láctico/glicólico) que tienen grupos ácido carboxílico terminales se conjugarán según el procedimiento descrito aquí, o los procedimientos alternativos descritos en la especificación.
Citas
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Aunque la realización preferida de la invención se ha ilustrado y descrito, se apreciará que se pueden hacer diversos cambios en ella, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (15)

1. Una endoprótesis intravascular que comprende una matriz y un revestimiento sobre dicha matriz, en la que el revestimiento y la matriz comprenden una cantidad de un inhibidor citoesquelético y/o una cantidad citostática de un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas, efectiva para inhibir la estenosis o reducir la reestenosis después de la colocación de la endoprótesis en un vaso.
2. La endoprótesis intravascular de la reivindicación 1, que se adapta para proporcionar una velocidad de liberación diferencial del inhibidor desde la endoprótesis.
3. La endoprótesis intravascular de la reivindicación 1 ó 2, que se adapta para mantener expandida el área luminal del vaso después de angioplastia.
4. La endoprótesis intravascular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la endoprótesis comprende un revestimiento biodegradable, o no biodegradable poroso o permeable, que comprende el inhibidor.
5. La endoprótesis intravascular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el inhibidor está en una forma de dosificación de liberación sostenida.
6. La endoprótesis intravascular de la reivindicación 5, en la que la endoprótesis comprende un revestimiento que comprende la forma de dosificación de liberación sostenida.
7. La endoprótesis intravascular de la reivindicación 5, en la que la forma de liberación sostenida del inhibidor comprende un péptido o proteína de unión capaz de unirse específicamente a células musculares lisas, células del estroma o la matriz intersticial que rodea a las células musculares lisas.
8. La endoprótesis intravascular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la endoprótesis intravascular comprende metal o plástico.
9. La endoprótesis intravascular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la matriz de la endoprótesis está formada de un material biodegradable.
10. La endoprótesis intravascular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el inhibidor citoesquelético comprende una citocalasina o su análogo.
11. La endoprótesis intravascular de la reivindicación 10, en la que el inhibidor citoesquelético comprende citocalasina B.
12. La endoprótesis intravascular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el revestimiento comprende una cantidad del inhibidor citoesquelético, y la matriz comprende una cantidad citostática del inhibidor de la proliferación de células musculares lisas.
13. Un método para preparar una endoprótesis intravascular revestida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y efectivo para mantener el área luminal de un vaso en un mamífero, que comprende dicho método tratar la endoprótesis intravascular con una cantidad de un inhibidor citoesquelético y/o una cantidad citostática de un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas, efectivo para inhibir la estenosis o reducir la reestenosis de dicho vaso, inhibiendo la proliferación y migración de las células musculares lisas vasculares después de la colocación de la endoprótesis en dicho vaso.
14. Un método según la reivindicación 13, para preparar una endoprótesis intravascular revestida que comprende una matriz y un revestimiento sobre dicha matriz, que comprende dicho método introducir dicha cantidad de un inhibidor citoesquelético en el revestimiento, y dicha cantidad citostática de un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas en la matriz de la endoprótesis intravascular.
15. Un método según la reivindicación 13, para preparar una endoprótesis intravascular revestida que comprende una matriz y un revestimiento sobre dicha matriz, que comprende dicho método introducir dicha cantidad citostática de un inhibidor de la proliferación de células musculares lisas en el revestimiento, y dicha cantidad de un inhibidor citoesquelético en la matriz de la endoprótesis intravascular.
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