ES2220918T3 - Metodo para obtencion de inmunoglobulinas modificadas con inmunogenicidad reducida de dominios variables de un anticuerpo murino y composiciones que los contienen. - Google Patents
Metodo para obtencion de inmunoglobulinas modificadas con inmunogenicidad reducida de dominios variables de un anticuerpo murino y composiciones que los contienen.Info
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Abstract
SE PRESENTAN ANTICUERPOS QUIMERICOS MODIFICADOS, Y CADENAS LIGERAS Y PESADAS DE ANTICUERPOS, QUE COMPRENDEN DOMINIOS VARIABLES DERIVADOS DE UNA PRIMERA ESPECIA DE MAMIFERO, USUALMENTE EL RATON, Y DOMINIOS CONSTANTES DE UNA SEGUNDA ESPECIE DE MAMIFERO, USUALMENTE LOS HUMANOS. LA MODIFICACION SE REFIERE A LOS DOMINIOS VARIABLES, EN PARTICULAR LAS REGIONES DE LA ESTRUCTURA DE LOS DOMINIOS VARIABLES. LAS MODIFICACIONES SE HACEN SOLAMENTE EN ESTRUCTURAS ANTIGENICAS DE LAS CELULAS T PRESENTES EN LAS REGIONES DE LA ESTRUCTURA, Y NO CUBREN ESTRUCTURAS CANONICAS O LA ZONA DE VERNIER. LAS MODIFICACIONES ADAPTAN LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDO REFERIDAS A AQUELLAS QUE SE PRODUCEN EN LOS ANTICUERPOS CORRESPONDIENTES DERIVADOS DE LA SEGUNDA ESPECIE DE MAMIFERO. DE ESTA FORMA, LOS ANTICUERPOS QUIMERICOS MODIFICADOS RETIENEN EL RECONOCIMIENTO DEL ANTIGENO ORIGINAL Y LAS PROPIEDADES DE UNION PERO SE HACEN MENOS INMUNOGENICOS A DICHA SEGUNDA ESPECIE DE MAMIFERO, LO QUE MEJORA SU ACTIVIDAD TERAPEUTICA CON DICHASEGUNDA ESPECIE DE MAMIFERO. PUEDE UTILIZARSE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE PARA CONSTRUIR Y PRODUCIR LOS ANTICUERPOS QUIMERICOS MODIFICADOS.
Description
Método para obtención de inmunoglobulinas
modificadas con inmunogenicidad reducida de dominios variables de
un anticuerpo murino y composiciones que los contienen.
La presente invención se refiere al sector de la
inmunología, en particular se refiere a un método para obtención de
inmunoglobulinas modificadas con inmunogenicidad reducida de
dominios variables de un anticuerpo murino y compuestos que las
contienen.
El sistema inmune construye anticuerpos que se
unen a una amplia gama de antígenos con gran avidez y especificidad,
y ponen en marcha mecanismos efectores. Se han utilizado anticuerpos
en medicina como agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos, y se
ha incrementado satisfactoriamente su potencial con la llegada de
nuevas tecnologías.
La tecnología de hibridomas permitió el
aislamiento de líneas celulares que segregaban anticuerpos de una
especificidad única (Köhler G., Milstein C. (1975) Nature (Londres)
256, 495-497), y la tecnología genética ha permitido
la construcción de una serie de anticuerpos de diseño a partir de
hibridomas.
El diseño o ingeniería de anticuerpos viene
facilitado por su estructura de dominio y puede mejorar además la
utilidad de muchos anticuerpos por la adquisición o pérdida de
algunas de sus características. Las características de unión de
antígenos del anticuerpo proporcionan la función de reconocimiento y
ésta puede ser acoplada a uno o varios de una serie de agentes
efectores. La combinación de estas dos características debe ser
comprobada entonces con respecto a los criterios de eficacia,
especificidad y de inmunogenicidad.
Los anticuerpos monoclonales que producen
hibridomas han sido obtenidos muy fácilmente a partir de roedores
inmunizados. En la actualidad, la utilización de varios anticuerpos
monoclonales murinos se ha extendido para la detección y tratamiento
de afecciones malignas, administración profiláctica para conseguir
protección contra shock tóxico, modificación de rechazos de injertos
episódicos, y para atemperar reacciones inflamatorias agudas.
En la mayor parte de los casos en los que se han
utilizado a efectos terapéuticos anticuerpos de roedores, los
receptores han elicitado una respuesta inmune dirigida hacia el
anticuerpo. Estas reacciones han limitado la duración y eficacia de
la terapia.
El desarrollo de reactivos similares a partir de
fuentes humanas se ha visto frustado, si bien existen varias
opciones, utilizando, por ejemplo, ratones SCID-hu,
inmunización in vitro, bibliotecas de recombinación, o alguna
combinación útil de éstos. Dado que existen muchos anticuerpos
monoclonales de roedores bien caracterizados que ya se encuentran a
disposición y que se podrían utilizar en el campo clínico si se
pudiera suprimir la respuesta inmune, la producción de anticuerpos
por diseño o ingeniería ha recibido notable atención.
Los anticuerpos de diseño o de ingeniería han
sido destinados a sustituir en la mayor medida posible las
secuencias xenogeneicas con las secuencias humanas equivalentes.
Entre los anticuerpos diseñados genéticamente se encuentran los
anticuerpos quiméricos en los que diversos segmentos de
inmunoglobulinas de diversas especies se han unido entre sí.
Inicialmente, los anticuerpos quiméricos fueron
construidos conteniendo las regiones variables del roedor unidas o
fusionadas con dominios constantes humanos. En particular, los
anticuerpos quiméricos de ratón/humano son potencialmente útiles
para inmunoterapia puesto que deben mostrar la misma especificidad
pero una inmunogenicidad reducida en comparación con sus
correspondientes murinos. Las siguientes referencias describen
tecnología de anticuerpos quiméricos: Lobuglio y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 4220-4224 (1989); Patente U.S.A.
4.816.567; publicación internacional PCT Nº WO 87/02671 publicada en
7 de mayo de 1987; publicación de Patente europea
Nº 255.694 publicado en 10 de febrero de 1988; publicación de Patente europea Nº 274.394 publicada en 13 de julio de 1988; publicación de Patente europea Nº 323.806 publicada en 12 de julio de 1989; publicación internacional PCT Nº WO 89/00999 publicada en 9 de febrero de 1989; publicación de Patente europea Nº 327.000 publicada en 9 de agosto de 1989; publicación de Patente europea Nº 328.404 publicada en 16 de agosto de 1989; y publicación de Patente europea Nº 332.424 publicada en 12 de septiembre de 1989.
Nº 255.694 publicado en 10 de febrero de 1988; publicación de Patente europea Nº 274.394 publicada en 13 de julio de 1988; publicación de Patente europea Nº 323.806 publicada en 12 de julio de 1989; publicación internacional PCT Nº WO 89/00999 publicada en 9 de febrero de 1989; publicación de Patente europea Nº 327.000 publicada en 9 de agosto de 1989; publicación de Patente europea Nº 328.404 publicada en 16 de agosto de 1989; y publicación de Patente europea Nº 332.424 publicada en 12 de septiembre de 1989.
Se debe observar que incluso la sustitución de
las regiones constantes con equivalentes humanos puede no reducir
efectivamente su inmunogenicidad. Aproximadamente, la mitad de los
receptores mostraron una respuesta inmune a las regiones variables
del roedor. Como consecuencia, se han manipulado extensamente los
anticuerpos de roedores para parecerse de manera más completa a
anticuerpos humanos completos.
Se ha conseguido otra reducción en la
inmunogenicidad de anticuerpos quiméricos al injertar solamente las
regiones que determinan complementariedad (CDR) de un anticuerpo
monoclonal de roedor en zonas del armazón humano (FR) antes de su
subsiguiente unión o fusión con un dominio constante apropiado
(Jones y otros, Nature 321:
522-525 (1986)). Este procedimiento para conseguir injertos CDR resulta frecuentemente en anticuerpos humanizados de forma imperfecta, lo que significa que el anticuerpo resultante ha perdido afinidad o, en un intento de conservar su afinidad original, una serie de los residuos del armazón murino han sustituido los correspondientes del armazón humano escogido (Winter, solicitud de Patente europea publicada Nº 239.400; Riechmann y otros, Nature 332:
323-327 (1988)).
522-525 (1986)). Este procedimiento para conseguir injertos CDR resulta frecuentemente en anticuerpos humanizados de forma imperfecta, lo que significa que el anticuerpo resultante ha perdido afinidad o, en un intento de conservar su afinidad original, una serie de los residuos del armazón murino han sustituido los correspondientes del armazón humano escogido (Winter, solicitud de Patente europea publicada Nº 239.400; Riechmann y otros, Nature 332:
323-327 (1988)).
Se han desarrollado una serie de estrategias con
el objetivo de identificar el número mínimo de residuos a transferir
para conseguir una afinidad de unión útil con las menores
consecuencias potenciales posibles sobre la inmunogenicidad. No
obstante, se ha observado que cada una de estas estrategias es
satisfactoria solamente en cierto grado de la reconstitución de la
afinidad parental.
Las características de unión de ligando de un
lugar de combinación de anticuerpo se determinan básicamente por la
estructura y disposición relativa de las CDR, si bien ciertos
residuos del armazón adyacentes se ha observado que estaban
involucrados en la unión de antígenos (Davies y otros, Ann. Rev.
Biochem. 59: 439-473 (1990)). Por lo tanto, la
especificidad fina de un anticuerpo se puede preservar si sus
estructuras CDR y una parte de los residuos adyacentes, su
interacción entre sí, y su interacción con el resto de dominios
variables se pueden mantener de manera estricta.
Otro procedimiento para humanización de un
anticuerpo ha sido sugerido por Padlan (Padlan, solicitud de Patente
europea publicada Nº 0 519 596 A1; Padlan, Molecular Immunology 28:
489-498 (1991)). Se basa en el hecho de que la
antigenicidad de una proteína depende de la naturaleza de su
superficie, y una serie de residuos de la región variable del
roedor, accesibles por disolventes, son sustituidos por residuos
procedentes de un anticuerpo humano. Las localizaciones de estos
residuos se identifican por inspección de estructuras por rayos X de
alta resolución del anticuerpo humano KOL y el anticuerpo murino
J539. La elección de los residuos de la superficie humana es
conseguida al identificar el subgrupo de anticuerpos con mayor
homología.
La naturaleza de la superficie de la proteína es
importante para su reconocimiento y para su internalización por
células de proceso de antígenos, específicamente por células B
específicas de antígenos. Además, el reconocimiento de secuencias
lineales específicas por células T es también un importante elemento
en la inmunogenicidad de proteínas.
Varios grupos han desarrollado métodos
automatizados por ordenador para la identificación de
características de secuencia y determinantes estructurales que
juegan un papel en la restricción MHC de péptidos antigénicos de
células auxiliares T (Bersofsky y otros, J. Immunol. 138:
2213-2229 (1987), Elliott y otros, J. Immunol. 138:
2949-2952 (1987), Reyes y otros, J. Biol. Chem. 264:
12854-12858 (1989)). Utilizando estos algoritmos, ha
sido posible identificar los péptidos presentados por células T
objeto de predicción.
El análisis de anticuerpos de estructura atómica
conocida ha aclarado relaciones entre la secuencia y estructura
tridimensional de lugares de combinación de anticuerpo (Chothia y
otros, J. Biol. Chem. 196: 901-917 (1987)). Estas
relaciones implican que, excepto para la tercera región de los
dominios VH, los bucles de los lugares de unión tienen un pequeño
número conformaciones de la cadena principal: "estructuras
canónicas". La estructura canónica formada en un bucle específico
es determinada por sus dimensiones y por la presencia de ciertos
residuos en lugares clave, tanto en el bucle como en el armazón.
Un subconjunto adicional de residuos del armazón
ha sido definido como zona "Vernier", que puede ajustar la
estructura CDR y ajustar de modo fino el acoplamiento al antígeno
(Foot y otros, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992)).
Las sustituciones de estos residuos se ha demostrado que son
importantes para restablecer la afinidad de anticuerpos injertados
CDR, de manera que la zona Vernier tiene una consecuencia evidente
en el diseño de anticuerpos humanizados.
De acuerdo con anterior, es un objetivo de la
presente invención dar a conocer un medio para la conversión de un
anticuerpo monoclonal de especies de un mamífero a un anticuerpo
monoclonal de otra especie. Otro objetivo consiste en la predicción
de epítopos T potenciales dentro de la secuencia de regiones
variables. Otro objetivo consiste en identificar los residuos de
aminoácidos responsables de la especificidad de la especie o de la
inmunogenicidad dentro de la secuencia del anticuerpo monoclonal
responsable de la inmunogenicidad T. Otro objetivo consiste en
sustituir de manera razonable los residuos aminoácidos dentro de las
secuencias de epítopo T de una especie con la serie de una segunda
especie de manera que los anticuerpos de la primera especie no serán
inmunogénicos en la segunda especie. Otro objetivo consiste en hacer
sustituciones solamente en las zonas del armazón de las cadenas
pesada y ligera, y no en las regiones que determinan
complementariedad; asimismo los aminoácidos correspondientes a la
zona Vernier y aquéllos vinculados a las estructuras canónicas no
pueden ser reemplazados. Otro objetivo de la presente invención es
dar a conocer nuevas secuencias de ADN que incorporan los residuos
de aminoácidos de sustitución. Otro objetivo consiste en dar a
conocer un vector que contiene las secuencias de ADN para el
anticuerpo modificado. Otro objetivo consiste en dar a conocer un
hospedante eucariótico o procariótico transformado con un vector que
contiene la secuencia de ADN para el anticuerpo modificado.
Se da a conocer un método único para identificar
y sustituir residuos de aminoácidos dentro de las secuencias
antígenas de células T, que convierten la antigenicidad de la
inmunoglobulina de una primera especie de mamífero a la de una
segunda especie de mamífero. El método cambiará simultáneamente la
inmunogenicidad y conservará estrictamente las características de
unión del ligando. La sustitución razonable de estos residuos
aminoácidos dentro de las secuencias antígenas de células T de las
regiones variables, que no están involucradas en la estructura
tridimensional, no tiene efecto alguno en las características de
unión del ligando pero alteran notablemente la inmunogenicidad.
Figura 1: secuencia de aminoácido deducida de un
anticuerpo (a) VK y (b) VH de murino R3. Las CDR se han
subrayado.
Figuras 2 y 3: análisis para la modificación de
regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo
IOR-R3.
IOR-R3.
- A:
- secuencia de la región variable del anticuerpo monoclonal murino IOR-R3.
- B:
- secuencia de la región variable de la inmunoglobulina humana con mayor homología.
- C:
- secuencia de la región modificada variable de IOR-R3.
- Sombreado: secuencias antigénicas de células T de predicción, residuos de aminoácidos subrayados: aminoácidos involucrados en estructura terciaria.
- Caracteres en negrita: regiones determinantes de complementariedad.
- Residuos de aminoácidos en las casillas: sustituciones propuestas.
La descripción es la misma para las dos cadenas,
pesada y ligera.
Figura 4: modelo molecular de la región variable
de mAB R3 mostrada en forma de cinta. El VH se encuentra a la
derecha y es más oscuro que el VL. El modelo muestra la cadena
lateral de residuos murinos que fueron mutados a efectos de
humanizar los segmentos anfipáticos de predicción.
Figura 5: detección de la unión de R3 quimérico y
mutante a EGF-R por RRA.
Se ensayó la actividad de unión de antígeno en
diferentes concentraciones de R3 (-,-) murino purificado, R3 (+)
quimérico y VHR3/muR3VK (*) mutante y se representó como CPM de
^{125}I-EGF unido con respecto al logaritmo de la
concentración de cada anticuerpo (la concentración de IgG se
cuantificó mediante ensayo ELISA).
Figura 6: inmunización de monos con R3 murino, R3
quimérico y R3 mutante.
- Ordenadas: Absorbancia a 405 nm.
- Abscisas: número de días de la sangre recogida.
Se llevó a cabo el ensayo ELISA tal como se
describe en el ejemplo 9. Las flechas indican el tiempo de inyección
intravenosa de 2 mg de cada mAb. La dilución de suero utilizada fue
de 1/10000.
Figuras 7 y 8: análisis para la modificación de
las regiones variables de cadenas pesada y ligera de anticuerpo
IOR-T1.
- A:
- secuencia de la región variable del anticuerpo monoclonal murino IOR-T1.
- B:
- secuencia de la región variable de la inmunoglobulina humana con mayor homología.
- C:
- secuencia de la región variable modificada del anticuerpo IOR-T1.
Los símbolos son iguales que en la figura 2. La
descripción es la misma para ambas cadenas, pesada y ligera.
Figuras 9 y 10: análisis para la modificación de
las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo
IOR-CEA1.
- A:
- secuencia de la región variable del anticuerpo monoclonal murino IOR-CEA1.
- B:
- secuencia de la región variable de la inmunoglobulina humana con mayor homología.
- C:
- secuencia de la región variable modificada del anticuerpo IOR-CEA1.
Los símbolos son iguales que en la figura 2. La
descripción es la misma para ambas cadenas, pesada y ligera.
La presente invención se refiere a un
procedimiento que reduce simultáneamente la inmunogenicidad del
anticuerpo monoclonal de roedor preservando sus características de
unión de ligando de modo completo. Dado que la antigenicidad de una
inmunoglobulina depende de la presencia de péptidos antigénicos de
células T en su secuencia, la inmunogenicidad de un anticuerpo
xenogénico o alogénico se puede reducir sustituyendo los residuos
incluidos en las secuencias antigénicas de células T que difieren de
las usualmente encontradas en anticuerpos de otras especies de
mamíferos.
La sustitución de los residuos no incluye los
involucrados en las estructuras canónicas o en la zona Vernier. La
sustitución razonable de residuos no tiene efectos en los
determinantes estructurales o en los contactos interdominios, por lo
tanto, las propiedades de unión de ligando deben quedar sin
afectación como consecuencia de alteraciones limitadas a los
residuos del armazón de la zona variable.
El presente procedimiento utiliza los datos de
secuencia disponibles para dominios variables de anticuerpos humanos
compilados por Kabat y otros, "Sequences of proteins of
immunological Interest", quinta edición, Bethesda, Maryland;
National Inst. of Health, 1994 ("Secuencias de proteínas de
interés inmunológico").
En la primera etapa, los dominios variables de
cualquier cadena pesada o ligera de una primera especie animal, por
ejemplo, ratón, se comparan con los dominios variables
correspondientes de una segunda especie animal, por ejemplo, la
especie humana. Se pretende que la presente invención permitirá la
alteración antigénica de cualquier anticuerpo de una especie
animal.
La comparación se lleva a cabo por un método
automatizado por ordenador (PC-DOS HIBIO PROSIS
06-00, Hitachi). Las regiones humanas variables con
mayor homología se comparan a continuación, residuo a residuo, a las
regiones murinas correspondientes. Esto definirá también el subgrupo
humano al cual se parece más íntimamente cada una de las secuencias
de ratón.
En la segunda etapa, las dos secuencias de región
variable homólogas, de ratón y humana, se analizan para la
predicción de secuencias T-antigénicas.
El algoritmo AMPHI (Bersofsky y otros, The
Journal of Immunology 138: 2213-2229 (1987)) predice
secuencias Helicoidales. El algoritmo SOHHA predice la zona de
hidrofobicidad de la hélice (Elliott y otros, J.Immunol. 138:
2949-2952 (1987)). Estos algoritmos predicen
fragmentos presentados por células T de proteínas antigénicas.
Los residuos del armazón de ratón que difieren de
su correspondiente parte humana se sustituyen por los residuos
presentes en la parte humana correspondiente. Este cambio
(sustitución) tiene lugar solamente con los residuos que se
encuentran en las secuencias T-antigénicas.
Finalmente, la sustitución de los residuos
responsables de las estructuras canónicas o de las involucradas en
la zona Vernier puede tener un efecto significativo en la estructura
terciara. Por lo tanto, no se pueden incluir en la sustitución. Se
puede obtener información adicional con respecto a la influencia de
las sustituciones propuestas sobre la estructura terciaria o del
lugar de unión a partir de un modelo molecular de las regiones
variables.
El modelo molecular puede ser construido en una
estación de trabajo Silicon Graphics Iris 4D utilizando UNIX y
utilizando el paquete de modelado molecular "QUANTA" (Polygen
Corp.).
Se utilizan los siguientes procedimientos para
preparar secuencias de ADN recombinante que incorporan las CDR de
una primera especie de mamífero, usualmente un animal, por ejemplo,
mAb murino, tanto a cadena pesada como ligera, en una segunda
especie de mamífero, preferentemente humano, apareciendo armazones
que pueden ser utilizados para transfectar células mamíferas para la
expresión de anticuerpo recombinante menos inmunogénico y con la
especificidad de antígeno del anticuerpo monoclonal animal.
La presente invención comprende además un método
para la construcción y expresión del anticuerpo modificado, que
comprende:
- a.-)
- mutagénesis y ensamblaje de dominios de regiones variables incluyendo regiones CDR y FR. El método de mutagénesis PCR (Kamman y otros, Nucleic Acids Res. 17: 5404-5409 (1989)) es utilizado preferentemente para introducir los cambios en diferentes posiciones.
- b.-)
- preparación de un vector de expresión que incluye una región variable y la región constante humana correspondiente que después de transfección en células tiene como resultado la secreción de proteínas suficiente para determinaciones de afinidad y especificidad.
- c.-)
- co-transfección de vectores de expresión de cadena pesada y ligera en las líneas celulares apropiadas.
Después de unas 2 semanas, los supernatantes
celulares son analizados por ensayo ELISA en cuanto a producción de
IgG humano. Las muestras son analizadas a continuación por cualquier
método para IgG humano capaz de la unión a antígenos
específicos.
La presente invención da a conocer un método para
la incorporación de CDR de anticuerpos monoclonales animales en
armazones que parecen ser inmunoglobulinas humanas en cuanto a su
naturaleza de manera que el anticuerpo recombinante resultante será
o bien débilmente inmunogénico o no inmunogénico una vez
administrado a humanos. Preferentemente, las inmunoglobulinas
recombinantes serán reconocidas como autoproteínas cuando se
administren con objetivos terapéuticos. Este método hará útiles los
anticuerpos recombinantes como agentes terapéuticos porque serán o
bien débilmente inmunogénicos o no inmunogénicos una vez
administrados a humanos.
La presente invención se prevé además que incluya
la conversión recombinante de cualquier anticuerpo monoclonal humano
en un anticuerpo monoclonal con aspecto de recombinante humano al
proporcionar aquél una región de armazón adecuada.
La presente invención es destinada a incluir la
conversión de cualquier inmunoglobulina animal en una
inmunoglobulina con aspecto humano. Se pretende además que la
inmunoglobulina de aspecto humano pueda contener cadenas ligeras
Kappa o Lambda o que sean una de cualquiera de los siguientes
isotipos de cadenas pesadas (alfa, delta, épsilon, gamma y mu).
Los siguientes ejemplos están destinados a
ilustrar la invención pero no limitar el alcance de la misma.
Se extrajo ARN citoplásmico de aproximadamente
10^{6} R3 células hibridoma (receptor del Factor de
anticrecimiento Epidérmico) tal como se describe por Faloro y otros
(Faloro, J. y otros, Methods in Enzymology 65:
718-749, 1989).
La reacción de síntesis de cADN consistió en 5
\mug ARN, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 75 mM KCI, 10 mM
DTT, 3 mM MgCl_{2}, 25 pmol de CG2AFOR cebador (5'
GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') para la reacción variable de la
cadena pesada o CK2FOR cebador (5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC
3') para la región variable de la cadena ligera, 250 \muM de cada
uno de los inhibidores de ribonucleasa de dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 15
U (ARN guard, Pharmacia) en un volumen total de 50 \mul. Las
muestras fueron calentadas a 70ºC durante 10 minutos y enfriadas
lentamente a 37ºC durante un período de tiempo de 30 minutos. A
continuación, se añadieron 100 unidades de transcriptasa inversa
(BRL) MMLV y continuó la incubación a 37ºC durante 1 hora.
Se amplificaron el VH y VK de los cADN utilizando
el PCR tal como se describe por Orlandi y otros (Orlandi, R. y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837,
1989). Para amplificación PCR de VH, las mezclas ADN/cebador
consistieron en 5 \mul de cADN, 25 pmoles de CG2AFOR cebador (5'
GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGT
TTTG 3') y VH1BACK cebador (5' AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3').
TTTG 3') y VH1BACK cebador (5' AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3').
Para amplificación PCR de VK, las mezclas de
ADN/cebadores consistían en 5 \mul cADN y 25 pmoles de CK2FOR
cebador (5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') y VK10BACK cebador
(5' TTGAATTCCAGT
GATGTTTTGATGACCCA 3'). Se añadió a cada una de estas mezclas 2,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP y dGTP, 5 \mul componentes de 10X tampón termolasa y 1 unidad de Termolasa (IBI) en un volumen final de 50 \mul. Se sometieron muestras a 25 ciclos térmicos a 94ºC, 30 seg; 50ºC, 30 seg; 72ºC, 1 min; y una última incubación de 5 minutos a 72ºC. Se purificaron VH y VK ADN amplificados en un equipo de purificación Prep. A Gene (BioRad).
GATGTTTTGATGACCCA 3'). Se añadió a cada una de estas mezclas 2,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP y dGTP, 5 \mul componentes de 10X tampón termolasa y 1 unidad de Termolasa (IBI) en un volumen final de 50 \mul. Se sometieron muestras a 25 ciclos térmicos a 94ºC, 30 seg; 50ºC, 30 seg; 72ºC, 1 min; y una última incubación de 5 minutos a 72ºC. Se purificaron VH y VK ADN amplificados en un equipo de purificación Prep. A Gene (BioRad).
Los VH y VK cDNA purificados fueron clonados en
un vector M13. Se secuenciaron clones mediante el método dideoxi
utilizando T7 DNA Pol (Pharmacia). Ver figura 1.
Los inventores reamplificaron el cDNA por PCR
utilizando VH1BACK cebador (5'
AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG
3') y VH1FOR cebador (5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3') para
VH y VK3BACK cebador (5' GACATTCAGCTGACCCA 3') y VK3FOR cebador (5'
GTTAGATCTC
CAGTTTGGTGCT 3') para VK. Los cDNA amplificados fueron sometidos a digestión con PstI y BstEII para el gen VH o Pvull y BgIII para el gen VK. Los fragmentos fueron clonados en M13-VHPCR1 (con digestión con PstI y BstEII) o en M-13VKPCR1 (con digestión con PvuII y BcII). Se facilitan detalles de los vectores por Orlandi, R. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, 1989. Los M13VHPCR-R3 y M13VKPCR-R3 conteniendo insertos de gen V fueron identificados directamente por secuenciado.
CAGTTTGGTGCT 3') para VK. Los cDNA amplificados fueron sometidos a digestión con PstI y BstEII para el gen VH o Pvull y BgIII para el gen VK. Los fragmentos fueron clonados en M13-VHPCR1 (con digestión con PstI y BstEII) o en M-13VKPCR1 (con digestión con PvuII y BcII). Se facilitan detalles de los vectores por Orlandi, R. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, 1989. Los M13VHPCR-R3 y M13VKPCR-R3 conteniendo insertos de gen V fueron identificados directamente por secuenciado.
El gen VH junto con el promotor de cadena pesada
Ig, los lugares de unión apropiados y secuencias de péptidos señal
fueron recortados de vectores M13 por digestión mediante HindlII y
BamHI y clonados en un vector de expresión (pSVgpt). A continuación
se añadió una región constante IgG1 humana (Takahashi, N. y otros,
Cell 29: 718-749, 1982) como fragmento BamHI. La
construcción resultante era R3VH-pSVgpt. La
construcción del R3VK-pSVhyg fue esencialmente la
misma excepto que el gen gpt fue sustituido por el gen de
resistencia a la higromicina y se añadió una región constante de
cadena Kappa humana (Hieter, P.A. y otros, Cell 22:
197-207, 1980).
Las secuencias de región variable de cadenas
pesada y ligera de R3 fueron analizados en cuanto secuencias
antigénicas de células T. Se llevó a cabo utilizando el algoritmo de
ordenador AMPHI, que predice segmentos de las secuencias con una
longitud de 11 aminoácidos con una estructura de hélice anfipática,
es decir, tienen un lado hidrofóbico y un lado hidrofílico que se
une a moléculas MHC II.
Dentro de la secuencia de dominio variable de la
cadena pesada se hizo la predicción de cinco segmentos que son
(utilizando la numeración de Kabat):
- 1.
- FR1 entre aminoácidos 3-13.
- 2.
- FR1 entre aminoácidos 8-20.
- 3.
- FR2 y CDR2 entre aminoácidos 39-55.
- 4.
- FR3 entre aminoácidos 74-84.
- 5.
- FR4 y CDR3 entre aminoácidos 100c-110.
La figura 2 muestra las secuencias
correspondientes a la cadena pesada.
Esta secuencia murina es comparada con las
secuencias de inmunoglobulina incluidas en la base de datos
GeneBank y EMBL. La secuencia de la región variable humana con mayor homología es determinada y asimismo se define el subgrupo humano al que se parece más íntimamente la secuencia murina. En este caso la secuencia humana hallada era una inmunoglobulina fetal designada HUMIGHVA, cuya región variable tiene 75% de homología con las regiones FR de la inmunoglobulina murina R3.
GeneBank y EMBL. La secuencia de la región variable humana con mayor homología es determinada y asimismo se define el subgrupo humano al que se parece más íntimamente la secuencia murina. En este caso la secuencia humana hallada era una inmunoglobulina fetal designada HUMIGHVA, cuya región variable tiene 75% de homología con las regiones FR de la inmunoglobulina murina R3.
Ambas secuencias de región variable, humana y
murina, son comparadas a continuación, residuo a residuo, y los
residuos en las regiones FR no involucradas en la zona Vernier o con
estructuras canónicas son las seleccionadas. Por lo tanto, pueden
ser cambiadas por los residuos en la misma posición dentro de la
secuencia humana.
Finalmente, este análisis es enriquecido mediante
modelado por ordenador del lugar de unión. En el modelo molecular es
posible definir las sustituciones que perturbarán la estructura
terciaria del lugar de unión.
Para la cadena pesada de R3 murino los inventores
proponen 6 sustituciones:
- 1.
- LEU en la posición 11 por VAL
- 2.
- VAL en la posición 12 por LYS
Solamente con estas dos sustituciones es posible
alterar la hélice anfipática y, por lo tanto, el epítopo T de
predicción en la FR1.
- 3.
- SER en la posición 75 por THR
- 4.
- THR en la posición 76 por SER
- 5.
- ALA en la posición 78 por VAL
- 6.
- THR en la posición 83 por ARG
En este caso, con las sustituciones propuestas en
la FR3, está humanizada.
La secuencia antigénica de célula T en la FR2
contiene dos PRO que es un residuo de aminoácido muy raro en la
mayor parte de lugares antigénicos de la hélice, de manera que los
inventores proponen que no es un epítopo real de célula T.
En la posición 108 en la FR4 aparece THR que se
encuentra presente en la misma posición en algunas inmunoglobulinas
humanas, solamente el residuo 109 (LEU) es muy raro en humanos,
excepto por esta diferencia puntual la mayor parte del epítopo de
célula T de predicción es humano, sobre esta base no necesita ser
modificado.
En la figura 3 se ha mostrado el análisis para la
cadena ligera de R3 murino.
En la secuencia solamente se predijo una hélice
anfipática entre residuos 52-63 correspondientes a
CDR2 y FR3, y en esta región solamente existe una diferencia puntual
entre secuencias murina y humana, en la posición 63. No se propone
sustitución, porque esta cadena murina ligera debe ser no
inmunogénica en humanos (ver modelado molecular).
Se construyó un modelo de las regiones variables
de mAb R3 de ratón utilizando el programa de modelado molecular
QUANTA/CHARm 4,0 (Molecular Simulations Inc., 1994), funcionando en
una estación de trabajo de 150 MHz Silicon Graphics Indigo Extreme
workstation. Los armazones VK y VH fueron construidos separadamente
a partir de Fab 26-10 (Jeffrey, P.D y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 10310, 1993) y Fab 36-71
(Strong, R.K. y otros, Biochemistry 30, 3739, 1993),
respectivamente. Los Fab 26-10 y mAb R3 tienen 92%
de homología en los armazones VK y 88% de homología en el conjunto
de la región VK. Los armazones VH de Fab 36-71 y mAb
R3 tienen una homología del 85%.
Se tomaron coordenadas del banco de datos de
proteínas Brookhaven (entradas 1IGI y 6FAB). Se encajaron los
armazones de Fab 36-71 en los armazones de Fab
26-10, correspondiéndose solamente los residuos que
se ha observado que están involucrados frecuentemente en el interfaz
entre las regiones ligera y variable (Chotia, C. y otros, J. Mol.
Biol. 186, 651, 1985). El dominio VH de Fab 26-10 y
el dominio VK de Fab 36-71 fueron cancelados dejando
el híbrido requerido. Se llevaron a cabo sustituciones de cadena
lateral siguiendo el proceso de solape máximo (Snow, M.E. y otros,
Proteins 1, 267, 1986) y comparando, siempre que ello era posible,
con otras estructuras cristalinas.
Las regiones hipervariables del dominio
R3-ligero variable (VL) (L1, L2 y L3) se
construyeron conservando las mismas conformaciones de cadena
principal, tal como en Fab 26-10, puesto que los CDR
correspondientes de ambos anticuerpos son altamente homólogos y
corresponden a los mismos grupos estructurales canónicos (Chotia, C.
y otros, Nature 342, 877, 1989). En el dominio VH de mAb R3, CDR H1
corresponde al grupo estructural canónico 1, igual que en Fab
36-71, de manera que los ángulos de torsión
principales de la molécula principal se mantuvieron. CDR H2 se
corresponde al grupo estructural canónico 2 y la conformación de
cadena principal de este bucle se tomó del fragmento Fv 4D5 (entrada
1FVC), que fue seleccionado entre otras estructuras de alta
resolución a causa de la buena correspondencia de su base de bucle
H2 con el armazón de Fab 36-71. Para la totalidad de
bucles antes mencionados se realizaron comparaciones con otros CDR
del banco de datos para orientar las cadenas laterales.
Para modelar CDR H3, que en mAb R3 tenía una
longitud de 14 aminoácidos, se utilizó una dinámica molecular de
alta temperatura para muestreo de conformación (Bruccoleri, R.E. y
otros, Biopolymers 29, 1847, 1990). En primer lugar, la estructura
completa sin CDR H3 fue sometida a minimización de energía
manteniendo los residuos H-94 y
H-103 fijos y utilizando limitadores harmónicos de
10 Kcal/(mol atom A^{2}) para los átomos de la cadena principal. A
continuación se construyó un bucle con una conformación arbitraria
empezando desde los dos aminoácidos previamente fijados. Estos
residuos próximos al armazón fueron colocados teniendo en
consideración otras estructuras cristalinas y la parte superior del
bucle fue construida con una conformación extendida evitando
interacciones estéricas fuertes con el resto de la molécula. Para
las siguientes etapas de modelación solamente se permitió el
desplazamiento de CDR H3 y de las cadenas laterales adyacentes con
una distancia de 5A^{0}. Se llevó a cabo en primer lugar una
minimización de energía y a continuación una dinámica molecular a
800 K fue activada durante 150 picosegundos. El período de tiempo
para el ciclo se fijó en 0,001 picosegundos y se registraron las
coordenadas cada 100 períodos o pasos. Las 120 conformaciones de
energía más baja de la dinámica efectuada fueron extraídas y
sometidas a minimización de energía en la que todos los átomos de la
estructura se pudieron desplazar. Se obtuvieron varias
conformaciones de baja energía y la que tenía la energía más baja
fue utilizada en los análisis subsiguientes. Se modelaron
individualmente diferencias entre las variantes murina y humanizada
del anticuerpo R3 para investigar su posible influencia en la
conformación de CDR.
Las sustituciones de aminoácidos en las
posiciones 11, 12 (FR1) y 83 (FR3) en la región de cadena pesada
variable se encuentran a mucha distancia de los límites de
CDRs-FRs y no deben tener influencia alguna en la
afinidad de unión. El residuo SER 75 está dirigido hacia afuera, por
lo que la sustitución por THR no parece ser importante en cuanto a
la capacidad de unión. Por el contrario, THR 76 es accesible desde
la parte superior de la molécula y se podría involucrar en la
interacción con el antígeno. Sin embargo, la sustitución de THR 76
por SER es un cambio conservador que probablemente no conduce a
variaciones importantes en la afinidad de unión.
La sustitución de ALA 78 por VAL no debe requerir
reestructuraciones estéricas. No obstante, VAL 78 podría
"empujar" hacia adelante ILE 34 (H!). En general, las
mutaciones puntuales propuestas no deben afectar la afinidad de
unión de acuerdo con el estudio de modelado molecular por ordenador
(figura 4).
Se realizó el mismo análisis en la región
variable de la cadena ligera de IOR-R3, indicando el
modelado molecular que no es necesario realizar cambios en esta
región.
Los cambios de los aminoácidos de la región
variable de la cadena pesada mutante fueron construidos utilizando
mutagénesis PCR (Kammann, M. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
86, 4220-4224, 1989).
De modo breve: dos amplificaciones por PCR: la
mezcla de reacción era 0,5 \mul del VH sobrenadante de ADN de una
sola hebra clonado en M13, 25 pmoles de oligo 1 ó 2 mutagénico, 25
pmoles de cebadores oligo 3 ó 4 mutagénicos (ver más adelante las
secuencias de los cebadores). Se añadieron a estas mezclas 2,5 mM de
cada uno de dATP, dCTP, dTTP, y dGTP, 5 \mul de componentes de
tampón 10X Vent Polimerasa (NEB) y 1 unidad de Vent DNA Polimerasa
(NEB) en un volumen final de 50 \mul. Las muestras fueron
sometidas a 12-15 ciclos térmicos a 94ºC, durante 30
segundos; 50ºC, 30 segundos; 75ºC, 1 minuto; y una última incubación
durante 5 minutos a 75ºC. Los productos de ambas PCR se unen en una
segunda PCR utilizando los cebadores externos solamente (3 y 4). Se
purificó VH DNA amplificado mediante un equipo de purificación Prep.
A Gene (BioRad).
Para los cambios en la FR1 de LEU 11 y VAL 12 por
VAL y LYS, respectivamente, se utilizaron los siguientes
cebadores:
Cebador 1: 5'
GAAGCCCCAGGCTTCTTCACTTCAGCCCCAGGCTG
3'.
Cebador 3: 5' GTAAAACGACGGCCAGT
3'.
Estos cebadores se combinan en una PCR.
Cebador 2: 5'
CAGCCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCA
3'.
Cebador 4: 5' ACTGGCCGTCGTTTTAC
3'.
Estos cebadores se combinan en una PCR.
A continuación, los productos de ambas PCR se
combinan en una PCR utilizando los cebadores 3 y 4.
Para los cambios en FR3, SER 75, THR 76, VAL 78 Y
THR 86 por THR, SER, VAL y ARG, respectivamente, se diseñaron los
siguientes cebadores:
Cebador 1: 5'
GCAGAGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTA
GACTGTGCTGGTGGATTCGTCTACCGT
3'.
Cebador 3: 5' GTAAAACGACGGCCAGT
3'.
Estos cebadores se combinan en una PCR.
Cebador 2: 5'
ACGGTAGACGAATCCACCAGCACAGTCTACATGCAACT
CAGCAGCCTGAGATCTGAGGACTCTGC
3'.
Cebador 4: 5' ACTGGCCGTCGTTTTAC
3'.
Estos cebadores se combinan, en una PCR.
A continuación, los productos de ambas PCR se
combinan en una PCR utilizando los cebadores 3 y 4.
Después de mutagénesis se clonaron genes VH en
vectores de expresión (pSVgpt) dando lugar a los plásmidos R3 mut
VH-pSVgpt.
Cuatro \mug de R3VH-pSVgpt y
ocho \mug R3VK-pSVhyg (quimérico) o mutante R3
VH-pSVgpt y R3VK-pSVhyg murino
fueron linealizados por digestión con Pvul. Los ADN fueron mezclados
entre sí, se precipitaron con etanol y se disolvieron en 25 \mul
de agua. Aproximadamente 10^{7} células NSO (la NSO de mieloma de
rata es una línea celular que no segrega Ig) fueron cultivadas hasta
semiconfluencia, se recogieron por centrifugación y resuspendieron
en 0,5 ml DMEN junto con el ADN digerido en una cubeta de
electroporación. Después de cinco minutos sobre hielo, las células
recibieron un impulso único de 170V a 960 \muF
(Gene-Pulser, Bio-Rad) y se dejaron
en hielo durante otros 30 minutos. Las células fueron colocadas a
continuación en 20 ml de suero fetal de vaca DMEN más 10% y se
permitió su recuperación durante 24 horas. Al cabo de este tiempo
las células fueron distribuidas en una placa de 96 pocillos y se
aplicó un medio selectivo, los clones transfectados eran visibles a
ojo desnudo catorce días más tarde.
La presencia de anticuerpo humano en el medio de
los pocillos que contenían los clones transfectados fue medida
mediante ensayo ELISA. Los pocillos de las placas de microtitulación
fueron dotadas de recubrimiento con anticuerpos IgG antihumanos de
cabra (cadena pesada específica) (Sera-Lab). Después
de lavar con PBST (solución salina con tampón fosfato conteniendo
0,02% Tween 20, pH 7,5), se añadieron 20 \mul de medio de cultivo
diluido en 100 \mul de PBST de los pocillos que contenían los
transfectantes a cada pocillo de microtitulación durante una hora a
37ºC. Los pocillos fueron vaciados a continuación, lavados con PBST
y recibieron la adición de anticuerpos de región
(Sera-Lab) kappa (específico de cadena ligera)
antihumanos conjugados de peroxidasa y se incubaron a 37ºC durante
una hora, vaciándose los pozos a continuación, lavados con PBST y
añadiendo un tampón sustrato conteniendo ortofenilendiamina. Las
reacciones se interrumpieron después de unos pocos minutos por la
adición de ácido sulfúrico y se midió la absorbancia a 492 nm.
La determinación de la constante de afinidad del
^{125}I-EGF que se une a su receptor por R3
murino, quimérico y mutante por ruptura de anticuerpos de epítopos T
fue llevada a cabo por Análisis Radio Receptor homogéneo (RRA) con
fracción microsomal de placenta humana (Macias, A. y otros,
Interferon y Biotecnología 2: 115-127, 1985).
Estos anticuerpos quiméricos y mutantes por
ruptura de epítopos T fueron ensayados utilizando esta técnica en
cuanto a su capacidad de unión a EGF-R (figura 5).
Ambos anticuerpos se unieron a EGF-R con la misma
afinidad que el anticuerpo murino original(10^{-9}M),
confirmando que las regiones radiables de ratón correctas habían
sido clonadas y que el isotipo del nuevo anticuerpo no afectaba la
unión. Incluso más, los cambios del anticuerpo mutante no afectaron
la unión al antígeno.
Se inmunizaron tres grupos de tratamiento con dos
monos Cercopithecus aethiops en cada grupo con anticuerpo R3
quimérico, R3 mAb murino, y anticuerpo mutante VH R3,
respectivamente. Todos los grupos fueron inmunizados por vía
subcutánea en los días 0, 14, 28 y 42, con 2 mg de anticuerpo
adsorbido en 5 mg de hidróxido de aluminio.
Se recogió la sangre antes de la primera
inmunización y una semana más tarde de cada inmunización, desde
todos los grupos, y el suero fue obtenido de cada muestra, y se
mantuvo a -20ºC. La titulación de anticuerpos con respecto a R3 mAb
murino se determinó por técnica ELISA.
Se recubrieron placas costar (alto grado de
unión) con anticuerpo monoclonado R3 murino con una concentración de
10 \mug/ml en tampón de bicarbonato (pH 9,6) y se incubó durante
una noche. Después de ello, las placas fueron lavadas con PBST, se
bloquearon con el mismo tampón conteniendo 1% BSA durante una hora a
temperatura ambiente.
La etapa de lavado fue repetida y se añadieron 50
\mul/pocillo de las diferentes diluciones de suero. Después de
incubar durante dos horas a 37ºC, las placas fueron lavadas
nuevamente e incubadas una hora a 37ºC con antisuero total
antihumano de cabra conjugado fosfatado alcalino o antisuero
específico de región IgG Fc antihumano (Sigma, Inc). Después de
lavar con PBST los pocillos fueron incubados con 50 \mul de tampón
sustrato (1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato diluido en
tampón de dietanolamina (pH 9,8). Absorbancia a 405 nm en un lector
ELISA (Organon Teknika, Inc).
Se obtuvo una elevada respuesta IgG al anticuerpo
R3 murino cuando este anticuerpo fue utilizado como inmunógeno. Se
obtuvo una respuesta IgG menor pero todavía medible (1/10000) al
anticuerpo R3 murino cuando se inmunizaron monos con el anticuerpo
quimérico, contrariamente a los resultados obtenidos con la versión
Vh mutante (figura 6). Con el anticuerpo R3 VH mutante no hubo
respuesta medible después de dos inmunizaciones, y se midió una
pequeña respuesta (1/10000) después de cuatro inmunizaciones.
Las secuencias de la región variable de las
cadenas pesada y ligera de IOR-T1 fueron analizadas
para las secuencias antigénicas de células T. En el dominio variable
de la cadena pesada se hizo la predicción de tres segmentos, a
saber:
- 1.
- FR1 entre los aminoácidos 2-21.
- 2.
- FR1, CDR1, FR2 entre los aminoácidos 29-43.
- 3.
- FR4, CDR3 entre aminoácidos 97-111.
La figura 7 muestra una comparación con la
secuencia humana de mayor homología y la sustitución propuesta, que
son cinco en la FR1, dos en la FR2 y dos en la FR4.
El mismo procedimiento con la cadena ligera
(figura 8) dio lugar a los siguientes segmentos antigénicos de
célula T:
- 1.
- FR3 entre los aminoácidos 60-65.
- 2.
- FR3, CDR3 entre los aminoácidos 79-90.
- 3.
- CDR3 entre los aminoácidos 93-95A.
Después de los análisis, los inventores
propusieron cinco sustituciones en FR3 en las posiciones: 60, 63,
83, 85 y 87.
Las secuencias de región variable de las cadenas
pesada y ligera de IOR-CEA1 fueron analizadas para
las secuencias antigénicas de células T.
En el dominio variable de la cadena pesada se
hizo la predicción de dos segmentos, a saber:
- 1.
- FR1 entre aminoácidos 1-16.
- 2.
- CDR3 y FR4 entre los residuos 96-110.
La figura 9 muestra una comparación con la
secuencia humana de mayor homología y la sustituciones propuestas,
que son siete en FR1 y dos en FR4.
El mismo análisis con la cadena ligera (figura
10) dio lugar a los siguientes segmentos antigénicos de células
T:
- 1.
- FR1 entre aminoácidos 1-14.
- 2.
- CDR2-FR3 entre aminoácidos 55-70.
- 3.
- FR3-CDR3-FR4 entre aminoácidos 74-100.
Después de los análisis, los inventores
propusieron cuatro sustituciones en FR1 en las posiciones 9, 10, 11
y 13, once sustituciones en FR3 en las posiciones 58, 60, 63, 70,
75, 76, 78, 81, 83, 85 y 87, y una sustitución en FR4 en la posición
100.
Se incluyó el programa AMPHI como subrutina en un
programa escrito para la lectura y proceso de las secuencias de
inmunoglobulina de la base de datos Kabat. En el proceso de las
secuencias, se hicieron las siguientes redistribuciones:
- -
- Los aminoácidos no definidos de tipo GLX (posiblemente GLN o GLU) fueron definidos como GLN (ambos GLN y GLU tienen índices de hidrofilicidad similares: -0,22 y -0,64, respectivamente).
- -
- Los aminoácidos no definidos de tipo ASX (posiblemente ASN o ASP, con índices de hidrofilicidad de -0,60 y -0,77) fueron definidos como ASN.
- -
- Otros aminoácidos no definidos (espacios vacíos o símbolos "extraños" en las secuencias fueron definidos como XXX (desconocidos). El programa AMPHI asigna un valor de hidrofilicidad de 0,0 a estos aminoácidos.
Las secuencias con más de 5 aminoácidos
desconocidos (XXX) no se incluyeron en el análisis.
Después de este análisis preliminar, cada una de
las secuencias fue procesada por el programa AMPHI y los resultados
son presentados en forma de tablas para cada una de las familias de
inmunoglobulinas.
En las tablas I a VI se muestran los análisis
para las seis familias de cadena pesada de ratón. Las "regiones
anfipáticas predominantes" (PAR) podrían ser definidas en las
presentes en más de 90% de las secuencias de región variable
correspondientes a cada familia. Por ejemplo, comparando el armazón
uno (FR1), se podía definir un PAR entre los residuos de aminoácidos
11 y 16 para las familias I y II, por el contrario las familias III
y IV no tienen regiones anfipáticas en general desde el primer
aminoácido hasta el de orden 30. En las familias V y VI, se podían
definir PAR más pequeños de 12-14 y
12-15 residuos, respectivamente.
La humanización de los PAR reduciría la
inmunogenicidad en pacientes. La agrupación de regiones anfipáticas
en los armazones de la región variable de inmunoglobulina soporta la
universalidad del método propuesto, es decir, humanizar estos
epítopos de células T de predicción en mutaciones de pocos
puntos.
Claims (12)
1. Método para la modificación de un anticuerpo,
que comprende:
- comparación de los aminoácidos del armazón de dominio variable de una primera especie de mamífero con los aminoácidos de armazón de dominios variables de una segunda especie de mamífero;
- determinar un subgrupo de las segundas especies de mamíferos al que corresponde de manera más íntima la primera especie de mamíferos;
- seleccionar un anticuerpo de dicho subgrupo cuya secuencia de armazón es más similar a la secuencia de armazón de la primera especie de mamífero;
- identificar residuos de aminoácidos de la primera especie de mamífero que difieren de los residuos de aminoácidos del armazón de la especie seleccionada de segundo mamífero, y que se encuentran dentro de las secuencias antigénicas de células T en la región variable del anticuerpo seleccionado;
- seleccionar los residuos de aminoácidos que no se encuentran dentro de las zonas determinantes de complementariedad y que no están involucradas directamente con estructuras canónicas o zona Vernier;
- sustituir los residuos de aminoácidos del armazón de la primera especie de mamífero que difieren de los residuos de aminoácidos de la segunda especie de mamífero con los correspondientes residuos de aminoácidos de la segunda especie de mamífero más similar identificada de este modo; y
- obtener el anticuerpo modificado.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
la primera especie de mamífero es un ratón.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que
la segunda especie de mamífero es humana.
4. Método, según la reivindicación 1, en el que
uno o varios dominios constantes de cadena pesada, el dominio
constante de cadena ligera, o ambos dominios constantes de cadena
pesada y ligera del anticuerpo de dicha primera especie de mamífero
son sustituidos por el dominio constante correspondiente del
anticuerpo de la segunda especie de mamífero.
5. Método, según la reivindicación 1, en el que
un anticuerpo quimérico modificado con inmunogenicidad reducida es
obtenido a partir de un anticuerpo que tiene una región variable de
cadena pesada mostrada en la figura 2 sub A y una región variable de
cadena ligera mostrada en la figura 3 sub A, al realizar las
siguientes mutaciones de puntos en las zonas del armazón de la
cadena pesada:
6. Método, según la reivindicación 1, en el que
se obtiene un anticuerpo quimérico modificado con inmunogenicidad
reducida a partir de un anticuerpo que tiene una región variable de
cadena pesada mostrada en la figura 7 sub A y una región variable de
cadena ligera mostrada en la figura 8 sub A, al hacer las siguientes
mutaciones puntuales en las zonas de armazón de las cadenas pesada y
ligera:
7. Método, según la reivindicación 1, en el que
se obtiene un anticuerpo quimérico modificado con inmunogenicidad
reducida a partir de un anticuerpo que tiene una región variable de
cadena pesada mostrado en la figura 9 sub A y una región variable de
cadena ligera mostrada en la figura 10 sub A, al realizar las
siguientes mutaciones puntuales en las zonas de armazón de las
cadenas pesada y ligera:
8. Anticuerpo quimérico que tiene una región
variable de cadena pesada mostrada en la figura 2 sub A y una región
variable de cadena ligera mostrada en la figura 3 sub A, modificada
por las siguientes mutaciones puntuales en las zonas de armazón de
la cadena pesada para reducir la inmunogenicidad:
\newpage
9. Anticuerpo quimérico que tiene una región
variable de cadena pesada mostrada en la figura 7 sub A y una región
variable de cadena ligera mostrada en la figura 8 sub A, modificada
por las siguientes mutaciones puntuales en las zonas de armazón de
las cadenas pesada y ligera para reducir la inmunogenicidad:
10. Anticuerpo quimérico que tiene una región
variable de cadena pesada, mostrada en la figura 9 sub A y una
región variable de cadena ligera mostrada en la figura 10 sub A,
modificada por las siguientes mutaciones puntuales en las zonas de
armazón de las cadenas pesada y ligera para reducir la
inmunogenicidad:
11. Compuesto farmacéutico que comprende un
anticuerpo quimérico modificado, según cualquiera de las
reivindicaciones 8-10.
12. Utilización de un anticuerpo quimérico
modificado, según cualquiera de las reivindicaciones
8-10, para la fabricación de un medicamento dirigido
contra tumores.
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