ES2221096T3

ES2221096T3 - Procedimiento cromatografico para la purificacion de alto rendimiento y la inactivacion virica de igg.

Info

Publication number: ES2221096T3
Application number: ES98110526T
Authority: ES
Inventors: Wytold R. Lebing; Patricia Alred; Doug C. Lee; Hanns-Ingolf Paul
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2018-06-09
Also published as: US5886154A; EP0893450B1; JPH1129494A; CA2239237A1; USRE43655E1; CA2676074C; DE69823931D1; CA2676074A1; CA2239237C; AU7009998A; PT893450E; EP0893450A1; JP4359347B2; ATE267214T1; USRE44558E1; DE69823931T2; AU749336B2; US6307028B1; DK0893450T3; US20020177693A1

Abstract

SE EXPONE UN PROCESO PERFECCIONADO PARA LA PURIFICACION DE ANTICUERPOS PROCEDENTES DEL PLASMA HUMANO U OTRA FUENTE. EL PROCESO REPRESENTA LA SUSPENSION DE LOS ANTICUERPOS A UN PH DE 3,8 A 4,5, SEGUIDO POR LA ADICION DE ACIDO CAPRILICO Y UN DESPLAZAMIENTO DEL PH HASTA PH 5,0 - 5,2. SE FORMA UN PRECIPITADO DE PROTEINAS, CONTAMINANTES, LIPIDOS Y CAPRILATO, QUE ES RETIRADO, MIENTRAS QUE LA MAYORIA DE LOS ANTICUERPOS PERMANECEN EN SOLUCION. VUELVE A AÑADIRSE CAPRILATO SODICO HASTA UNA CONCENTRACION FINAL NO INFERIOR A 15 MM APROXIMADAMENTE. ESTA SOLUCION SE INCUBA DURANTE 1 HORA A 25 C PARA EFECTUAR LA INACTIVACION VIRICA. SE RETIRA UN PRECIPITADO (BASICAMENTE CAPRILATO) Y LA SOLUCION TRANSPARENTE SE DILUYE CON AGUA PURIFICADA PARA REDUCIR SU CONCENTRACION IONICA. SE UTILIZA CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO DE ANIONES, QUE USA DOS RESINAS DIFERENTES, PARA OBTENER UNA IGG EXCEPCIONALMENTE PURA CON UNA DISTRIBUCION DE LAS SUBCLASES SIMILAR A LA DISTRIBUCION DE PARTIDA. EL PROCEDIMIENTO AUMENTA EL RENDIMIENTO Y PRODUCE UNA GAMMAGLOBULINA CON PUREZA SUPERIOR AL 99%.

Description

Procedimiento cromatográfico para la purificación de alto rendimiento y la inactivación vírica de IgG.

Antecedentes de la invención Campo

Esta invención se refiere en general a la purificación de proteínas y a la inactivación/eliminación de virus y de manera específica a un procedimiento mejorado para la purificación de gammaglobulinas a partir del plasma sanguíneo y otras fuentes.

Antecedentes

Los ácidos carboxílicos, como el ácido caprílico, se han utilizado en la preparación de productos plasmáticos (precipitación de proteínas) y en la inactivación de virus. Véase, por ejemplo, el resumen de dicho uso en Seng y col. (1990).

Fraccionamiento usando caprilato

Durante la preparación de las inmunoglobulinas humanas se reconoce generalmente que el ácido caprílico es un agente precipitante efectivo para la mayoría de las proteínas plasmáticas a pH 4,8, siempre que estén optimizados parámetros como la temperatura y la fuerza iónica. Steinbuch y col. (1969) han descrito la precipitación del grueso de las proteínas plasmáticas con ácido caprílico sin afectar a la IgG, la ceruloplasmina o la IgA. Steinbuch y col. aislaron la IgG del suero de mamíferos usando ácido caprílico y refirieron que la mejor manera de obtener una precipitación extensa de proteínas no inmunoglobulinas era con un pH ligeramente ácido, pero no por debajo de 4,5. Se diluyó el plasma 2:1 con tampón acetato 0,06 M a pH 4,8, y posteriormente se trató con caprilato al 2,5% en peso para iniciar la precipitación. La adsorción en lotes del sobrenadante en DEAE-celulosa se usó para eliminar impurezas adicionales de la fracción de IgG aislada. Trabajos posteriores de Steinbuch y col. mostraron el uso de ácido caprílico para precipitar la mayoría de las proteínas y lipoproteínas (distintas de las inmunoglobulinas) presentes en la fracción de etanol III de Cohn (Steinbuch y col., 1973).

El procedimiento de Steinbuch, véase más arriba, se aplicó a un medio de cultivo celular y al líquido ascítico de ratones usando ácido caprílico al 0,86% en peso para la recuperación de IgG (Russo y col, 1983). Se aplicó el mismo procedimiento al plasma humano diluido usando caprilato al 2,16% en peso (Habeeb y col., 1984). Después de la precipitación con ácido caprílico, Habeeb y col. realizaron el fraccionamiento sobre DEAE-celulosa. La IgG resultante procedente del plasma estaba libre de agregados, de plasmina y de plasminógeno. Además, la IgG que se obtuvo tenía una actividad anticomplemento baja y era relativamente estable durante su almacenamiento.

Como consecuencia de estos estudios, los científicos desarrollaron algunas técnicas para purificar la IgA, la IgG, la glucoproteína ácida alfa 1 y la prealbúmina, concluyendo al mismo tiempo que la relación de precipitación era muy dependiente de la temperatura y del pH (Steinbuch y col., 1969; Steinbuch y col., 1973; véase también Tenold, 1996).

A modo de ejemplo, la IgG se ha preparado como subproducto del fraccionamiento rutinario de la fracción III de Cohn, basándose en la solubilidad de la IgA con el ácido caprílico presente a pH 4,8 (Pejaudier y col., 1972). La IgA que se aisló de la fracción III de etanol frío mediante adsorción en DEAE-celulosa y elución se purificó más mediante precipitación en ácido caprílico. Las condiciones para la precipitación fueron concentración de proteínas de 1,5-2%, cloruro sódico al 0,9%, pH 5,0 y ácido caprílico al 1,12% en peso.

Se ha descrito una purificación en dos etapas de las inmunoglobulinas del suero y de líquido ascítico de mamíferos (McKinney y col., 1987). En primer lugar se precipitó la albúmina y otras proteínas no IgG usando ácido caprílico, y posteriormente se añadió sulfato de amonio al sobrenadante para precipitar la IgG.

La patente de EE.UU. 5.164.487, de Kothe y col. (1992), se refiere al uso del ácido caprílico para la fabricación de una preparación de IgG libre de agregados, sustancias vasoactivas y enzimas proteolíticos, que sea tolerable por vía intravenosa. El procedimiento incluye poner en contacto el material de partida que contiene IgG con ácido caprílico al 0,4% a 1,5% antes de la purificación cromatográfica con una matriz de intercambio iónico o hidrófoba.

También se ha usado el caprilato sódico para purificar la albúmina. Según estos procedimientos, se añade el caprilato sódico al plasma que se va a procesar, y protege la albúmina cuando la corriente de proceso es expuesta a temperaturas elevadas. Las temperaturas extremas no sólo desnaturalizan las globulinas de la corriente de proceso, sino que también pueden generar neoantígenos contaminantes (Schneider y col., 1979; Condie, 1979; véase también Plan, 1976).

Tenold (1996) muestra el uso del caprilato como agente de partición para el aislamiento de la albúmina a partir del efluente de la fracción II + III o IV-1 de Cohn. Una vez más se usa el caprilato sódico para desnaturalizar (y precipitar) las globulinas.

Inactivación de los virus

La patente de EE.UU. 4.939.176, de Seng y col. (1990), presenta un procedimiento para inactivar los virus de soluciones de proteínas con actividad biológica poniendo en contacto las soluciones con ácido caprílico. Las condiciones preferidas que se señalaron para el procedimiento fueron pH de 4 a 8 y ácido caprílico, y la forma no ionizada del ácido caprílico con un 0,07% a 0,001% del de la forma no ionizada del ácido caprílico.

Se conocen otros procedimientos de inactivación química de los virus mediante el uso de agentes químicos. La patente de EE.UU. 4.540.573 de Neurath (1985) enseña el uso de di o trialquilfosfatos como agentes antivíricos. La patente de EE.UU. 4.534.972, de Lembach (1985), describe un procedimiento para obtener soluciones de proteínas terapéuticamente o inmunológicamente activas y sustancialmente libres de agentes infecciosos. En el procedimiento del Lembach se pone en contacto una solución de proteínas con un complejo que tiene un metal de transición, por ejemplo fenantrolina cúprica, y un agente reductor para realizar la inactivación de los virus sin afectar sustancialmente a la estructura de la proteína.

Cromatografía de intercambio aniónico

Bloom y col. (1991) presentan un ejemplo del uso de la cromatografía de intercambio aniónico para purificar preparaciones de anticuerpos. Este procedimiento incluye poner en contacto una solución que contiene anticuerpos y una proteína contaminante A con una resina de intercambio aniónico, y posteriormente eluir los anticuerpos de la resina en condiciones de fuerza iónica creciente.

La patente canadiense 1.201.063, de Friesen, enseña la preparación de una IgG aceptable para su uso intravenoso sometiendo una fracción plasmática a un procedimiento de separación en dos etapas utilizando dos resinas de intercambio aniónico diferentes. En cada etapa el tampón que se utiliza para equilibrar la resina de intercambio aniónico también se usa para eluir de la resina la fracción que contiene IgG.

Kimura y col. (1984) han descrito un procedimiento para aislar una composición que contiene IgG y albúmina humanas para su administración intravenosa. El procedimiento supone etapas de precipitación en condiciones controladas de pH, concentración de etanol, fuerza iónica y temperatura.

Resumen de la invención

La invención es un procedimiento mejorado para la purificación deanticuerpos de tipo IgG a partir del plasma humano y de otras fuentes. El procedimiento supone la suspensión de los anticuerpos a pH 3,8 a 4,5 seguida de la adición de ácido caprílico (o de otra fuente de caprilato) y de un cambio de pH de pH 5,0 a 5,2. Se elimina un precipitado que contiene proteínas contaminantes, lípidos y formas de caprilato, mientras que la mayoría de los anticuerpos permanecen en solución. De nuevo se añade el caprilato sódico a una concentración final de no menos de alrededor de 15 mM. Esta solución se incuba en condiciones suficientes como para reducir sustancialmente el título de virus activo (por ejemplo, durante una hora a 25ºC). Se elimina un precipitado (principalmente caprilato), y la solución clara se diluye con agua purificada para reducir la fuerza iónica. La cromatografía de intercambio aniónico que usa dos resinas diferentes se utiliza para obtener una preparación excepcionalmente pura de anticuerpos con una distribución de subclases de anticuerpos similar a la distribución de partida.

Este procedimiento difiere de la técnica anterior porque combina la inactivación y la eliminación de los virus como una parte integral del esquema de procesado y minimiza la manipulación de la solución de gammaglobulinas después del tratamiento de los virus. Al integrar el tratamiento de los virus en el esquema de procesado, el procedimiento maximiza el rendimiento y produce unas gammaglobulinas con una pureza superior a 99%.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de flujo que describe el procedimiento de la invención.

La Figura 2 es un diagrama de flujo que muestra el procedimiento de la técnica anterior para aislar anticuerpos.

Formas de realización específicas Materiales y procedimientos

Los ajustes del pH se hicieron con ácido acético 1 M, ácido acético 2 M, NaOH al 6%, NaOH 1 M o HCl 1 M. La solución de almacenamiento de caprilato sódico se hizo disolviendo caprilato sódico al 30% en agua para inyección mediante mezcla. La fracción del plasma humano II + III se produjo como describieron Lebing y col. (1994). Todos los reactivos eran de grado USP o mejores. Se hizo la nefelometría usando un nefelómetro Beckman Array 360 y kits Beckman. Se hizo la HPLC analítica usando sistemas HP 1050 con columnas de SEC Tosohaas G3000SW y G4000SW. Se determinaron las proteínas usando el procedimiento de Biuret.

El procedimiento es robusto y sencillo (véase la Figura 1). El procedimiento comienza disolviendo de nuevo los anticuerpos precipitados en agua purificada a un pH próximo a 4,2. En la práctica, el aumento de la cantidad de agua por unidad de pasta da lugar a un aumento del rendimiento. Sin embargo, cuando se procesan cientos de kilogramos de pasta es práctico sacrificar parte del rendimiento a fin de mantener la escala de los vasos y de las columnas dentro de los límites de capacidad de funcionamiento. El rendimiento de las etapas de disolución, inactivación vírica y cromatografía es relativamente importante porque la demanda de inmunoglobulinas generalmente excede con mucho al suministro.

La inactivación de los virus recubiertos precisa que se retire la mayor parte del precipitado sensible al pH antes de la etapa de inactivación. Además, el contenido de caprilato sódico debe ser de 15-60 mM durante la retención a 25ºC para conseguir la inactivación completa de los virus recubiertos. Los estudios de inactivación de virus han confirmado que el caprilato 16 mM o 18 mM inactiva más de cuatro unidades logarítmicas el virus de la diarrea vírica bovina y el virus de la pseudorrabia (los dos son virus recubiertos) en 30 min a 24ºC. Esta inactivación química adicional de los virus complementa la inactivación de los virus de una etapa de retención a pH 4,25 que también se incorpora en el procedimiento de fabricación.

Las etapas principales del procedimiento se definen como:

1): Suspensión de una composición que contiene inmunoglobulinas precipitadas en agua purificada para inyección (API) a 5ºC mediante una mezcla vigorosa. En una forma de realización preferida se usa pasta de la fracción II + III, pero también se pueden usar otras fuentes, como líquido ascítico, medio de cultivo tisular que contiene anticuerpos y otras fracciones del plasma humano o fracciones del plasma de animales.

2): Disolución de las inmunoglobulinas en una solución mediante la reducción del pH de la mezcla a pH 3,8 a 4,5, preferentemente 4,2, mediante la adición de ácido, preferentemente ácido acético, con una ulterior mezcla vigorosa.

3): Adición de una fuente de iones caprilato (por ejemplo, caprilato sódico al 40% en agua al 40% en p/v) hasta una concentración final de 15 mM a 25 mM, preferentemente 20 mM, y ajustando el pH hasta 5,0 a 5,2, preferentemente 5,1, con una base (como NaOH 1 M).

4): Eliminación de las proteínas, lípidos y caprilato precipitados mediante filtración a temperatura ambiente (por ejemplo, 5-25ºC). La filtración precisa la adición de un coadyuvante de la filtración (por ejemplo, en este caso el coadyuvante de la filtración es tierra diatomácea al 2% a 5%). La solución se filtra usando filtración mediante flujo normal. Esta etapa de lugar a una reducción significativa de los virus no recubiertos. La filtración se puede sustituir por centrifugación.

5): Adición de más caprilato para ajustar la concentración de nuevo hacia aproximadamente 15 mM a aproximadamente 60 mM, preferentemente 20 mM, mientras se mantiene el pH a 5,0-5,2, preferentemente 5,1, mediante la adición de ácido (por ejemplo, ácido acético 1 M).

6): La temperatura se aumenta hasta aproximadamente 25-35ºC, preferentemente 25ºC, y se mantiene por un periodo de aproximadamente 15 min a aproximadamente 6 horas, preferentemente aproximadamente 1 hora. Se pueden usar tiempos de incubación más prolongados con cierta disminución del rendimiento. Durante esta etapa se forma un precipitado que contiene principalmente caprilato y algunas proteínas adicionales.

7): Se añade un coadyuvante de la filtración (tierra de diatomeas) y se elimina el precipitado mediante filtración de flujo normal. Se inactivan los virus recubiertos con la suspensión en caprilato, y los virus no recubiertos se capturan en el elemento de filtro.

8): La solución clarificada se diluye con agua purificada para reducir la conductividad a entre 1-8 mS/cm, preferiblemente menos de 5 mS/cm.

9): Hacer pasar la solución a través de dos columnas de cromatografía de intercambio aniónico unidas en serie. Los intercambiadores aniónicos se eligen por su capacidad de retirar IgA, IgG, IgM, albúmina y otras impurezas proteicas residuales. Después de la carga, se lavan las columnas con tampón de equilibración. El flujo final y la fracción de lavado se recogen como IgG purificada. Las dos columnas se equilibran con el mismo tampón y al mismo pH.

Se pueden utilizar varias combinaciones de resinas de intercambio aniónico dependiendo de la selectividad de las resinas. Las resinas de intercambio aniónico se eligen por su capacidad de eliminar selectivamente las impurezas que se encuentran en las fracciones del plasma precipitadas mediante alcohol/pH. Cuando se desarrolló este procedimiento se obtuvieron purificaciones satisfactorias con combinaciones de resinas de Pharmacia Biotech Q & ANX y E. Merck TMAE Fractogel.

Las condiciones que se describen para la cromatografía generalmente varían desde pH 5,0 a 5,2. A pH <5,0 las impurezas atraviesan las columnas. A pH >5,2 se sacrifica el rendimiento. La fuerza iónica durante la cromatografía es relativamente importante porque se observa una reducción de la pureza cuando aumenta la fuerza iónica durante la cromatografía.

En las formas de realización preferidas la solución se aplica directamente al primer intercambiador aniónico que se ha equilibrado con acetato sódico 20 mM a pH 5,1. A esto le sigue de la aplicación de la fracción que no se une (flujo directo) desde la primera columna de intercambio aniónico directamente hacia la segunda columna de intercambio aniónico. Esta columna también se ha equilibrado con tampón de acetato 20 mM a pH 5,1. La solución de proteínas se carga típicamente en la primera columna a un cociente de 50-110 mg de IgG/ml de resina compacta. La solución de proteínas se carga típicamente en la segunda columna a un cociente de 75-95 mg de IgG/ml de resina compacta. También se pueden ajustar los cocientes de proteína a resina más allá de estos límites, pero esto influirá en el rendimiento y la pureza. A la solución de proteínas le siguen aproximadamente dos volúmenes de columna del tampón de equilibración, que elimina de las columnas mediante lavado toda la IgG no unida. La fracción no unida se recoge como IgG altamente purificada, que posteriormente se diafiltra, y la proteína se concentra hasta los valores finales de la formulación.

Las condiciones preferidas para el producto final se eligen basándose en patentes propiedad de este fabricante. Estas condiciones (pH bajo y cantidad baja de sales) en teoría beneficiarían a cualquier producto que contenga IgG. La proteína que se recoge se ajusta a pH 4,2. Se ultrafiltra hasta una concentración de aproximadamente 5% (p/v). Posteriormente se diafiltra con agua purificada.

La IgG purificada se concentra a una formulación líquida estable (como describió Tenold, 1983) o a otra formulación final adecuada (por ejemplo, una formulación liofilizada). Para una formulación líquida la IgG purificada se concentra para obtener IgG al 5% o al 10% (p/v) después de la filtración en condiciones estériles. Antes de la filtración se ajusta el pH a 3,80 a 4,25 y se añade maltosa o glicina para ajustar la osmolaridad para que sea compatible para la inyección intravenosa. La sustancia estéril se mantiene durante no menos de 21 días para reducir la actividad anticomplemento y para inactivar los virus recubiertos.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, los valores porcentuales de las concentraciones se determinan en una escala peso/volumen.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, reducir sustancialmente el título de virus activos significa reducir el título de virus activos al menos aproximadamente dos unidades logarítmicas, más preferentemente al menos aproximadamente tres unidades logarítmicas, y más preferentemente al menos aproximadamente cuatro unidades logarítmicas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, sustancialmente la totalidad de una proteína significa al menos aproximadamente el 90% de la proteína. Sustancialmente nada de una proteína significa menos de aproximadamente el 5% de la proteína.

Ejemplo 1 Purificación de la IgG a partir de pasta de la fracción II + III de Cohn

Se solubilizó la pasta de la fracción II + III en 12 volúmenes de agua purificada a 5ºC. Se ajustó el pH de la mezcla a pH 4,2 con ácido acético, y se mezcló durante una hora. Esta etapa disolvió la IgG.

Posteriormente se ajustó el pH de la mezcla hasta pH 5,2 con NaOH. y caprilato sódico ("cambio de pH"). Se precipitaron las proteínas y los lípidos. Se clarificó la mezcla mediante filtración para eliminar el precipitado que podría interferir con la inactivación de los virus. Se ajustó la concentración de caprilato a 20 mM a pH 5,1, y se incubó la mezcla durante 1 hora a 25ºC para llevar a cabo la inactivación de los virus recubiertos.

Se filtró la mezcla para producir una solución clara para la cromatografía. Se ajustó la conductividad de la solución a entre 2,0 y 3,0 mS/cm usando agua purificada. Se ajustó el pH de la solución a 5,0 a 5,2 después del ajuste de la conductividad.

Posteriormente se aplicó la solución directamente a dos columnas de intercambio aniónico (un intercambiador aniónico fuerte seguido de un intercambiador aniónico débil). Las dos columnas estaban unidas en serie. La IgG fluyó a través de la columna, mientras que las impurezas (incluyendo el caprilato) se unieron a las dos columnas aniónicas.

El pH del flujo directo recogido de la cromatografía se ajustó a 3,8 a 4,0 usando ácido acético. Se diafiltró con siete intercambios de tampón (agua purificada). Posteriormente se concentró y se formuló finalmente a pH 4,2.

El rendimiento global de la disolución de la pasta hasta el producto final fue 69% (véase la tabla). Esto supone una mejora significativa respecto al rendimiento del procedimiento anterior utilizando el procedimiento de lavado con alcohol (48%). (Véase la Figura 2, que muestra el procedimiento anterior).

TABLA Resumen del rendimiento

1

Ejemplo 2 Purificación de la IgG a partir de un medio de cultivo celular

En primer lugar se ajusta el medio de cultivo de líneas celulares que contiene anticuerpos monoclonales segregados al pH y la conductividad adecuados. Esto se consigue mediante diafiltración frente a agua purificada mientras se ajusta el pH a 4,2 con ácido acético. La conductividad debe ser menor de 1,0 mS/cm.

La purificación de los anticuerpos monoclonales se consigue siguiendo las etapas que se han presentado más arriba. Posteriormente se concentra el anticuerpo monoclonal purificado y se formula finalmente a pH 4,2 usando glicina, maltosa u otros expedientes adecuados. Mediante la formulación a pH, 4,2 se puede conseguir una solución líquida estable durante 2 años a 5ºC. Esto es muy deseable desde el punto de vista comercial.

Discusión

Las inmunoglobulinas precipitan con la fracción II + III durante el fraccionamiento con alcohol de Cohn. La precipitación depende de la carga global de la superficie de las proteínas y de su interacción con el disolvente. Establecer unos intervalos exactos de salinidad, alcohol y pH puede reducir algo el intervalo en el que precipitan las proteínas. Sin embargo, la mayoría de las proteínas precipita en un intervalo amplio de pH y de concentración de alcohol (tanto como 1,5 unidades de pH y 10% de alcohol). De esta manera los intervalos de precipitación de las proteínas tienden a solaparse. Los tres principales tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgA e IgM, coprecipitan debido a la similitud de sus puntos isoeléctricos. Esta similitud complica la ulterior separación de las inmunoglobulinas. Por lo tanto, los esquemas de producción que utilizan precipitación precisan que una cantidad significativa de la IgG esté coprecipitada con IgA e IgM.

Además de la reducción del rendimiento, la precipitación clásica precisa el uso de etanol. Puesto que el etanol desestabiliza las proteínas, son necesarias temperaturas reducidas (típicamente -5ºC) durante el procesado para incrementar la estabilidad de las proteínas. La cromatografía puede evitar los problemas de desnaturalización de las proteínas que surgen con frecuencia en las estrategias de precipitación. Las etapas de cromatografía de las proteínas generalmente se pueden hacer en condiciones que favorecen la estabilidad de las proteínas. Otra desventaja del fraccionamiento con etanol es que debido a su naturaleza química el alcohol supone un posible riesgo de explosión, y por ello precisa instalaciones a prueba de explosiones y protocolos de manejo especiales. Este hecho incrementa significativamente el coste del procedimiento de fraccionamiento, una desventaja que no existe con los procedimientos cromatográficos convencionales.

La cromatografía de intercambio iónico aprovecha la distribución de superficie y la densidad de carga de las proteínas y de los medios de intercambio iónico. La resina de intercambio aniónico presenta una superficie cargada positivamente. La densidad de carga es específica de la resina y generalmente es independiente del pH (dentro del intervalo de trabajo de la resina). Un intercambiador aniónico típico se unirá a las proteínas que tienen una carga negativa neta (es decir, cuando el pH de la solución está por encima del punto isoeléctrico de la proteína). En realidad la superficie de una proteína no presenta una sola carga, sino que es un mosaico de cargas positivas, negativas y neutras. La estructura de superficie es específica para una proteína dada y se afecta por las condiciones de la solución como fuerza iónica y pH. Este carácter único se puede aprovechar para establecer condiciones específicas en las que proteínas individuales se unirán o se desprenderán de la resina de intercambio aniónico. Al establecer esas condiciones, proteínas que tienen propiedades de superficie o de carga que son sólo ligeramente diferentes se pueden separar de manera efectiva con un alto rendimiento (> 95%).

Las mejoras de la estructura de los soportes de resinas de cromatografía han hecho que la cromatografía a gran escala sea una alternativa práctica a procedimientos de purificación más convencionales. Las resinas rígidas permiten que se procesen rápidamente (< 5 horas) grandes volúmenes, y la elevada densidad de ligando ofrece la elevada capacidad que es necesaria para el procesado de grandes volúmenes. Estos factores, junto con los elevados rendimientos, pureza del producto y sencillez del procesado, favorecen el uso de la cromatografía en la fabricación a gran escala.

Conclusión

El procedimiento de cromatografía que se describe en la presente memoria descriptiva aprovecha la elevada especificidad de las resinas de cromatografía. Se usan dos intercambiadores aniónicos para eliminar selectivamente contaminantes proteicos y el agente de inactivación de los virus. El producto resultante tiene una pureza >99% cuando se ensaya mediante nefelometría o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC-HPLC).

El procedimiento también se ha diseñado para minimizar la pérdida de IgG. Se ha integrado cuidadosamente la inactivación y eliminación de los virus en las etapas de disolución y cromatografía, incrementando de esta manera la eficiencia del procedimiento. El rendimiento global desde la disolución de la pasta al producto final es de 69% (véase la tabla). Esto supone una mejora significativa respecto al rendimiento del procedimiento actual que usa el procedimiento de lavado en alcohol (48%).

El procedimiento se realizó con la pasta de la fracción II + III humana de Cohn del ejemplo 1. Sin embargo, se prevé que el procedimiento se puede usar con resultados equivalentes en fracciones de plasma aisladas también de animales no humanos.

Referencias

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Claims

1. Un procedimiento para preparar una preparación de IgG purificada y con inactivación de los virus a partir de una solución inicial que comprende IgG y contaminantes, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a): ajuste del pH de la solución inicial a 3,8 a 4,5 para producir una solución intermedia;

(b): adición de iones caprilato a la solución intermedia y ajuste del pH para formar una solución sobrenadante que comprende anticuerpos y un precipitado;

(c): separación de la solución sobrenadante del precipitado;

(d): incubación de la solución sobrenadante en condiciones de concentración de ion caprilato, tiempo, pH y temperatura tales que el título de virus recubiertos activos se reduce al menos dos unidades logarítmicas o hasta un nivel indetectable, para producir una solución con inactivación de los virus;

(e): puesta en contacto de la solución con inactivación de los virus con al menos una resina de intercambio aniónico y ocasionalmente con dos resinas de intercambio aniónico diferentes en condiciones que permiten la unión de los contaminantes a la resina a la vez que no permiten una unión significativa de la IgG a la resina, de modo que se produce una preparación de IgG purificada con inactivación de los virus.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que en la etapa (d) la solución sobrenadante se incuba a un pH de 5,0 a 5,2.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que en la etapa (b) el pH de la solución intermedia se ajusta a de 5,0 a 5,2.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que en la etapa (e) la solución con inactivación de los virus se pone en contacto con al menos una resina de intercambio aniónico a un pH que va de 5,0 a 5,2.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la solución inicial comprende anticuerpos procedentes del plasma.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la solución inicial se obtiene a partir de un medio de cultivo de células de mamíferos.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que en la etapa (e) la solución con inactivación de los virus se pone en contacto con dos resinas de intercambio aniónico diferentes en condiciones tales que los contaminantes se unen selectivamente a las resinas mientras que la IgG no se une significativamente a las resinas.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que las dos resinas de intercambio iónico están presentes en dos columnas de cromatografía de intercambio aniónico diferentes y la solución con inactivación de los virus se hace pasar a través de las dos columnas de cromatografía de intercambio aniónico en serie.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8 en el que la solución con inactivación de los virus se pone en contacto con las dos resinas de intercambio aniónico a un pH que varia de 5,0 a 5,2.