JPH06504441A - アルツハイマー病に関するテストおよびモデル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルツハイマー病に関するテストおよびモデル発明の背景 アルツハイマー病は、一般的に老人痴呆として知られている進行性の病気である 。広義にいうと、この病気は、２つのカテゴリー、つまり後年に始まるものと初 期に始まるものとに分かれる。後年に始まるものは、老年（６５＋数年）で起こ り、正常なものより早い速度でかつより重度に脳の自然の萎縮が起こることによ って生じるものである。

初期に始まるアルツハイマー病は、かなりより頻繁に起こるが、老年期前、つま り３５から６０才の間で、非常に発達する広範囲な脳の萎縮による病理学的に同 様な痴呆を示す。このタイプのアルツハイマー病の一形態としては血族で起こり やすいものがあることが知られており、このため１、これは家族性アルツハイマ ー病（ｆａｍｉｌｉａｌ　ＡｌｚｈｅｉｍＣｒ’５ｄｉｓｅａｓｅ）　（ＦＡＤ ）として知られている。

両方のタイプのアルツハイマー病において、病理学的には同様であるが、より若 い年齢で始まる場合のほうが、異常性がより重度でかつより広範囲になる傾向が ある。この病気は、２タイプの脳の病変、つまり、老年性局面および神経細線維 のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅ）によって特徴づけ られる。

老人性局面は、中枢の細胞外のアミロイドの沈着による１５０μｍまでの直径の 破壊された神経網の領域である。

神経細線維のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅ）は、そ れぞれが対でねじれている２本のフィラメントからなるアミロイドタンパク質の 細胞内の沈着物である。

老人性局面のアミロイドフィラメントの主要なタンパク質のサブユニットである 、β−アミロイドタンパク質は、相対的な分子量が約４，５００の非常に凝集し た小さいポリペプチドである。このタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質 （ａｍｙｌｏｉｄ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　（ＡＰＰ）と呼ば れるかなりより大きな前駆体タンパク質の切断生成物である。

現在、様々な形態のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する効果的な治療は知られて いない。しかしながら、それに対する治療が利用でき、アルツハイマー病に関す る痴呆とよく似た進行性の知能の衰退が生じる様々な他の形態の痴呆は存在する 。

したがって、ＡＤに関する診断テストによって、アルツハイマー病を排除できる ため、これらの他の症状の診断および治療に有用な道具が得られる。また、適当 な治療が利用できる際にも有用である。

ＡＤの病因に含まれる基礎的な生化学的な事項をさらに定義するために用いられ るアルツハイマー病の実験モデルの開発も重要である。このようなモデルは、一 つの適用として、アルツハイマー病の変性の過程を変える物質（ａｇｅｎｔ］を 評価するために用いることができると考えられる。例えば、アルツハイマー病の モデルシステムを、ＡＤの病因を誘発する若しくは促進する環境因子のスクリー ニングに用いられる。一方、実験モデルは、ＡＤの進行を阻害し、防止し、また は転換する物質のスクリーニングに用いることができる。ＡＤを防止し、はばみ 、若しくは転換するのに効果的である薬剤の開発に用いることもできると考えら れる。

発明の要約 本発明は、モデルシステムがＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に 相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タン パク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードするＤＮＡ配列からなる、ア ルツハイマー病のモデルシステムを提供するものである。

第一の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残 基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド 前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードする単離されたＤ ＮＡ配列を提供するものである。

第二の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残 基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミロイド 前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片をエンコードするヒトのＤＮＡ 配列の少なくとも１つの組込まれたコピーを何するヒト以外の形質転換動物を提 供するものである。

第二の実施態様においては、本発明は、ヒト以外の内因性のＡＰＰ対立遺伝子の 少なくとも１つがバリンをエンコードしない７１７番目のコドンを含むすべての 若しくは一部のヒトのＡＰＰ遺伝子によって完全に若しくは部分的に置き代った ものである、ヒト以外の形質転換動物を提供するものである。

第四の実施態様においては、本発明は、細胞がＡＰＰ７７０の７１７番目のアミ ノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有するアミ ロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型または断片を発現する、異種のＤＮ Ａ配列で形質転換した若しくはトランスフェクションした、またはヒト以外の形 質転換動物由来の、細胞、具体的には哺乳類動物の細胞および好ましくは神経、 神経膠、または星状細胞の系統（ｌ　ｉｎｅａｇｅ）の哺乳類動物の細胞を提供 するものである。標準的なプロトコルによると、培養されたヒトの細胞は、初代 培養物若しくは不死化した細胞株のいずれにしても、培養されたヒトの細胞が突 然変異ＡＰＰポリペプチドを発現するよろに、突然変異ＡＰＰ対立遺伝子で、一 時的あるいは安定してトランスフェクションされる。

第五の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残 基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を釘するアミロイド 前駆体タンパク質（Ａ　Ｐ　Ｐ）のイソ型または断片をエンコードするＤＮＡ配 列を含むヒト以外の形質転換動物および形質転換された細胞の製造方法を提供す るものである。

第六の実施態様においては、本発明は、他のヒトのタンパク質を含まない、ＡＰ Ｐ７７０の７１７番目のアミノ酸残基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン 以外のアミノ酸を有するヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型 または断片の製造方法を提供するものである。

第七の実施態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０の７１７番目のアミノ酸残 基の位置に相当するアミノ酸の位置にバリン以外のアミノ酸を有し、他のヒトの タンパク質を含まない、ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のイソ型 または断片を提供するものである。

第への実施態様においては、本発明は、対立遺伝子の７１７番目のコドンがバリ ンをエンコードしないことを決定することによってこのような疾病に特徴的なＡ ＰＰ対立遺伝子を検出するものである、アルツハイマー病、特に初期に始まるＡ Ｄの遺伝学的な素因に連結した（ｌｉｎｋｅｄ）　（つまり、コセグレケートし た（ｃｏ＋ｅｇｒｅｇａｊｅ）　）　ＡＰＰ対立遺伝子の検出方法を提供するも のである。好ましくは、７１７番口のコドンかイソロイシン、グリシン、若しく はフェニルアラニンのいずれかをエンコードすることが決定される際に、疾病に 特徴的なＡＰＰ対立遺伝子が検出される。したがって、アルツハイマー病に関連 した遺伝学的な変化の存在を定める方法が得られる。この診断方法を用いて、遺 伝学的なスクリーニングを目的として、発病する前に、この病気の発達を予想す るまたはヒト以外の実験動物若しくは細胞において特異的な突然変異を検出する ことができる。

第九の実施態様においては、本発明は、特にヒト以外の動物の細胞に存在する、 他のヒトのタンパク質を含まないヒトの変異ＡＰＰポリペプチドを提供するもの である。本発明は、また、７１７番目の位置（ＡＰＰ７７０に関して定義される 際の）でのアミノ酸の置換を含む本発明の特別な実施態様に関して上記したよう なこのようなポリペプチドをエンコードする単離された核酸およびこのような核 酸の使用及び適用に関するものである。

本発明の一概念によると、ＡＰＰに関してコードする遺伝子配列における遺伝学 的な変化を同定することからなる、被験者から除去した核酸または他のサンプル における、アルツハイマー病に対する遺伝子の存在を検出する方法を提供するも のである。

図の簡単な説明 図１は、初期に始まるＡＤが明らかに常染色体優性の無秩序ｆｄｉｓｏｔｄｅｔ ）として受け継がれている第一の家系図を示すものである。この家族における疾 病する平均年齢は５７±５才である。黒塗は、疾病した人を意味し、斜線は死亡 した人を示す。女性は丸によって示され、男性は四角によって示される。三角は プライバシーの保護のため現在の世代について用いられる。第二助代においては 、２人の疾病した兄弟の配偶者は姉妹であった。サンプルは、ハブロタイブが示 されている１３人、これらの人々の１９人の子供及び配偶者、および７人のより 遠い血縁の疾病していない人から用いた。染色体の長腕上の４遺伝子座における 第三世代の各人の２本の第２１染色体の文字を家系図の下に示す。この連鎖デー タ（ｌｉｎｋａｇｅ　ｄａｔａ）によって、黒塗の染色体は疾病した父親から受 け継がれていることが指摘される。

図２は、疾病した人における２１４９番目の塩基対での１塩基対変化（ａ　ｓｉ ｎｇｌｅ　ｂａｓｅ　ｐａｉｒ　ｃｈａｎｇｅ）を示す図１の家系図の正常なお よび疾病した人におけるＡＰＰ遺伝子のエキソン１７の一部のシーフェンシング ゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｇｅ　ｌｌのオートラジオグラフである。このＣか らＴへのトランジションによって７１７番目のコドンでのバリンからイソロイシ ンへのアミノ酸置換が起こる。

図３は、トランスメンブレンドメイン内のバリンからイソロイシンへの突然変異 （Ｖから１）および細胞外ドメインにおけるエッチシーエッチダブルニー−ディ 　（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）を引き起こす突然変異（ＥからＱ）を示すＡＰＰ遺伝子の エキソン１６および１７によってエンコードされるアミノ酸配列の一部を示すも のである。トランスメンブレンドメインの斜線のはいった領域および細胞外ドメ インの四角で囲っであるアミノ酸は、沈着したβ−アミロイドペプチドの配列を 示している。カング（Ｋａｎｇ）ら、（１９８７年）、ネイチ＋　−ｎｔａｔｕ ｒｅ）、３２５　：　７３３より用いた。

図４は、初期に始まるＡＤ家族における疾病しないおよび疾病した人からのエキ ソン１７のＰＣＲ生成物のＢｃｌＩ消化物を示し、制限部位および病気のコセグ レゲーション（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を示すものである。

図５は、家族Ｆ１９の家系図、さらにはＤ２１ｓ２１゜のデータを示すものであ る。

図６は、Ｆ１９の疾病したおよび疾病しない人のＡＰＰのエキラン１フ配列を示 すものである。疾病した人においては、２１５０番目の位置でＧ−＞Ｔ）ランジ ションが存在する。

図７は、ＡＰＰ６９５の配列を示すものである。

図８は、ＡＰＰ７５１の配列を示すものである。

図９は、ＡＰＰ７７０の配列を示すものである。

好ましい実施態様の詳細な説明 特に脳の領域におけるβ−アミロイドタンパク質（Ａ４）の＃積は、アルツハイ マー病の主要な病理学的な特徴の一つである。このβ−アミロイドタンパク質は 、内部の切断生成物（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｐｒｏｄｕｔ）と して、より大きなアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ　ｐｒｅｃｕｒ ｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　（ＡＰＰ）の一つまたはそれ以上のイソ型由来であ る約４ｋＤのタンパク質（３９がら４２アミノ酸）である。それぞれ、５６３． ６９５．７１４．７５１、及び７７０個のアミノ酸を含む、少なくとも５つのＡ ＰＰの独特なイソ型がある（ライラック（Ｗｉｒａｋ）　ら、（１９９１年）、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２５３　：　３２３）　、これらのＡＰＰの イソ型は、ヒトの第２１染色体上に位置する、ＡＰＰ遺伝子と称される、単一の 遺伝子の一次転写産物をスプライシングすることによっても生じる。はとんどの ＡＰＰのイソ型は配糖化された貫層タンパク質であり（ゴールドガバー（Ｇｏｌ ｄｇａｂｅｒ）　ら、（１９８７年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３５ 　：　８７７）　、４つのイソ型、ＡＡ５６Ｂ、ＡＰＰ７１４、ＡＰＰ７５１及 びＡＰＰ７７０がクニッッタイプ（Ｋｕｎｉｔｘ　ｔＹｐｅ）のセリンプロテア ーゼインヒビターと相同性のあるプロテアーゼインヒビタードメインを有するこ とが知られている。β−アミロイド（Ａ４）セグメントは、約　・半分のトラン スメンブレンドメインおよびＡＰＰのイソ型の細胞外ドメインの最初の約２８ア ミノ酸からなる。

ｉｎ　ｖｉｖｏのＡＰＰのタンパク質分解プロセッシング（ｐｒｏ＋ｅｏｌｙ＋ ｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）は正常な生理学的なプロセスである。カルボキシ ル末端を切り取った形態のＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０は、脳 および脳を髄液に存在しくパル７−ト（ＰａｌｍｅＮＪ　ら、（１９８９年）Ｓ ブロック　ナショル　ア力デ　サイ　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ ｃｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８６　：　６３３８　；ワイプマン（Ｗｅｉｄ ｅｍａｎｎ）　ら、（１９８９年）、セル（Ｃｅｌｌ）、５７：１１５）　、Ａ ＰＰのイソ型のＡ４ペプチドドメイン内の構成性切断部位（ｃｏｎｓｊｉｊｕｔ ｉｖｅ　ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ）でのＡＰＰのイソ型の切断によって生じ る（ニッシュ（Ｅｓｃｈ）ら、（１９９０年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 　、２４８　：　１１２２）　ｏ構成性切断部位（ｃｏｎｓｊｉｔｔｕｉｖｅ　 ｃｌｅａｖａｇｅ　ｓ目ｅ）での正常なタンパク質分解による切断によって、イ ソ型によってはプロテアーゼインヒビタードメインを含む大きい（約１００ｋＤ ）の可溶性のＮ−末端断片、およびほとんどのＡ４ドメインを含む９〜１０ｋＤ の膜に結合したＣ−末端断片が得られる。

病原性のβ−アミロイド（Ａ４）タンパク質の生成は、Ａ４ドメイン内の構成性 部位での正常な切断は起こらず、むしろＡ４ドメインに隣接する２か所の特異的 な部位で切断が起こる等の、ＡＰＰの異常な若しくは代わりのタンパク質分解プ ロセッシング（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｃｅ＠ｓｔｎｇ）の結果である と考えられる。これらの異常な切断部位の１つはトランスメンブレンドメイン中 にあり、他の異常な切断部位は細胞外のドメインの最初の２８アミノ酸のＮ−末 端辺りに位置する（図３を参照）。このような異常なタンパク質分解による切断 によって、タンパク質分解による分解および除去に対して耐性のある高密度のア ミロイド形成性の凝集物（ｄｅｎｓｅ　ａｍ７１ｏｉｄｏｇｅｎｉｃ　ａｇｇｒ ｅｇａｔｅ）を形成しゃすいβ−アミロイドＡ４ポリペプチドが生じる。このよ うにして得られたβ−アミロイドの凝集物は、アルツハイマー病の神経病理学的 な証しである多くのアミロイド斑および脳血管のアミロイドの形成に含まれると 考えられる。しかしながら、正確な異常な切断部位は必ずしも明らかではない； ＡＤに罹っている患者の脳から単離されたβ−アミロイド分子はＮ−およびＣ− 末端の異質性を示す。したがって、異常な切断経路は、配列に特異的なタンパク 質分解後のエキソペプチダーゼ活性化（末端の異質性を生じる）を含む、または 配列に特異的でない。

ＡＰＰ遺伝子はヒトの第２１染色体上に位置することが知られている。家族性ア ルツハイマー病によって分離する遺伝子座は、ＡＰＰ遺伝子の近くの第２１染色 体上に位置する（ハイスロップ１ｙｓｌｏｐ）ら、（１９８７年）、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２３５　：　８８５）　ｏ　ＡＰＰ遺伝子とＡＤ遺伝子 座との間の組換えはすでに報告されている（シエレンバーグ（Ｓｃｈｅｌｌｅｏ ｂｅｒｇ）ら、（１９８８年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅｌ　、２４１　： 　１５０７）　ｏこれらのデータによって、ＦＡＤを引き起こす突然変異の部位 としてＡＰＰ遺伝子が除外されるように思われる（ファン　ブロウクホーヴエン （Ｖａｎ　ＢｒｏｅｋｈｏｖｅｎＪら、（１９８７年）、ネイチャー（Ｎａｔｕ ｒｅ）、３２９：１５３；タング（Ｔａｎｚｉ）　ら、（１９８７年）、ネイチ ャー　（Ｎａｆｕｒｃ）、３２９：１５６）。

組換えＤＮＡ技術によって、可能な突然変異の位置を決めるための様々な遺伝子 の分析技術が害られる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（ベル、（１９８９年）、イムノロジー　 ツデイ（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ）、１０　：　：３５１）は、イント ロンのプライマーを用いた特異的な配列を増幅するのに使用でき、さらに、これ は直接配列決定（ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって分析できる。

ダッチタイプのアミロイド症（「エッチシーエッチダブルニー−ディ」　（ＨＣ ＨＷＡ−Ｄ”）による遺伝性の脳出血の分野において作業をしている研究者たち （レヴイ（Ｌｅｖ７）ら、（１９９０年）、サイエンス（Ｓｃ：ｅｒｒｃｅ）　 、２４８　：１１２２４）は、これによってこれらの患者の脳血管中にβ−アミ ロイドの蓄積が起こると考えられるＡＰＰにおける６１８番目の残基（ＡＰＰ６ ９５のナンバリングシステム（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ　ｇ７ｇｊｅｍ）を用いる） でのＧｌｕからＧｉｎへの置換を発見した。本発明者らは、−塩基置換、つまり ２１４９１４９番目対でのＣからＴへのトランジションが家族性アルツハイマー 病のケースによってはＡＰＰ遺伝子配列の一部で発見されることを確認した。こ の塩基対のトランジションによって、β−アミロイドタンパク質のＣ−末端付近 の、アミノ酸の置換、つまり７１７番目のアミノ酸（Ａ　Ｐ　Ｐ　７７０　）で のバリンからインロイシンへの置換が起こる（ヨシカイ（Ｙｏｓｈｉｋａｉ）） ら、（１９９０年）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、８７　：　２５７を参照）。これに よって、アルツハイマー病のケースによってはＡＰＰ遺伝子内の突然変異、特に バリン以外のアミノ酸をエンコードする等の７１７番目のコドンを変える突然変 異によって生じることが指摘される。

さらに、−塩基置換、つまり２１５０１５０番目対付近のＴからＧへのトランジ ションが、家族性アルツハイマー病の他のケースにおいてＡＰＰ遺伝子配列の一 部で発見された。この塩基対のトランジションによって、７１７番目のアミノ酸 で、異なるアミノ酸の置換、つまりバリンからグリシンへの置換が生じ、これに よってアルツハイマー病のケースによっては特に７１７番目のコドンでの、ＡＰ Ｐ遺伝子における突然変異によって生じるという論拠が有力になる。

７１７＃目のコドン（ＡＰＰ６９５では６４２番目の残基）でのバリンからイン ロイシンへの置換が生じるＡＰＰ遺伝子座における突然変異によって、家族によ ってはＡＤが生じることは現在明らかである（ボウティ（Ｇｏａｆｅ）　ら、（ １９９１年）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４９　：　７０４）。

７１７番目のコドンでバリンがグリシンに置換される第二のＡＰＰ対立遺伝子の 変異体も現在確認され、ＡＰＰ遺伝子の７１７番目のコドンでの対立遺伝子の変 異体、好ましくはバリン以外のアミノ酸をエンコードするもの、さらに好ましく はイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンをエンコードするものが 病原性のおよび／または疾病に特徴的な対立遺伝子であることが示されるくらい 、ＡＤの表現型によく連接している（ｌｉｎｋｌ　（チャーティアー−ハーリン ｔｃｈａｒｔｉｅｒ４ａ＋ｌ１ｎｊ　ら、（１９９１年）、ネイチャー　（Ｎａ ｔｕｒｅ）、３５３　：　８４４）。

ＡＰＰのβ−アミロイド（Ａ４）領域のいずれの側でのタンパク質分解も、７１ ７番口のコドンでの特異的な突然変異によって促進または量的に変化し、β−ア ミロイドの沈着および凝集の割合が増す。このような７１７番口のコドンでの突 然変異は、主要なタンパク質分解経路（構成性部位（ｃｏｎＮｉｔｕｊｉｖｅ　 ５ｉｔｅ）での切断）に対するより悪い基質若しくは（異常な切断部位での）競 合する、代わりの切断経路に対するより良好な基質を提供することによってβ− アミロイドの形成を増加する。

定義 多くの言葉および表現はこの明細書を通して使用され、さらに、明細書の理解を 容易にするために、以下の定義を用いる： ここで用いられるように、「エキソン」は成熟したＲＮＡ生成物中で発現する分 断遺伝子のセグメントを意味する。

ここで用いられるように、「イントロン」は成熟したＲＮＡ生成物中で発現しな い分断遺伝子のセグメントを意味する。イントロンは、核の一次転写産物の一部 であるが、スプライシングによってｍＲＮＡを生産し、さらに、細胞質へ運ばれ る。

ここで用いられるように、「アミロイドタンパク質前駆体に対してコードする遺 伝子配列」という句は、ヨシカイ（Ｙｏｓｈｉｋａｉｌら、（１９９０年）、ジ ーン（Ｇｅｎｅｌ、８７；２５７およびカング（ＫａｎｇＪら、上記引用文（ｆ ｏｅ、ｃＮ、）で詳細に記載されているようなりＮＡおよびｃＤＮＡを意味する ものとし、さらに、プロモーターＤＮＡ配列はサルバウム（Ｓｌｌｂａｕｍｌ　 ら、（１９８８年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）　、７　（９）４２８０７ で詳細の記載されているようなものを意味するものとする。

ここで用いられるように、「標識」または「標識された」という言葉は、検出可 能なマーカーの導入（例えば、放射性同位元素で標識した（ｒａｄｉｏｌａｂｅ ｌｅｄ）ヌクレオチドの導入による、または末端を放射性同位元素で標識した（ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ）リン酸塩で末端標識することによる）を意味する。

ＤＮＡ若しくはＲＮＡは、具体的には、放射性同位元素で標識した（ｒａｄｉｏ ｌａｂｅｌｅｄ）ヌクレオチド（Ｈ３、Ｃ１４、Ｓ３５、Ｐ３２）、または標識 されたアビジン（例えば、蛍光マーカー若しくは酵素活性を有するアビジン）に よって検出できるビオチン化（ｂｉｏｔｉｎ７１ａｔｅｄ）ヌクレオチド、また は標識された特異的な抗体によって検出できるジゴキシゲニン化（ｄｔｇｏｘ７ ｇｅｎｉｎ７１ａｊｃｄ）　ヌクレオチドを導入することによって標識される。

ここで用いられるように、「イソ型」、ｒＡＰＰＪ、およびｒＡＰＰのイソ型」 は、ＡＰＰ遺伝子の少なくとも１つのエキソンによってエンコードされるポリペ プチドを意味する（キタグチ（にＨａｇｕｃｈｉ）　ら、（１９８８年）、夫イ 回書（ｉ　ｂ　ｉ　ｄ）、ページ５２５；アールイー　タング（Ｒ，Ｅ、　Ｔ！ ｕｙａｇｅ）およびオクテイブ（ＯＨａｖｅ）、（１９８９年）、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２４５　：　６５１　；ゴールド（Ｇｏｌｄｅ）　ら、（ １９９０年）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）、４：２５３＞、ＡＰＰのイソ型は 、アルツハイマー病の一形態に関連のあるまたはＡＤの病気の表現型に関連のな いＡＰＰの対立遺伝子（若しくはこれのエキソン）によってエンコードされる。

「β−アミロイド遺伝子」という言葉は、β〜ルアミロイドＡＰＰ遺伝子の生成 物の翻訳後切断によって生じたタンパク質生成物であるため、ここではＡＰＰ遺 伝子の同義語として用いられる。

ここで用いられるように、「断片」は、ポリペプチドが以下のアミノ酸のコア配 列（アミノ−からカルボキシル−末端の方向で並べられている）を含む、少なく とも約９個のアミノ酸、具体的には５０から７５、またはそれ以上のアミノ酸の ポリペプチドを意味するニ ーｌ１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ｖａｌ−１１ｅ−Ｘ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　［ 配列番号：６］ただし、Ｘはバリン以外の２０個の既知のアミノ酸のいずれかで あり、さらに特にＸはイソロイシン、グリシン、若しくはフェニルアラニンであ る。断片は、末端を切り取ったＡＰＰのイソ型、修飾されたＡＰＰのイソ型（ア ミノ酸の置換、欠損、またはコア配列の外側での添加による等）、または他の変 異ポリペプチド配列であるが、ＡＤに疾病しているまたは疾病していないにかか わらず、ヒト個人中に存在する自然に生じたＡＰＰのイソ型またはβ−アミロイ ドのポリペプチドではない。必要であれば、この断片は、１から２０から、具体 的には５０から１００、ただし２５０から５００またはそれ以上までの数である 、いずれかの末端で添加アミノ酸（ａｄｄＨｉｏｎａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ ）に融合される。

ここで用いられるように、ｒＡＰＰ７５１Ｊおよび［ＡＰＰ７７０Ｊは、ヒトの ＡＰＰ遺伝子によってエンコードされたそれぞれ７５１および７７０個のアミノ 酸残基長のポリペプチドを意味する（プロンテ（Ｐｒｏｎｔｅ）ら、上記引用９ 　（Ｉｏｃ、ｃａ＋、　）　；キタグチ（にＨｘｇｕｃｈｉ）　ら、上記引用文 （１ｏｃ、　ｃｉｔ、）　；タング（Ｔａｎｘｉ）　ら、上記引用文（ｌｏｃ、 　ｃＨ，）　）ここで用いられるように、「７１７番目のコドン」は、ＡＰＰ７ ７０の７１７番目のアミノ酸の位置、またはＡＰＰ７７０の７１７番目の位置に 相当するＡＰＰのイソ型若しくは断片中のアミノ酸の位置をエンコードするコド ン（つまり、トリヌクレオチド配列）を意味する。例えば、以下に限定されない が、１００個のＮ−末端のアミノ酸を除去することによってＡＰＰ７７０の末端 を切り取ることによって生じた６７０残基長の断片は、７１７番目のコドンに相 当する６１７番目のアミノ酸の位置を有する。事実、ここで用いられるように、 ７１７番目のコドンは、ＡＰＰ７５１　［配列番号：２］の６８９番目のアミノ 酸残基およびＡＰＰ６９５　［配列番号：１］の６４２番目のアミノ酸残基をエ ンコードするコドンを意味する。

ここで用いられるように、「ヒトのＡＰＰのイソ型または断片」は、ヒト個人に おいて自然に生じたヒトのＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、若しくはＡＰＰ６９５ タンパク質における配列と一致する少なくとも９個の保存アミノ酸（Ｃｏｎｓｅ ｒｖａｔｉｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）の配列を含むＡＰＰのイソ型または断 片であり、かつ一致した配列がヒト以外の種において自然に生じたＡＰＰタンパ ク質中雪中存在しないものであることを意味する。

核酸は、他の核酸配列と結合する（ｐｌａｃｅｄ　１ｎｔｏ　！　ｆｕｎｃｊｉ ｏｎａｌ　ｒｅｌａｔｔｏｎｓｈｉｐ）際には「操作して連結される（ｏｐｅｒ ａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）　Ｊ。例えば、プロモーターまたはエンハンサ−は、 配列の転写に影響を及ぼす際にはコーディング配列に操作して連結される（ｏｐ ｅｒａｂ１７１ｉｎｋｃｄ）。転写調節配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｒ ｅｇｕｌａｔｏｒ７５ｅｑｕｅｎｃｅ）に関しては、［操作して連結される（ｏ ｐｅｒａｂ１７１ｉｎｋｓｄ）　Ｊとは、連結されるＤＮＡ配列が隣接している 、さらに必要であれば２つのタンパク質のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｔ ｅｇｉｏｎ）を結合する際には、隣接しかつ読み枠内にあることを意味する。

「に相当する」という言葉は、配列が基準配列のすべて若しくは一部と相同性の ある（すなわち、厳密に展開して関連しないが、一致する）という意味で、ここ では使用する。一方、「に相補する」という言葉は、相補的配列が基準配列のす べて若しくは一部と相同性のあるという意味で、ここでは使用する。例えば、ヌ クレオチド配列“ＴＡＴＡＣ”は、基準配列“ＴＡＴＡＣ”に相当し、基準配列 “ＧＴＡＴＡ”に相補する。

「転写促進（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｊｉｏｎａｌ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）　Ｊ という言葉は、機能的なプロモーターを有する連結された配列の転写速度が増加 するような機能的な性質という意味でここでは使用する。

「物質（ａｇｅｎｉ）　Ｊという言葉は、化学的な化合物、化学的な化合物の混 合物、生物学的な高分子、または細菌、植物、菌類、若しくは動物（特に哺乳動 物）細胞若しくは組織等の生物材料から作製された抽出物という意味でここでは 使用する。物質（ａｇｅｎｊ）は、以下に記載されているスクリーニングアッセ イに含まれる強力な生物学的な活性によって評価される。

ここで用いられるように、「突然変異体」という言葉は、ＡＤを発達させる遺伝 的な素因に対して特徴的であるミスセンス突然変異を有するＡＰＰ対立遺伝子を 意味する；詳しくは、７１７番目のコドンがバリンでない１９個のアミノ酸の一 つ（すなわち、グリシン、メチオニン、アラニン、セリン、イソロイシン、ロイ シン、トレオニン、プロリン、ヒスチジン、システィン、チロシン、フェニルア ラニン、グルタミン酸、トリプトファン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパ ラギン、リシン、およびグルタミン）、好ましくはイソロイシン、グリシン、フ ェニルアラニンをエンコードする等の、ＡＰＰ遺伝子の７１７番目のコドン（Ａ ＰＰ７７０におけるアミノ酸配列について）での突然変異。

このように、突然変異ＡＰＰ７７０のポリペプチドは、バリンではない７１７番 目の位置のアミノ酸残基を有するＡＰＰ７７０のポリペプチドである。他の突然 変異ＡＰＰのイソ型は、７１７番目のコドンに相当する（つまり、７１７番目の コドンによってエンコードされる）アミノ酸残基の位置がバリンでないアミノ酸 からなる。同様にして、突然変異ＡＰＰの対立遺伝子または変異体ＡＰＰの７１ ７番目のコドンの対立遺伝子は、７１７番目のコドン（上記の、「７１７番目の コドン」の定義において記載したように翻訳を誘導したヒトのＡＰＰ７７０につ いて）にバリン以外のアミノ酸、好ましくはインロイシン、グリシン、若しくは フェニルアラニンをエンコードするＡＰＰの対立遺伝子である。したがって、７ １７番目のコドンにバリンをエンコードするＡＰＰの対立遺伝子は、「野生型」 のＡＰＰの対立遺伝子である。

ヌクレオチドの置換、欠損、および添加が本発明のポリヌクレオチドに含まれる ことは当業者に明らかである。しかしながら、このようなヌクレオチドの置換、 欠損、および添加は、実質的に、ポリヌクレオチドが特異的なハイブリッドの形 成を生じるのに十分厳しいハイブリッド形成条件下で図５および６に示されるポ リヌクレオチド配列の一つにハイブリッドを形成できなくなるようなものではあ ってはならない。

「特異的なハイブリッド形成」は、例えば、変異体ＡＰＰの対立遺伝子またはこ の制限断片に相当するバンドはサザンプロット上で同定できるが、野生型のＡＰ Ｐの対立遺伝子（すなわち、７１７番目のコドンにバリンをエンコードするもの ）は同定されない若しくはシグナル強度を基にすると変異体ＡＰＰの対立遺伝子 と識別できる等、プローブが特異的なターゲットに対して選択的にハイブリッド を形成する、プローブであるポリヌクレオチド（例えば、置換、欠損、および／ または添加を含む本発明のポリヌクレオチド）および特異的なターゲットである ポリヌクレオチド（例えば、配列を有するポリヌクレオチド）との間のハイブリ ッド形成としてここでは定義される。特異的なハイブリッド形成によって１塩基 のミスマツチ（ｍｉｇｍａｆｃｈ）の検出が可能なハイブリッド形成用のプロー ブは、既知の方法にしたがって設計され、これらは、マニアティス（Ｍａｎｉａ ｔｉ２版、（１９８９年）、コールド　スプリング　ハーバ−、ニューヨーク（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）およびバーガー（Ｂｅ＋ｇ ｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、メソッズ　イン　エンザイモロジー、 １５２巻、ガイド　ツー　モレキュラーｆｕｍｅ　１５２．　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｌ、（１９８７ 年）、アカデミツク　プレス、インク（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ 、）、サン　ジエゴ、シーニー（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ギブス（Ｇｉｂ ｂｓ）　ら、（１９８９年）、ヌクレイックアシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１７：２４３７；コウク（Ｋｏｗｋ）ら、（１９ ９０年）、ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、）、１８　：　９９９　；ミャダ（Ｍｉｙａｄａ）ら、（１９８７年） 、メソッズ　エンザイモル（ＭｅｔｈｏｄＳＥｎｚｙｍｏｌ、）、１５４　：　 ９４に記載されており、それぞれを参考としてここに記載した。オリゴヌクレオ チドのＴ　は、標準的な条件下（ＬＭ　ＮａＣ１）で［４℃Ｘ　（Ｇ＋Ｃ）＋２ ℃Ｘ　（Ａ＋Ｔ）Ｅの計算によってめられる。ＰＣＨの条件は標準的な条件とは 異なるが、このＴ。はオリゴヌクレオチドの予想される相対的な安定性の規準と して用いられる。対立遺伝子に特異的なプライマーは、具体的には、１３〜１５ ヌクレオチド長、場合によっては１６〜２１ヌクレオチド長、若しくはそれ以上 である；１４ヌクレオチド長のプライマー等の、短いプライマーを使用する際に は、４４から５０℃等の低いアニーリング温度を用い、必要であれば、配列の塩 基組成によってはこれより少し高い若しくは低くなる。

好ましい実施態様の説明 ７１７番目のコドンが突然変異したＡＰＰ対立遺伝子の検水発明の実施態様にお いては、方法は、これによって共通のバリン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　Ｖａｔ）が 例えば、他の疎水性の残基に変化する、７１７番目のアミノ酸での遺伝学的な変 化を同定することを含むものである。上記は、通常、被験者から取った試料につ いて行う。疎水性の残基としては、ＬｅｕＳＡｌａ、１１ｅおよびＧｌｙが挙げ られ、初めの３つは脂肪族の側鎖を有する。Ｐｈｅもまた、適当な疎水性の残基 を有する。上記したように、好ましい残基としては、１１ｅ％Ｇｌｙ、およびＰ ｈｅが挙げられる（マレル（Ｍｕｒｒｅ　Ｉ　Ｉｌ　ら、（１９９１年）、サイ エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　％　２５４：９７）。

上記したこれらの突然変異が同じコドンで起こるという事実は一致しているが、 このことは統計上の分野ではありえないように思われる。これらのデータを説明 できる可能性が２つある。第一には、７１７番目のコドンでのバリン残基の置換 によって、ＡＰＰの代謝における変化によるβ−アミロイドの蓄積が増加するこ とである。第二には、この位置周辺の配列の変異によって、ＡＰＰのｍＲＮＡの 翻訳量が増加し、これによってＡＤがダウン症候群によって引き起こされると考 えられている経路と類似した経路によってＡＤが生じる（タング（Ｔａｎｚｉ） およびハイマン（Ｈ７ｍａｎ）、（１９９１年）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ ）、３５０　：　５６４およびランプル（Ｒｕｍｂｌｅｌら、（１９８９年）、 エヌ　イングル　ジェー　メト（Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、）、３２０：１ ４４６）。ｉｎ　５ｉｔｕ　ハイブリッド形成法の研究によって、ＡＰＰ７１７ の突然変異体がＡＰＰの発現を変えないことが示された（ハリソン（Ｂａｒｒｉ ｓｏｎ）ら、（１９９１年）、二ニーロレプ（Ｎｅｕｒｏｒｅｐ、）　、２　： 　１５２）。

Ｖ７１７Ｉ（ＡＰＰ７１７　Ｖａｌ−＞ｌ１ｅ）、Ｖ７１７Ｇ　（ＡＰＰ７１７ 　Ｖａｌ−＞Ｇｌｙ）およびＶ７１７Ｆ　（ＡＰＰ７１７　Ｖａｌ−＞Ｐｈｅ） の突然変異体は、推定のステムループ構造を不安定化しくｄｅｓｔａｂｉｌｉｓ ｅ）　、２１３１および２１５６１５６番目対の間の可能な鉄応答性の要素（ｉ ｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を破壊する（タング（Ｔｔａ ｘｉ）およびハイマン（Ｈｙｍａｎ）　、上記引用文（ｆｏｅ、　ｃｉｔ、）　 ）。この構造をも破壊する他の可能性のある突然変異体が様々あり、そのうち多 くがタンパク質レベルでサイレント（Ｓｉｌｅｎｔ）である；しかしながら、こ れらの突然変異は、同様のアミノ酸への変化を含むことを特に意味し、サイレン トな（ｇｉｌｅｌ）変化または他のアミノ酸への変化はここで記載されたものよ り以前では報告されていない。１０の他の哺乳動物種からの配列データを調べる （ジョーンストーン（ｊｏｈｎｓ　ｊｏｎｅ）　ら、（１９９１年）、モル　プ レイン　レス（Ｍｏｆ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　、１０　：　２９９）こと によって、７１７番目のコドンでのバリン残基はこれら全てにおいて保存されて いるが、ヒトの配列から仮定された推定のステムループ構造（タング（Ｔａｎｘ ｉ）およびハイマン（Ｈｙｍａｎ）　、上記引用文（ｆｏｅ、ｃ白、））は畜生 及び羊では起こらないと考えられる；さらに、ブタ及びマウスでは鉄応答性の要 素（ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）に対する共通配列は存 在しない。最後に、このようなステムループ構造は、ｍＲＮＡの安定性を変化さ せることによって遺伝子の翻訳を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）と考えられる（ クラウスナ−（Ｉｌａｕｓｎｅｔ）およびハーフオード（Ｈａｒｆｏｒｄ）　、 （１９８９年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２４６：８７０）；しかし ながら、ハリソン（Ｈａｒｒｉｓ。

ｎ）やその同僚（ハリソン（Ｈａｒｒｉｇｏｎ）ら、上記引用文（ｆｏｅ。

ｃｉｔ、）　）は、ＡＰＰのｍＲＮＡがＶ７１７１の突然変異体を有する人の脳 においてあまり変化していないことを、ｉｎ　５ｉｔｕ　ハイブリッド形成法に よって示した。これらの理由によって、同定された特異的な突然変異によって起 こるＡＰＰの翻訳速度の変化は病原性への鍵ではないと考えられる。

上記した特異的な突然変異が様々な変化（Ｖａｌ−＞１１ｅ、Ｖａｌ−＞Ｇｌｙ 、およびＶａｌ−＞Ｐｈｅ）を含むという事実によって、側鎖の疎水性若しくは 側鎖の大きさが決定的な論点ではないことが指摘される。７１７番目のコドンで バリン以外のアミノ酸をエンコードするＡＰＰの対立遺伝子のすべての例はＦＡ Ｄとコセグレゲートする（ｃｏｓｅｇｒｅｇａ＋ｅ）　；これによって、野生型 のＡＰＰ７７０若しくはＡＰＰ７５１の７１７番目の位置であるバリンは非病原 性のＡＰＰのタンパク質分解のプロセッシング（ｐｒｏｎｅｏ１７ｔｉｃ　ｐｒ ｏｃｅｓｓｉｎｇ）の（つまり、構成性切断経路（ｃｏｎｓｔＨｌｉｖｅ　ｃｌ ｅａｖａｇｅ　ｐａｔｈｗａｙ）による）臨界アミノ酸残基であることが示唆さ れる。

ＡＰＰ分子に対する主要な代謝経路としては、β−アミロイド断片内の切断が挙 げられる（ニッシュ（Ｅ　ｓ　ｃ　ｈ）ら、上記引用文（１０（、ｃｉｔ、）　 ）。β−アミロイドを得るためには、ＡＰＰをこの配列の外で切断する第二の経 路が存在しなければならない。このような切断は、膜内に埋め込まれたβ−アミ ロイド断片を含むＡＰＰ分子のスタブ（ｓｔｕｂ）を切り離すと考えられる。恐 らく、第二の経路によって生じたβ−アミロイドを含む断片はペプチダーゼの作 用によって分解される；報告された突然変異体は、これらの含むペプチドが上記 ペプチダーゼの作用に対してより耐性があるため、病原性がある。したがって、 分解特性の変化（通常、減少）を生じるＡＰＰ遺伝子の遺伝学的な変化は、本発 明の適用において特に重要である。アルツハイマー病に応答する遺伝学的な突然 変異体を検出し、同定するために使用される組換えＤＮＡ技術が利用できる方法 論は様々なものがある。

これらとしては、ダイレクトプロービング（ｄｉｒｅｃｔ　ｐｒｏｂｉｎｇ）１ ポリメラ一ゼ連鎖反応（ｐｏ１７ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ） （Ｐ　ＣＲ）方法論、制限断片長炎型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｒｒａｇｍｅ ｎｒ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏ１７ｍｏｒｐｈｉｓｍ）　（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）分析およ び１重鎖立体配座解析（ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｊｉｏ ｎｘｌ　ｉｎａ１７ｓｉｓ）（ＳＳＣＡ）が挙げられる。

ダイレクトプロービング（ｄｉｔｅｃｊ　ｐｒｏｂｉｎｇ）を用いた点突然変異 （ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）の検出は、合成でまたはニックトランスレー ションによって調製されるオリゴヌクレオチドのプローブを使用する。このＤＮ Ａプローブは、例えば、放射性同位元素標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン− アビジン標識および例えばサザンブロッティングによるハイブリッド形成方法で 肉眼観察できるもの等を用いて適当に標識される。標識されたプローブは、ニト ロセルロース若しくはナイロン６６の基質に結合したＤＮＡのサンプルと反応す る。標識されたＤＮＡプローブに相補的であるＤＮＡ配列を有する領域は、再ア ニーリング反応の結果、それ自身標識される。さらに、このように標識されたフ ィルターの領域を、例えば、ラジオオートグラフィーによって肉眼観察する。

また、リガーゼ連鎖反応（Ｉｉｇｘｇｅｃｈａｉｎ　ｔｅａｃｔ：ｏｎ）　（Ｌ ＣＲ）等の、ブロービング技術（ｐｒｏｂｉＢ　Ｈｃｈｎｉｑｕｅ）　は、ミス マツチプローブ、すなわち突然変異の点（ｐａｉｎｔ）以外はターゲラ）・と完 全に相補性を有するプローブを用いる。

さらに、ターゲット配列を、以下の２つのオリゴヌクレオチドを識別できる条件 下で、完全に相補性を有するオリゴヌクレオチドおよびミスマツチ（ｍｉｓｍａ ｔｃｈ）を含むオリゴヌクレオチドの両方とハイブリッド形成させる。反応条件 を操作することによって、完全に相補性を有する場合のみハイブリッド形成を得 ることが可能である。ミスマツチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が存在する際には、非常 にハイブリッド形成が減少する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ ）（ＰＣＲ）は、かなり効率よく特異的なりＮＡ配列を増幅させる技術である。

熱に安定な酵素であるＴａｑｌポリメラーゼを用いて行われた変性、プライマー のアニーリングおよび拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を繰り返し行うことによって 、目的とするＤＮＡ配列の濃度が指数的に増加する。

ＡＤのアミロイドタンパク質の前駆体をエンコードするヌクレオチド配列が分か ること（カング（Ｋａｎｇ）ら、上記引用文（ｌｏｃ、ｃｉｊ、）およびヨシカ イ（Ｙａｓｈｉｋａｉ）、上記）により、有用なりＮＡに隣接する配列に相補的 である合成のオリゴヌクレオチドが調製できる。それぞれのオリゴヌクレオチド は２本鎖の一つに相補的である。さらに、ＤＮＡを高温（例えば、９５℃）で変 性させ、次に、過剰な高いモル濃度のオリゴヌクレオチドの存在下で再アニーリ ングする。それぞれが互いに向いている３′方向の、オリゴヌクレオチドを、タ ーゲット配列の反対の鎖とハイブリッド形成させ、さらに、４つのデオキシリボ ヌクレオチド三リン。

酸の存在下で核酸の鋳型に沿って酵素拡張（ｅｎｘｙｍａｔｉｃ　ｅｘｔｅｎｓ ｓｉｏｎ）を開始する。次に、末端生成物を他のサイクルのために再変性する。

この３段階のサイクル（ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ　ａｙｃｌｅ）を数回繰り返した 後、百万倍以上によるＤＮＡセグメントの増幅が得られる。さらに、このように して得られたＤＮＡを、遺伝的な変化の位置を決定するために直接配列決定を行 う。または、変化したＤＮＡにのみ結合するオリゴヌクレオチドを調製すること も可能であり、これによって突然変異が存在する際にＰＣＨによってのみＤＮＡ が増殖する。ＰＣＲ後、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリッ ド形成（ジヘラ（Ｄｉｈｅｌｌａ）　ら、（１９８８年）、ランセット（Ｌａｎ ｃｅ＋）、１：４９７）を用いて、ＡＤの点突然変異を検出する。または、特異 的な対立遺伝子の増幅と呼ばれるＰＣＲ（ＰＡＳＡ）を用いることもできる；上 記は、１塩基対が異なる対立遺伝子間を迅速にかつ正確に識別するために分画増 幅（ｄｉＨｅｒｅｎＨａｌ　ａｍｐｌ百ｉｃａ＋１ｏｎ）を用いる。

さらに他の方法においては、ＰＣＨの後に、このようにして得られた生成物をさ らに分析する制限エンドヌクレアーゼによる消化を行う。エキラン１７の配列決 定の結果で見られるように、２１４９番目の塩基対でのＣからＴこのへの置換に よって、ＢｃｌＩの制限部位が生じる。この制限エンドヌクレアーゼの２諏部位 が生じることによって、ＲＦＬＰ分析を用いたＡＤの突然変異の検出または７１ ７番目のコドンを含むＰＣＲによる生成物における多形性のＢｃｌＩ部位の存在 若しくは欠損の検出が容易になる。

ＲＦＬＰ分析のために、例えば、ＡＤに罹っていると思われる被験者のおよび正 常な被験者の血液からＤＮＡを得、制限エンドヌクレアーゼのＢａ１ｌで消化し 、さらに、アガローズゲル電気泳動を用いて大きさによって分離する。

次に、標識されたプローブを用いてハイブリッド形成することによって、エンド ヌクレアーゼで消化された生成物を検圧するために、サザンプロット（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）技術を用いることができる。サザンプロット（Ｓｏｌｈｅ ｒｎ　ｂｌｏｔ）により得られたパターンをさらに比較できる。このような方法 を用いて、Ｂｃ１１部位等の、７１７番目のコドンでの制限部位を作製するまた は除去するアルツハイマー病の突然変異にまたがるＤＮＡを、検出されたバンド の数をはかり、この数をバリンをエンコードする７１７番目のコドンの対立遺伝 子を有する規準となる対立遺伝子のものと比較することによって、検出する。

相応じて、２１５０番目の塩基対でのＴからＧのへの置換によって、５ｆａＮＩ の制限部位（ＧＣＡＴＣ）が生じ、これは、必要な変更を加えて（ｍｕｔａｔｉ ｓ　ｍｕＨｎｄｉｓ）上記の方法と同様にして利用される。７１７番目のコドン がバリン以外のアミノ酸をエンコードする、７１７番目のコドン内でのヌクレオ チドの置換によってさらに制限部位が同様にして生じることは、遺伝コードおよ び制限エンドヌクレアーゼによって認識されたヌクレオチド配列のリストを参考 ｔｏｃｏｌｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｇｕｉｄｅ）、（１９９１ 年）、プロメガ　コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａ目ｏｎ） 、マディラン、ライスコンシン（Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）　）。

１重鎖立体配座解析（ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｔｍａｊｉｏｎ ａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ）　（Ｓ　Ｓ　ＣＡ）　（オリタ（Ｏｒｉｊａ）　ら、 （１９８９年）、ジェノミックス（Ｇｅｎｏｍｔｃｓ）、５　：　８７４および オリタ（ＯｒＨａ）　ら、（１９９０年）、ジェノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ）、６：２７１）は、少なくともある例においては好ましい配列の変化を迅速に 検出する方法を提供している。

特異的な対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）は、１塩基の突然変異あるいは多 形性を素早く検出する方法である６４；ソ７−　（Ｓ　ｏｍｍｅ　ｒ）ら、（１ ９８９年）、マヨ　クリソ２７５７　；およびダットン（Ｄｕｊｔｏｎ）ら、（ １９９１年）、バイオテクニックス（Ｂｉｏｊｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、よ↓ニ ア００））。

ＰＡＳＡ　（対立遺伝子の特異的増幅として知られている）は、対立遺伝子に特 異的である等の２本のオリゴヌクレオチドのプライマーによる増幅を含む。対立 遺伝子に特異的なプライマーの３′末端の若しくは付近の塩基とのミスマツチ（ ｍｉｓｍａｌｃｈ）により他の対立遺伝子はあまり増幅しないが、目的とする対 立遺伝子が効果的に増幅する。このようにして、ＰＡＳＡまたはＰＡＭＳＡの関 連した方法を用いて、１つ若しくはそれ以上の７１７番目のコドンが変異したＡ ＰＰの対立遺伝子を特異的に増幅できる、このような増幅が個体より得られた遺 伝材料（若しくはＲＮＡ）上でなされる際には、個体における１つ若しくはそれ 以上の７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの対立遺伝子の存在の検出方法とし て機能できる。

同様にして、リガーゼ連鎖反応（Ｉｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ ＞　（ＬＣＲ）として知られている方法は、錐状赤血球貧血を引き起こすヘモグ ロビンの対立遺伝子における１塩基置換を良好に検出するために用いられる（バ ラニー（Ｂａｒｇｅ）に用いる、または多数の異なる突然変異体を同時にスクリ ーニングするために複合したものを用い（ｍｕＨｉｐｌｅｘ）てもよい。したが って、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの対立遺伝子のスクリーニングの一 方法としては、バリンはエンコードしないがアミノ酸をエンコードする７１７番 口のコドンを有するＡＰＰの対立遺伝子を検出する少なくとも２つの、好ましく はすべてのＬＣＲのプローブを複合して用いるものがある。普遍遺伝コードによ って、すべてのバリン以外をエンコードしたアミノ酸の同義配列（ｄ　ｅ　ｇ　 ｅ　ｎｅｒａｔｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）が得られるため、特に７１７番目のコド ンが変異した対立遺伝子を検出するためのＬＣＲのプローブの設計は簡単であり 、ＬＣＲのプローブ等の複合して用いられたプール（ｐｏｏｌ）を特徴とする特 殊な使用に対して従業者の裁量で選択できる。

上記の技術またはこれらの変形のいずれかを用いて診断を行うにあたって、様々 な個体を調べることは好ましい。

上記としては、疾病していない親、疾病している親、疾病している兄第、疾病し ていない兄第が挙げられ、さらにはより遠い血族の人々をも恐らく挙げられる。

モデル動物および細胞株 家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の原因としてのβ−アミロイド遺伝子の７１ ７番目のコドンにおける特異的なと突然変異を同定することによって、遺伝子操 作を用いて、例えば、薬剤をスクリーニングするおよび薬剤の効果を評価するた めのモデルシステムとして使用する突然変異ＦＡＤ遺伝子（若しくはこの一部） を含む形質転換モデルシステムおよび／または全細胞システムを開発することが できる。さらに、このようなモデルシステムによって、ＡＰＰおよびβ−アミロ イドの代謝の基礎的な生化学を定義する道具が得られ、これによって合理的な薬 剤の設計の基礎が得られる。

細胞システムの一タイプは自然由来のものである。このタイプでは、例えば、エ プスタイン−パールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）を用い てリンパ芽球様細胞株（１７ｐｈｏｂｌａｓ＋ｏｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅＪ中 に永久に形質転換できる必要な細胞を提供するために、疾病した被験者からの血 液サンプルを得なければならない。

確立されたら、このような細胞株を浮遊培養で連続して生育させ、ＡＰＰの発現 およびプロセッシングを研究するための様々なｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験に用いる 。

ＦＡＤの突然変異体は優性であるため、細胞株の構築方法としては、（安定にま たは一時的のいずれかで）確立された選択細胞株中に突然変異遺伝子、若しくは ７１７番目のコドンを含むこれらの一部を遺伝子操作することも挙げられる。シ ソディア（Ｓｉｓｏｄｉａ）　（（１９９０年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）　、２４８　：　４９２）は、トランスフェクションよる哺乳動物細胞への正 常なＡＰＰ遺伝子の挿入を記載している。オルタースドルフ（ＯＮｅｒｓｄｏｒ ｆ）ら（（１９９０年）、ジエー　パイオル　ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　）、２６５：４４９２）は、不死化された真核生物の細胞株へのＡＰＰの 挿入について記載している。

バキュロウィルスの発現システムは、真抗生物の細胞における異種遺伝子を高い レベルで発現させるのに有用である。クノブス（Ｘｎｏｐｓ）　ら、（１９９１ 年）、ジエー　パイオル　ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、　）、２６６　 （１１）ニア２８５は、このようなシステムを用いたＡＰＰの発現について記載 している。

本発明の方法をさらに使用すると、突然変異遺伝子を有する形質転換動物の作製 に使用できる突然変異遺伝子（すなわち、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰ の遺伝子）を除去できる。例えば、ヒトの７１７番目のコドンが変異したＡＰＰ の対立遺伝子全体を、クローニングベクター（例えば、λシャロン３５、コスミ ド、若しくは酵母の人工染色体）中に、一部または全体として、クローニングし 、単離する。ヒトの７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの遺伝子を、一部また は全体、マウス等の、ヒト以外の宿主動物に転移する。転移の結果、このように して得られたヒト以外の形質転換動物は、好ましくは１つまたはそれ以上の７１ ７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドを発現する。最も好ましくは、 本発明のヒト以外の形質転換動物は、ニューロンに特異的な様式で１つまたはそ れ以上の７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドを発現する（ライ ラック（Ｗｉｒａｋ）　ら、（１９９１年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）　 、１０　：　２８９）。最初の主要なＡＰＰの転写開始部位の付近および上流に ある４、５キロベースの配列を含むヒトの全ＡＰＰ遺伝子（７１７番目のコドン が突然変異したものをエンコードする）を実質的に転移することによって上記が 達成される。

または、７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドをエンコードする ミニ遺伝子を設計してもよい。このようなミニ遺伝子は、ポリアデニル化シグナ ル（ｐｏｋｙａｄｅＢｌａｊｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列の下流および上流のプ ロモーター（および好ましくはエンハンサ−）に連結した、好ましくは全長の、 ７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチド、ＡＰＰ遺伝子のエキラン の組み合わせ、若しくはこれらの組み合わせをエンコードするｃＤＮＡ配列を含 む。

このようなミニ遺伝子の構築物は、適当な形質転換宿主（例えば、マウス若しく はラット）中に導入されると、エンコードされた７１７番目のコドンが変異した ＡＰＰのポリペプチド、最も好ましくはＡＰＰ７７０の７１７番目のコドンまた はＡＰＰのイソ型若しくは断片の相当する位置にイソロイシン、グリシン、若し くはフェニルアラニンのいずれかを含む７１７番目のコドンが変異したＡＰＰの ポリペプチドを発現する。

形質転換動物を作製する一方法としては、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの胚の幹（ｅｍｂｒ ｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ）　（ＥＳ）細胞株において相同的組換によって目的とす る遺伝子に突然変異を行った後、宿主の未分化胚芽細胞（ｂｌａｓｊｏｃｙｇｔ Ｊ中に修飾されたＥＳ細胞株をマイクロインジェクションし、さらに養い母中で 培養するものがある（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）およびマーティン（Ｍａｒ ｔｉｎ）、（１９８９年）、セル（Ｃｅｌｌ）、５６：１４５を参照）。または 、１細胞の胚への突然変異遺伝子若しくはこれの一部のマイクロインジェクショ ン後に養い母において培養する技術を使用してもよい。形質転換動物、特に野生 型のＡＰＰのイソ型若しくは断片を発現する形質転換動物の様々な使用が、ライ ラック（Ｗｉｒａｋ）　ら、（１９９１年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）　 、１０　（２）：　２８９；シリング（Ｓｃｈｉ　Ｉ　ｌ　ｉｎｇ）　ら、（１ ９９１年）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、９８　（２）：　２２５　；クオン（Ｑｕｏ ｎ）ら、　（１９９１年）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３５２　：　２３ ９　；ライラック（Ｗｉｒａｋｌ　ら、（１９９１年）、サイエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ）　、２されている。さらなる形質転換動物の作製方法は既知である。

または、部位特異的突然変異誘発および／または遺伝子変換を用いて、突然変異 された対立遺伝子がヒトのＡＰＰ遺伝子の（ＡＰＰ７７０の）７１７番目のコド ン（この位置はヒトのＡＰＰ遺伝子若しくはＡＰＰ７７０タンパク質に対するマ ウスのＡＰＰ遺伝子若しくはＡＰＰタンパク質の相同性のマツチングＩｂｏｍｏ Ｉｏｇｙ　ｍａｔｃｈｉＢ＞によって容易に同定される）に相当するマウスのＡ ＰＰ遺伝子におけるコドンの位置にバリンをエンコードしない等の、内因性の若 しくはトランスフェクションされた、マウス（または他のヒト以外の動物）のＡ ＰＰ遺伝子の対立遺伝子を突然変異できる。好ましくは、このような突然変異さ れたマウスの対立遺伝子は、相当するコドンの位置でイソロイシン若しくはグリ シン若しくはフェニルアラニンをエンコードし家族性ＡＤの明白な徴候をまだ示 さない個人においてβ−アミロイドタンパク質に対してう−ドする遺伝子配列中 の遺伝子の突然変異を検出することによって、本発明の方法を用いて、病気の発 達を防止する、遺伝子の移植の形態を有する、遺伝子治療を用いることが可能で ある。

変異ＡＰＰタンパク質の製造のモジュレーシヨンに対するさらなる実施態様とし ては、変異ＡＰＰ配列、または実施態様によっては野生型のＡＰＰ配列のすべて 若しくは一部に相補的である特異的なアンチセンスなポリヌクレオチドを用いる 方法が挙げられる。このように相補的なアンチセンスなポリヌクレオチドとして は、関連したターゲット配列、すなわち７１７番目のコドンが変異したＡＰＰ配 列に対する特異的なハイブリッド形成がポリヌクレオチドの性質として維持され ればよく、具体的には、ヌクレオチドの置換、添加、欠損、または転位が挙げら れる。したがって、アンチセンスなポリヌクレオチドは、野生型のＡＰＰ（つま り、７１７番目のコドンがバリンをエンコードする）と比較した場合、変異ＡＰ Ｐ　（つまり、７１７番目のコドンがバリンをエンコードしない）配列に選択的 に結合しなければならない。このアンチセンスなポリヌクレオチドは変異対立遺 伝子（若しくは必要であれば野生型の対立遺伝子）のヌクレオチド配列を意味し 、同義性配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｊｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を意味するものでは ないことは明らかである。

相補的なアンチセンスなポリヌクレオチドとしては、変異ＡＰＰのＭＲＮＡ種に 特異的にハイブリッド形成でき、ｍＲＮＡ種の転写および／またはエンコードさ れたポリペプチドの翻訳を防止できる可溶性のアンチセンスなＲＮＡまたはＤＮ Ａのオリゴヌクレオチドが挙げられる（チング（Ｃｈｉｎｇ）　ら、（１９８９ 年）、ブロック　ナシミル　アカ４；ロロイ（Ｌｏｒｅａｕ）ら、（１９９０年 ）、エフイービーニス　レターズ（ＦＥＢＳ　ＬｅＨｅｒｇ）、２７４　：　５ ３〜５６　；ホルセンベルグ（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｗ０９１／１１５３ ５；米国特許番号ニア、５３０．１６５号（「ニュー　ヒユーマンクリプト　ジ ーン（Ｎｅｗ　ｈｕｍａｎ　ＣＲＩＰＴＯｇｅｎｅ）　Ｊ−ダーウエント　パブ リケーションズ　エルティディ、ロクデイルハウス、１２８　テオバルズ　ロー ド、ロンドン（Ｄｅｒｗｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｌｔｄ、、　Ｒｏ ｃｈｄａｌｓ　Ｈｏｕｓｅ、１２８　ＴｈｅｏｂａｌｄｓＲｏａｄ、　Ｌｏｎｄ ｏｎ）　、英国）より出版、ＷＯ９１１０９８６５。

ＷＯ９１１０４７５３、ＷＯ９０／１３６４１　、およびＥＰ３８６５６３号、 それぞれここでは参考として挙げられている）。したがって、このアンチセンス なポリヌクレオチドは変異ＡＰＰのポリヌクレオチドの製造を阻害する。

アンチセンスなポリヌクレオチドが転写を選択的に阻害するおよび／または変異 （若しくは野生型の）ポリペプチドに相当するｍＲＮＡの翻訳がＴリンパ球の活 性化を阻害することができる。

アンチセンスなポリヌクレオチドは、好ましくは発現カセットが細胞タイプの特 異的な発現を促進する配列を含むものである、形質転換された神経性の、神経膠 の、若しくは星状細胞等の、トランスフェクションされた細胞または形質転換細 胞若しくは動物において異種の発現カセットより生産される（ライラック（Ｗｉ ｒａｋ）　ら、上記引用文（ｔｏｅ。

ｃｉＬ）　）。または、アンチセンスなポリヌクレオチドは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ の培養液若しくは循環系若しくは１ｎｖｉｖｏの間質液のいずれかにおける、外 部環境に投与される可溶性のオリゴヌクレオチドからなる。外部環境に存在する 可溶性のアンチセンスなポリヌクレオチドは、細胞質に接近して特異的なｍＲＮ Ａ種の翻訳を阻害することが知られている。実施態様によっては、アンチセンス なポリヌクレオチドはメチルホスホネー）　（ｍｅｔｈ７１ｐｈｏｇｐｈｏｎａ ｔｅ）イエ−メルトン（Ｄ、　ＡｏＭｅＩｔｏｎ）　、出版、コールド　スプリ ング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａ＋ｏｒｙ＋　、コールド　スプリング　ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨークを参照。

変異ＡＰＰの抗原およびモノクローナル抗体本発明の他の概念においては、ＡＰ Ｐに対してコードする遺伝子配列中の遺伝子の変化を検出することによって、同 じ源の変化したβ−アミロイドタンパク質のサンプルが得られる。このタンパク 質は、アルツハイマー病に罹っていると診断された被験者の脳組織由来であり、 または、より好ましくは、このタンパク質は組換ＤＮＡ方法によって製造される または固体の支持体における直接化学合成（ｄ　ｉ　ｔｅｃｔ　ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって合成される。このようなポリペプチドは、７ １７番目のコドンを含むＡＰＰの変異対立遺伝子のアミノ酸配列を含むものであ る。上記配列の例を以下に示す： （ａ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ −Ｌｅｕ−［配列番号ニア１（ｂ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ ｅ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号：８１（ｃ）　−１１ｅ−Ａ ｌａ−Ｔｈｒ−ｖａｌ−１１ｅ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｔｈｔ−Ｌｅｕ−［配列番号 、９Ｊ（ｄ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ４ａｌ−１１ｅ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｔ ｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号；１０］（ｅ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ’Ｖａｌ −１１ｅ−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号：１１］［ｆ）　−１ １ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−１ａｌ−１１ｅ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［ 配ＭＨ：１２］（ｇ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ４ａｌ−１１ｅ−Ｔｈｒ−１ １ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号：１３１（ｈｌ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ −Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号；１４］（ｉ ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｈｉｇ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌ ｅｕ−［配列番号；１５１（ｉ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ −Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号二１６］（ｋ）　−１１ｅ−Ａ ｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号 ；１７１（１）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｈｅ−１１ｅ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号；１８］（ｍ）　１ｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−４ａ ｌ−１１ｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号；１９］（ｎ）　− １１ｅ−Ａｌａ−ＴｈｒＶａｌ−１１ｅ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［ 配ＭＨ：２０］（ｏ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｒｇ− １１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号；２１］（ｐ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈ ｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｇｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号；２２］（ ｑ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−［配列番号；２３］（ｒ）　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ’Ｖａｌ−１１ ｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−［配列番号：２４１（ｓ）　−１１ｅ− Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｔｈｔ−Ｌｅｕ−［配列番 号；２５１さらに、このようなポリペプチド材料を用いて、例えば、コーラ−（ Ｉｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｊｅｉｎ）　（（１９７５年）、 ネイチ−？　−（Ｎａｊｕｒｅ）、２５６：４９５）の方法を用いて、抗血清お よびモノクローナル抗体を調製できる。

さらに、このようなモノクローナル抗体は診断テストの基礎を形成するものであ る。

このような変異ＡＰＰのポリペプチドを用いて、特異的な抗体の製造のために動 物を免疫処理する。これらの抗体は、多クローン性の抗血清からなるまたはハイ ブリドーマ細胞によって製造されるモノクローナル抗体からなる。抗ｎｕａｌ） 　、（１９８８年）、イー　バーロウ（Ｅ、Ｈａｒｔｏｗ）およびディ　レイン （Ｄ、Ｌａｎｅ）　、コールド　スプリング　ノへ−バー　ラボラトリ−（Ｃｏ ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド　スプ リング　ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ）、ニューヨーク を参照（これはここでは参考として挙げられている）。

例えば、以下に制限されないが、組換によって製造される７１７番目のコドンが 変異したＡＰＰのポリペプチドの断片を、免疫反応を生じるようにアジュバント と共にマウスに注入することができる。少なくとも１×１０７Ｍ−１の結合親和 性（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔ７）を有する組換断片を結合するマウスの 免疫グロブリンを、抗血清として免疫処理されたマウスから集め、さらに、アフ ィニティクロマトグラフィーまたは他の方法によって精製する。さらに、膵臓細 胞をマウスより集め、ミエローマ細胞に融合させ、抗体を分泌するハイブリドー マ細胞のバンクを作製する。ハイブリドーマのバンクから、少なくともｌＸ１０ ６Ｍ−１の親和力を有する組換えで生産された断片を結合する免疫グロブリンを 分泌するクローンをスクリーニングできる。さらに詳しくは、７１７番目のコド ンが変異したＡＰＰのポリペプチドには結合するが野生型の（すなわち、７１７ 番目のコドンがバリンをエンコードする）ＡＰＰのポリペプチドとの交差反応性 が限られている免疫グロブリンが、野生型のＡＰＰによる予備吸着（ｐｒｅａｂ ｇｏｒｐｔｉｏｎ）または野生型と比較した場合変異体を選択的に結合する特異 的なイディオタイプのハイブリドーマ細胞株のスクリーニングのいずれかによっ て、選択される。

最終的に目的とする変異ＡＰＰポリペプチドを発現できる本発明の核酸配列を、 様々な異なるポリヌクレオチド（ゲノム若しくはｃＤＮＡＳＲＮＡ、合成オリゴ ヌクレオチド等）から、さらには様々な異なる技術によって、形成できる。

前記したように、ＤＮＡ配列は、配列を発現調節配列に操作して連結した（ｏｐ ｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋ）　（つまり、発現調節配列の機能を確保するために位 置づけた）後、宿主において発現する。これらの発現ベクターは、具体的にはエ ピワームとしであるいは宿主の染色体ＤＮＡの内在性の一部として宿主生物にお いて複製可能である。一般的には、発現ベクターは、目的とするＤＮＡ配列を形 質転換した細胞を検出および／または選択できるような、例えばテトラサイクリ ン耐性またはヒグロマイシン耐性等の、選択マーカーを有する（例えば、米国特 許番号：４，７０４，３６２号を参照、これはここでは参考として挙げられてい る）。

７１７番目のコドンが変異したＡＰＰのポリペプチドをエンコードするポリヌク レオチドは、エンコードされたポリペプチド生成物が生産される等の、コーディ ング配列（Ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の転写（発現配列）および翻訳を 容易にする配列を含む。このようなポリペプチドの構築は既知であり、マニアテ ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー　タローｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、２版、（１９８９年）、コールド　スプリング　ハ ーバ−、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ１’１ａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、 ）に記載されている。例えば、以下に制限されないが、このようなポリペプチド としては、プロモーター、転写終結部位（真核生物の発現宿主においてはポリア デニル化部位（ｐｏｋｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ））　、リポソーム 結合部位、および必要であれば、真核生物の発現宿主において使用するエンハン サ−１およびさらに必要であれば、ベクターの複製に必要な配列が挙げられる。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に 有用な一原核生物宿主である。使用するのｐｅｃｉｅｓ）が挙げられる。これら の原核生物宿主においては、発現ベクターを作製することも可能であり、具体的 には、これらのベクターは宿主細胞と両立できる発現制御配列（例えば、複製起 点）を含む。さらに、ラクトースのプロモーターシステム、トリプトファン（ｔ ｒｐ）のプロモーターシステム、β−ラクタマーゼのプロモーターシステム、ま たはλファージのプロモーターシステム等の、多くの様々な既知のプロモーター が存在する。これらのプロモーターは、具体的には、必要であればオペレーター 配列と共に発現を制御し、さらに、転写及び翻訳を開始し終了させるために、リ ポソーム結合部位配列等を有する。

酵母等の、他の微生物を発現に用いてもよい。３−ホスホグリセリン酸キナーゼ 若しくは他の解糖酵素を含む、プロモーター、および複製起点等の、発現制御配 列、および必要であれば終結配列等を有する適当なベクターを有する、サツカロ マイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が、好ましい宿主である。

微生物に加えて、哺乳動物の組繊細胞培養物も、本発明のポリペプチドを発現し 、生産するのに使用できる（ウィンナツカ−（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ）　ら、「フ ロム　ジーン　ツー　クローンズ（Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅ　ｊｏ　Ｃ１ｏｎｅｓ） 　Ｊ　、ブイシーエッチ　パブリッシャーズ（ＶＣＩＩ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ）、ニューヨーク、ニューヨーク、（１９８７年）を参照、これはここでは参考 として挙げられている）。真核生物の細胞が、ヒトのタンパク質をそのまま分泌 できる多くの好ましい宿主細胞株が当該分野において開発されているため、実際 に好ましく、具体的には、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯ８細胞株、ヒーラ（ＨｅＬ ａ）細胞、ミエローマ細胞株、ジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｊ　ｃｅｌｌ）等 が挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エン ハンサ−等の発現制御配列（１ｍｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、）　、８９　：　４９ 、これはここでは参考として挙げられている）、およびリポソーム結合部位、Ｒ ＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（ｐｏｋｙｘｄｅｎｙｌＮｉｏｎ　５ Ｈｅ）、及び転写終結配列等の必要なプロセッシング情報部位（ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｇ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　５ｕｅ）を含む。好ましい発現制御配列は、 免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシのパピローマウィルス 等由来のプロモーターである。有用なりＮＡ上セグメント例えば、変異ＡＰＰポ リペプチドをエンコードするポリペプチド）を含むベクターを、細胞宿主のタイ プによって変わる、既知の方法によって宿主細胞に転移することができる。例え ば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは一般的に原核生物の細胞に用 いられるが、リン酸カルシウム処理若しくはエレクトロポレーションは他の細胞 宿主に使用される。（通常、ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド　ス プリング　ハーバ−プレス、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅ ｓｓ）、（１９８２年）を参照、これはここでは参考として挙げられている。） または、相同的組換を用いて、特異的な部位、例えば、宿主のＡＰＰ遺伝子座に おいて、宿主ゲノム中にＡＰＰの変異配列を挿入してもよい。相同的組換の一つ のタイプでは、１つまたはそれ以上の宿主の配列を置き換える；例えば、宿主の ＡＰＰの対立遺伝子（若しくはこの一部）を変異ＡＰＰの対立遺伝子（若しくは この一部）と置換する。

このような遺伝子の置換方法に加えて、相同的組換を用いて、宿主のＡＰＰ遺伝 子座以外の特異的な部位に変異ＡＰＰの対立遺伝子を標的にして（ｔ　ａ　ｒ　 ｇ　ｅ　＋）もよい。相同的組換を用いて、変異ＡＰＰの対立遺伝子を導入した ヒト以外の形質転換動物および／または細胞を作製できる。

この方法自身によって、診断において使用できるテストキットを容易に形成でき る。このようなキットは、第一のコンテナー（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）が適当に標 識されたＤＮＡプローブを含む１つまたはそれ以上のコンテナー（ｃｏｌａｉｎ ｅｔ）を密に並べて区分されるキャリアー（ｃａｒｒｉｅｒ）からなる。他のコ ンテナーｆｃｏｎｔａｉｎｅｒ）は、酵素基質等の、標識されたプローブの位置 を決定するのに用いる試薬を含む。さらに他のコンテナー（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ）には、制限酵素（ＢｃｌＩ等）′、バッファーなどが、使用のための指示に従 って入っている。

実験の実施例 以下の実施例によって詳細に説明するが、以下の実施例によって本発明は制限さ れるものではない。

アルツハイマー病を剖検で確認した一家族（図１を参照）おける第２１染色体の 長腕に沿ったＡＤおよびマーカーの分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を評価した 。６人の疾病した人および３３人の疾病していないが疾病する危険を有する人か らのＤＮＡサンプルを用いた。。

疾病した家族員におけるＡＰＰ遺伝子を、イントロンのプライマーを用いたポリ メラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　 （ＰＣＲ）の直接配列決定（ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって分 析した（ギレンステン（Ｇ７１１ｅｎｓｔｅｎ）、ニー　イン　ピーシ−アール 　テクノロジー（Ｕ、ｉｎ　ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇ７）、エリツク、エッチ ニー（Ｅｒｌｉｃｈ、Ｂ、Ａ、）著、ストックトン　プレス（Ｓｊｏｃｋｊｏｎ 　Ｐｒｅｓｓ）、４５〜６０．１９８９年；ヨシカイ（Ｙｏｓｈｉｋａｉ）ら、 （１９９０年）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、８７　：　２５７）。（図２）。このプ ライマーを、ジーン　アセンブラ−プラス（Ｇｅｎｅ　Ａｓ＠ｅｍｂｌｅｒ　Ｐ ｌｕｓ）　（ファルマシア　エルケービ−（Ｐｈａｒｍｉｃｉａ　ＬＫＢ）製） を用いて製造会社のプロトコルにしたがって作製した。

ＡＰＰ遺伝子のエキラン１７を増幅するために、ＰＣＲヲ以下のイントロンのプ ライマーを用いて行った：［Ａ］　５’　−ＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＧＴＣＣ ＣＣＧＴＣＡＴＴ−３’　［配列番号＝２６］および［Ｂ］５’−ＧＣＣＴＡＡ ＴＴＣＴＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＡＴＴＣＣＣＡＣ−３’　［配列番号；２７ ］ＰＣＨの条件は、９４℃、１０分間で変性：さらに、６０℃で１分、７２℃で ３分、９４℃で１．５分を３５サイクル；および７２℃で１０分を１サイクル。

１０ｍＭ）リス−塩酸　ｐＨ８，３，５０ｍＭ塩化カリウム、０．０１％ゼラチ ン、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ピコモルのそ れぞれのＰＣＲプライマーおよび１単位のＴａｑポリメラーゼを用いて、反応を 行った。全体の最終反応容積は２５μｍであった。

次に、第二のＰＣＲ反応を、最終濃度がプライマー［Ａ］が５０ピコモルおよび プライマー［Ｂ］が０．５ピコモルで行った。ＰＣＲ生成物を、セントリコン　 １００　マイクロコンセントレータ−（ｃｅｎＨｉｃｏｎ　１００　ｍ１ｃｒｏ ｃｏｎｃｅｎＨａｊｏｒ）　（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）製）上で精製し、製造 会社のプロトコルにしたがってシークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）キット（ バージョン　２．０、ユナイテッド　ステーツバイオケミカル　コープ（Ｕｎｉ ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）；シークエナー ゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）は商標である）を用いた配列決定のために直接用いた 。

エキラン１７はβ−アミロイドペプチドの一部をエンコードし、ダッチタイプの アミロイド症（「エッチシーエッチダブルニー−ディ」　（“ＨＣＨＷＡ−Ｄ” 　））による遺伝性の脳出血を引き起こす（ＡＰＰ６９３の）突然変異の部位で あるため、これを最初に配列決定した。

エキラン１７の配列分析によって、７１７番目のアミノ酸でバリンからイソロイ シンへの変化が生じる、２１４９番目の塩基対でＣからＴへのトランジションが 明らかになった（図２および図３）。

このＣからＴへのトランジションによって、ＰＣＨの生成物内で検出できるＢｃ ｌＩの制限部位が生じる（図４）。

製造会社によって推奨されているように、Ｂｃｌｌによる消化を５０℃で２〜４ 時間行い、さらに、３％アガロースで電気泳動した。

１００人の関連のない正常な個人および１４ケース（９家族）の家族性の後年に 始まる病気のＰＣＲによるスクリーニングでは、この置換が示されなかった。家 族性の初期に始まる病気の１１ケース（９家族）のスクリーニングで、関連のな い家族の２人の疾病した個人においてＢａ１ｌの制限部位が明らかになった。遺 伝的データによって、病気の遺伝子座がミスセンス突然変異体に連結しているこ とが示される。また、２００個の正常な染色体において多形性が検出されなかっ たことによって、これが病原性のある突然変異体であるという主張が支持される 。

バリンからイソロイシンへの置換は、β−アミロイドペプチドのＣ−末端のトラ ンスメンブランドメインの２残基内で起こる。コンピューター分析によって、置 換によってトランスメンブランがより疎水性になり、これによって膜内により強 力にタンパク質を固定することが予想される。

置換の位置、β−アミロイドペプチドのＣ−末端から２残基は、沈着したペプチ ドのオリジン（ｏｔｉｇｉｎ）に重要である。

この知見は、アルツハイマー病のエッチシーエッチダブルニー−ディ　（ＨＣＨ ＷＡ−Ｄ）　、つまりアミロイドの沈着がβ−アミロイドペプチド内ではなくＮ −末端により近い突然変異によって起こる病気への関連を示すものである（レヴ イ（ｌｅｖｙ）ら、上記引用文（ｌｏｃ、ｃｉＬ）　）。

実施例２−欠陥（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）　β−アミロイド（ＡＰＰ）遺１０ｍ１ の新鮮な血液を、家族性アルツハイマー病に罹っているそれぞれの個人から集め た。リンパ球をパーコルグラジェント（Ｐｅｒｃｏｌｌ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）上 で血液から精製し、エプスタイン−パールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ 　ｖｉｒｕｓ）　（ＥＢＶ）と混合した。次に、細胞を１０％ウシ胎児血清、抗 生物質、グルタミンおよびＴリンパ球を殺すシクロスポリンＡを追加した培地中 に撒いた。ＥＢＶによって感染したＢリンパ球を不死化し、患者のＢ細胞由来の 永久細胞株を確立した。

リンパ芽球様細胞株（ｌｙｐｈｏｂｌａｇｊｏｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）　、 ＡＣ２１は、ヨーロッピアン　コレクション　オブ　アニマルセル　カルチャー ズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｆ 　ＣｕＨｕｒｅｓ）　、ポートン　ダウン（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ）に寄託疾 病年齢が５９±４才であるＡＤを剖検で確認した、Ｆ１９と称され、図５に示さ れた家系を、ＡＰＰ遺伝子の近くに位置する、非常に多形性であるジヌクレオチ ドの反復マーカー（ｒｅｐｅａｔ　ｍａｒｋｅｒ）　ＧＴ　１２の対立遺伝子（ Ｄ２１Ｓ２１０）が病気とコセグレゲートする（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）こ とを観察することによって確認した。連鎖分析（ｌｉｎｋａｇｅ　ａｎａｌｙｓ ｉｓ）によって、以下の表に示されるように、組換画分がゼロの際にマーカーと 病気との間のピーク　ロッド　スコア（ｐｅａｋ　ｌｏｄ　５ｃｏｒｅ）が３． ０２であった：シータ　０　０．０１　０．０５　０．１　０．２　０．３　０ ．４０ツド　３．０２　２．９７　２．７５　２．４７　１．８６　１．２２　 ０．６０ソド　スコア（Ｉｏｄ　５ｃｏｒｅ）を、リンケージ（Ｌ　Ｉ　ＮＫＡ ＧＥ）パッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）のムリンク（ＭＬ　ＩＮＫ）を用いて０． ００１の表現型模写率および０．００１の遺伝子頻度を有する年齢に依存してい る浸透度が０．０１から０．９５である病気に罹りやすい７クラスを用いて計算 した（ラトロツプｆＬａｔｈｒｏｐｌ　ら、（１９８４年）、ブロック　ナシコ ル　アカデ　サイ　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８１　：　３４４Ｂ）。

Ｆ１９の疾病したおよび疾病していない個人のＡＰＰのエキラン１７の配列を決 定した。疾病した人においては、図６に示されるように、２１５０番目の位置で Ｇ−＞Ｔのトランジションが存在した。

エキラン１７の増幅を、以下のように修飾して、上記実施例１およびチャーティ アー−パーリン（Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ）ら、（１９９１年）、ニュ ーロサイ　レッゾ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

Ｌｅｎｓ、）、１２９：１３４に記載されたようにして行った：（ａ）増幅用の プライマー配列は以下の通りである：ＡＴＡ−ＡＣＣ−ＴＣＡ−ＴＣＣ−ＡＡＡ −ＴＧＴ−ＣＣＣ−Ｃ［配列番号：２８１　およびＧＴＡ−ＡＣＣ−ＣＡＡ−Ｇ ＣＡ−ＴＣＡ−ＴＧＧ−ＡＡＧ−Ｃ［配列番号＋２９］　；　さら１ニ（ｂ）Ｐ ＣＲの条件ハ、９４℃、１ｏ分間した後、６０℃で１分、７２℃で１分、９４℃ で１分を３５サイクル、さらに、７２℃で５分であった。

５０ピコモルの第二のプライマーを用いて、１本鎖の生成物を生産し、さらに、 これを精製した（チャーティアー−パーリン（ＣｈａＮｉｅｒ４ａｒｌｉｎ）ら 、上記引用文（ｌｏｃ、　ｃｉ（））。精製した生成物を以下の配列のプライマ ーを用いてシークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）　キット（２，０）（商標； ニーエスピー（［ｌ５Ｂ）　）を用いて配列決定した：ＡＡＡ−ＴＧＡ−ＡＡＴ −ＴＣＴ−ＴＣＴ−ＡＡＴ−ＴＧＣ−Ｇ　［配列番号：　３０７Ｔ−＞Ｃのトラ ンジションの存在によって、配列決定反応におけるイノシン（シークエナーゼ（ ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）キット）を含ませることによって溶解するゲルのアーチフ ァクトが得られた。

Ｆ１９の疾病した個人のエキラン７および１６を直接配列決定（ｄｉｒｅｃｔ　 ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）すること（チャーティアー−パーリン（Ｃｈａｒｆｉｅ ｒ４ａｒｌｉｎ）　ら、上記引用文（Ｉｏｃ、　ｃｉ、））によって、これらは 正常な配列を有することが示され、５ＳＣＡ（オリタ（ＯｒＨａ）　ら、上記引 用文（Ｉｏｃ、　ｃｉＬ）　）および（オリタ（Ｏｒｉｊａ）　ら）によっては エキラン２．３．７．９．１２．１３若しくは１５における変化を同定できなか った。エキラン１７の５ＳＣＡによって、標準のスクリーニングの条件下で、Ａ ＰＰ６９３　（レヴイ（ｌｅｖｙＪら、上記引用文（ｔｏｅ、ｃｉｆ、）および バーディ（Ｈａｒｄｙ）　ら、（１９９１年）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、 ３３７　：１３４２〜１３４３）およびＡＰＰ７１７　Ｖａｌ−＞Ｉｌｅの両方 が検出され、修飾すると、ＡＰＰ７１７　Ｖａｌ−＞Ｇｌｙが検出される。

実施例４−変異ＡＰＰ対立遺伝子を有する形質転換動物の非 構築物の生産：ポリリン力−のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ末端がＰｖｕ１１部位の付近 にくるように、ｐＢＲ３２２のＰｖｕｌｌおよびＥｃｏＲＩ部位の間にポリリン カーをクローニングすることによって、ベクターブリンク（ｖｅＮｏｒ　ｐｌｉ ｎｋ）を構築した。連結によって、ｐＢＲ３２２のセグメントに関連したＥｃｏ ＲＩおよびＰｖｕｌＩ部位の両方を破壊した。ＳＶ４０のポリアデニル化シグナ ル（ｐｏｋ７ｘｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｉｇｎｉｌ）を含むｐＳＶ２ｎｅｏ　（ サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびベルブ（Ｂ　ｅ　ｒ　ｇ）、（１９８２年） 、ジエー　モル　アップルジエネット（Ｊ、　Ｍｏ１．、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ ｅＬ）、１：３２７）の７００ｂｐのＨｐａＩからＥｃｏＲＩまでの断片を、プ リンク（ｐｌｔｎｋ）のＨｐａｌからＥｃｏＲＩの部位にクローニングすること によって、ｐＮｏ　ｔＳＶを得た。ＳＶ４０の１６Ｓ／１ｇＳのスプライス部位 を含ｔｉ’ｐＬ２（７）２００ｂｐのＸｈｏＩからＰｓｔｌの断片（オカヤ７　 （Ｏｋａ７ａｍａ）およ断端を平滑にし、さらに、ｐＮｏ　ｔ　ＳＶのＨｐａ１ 部位にクローニングすることによって、ｐｓｐｌｉｃｅを得た。

ＡＰＰに対するｃＤＮＡのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を 含むｐＡＰＰ６９５の２，３ｋｂのＮｒｕｌから５ｐｅｌの断片（タング（Ｔａ ｎｘｉ）　ら、（１９８７年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２３５　： 　８８０）をｐｓｐｌｉｃｅ（７）Ｎｒｕｌから５ｐｅＩの部位にクローニング することによって、ｐｄ６９５を得た。同様のストラテジーを用いて、ＡＰＰ７ ５１　（タング（Ｔｉｎｘｉ）　ら、（１９８８年）、ネイチャー（Ｎｉｔｕｒ ｅ）、３３１　：　５２８）のｃＤＮＡを用いてｐｄ７５１を得た。様々なプロ モーターを、単一のＮｒｕ　Ｉ部位またはＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩおよびＮｒｕＩ部 位を用いて、ｐｄ６９５およびｐｄ７５１ベクターに挿入した。

ｐｓｈＡＰＰ６９５およびｐｓｈＡＰＰ７５１の生成：ＡＰＰのｃＤＮＡの１． ５ｋｂのＢａｍＨＩ断片をｐｕｃ１９　ｘＨａｍｙのＢａｍＨＩ部位にクローニ ングすることによって、構築物、ｐＡｍｙｐｒｏＢａｍを得た。ｐＡｍｙｐｒｏ Ｂａｍの７００ｂｐのＨｉｎｄｌｌＩからＡｓｐ７１８の断片（サルバウム（Ｓ ａｌｂａｕｍ）　ら、（１９８８年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）、７　： 　２８０７に記載された７００ｂｐのＢａｍＨＩからＡｓｐ７１８の断片と同じ ）をｐｄ６９５およびｐｄ７５１のＨｉｎｄｌｌｌからＡｓｐ７１８の部位にク ローニングし、ｐｓｈＡＰＰ６９５およびｐｓｈＡＰＰ７５１を得た。

Ｂａｍの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩからＸｈｏｌの断片、ＡＰＰ７５１　ｃＤＮＡ の１．５ｋｂのＸｈｏｌから５ｐｅＩの断片、およびｐｄ７５１の５ｐｅｌから ＥｃｏＲＩの断片の３工程の連結反応（！ｈｒｅｅ−ｗａ７１ｉｇａ目ｏｎ）に よって、ｐＡＰＰ６９５およびｐＡＰＰ７５１ベクターを得た。

ｐＮｓＥ７５１　（＋４７）の生成：　ｐＮＳＥ６　（フォース−ペラターｕ’ ｏｒｓｓ−ｐｅｔｔｅｒ）ら、（１９９０年）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）、 ５：１８７）のＨｉｎｄｌＩＩからＫｐｎｌの断片、ｐＮＳＥ６のＫｐｎｌから Ｂｓ　ｔＹＩの断片およびｐＡＰＰ７５１の部分的なりａｍＨＩ　（ＡＴＧより 一４７番目）からＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉの断片の３工程の連結反応（ｔｈｒｅｅ− ｗａｙ　Ｉ＋ｇａＮｏｎ）を用いて、ｐＮｓＥ７５１　（＋４７）を構築した。

これによって、ｐＮｓＥ７５１　（＋４７）のＫｐｎＩ部位にクローニングされ たＫｐｎｌ断片を得た。

ＢｓｔＹ１／Ｂａｍの融合によって、両方の部位が欠損する。

ｐＮｓＥ７５１の生成：これによってＡＰＰのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ 　ｒｅｇｉｏｎ）　ヘのＮＳＥの開始コドンの直接融合（ｄｉｒｅｃｔ　ｆｕｓ ｉｏｎ）が生じる、４プライマーの２段階のＰＣＨのプロトコル（４ｐｒｉｍｅ ｒ　ｔｗｏ−ｓｔｅｐ　ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ヒグチ（Ｂｉｇｕｃｈｉ） 　ら、（１９８８年）、ヌクレイックアシッズ　レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１６　：　７３５１）を用いて、このベクターを得た。オリ ゴヌクレオチドＣ２，１０７２，１０７３、およびＡ２（下記のヌクレオチド配 列を参照）を用いて、ＰＣＲ生成物を得た。制限酵素による消化によってＫｐｎ ｌ断片を得た。このＫｐｎｌ断片を用いて、ｐＮｓＥ７５１　（＋４７）中の同 様の断片を置換−の２段階のＰＣＨのプロトコル（４ｐｒｉｍｅｒ　ｔｗｏ−ｓ ｔｅｐ　ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて、バーディ（Ｈａｒｄｙ）　（ＡＰ Ｐ６４２ＡＰＰ６９５のＶａｌ−＞１ｉｅ）およびダッチ（Ｄｕｔｃｈ）（ＡＰ Ｐ６１８　ＡＰＰ６９５のＧｌｎ−＞Ｇｌｕ）の突然変異を導入した。反応のセ ットは両方とも、適当な突然変異を含む「内側のプライｖ−（ｉｎｓｉｄｅ　ｐ ｒｉｍｅｒ）　Ｊを有する同様の「外側のフライ７−　（ｏｌｓｉｄｅ　ｐｒｉ ｍｅｒ）　Ｊを使用した。これによって、消化後ＢｇｌＩＩから５ｐｅＩの断片 突然変異のいずれかを含んでいた。ｐＮｓＥ７５１のＢｇＩＩＩから５ｐｅｌの 断片を突然変異断片によって置換し、適当なベクターを得た。突然変異の存在を ベクターの配列分析によって確認した。

−の２段階のＰＣＨのプロトコル（４ｐｒｉｍｅｒ　ｔｔｏ−ｓｔｅｐ　ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）　（ヒグチ（旧ｇｕｃｈｉ）　ら、（１９８８年））を用い て、バーディＶｌ（ＨａｒｄｙＶＩ）（ＡＰＰ６４２　Ｖから■）、バーディＶ Ｇ（ｌｌａｒｄｙ　ＶＧ）　（ＡＰＰ６４２　ＶからＧ）、およびダッチ（Ｄｕ ｔｃｈ）　（ＡＰＰ６１８　ＥからＱ）の突然変異を導入した。プライマー１１ ７／７３８．９２２．９２３、および７８５を用いて、／＼−ディＶ　Ｉ　（Ｈ ａｒｄｙ　Ｉ／Ｉ）の突然変異体を得た；プライマー１１７／７３８．１１０５ 、Ｇ）の突然変異体を得た；プライマー１１７／７３８．１０１０．１０１１、 および７８５を用いて、ダ’７チ（Ｄｌｃｈ）の突然変異体を得た。これらすべ ての突然変異において、ＰＣＲ生成物を制限酵素で消化することによって、７０ ０ｂｐのＢｇｌｌＩから５ｐｅＩの断片を単離し、さらにｐＮＳＥ７５１の同様 の部位にクローニングした。この突然変異は配列分析によって確認した。

ｐＮＦＨ７５１の生成：ヒトのＮＦＨ遺伝子（リーズ（Ｌｅｅｓ）ら、（１９８ ８年）、イーエムビーオー（ＥＭＢＯ）、７（７）：１９４７）を、プローブと してう・ノドのＮＦＨのｃＤＮＡを用いてゲノムライブラリーから単離した（り 一ベルバーグ（Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ）ら、（１９８９年）、プロ・ノクナショ ル　アシツズ　レス　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎｘｔｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　 Ｒｃｓ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８６　：　２４６３）、Ｓｓ　ｔ　Ｉ断片をｐＳＫ ベクターにサブクローニングした。１対のＰＣＲプライマーを作製し、ＮＦＨ遺 伝子の開始コドンの直ぐ上流の１５０ｂｌ）の増幅した断片の３′末端にＮｒｕ Ｉ部位を置いた。５′末端は、開始コドンから１５０番目の上流にＫｐｎＩ部位 を有する。ｐＮＦＨ８，８の５．５ｂのＨｉｎｄｌｌｌからＫｐｎ　Ｉ断片、Ｋ ｐｎ　ＩからＮｒｕｌのＰＣＲによって生じた断片、およびｐｄ７５１のＨｉｎ ｄｌＩＩからＮｒｕｌの断片の３工程の連結反応（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ　１ｉｇ ａｔｉｏｎ）によって、ｐＮＦＨ７５１の最終的な構築物を得た。開始コドンで のＰＣＲによって生じた融合物周辺の配列を、配列分析によって確認した。ｐＮ ＦＨ７５１の同様の断片を配列を確認した突然変異ベクターの６００ｂｐのＢｇ ｌＩＩから５ｐｅＩの断片で置換することによって、ｐＮＦＨ７５１のダッチ（ Ｄｕｔｃｈ）およびバーディ（ｌｌａｒｄｙ）の変異体を得た。突然変異の存在 は、突然変異したオリゴマーによるハイブリッド形成によってまたは配列分析に よって確認した。

ｐＴｈｙ７５１の生成：以下の３工程の連結反応（ｔｈｒｅｅ−Ｗ！Ｆ　１ｉｇ ａ＋１ｏｎ）によって、ｐＴ１ｙ７５１ベクターを得た。

ヒトのゲノムライブラリーから単離したｐＴｈｙ８．２のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉか らＢａｍＨＩの断片（チャンク（Ｃｈａｎｇ）ら、（１９８５年）、ブロック　 ナショル　アカデ　サイニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｄ、Ｓｃ ｉ、υ、　Ｓ、　Ａ、　）、８２：３８１９）、合成断片’ｒｈｙＡｐｐ、およ びｐｄ７５１のＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩからＮｒｕ　Ｉの断片。

’ｒｈｙＡｐｐを以下に示す： ＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＧＴＣＴＴＧＧ　［配列番号：３１］ ｐ’ｒｈｙｃ１ｏｏの生成：以下の３工程の連結反応（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ　ｌ ｉｇａｔｉｏｎ）によって、このｐ”ｒｈｙｃ１ｏｏ構築物を得た。ｐＴｈｙ８ ．２の３．６ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩからＢａｍＨＩの断片、合成断片ＴｈｙＡＰ Ｐ２、およびｐｄ７５１またはｐＮｓＥ７５１ダッチ（Ｄｕｔｃｈ）若しくはｐ ＮＳＥ７５１バーディ（ｌｉａｒｄｙ）のＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩからＢｇ］、　Ｉ 　Ｉの断片を連結し、ｐ’ｒｈｙｃｘｏｏを得た。

ＴｈｙＡＰＰ２を以下に示す： ＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＴＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴ ＣＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧ　［配列番号、３２１ 開始コドン周辺の領域を配列分析によって確認した。

注入用のＤＮＡの調製：Ｎｏｔｌによる消化およびゲル電気泳動のために有用な 相当するベクターから注入用のトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を単離し た。このトランスジーン（ｔ：ｒａｎｓｇｅｎｅ）をジーン　クリーン　キット （Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎｋｉｌ　（バイ第１０１　（Ｂｉｏｌｏｌ））を用いて 精製し、さらに、エルチップ（Ｅｌｕｆｉｐ）またはヌクレオゲン　４０００　 カラム（Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ　４０００　ｃｏｌｕｍｎ）で精製したＨＰＬＣで 精製した。

マイクロインジェクション：このトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を、Ｆ ＶＢ若しくはＢ６Ｄ２Ｆ２の１細胞胚（ｏｎｅ−ｃｅｌｆ　ｅｍｂｒｙｏ）の最 も便利な前核（一般的にはオスの前核）中に２〜２０μｇ／ｍｌ量を注入した（ マニピュレイティング　ザ　マウス　エンブリオ（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　 ｔｈｅ　ＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ）　、ビー　ホーガン（Ｂ、　Ｈｏｇａｎ）、 エフ　コンスタンチニ（Ｆ、　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ）、イー　ラシーｆＥ、 　Ｌａｃｙ）　、コールド　スプリング　ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏ「）、（１９８６年））。注入された胚を一晩培養した。２細胞段階 に分裂した胚を、偽妊娠した（ｐｓｅｕｄｏ−ｐｒｅｇｎａｎ＋）メスのＣＤ１ マウス中に移植した。このマウスを約２１日で離乳させた（ｗｅａｎｅｄ）。尾 の生検により得られたＤＮＡサンプルを、トランスジーン（ｔｒａｎｇｇｅｎｅ ）に特異的なプローブ（一般的にはＳＶ４０　３＝のスプライス（ＳＶ４０３’ 　ｇｐｌｉｃｅ）およびポリアデニル化シグナル（ｐｏｋｙａｄｅｎｙｌａｔｉ ｏｎ　ｇｉｇｎａｌ）配列）を用いたサザンプロットによって分析した。トラン スジーン（１，ｒａｎｇｇｅｎｅ）の少なくとも１コピーを有する形質転換マウ スを同定した。

形質転換マウスの使用：　ｈＡＰＰ遺伝子またはその変異体を発現するマウスを 用いて、アミロイドの沈着の病因およびアミロイドの沈着を調節する（ｍｏｄｕ ｌａｔｅ）ように設計された治療上の関与を試験できる。

形質転換マウスの生化学的な分析によって、β−アミロイドに対する前駆体と考 えられるＡＰＰの異化作用における可能な中間体が明らかになる。この分析は、 動物においてまたは発現する細胞の一次組織培養において行うことができる。

この動物を用いて、強力な治療物質を試験することができる。マウスの試験群を 、一定期間適当な様式で投与される試験化合物によって処理する。試験期間が終 了した際、動物を、試験化合物の可能な効果について、行動学的に、生化学的に 、および組織学的に評価する。このプロトコルは、試験化合物の作用の予想され るメカニズムに依存する。

ＡＤを治療するのに用いられる化合物をこの方法を用いて同定できる。

配列リスト （１）　一般的な情報： （ｉ）　出願人： （Ａ）　名称：　インペリアル　カレッジ　オン　サイエンス。

テクノロジー　アンド　メデイシン （アメリカ合衆国を除く） （Ｂ）ｋｍη：　エキシビジョン　ロード、サーフイールド　ビルディング （Ｃ）　市（ＣｒｒＹ）：　ロンドン ■）　国：　イギリス国 （Ｆ）　郵便番号二　ニスダブル７２ニーゼツト（Ａ）　氏名：　バーディ、ジ ョーン　アンソニー（アメリカ合衆国のみ） し）　新旧η司！η：　ドレイクツエル　ロード　１８７（Ｃ）　市（ｃｒｒＹ ）：　ロンドン ■）　国：　イギリス国 （Ｆ′）郵便番号：　ニスイー４ （Ａ）　氏名：　ゴウテイ、アリラン　マリ−（アメリカ合衆国のみ） ■）　ＮＥｒｒＲＥＥＴ）：　ハンプトン　ウィック、ハイ　ストリート　ｌ■ （Ｃ）　市（ＣＩＴＹ）：　キックストン−オン、テムズ（Ｄ）　州（ＳＴＡＴ Ｅ）：　サリー ■）　国：　イギリス国 （Ｆ）　郵便番号二　ケーティ１４デイキユー（Ａ）　氏名：　マラン、マイケ ル　ジョーン（アメリカ合衆国のみ） （Ｂ）　街（８ＴＲＩ！Ｊｉ’ｒ）：　ブルース　ビー、ダウンズ　ブルヴアー ド　エムディジー　５０　１２９０１．　サンコースト　ジェロントロジー　セ ンター （Ｃ）　市（ＣｒｒＹ）：　テンバ （Ｄ）　州（ＳｒｒＡＴＥ）：　７　ａリダα）　国：　アメリカ合衆国 ■　郵便番号：　３３６１２ （Ａ＞　氏名：　チャーテイアー−ハーリン、マリ−、クリステイン（アメリカ 合衆国のみ） （Ｂ）　ＭＳＴＲＥＲＴ）：　フランシス　ロード　田（Ｃ）　市（ＣｆｆＹ） ：　ロンドン ■）国：　イギリス国 （Ｆ）　郵便番号：　イー１０６ビーエヌ（Ａ）　氏名：　オウエン、マイケル 　ジョーン（アメリカ合衆国のみ） （Ｂ）　街（ＳＴＲＥＥＴ）：　ランブレシアン、キャッスルヒル、フォーへツ ジェス （Ｃ）　市（ＣｒｒＹ）：　カラブリッジ（Ｄ）　州（ＳＴＡＴＥ）：　サウス 　グラモルガンＧ）　国：　イギリス国 （ｉｉ）　発明の名称：　アルツハイマー病に関するテストおよびモデル（ｉｉ ｉ）　配列の数；　楓 （ｉｖ）　コンピューターの解読可能な形態（ＣＯｎＲＲＥＡＤＡＢＩＪＦＯＲ Ｍ）：申８青せず （Ｖ）　一般的な出願資料： 出願番号：　ＷＯＰＯＴ／ＧＢ９２／ （２）　配列番号＝１に間する情報： （ｉ）　配列の特性： （ｉｆ）　分子のタイプ：　タンパク質（傾　配列の記載：　配列番号：ｌ： Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ｃｌｕ　Ｇｌｙ　工ｌａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｒ、＋≠■ Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　）ｘｑ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＣＹ！！ 　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｐｈａ　Ｖａ■ ｌ、００　１０５　１ＬＯ 工１ａ　Ｐｒｏ　’ｒｙｒ　Ａｒｑ　ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ 　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ｒｘ■ １１５　１２α　１２５ Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 入１ａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ工４５　工５０　１ ５５　１６０ ＬＹ！Ｉ　ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ａｊｉｎ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ｃｘ ｙ　ｘａｔ　Ｌ４１ｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｃ７１１ＧＩＹ工P・ １６５　１７０　１フ５ ａｌｕ　Ａｌａ　ＡＪＩＰ　ＡＪＩＰ　Ａ１％Ｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇ Ｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　fｌｕ ２４５　２５Ｑ　２５５ ＧＬｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｒ、ｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ 　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ａｒ■ コ２５　ココ０　コ３５ ｃｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｒｘ　Ａｌａ 　Ｌｙａ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓに１」―ｐココ０　コ４５　コ５０ （２）配列番号：２に関する情報： （ｉｉ）　分子のタイプ：　タンパク質（ｘｉ）配列の記載：　配列番号：２： Ｍｓａｔ　Ｌａｕ　Ｐｒ口　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ 　Ｌａｕ　Ａｌａ　入１ａ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　入ｒ■ 工　５　１０　１５ 人１９ｎ　Ｇａｙ　Ｌ７！ｌ　Ｉｈ−ｐ　Ａｓｐ　Ｂａｒ　Ａｓｐ　ｐｒｏ　Ｓ ａｒ　ＧＩＹ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＣＹｓ　工ｌａ　`ｓｐ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ工１ａ　ｒｌ、ａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ 　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａ１Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＬａｕＴｒｐ　Ｃｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｑ　Ｌｙｇ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈ ｌｓ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｐｈ＠　ＶａｌＺｏｏ　１０５　ｘｌ。

Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｇｐ　Ｇｌｕ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｇａｙ　Ｇ １．ｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ａｓ１ｎ　ＡＳｎ　Ｐｈａ 　ＡＳｐ　τｈｒＧユｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙ■ ３２５　３コ０　ココ５ Ｍａｔ　ｌ１・　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ｌ１＊　５ａｒ　Ｔｙｒ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎλｓｐ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｍａｔ　Ｐｒ。

５６５　５フ０　５７５ −Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｓａｒ　Ｌ＠ｕＡｓｐ　Ａｊｐ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　 ’ｒｒｐ　１Ｅｉｓ　５ＣＰｈａ　Ｇｌｙ　紅＆　ｊｌＪｐ（２）配列番号：３ に関する情報： （ｉ）　配列の特性： （Ｄ）　）ポロジー：　直線状 （■）分子のタイプ：　タンパク質 （ｘｉ）　配列の記載；　配列番号二３：Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ａｊｐ　Ａｓｐ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖ ａ工工ｌｕ　Ｇｌｕ２４５　２５０　２５！ Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　ＭＰ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｉ、ｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈａコｏ５　コ１０　３ １５　コ２゜ Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇａｙ　Ｍｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａ ｓｎ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇ工ｕ’ｒｙｒ３２５　コ３０　３コ ５ ｃｙｓ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＣＹｓ　Ｇａｙ　！ｉａｒ　Ａｌａ　Ｍａｔ 　５ａｒ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｉａａｕ　Ｌｙｓ　’窒■■ ３４０　３４５　コ５０ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　ｋｘｑ　ＶａｌエニーＴｙ ｒ　Ｇｉｕ　）！ｑ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　ＧＩＪＩ　Ｓ＆ｒ５コ０　５コ５　５４ ０ Ｌａｕ　Ｍａｔ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａ工工ｌａ　Ａｌａ　Ｔ ｈｒ　ＶａｌＨｌｓ　Ｖａｌ　ｎａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ７０５　フ１０　フ１５　 フ２０ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　）ｒｑ　Ｈｌｓ　−ｕ　Ｂａｒ　Ｌｙ！Ｉ　Ｍａｔ７４０　７４５　７ ５Ｇ Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　’ｒｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ 　’！’ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　lａｔ Ｇｉｎ　Ａｓｎ （２）　配列醤号：４に関する情報： （ｉ）　配列の特性： （Ｄ）トポロジー：　直線状 （ｉｆ）　分子のタイプー　ＤＮＡ　（ゲノム）（−）　配列の記載シ　配列誉 号：４：τλＣＡＴＣλＣＣＧ　ＣＴＣτＣＣ入ＣＧＣτＧＴτＣＣ’ｌ’Ｃ（ Ｔ　ＣＧＧＣＣτＣＣτＣ入ＣＧＴＧＴτＣ入Ａτ入ＭＣτ入入ＡＧ@１２６０ ＡＡＧＴ入τ’にＴｅＣＧＣｆ：ＣＡＧＡ＆ＣλＧλＡＧＧλＣ＾Ｇλ（Ｊ：Ｃ ＡＣＡＣＣＣ？ＡＪｕｊ；ＣλτＴｌ’Ｃ（、ＷＣＡＴＧＴfＬコ２゜ 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３６：ＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　２１（２）　配列番号： ３７に関する情報：（ｉ）　配列の特性： （Ｃ）　鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直線状 （ｉｆ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記載：　配列番号 ：３７：ＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣ’ＩＴＧＧＴＧ　２８ （２）　配列番号：３８に関する情報：（ｉ）　配列の特性： （Ａ）　長さ＝２８塩基対 （Ｂ）　タイプ：　核酸 （Ｃ）　鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直線状 （ｉｆ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：　配列番号： ３８：ＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＯＡＣＴＯＴＯＯＣＴ（２）　配 列番号：３９に関する情報：（ｉ）　配列の特性： （Ｄ）トポロジｍ：　直線状 （ｉｉ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｎ）　配列の記載：　配列番号＝ ３９＝２６　ＡＣＣＣＡＣＡＴｃＴＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣ（２）　配列 番号＝４０に関する情報：（ｉ）配列の特性： （Ｄ）トポロジｍ：　直線状 （ｉｉ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｎ）　配列の記載：　配列番号： ４０：ＧＴＧＴＴＣ苗ＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＴ　２４（２）配列番号： ４１に関する情報： （ｉ）　配列の特性： （Ａ）　長さ＝２７塩基対 （Ｄ）トポロジｍ：　直線状 （ｉｆ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｍｌ）配列の記載：　配列番号： ４１：ＣＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴｒＧＧＣ２７（２）配 列番号＝４２に関する情報： （ｉ）配列の特性： （ｉｉ）　分子のタイブコ　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｉ）配列の記載：　配列番 号：４２：ＧＣＣＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴ Ｃ３２（２）　配列番号＝４３に関する情報：（ｉ）　配列の特性： （Ｄ）トポロジー：　直線状 （ｆｉ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記載：　配列番号 ：４３：ＡＣＣＴＧＣＣＡＣＴＡＴＡＣＴＧＧＡＡＴＡ　２１（２）配列番号： ４４に関する情報： Ｑ）　配列の特性： （ｆ、ｉ）　分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記載：　配列番 号：４４：ＴＧＴＧＣＡＴＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＡＣ２１ＦＩＧ　、　３ ＣＯＯＨ ！　２ 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ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡｔＪ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ （７２）発明者　ゴウティ、アリラン　マリーイギリス国、サリー　ケーティ１ ４デイキユー、キックストン、ハンプトン　ウィック、ハイ　ストリート１００ ＦＩ （７２）発明者　オウエン、マイケル　ジョーンイギリス国、サウス　グラモル ガン　シーエフ７７ジエービー、ニア−カウブリ ッジ、ランブレシアン、キャッスルヒル。

フォー　へッジェス（番地なし） （７２）発明者　マラン、マイケル　ジョーンアメリカ合衆国、フロリダ州　３ ３６１２．テンパ、ブルース　ビー、ダウンズ　ブルヴアード　エムディジー　 ５０．１２９０１．ユニバーシティ　オン　サウス　フロリダ、サンコースト　 ジエロントロジー　センター内

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトのアミロイド前駆体タンパク質７７０（ＡＰＰ７７０）の７１７番目の コドンが突然変異したもの、または７１７番目のコドンによってエンコードされ る位置に突然変異したアミノ酸残基を有するＡＰＰ７７０のイソ型若しくは断片 をエンコードする核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
2. ２．７１７番目のコドンによってエンコードされた位置のアミノ酸がイソロイシ ン、グリシン、またはフェニルアラニンである、請求の範囲１に記載の単離され たポリヌクレオチド。
3. ３．該核酸配列がｃＤＮＡである、請求の範囲１に記載の単離されたポリヌクレ オチド。
4. ４．７１７番目のコドンで突然変異を発現するアミロイド前駆体タンパク質７７ ０（ＡＰＰ７７０）の対立遺伝子に対して特異的にハイブリッドを形成すること ができるポリヌクレオチドプローブからなる組成物。
5. ５．該突然変異した対立遺伝子の７１７番目のコドンがイソロイシン、フェニル アラニン、またはグリシンをエンコードする、請求の範囲４に記載の組成物。
6. ６．該プローブが標識されている、請求の範囲４に記載の組成物。
7. ７．該プローブがＡＰＰ７７０の対立遺伝子の７１７番目のアミノ酸にわたる少 なくとも約１０ヌクレオチドからなる、請求の範囲４に記載の組成物。
8. ８．ヒトのアミロイド前駆体タンパク質７７０（ＡＰＰ７７０）の７１７番目の 位置が突然変異したもの、または突然変異を有するＡＰＰ７７０のイソ型若しく は断片をエンコードする核酸セグメンを有する形質転換宿主。
9. ９．初代培養の若しくは不死化した真核生物の細胞株である、請求の範囲８に記 載の宿主。
10. １０．細菌である、請求の範囲８に記載の宿主。
11. １１．該セグメントが宿主のゲノム中に組込まれた、請求の範囲８に記載の宿主 。
12. １２．生殖系列中に導入されたＤＮＡセグメントを有するヒト以外の動物であり 、かつ該突然変異ＡＰＰ７７０タンパク質を発現できる、請求の範囲８に記載の 宿主。
13. １３．該突然変異ＡＰＰ７７０タンパク質が動物によって生産される単一のＡＰ Ｐ７７０タンパク質である、請求の範囲１２に記載の宿主。
14. １４．発現した際の遺伝子が動物においてアルツハイマー病の神経病理学的な特 性を促進する、７１７番自の位置が突然変異したアミロイド前駆体タンパク質７ ７０（ＡＰＰ７７０）をエンコードする異種遺伝子からなる生殖細胞若しくは体 細胞を有するヒト以外の形質転換動物。
15. １５．ヒトのアミロイド前駆体タンパク質７７０（ＡＰＰ７７０）の７１７番目 の位置が突然変異したもの、または突然変異を有するＡＰＰ７７０のイソ型若し くはＡＰＰ７７０の断片をエンコードする核酸セグメントを有する、培養された ヒトの初代培養の若しくは不死化した細胞。
16. １６．以下よりなる、アルツハイマー病を治療できる物質（ａｇｅｎｔ）のスク リーニング方法：請求の範囲８に記載の宿主に該物質（ａｇｅｎｔ）を接触させ ；さらに、突然変異ＡＰＰ７７０遺伝子によってエンコードされたタンパク質の 発現またはプロセッシングを検査する。
17. １７．被験者におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の対立遺伝子、こ れらのイソ型若しくは断片の存在を検出することからなり、該対立遺伝子がＡＰ Ｐ７７０の７１７番目のコドンに相当する位置に配列の多形性を有する、被験者 におけるアルツハイマー病の遺伝的な素質を決定するための診断方法。
18. １８．該配列の多形性がヌクレオチドの置換であり、これによってＡＰＰ７７０ の７１７番目のコドンでイソロイシンまたはグリシンに置換される、請求の範囲 １７に記載の方法。
19. １９．該配列の多形性が１個のヌクレオチドの置換である、請求の範囲１７に記 載の方法。
20. ２０．該検出段階が被験者の第２１染色体のゲノムＤＮＡのセグメントを配列決 定することからなる、請求の範囲１７に記載の方法。
21. ２１．該検出段階が（ｉ）被験者からの核酸サンプルを反応物中のＡＰＰ遺伝子 の対立遺伝子に選択的にハイブリッド形成できる１つまたはそれ以上のポリヌク レオチドプローブと混合し、さらに（ｉｉ）反応物を検査してサンプル中の遺伝 子の対立遺伝子の存在を決定し、これによって被験者がアルツハイマー病になる 危険性があるかどうかを判定する、請求の範囲１７に記載の方法。
22. ２２．１つのプローブがＡＰＰ７７０の７１７番目のコドンにわたる少なくとも 約１０ヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチドである、請求の範囲２０に 記載の方法。
23. ２３．該プローブがポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ 　ｒｅａｃｔｉｏｎ）においてポリヌクレオチドの合成を開始することができる オリゴヌクレオチドであり、反応生成物がＡＰＰ遺伝子のエキソン１７の少なく とも２５個の隣接するヌクレオチド配列を有する、請求の範囲２２に記載の方法 。
24. ２４．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがＡＰＰ７７０遺伝子のイントロン またはブランキング領域（ｆｌａｎｋｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）中に存在する配列に 特異的にハイブリッドを形成する、請求の範囲２１に記載の方法。
25. ２５．該検査段階がＰＣＲ反応物のシークエンシングゲル反応生成物（ｓｅｑｕ ｅｎｃｉｎｇ　ｇｅｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）を分析することか らなる、請求の範囲２１に記載の方法。
26. ２６．該検査段階がＰＣＲ反応物による反応生成物のＢｃｌＩ消化物のオートラ ジオグラフを分抗することからなる、請求の範囲２１に記載の方法。
27. ２７．該検査段階が（ｉ）免疫学的なアッセイにおいて被験者からのＡＰＰ７７ ０若しくはイソ型のタンパク質のサンプルを対立遺伝子に特異的な抗体試薬と混 合し、さらに（ｉｉ）アッセイを検査して抗体試薬とタンパク質サンプルとの間 の特異的な結合を測定し、これによって被験者がアルツハイマー病になる危険性 があるかどうかを判定する、請求の範囲１７に記載の方法。
28. ２８．該抗体試薬が対立遺伝子に特異的な抗原決定基と特異的に反応するモノク ローナル抗体である、請求の範囲２７に記載の方法。
29. ２９．被験者におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子のＡＰＰ７ ７０遺伝子の７１７番自のコドンにおける少なくとも１つの多形性の存在または 欠損を検出することからなるヒトの被験者の遺伝学的な分析方法。
30. ３０．被験者からのゲノムＤＮＡを少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで 消化し、得られた断片を検出用のプローブとハイブリッドを形成させることによ って該多形性を検出する、請求の範囲２９に記載の方法。
31. ３１．以下のコア配列を有する、ヒトのタンパク質を含まないポリペプチドから なる組成物； 【配列があります】［配列番号：６］ ただし、Ｘはバリン以外の２０個の既知のアミノ酸のいずれかである。
32. ３２．請求の範囲３１に記載のポリペプチドを有するヒト以外の形質転換動物。
33. ３３．該ポリペプチドが脳に存在するものである、請求の範囲３２に記載のヒト 以外の形質転換動物。
34. ３４．アルツハイマー病の遺伝学的な素質とコセグレゲートする（ｃｏｓｅｇｒ ｅｇａｔｅ）突然変異したヒトのＡＰＰ対立遺伝子をエンコードする核酸配列か らなる、単離されたポリヌクレオチド。
35. ３５．該突然変異したヒトのＡＰＰ対立遺伝子が７１７番目のコドンが突然変異 したものからなる、請求の範囲３４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
36. ３６．被験者のＤＮＡにおけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をエンコ ードする遺伝子の対立遺伝子の存在を検出することからなる方法である、アルツ ハイマー病に対する被験者の遺伝学的な素質の決定方法。
37. ３７．該検出の段階が被験者の体から除去された材料（これは戻さない）につい て行われるものである、請求の範囲３６に記載の方法。
38. ３８．該遺伝子の対立遺伝子がＡＰＰの置換による突然変異体をエンコードする 、請求の範囲３６または３７に記載の方法。
39. ３９．１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換するものである、請求の範囲３８に 記載の方法。