ES2278663T3 - Antagonistas del factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares vegf. - Google Patents

Abstract

Utilización de un antagonista del hVEGF, el cual es un receptor del hVEGF aislado, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

Description

Antagonistas del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares VEGF.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a antagonistas del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF), a composiciones terapéuticas que comprenden los antagonistas, y a procedimientos para el uso de los antagonistas con propósitos diagnósticos y terapéuticos.

Antecedentes de la invención

Los dos componentes celulares mayoritarios del sistema vascular son las células endoteliales y del músculo liso. Las células endoteliales forman el recubrimiento de la superficie interna de los vasos sanguíneos, y constituyen una interficie no trombógena entre la sangre y los tejidos. Además, las células endoteliales son un componente importante para el desarrollo de nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las células endoteliales proliferan durante la angiogénesis o la neovascularización asociadas al crecimiento tumoral y metástasis, y a una diversidad de enfermedades no neoplásicas o alteraciones.

Varios polipéptidos, que ocurren de forma natural, inducen presumiblemente la proliferación de las células endoteliales. Entre esos polipéptidos se hallan los factores ácido y básico de crecimiento de fibroblastos (FGF), Burgess y Maciag, Annual Rev. Biochem., 58:575 (1989), el factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa et al., Nature, 338:557 (1989), y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Leung et al., Science 246:1306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1198 (1989); Ferrara et al., patente publicada del PCT con el nº WO 90/13.649 (publicada el 15 de noviembre de 1990); Ferrara et al., patente estadounidense con nº de solicitud 07/360.229.

El VEGF se identificó primero en medio acondicionado por células foliculares o foliculoestrelladas de la pituitaria bovina. El análisis bioquímico indica que el VEGF bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de aproximadamente 45.000 daltones, y con una especificidad mitogénica aparente por las células endoteliales vasculares. El ADN que codifica el VEGF bovino se aisló examinando una biblioteca de cADN preparada a partir de tales células, usando oligonucleótidos basados en la secuencia de aminoácidos amino-terminal de la proteína como sondas de hibridación.

El VEGF humano se obtuvo examinando primero una biblioteca de cADN preparada a partir de células humanas, usando cADN de VEGF bovino como sonda de hibridación. Un cADN identificado de ese modo codifica una proteína de 165 aminoácidos que tiene más del 95% de homología con el VEGF bovino, proteína que se denomina como VEGF humano (hVEGF). La actividad mitogénica del VEGF humano se confirmó expresando el cADN del VEGF humano en células huésped de mamífero. El medio acondicionado por células transfectadas con el cADN de VEGF humano promovió la proliferación de células endoteliales de capilares, mientras que las células control no lo hicieron. Leung et al., Science 246:1306 (1989).

Se identificaron varios cADN adicionales en bibliotecas de cADN humano que codifican isoformas de 121, 189 y 206 aminoácidos del hVEGF (también denominadas colectivamente como proteínas relacionadas con el hVEGF). La proteína de 121 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la supresión de 44 aminoácidos entre los residuos 116 y 159 del hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la inserción de 24 aminoácidos en el residuo 116 de hVEGF, y es aparentemente idéntica al factor de permeabilidad vascular humano (hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de una inserción de 41 aminoácidos en el residuo 116 de hVEGF. Houck, et al., Mol. Endocrin. 5: 1806 (1991); Ferrara, et al., J. Cell. Biochem. 47:211 (1991); Ferrara, et al., Endocrine Reviews 13:18 (1992); Keck, et al., Science 246:1309 (1989); Connolly, et al., J. Biol. Chem. 264:20017 (1989); Keck, et al., patente de la EPO publicada nº 0.370.989 (publicada el 30 de mayo de 1990).

El VEGF no sólo estimula la proliferación de las células endoteliales vasculares, sino que también induce la permeabilidad vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de endotelio preexistente, es un componente importante de una diversidad de enfermedades y desórdenes, incluyendo el crecimiento tumoral y la metástasis, la artritis reumatoide, la psoriasis, la ateroesclerosis, la retinopatía diabética, la fibroplasia posterior del cristalino (retrolental fibroplasia), el glaucoma neovascular, los hemangiomas, el rechazo inmune del tejido de la córnea transplantado y de otros tejidos, y la inflamación crónica.

En el caso del crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición desde hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar nutrientes al tumor sólido en crecimiento. Folkman, et al., Nature 339:58 (1989). La angiogénesis también permite que los tumores estén en contacto con el lecho vascular del huésped, lo que puede proporcionar una ruta para la metástasis de las células tumorales. La evidencia del papel de la angiogénesis en la metástasis tumoral se obtiene, por ejemplo, mediante estudios que muestran la correlación entre el número y densidad de microvasos en cortes histológicos de carcinoma de mama invasor humano y la presencia efectiva de metástasis distantes. Weidner, et al., New Engl. J. Med. 324:1 (1991).

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A la vista del papel del crecimiento de las células endoteliales vasculares y de la angiogénesis, y del papel de estos procesos en múltiples enfermedades y desórdenes, es deseable disponer de medios para reducir o inhibir uno o más de los efectos biológicos del VEGF. Es también deseable disponer de medios de ensayo para la presencia de VEGF en condiciones normales y patológicas, y especialmente cáncer.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona usos, tal y como se definen en las reivindicaciones, de antagonistas del VEGF, siendo dichos antagonistas el receptor del hVEGF y las variantes del mismo. Los antagonistas inhiben la actividad mitogénica, angiogénica, u otras actividades biológicas del hVEGF, y, por tanto, son útiles para el tratamiento de los tumores, y especialmente los tumores sólidos malignos.

En otros aspectos, los antagonistas del VEGF están conjugados con una parte citotóxica.

El medicamento es para su administración a un mamífero, preferiblemente un paciente humano, que precisa de dicho tratamiento. Si se desea, el antagonista del VEGF se coadministra, bien simultánea o secuencialmente, con uno o más de otros antagonistas del VEGF, o con sustancias antitumorales o antiangiogénicas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o un anticuerpo irrelevante contra un factor del crecimiento de hepatocitos (anti-HGF), sobre la unión del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF al hVEGF.

La Figura 2 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o un anticuerpo anti-HGF irrelevante, sobre la actividad biológica del hVEGF en cultivos de células endoteliales capilares del córtex adrenal (ACE) bovino.

La Figura 3 muestra el efecto de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1) sobre la unión del hVEGF a células ACE bovinas.

La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre la velocidad de crecimiento de tumores NEG55 en ratones.

La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre el tamaño de tumores NEG55 en ratones después de cinco semanas de tratamiento.

La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores SK-LM-1 en ratones.

La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento con dosis variables de anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores A673 en ratones.

La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre el crecimiento y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en cultivo.

La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre el crecimiento y supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.

La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre la quimiotaxis de células endoteliales humanas inducida por líquido sinovial humano.

Descripción detallada de la invención

El término "hVEGF" se ha usado en la presente invención para referirse al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos, y a los factores de crecimiento de células endoteliales relacionados de 121, 189 y 206 aminoácidos, según fueron descritos por Leung, et al., Science 246:1306 (1989), y Houck, et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991), junto con las formas alélicas y procesadas, que ocurren de forma natural, de estos factores del crecimiento.

La presente invención usa antagonistas del hVEGF, tal y como se definen en las reivindicaciones, que son capaces de inhibir una o más de las actividades biológicas del hVEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o angiogénica. Los antagonistas del hVEGF actúan interfiriendo la unión del hVEGF a un receptor celular, incapacitando o matando células que han sido activadas por el hVEGF, o interfiriendo la activación de las células endoteliales vasculares después de la unión del hVEGF a un receptor celular. Todos estos puntos de intervención mediante un antagonista del hVEGF deberían considerase equivalentes para los propósitos de esta invención. Por tanto, se encuentran incluidos dentro del ámbito de la invención el receptor del hVEGF y fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos del mismo, los cuales son capaces de unir el hVEGF.

El término "receptor del hVEGF" o "hVEGFr", tal y como se usa en la presente invención, se refiere a un receptor celular del hVEGF, ordinariamente un receptor de la superficie celular que se encuentra en células endoteliales vasculares, así como variantes del mismo que retienen la capacidad de unir el hVEGF. Típicamente, los receptores del hVEGF, y las variantes de los mismos que son antagonistas del hVEGF, estarán en una forma aislada en vez de estar integrados en una membrana celular o fijados a una superficie celular, como puede ser el caso en la naturaleza. Un ejemplo de un receptor del hVEGF es la tirosina quinasa similar a fms (flt), un receptor transmembrana de la familia de las tirosina quinasas. DeVries, et al., Science 255:989 (1992), Shibuya, et al., Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión del hVEGF, mientras que el dominio intracelular está implicado en la transducción de la señal.

Otro ejemplo de un receptor del hVEGF es el receptor flk-1 (también denominado KDR). Matthews, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman, et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992).

La unión del hVEGF al receptor flt resulta en la formación de al menos dos complejos de elevado peso molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 daltones. El complejo de 300.000 daltones se cree que es un dímero que comprende dos moléculas receptoras unidas a una única molécula de hVEGF.

Las variantes del hVEGFr también se incluyen en el ámbito de la presente invención. Los ejemplos representativos incluyen las formas truncadas de un receptor en el que los dominios transmembrana y citoplasmático están suprimidos en el receptor, y las proteínas de fusión en las cuales los polímeros o polipéptidos que no son del hVEGFr están conjugados con el hVEGFr, o, preferiblemente, formas truncadas de los mismos. Un ejemplo de un polipéptido de no es hVEGF es una inmunoglobulina. Es ese caso, por ejemplo, el dominio extracelular del hVEGFr se sustituye con un dominio Fv de una cadena ligera o (preferiblemente) pesada de una inmunoglobulina, con el extremo C-terminal del dominio extracelular del receptor unido covalentemente al extremo amino-terminal del CH1, gozne, CH2 u otro fragmento de la cadena pesada. Tales variantes se preparan de la misma forma que las inmunoadhesinas conocidas. Ver, por ejemplo, Gascoigne, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84:2936 (1987); Capon, et al., Nature, 337:525 (1989); Aruffo, et al., Cell, 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 88:10535 (1991); Bennett. et al., J. Biol. Chem., 266:23060 (1991). En otras realizaciones, el hVEGFr se conjuga con un polímero no proteico tal como el polietilenglicol (PEG) (ver, por ejemplo, Davis, et al., patente estadounidense nº 4.179.337; Goodson, et al., BioTechnology 8:343-346 (1990); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3578 (1977); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3582 (1977)) o carbohidratos (ver, por ejemplo, Marshall, et al., Arch. Biochem. Biophys. 167:77 (1975)). Esto sirve para extender la vida media biológica del hVEGFr y reduce la posibilidad de que el receptor sea inmunogénico en el mamífero al cual se le administra. El hVEGFr se usa sustancialmente de la misma forma que los anticuerpos contra el hVEGF, teniendo en cuenta la afinidad del antagonista y su valencia por el hVEGF.

El dominio extracelular del receptor del hVEGF, bien por sí mismo o unido a un polipéptido de inmunoglobulina u otro polipéptido portador, es especialmente útil como antagonista del hVEGF, gracias a su capacidad para secuestrar hVEGF que está presente en una célula huésped pero que no está unido a hVEGFr sobre una superficie celular.

El término "recombinante", usado en referencia al hVEGF, al receptor de hVEGF, a los anticuerpos monoclonales, y otras proteínas, se refiere a proteínas que se producen mediante expresión de cADN recombinante en una célula huésped. La célula huésped puede ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una célula de levadura o de mamífero).

Conjugados con partes citotóxicas

En algunas realizaciones es deseable proporcionar una parte citotóxica conjugada con el hVEGFr. En estas realizaciones, la citotoxina sirve para incapacitar o matar células que están expresando o uniendo hVEGF. El conjugado es dirigido hacia la célula por el dominio, el cual es capaz de unirse a hVEGF, hVEGFr, o al complejo hVEGF-hVEGFr. Por tanto, el hVEGFr se conjuga a una citotoxina. No es necesario, en esta realización, que el receptor sea capaz de nada más que de unirse al hVEGF o al complejo hVEGF-hVEGFr.

Típicamente, la citotoxina es una citotoxina proteica, por ejemplo, la difteria, ricina, o la toxina de pseudomonas. No obstante, la citotoxina no necesita ser proteica, y puede incluir agentes quimioterapéuticos empleados a partir de ahora, por ejemplo, en el tratamiento de tumores.

La citotoxina está habitualmente unida a un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, mediante un enlace amida de la estructura (backbone amide bond) dentro de (o en lugar de parte o de la totalidad de) el dominio Fc del anticuerpo. Cuando la función de dirigir la proporciona el hVEGFr, la porción citotóxica se sustituye sobre cualquier dominio del receptor que no participe en la unión del hVEGF; preferiblemente, la porción se sustituye en lugar de o sobre los dominios transmembrana y/o citoplasmático del receptor. El sitio de sustitución óptimo se determinará mediante experimentación rutinaria, y se incluye entre los conocimientos ordinarios.

Los conjugados que son fusiones de proteínas se construyen fácilmente mediante cultivo de células recombinantes y expresión de un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los conjugados se construyen mediante entrecruzamiento covalente de la porción citotóxica a la cadena lateral de un residuo aminoácido, o al carboxilo C-terminal del anticuerpo o del receptor, usando procedimientos conocidos per se, tales como el intercambio de disulfuro, o el engarce a través de un enlace tioéster usando, por ejemplo, iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimadato.

Conjugados con otras porciones

Los hVEGFr que son antagonistas del hVEGF también se conjugan a sustancias que no pueden clasificarse fácilmente como citotoxinas en sentido estricto, pero que aumentan la actividad de las composiciones en la presente invención. Por ejemplo, se fusionan hVEGFr, capaces de unirse al hVEGF o al complejo hVEGF-hVEGFr, con polipéptidos heterólogos, tales como secuencias virales, con receptores celulares, con citoquinas tales como TNF, interferones, o interleucinas, con polipéptidos que tienen una actividad procoagulante, y con otros polipéptidos activos biológica o inmunológicamente. Tales fusiones se consiguen fácilmente mediante procedimientos recombinantes. Típicamente, tales polipéptidos que no son de inmunoglobulina se sustituyen por el dominio transmembrana y/o intracelular de un hVEGFr.

La observación de que el hVEGF parece ser capaz de formar un complejo con dos o más moléculas del hVEGFr sobre la superficie de una célula sugiere que el hVEGF tiene al menos dos sitios discretos para unirse al hVEGFr, y que se une a tales receptores celulares de forma secuencial, primero en un sitio y a continuación en el otro, antes de que ocurra la activación, de la forma en que lo hacen la hormona del crecimiento, la prolactina y similares (ver, por ejemplo, Cunningham, et al., Science 254:821 (1991); deVos, et al., Science 255:306 (1992); Fuh, et al., Science 256:1677 (1992)). En consecuencia, se seleccionan variantes antagonistas del hVEGF en las que un sitio de unión al receptor del hVEGF (típicamente, el sitio implicado en la unión inicial del hVEGF al hVEGFr) permanece inalterado (o, si se modifica, se varía para mejorar su unión), mientras que un segundo sitio de unión al receptor del hVEGF típicamente se modifica mediante sustitución o sustituciones no conservadoras de residuos aminoácidos, o mediante supresión o supresiones, con objeto de hacer no operativo el sitio de unión.

Los dominios de unión en el hVEGF y los dominios unidores del hVEGF en el hVEGFr se determinan mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los estudios con rayos X, los análisis de mutaciones, y los estudios de unión a anticuerpos. Las estrategias de mutaciones incluyen las técnicas de mutagénesis de saturación aleatoria acoplada con la selección de mutantes de fuga, y la mutagénesis por inserción. Otra estrategia apropiada para identificar los dominios de unión al receptor en los ligandos se conoce como mutagénesis por barrido con alanina (Ala). Cunningham, et al., Science 244:1081-1085 (1989). Este procedimiento implica la identificación de regiones que contienen cadenas laterales de aminoácidos cargadas. Los residuos cargados en cada región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son remplazados (una región por molécula mutante) con Ala, y se ensaya la unión al receptor de los ligandos obtenidos, para verificar la importancia de la región concreta en la unión al receptor. Un potente procedimiento adicional para la localización de los dominios de unión al receptor es a través del uso de anticuerpos anti-hVEGF neutralizantes. Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992). Habitualmente se usa una combinación de éstos y similares procedimientos para localizar los dominios implicados en la unión al receptor.

El término "variante de la secuencia de aminoácidos" usado en referencia al hVEGF se refiere a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere hasta cierto punto de las secuencias de aminoácidos de las formas nativas del hVEGF. Ordinariamente, las variantes de la secuencias de aminoácidos antagonistas poseerán al menos aproximadamente el 70% de homología con al menos un dominio unidor al receptor de un hVEGF nativo, y preferiblemente, serán aproximadamente el 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% homólogas con un dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos del hVEGF nativo, de tal forma que las variantes retienen la capacidad para unirse al receptor del hVEGF (y, por tanto, para competir con el hVEGF nativo por la unión al receptor del hVEGF), pero no consiguen inducir uno o más de los efectos biológicos del hVEGF, tales como la proliferación de las células endoteliales, la angiogénesis, o la permeabilidad vascular.

"Homología" se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es preciso, para conseguir el máximo porcentaje de homología. Los procedimientos y programas de ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Uno de tales programas es el "Align 2" escrito por Genentech, Inc., el cual se registró con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, el 10 de diciembre de 1991. Las variantes por sustitución son aquellas que tiene al menos un residuo aminoácido en una secuencia nativa suprimido y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser simples, en las que sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma molécula.

Las variantes por inserción son aquéllas que tienen uno o más aminoácidos insertados de forma inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición determinada en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado, bien al grupo funcional \alpha-carboxilo o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes por supresión son aquéllas con uno o más residuos aminoácidos suprimidos en una secuencia de aminoácidos. Ordinariamente, las variantes por supresión tienen uno o dos residuos aminoácidos suprimidos en una región determinada de la molécula.

Los fragmentos y las variantes de la secuencia de aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a un sitio del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en un vector de expresión apropiado, y a continuación se transfectan las células huéspedes con el vector recombinante. Las células huéspedes recombinantes se cultivan en medios de cultivo apropiados, y el fragmento deseado o la variante de la secuencia de aminoácidos expresados en las células huéspedes se recuperan entonces del cultivo de células recombinantes mediante procedimientos cromatográficos u otros procedimientos de purificación.

Alternativamente, los fragmentos y variantes de aminoácidos del hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo, mediante proteolisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis usando procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida, tal y como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)), aunque pueden usarse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido, acoplando un \alpha-aminoácido protegido a una resina apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando técnicas bien conocidas en el campo para la formación de enlaces peptídicos.

Usos terapéuticos

Para las aplicaciones terapéuticas, los antagonistas de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquéllas que pueden administrarse a un humano intravenosamente como un bolo, o mediante infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante ruta intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o de inhalación. Los antagonistas también se administran de forma apropiada mediante ruta intratumoral, peritumoral, intralesión, o perilesión, para ejercer efectos terapéuticos locales, así como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal sea especialmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovarios.

Tales formas de dosificación abarcan portadores farmacéuticamente aceptables que son, de forma inherente, no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen los intercambiadores de iones, la alúmina, el estearato de aluminio, la lecitina, las proteínas del suero, tales como la albúmina de suero humano, sustancias tamponantes, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicérido de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos tales como el sulfato de protamina, el fosfato hidrógeno de disodio, el fosfato hidrógeno de potasio, el cloruro sódico, las sales de zinc, el sílice coloidal, el trisilicato de magnesio, la polivinilpirrolidona, las sustancias basadas en la celulosa, y el polietilenglicol. Los portadores para formas tópicas o basadas en gel del antagonista incluyen polisacáridos tales como la carboximetilcelulosa sódica o la metilcelulosa, la polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros del bloque polioxietileno-polioxipropileno, el polietilenglicol, y los alcoholes de ceras de madera. Para todas las administraciones se usan apropiadamente formas de almacenamiento convencionales. Tales formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nano-cápsulas, liposomas, emplastos, formas para inhalación, vaporizadores nasales, tabletas sublinguales, y preparaciones de liberación sostenida. El antagonista se formulará típicamente en tales vehículos a una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), tal y como los describen Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), o poli(vinilalcohol), poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.619), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547 (1983)), etilenvinilacetato no degradable (Langer et al., ver más arriba), copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico, tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como el etilvinilacetato u el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más breves. Cuando los antagonistas polipeptídicos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar a resultas de la exposición a humedad a 37ºC, lo que resulta en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden desarrollar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los residuos sulfhidrilos, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímeros.

Las composiciones de antagonista del hVEGF de liberación sostenida también incluyen los hVEGFr atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen los antagonistas se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); patente estadounidense nº 4.485.045; patente estadounidense nº 4.544.545. Ordinariamente los liposomas son pequeños (aproximadamente 200-800 angstroms), del tipo unilamelar, en los que el contenido lipídico es superior a aproximadamente el 30% molar de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia HRG óptima. En la patente estadounidense nº 5.013.556 se descubren liposomas con tiempos de circulación mejorados.

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Otro uso de la presente invención comprende la incorporación de un antagonista del hVEGF en artículos moldeados. Tales artículos pueden usarse para modular el crecimiento de las células endoteliales y la angiogénesis. Además, la invasión del tumor y la metástasis pueden modularse con estos artículos.

La dosificación apropiada del antagonista, para la prevención o tratamiento de una enfermedad, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal y como se define más arriba, la gravedad y el curso de la enfermedad, tanto si los anticuerpos se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente, y la respuesta al antagonista, y la opinión del médico que lo atienda. El antagonista se administra apropiadamente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Los antagonistas del hVEGF son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y alteraciones neoplásicas. Los neoplasmas y condiciones relacionadas que son tratables incluyen los carcinomas de mama, los carcinomas de pulmón, los carcinomas gástricos, los carcinomas esofágicos, los carcinomas colorectales, los carcinomas hepáticos, los carcinomas ováricos, los tecomas, los arrenoblastomas, los carcinomas cervicales, los carcinomas endometriales, la hiperplasia endometrial, la endometriosis, los fibrosarcomas, los coriosarcomas, el cáncer de cabeza y cuello, el carcinoma nasofaríngeo, los carcinomas laringeales, los hepatoblastomas, el sarcoma de Kaposi, los melanomas, los carcinomas de la piel, los hemangiomas, los hemangiomas cavernosos, los hemangioblastomas, los carcinomas de páncreas, los retinoblastomas, los astrocitomas, los glioblastomas, los Schwannomas, los oligodendrogliomas, los meduloblastomas, los neuroblastomas, los rabdomiosarcomas, los sarcomas osteogénicos, los leiomiosarcomas, los carcinomas del tracto urinario, los carcinomas de tiroides, los tumores de Wilm, los carcinomas de células renales, los carcinomas de próstata, la proliferación vascular anormal asociada con la facomatosis, los edemas (tales como los asociados con tumores cerebrales), y el síndrome de Meig.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente desde 1 \mug/kg hasta 15 mg/kg de antagonista es una dosis inicial candidata para la administración al paciente, bien sea, por ejemplo, mediante una o varias administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días, o más, dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que ocurre la supresión deseada de síntomas de la enfermedad. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, la imaginología radiográfica de tumores.

Según otra realización de la invención, la efectividad del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad puede mejorarse administrando el antagonista en serie, o en combinación con otro agente que es efectivo para esos propósitos, tal como el factor de la necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor ácido o básico del crecimiento de fibroblastos (FGF), o del factor del crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor de tejido, proteína C, o proteína S (ver Esmon, et al., patente publicada del PCT nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), o uno o más agentes terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, triazol-nucleósidos, o corticoesteroides. Tales otros agentes pueden estar presentes en la composición que se está administrando, o pueden administrarse de forma separada. También, el antagonista se administra de forma apropiada en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, no importa si implican irradiación o administración de sustancias radioactivas.

En una realización, la vascularización del tumor se ataca mediante terapia combinada. Se administran uno o más antagonistas del hVEGF, a pacientes que tienen un tumor, en dosis terapéuticamente efectivas, según se determina, por ejemplo, observando la necrosis del tumor o de su foco metastásico, si hay alguno. Esta terapia se continua hasta el momento en que no se observa ningún efecto beneficioso ulterior, o hasta que el examen clínico no muestra trazas del tumor o de ningún foco metastático. A continuación, se administra TNF, sólo o en combinación con un agente auxiliar, tal como el alfa-, beta-, o gamma-interferón, el anticuerpo anti-HER2, la heregulina, un anticuerpo anti-heregulina, el factor D, la interleucina-1 (IL-1), la interleucina-2 (IL-2), el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o agentes que promueven la coagulación microvascular en tumores, tales como el anticuerpo anti-proteína C, el anticuerpo anti-proteína S, o la proteína unidora del C4b (ver Esmon, et al., patente publicada del PCT nº W0 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), o el calor, o la radiación.

Puesto que los agentes auxiliares variarán en su efectividad, es deseable comparar su impacto sobre el tumor examinando la matriz de forma convencional. La administración de antagonista del hVEGF y del TNF se repite hasta que se consigue el efecto clínico deseado. Alternativamente, el(los) antagonista(s) del hVEGF se administra(n) junto con el TNF y, opcionalmente, agente(s) auxiliar(es). En los casos en que los tumores sólidos se hallan en las extremidades o en otras ubicaciones susceptibles de estar aisladas de la circulación general, los agentes terapéuticos descritos en la presente invención se administran al tumor u órgano aislado. En otras realizaciones, se administra un antagonista del FGF o del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tal como un anticuerpo neutralizante anti-FGF o anti-PDGF, conjuntamente con el antagonista del hVEGF. El tratamiento con antagonistas del hVEGF puede suspenderse óptimamente durante períodos de cicatrización de heridas o de neovascularización deseable.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente a modo de ilustración, y no se pretende que limiten la invención en modo alguno.

Ejemplo 1 Preparación de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF

Para obtener hVEGF conjugado a hemocianina de lapa "ojo de cerradura" (keyhole limpet) (KLH) para la inmunización, se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung, et al., Science 246:1306 (1989), con KLH en una proporción de 4:1, en presencia de 0,05% de glutaraldehído, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas con agitación suave. A continuación se dializó la mezcla frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC, durante la noche.

Se inmunizaron ratones Balb/c cuatro veces cada dos semanas mediante inyecciones intraperitoneales con 5 \mug de hVEGF conjugado a 20 \mug de KLH, y se potenciaron con la misma dosis de hVEGF conjugado a KLH cuatro días antes de la fusión celular.

Las células de bazo procedentes de los ratones inmunizados se fusionaron con células de mieloma P3X63Ag8U.1, Yellon. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), usando polietilenglicol (PEG) al 35% según se describe. Yarmush, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2899 (1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.

Los sobrenadantes procedentes de los cultivos celulares se examinaron en busca de producción de anticuerpo anti-hVEGF mediante un ensayo de ELISA, usando placas de microvaloración recubiertas con hVEGF. El anticuerpo que se había unido al hVEGF en cada uno de los pocillos se determinó usando inmunoglobulina IgG anti-ratón, de cabra, conjugada con fosfatasa alcalina, y el sustrato cromagénico p-nitrofenilfosfato. Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratoy, 1988). Las células de hibridoma, que se determinó de este modo que producían anticuerpos anti-hVEGF, se subclonaron mediante dilución limitada, y dos de estos clones, denominados A4.6.1 y B2.6.2, se escogieron para estudios ulteriores.

Ejemplo 2 Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A. Especificidad del antígeno

Las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de microvaloración que previamente se habían recubierto con hVEGF, FGF, HGF, o factor de crecimiento epidermal (EGF). El anticuerpo unido se detectó con inmunoglobulinas IgG de cabra anti-ratón conjugadas con peroxidasa. Los resultados de esos ensayos confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al hVEGF, pero no, de forma detectable, a los otros factores de crecimiento proteicos.

B. Mapado del epítopo

Se usó un ELISA competitivo para determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unían a los mismos o distintos epítopos (sitios) con el hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun. 57:944 (1989). Se añadieron los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF individuales sin marcar (A4.6.1 o B2.6.2) o anticuerpo irrelevante anti-HGF (isotipo IgG1) a los pocillos de placas de microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF. A continuación se añadieron anticuerpos monoclonales anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1 o BIO-B2.6.2). La proporción de anticuerpo biotinilado respecto el anticuerpo sin marcar fue de 1:1000. La unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó mediante la adición de peroxidasa conjugada con avidina, seguida por o-fenilenediamina dihidrocloruro y peróxido de hidrógeno. El color de la reacción, que indica la cantidad de anticuerpo biotinilado hallada, se determinó midiendo la densidad óptica (O.D.) a la longitud de onda de 495 nm.

Tal y como se muestra en la Figura 1, en cada caso, la unión del anticuerpo biotinilado anti-hVEGF fue inhibida por el correspondiente anticuerpo sin marcar, pero no por el otro anticuerpo anti-hVEGF sin marcar o el anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a epítopos diferentes del hVEGF.

C. Isotipado

Los isotipos de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras del medio de cultivo (sobrenadante), en el que estaban creciendo cada uno de los hibridomas, a los pocillos de placas de microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF capturados se incubaron con diferentes inmunoglobulinas anti-ratón de cabra, conjugadas con fosfatasa alcalina, específicas para cada isotipo, y la unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF se determinó mediante la adición de p-nitrofenilfosfato. El color de la reacción se midió a 405 nm con un lector de placas de ELISA.

Mediante este procedimiento, se determinó el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por ambos hibridomas A4.6.1 y B2.6.2.

D. Afinidad de unión

Las afinidades de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinó mediante ensayos de unión competitiva. Se añadió una concentración predeterminada subóptima de anticuerpo monoclonal a muestras que contenían 20.000-40.000 c.p.m. de ^{126}I-hVEGF (1-2 ng) y varias cantidades conocidas de hVEGF sin marcar (1-1000 ng). Transcurrida 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100 \mul de antisuero Ig anti-ratón de cabra (Pel-Freez, Rogers, AR, EE.UU.), y se incubaron las mezclas otra hora a temperatura ambiente. Los complejos de anticuerpo y proteína unida (complejos inmunes) se precipitaron mediante la adición de 500 \mul de polietilenglicol al 6% (PEG, peso molecular 8000) a 4ºC, seguida por centrifugación a 2000 x G. durante 20 minutos a 4ºC. La cantidad de ^{126}I-hVEGF unida al anticuerpo monoclonal anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el material apelotonado en un contador gamma.

Las constantes de afinidad se calcularon a partir de los datos mediante análisis de Scatchard. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 era de 1,2 \times 10^{9} litros/mol. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma B2.6.2 era de 2,5 \times 10^{9} litros/mol.

E. Inhibición de la actividad mitogénica del hVEGF

Se sembraron células endoteliales capilares del córtex adrenal (ACE) bovino, Ferrara. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml en 12 placas multipocillo, y se añadieron 2,5 ng/ml de hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de varias concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal anti-HGF irrelevante. Después de cultivarlas durante 5 días, se contaron las células en cada pocillo con un contador Coulter. Como control, se cultivaron células ACE en ausencia de hVEGF añadido.

Tal y como se muestra en la Figura 2, ambos anticuerpos monoclonales anti-hVEGF inhibieron la capacidad del hVEGF añadido para soportar el crecimiento o supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad mitogénica del hVEGF (más del 90% de inhibición), mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2 sólo inhibía parcialmente la actividad mitogénica del hVEGF.

F. Inhibición de la unión del hVEGF

Las células ACE bovinas se sembraron a una densidad de 2,5 \times 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas de microvaloración de 24 pocillos, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero bovino, glutamina 2 mM, y 1 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos. Después de cultivarlas durante la noche, se lavaron las células una vez en tampón de unión (volúmenes iguales de DMEM y medio F12, más HEPES 25 mM y 1% de albúmina de suero bovino) a 4ºC.

Se preincubaron 12.000 c.p.m. de ^{126}I-hVEGF (aproximadamente 5 \times 10^{4} c.p.m./ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1 (volumen total de 250 ml), y, a continuación, se añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en las placas de microvaloración. Después de incubar las células durante 3 horas a 4ºC, se lavaron las células 3 veces con tampón de unión a 4ºC, se solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N, y se contaron en un contador gamma.

Tal y como se muestra en la Figura 3 (superior), los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a las células ACE bovinas. Por contra, el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no tenía un efecto aparente sobre la unión del hVEGF a las células ACE bovinas. De forma consistente con los resultados obtenidos en el ensayo de proliferación celular descrito más arriba, en anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión del hVEGF a un nivel superior que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2.

Tal y como se muestra en la Figura 3 (inferior), el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la unión del hVEGF a las células ACE bovinas, a una proporción molar 1:250 de hVEGF respecto el anticuerpo.

G. Reactividad cruzada con otras isoformas VEGF

Para determinar si el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 reacciona con las formas del hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, se ensayó la capacidad del anticuerpo de inmunoprecipitar esos polipéptidos.

Se transfectaron células 293 humanas con vectores que incluían la secuencia codificante de nucleótidos de los polipéptidos de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, tal y como se describe en Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dos días después de la transfección, se transfirieron las células a medio que carecía de cisteína y metionina. Se incubaron las células 30 minutos en ese medio, y a continuación se añadieron al medio 100 \muCi/ml de cada uno de ^{36}S-metionina y ^{36}S-cisteína, y se incubaron las células otras dos horas. El marcaje se cazó transfiriendo las células a medio sin suero e incubando durante tres horas. Se recolectó el medio de cultivo, y se lisaron las células mediante incubación durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM; 1% de NP40, 0,5% de deoxicolato, 0,1% de sodiododecilsulfato (SDS), Tris 50 mM, pH 8,0). Los restos celulares se suprimieron mediante centrifugación a 200 \times G. durante 30 minutos.

Se incubaron muestras de 500 \mul de los medios de cultivo y de los lisados de células con 2 \mul de anticuerpo del hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora a 4ºC, y a continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG anti-ratón de cabra durante 1 hora a 4ºC. Los complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{36}S y anticuerpo monoclonal anti-hVEGF se precipitaron con Sepharosa de proteína A (Pharmacia), se sometieron a continuación a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 12% en condiciones reductoras. Se expuso el gel a película para rayos X para el análisis mediante autoradiografía de las proteínas radiomarcadas inmunoprecipitadas.

Los resultados del análisis indican que el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 presentaba reacción cruzada con ambos, los formas de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF.

Ejemplo 3 Preparación de la proteína de fusión receptor del hVEGF-IgG

Las secuencias codificantes de nucleótidos y aminoácidos del receptor flt de hVEGF se descubren en Shibuya, et al., Oncogene 5:519-524 (1990). La secuencia codificante del dominio extracelular del receptor flt del hVEGF se fusionó en un proceso de dos pasos a la secuencia codificante de la cadena pesada de IgG1 humana.

Se usó la mutagénesis dirigida contra un sitio para introducir un sitio de restricción BstBI en el ADN que codificaba el flt, en un sitio 5' respecto el codón para el aminoácido 759 del flt, y para convertir el único sitio BstEII en el plásmido pBSSK FC, Bennett, et at., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991), en un sitio BstBI. El plásmido modificado se digirió con EcoRI y BstBI, y el gran fragmento resultante de ADN plasmídico se ligó junto con un fragmento EcoRI-BstBI del ADN de flt que codificaba el dominio extracelular (aminoácidos 1-758) del receptor flt del hVEGF.

Se digirió la construcción resultante con CalI y NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, que a continuación se inserta mediante ligación en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión en mamíferos pHEB02 (Leung, et al., Neuron 8:1045 (1992). Los extremos del fragmento de 3,3 kb se modifican, por ejemplo, mediante la adición de eslabones, para obtener la inserción del fragmento en el vector en la posición correcta para su expresión.

Se transfectaron células huésped de mamífero (por ejemplo, células CEN4 (Leung, et al., ver más arriba) con el plásmido pHEB02, que contenía el inserto flt, mediante electroporación. Las células transfectadas se incubaron en medio que contenía aproximadamente un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, y antibióticos, y, a aproximadamente un 75% de confluencia, se transfirieron a medio sin suero. Se acondiciona el medio durante 3-4 días antes de su recolecta, y la proteína de fusión flt-IgG se purifica a partir del medio acondicionado mediante cromatografía sobre una matriz de afinidad de proteína A, esencialmente según se describe en Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991).

Ejemplo 4 Inhibición del crecimiento tumoral con antagonistas de hVEGF

Se ensayaron mediante ELISA varias líneas celulares tumorales humanas, que crecían en cultivos, en busca de la producción de hVEGF. Se halló que las líneas celulares de tumores de ovarios, pulmón, colon, gástricos, mama, y de cerebro producían hVEGF. Se usaron para estudios ulteriores tres líneas celulares que producían hVEGF: NEG 55 (también conocida como G55) (línea celular de glioma humano, procedente del Dr. M. Weslphal, Departamento de Neurocirugía, Hospital Universitario de Eppendor, Hamburgo, Alemania, también denominada como G55), A-673 (línea celular de rabdomiosarcoma humano, obtenida del The American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU., 20852, como línea celular número CRL 1598), y SK-LMS-1 (línea celular de leiomiosarcoma, obtenida del ATCC como línea celular número HTB 88).

Se inyectaron subcutáneamente ratones "Beige/nude" hembra (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts, EE.UU.), de seis a diez semanas de edad, con 1-5 \times 10^{8} células tumorales en 100-200 \mul de PBS. A diversos intervalos después de que se estableciera el crecimiento del tumor, se inyectaron los ratones intraperitonealmente una o dos veces por semana con varias dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1, un anticuerpo monoclonal anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño del tumor se midió cada semana, y a la conclusión del estudio se extrajeron los tumores y se pesaron.

El efecto de diversas cantidades del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento de los tumores de NEG 55 en ratones se muestra en las Figuras 4 y 5. La Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug ó 100 \mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1, empezando una semana después de la inoculación de células NEG 55, tenía una velocidad de crecimiento tumoral sustancialmente reducida en comparación con ratones tratados, bien con el anticuerpo irrelevante, bien con PBS. La Figura 5 muestra que cinco semanas después de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en los ratones tratados con anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente del 50% (en el caso de los ratones tratados con dosis de 25 \mug de anticuerpo) al 85% (en el caso de los ratones tratados con dosis de 100 \mug de anticuerpo) inferior al tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o PBS.

El efecto del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento de tumores SK-LMS-1 en ratones se muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de las células SK-LMS-1, el tamaño promedio de los tumores en los ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente un 75% inferior que el tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o PBS.

El efecto del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento de tumores A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas después de la inoculación de las células A673, el tamaño promedio de los tumores en los ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente del 60% (en el caso de ratones tratados con dosis de 10 \mug de anticuerpo) hasta más del 90% (en el caso de ratones tratados con dosis de 50-400 \mug de anticuerpo) inferior al tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o PBS.

Ejemplo 5 Análisis del efecto directo del anticuerpo anti-hVEGF sobre el crecimiento de las células tumorales en cultivo

Se sembraron células de glioblastoma humano NEG55 o células de rabdomiosarcoma A673 a una densidad de 7 \times 10^{3} células/pocillo en placas multipocillos (12 pocillos/placa), en medio F12/DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, y antibióticos. A continuación, se añadió el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 a los cultivos de células hasta una concentración final de 0-20,0 \mug de anticuerpo/ml. Transcurridos cinco días, se disociaron las células que crecían en los pocillos mediante exposición a tripsina, y se contaron en un contador Coulter.

Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de esos estudios. Como es evidente, el anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 no tienen ningún efecto significativo sobre el crecimiento de las células NEG55 o A673 en cultivo. Estos resultados indican que el anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1. no es citotóxico, y sugiere con fuerza que los efectos antitumorales del anticuerpo observados se deben a su inhibición de la neovascularización mediada por VEGF.

Ejemplo 6 Efecto del anticuerpo anti-hVEGF sobre la quimiotaxis de las células endoteliales

La quimiotaxis de las células endoteliales y de otras células, incluyendo monocitos y linfocitos, juega un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide. La migración de células endoteliales y la proliferación acompañan la angiogénesis que ocurre en la sinovia reumatoide. El tejido vascularizado (pannus) invade y destruye el cartílago articular.

Para determinar si los antagonistas del hVEGF interfieren con este proceso, ensayamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 sobre la quimiotaxis de las células endoteliales, estimulada por el fluido sinovial procedente de pacientes con artritis reumatoide. Como control, también ensayamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 sobre la quimiotaxis de las células endoteliales, estimulada por fluido sinovial procedente de pacientes con osteoartritis (la angiogénesis que ocurre en la artritis reumatoide no ocurre en la osteoartritis).

La quimiotaxis de las células endoteliales se ensayo usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con procedimientos establecidos. Thompson, et al., Cancer Res. 51:2670 (1991); Phillips, et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197:458 (1991). Aproximadamente 10^{4} células endoteliales de la vena umbilical humana se dejaron adherir a filtros recubiertos con gelatina (0,8 micras de tamaño de poro) en microcámaras multipocillo de 48 pocillos, en medio de cultivo que contenía un 0,1% de suero fetal bovino. Transcurridas aproximadamente dos horas, se invirtieron las cámaras, y se añadieron a los pocillos las muestras de ensayo (fluido sinovial de la artritis reumatoide, fluido sinovial de la osteoartritis, FGF básico (bFGF) (hasta una concentración de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 (hasta una concentración final de 109 \mug/ml). Transcurridas de dos a cuatro horas, las células que habían migrado se tiñeron y contaron.

La Figura 10 muestra los resultados promediados de estos estudios. Los valores mostrados en la columna marcada "Fluido sinovial", y los mostrados al pie de página para los controles, son el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS sólo. Los valores en la columna marcada "Fluido sinovial + mAB VEGF" son el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial más anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 añadido. Los valores en la columna marcada "% de supresión" indican el porcentaje de reducción, en la migración de células endoteliales inducida por el fluido sinovial, que resulta de la adición del anticuerpo anti-hVEGF. Como se indica, el anticuerpo anti-hVEGF inhibió significativamente la capacidad del fluido sinovial de la artritis reumatoide (53,40 de promedio de porcentaje de inhibición), pero no la del fluido sinovial de la osteoartritis (13,64 de promedio de porcentaje de inhibición), para inducir la migración de las células endoteliales.

Claims (18)

1. Utilización de un antagonista del hVEGF, el cual es un receptor del hVEGF aislado, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la cual se suprimen los dominios transmembrana y citoplasmático del receptor.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la cual el receptor del hVEGF aislado consiste en el dominio extracelular de un receptor del hVEGF.

4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual el receptor del hVEGF es el receptor flt.

5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la cual el receptor del hVEGF es el receptor KDR.

6. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual el antagonista del hVEGF se usa en una cantidad suficiente para reducir el tamaño de un tumor.

7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual el tumor es un tumor maligno sólido.

8. Utilización según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en las cuales el antagonista del hVEGF reduce el tamaño del tumor mediante inhibición de la neovascularización mediada por el VEGF.

9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las cuales el receptor del hVEGF está fusionado a un polipéptido portador.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la cual el polipéptido portador es un polipéptido de inmunoglobulina.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la cual la inmunoglobulina es la IgG.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la cual el antagonista del hVEGF es una proteína de fusión flt-IgG.

13. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual el antagonista del hVEGF está acoplado a una porción citotóxica.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la cual la porción citotóxica es una proteína citotóxica.

15. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual el receptor del hVEGF está conjugado con un polímero no proteico.

16. Utilización según la reivindicación 14, en la cual el polímero es polietilenglicol.

17. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual el medicamento está formulado de manera que permite que sea administrado en serie o en combinación con otro agente para el tratamiento del cáncer.

18. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la cual el medicamento está formulado de manera que permite que sea administrado en serie o en combinación con tratamientos radiológicos.