ES2289351T3 - Vesiculas de membranas externas bacterianas mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la elaboración de una preparación de vesículas de membranas externas a partir de una bacteria, en el que la membrana bacteriana es sustancialmente rota en ausencia de detergente de desoxicolato y la bacteria sobreexpresa TbpA.
Description
Vesículas de membranas externas bacterianas
mejoradas.
Esta invención pertenece al campo de la
preparación de vesículas para fines de inmunización.
Una de las diversas aproximaciones a la
inmunización frente a una infección de N. meningitidis es
usar vesículas de membranas externas (OMVs). Una vacuna de OMV
eficaz frente al serogrupo B ha sido producida por el instituto
Nacional Noruego de la Sanidad Pública [por ejemplo, referencia 1]
pero, aunque está vacuna es segura y previene la enfermedad MenB,
su eficacia está limitada a la cepa usada para preparar la
vacuna.
La vacuna "RIVM" esta basada en vesículas
que contienen seis subtipos diferentes de PorA y se ha mostrado que
es inmunógena en niños en ensayos clínicos de fase II. [2].
La referencia 3 describe una vacuna contra
diferentes serotipos patógenos de meningococo del serogrupo B basada
en OMV que retiene un complejo de proteínas de 65 kDa. La
referencia 4 describe una vacuna que comprende OMV de cepas
meningocócicas tratadas por ingeniería genética, en las que las OMVs
comprenden: al menos una proteína de membrana externa (OMP) de
clase 1 pero que no comprende OMP de clase 2/3. La referencia 5
describe OMVs que comprenden OMPs que tienen mutaciones en sus
bucles superficiales y OMVs que comprenden derivados de
lipopolisacárido meningocócico (LPS).
La referencia 6 describe composiciones que
comprenden OMVs complementadas con proteínas de unión de
transferrina (por ejemplo, TbpA y TbpB) y/o
superóxido-dismutasa Cu, Zn. La referencia 7
describe composiciones que comprenden OMVs complementadas con
diversas proteínas. La referencia 8 describe preparaciones de
vesículas de membranas obtenidas a partir de N. meningitidis
con un gen furK modificado.
Además de N. meningitidis del serogrupo
B, han sido preparadas vesículas a partir de otras bacterias. La
referencia 9 describe un procedimiento para preparar vacunas basadas
en OMV para meningococos del serogrupo A. Las referencias 10 y 11
describen vesículas a partir de N. gonorrhoeae. La Referencia
12 describe preparaciones de vesículas a partir de N.
lactamica. Han sido preparadas también vesículas a partir de
Moraxella catarrhalis [13,14], Shigella flexneri
[15,16], Pseudomonas aeruginosa [15,16], Porphyromonas
gingivalis [17], Treponema pallidum [18], Haemophilus
influenzae [19 y 20] y Helicobacter pylori [21].
Un inconveniente de las preparaciones de
vesículas bacterianas es que no están presentes agentes protectores
importantes. Para retener antígenos como nspA en
preparaciones de OMV, la referencia 20 expone que la expresión de
NspA debe ser sobrerregulada con una desactivación concomitante de
porA y cps. Es un objeto de la invención proporcionar
preparaciones de vesículas adicionales y mejoradas, junto con
procedimientos para su elaboración. En particular, es un objeto de
la invención proporcionar vesículas que retengan componentes
inmunógenos bacterianos importantes a partir de N.
meningitidis.
Los métodos de la técnica anterior para la
preparación de OMV meningocócicos incluyen el uso de un detergente
durante la rotura de la membrana bacteriana [por ejemplo, véase la
referencia 22, en la que se usa un detergente de desoxicolato]. La
invención está basada en el descubrimiento sorprendente de que la
rotura de la membrana sustancialmente en ausencia de detergente da
lugar a OMVs que retienen importantes componentes inmunógenos
bacterianos, particularmente (i) la proteína de superficie de NspA
protectora, (ii) la proteína "287" y (iii) la proteína
"741".
Por lo tanto, la invención proporciona un
procedimiento para la elaboración de una preparación de vesículas
de membranas externas a partir de una bacteria, en la que la
membrana de bacteria es rota sustancialmente en ausencia de
detergente. Se proporcionan también preparaciones de OMVs que pueden
ser obtenidas mediante procedimientos de la invención.
Para la obtención de vesículas de NspA^{+ve},
el procedimiento de la invención es mucho más sencillo que realizar
las múltiples manipulaciones genéticas descritas en la referencia
20.
El procedimiento de la invención incluirá
normalmente las siguientes etapas básicas (a) tratar células
bacterianas en ausencia sustancial de detergente; (b) centrifugar
la composición de la etapa (a) para separar las vesículas de las
membranas externas de las células tratadas y el debris celular y
recoger la materia sobranadante; (c) realizar una centrifugación a
velocidad elevada de la materia sobranadante de la etapa (b) y
recoger las vesículas de membranas externas en un sedimento; (d)
volver a dispersar el sedimento de la etapa (c) en un tampón; (e)
realizar una segunda centrifugación a velocidad elevada de acuerdo
con la etapa (c) recogiendo las vesículas de membranas externas en
un sedimento; (f) volver a dispersar el sedimento de la etapa (e)
en un medio acuoso.
El procedimiento puede comprender también las
siguientes etapas: (g) realizar una filtración en condiciones
estériles a través de al menos dos filtros de tamaño de poros
decreciente de la composición nuevamente dispersada de la etapa
(f); y (h) opcionalmente, incluir la composición de la etapa (g) en
un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una composición
adyuvante.
La etapa (a) da lugar a vesículas de la membrana
externa bacteriana, y las vesículas comprenden generalmente
componentes de la membrana externa sustancialmente en su forma
nativa. Ventajosamente, son conservados los componentes de
membranas de NspA "287" y "741".
La etapa (b) incluirá normalmente una
centrifugación a aproximadamente 5.000-10.000 g
durante hasta 1 hora.
Las etapas (c) y (e) incluirán normalmente una
centrifugación a aproximadamente 35.000-100.000 g
durante hasta 2 hora.
Las etapas de centrifugación son realizadas
preferentemente entre 2ºC y 8ºC.
Puede ser usado cualquier tampón adecuado en la
etapa (b) por ejemplo, tampón Tris, tampón de fosfato, tampón de
histidina etc. La etapa (f) puede incluir también el uso de un
tampón que puede ser el mismo tampón usado en la etapa (d) o puede
incluir sencillamente el uso de agua (por ejemplo, agua para
inyección).
La etapa (g) finaliza preferentemente con un
filtro con un tamaño de poros de aproximadamente 0,2 \mum.
La invención proporciona también una composición
de vesículas de N. meningitidis caracterizada porque las
vesículas incluyen (i) proteína de NspA, (ii) proteína "287" y
(iii) proteína "741".
La bacteria a partir de la cual son preparadas
las OMVs puede ser gram-positiva, pero es
preferentemente gram-negativa. La bacteria puede
ser del genero Moraxella, Shigella, Pseudomonas, Treponema,
Porphyromonas o Helicobacter, (véase lo que antecede para las
especies preferidas) pero es preferentemente del genero
Neisseria. Las especies preferidas de Neisseria
son N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Dentro de la
N. meningitidis, puede ser usado cualquiera de los
serogrupos A, C, W135 e Y, pero es preferido preparar vesículas a
partir del serogrupo B. Las cepas preferidas dentro del serogrupo B
son MC58, 2996, H4476 y 394/98.
Para reducir la actividad pirógena, es preferido
que la bacteria tenga bajos niveles de endotoxinas (LPS). Son
conocidas bacterias mutantes adecuadas, por ejemplo,
Neisseria mutante [23] y Helicobacter mutante [24].
Los procedimientos para preparar membranas externas agotadas en LPS
a partir de bacterias gram-negativas se describen
en la referencia 25.
La bacteria puede ser una bacteria de tipo
salvaje o puede ser una bacteria recombinante. Las bacterias
recombinantes preferidas sobreexpresan (con relación a la
correspondiente cepa de tipo salvaje) inmunógenos como NapA,
287,741, TbpA, TbpB, superóxido dismutasa [6] etc. La bacteria
puede expresar más de una proteína de membrana externa de clase I
PorA, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6 de subtipos de PorA: P1.7,16;
P1.5,2; P1.19,15; P15c,10; P1.12,13; y P1.7h,4, [por ejemplo,
referencias 26 y 27].
El procedimiento de la invención incluirá
normalmente una etapa inicial de cultivo de las bacterias,
opcionalmente seguida de una etapa de concentración de las células
cultivadas.
La rotura de membranas para la formación de
vesículas es realizada sustancialmente en ausencia de
detergente.
En particular, la rotura de membranas puede ser
realizada sustancialmente en ausencia de un detergente de
desoxicolato, estando presente opcionalmente otros detergentes.
La rotura de membranas puede ser realizada
sustancialmente en ausencia de un detergente iónico, estando
presente opcionalmente un detergente no iónico. Alternativamente,
puede ser realizada sustancialmente en ausencia de un detergente no
iónico, estando presente opcionalmente un detergente iónico. En
algunas realizaciones, tampoco está presente un detergente no
iónico.
Las etapas después de la rotura de membranas y
formación de vesículas pueden incluir el uso de un detergente. Por
tanto, está abarcado por la invención un procedimiento en el que se
produce una rotura de membranas en ausencia de detergente, pero en
el que es posteriormente añadido un detergente a las vesículas
preparadas.
La expresión "sustancialmente en ausencia"
significa que el detergente en cuestión está presente a una
concentración de más de 0,05% (por ejemplo, \leq0,025%,
\leq0,015%, \leq0,010%, \leq0,005%, \leq0,002%, \leq0,001%
o incluso 0%) durante la rotura de membranas. Por tanto, no están
excluidos procedimientos en los que están presentes cantidades
residuales de detergentes durante la preparación de las
vesículas.
La rotura de membranas en ausencia de detergente
puede ser realizada sobre bacterias intactas usando técnicas
físicas, por ejemplo, aplicación de ultrasonidos, homogeneización,
microfluidización, cavitación, choque osmótico, trituración, prensa
francesa, combinación, etc.
Los procedimientos de la invención producen
vesículas de membranas externas. Las OMVs son preparadas a partir
de la membrana externa de bacterias cultivadas. Son obtenidas a
partir de bacterias crecidas en un caldo o en un cultivo en medio
sólido, preferentemente separando las células bacterianas del medio
de cultivo (por ejemplo, por filtración o mediante centrifugación a
baja velocidad para sedimentar las células), lisado de las células
(sin detergente) y separación de una fracción de membranas externas
de moléculas citoplásmicas (por ejemplo, por filtración, por
precipitación diferencial o agregación de membranas externas y/o
OMVs, mediante métodos de separación por afinidad usando ligandos
que reconocen específicamente moléculas de membranas externas, o
mediante centrifugación a velocidad elevada que sedimenta las
membranas externas y/o OMVs).
Las OMVs pueden ser distinguidas de las
microvesículas (MVs [28]) y las "OMVs nativas" ("NOMVs"
[66]), que son vesículas de membranas que se producen de forma
natural, que se forman espontáneamente durante el crecimiento
bacteriano y son libradas en el medio de cultivo. Las MVs pueden ser
obtenidas cultivando Neisseria en un medio de cultivo de
caldo, separando las células completas del medio de cultivo de caldo
(por ejemplo, por filtración o por centrifugación a baja velocidad,
para sedimentar solamente las células y no las ampollas más
pequeñas) y recogiendo las MVs que están presentes en el medio
agotado en células (por ejemplo, por filtración, por precipitación
diferencial o agregación de MVs, por centrifugación a velocidad
elevada para sedimentar las MVs). Las cepas para ser usadas en la
producción de MVs pueden ser generalmente seleccionadas sobre la
base de la cantidad de MVs producidas en cultivo. Las referencias 29
y 30 describen Neisseria con una elevada producción de
MV.
La ausencia sustancial de detergente en los
procedimientos de la invención da lugar a preparaciones de vesículas
que retienen componentes inmunógenos de la superficie bacteriana
que, de otra forma, usando métodos de la técnica anterior basados
en detergentes, serían perdidos o disminuidos. En N.
meningitidis, tres inmunógenos que son ventajosamente retenidos
usando la invención incluyen, pero sin limitación: (1) NspA; (2)
proteína "741" y (3) proteína "287".
La NspA (proteína A de superficie de Neisseria)
es descrita en las referencias 31 a 37 y como la SEQ ID
40008-4033 de la referencia 38. Es una vacuna
candidata para la prevención de una enfermedad meningocócica. Está
altamente conservada entre las cepas. Sin embargo, a pesar de una
esperanza inicial, se cree actualmente que la NspA no será un
antígeno protector adecuado por sí mismo y necesitará ser
administrada con antígenos adicionales [por ejemplo, la referencia
36 y ejemplo 11 de la referencia 38]. La NspA se ha encontrado que
es separada mediante métodos de preparación basados en detergentes
de la técnica anterior. Sin embrago, según la presente invención,
la NspA puede ser retenida en las vesículas. Las vesículas de
NspA^{+ve} son ventajosas porque es preparada una combinación de
dos inmunógenos potentes conocidos (es decir, vesículas + NspA) en
un único procedimiento, y cada inmunógeno aumenta la eficacia del
otro.
La proteína "741" es descrita como
"NMB1870" en la referencia 39 (GenBank AAF42204, Gl:7227128).
Es descrita también en las referencias 40 y 41. Provoca fuertes
anticuerpos bactericidas. Se ha encontrado que la proteína
"741" es parcialmente suprimida en vesículas preparadas
mediante métodos basados en detergente de la técnica anterior. Sin
embargo, según la presente invención, la "741" puede ser
retenida en las vesículas. Estas vesículas 741^{+ve} son
ventajosas porque una combinación de dos potentes inmunógenos (es
decir, vesículas +741) es preparada en un único procedimiento, y
cada inmunógeno aumenta la eficacia del otro.
La proteína "287" es descrita como
"NMB2132" en la referencia 39 (GenBank AAF42440, Gl:7227388).
Es descrita también en las referencias 40 y 42. Provoca fuertes
anticuerpos bactericidas. La proteína "287" normalmente no
está presente en vesículas preparadas mediante métodos basados en
detergente de la técnica anterior y, para superar su supresión, ha
sido previamente propuesto que las preparaciones de OMV pueden ser
complementadas con 287 [43]. Sin embargo, según la presente
invención, la "287" puede ser retenida en las vesículas. Estas
vesículas de 287^{+ve} son ventajosas porque una combinación de
dos potentes inmunógenos (es decir, vesículas +287) es preparada en
un único procedimiento, en el que cada inmunógeno aumenta la
eficacia del otro.
La NspA preferida (a) tiene al menos un a% de
identidad de secuencias para la secuencia de aminoácidos GI:
1518522 y/o (b) comprende un fragmento de al menos x aminoácidos de
la secuencia de aminoácidos GI: 1518522. La "741" preferida
(s) tiene al menos b% de identidad de secuencias para la secuencia
de aminoácidos GI: 7227128 y/o (b) comprende un fragmento de al
menos x aminoácidos de la secuencia de aminoácidos GI: 7227128. La
"287" preferida (a) tiene al menos un c% de identidad de
secuencias para la secuencia de aminoácidos GI: 7227388 y/o (b)
comprende un fragmento de al menos x aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos GI: 7227388. Los valores de a, b y c son independiente
unos de otros, pero cada valor es al menos 70 (por ejemplo, 75, 80,
85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 ó 100). Los valores x, y y z son
independientes unos de otros, pero cada valor es al menos 8 (por
ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 etc.). Los fragmentos
comprenden preferentemente epitopos.
Las proteínas NspA, 287 y 741 preferidas
retienen sustancialmente la capacidad de las proteínas de tipo
salvaje (como se encuentra en las bacterias intactas) para provocar
anticuerpos bactericidas en pacientes.
El procedimiento de la invención proporciona una
preparación de vesículas. Para una administración a un paciente,
las vesículas son formuladas preferentemente en forma de
composiciones inmunógenas y, más preferentemente en forma de
composiciones adecuadas para ser usadas como una vacuna en seres
humanos (por ejemplo, niños o adultos). Las vacunas de la invención
pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir una infección) o
terapéuticas (es decir, para tratar una enfermedad después de una
infección), pero normalmente serán profilácticas.
La composición de la invención está
preferentemente esterilizada.
La composición de la invención está
preferentemente exenta de agentes pirogénos.
La composición de la invención tiene
generalmente un pH entre 6,0 y 7,0, más preferentemente entre 6,3 y
6,9, por ejemplo, 6,6 \pm 0,2. La composición está
preferentemente tamponada a este pH.
Otros componentes adecuados para una
administración a seres humanos se describen en la referencia 44.
La composición comprenderá generalmente un
adyuvante. Los adyuvantes preferidos para aumentar la eficacia de
la invención incluyen, pero sin limitación: (A) MF59 (5% de
escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0,5% de Span 85, formulados en forma
de partículas submicrónicas usando un microfluidizador) [véase el
capítulo 10 de la referencia 45; véase también la referencia 46];
(B) micropartículas (es decir, una partícula de \sim100 nm a
\sim150 \mum de diámetro, más preferentemente \sim200 nm a
\sim30 \mum de diámetro y lo más preferentemente \sim500 nm a
\sim 10 \mum de diámetro) formadas a partir de materiales que
son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un
poli(\alpha-hidroxiácido), un poli(ácido
hidroxibutírico) un poliortoéster, un polianhídrido, una
policaprolactona, etc.), siendo preferido un
poli(láctido-co-glicólidos)
opcionalmente con materiales de carga superficiales (por ejemplo,
añadiendo un detergente catiónico, aniónico o no iónico como SDS
(negativo) o CTAB (positivo) [por ejemplo, referencias 47 y 48);
(C) liposomas [véase los capítulos 13 y 14 de la referencia 45]; (D)
ISCOMs [véase el capítulo 45 de la referencia 45], que pueden estar
desprovistos de detergentes adicional [49]; (E) SAF, que contiene
10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 de bloques
plurónicos y thr-MDP, microfluidizado en forma de
una emulsión submicrónica o centrifugado para generar una emulsión
de tamaño de partículas mayor [véase el capítulo 12 de la
referencia 45]; (F) sistema adyuvante Ribi® (RAS), (Eibi inmunochem)
que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o más
componentes de paredes celulares bacterianas del grupo que consiste
en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y
estructura principal de las paredes celulares (CWS),
preferentemente MPL + CWS (Detox®); (G) adyuvantes de saponina, como
QuilA o QS21 [véase el capítulo 22 de la referencia 45] también
conocido como estimulon®; (H) quitosano [por ejemplo, 50]; (1)
adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund
(IFA); (J) citoquinas, como interleucinas (por ejemplo,
IL-1, IL-2, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-12, etc.), interferones (por ejemplo,
interferón-y), factor de estimulación de colonias
de macrófagos, factor de necrosis tumoral, etc. [véanse los
capítulos 27 y 28 de la referencia 45]; (K) una saponina (por
ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un
esterol) [51]; (L) monofosforil-lipidoA (MPL) o MPL
3-O-desacilado (3dMPL) [por ejemplo,
capítulo 21 de la referencia 45]; (M) combinaciones de 3sMPL con,
por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [52]; (N)
oligonucleótidos que comprenden restos CpG [53], es decir, que
contienen al menos un dinucleótido CG, siendo usada opcionalmente
5-metilcitosina en lugar de citosina; (O) un
polioxietileno-éter o un polioxietileno-estér [54];
(P) un tensioactivo de éster de
polioxietileno-sorbitán en combinación con un
octoxinol [55] o un polioxietileno-alquil-éter o un
tensioactivo de éster en combinación con al menos un tensioactivo no
iónico adicional como un octoxinol [56]; (Q) un oligonucleótido
inmunoestimulador (por ejemplo, un poligonucleótido CpG) y una
saponina [57]; (R) un inmunoestimulante y una partícula de sal
metálica [58]; (S) una saponina y una emulsión de aceite en agua
[59]; (T) enterotoxina lábil respecto al calor de E. coli
("LT") o sus mutantes destoxificados, como los mutantes K63 o
R72 [por ejemplo, capítulo 5 de la referencia 60]; (U) toxina del
cólera ("CT") o sus mutantes destoxificados [por ejemplo,
capítulo 5 de la referencia 60]; (V) RNA de cadena doble; (W) sales
de aluminio, como hidróxidos de aluminio (incluidos los
oxihidróxidos), fosfatos de aluminio (incluidos los
hidroxifosfatos), sulfato de aluminio, etc. [Capítulos 8 y 9 de la
referencia 61]; (X) emuladores de
monofosforil-lípidos A, como derivados de
aminoalquil-glucosaminida-fosfato,
por ejemplo, RC-529 [62]; (Y) polifosfazeno (PCCPP);
o (Z) un bioadhesivo [63] como microesferas de ácido hialurónico
esterificado [64] o un mucoadhesivo seleccionado entre el grupo que
consiste en derivados reticulados de poli(ácido acrílico),
poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, polisacáridos
y carboximetilcelulosa. Pueden ser usadas también otras sustancias
que actúan como agentes inmunoestimuladores para aumentar la
eficacia de la composición [por ejemplo, véase el capítulo 7 de la
referencia 45]. Las sales de aluminio (especialmente los fosfatos
y/o hidróxidos de aluminio) son adyuvantes preferidos para una
inmunización parenteral. Las toxinas mutantes son preferidas para
los adyuvantes mucosales.
Las vesículas en las composiciones de la
invención estarán presentes en "cantidades inmunológicamente
eficaces", es decir, la administración de esa cantidad a un
individuo, en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz
para el tratamiento o la prevención de la enfermedad. Esta cantidad
varía dependiendo del estado de salud y físico del individuo que va
a ser tratado, como la edad, el grupo taxonómico del individuo que
va a ser tratado (por ejemplo, un primate no humano, primate, etc.),
la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar
anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la
vacuna, la valoración del facultativo encargado de la situación
médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga
en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a
través de ensayos rutinarios. El tratamiento mediante la
dosificación puede seguir un esquema de dosis única o un esquema de
dosis múltiples (por ejemplo, que incluyan dosis estimuladoras).
La vacuna puede ser administrada conjuntamente con otros agentes
inmunorreguladores.
Normalmente, las composiciones de la invención
son preparadas en formas inyectables. El suministro directo de las
composiciones será generalmente por vía parenteral (por ejemplo, por
inyección, ya sea subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o
intramuscular o suministrada al espacio intersticial de un tejido) o
mucosal (por ejemplo, oral o intranasal [65, 66]). Las
composiciones pueden ser administradas también en una lesión.
Una vez formuladas, las composiciones de la
invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los
sujetos que van a ser tratados pueden ser animales; en particular,
pueden ser tratados sujetos humanos. Las vacunas son
particularmente útiles para vacunar niños y adolescentes.
La composición puede comprender vesículas de más
de un serosubtipo de N. meningitidis [28]. Análogamente, la
composición puede comprender más de un tipo de vesícula, por
ejemplo, tanto MVs como OMVs.
Además de las vesículas, la composición de la
invención puede comprender antígenos adicionales. Por ejemplo, la
composición puede comprender uno o más de los siguientes antígenos
adicionales:
- antígenos de Helicobacter pylori como
CagA [67 a 70], VacA [71, 72], NAP [73, 74, 75], HopX [por ejemplo,
76], HopY [por ejemplo, 76] y/o ureasa.
- un antígeno de sacárido del serogrupo de N.
meningitidis A, C, W135 y/o Y, como el oligosacárido descrito
en la referencia 77 del serogrupo C [véase también la referencia 78]
o el oligosacárido de la referencia 79;
- un antígeno de sacárido de Streptococcus
pneumoniae [por ejemplo, 80, 81, 82];
- un antígeno del virus de la hepatitis A, como
un virus inactivado [por ejemplo, 83, 84];
- un antígeno del virus de la hepatitis B, como
los antígenos de la superficie y/o el núcleo [por ejemplo, 84,
85];
- un antígeno de Bordetella pertussis,
como holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA)
de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con
pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo 86 y 87];
- un antígeno de la difteria como toxoide de
difteria [por ejemplo, capítulo 3 de referencia 88] por ejemplo, el
mutante CRM_{197} [por ejemplo, 89];
- un antígeno del tétanos, como un toxoide del
tétanos [por ejemplo, capítulo 4 de referencia 108];
- un antígeno de sacárido de Haemophilus
influenzae B [por ejemplo, 78];
- un antígeno del virus de la hepatitis C [por
ejemplo, 90];
- un antígeno de N. gonorrhoeae [por
ejemplo 91, 92, 93, 94];
- un antígeno de Chlamydia pneumoniae
[por ejemplo, referencias 95 a 101];
- un antígeno de Chlamydia trachomatis
[por ejemplo, 102].
- un antígeno de Porphyromonas gingivalis
[por ejemplo, 103];
- antígeno(s) de la polio [por ejemplo,
104, 105] como OPV o, preferentemente, IPV;
- antígeno(s) de la rabia [por ejemplo,
106] como virus inactivados liofilizados [por ejemplo, 107,
RabAvert(®];
- antígenos del sarampión, paperas y/o rubeola
[por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la referencia 108];
- antígeno(s) de la gripe [por ejemplo,
capítulo 19 de la referencia 108], como las proteínas de superficies
de hemaglutinina y/o neuraminidasa;
- un antígeno de Moraxella catarrhalis
[por ejemplo, 109];
- un antígeno de proteína de Streptococcus
agalactie (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 110,
111];
- un antígeno de sacárido de Streptococcus
agalactie (estreptococo del grupo B);
- un antígeno de Streptococcus pyogenes
(estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 1ll, 112, 113];
- un antígeno de Staphylococcus aureus
[por ejemplo, 114];
- un antígeno de Bacillus anthracis [por
ejemplo, 115, 116, 117];
- un antígeno de un virus de la familia de las
flavivíridas (genero flavivirus), como el virus de la fiebre
amarilla, virus de la encefalitis Japonesa, cuatro serotipos de
virus dengue, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas o
virus del Nilo occidental;
- un antígeno de pestivirus, como el virus de la
fiebre porcina clásica, virus de la diarrea vírica bovina y/o virus
de la enfermedad de la frontera;
- un antígeno de parvovirus, por ejemplo, de
parvovirus B 19;
- una proteína priónica (por ejemplo, la
proteína priónica CJD);
- una proteína amiloide, como un
beta-péptido [118];
- un antígeno del cáncer, como los recogidos en
la Tabla 1 de la referencia 119 o en las Tablas 3 y 4 de la
referencia 120.
La composición puede comprender uno o más de
estos antígenos adicionales.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden ser
destoxificados cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificacidón
de toxina de pertussis por medios químicos y/o genéticos [87]).
Cuando un antígeno de difteria es incluido en la
composición, es preferido incluir también antígeno de tétanos y
antígenos de pertussis. Análogamente, cuando un antígeno de tétanos
es incluido, es preferido incluir también antígenos de difteria y
de pertussis. Análogamente, cuando es incluido un antígeno de
pertussis, es preferido incluir también antígenos de difteria y de
tétanos. Por tanto, son preferidas combinaciones de DTP.
Los antígenos de sacáridos están preferentemente
en la forma de conjugados. Las proteínas portadoras para los
conjugados incluyen la proteína de membranas externas de N.
meningitidis [121], péptidos sintéticos [122,123], proteínas de
choque con calor [124,125], proteínas de pertussis [126,127],
proteína D de H. influenzae [128], citoquinas [129],
lifoquinas [129], hormonas [129], factores de crecimiento [129],
toxina A o B de C. difficile [130], proteínas de absorción
de hierro [131], etc. Una proteína portadora preferida es el
toxoide de difteria CRM197 [132].
Los antígenos del serogrupo B de N.
meningitidis pueden ser añadidos también a las composiciones de
OMV. En particular, puede ser añadido un antígeno como el descrito
en las referencias 133 a 139.
Los antígenos en la composición estarán
presentes normalmente a una concentración de al menos 1 \mug/ml
cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado
será suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese
antígeno.
Como una alternativa para usar antígenos de
proteínas en la composición de la invención, puede ser usado un
ácido nucleico que codifique el antígeno. Los componentes proteicos
de las composiciones de la invención, por tanto, pueden ser
sustituidos con un ácido nucleico (preferentemente DNA, por ejemplo,
en la forma de un plásmido) que codifique la proteína.
La invención proporciona vesículas de la
invención para ser usadas como medicamentos.
Las vesículas de la invención pueden ser usadas
en un método para elevar una respuesta inmune en un paciente, que
comprende administrar a un paciente una composición de la invención.
La respuesta inmune es preferentemente protectora frente a una
enfermedad meningocócica, y puede comprender una respuesta inmune
humoral y/o una respuesta inmune celular. El paciente es
preferentemente un niño.
El método puede hacer surgir una respuesta
estimuladora en un paciente que ya haya sido cebado frente a N.
meningitidis. Los regímenes de cebado/propulsión subcutáneos e
intranasales para OMVs son descritos en la referencia.
La invención proporciona también el uso de una
vesícula de la invención en la elaboración de un medicamento para
hacer surgir una respuesta inmune en un paciente. El medicamento es
preferentemente una composición inmunógena (por ejemplo, una
vacuna). El medicamento es preferentemente para la prevención y/o el
tratamiento de una enfermedad provocada por una Neisseria
(por ejemplo, N. meningitidis, septicemia, gonorrea,
etc.).
Estos métodos y los usos pueden incluir la
administración de vesículas a partir de un serosubtipo de N.
meningitidis [por ejemplo, referencia 28].
La invención proporciona una composición que
comprende vesículas de membranas externas meningocócicas, un
adyuvante de hidróxido de aluminio, un tampón de histidina y cloruro
de sodio, en el cual: (a) la concentración de cloruro de sodio es
mayor que 7,5 mg/ml; y/o (b) la concentración de OMVs es menor que
100 \mug/ml.
La concentración de cloruro de sodio es
preferentemente mayor que 8 mg/ml, y es más preferentemente de forma
aproximada 9 mg/ml.
La concentración de OMVs es preferentemente
menor que 75 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 50 mg/ml.
El tampón de histidina tiene preferentemente un
pH entre 6,3 y 6,7, por ejemplo, un pH de 6,5.
El adyuvante puede ser usado a aproximadamente
3,3 mg/ml (expresada como concentración de Al^{3+}).
Las referencias al porcentaje de identidad de
secuencias entre dos secuencias de aminoácidos significa que,
cuando están alineadas, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al
comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de
homología de la identidad de secuencias pueden ser determinados
usado programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo,
los descritos en la sección 7.7.18de la referencia 140. Una
alineación preferida es determinada mediante el algoritmo de
búsqueda de homologías de Smith-Waterman usando una
búsqueda de espacios de afinado con una penalización de espacios
abiertos de 12 y una penalización de la extensión de los espacios
de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homologías de
Smith-Waterman es bien conocido y está descrito en
la referencia 141.
La expresión "que comprende" significa
"que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una
composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente
en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.
El término "aproximadamente" en relación
con un valor numérico x significa, por ejemplo, x \pm 10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye
"completamente" por ejemplo, una composición que está
"sustancialmente exenta" de Y puede estar completamente exenta
de Y. cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede
ser omitida de la definición de la invención.
Las Figuras 1 y 2 muestran la presencia/ausencia
de (1) proteína "287" y (2) proteína "741" en bacterias
("TOT") y vesículas de membranas externas ("OMV")
preparadas a partir de las cepas MC58, H4476 y 394/98 de N.
meningitidis. La flecha muestra la posición de "287" en la
Figura 1 y "741" en la Figura 2.
La Figura 3 muestra las secuencias de
aminoácidos de las entradas de GenBank GI: 7227128, GI: 7227388 y
GI: 1518522 de fecha de 29 de agosto de 2002.
Fueron preparadas OMVs mediante métodos
"noruegos" de la técnica anterior (cepas H4476 y 394/98) o
mediante el siguiente procedimiento (cepa MC58):
- Fueron recogidas bacterias de
2-5 placas en 10 ml de tampón de
Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y fueron destruidas con
calor a 56ºC durante 45 minutos. Las muestras fueron seguidamente
sometidas a ultrasonidos en hielo (ciclo de funcionamiento 50
durante 10 minutos con la punta a 6/7) para romper las
membranas.
- El debris celular fue separado por
centrifugación a 5.000 g durante 30 minutos a 4ºC, o a 10.000 g
durante 10 minutos.
- La materia sobranadante fue nuevamente
centrifugada a 50.000 g durante 75 minutos a 4ºC.
- El sedimento se volvió a poner en suspensión
en 7 ml sarcosinato de N-lauroilo al 2% (Sarcosil)
en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) durante 20 minutos a
temperatura ambiente para solubilizar las membranas
citoplásmicas.
- La muestra fue centrifugada a 10.000 g durante
10 minutos para separar las partículas y la materia sobrenadante
fue centrifugada a 75.000 g durante 75.000 minutos a 4ºC. La muestra
fue lavada en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y
centrifugada a 75.000 g durante 75 minutos.
- El sedimento se volvió a poner en suspensión
en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) o agua destilada.
Las bacterias y las preparaciones de OMV fueron
ensayadas mediante una transferencia Western en presencia de NspA,
287 y 741 (Figuras 1 y 2) y los resultados se resumen en la
siguiente Tabla:
En contraste con los métodos basados en
detergentes de la técnica anterior, por lo tanto, la ausencia de
detergente da lugar a que la NspA este retenida en las OMVs y evite
la pérdida de 287 y 741.
Se prepararon OMVs a partir de cepa de serogrupo
B 394/98 de N. meningitidis. Estas fueron formuladas de dos
formas diferentes, en las que los componentes tenían las siguientes
concentraciones:
La formulación "B" se encontró que era
inmunológicamente superior a la formulación "A". La formulación
"B" difiere de la descrita en la referencia 142 por tener la
mitad de la concentración de OMV y una mayor concentración de NaCl,
y un pH ligeramente diferente.
Se comprenderá que la invención ha sido escrita
a modo de ejemplo solamente y que pueden hacerse modificaciones,
permaneciendo dentro del alcance de la invención.
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Claims (18)
1. Un procedimiento para la elaboración de una
preparación de vesículas de membranas externas a partir de una
bacteria, en el que la membrana bacteriana es sustancialmente rota
en ausencia de detergente de desoxicolato y la bacteria
sobreexpresa TbpA.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la membrana bacteriana es sustancialmente rota en ausencia
de cualquier detergente.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en comprende las siguientes etapas básicas: (a)
tratar células bacterianas en ausencia sustancial de detergente; (b)
centrifugar la composición de la etapa (a) para separar las
vesículas de las membranas externas de las células tratadas y el
debris celular y recoger la materia sobranadante; (c) realizar una
centrifugación a velocidad elevada de la materia sobranadante de la
etapa (b) y recoger las vesículas de membranas externas en un
sedimento; (d) volver a dispersar el sedimento de la etapa (c) en
un tampón; (e) realizar una segunda centrifugación a velocidad
elevada de acuerdo con la etapa (c) recogiendo las vesículas de
membranas externas en un sedimento; (f) volver a dispersar el
sedimento de la etapa (e) en un medio acuoso.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, que
comprende adicionalmente las siguientes etapas: (g) realizar una
filtración estéril a través de al menos dos filtros de tamaño de
poros decreciente de la composición nuevamente dispersada de la
etapa (f); y (h) opcionalmente, incluir la composición de la etapa
(g) en un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una composición
adyuvante.
5. El procedimiento de la reivindicación 3 o la
reivindicación 4, en el que la etapa (b) comprende una
centrifugación a aproximadamente 5.000-10.000 g
durante hasta 1 hora y las etapas (c) y (e) comprenden una
centrifugación a aproximadamente 35.000-100.000 g
durante hasta 2 horas.
6. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la rotura de membranas es
por aplicación de ultrasonidos, homogeneización, microfluidización,
cavitación, choque osmótico, trituración, prensa francesa,
combinación o cualquier otra técnica física.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tampón usado en la etapa
(d) y/o en la etapa (f) es un tampón de Tris, un tampón de fosfato o
un tampón de histidina.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en el que la etapa (g) finaliza con un
filtro de tamaño de poros de aproximadamente 0,2 \mum.
9. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria a partir de la
cual son preparadas las OMVs es del género Moraxella, Shigella,
Pseudonconas, Treponema, Porphyromonas, Helicobacter o
Neisseria.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que la bacteria es N. meningitidis o N.
gonorrhoeae.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que la N. meningitidis es del serogrupo B.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la bacteria es Neisseria meningitidis serogrupo B
cepa H4476.
13. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa
de formular una cantidad inmunológicamente eficaz de las OMVs en
forma de una composición inmunógena.
14. Una composición de OMV, que puede ser
obtenida mediante el procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores.
15. Una composición de vesículas de Neisseria
meningitidis, caracterizada porque las vesículas incluyen
(i) proteína NspA, (ii) proteína "287" y (iii) proteína
"741".
16. La composición de la reivindicación 14 o la
reivindicación 15, en la que la composición es esterilizada y/o
exenta de pirógenos y/o tamponada a un pH entre 6,0 y 7,0.
17. la composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, para ser usada como un medicamento.
18. El uso de una composición de una cualquiera
de las reivindicaciones 14 a 16, en la elaboración de un medicamento
para hacer surgir una respuesta inmune en un paciente.
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