ES2301832T3 - Conjugados de bisaciloxipropilcisteina y su uso. - Google Patents
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Abstract
Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según la fórmula 1, (Ver fórmula) pudiendo ser R 1 y R 2 iguales o diferentes y significando restos de ácido graso unidos mediante el grupo carboxilo, siendo Y = -NH-, -O-, -S- o -OCO-, siendo R 3 un polímero unido de manera covalente, tolerable fisiológicamente y soluble en agua, y estando sustituido el resto polimérico R3 una, dos o múltiples veces con (Ver fórmula)
Description
Conjugados de bisaciloxipropilcisteína y su
uso.
La invención se refiere a nuevos conjugados de
bisaciloxipropilcisteína y a su uso, también en forma de
composiciones farmacéuticas.
Desde hace mucho tiempo se conoce que
determinados lipopéptidos son activadores de macrófagos (Hoffmann,
P., S. Heinle, U.F. Schade, H. Loppnow, A.J. Ulmer, H.-D. Flad, G.
Jung, y W. Bessler, 1988, "Stimulation of human and murine
adherent cells by bacterial lipoprotein and synthetic
Bisacyloxypropylcysteine analogues", Immunobiol. 177:
158-170). Dentro de esta clase de activadores de
macrófagos se conocen especialmente también péptidos o proteínas
con acción fisiológica sustituidos con ácido graso
(aciloxi-sustituidos) múltiples veces en un resto de
propilcisteína.
Sin embargo, los péptidos y entre ellos
especialmente los lipopéptidos con cadenas de ácido graso más largas
tienen frecuentemente la desventaja agravante de una solubilidad en
agua demasiado reducida para aplicaciones farmacéuticas y similares
en el cuerpo humano y animal, lo que limita considerablemente su
eficacia y su campo de utilización.
Estos problemas pueden solucionarse mediante la
conjugación de las proteínas y los péptidos con polímeros solubles
en agua. A partir del documento EP 0 510 356 B1 se conocen por
ejemplo conjugados de polietilenglicol-proteína, en
los que una proteína está unida mediante un ligador a
polietilenglicol y por ello se hace esencialmente soluble en agua.
En el documento EP 0 510 356 B1 se mencionan numerosos documentos
adicionales, en los que se describe la conjugación de péptidos o
proteínas con polímeros solubles en agua, en este caso especialmente
con polietilenglicol. La conjugación con PEG se denomina hoy en día
también como "pegilación".
El documento KLEINE B. et al:
"Lipopeptide-polyoxyethylene conjugates as
mitogens and adjuvants" Immunobiology, 3ª Ed. 190, 1994, páginas
56-66 describe conjugados de
lipopéptidos-polioxietileno como inmunoestimulante
pero el grupo amino de la cisteína no está conjugado.
También se conocen ya activadores de macrófagos
pegilados de la manera descrita anteriormente. Puede obtenerse
comercialmente por ejemplo un PEG aciloxi-sustituido
tres veces en un resto de propil-cisteína,
tripalmitoil-S-gliceril-cisteína-polietilenglicol,
que puede denominarse como
PAM_{3}-Cys-PEG.
PAM_{3}-Cys-PEG
tiene la estructura
estando conjugada la propilcisteína
sustituida con ácido graso en la posición X mediante un resto
bivalente tal como -NH-, -OCO-, -S-, -O-, o similares con el
polietilenglicol.
A pesar de la solubilidad en agua mejorada
considerablemente de
PAM_{3}-Cys-PEG en comparación con
los correspondientes
PAM_{3}-Cys-péptidos, en el caso
del uso de esta sustancia como activador de macrófagos,
frecuentemente es necesaria o al menos muy recomendable la adición
de un solubilizante orgánico, dado que de lo contrario la
activación de macrófagos sería reducida. Sin embargo, solubilizantes
tales como octil-glucósido no están completamente
libres de problemas desde el punto de vista farmacológico.
Por tanto existe además una necesidad
considerable de nuevos activadores de macrófagos activos, que se
disuelven bien en agua, especialmente no inmunógenos y que se
toleran bien fisiológicamente. Por tanto, el objetivo de la
invención consiste en proporcionar un nuevo activador de macrófagos
de este tipo muy activo, que se disuelve en agua y se tolera
bien.
El objetivo se soluciona mediante un conjugado
de bisaciloxipropilcisteína según la fórmula (1),
pudiendo ser R_{1} y R_{2}
iguales o diferentes y significando restos de ácido graso unidos
mediante el grupo
carboxilo,
siendo Y = -NH-, -O-, -S- o -OCO-,
siendo R_{3} es un resto de conjugado unido de
manera covalente, iónica o asociativa, especialmente un polímero
unido de manera covalente o iónica, tolerable fisiológicamente y
soluble en agua, especialmente polietilenglicol (polioxietileno)
unido de manera covalente,
-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{m}-CH_{2}-CH_{2}-X,
con X = OR, NR_{2}, SR, COOR y
R = H, bencilo, alquilo
C_{1-6}, pudiendo ser varios restos R iguales o
diferentes,
un copolímero de
polioxietileno-polioxipropileno, un dextrano, un
azúcar, una polivinilpirrolidona, un alginato, una pectina o un
colágeno,
y estando sustituido el resto polimérico R_{3}
una, dos o múltiples veces con
El conjugado según la invención puede
encontrarse tanto como racemato como como sustancias ópticamente
puras.
En el caso del conjugado de
bisaciloxipropilcisteína según la invención se trata preferiblemente
de un
S-[2,3-bis(aciloxi)-(2S)-propil]-L-cisteinil-carboxipolietilenglicol
(BAP-Cys-PEG), en el que el
polietilenglicol está unido mediante el grupo carboxilo de la
cisteína y el grupo amino de la cisteína permanece libre. En otra
forma de realización se trata, en el caso del conjugado de
bisaciloxipropilcisteína según la invención preferiblemente de un
S-[2,3-bis(aciloxi)-(2R)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol
(BAP-Cys-PEG), en el que el
polietilenglicol está unido mediante el grupo carboxilo de la
cisteína y el grupo amino de la cisteína permanece libre.
Manteniendo la función o en este caso la acción fisiológica pueden
realizarse modificaciones y sustituciones en la molécula conocidas
por el químico.
Los restos R_{1,2} del conjugado de
bisaciloxipropilcisteína según la invención pueden ser iguales o
diferentes. Actualmente se prefieren grupos alquinilo, alquenilo o
alquilo C_{7-25}, preferiblemente
C_{8-22}, encontrándose las posiciones
insaturadas preferiblemente en configuración cis. Los restos
alquinilo, alquenilo y alquilo pueden representar restos
ramificados o no ramificados, cíclicos o
cicloalquil-sustituidos. A partir de la química de
los ácidos grasos se conocen suficientemente restos R_{1}, R_{2}
adecuados.
Con respecto al grupo Y depende exclusivamente
de que se produzca una unión estable con el resto de conjugado
R_{3}, por eso la bisaciloxipropilcisteína permanece
suficientemente unida a éste y por eso permanece soluble en
agua.
El resto R_{3} es preferiblemente un resto de
polietilenglicol. Sin embargo, en general se trata de un resto de
conjugado tolerable fisiológicamente unido de manera covalente,
iónica o asociativa, que es adecuado para transformar la
bisaciloxipropilcisteína en una forma activa soluble en agua.
Actualmente se prefieren polímeros unidos de manera covalente.
Alternativamente, el resto de conjugado puede ser también, sin
embargo, un dextrano, un azúcar, una polivinilpirrolidona, un
alginato, una pectina o un colágeno. Especialmente se utiliza
dextrano como expansor sanguíneo y en cuanto a su tolerabilidad, es
inofensivo.
Precisamente en el caso de restos de conjugado
macropoliméricos pueden estar unidas también varias unidades
BAP-Cys a un resto de conjugado R_{3}.
El peso molecular del resto polimérico soluble
en agua se selecciona preferiblemente de modo que asciende, por
molécula de bisaciloxipropilcisteína, a de 100 a 30.000 Dalton. En
el caso de polietilenglicol se prefiere una longitud de cadena m de
desde 5 hasta 700, preferiblemente de 100 a 500, sin embargo no es
obligatorio.
En una forma de realización preferida, el
S-[2,3-bis(aciloxi)-(2S)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol
es un
S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2S)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol.
En otra forma de realización preferida el
S-[2,3-bis(aciloxi)-(2R)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol
es un
S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2R)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol.
El conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
esta invención presenta, en comparación con los activadores de
macrófagos conocidos anteriormente, la ventaja de que relaciona una
buena solubilidad en agua con una actividad de macrófagos en
comparación muy alta (véase a continuación). No es inmunógeno, de
modo en el caso del uso en seres humanos o animales no tiene lugar
el desarrollo de anticuerpos frente al preparado.
La invención comprende además composiciones
farmacéuticas que contienen el conjugado de bisaciloxipropilcisteína
según la invención. Las composiciones de este tipo incluyen, entre
otras, disoluciones del conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
la invención. Dentro de estas composiciones pueden estar contenidos
excipientes y aditivos farmacéuticos adicionales. Especialmente, el
conjugado de bisaciloxipropilcisteína puede estar adsorbido o unido
a un vehículo aceptable farmacéuticamente. El experto conoce
vehículos adecuados y también están a disposición
comercialmente.
La composición farmacéutica se encuentra
preferiblemente en forma de una formulación adecuada para la
inyección, para la inhalación o para la aplicación intranasal o
tópica, estando incluidas formas de aplicación unidas a vehículo.
Para la aplicación local se prevén, entre otras, pomadas, cremas,
tinturas, disoluciones y similares, tales como el experto conoce
para ese fin.
Los conjugados de bisaciloxipropilcisteína o las
composiciones farmacéuticas correspondientes según la invención
pueden utilizarse, entre otros, para la estimulación de macrófagos,
para la estimulación de la síntesis de anticuerpos, para la defensa
antiinfecciosa, para la inmunoestimulación, especialmente frente a
tumores, para la prevención y el tratamiento de choque septicémico,
para la cicatrización y como adyuvante para vacunas.
Como adyuvantes se denominan sustancias que en
el caso de una inmunización se añaden al propio antígeno (es decir,
la sustancia que provoca la reacción inmunitaria deseada), para
reforzar la respuesta inmunitaria mediada por células y/o
humoral.
El uso de adyuvantes óptimos desempeña un papel
decisivo en las sustancias. Los antígenos administrados sin
adyuvantes median sólo rara vez una respuesta inmunitaria
suficiente. Además no depende sólo de la intensidad de la respuesta
inmunitaria provocada, sino también de su calidad. La estimulación
de un modelo de inmunización erróneo puede conducir a reacciones
inmunopatológicas y a un empeoramiento de los síntomas de la
infección. En este contexto el adyuvante puede ayudar a favorecer
la reacción inmunitaria deseada.
Los adyuvantes pueden combinarse con los
antígenos más diversos para dar vacunas. Como antígenos pueden
seleccionarse especialmente antígenos diana para el tratamiento
profiláctico de enfermedades infecciosas, tumores, enfermedades
autoinmunitarias, alergias así como enfermedades inflamatorias
crónicas o agudas. Por una vacunación se entiende también un
tratamiento con antígenos para el control de la fertilidad en
poblaciones humanas o animales.
Estos usos comprenden la activación de
macrófagos/monocitos u otras células, que portan la combinación de
receptores receptor tipo Toll 2 y 6, con todas las consecuencias
indirectas mediante mediadores en el animal o el ser humano. Esto
implica la aplicación como adyuvante (o sea, como adición a
vacunas), para el tratamiento de tumores en el sentido más amplio,
inclusive un cebado in vitro para dar células autólogas
reimplantadas frente a los antígenos tumorales o mediante
tratamiento directo, que puede tener lugar local o sistémicamente,
para la generación de tolerancia cruzada frente a endotoxina y otros
componentes microbianos correspondientes, lo que hace posible una
protección frente a septicemia, así como para la aceleración de la
cicatrización.
Figura 1: Dependencia de la concentración de la
activación de macrófagos, medida por medio de la producción de
monóxido de nitrógeno (determinada espectroscópicamente a DO 550
nm), con respecto a la concentración de activador de macrófagos en
picomoles.
Figura 2: Aceleración de la cicatrización en
ratones diabéticos mediante la aplicación de tres veces de
BPP-Cys-PEG. Símbolo triangular:
animales control tratados con vehículo; símbolos cuadrangulares:
animales tratados con
BPP-Cys-PEG.
Figura 3: Respuestas humorales estimuladas tras
la vacunación con derivados de MALP-2 y
BPP-Cys-PEG como adyuvantes de
mucosa con una dosis de 0,05 \mug por animal por inmunización. Se
inmunizaron los ratones por vía intranasal con
\beta-galactosidasa (50 \mug/dosis) mezclada con
los derivados anteriores en el día 0, 7 y 14. En el día 31 tras la
primera inmunización se tomaron muestras de suero y se determinaron
con ELISA las concentraciones de los anticuerpos específicos de
\beta-galactosidasa. Los resultados se representan
como títulos de punto final.
Figura 4: IgA específica de
\beta-gal total en el lavado pulmonar de ratones
inmunizados por vía intranasal. La desviación estándar (DE) está
representada mediante líneas verticales.
Figura 5: IgA específica de
\beta-gal total en el lavado vaginal de ratones
inmunizados por vía intranasal. La desviación estándar está
representada como líneas verticales.
Figura 6: Respuestas de proliferación de células
T específicas de \beta-gal de micelas de ratones
inmunizados. Las células volvieron a estimularse in vitro
durante 4 días con diferentes concentraciones de
\beta-gal soluble. Los resultados están
representados como la relación entre los valores (media de
determinación triple) de muestras estimuladas y no estimuladas
(índice de estimulación).
A. La síntesis de (I) tiene lugar según el
método descrito (Metzger, J., Wiesmüller, K.-H., Schaud, R.,
Bessler, W.G., y Jung, G., 1991, "Synthesis and novel
immunologically active
tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl
Bisacyloxypropylcysteines as useful intermediates for immunogen
preparations". Int. J. Pept. Protein Res. 37:
46-57; Metzger, J.W., Wiesmüller, K.-H., y Jung,
G., 1991, "Synthesis of N-Fmoc protected
derivatives of
S-(2,3-dihydroxypropyl)-cysteine
and their application in peptide synthesis", Int. J. Pept.
Protein Res. 38:545-554).
B. A continuación se enlaza el grupo carboxilo
por ejemplo con polímeros que contienen grupos NH_{2} solubles en
agua, por ejemplo diamino-PEG según métodos
conocidos (síntesis de carbodiimidas).
Se disuelven 34 mg (38 \mumol) de (I) en 1 ml
de dimetilformamida seca/diclorometano 2:1 y se mezclan
sucesivamente 6 \mul (38 \mumol) de diisopropilcarbodiimida y 6
mg (38 \mumol) de 1-hidroxibenzotriazol. A esta
mezcla se le añaden 76 mg (38 \mumol) de
diamino-PEG 2000. Tras 24 horas a temperatura
ambiente se concentra hasta sequedad y se separa el grupo protector
Fmoc con piperidina al 20% en dimetilformamida. Se purifica el
compuesto (II) mediante cromatografía en gel de sílice. Se
caracteriza mediante RMN y espectroscopia de masas. Se purifica
adicionalmente mediante HPLC en columna C18 a 40ºC, tampón 1: TFA al
0,1% en agua; tampón 2: TFA al 0,1% en 2-propanol.
Se eluye la sustancia a aproximadamente el 80% V/V de tampón 2.
El análisis del contenido tiene lugar
mediante la determinación de los ácidos grasos con patrón C14
añadido de manera interna, tras la hidrólisis y CGL según métodos
convencionales o mediante la determinación de los grupos amino con
fluorescamina.
En principio, puede medirse la activación de
macrófagos y monocitos mediante un gran número de parámetros, tales
como por ejemplo mediante la liberación de citocinas, quimiocinas o
metabolitos del ácido araquidónico en cultivos de monocitos humanos
o macrófagos peritoneales murinos. La prueba usada en el presente
documento se basa en la estimulación simultánea de macrófagos
peritoneales del ratón con interferón-\gamma y
activador de macrófagos, por ejemplo
BAP-Cys-PEG para la liberación de
monóxido de nitrógeno. (Referencia: Mühlradt, P. F., y Frisch, M.,
1994, "Purification and partial biochemical characterization of a
Mycoplasma fermentans-derived substance that
activates macrophages to release nitric oxide, tumor necrosis
factor, and interleukin-6", Infect. Immun. 62:
3801-3807).
En resumen, los macrófagos peritoneales de
ratones C3H/HeJ sirvieron como fuente de macrófagos. Se cultivaron
éstos en placas de microtitulación de 96 pocillos y se estimularon
simultáneamente con rIFN-\gamma y con una
dilución en serie de activador de macrófagos. Siempre que fuera
necesario se disolvieron los activadores de macrófagos en la
primera etapa de dilución en octil-glucósido 25 mM y
luego se diluyeron adicionalmente con el medio. Tras un tiempo de
incubación de 45 - 48 horas, se redujo el nitrato con nitrato
reductasa y se determinó la sustancia de partida, monóxido de
nitrógeno, con reactivo de Griess como la suma de nitrato y
nitrito.
Se define 1 unidad (U)/ml como aquella dilución
en la que tiene lugar una estimulación de la mitad de la máxima.
Los resultados de la prueba de activación de
macrófagos están representados en la figura 1.
De la imagen ha de deducirse que
bispalmitoiloxipropil-cisteína-PEG
(BPP-Cys-PEG), (un activador de
macrófagos según esta invención), tiene un potencial notablemente
más alto para la activación de macrófagos que el
PAM_{3}-Cys-PEG conocido
(denominado en el presente documento como
TPP-Cys-PEG). La figura muestra que
se consigue la misma magnitud de activación de macrófagos mediante
BPP-Cys-PEG ya con una concentración
inferior en aproximadamente cuarenta veces que con
TPP-Cys-PEG.
La imagen muestra además que esta acción de
activación destacada e inesperada con
BPP-Cys-PEG mediante la adición de
un solubilizante (en el presente documento
octil-glucósido) no se mejora de manera notable,
mientras que para el desarrollo óptimo de la acción de
PAM_{3}-Cys-PEG es necesaria una
adición de este tipo.
Por tanto, el nuevo conjugado de
bisaciloxipropilcisteína según esta invención no necesita ninguna
solubilización adicional y dado el caso desventajosa
fisiológicamente mediante un detergente o disolvente orgánico.
Una ventaja adicional del
BAP-Cys-PEG con respecto al
PAM_{3}-Cys-PEG es la mayor
especificidad celular, que se atribuye a que esta sustancia
requiere la cooperación de los receptores de tipo Toll 2 y 6,
mientras que para una estimulación mediante
PAM_{3}-Cys-PEG es suficiente la
presencia simultánea de los receptores de tipo Toll 1 y 2 en las
células que van a estimularse. La expresión del receptor de tipo
Toll 6 está limitada a determinadas células, mientras que el
receptor de tipo Toll 1 se expresa de manera ubicua a partir de casi
todas las células del organismo.
De manera similar al caso de pacientes
diabéticos, también en el caso de ratones diabéticos la
cicatrización está perturbada y transcurre más lentamente que en el
caso de ratones de tipo natural. Por eso, el ratón diabético es un
modelo animal establecido en la cicatrización. Se rasuró en 20
ratones diabéticos (32 C57BKLS/Bom-db) en el lomo
una superficie de aproximadamente 4 x 4 cm de tamaño y dos días más
tarde se depiló ésta con Veet y se retiró la crema cuidadosamente.
Tras dos días más, se desinfectaron los lomos depilados de los
ratones con Braunol. Tras la inducción de la insensibilización con
isoflurano/aire tuvo lugar una anestesia local adicional mediante
inyección i.c. de xilocaína al 2% directamente en el sitio previsto
para la escisión así como la eliminación de la grasa de la piel con
tricloretileno. A continuación, se les escindió a los ratones
respectivamente una herida de la piel circular con un diámetro de
1,3 cm con un unas tijeras. Se taparon las heridas con un apósito
transparente (Hydrofilm, F. Hartmann) y adhesivo para vendajes.
Sobre este apósito se adhirió otro apósito, más grande con una
abertura correspondiente a la herida, que hacía posible la
observación de la herida. A través del apósito transparente tuvo
lugar la aplicación de:
3 x 200
kUnidades de BPP-Cys-PEG por animal
en metilcelulosa y suero de ratón al 5% (como vehículo) en los días
0, día 2 y día
5.
Los ratones control contenían sólo la mezcla de
vehículo. Se observaron los ratones durante un periodo de tiempo de
29-30. Los apósitos se cambiaron normalmente en el
intervalo de cinco días.
Mediante la aplicación de
BPP-Cys-PEG (3 x 200 kU) se
consiguió una aceleración significativa de la cicatrización (véase
la imagen 2).
Se usaron para los ensayos ratones BALB/c
(H-2d) hembra de 6-8 semanas de edad
(Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Alemania). A grupos de 5 ratones
respectivamente se les administraron, en el día 1, 14 y 21, 50
\mug de \beta-galactosidasa
(\beta-gal) (Boehringer, Mannheim, Alemania) sola,
o 0,5 \mug de R-MALP-2,
S-MALP-2 o
BPP-Cys-PEG sintéticos como
adyuvante por vía nasal (25 \mul). Se tomaron muestras de suero en
el día 31 y se almacenaron a -20ºC hasta la determinación de los
anticuerpos específicos de \beta-gal. Se
recubrieron placas de prueba Nunc-Immuno MaxiSorp
con 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 100 \mul de
\beta-gal (Boehringer, Mannheim, Alemania) con 5
\mug/ml en 0,05 mol de tampón de carbonato (pH 8,2) por pocillo.
Se agregaron diluciones de dos veces en serie de los sueros o
lavados en PBS con BSA al 1% BSA y Tween 20 al 0,05% (100
\mul/pocillo) y se incubaron las placas durante dos horas a 37ºC.
Tras lavar se agregó IgG de cabra anti-ratón
específica de cadena \gamma biotinilada (Sigma Chemie,
Deisenhofen, Alemania) y se incubaron las placas durante otra hora
a 37ºC. Tras lavar cuatro veces se añadieron 100 \mul de
estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pharmingen) a los pocillos
y se incubaron las placas durante 30 minutos a 37ºC. Tras lavar
cuatro veces se desarrollaron las reacciones por medio de ABTS en
0,1 mol de tampón de citrato-fosfato (pH 4,35), que
contenía H_{2}O_{2} al 0,01%. Se representaron los títulos en el
punto final como el Log_{2} recíproco de la última dilución, que
tras una incubación de 30 minutos dio como resultado una densidad
óptima a 405 nm de 0,1 unidades por encima del valor de los
controles negativos tras una incubación de 30 minutos.
Se obtuvieron lavados vaginales y pulmonares
mediante el lavado de los órganos con PBS 1 mM, que contenía EDTA
50 mM, BSA al 0,1% y PMSF 10 mM. A continuación se centrifugaron los
lavados para eliminar los residuos de tejido (10 min. a 3000 x g) y
se conservaron los sobrenadantes a -20ºC. Para determinar las
concentraciones de IgA total de los lavados del pulmón y la vagina,
se incubaron diluciones en serie de las muestras correspondientes
en placas de microtitulación, habiéndose recubierto estas placas
previamente con IgA de cabra anti-ratón (Sigma
Chemie, Deisenhofen, Alemania) como anticuerpo de captura (100
\mul/pocillo). Se usaron diluciones en serie de IgA de ratón
purificada (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemania) para la obtención
de una curva patrón. Para analizar la capacidad de
R-MALP-2,
S-MALP-2 y
BPP-Cys-PEG para la estimulación de
respuestas inmunitarias humorales eficaces, se determinaron los
títulos séricos de anticuerpos específicos de
\beta-gal en los ratones vacunados. Tal como se
representa en la figura 3, la administración de
\beta-gal en presencia de
BPP-Cys-PEG conduce a una
generación de títulos de IgG específicos de antígeno, que aumentan
más rápidamente que los obtenidos con ayuda de
R-MALP-2.
Para determinar la capacidad de los derivados
indicados anteriormente para la estimulación de respuestas de la
mucosa frente a antígenos, que se administraron juntos por vía
intranasal (i.n.), se analizó la producción de IgA específica de
\beta-gal en los lavados pulmonares y vaginales de
los animales inmunizados. Mientras que tras la vacunación i.n. con
\beta-gal pura o mezclas con el derivado de
S-MALP-2 no tuvo lugar ninguna
producción de IgA específica de \beta-gal en los
lavados pulmonares, en el caso de los animales que se inmunizaron
con \beta-gal y adicionalmente o bien
R-MALP-2 o bien
BPP-Cys-PEG, se comprobó un aumento
significativo de los anticuerpos IgA específicos de antígeno
(figura 4). La administración simultánea de
R-MALP-2 y
BPP-Cys-PEG con antígeno condujo a
la estimulación de una producción de IgA eficaz también en las
membranas mucosas que se encuentran alejadas, tal como se demostró
mediante la presencia de concentraciones significativas de IgA
específica de \beta-gal en los lavados vaginales
(figura 5).
Se extirparon los bazos y se tomaron
conjuntamente para el análisis de las respuestas inmunitarias
celulares. Se hacen proliferar las células en RPMI 1640, mezclado
con suero del ternero al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina
15 \mug/ml, 2-mercaptoetanol 5 x
10-^{5} M y L-glutamina 1 mM
(GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemania) y se conservaron a 37ºC en una
atmósfera húmeda con CO_{2} al 5%. Se ajustaron las suspensiones
celulares hasta 5 x 10^{6} células/ml en medio completo, se
sembraron en una placa de microtitulación de fondo plano con 96
pocillos (Nunc) con 100 \mul por pocillo y se incubaron las placas
durante 4 días en presencia de diferentes concentraciones de
\beta-gal disuelto. Cada concentración se sometió
a prueba tres veces. Durante el último cultivo de 8 horas se agregó
a cada pocillo 1 \muCi de [^{3}H]timidina (Amersham
International, Freiburg, Alemania). Entonces se recogieron estas
células sobre filtro de papel (Filtermat A; Wallac, Freiburg,
Alemania) con la ayuda de un colector de células (Inotech, Wohlen,
Suiza) y se determinó la cantidad de [^{3}H]timidina
absorbida en el ADN de las células proliferativas por medio de un
contador de centelleo (Wallac 1450, Micro-Trilux).
Se representaron los resultados como la relación entre los valores
(valor medio de determinación triple) de las muestras estimuladas y
no estimuladas (índice de estimulación). Mientras que la
administración i.n. de \beta-gal sola no generó
ninguna inducción de la proliferación celular demostrable, la
administración simultánea de
R-MALP-2 o
BPP-Cys-PEG con antígeno condujo a
una respuesta de proliferación eficaz (figura 6). Se menciona que
pudo observarse la respuesta de proliferación de células T más
fuerte en las células de bazo de ratones inmunizados con
BPP-Cys-PEG y
\beta-gal. El uso de
S-MALP-2 condujo a un índice de
estimulación esencialmente más débil y sólo en el caso del uso de
la dosis más alta de \beta-galactosidasa para la
reestimulación.
Los resultados obtenidos muestran claramente que
BPP-Cys-PEG como adyuvante de la
mucosa es al menos tan eficaz o incluso más eficaz que
R-MALP-2. Se consiguieron respuestas
inmunitarias humorales y celulares eficaces frente a antígenos
administrados simultáneamente con
BPP-Cys-PEG tanto a nivel sistémico
como mucosal.
Claims (13)
1. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
la fórmula 1,
pudiendo ser R_{1} y R_{2}
iguales o diferentes y significando restos de ácido graso unidos
mediante el grupo
carboxilo,
siendo Y = -NH-, -O-, -S- o -OCO-,
siendo R_{3} un polímero unido de manera
covalente, tolerable fisiológicamente y soluble en agua,
y estando sustituido el resto polimérico R_{3}
una, dos o múltiples veces con
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2. Conjugado de bisacilpropilcisteína según la
reivindicación 1, caracterizado porque el polímero se
selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol unido de
manera covalente
-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{m}-CH_{2}-CH_{2}-X,
con X = OR, N(R)_{2}, SR, COOR
y
R = H, bencilo, alquilo
C_{1-6}, pudiendo ser varios restos R iguales o
diferentes
un copolímero de
polioxietileno-polioxipropileno, un dextrano, un
azúcar, una polivinilpirrolidona, un alginato, una pectina o un
colágeno.
3. Conjugado de bisacilpropilcisteína según la
reivindicación 2, caracterizado porque el polímero es un
polietilenglicol unido de manera covalente
-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{m}-CH_{2}-CH_{2}-X,
con X = OR, N(R)_{2}, SR, COOR
y
R = H, bencilo, alquilo
C_{1-6}, pudiendo ser varios restos R iguales o
diferentes.
4. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los
restos R_{1,2}, que pueden ser iguales o diferentes, son grupos
alquinilo, alquenilo o alquilo C_{7-25},
preferiblemente C_{8-22} y las posiciones
insaturadas se encuentran preferiblemente en configuración
cis, representando los restos alquinilo, alquenilo y alquilo
restos ramificados o no ramificados, cíclicos o
cicloalquil-sustituidos.
5. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el
peso molecular del resto polimérico soluble en agua se selecciona
de modo que asciende, por molécula de conjugado, a de 100 a 30.000
Dalton.
6. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el
polietilenglicol del resto R_{3} tiene una longitud de cadena m de
desde 5 hasta 700, preferiblemente de 100 a 500.
7. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el
compuesto es un
S-[2,3-bis(aciloxi)-(2S)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol,
preferiblemente
S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2S)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol.
8. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína según
una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el
compuesto es un
S-[2,3-bis(aciloxi)-(2R)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol,
preferiblemente
S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2R)-propil]-L-cisteinil-carboxi-polietilenglicol.
9. Composición farmacéutica que contiene un
conjugado de bisaciloxipropilcisteína según una de las
reivindicaciones 1 a 8.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 9, caracterizada porque contiene aditivos o
excipientes farmacéuticos y preferiblemente un vehículo tolerable
farmacéuticamente.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 9 ó 10 en forma de una formulación adecuada para la
inyección, para la inhalación o para la aplicación intranasal o
tópica.
12. Uso de los conjugados de
bisaciloxipropilcisteína según una de las reivindicaciones 1 a 8 o
de la composición farmacéutica según la reivindicación 9, 10 u 11
para la producción de un medicamento para el tratamiento de
tumores, para la prevención y el tratamiento de choque septicémico,
para la cicatrización y como adyuvante para vacunas.
13. Vacuna, caracterizada porque contiene
un conjugado de bisaciloxipropilcisteína según una de las
reivindicaciones 1 a 8 como adyuvante.
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