ES2321409T3

ES2321409T3 - Arn (dsarn) de hebra doble para la inhibicion de la expresion de un gen predeterminado.

Info

Publication number: ES2321409T3
Application number: ES05002454T
Authority: ES
Inventors: Roland Kreutzer; Stefan Limmer
Original assignee: Alnylam Europe AG
Current assignee: Alnylam Europe AG
Priority date: 1999-01-30
Filing date: 2000-01-29
Publication date: 2009-06-05
Anticipated expiration: 2020-01-29
Also published as: US20040102408A1; PT2363479T; JP2019017390A; US20130164843A1; JP5990468B2; US8168776B2; DE50010528D1; US8101584B2; ES2243608T5; US20140051166A1; EP1214945B2; CA2359180A1; JP2007312784A; JP2009100758A; DE20023125U1; DE20023125U8; US20040072779A1; US20080171862A1; US8729037B2; EP1550719A1

Abstract

Oligorribonucleótido con estructura de doble hebra (dsARN) para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en células de mamíferos, estando constituido el dsARN por 15 a 21 pares de bases, y presentando una hebra de dsARN una zona I complementaria al gen objetivo, constituida por 15 a 21 pares de nucleótidos sucesivos, y estando formada una zona II complementaria dentro de la estructura de hebra doble por II hebras simples de ARN separadas, estando estabilizada la estructura de hebra doble por enlace químico de las hebras simples.

Description

ARN (dsARN) de hebra doble para la inhibición de la expresión de un gen predeterminado.

La invención se refiere a un oligorribonucleótido con estructura de hebra doble para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en una célula.

Se conoce tal procedimiento por la WO 99/32619 publicada posteriormente. El procedimiento conocido tiene por objetivo la inhibición de la expresión de genes en células de invertebrados. A tal efecto es necesario que el oligorribonucleótido de hebra doble presente una secuencia idéntica al gen objetivo con una longitud de al menos 25 bases. Para la consecución de una inhibición eficiente es necesaria una longitud de la secuencia idéntica de 300 a 1.000 pares de bases. El gasto de obtención de tal oligorribonucleótido es elevado.

La DE 196 31 919 C2 describe un ARN antisentido con estructuras secundarias especiales, presentándose el antisentido en forma de un vector que codifica las mismas. En el caso del ARN antisentido se trata de una molécula de ARN que es complementaria a zonas de mARN. Mediante enlace en estas zonas se provoca una inhibición de la expresión génica. Esta inhibición se puede emplear en especial para el diagnóstico y/o terapia de enfermedades, por ejemplo enfermedades tumorales, o infecciones virales. De modo desventajoso, se debe introducir el ARN antisentido en la célula en una cantidad que presenta al menos la misma magnitud que la cantidad de mARN. La eficacia de los procedimientos antisentido conocidos no es especialmente elevada.

Se conoce por la US 5,712,257 un medicamento que contiene ARN (dsARN) de hebra doble de pares defectuosos, y fragmentos biológicamente activos de pares defectuosos de dsARN en forma de un complejo ternario con un agente tensioactivo. El dsARN empleado en este caso está constituido por hebras simples de ácido nucleico obtenidas sintéticamente sin secuencia de bases definida. Las hebras simples efectúan entre sí apareamientos de bases irregulares, los denominados "Nicth-Watson-Crick", de modo que se forman hebras dobles de pares defectuosos. El dsARN conocido sirve para la inhibición de la propagación de retrovirus, como VIH. Se puede inhibir la propagación del virus si se introduce en las células dsARN de secuencia no específica. En este caso se llega a una inducción de interferona, mediante lo cual se debe inhibir la propagación de virus. El efecto inhibidor, o bien la eficacia de este procedimiento, es reducido.

Se conoce por Fire, A. et. al, NATURE, Vol. 391, página 806, que el dsARN, una de cuyas hebras es complementaria por secciones aún gen a inhibir de un nematodo, inhibe la expresión de este gen con una eficacia elevada. Sostendrá el concepto que la eficacia especial del dsARN empleado en células del nematodo no se basa en el principio antisentido, sino posiblemente en propiedades catalíticas del dsARN, o bien se puede atribuir a enzimas inducidos por el mismo. En este artículo no se dice nada sobre la eficacia de dsARN específico con relación a la inhibición de la expresión génica, en especial en células de mamíferos y células humanas.

La WO 99/53050 describe agentes y procedimientos para la reducción de la expresión génica en células eucariotas, en especial células vegetales, introduciéndose genes quiméricos que codifican moléculas de ARN tanto sentido, como también antisentido, que están orientadas contra el gen objetivo. Un oligorribonucleótido con dos hebras simples de ARN separadas, en especial para la inhibición de la expresión génica en células de mamíferos, no se da a conocer en la WO 99/53050.

La WO 00/63364 describe procedimientos y composiciones para la inhibición de la función de una secuencia de nucleótidos objetivo en una célula de mamífero. El agente previsto es un ARN de doble hebra al menos parcialmente, con una longitud mínima de 200 nucleótidos.

La WO 99/32619 describe ARN, que presentan una región con estructura de doble hebra para la inhibición de la expresión génica de un gen objetivo en una célula. La invención se ejemplifica por medio de la inhibición de la expresión génica en C. elegans. Las estructuras que se emplean en este caso tienen una longitud de varios cientos de pares de bases. En la WO 99/32619 no se describe un enlace químico de las hebras aisladas.

La WO 94/01550 describe agentes terapéuticos que encuentran empleo en carga terapéutica basada en oligonucleótidos antisentido.

Es tarea de la presente invención eliminar los inconvenientes según el estado de la técnica. Se debía indicar en especial un procedimiento, medicamento, o bien un empleo lo más eficiente posible para la obtención de un medicamento, con el cual se pueda provocar una inhibición especialmente eficaz de la expresión de un gen objetivo predeterminado.

La invención se define mediante las reivindicaciones. Correspondientemente, la invención pone a disposición un oligorribonucleótido con estructura de hebra doble (dsARN) para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en células de mamíferos, estando constituido el dsARN por 15 a 21 pares de bases, presentando una hebra de dsARN una zona I constituida por 15 a 21 pares de nucleótidos sucesivos complementarios al gen objetivo, y estando formada una zona II complementaria a la estructura de hebra doble por dos hebras simples de ARN separadas, estando estabilizada la estructura de hebra doble por enlace químico de las hebras simples.

Otros acondicionamientos resultan de las reivindicaciones 2 a 28.

Según la invención, para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en una célula de mamífero está previsto introducir un oligorribonucleótido que presenta 15 a 21 pares de bases, definido en las reivindicaciones, con estructura de hebra doble (dsARN) en la célula, presentando una hebra de dsARN una zona I complementaria al gen objetivo, que presenta a lo sumo 21 pares de nucleótidos sucesivos, y formándose una zona II complementaria dentro de la estructura de hebra doble por dos hebras sencillas de ARN separadas. El oligorribonucleótido presenta al menos por secciones una secuencia de nucleótidos definida. La sección definida puede estar limitada a la zona I complementaria. No obstante, también puede ser que el oligorribonucleótido de hebra doble presente en total una secuencia de nucleótidos definida. También se describe que el dsARN puede ser más largo que la zona I complementaria al gen objetivo. La zona I complementaria puede presentar disposición terminal, o estar insertada en el dsARN.

El dsARN según la invención se puede obtener por vía sintética, o bien enzimática con procedimientos de uso común.

Sorprendentemente, se ha mostrado que ya con una longitud de zona complementaria de menos de 25 pares de nucleótidos sucesivos, se puede conseguir una inhibición eficaz de la expresión del gen objetivo. Se pueden poner a disposición oligorribonucleótidos correspondientes con gasto de obtención más reducido.

En especial el dsARN con una longitud de más de 50 pares de nucleótidos induce determinados mecanismos celulares en células de mamíferos y células humanas, por ejemplo la proteína quinasa dependiente de dsARN, o el sistema 2-5A. Esto conduce a la desaparición del efecto de interferencia ocasionado por el dsARN que presenta una secuencia definida. De este modo se bloquea la biosíntesis de proteínas en la célula. En especial se elimina este inconveniente mediante la presente invención.

Además se facilita claramente la absorción de dsARN con longitud de cadena reducida en la célula, o bien en el núcleo celular, frente a dsARN de cadena más larga.

Se ha mostrado ventajoso que el dsARN se presente en estructuras micelares, preferentemente en liposomas. El dsARN puede estar incluido igualmente en cápsidas virales naturales, o en cápsidas sintéticas obtenidas por vía química o enzimática, o estructuras derivadas de las mismas. Las características citadas anteriormente posibilitan una inclusión del dsARN en células objetivo predeterminadas.

Convenientemente se exprime el gen a inhibir en células eucariotas. El gen objetivo puede ser seleccionado a partir del siguiente grupo: oncogén, gen de citoquina, gen de proteína Id, gen de desarrollo, gen prión. También se puede exprimir en organismos patógenos, preferentemente en plasmodios. Puede ser componente de un virus o viroide, preferentemente patógeno humano. El procedimiento propuesto posibilita la obtención de agentes para la terapia de enfermedades controladas genéticamente, por ejemplo cáncer, enfermedades virales o enfermedad de Alzheimer.

El virus o viroide puede ser también un virus o viroide patógeno animal o vegetal. En este caso, el procedimiento según la invención permite también la puesta a disposición de agentes para el tratamiento de enfermedades animales o vegetales.

Según otra característica de acondicionamiento, el dsARN presenta configuración de hebra doble por secciones. Los extremos del dsARN pueden estar modificados para contrarrestar una degradación en la célula o una disociación en las hebras simples. Se presenta una disociación en especial en el caso de empleo de bajas concentraciones o longitudes de cadena reducidas. Para la inhibición especialmente eficaz de la disociación se puede aumentar la cohesión de la estructura de hebra doble provocada por los pares de nucleótidos a través de al menos 1, preferentemente 2 enlaces químicos adicionales. Un dsARN según la invención, cuya disociación está reducida, presenta una estabilidad más elevada contra la degradación enzimática y química en la célula, o bien en el organismo.

Convenientemente se forma enlace químico mediante un enlace covalente o iónico, un enlace por puentes de hidrógeno, interacciones hidrófobas, preferentemente interacciones de van-der-Waals o de apilado, o mediante coordinación de iones metálicos. Según una característica de acondicionamiento especialmente ventajosa, se puede obtener el mismo al menos en 1, preferentemente en ambos extremos de la zona II complementaria.

Además se ha mostrado ventajoso formar el enlace químico por medio de uno o varios grupos de enlace, siendo los grupos de enlace preferentemente cadenas de poli-(oxifosfinicooxi-1,3-propanodiol) y/o polietilenglicol. Se puede formar el enlace químico también mediante análogos de purina utilizados en lugar de purinas en las zonas II complementarias. Además es ventajoso que el enlace químico se forme a través de unidades azabenceno introducidas en las zonas II complementarias. Además se puede formar el mismo mediante análogos de nucleótidos modificados utilizados en lugar de nucleótidos en las zonas II complementarias.

Se ha mostrado conveniente utilizar para la obtención del enlace químico al menos uno de los siguientes grupos: azul de metileno; grupos bifuncionales, preferentemente bis-(2-cloroetil)-amina; N-acetil-N'-(p-glioxilbenzoil)-cistamina; 4-tiouracilo; psoraleno. Además se puede formar el enlace químico mediante los grupos tiofosforilo introducidos en los extremos de la zona de hebra doble. Preferentemente se obtiene el enlace químico en los extremos de la zona de hebra doble mediante enlaces de triple hélice.

Se puede inducir el enlace químico convenientemente mediante luz ultravioleta.

Los nucleótidos de dsARN pueden estar modificados. Esto provoca un activado de una proteína quinasa dependiente de ARN de hebra doble, PKR en la célula. Ventajosamente, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos del dsARN en la estructura de hebra doble está reemplazado por un grupo químico, preferentemente un grupo 2'-amino o un grupo 2'-metilo. Al menos un nucleótido en al menos una hebra de la estructura de hebra doble puede ser también un denominado "locked nucleotide" con un anillo sacárico modificado químicamente, de modo preferente a través de un puente 2'-O, 4'-C-metileno. Ventajosamente, varios nucleótidos son "locked nucleotide".

Según otro acondicionamiento especialmente ventajoso está previsto que el dsARN esté enlazado, asociado, o rodeado por al menos una proteína envolvente viral procedente de un virus, derivada del mismo, u obtenida sintéticamente. La proteína envolvente puede ser derivada del virus de polioma. La proteína envolvente puede contener la proteína viral 1(VP1) y/o la proteína viral 2(VP2) del virus de polioma. Se conoce el empleo de tales proteínas envolventes, por ejemplo, por la DE 196 18 797 A1. Las características citadas anteriormente facilitan de manera esencial la introducción de dsARN en la célula.

En el caso de formación de una cápsida o de una estructura de tipo cápsida a partir de la proteína envolvente, uno de los lados está orientado al interior de la cápsida o de la estructura de tipo cápsida. La estructura formada es especialmente estable.

El dsARN puede ser complementario al elemento de trascripción de ARN primario o procesado del gen obtenido. La célula puede ser una célula de vertebrado o una célula humana.

Se puede introducir al menos dos dsARN diferentes entre sí en la célula, siendo una hebra de cada dsARN complementaria, al menos por secciones, respectivamente a uno de al menos dos genes objetivo diferentes. De este modo es posible inhibir simultáneamente la expresión de al menos dos genes objetivo diferentes. Para suprimir la expresión de una proteína quinasa dependiente de ARN de hebra doble PKR, en la célula, uno de los genes objetivo es ventajosamente el gen PKR. De este modo se puede suprimir eficazmente la actividad de PKR en la célula.

Además se describe un medicamento con al menos un oligorribonucleótido que presenta al menos 15 a 49 pares de bases con estructura de hebra doble (dsARN) para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en células de mamíferos, presentando una hebra de dsARN una zona I complementaria al gen objetivo al menos por secciones, que presenta a lo sumo 49 pares de nucleótidos sucesivos, y estando formada una zona II complementaria dentro de la estructura de hebra doble por dos hebras simples de ARN separadas. Sorprendente se ha mostrado que tal ARN es apropiado como medicamento para la inhibición de la expresión de un gen predeterminado en células de mamíferos. La inhibición se ocasiona ya a concentraciones que son más reducidas al menos en un orden de magnitud en comparación con el empleo de oligorribonucleótidos de hebra simple. El medicamento según la invención es altamente eficaz. Son de esperar efectos secundarios más reducidos. Sorprendentemente se ha mostrado que ya con una longitud de zona I complementaria de un máximo de 49 pares de bases se puede conseguir una inhibición eficiente de la expresión del gen objetivo. Se pueden poner a disposición oligorribonucleótidos correspondientes con gasto de obtención reducido.

Del mismo modo se describe un empleo de un oligorribonucleótido que presenta 15 a 49 pares de bases con estructura de hebra doble (dsARN) para la obtención de un medicamento para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en células de mamíferos, presentando una hebra de dsARN una zona I complementaria al gen objetivo al menos por secciones, que presenta a lo sumo 49 pares de nucleótidos sucesivos, y estando formada una zona II complementaria dentro de la estructura de hebra doble por dos hebras simples de ARN separadas. Sorprendentemente, tal dsARN es apropiado para la obtención de un medicamento para la inhibición de la expresión de un gen predeterminado. En el caso de un empleo de dsARN, la inhibición se ocasiona ya a concentraciones más reducidas en un orden de magnitud en comparación con el empleo de oligorribonucleótidos de hebra simple. Por lo tanto, el empleo citado posibilita la obtención de medicamentos especialmente eficaces.

Respecto a otros acondicionamientos del medicamento y al empleo se remite a la descripción de las características precedentes.

A continuación se explican más detalladamente ejemplos de realización de la invención por medio de las figuras. Muestran:

la figura 1 la representación esquemática de un plásmido para la trascripción in vitro con polimerasa T7 y SP6,

la figura 2 ARN según electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% y coloración de bromuro de etidio,

la figura 3 una representación de elementos de trascripción de ARN radioactivos según la electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% con urea 7 M por medio de un "Instant Imagers", y

las figuras 4a-e fluorescencia de Texas-Rot y YPF en fibroblastos murinos.

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Ejemplo de realización 1

Se identificó la inhibición de la trascripción mediante dsARN de secuencias homólogas en un sistema de trascripción in vitro con un extracto nuclear a partir de células HeLa humanas. La matriz de ADN para este ensayo era el plásmido linealizado por medio de BamHI pCMV1200.

Obtención de los plásmidos matriz

Para el empleo en la síntesis enzimática de dsARN se construyó el plásmido representado en la figura 1. A tal efecto se llevó a cabo en primer lugar una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con el kit de trascripción "positive control DNA" de HeLaScribe® Nuclear Extract in vitro de la firma Promega, Madison, USA como matriz de ADN. Uno de los cebadores empleados contenía la secuencia de un punto de corte EcoRI y del promotor de polimerasa T7-ARN según el protocolo de secuencia número 1. El otro cebador contenía la secuencia de un punto de corte BamHI y del promotor de polimerasa SP6-ARN según el protocolo de secuencia numero 2. Además, ambos cebadores presentan en sus extremos 3' zonas idénticas, o bien complementarias, respecto a la matriz ADN. Se llevó a cabo el PCR por medio del "Taq PCR Core Kit" de la firma Qiagen, Hilden, Alemania, según datos del fabricante. En un volumen de 100 \mul se emplearon como matriz MgCl_{2}1,5 mM, respectivamente dNTP 200 \muM, respectivamente cebador 0,5 \muM, 2,5 U de Taq-ADN-polimerasa, y aproximadamente 100 ng de "positive control DNA" como matriz en tampón de PCR. Tras el desnaturalizado inicial del ADN matriz mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos, se efectuó la amplificación en 30 ciclos de 60 segundos respectivamente de desnaturalizado a 94ºC, condensación de 60 segundos a 5ºC por debajo de la temperatura de fusión calculada del cebador, y 1,5-2 minutos de polimerización a 72ºC. Tras una polimerización final de 5 minutos a 72ºC se analizaron 5 \mul de la carga de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa. La longitud del fragmento de ADN amplificado de este modo ascendía a 400 pares de bases, correspondiendo 340 pares de bases al "positive control DNA". Se purificó el producto de PCR, se hidrolizó con EcoRI y BamHI, y tras nueva purificación se empleó para la unión con un vector pUC18, igualmente hidrolizado por medio de EcoRI y BamHI. Se efectuó la transformación de azul de E. Coli XL1. El plásmido obtenido (pCMV5) porta un fragmento de ADN, que es flanqueado en el extremo 5' por el promotor T7, y en el extremo 3' por el promotor SP6. Mediante linealizado del plásmido con BamHI, se puede emplear in vitro con la T7-ARN-polimerasa para la trascripción run-off de un ARN de 340 nucleótidos de longitud, representado en el protocolo de secuencia número 3, de hebras simple. Si se linealiza el plásmido con EcoRI, se puede emplear para la trascripción run-off con la SP6-ARN-polimerasa, produciéndose la hebra complementaria. Correspondientemente al procedimiento representado anteriormente se sintetizó también un ARN más largo en 23 nucleótidos. A tal efecto se unió un ADN representado en el protocolo de secuencia nº 4, a través de los puntos de corte EcoRI y BamHI, con el vector pUC18.

Como matrices de ADN para la transcripción in vitro con extracto nuclear HeLa se construyó el plásmido
pCMV1200. A tal efecto se amplificó un fragmento EcoRI/BamHI de 1191 bp de tamaño con el ADN de control positivo obtenido en el kit de transcripción HeLaScribe® Nuclear Extract in vitro, por medio de PCR. El fragmento amplificado comprendía el promotor CMV de 828 bp de tamaño "inmediatamente anterior", y un fragmento de ADN transcribible de 363 bp de tamaño. Se ligó el producto de PCR a través de un ligamiento "parte sobresaliente T" con el vector pGEM-T. En el extremo 5' del fragmento se encuentra un punto de corte BamHI. Se linealizó el plásmido mediante hidrólisis con BamHI, y se empleó como matriz para la transcripción run-off.

Trascripción in vitro de las hebras dobles complementarias

Se linealizó ADN de plásmido pCMV5 con EcoRI, o bien BamHI. Se empleó el mismo como matriz de ADN para una trascripción in vitro de las hebras simples de ARN complementarias con SP6, o bien T7-ARN-polimerasa. A tal efecto se empleó el sistema "Riboprobe in vitro Transcription" de la firma Promega, Madison, USA. Según los datos del fabricante se incubaron 2 \mug de ADN de plásmido linealizado en 100 \mul de tampón de trascripción y 40 U T7- o SP6-ARN- polimerasa 5 a 6 horas a 37ºC. A continuación se degradó la matriz de ADN mediante adición de 2,5 \mul de DNasa RQ1 exento de RNasa, e incubación durante 30 minutos a 37ºC. Se completó la carga de trascripción con H_{2}O a 300 \mul, y se purificó mediante extracción con fenol. Se precipitó el ARN mediante adición de 150 \mul de acetato amónico 7 M, y 1125 \mul de etanol, y se conservó a -65ºC para la hibridación.

Obtención de las hebras dobles de ARN

Para la hibridación se centrifugaron 500 \mul del ARN de hebras simple conservado en etanol y precipitado. Se secó el comprimido resultante, y se absorbió en 30 \mul de tampón PIPES, pH 6,4, en presencia de un 80% de formamida, 400 mM NaCl y 1 mM EDTA. Se reunieron respectivamente 15 \mul de hebras simples complementarias, y se calentaron durante 10 minutos a 85ºC. A continuación se incubaron las cargas a 50ºC durante la noche, y se enfriaron a temperatura ambiente.

En la hibridación se emplearon sólo cantidades aproximadamente equimolares de ambas hebras simples. De este modo, las preparaciones de dsARN contenían ARN (ssARN) de hebra simple como contaminación. Para eliminar estas contaminaciones de ssARN, se trataron las cargas tras la hibridación con las ribonucleasas específicas de hebras simple RNasaA de páncreas de vaca, y RNasaT1 de Aspergillus oryzae. RNasaA es una endorribonucleasa específica para pirimidinas. RNasaT1 es una endorribonucleasa, que corta preferentemente en el lado 3' de guanosinas. dsARN no es un sustrato para estas ribonucleasas. Para el tratamiento de RNasa se añadió a las cargas en 300 \mul Tris, pH 7,4, NaCl 300 mM y EDTA 5 mM, 1,2 \mul RNasaA en una concentración de 10 mg/ml y 2 \mul de RNasaT1 en una concentración de 290 \mug/ml. Se incubaron las cargas 1,5 horas a 30ºC. Después se desnaturalizaron las RNasas mediante adición de 5 \mul de proteinasaK en una concentración de 20 mg/ml, así como 10 \mul de SDS al 20%, e incubación durante 30 minutos a 37ºC. Se purificó el dsARN mediante extracción con fenol, y se precipitó con etanol. Para poder verificar la integridad de la digestión de RNasa, se trataron dos cargas de control con ssARN análogamente a las cargas de hibridación.

Se absorbió el comprimido desecado en 15 \mul de tampón TE, pH 6,5, y se sometió a una electroforesis en gel de poliacrilamida nativa en un gel al 8%. A continuación se tiñó el gel de acrilamida en una disolución de bromuro de etidio, y se lavó en un baño de agua. La figura 2 muestra el ARN visibilizado en un transiluminador UV. Los ARN sentido aplicados en la vía 1, y antisentido aplicados en la vía 2, mostraban bajo las condiciones seleccionadas un comportamiento de dilución diferente que los dsARN de la carga de hibridación aplicados en la vía 3. El ARN sentido, o bien antisentido aplicado en las vías 4, o bien 5, tratado con RNasa no generaba ninguna banda visible. Esto muestra que los ARNs de hebra simple se degradaron completamente. El dsARN aplicado en la vía 6, tratado con RNasa de la carga de hibridación, es resistente frente al tratamiento con RNasa. La banda de migración más rápida en el gel nativo en comparación con el dsARN aplicado en la vía 3, resulta de dsARN, que está exento de ssARN. Además de las bandas principales dominantes, tras el tratamiento con RNasa se presentan bandas más débiles, de migración más rápida.

Test de trascripción in vitro con extracto nuclear celular humano

Bajo empleo del kit de trascripción HeLaScribe® Nuclear Extract in vitro de la firma Promega, Madison, USA se determinó la eficiencia de trascripción del fragmento de ADN indicado anteriormente, obtenido en el plásmido pCMV1200, homólogo al "positive control DNA", en presencia del dsARN (dsARN-CMV5) de secuencias homólogas. Además se analizó la influencia de dsARN (dsARN-YFP) de secuencias no homólogas, correspondiente al gen (YFP) "proteína fluorescente amarilla". Este dsARN se había obtenido análogamente al dsARN de secuencias homólogas. La secuencia de una hebra de este dsARN se puede extraer del protocolo de secuencia número 5. Como matriz para la trascripción run-off sirvió el plásmido pCMV1200. Este porta el promotor "inmediatamente anterior" del virus de citomegalia, que es identificado por las polimerasas de ARN eucariotas II, y un fragmento de ADN transcribible. La trascripción se efectuó por medio del extracto nuclear HeLa, que contenía todas las proteínas necesarias para una trascripción. Mediante adición de [\alpha^{-32}P]rGTP a la carga de trascripción se obtuvo un elemento de trascripción marcado radioactivamente. El [\alpha^{-32}P]rGTP empleado tenía una actividad específica de 400 Ci/mmol, 10 mCi/ml. Por carga se emplearon MgCl_{2}3 mM, respectivamente rATP, rCTP, rUTP400 \muM, rGTP16 \muM, [\alpha^{-32}P]rGTP 0,4 \muM, y según ensayo, un mol de ADN de plásmido linealizado, y diferentes cantidades de dsARN en el tampón de trascripción. Cada carga se completó con H_{2}O a un volumen de 8,5 \mul se mezclaron cuidadosamente las cargas. Para la iniciación de la trascripción se añadieron 4 U de extracto nuclear HeLA en un volumen de 4 \mul y se incubaron durante 60 minutos a 30ºC. Se concluyó la reacción mediante adición de 87,5 \mul al Stopp-Mix calentado a 30ºC. Para la eliminación de las proteínas se mezclaron las cargas con 100 \mul de fenol/cloroformo, alcohol isoamílico (25:24:1, v/v/v), saturado con tampón TE, pH 5,0, y se mezclaron intensivamente 1 minuto. Para la separación de fases se centrífugo aproximadamente 1 minuto a 12.000 rpm, y se trasladó la fase superior a un nuevo recipiente de reacción. Se añadieron a cada carga 250 \mul de etanol. Se mezclaron convenientemente las cargas y se incubaron durante al menos 15 minutos en hielo seco/metanol. Para la precipitación de ARN se centrifugaron las cargas 20 minutos a 12.000 rpm y 4ºC. Se desechó el exceso. Se secó el comprimido 15 minutos en vacío, y se resuspendió en 10 \mul de H_{2}O. Se añadieron a cada carga 10 \mul de tampón de muestra desnaturalizado. La separación del GTP libre del elemento de trascripción producido se efectuó por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante en un gel al 8% con urea 7 M. Los elementos de trascripción ARN formados en la trascripción con el extracto nuclear HeLa en tampón de muestra desnaturalizante, se calentaron 10 minutos a 90ºC, e inmediatamente se aplicaron 10 \mul de los mismos en las bolsas de muestra recién lavadas. La electroforesis se efectuó a 40 mA. La cantidad de ssARN radioactivo formado en la trascripción se analizó tras la electroforesis con ayuda de un Instant Imager.

La figura 3 muestra el ARN radioactivo sintetizado por medio del Instant Imagers a partir de un test representativo. Se aplicaron muestras obtenidas a partir de las siguientes cargas de trascripción:

vía 1:: sin ADN matriz, sin dsARN;

vía 2:: 50 ng de ADN matriz, sin dsARN;

vía 3:: 50 ng de ADN matriz, 0,5 \mug de dsARN-YPF;

vía 4:: 50 ng de ADN matriz, 1,5 \mug de dsARN-YPF;

vía 5:: 50 ng de ADN matriz, 3 \mug de dsARN-YPF;

vía 6:: 50 ng de ADN matriz, 5 \mug de dsARN-YPF;

vía 7:: sin ADN matriz, 1,5 de dsARN-YPF;

vía 8:: 50 ng de ADN matriz, sin dsARN;

vía 9:: 50 ng de ADN matriz, 0,5 \mug de dsARN-CMV5;

vía 10:: 50 ng de ADN matriz, 1,5 \mug de dsARN-CMV5;

vía 11:: 50 ng de ADN matriz, 3 \mug de dsARN-CMV5;

vía 12:: 50 ng de ADN matriz, 5 \mug de dsARN-CMV5;

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Se mostró una clara reducción de la cantidad de elemento de trascripción en presencia de dsARN de secuencias homólogas en comparación con la carga de control sin dsARN, así como también respecto a las cargas con dsARN-YFP de secuencias no homólogas. El control positivo en la vía 2 muestra que, en la trascripción in vitro con extracto nuclear HeLa, se formó elemento de trascripción radioactivo. La carga sirve como comparación con las cargas de trascripción, que se habían incubado en presencia de dsARN. Las vías 3 a 6 muestran que la adición de dsARN-YFP de secuencias no específicas no ejerce ninguna influencia sobre la cantidad del elemento de trascripción formado. Las vías 9 a 12 muestras que la adición de una cantidad, situada entre 1,5 y 3 \mug, de dsARN-CMV5 de secuencias específicas, conduce a un descenso de la cantidad de elemento de trascripción formado. Para excluir que los efectos observados no se basen en el dsARN, sino en una contaminación arrastrada posiblemente de manera involuntaria en la obtención de dsARN, se llevó a cabo un control adicional. Se trascribió como se ha descrito anteriormente el ARN de hebra simple, y a continuación se sometió al tratamiento con RNasa. Por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida nativa se pudo mostrar que el ssARN se había degradado completamente. Esta carga se sometió, como las cargas de hibridación, a una extracción con fenol y una precipitación con etanol, y a continuación se absorbió en tampón TE. De este modo se obtuvo una muestra que no contenía ARN, pero que se había tratado con los mismos enzimas y tampones que el dsARN. La vía 8 muestra que la adición de esta muestra no tiene influencias sobre la trascripción. El descenso del elemento de trascripción en el caso de adición de dsARN de secuencias específicas, por lo tanto, se puede asignar claramente al propio dsARN. La reducción de la cantidad de elemento de trascripción de un gen en presencia de dsARN en el caso de un sistema de trascripción humano muestra una inhibición de la expresión del gen correspondiente. Este efecto se puede atribuir a un nuevo mecanismo, provocado por el dsARN.

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Ejemplo de realización 2

Como sistema de ensayo para estos experimentos in vivo sirvió la línea celular de fibroblastos murinos NIH3T3, ATCC, CRL-1658. Con ayuda de la microinyección se introdujo el gen del YFP en el núcleo celular. Se analizó la expresión de YFP bajo la influencia de dsARN de secuencias homólogas, transferidos de modo concomitante simultáneamente. Este dsARN-YFP es, a través de una longitud de 315 bp, homólogo a la zona 5' del gen de YFP. La secuencia de nucleótidos de una hebra de dsARN-YFP se representa en el protocolo de secuencia número 5. La valoración bajo el microscopio de fluorescencia se efectuó 3 horas después de inyección por medio de fluorescencia amarilla-verde de YFP formado.

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Construcción del plásmido matriz y obtención del dsARN

Como matriz para la obtención de YFP-dsARN por medio de trascripción T7 y SP6-in vitro se construyó un plásmido según el mismo principio que se describe en el ejemplo de realización 1. El fragmento génico deseado se amplificó bajo empleo del cebador Eco_T7_YFP según el protocolo de secuencia número 6, y Bam_SP6_YFP según el protocolo de secuencia número 7, por medio de PCR, y se empleó análogamente a la anterior descripción respecto a la obtención de dsARN. El dsARN-YFP obtenido es idéntico al dsARN empleado en el ejemplo de realización 1 como control de secuencias no específicas.

Se obtuvo un dsARN (L-dsARN) enlazado químicamente con el extremo 5' del ARN complementario en el extremo 3' del ARN según el protocolo de secuencia número 8 a través de un grupo cebador C18. A tal efecto se emplearon sintones modificados con puentes disulfuro. El sintón 3' terminal está unido al soporte sólido a través del carbono 3' con un grupo cebador alifático a través de un puente disulfuro. En el sintón 5' terminal del oligorribonucleótido complementario, complementario al sintón 3'-terminal de uno de los oligorribonucleótidos, el grupo protector 5'-tritilo está enlazado a través de un cebador alifático adicional y un puente disulfuro. Tras la síntesis de ambas hebras simples, eliminación de grupos protectores e hibridación de los oligorribonucleótidos complementarios, los grupos tiol producidos llegan a la proximidad espacial entre sí. Mediante oxidación se enlazan entre sí las hebras simples a través de su cebador alifático y un puente disulfuro. A continuación se efectúa la purificación con ayuda de HPLC.

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Preparación de cultivos celulares

Se incubaron las células en DMEM con 4,5 g/l de glucosa, 10% de suero vacuno fetal bajo un 7,5% de atmósfera de CO_{2} a 37ºC en cubetas de cultivo, y se pasaron antes de la consecución de la confluencia. El desprendimiento de las células se efectuó con tripsina/EDTA. Para la preparación de la microinyección se trasladaron las células a cubetas de petri, y se incubaron adicionalmente hasta la formación de microcolonias.

Microinyección

Para la microinyección se extrajo las cubetas de cultivo del incubador durante aproximadamente 10 minutos. Se inyectó de manera aislada en aproximadamente 50 núcleos celulares por carga dentro de una zona marcada bajo empleo del sistema de microinyección AIS de la firma Carl Zeiss, Göttingen, Alemania. A continuación se incubaron las células otras 3 horas. Para la microinyección se prepararon capilares de vidrio de silicato bórico de la firma Hilgenberg GmBH, Malsfeld, Alemania, con un diámetro de punta por debajo de 0,5 \mum. Se llevó a cabo la microinyección con un micromanipulador de la firma Narishige Scientific Instrument Lab., Tokio, Japón. El tiempo de inyección ascendía a 0,8 segundos, la presión aproximadamente a 100 hPa. Para la transfección se empleó el plásmido pCADN-YFP, que contenía un fragmento BamHI/EcoRI de aproximadamente 800 bp de tamaño con el gen de YFP en el vector pcADN3. Las muestras inyectadas en los núcleos celulares contenían 0,01 \mug/\mul de pCADN-YFP, así como Texas-Rot copulado en dextrano-70.000 en NaCl 14 mM, KCl 3 mM, KPO_{4} 10 mM, pH 7,5. Adicionalmente se añadieron unos 100 pl de ARN con una concentración de 1 \muM, o bien 375 \muM en el caso de L-dsARN.

Se analizaron las células por medio de un microscopio de fluorescencia en el caso de excitación con luz de longitudes de onda de excitación de Texas-Rot, 568 nm, o bien de YFP, 488 nm. Se documentaron células aisladas por medio de una cámara digital. Las figuras 4a-e muestran el resultado para células NIH3T3. EN el caso de las células mostradas en la figura 4a se ha inyectado YFP-ssARN sentido, en la figura 4b YFP-ssARN antisentido, en la figura 4c dsARN-YFP, en la figura 4d no se ha inyectado ARN y en la figura 4e se ha inyectado LdsARN.

El campo izquierdo respectivamente muestra la fluorescencia de células que se excitaron con 568 nm. A la derecha se puede ver la fluorescencia de las mismas células en el caso de excitación con 488 nm. La fluorescencia de Texas-Rot de todas las células representadas muestran que la disolución de inyección se aplicó con éxito en los núcleos celulares, y las células afectadas estaban aún vivas después de 3 horas. Las células muertas ya no mostraban fluorescencia de Texas-Rot.

Los campos derechos respectivamente de las figuras 4a y 4b muestran que la expresión de YFP no se inhibió de manera visible en el caso de inyección de ARN de hebra simple en los núcleos celulares. El campo derecho de la figura 4c muestra células cuya fluorescencia de YFP ya no era identificable tras la inyección de dsARN-YFP. La figura 4d muestra como control células en las que no se había inyectado ARN. La célula representada en la figura 4e muestra, a través de la inyección de L-dsARN, que presenta zonas de secuencias homólogas al gen de YFP, una fluorescencia de YFP ya no identificable. Este resultado justifica que también los dsARN más cortos se pueden emplear para la inhibición específica de la expresión génica en mamíferos, si se estabilizan las hebras doble mediante enlace químico de las hebras simples.

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Literatura

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<110> Alnylam Europe AG

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<120> Oligorribonucleótido para la inhibición de la expresión de un gen predeterminado

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<130> 453722EH

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<140>

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<141>

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<150> 199 03 713.2

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<151> 1999-01-30

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<150> 199 56 568.6

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<151> 1999-11-24

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<160> 8

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<170> Patentin Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: punto de corte EcoRI, promotor de polimerasa T7-ARN

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaattctaa tacgactcac tatagggcga tcagatctct agaag

\hfill

45

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<210> 2

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: punto de corte BamHI, promotor de polimerasa SP6-ARN

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggatccatt taggtgacac tatagaatac ccatgatcgc gtagtcgata

\hfill

50

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<210> 3

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<211> 340

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ARN, que corresponde a una secuencia de "positive control DNA" del kit de trascripción HeLaScribe Nuclear Extract in vitro de la firma Promega

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<400> 3

1

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<210> 4

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<211> 363

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 4

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3

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<210> 5

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<211> 315

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del gen YFP

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<400> 5

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4

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<210> 6

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Punto de corte EcoRI, promotor de polimerasa T7-ARN, zona complementaria al gen YFP

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaattctaa tacgactcac tatagggcga atggtgagca agggcgagga gc

\hfill

52

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<210> 7

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<211> 53

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Punto de corte BamHI, promotor de polimerasa SP6-ARN, zona complementaria al gen YFP

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggatccatt taggtgacac tatagaatac gccgtcgtcc ttgaagaaga tgg

\hfill

53

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<210> 8

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<211> 21

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ARN, que corresponde a una secuencia del gen YFP

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<400> 8

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ucgagcugga cggcgacgua a

\hfill

21

Claims

1. Oligorribonucleótido con estructura de doble hebra (dsARN) para la inhibición de la expresión de un gen objetivo predeterminado en células de mamíferos, estando constituido el dsARN por 15 a 21 pares de bases, y presentando una hebra de dsARN una zona I complementaria al gen objetivo, constituida por 15 a 21 pares de nucleótidos sucesivos, y estando formada una zona II complementaria dentro de la estructura de hebra doble por II hebras simples de ARN separadas, estando estabilizada la estructura de hebra doble por enlace químico de las hebras simples.

2. DsARN según la reivindicación 1, siendo seleccionado el gen objetivo a partir del siguiente grupo: oncogen, gen de citoquina, gen de proteína Id, gen de desarrollo, gen PKR, gen prión.

3. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, presentándose el dsARN empaquetado en estructuras micelares, preferentemente en liposomas.

4. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, estando incluido el dsARN en cápsidas virales naturales, o en cápsidas artificiales obtenidas por vía química o enzimática, o estructuras derivadas de las mismas.

5. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, siendo el gen objetivo componente de un virus.

6. DsARN según la reivindicación 5, siendo el virus, un virus patógeno humano.

7. DsARN según la reivindicación 5, siendo el virus o viroide un virus patógeno animal.

8. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, presentando el dsARN configuración de hebra doble al menos por secciones.

9. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, estando modificados los extremos de dsARN para contrarrestar una degradación en las células de mamíferos o una disociación en las hebras simples.

10. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, siendo elevada la cohexión de la zona complementaria II, ocasionada por los pares de nucleótidos, a través de al menos uno, preferentemente dos enlaces químicos adicionales.

11. DsARN según la reivindicación 10, formándose el enlace químico mediante un enlace covalente o iónico, un enlace por puentes de hidrógeno, interacciones hidrófobas, preferentemente interacciones de van-der-Waals o de apilado, o mediante coordinación de iones metálicos.

12. DsARN según la reivindicación 10 u 11, siendo obtenido el enlace químico en al menos uno, preferentemente en ambos extremos de la zona complementaria II.

13. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, estando formado el enlace químico por medio de uno o varios grupos de enlace, siendo los grupos de enlace preferentemente cadenas de poli-(oxifosfinicooxi-1,3-propanodiol) y/o polietilenglicol.

14. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, siendo formado el enlace químico a través de análogos de purina utilizados en las zonas II complementarias en lugar de purinas.

15. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, estando formado el enlace químico a través de unidades azabenceno introducidas en la zonas II complementarias.

16. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, estando formado el enlace químico a través de análogos de nucleótidos ramificados utilizados en lugar de nucleótidos en las zonas II complementarias.

17. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, utilizándose para la obtención del enlace químico al menos uno de los siguientes grupos: azul de metileno; grupos bifuncionales, preferentemente bis-(2-cloroetil)-amina; N-acetil-N'-(p-glioxil-benzoil)-cistamina; 4-tiouracilo; psoraleno.

18. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, formándose el enlace químico mediante grupos tiofosforilo previstos en los extremos de la zona de hebra doble.

19. DsARN según una de las reivindicaciones 10 a 12, siendo el enlace químico enlaces de triple hélice previstos en los extremos de la zona de hebra doble.

20. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, estando modificados los nucleótidos de dsARN.

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21. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, estando substituido al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos del dsARN en la zona complementaria II por un grupo químico, preferentemente un grupo 2'-amino, o 2'-metilo.

22. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, siendo al menos un nucleótido en al menos una hebra de la zona II complementaria un "locked nucleotide" con un anillo sacárico modificado químicamente, preferentemente por medio de un puente 2'-O, 4'-C-metileno.

23. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, enlazándose el dsARN a al menos una proteína envolvente viral procedente de un virus, derivado del mismo, u obtenida sintéticamente, asociándose con la misma, o envolviéndose por la misma.

24. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, siendo la proteína envolvente derivada del virus de polioma.

25. DsARN según la reivindicación 24, conteniendo la proteína envolvente la proteína viral 1 (VP1) y/o la proteína viral 2 (VP2) del virus de polioma.

26. DsARN según la reivindicación 24 o 25, estando orientado un lado al interior de la cápsida o estructura de tipo cápsida, en el caso de formación de una cápsida o estructura de tipo cápsida a partir de la proteína envolvente.

27. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, siendo el dsARN complementaria al elemento de trascripción de ARN primario o procesado del gen objetivo.

28. DsARN según una de las reivindicaciones precedentes, siendo las células de mamífero células humanas.