ES2323056T3

ES2323056T3 - Anticuerpos dirigidos contra factor tisular como anticoagulantes.

Info

Publication number: ES2323056T3
Application number: ES03721974T
Authority: ES
Inventors: David Light; Kirk Mclean
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2009-07-06
Anticipated expiration: 2023-04-30
Also published as: EP1549341A4; MXPA04010795A; JP4567437B2; DK1503785T3; MXPA04010851A; NO20035849L; EP1503785A4; US7250168B2; ES2354419T3; PT1503785E; WO2003093422A2; PL373945A1; EP1503785B1; JP2005538046A; RU2345789C2; US7622457B2; US20080020965A1; ATE427121T1; JP2005532045A; IL164732A0

Abstract

Un anticuerpo anticoagulante que se une con mayor afinidad al complejo de factor FVIIa/factor tisular (FVIIa/TF) que al factor tisular (TF) en solitario, en el que dicho anticuerpo tiene una identidad de al menos aproximadamente el 90%, o una identidad de al menos el 95%, o una identidad de al menos el 97% con los dominios de las regiones VL y VH de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3, y en el que dicho anticuerpo no compite por la unión a TF con uno o más de los factores de coagulación seleccionados del grupo constituido por factor VII (FVII) y factor X (FX).

Description

Anticuerpos dirigidos contra factor tisular como anticoagulantes.

Antecedentes

El mantenimiento del equilibrio apropiado entre la actividad procoagulante y anticoagulante en el interior de vasos sanguíneos es esencial para una hemostasia normal (Davie, E. W. y col. (1991) Biochemistry, 30 (43): 10363-10370). La alteración del equilibrio hacia la coagulación conduce a trombosis, que puede causar ataque cardiaco, apoplejía, embolia pulmonar y trombosis venosa. Existe la necesidad de anticoagulantes más eficaces y seguros para el tratamiento de trastornos trombóticos específicos.

El factor tisular ("TF") es una glicoproteína transmembrana que es el iniciador principal de la cascada de coagulación (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74 (1): 180-184). En condiciones fisiológicas normales el TF activo no está en contacto con la sangre. Durante una lesión vascular, la exposición a la sangre del TF y del colágeno subendoteliales conduce a la activación de factores de coagulación y plaquetas y, posteriormente, a la formación de un trombo hemostático. El TF expuesto actúa como un cofactor para la activación catalizada por factor VIIa ("FVIIa") del factor IX ("FIX") y del factor X ("FX"), componentes críticos de los complejos de intrínsecos tenasa y protrombinasa, respectivamente. Esto conduce a una rápida formación de FXa y trombina. Después, la trombina escinde el fibrinógeno en fibrina, que posteriormente se polimeriza para formar el coágulo de fibrina. La inducción inapropiada de la expresión de TF en una diversidad de entornos clínicos puede conducir a una trombosis potencialmente mortal y/o contribuir a complicaciones patológicas. Se piensa que la exposición a TF después de la ruptura de una placa es responsable de la oclusión trombótica que conduce a un infarto agudo de miocardio y a una apoplejía. En estos entornos, las rutas de señalización proinflamatorias activadas por factores de coagulación también contribuyen a la formación de edema y aumentan el tamaño del infarto. La lesión vascular asociada con una angioplastia conduce a una regulación positiva de TF en SMC que se piensa que induce rutas de señalización celular asociadas con reestenosis. La sobreexpresión de TF en cáncer y
septicemia por gram-negativas conduce a una trombosis potencialmente mortal y activación de rutas inflamatorias.

El complejo FVIIa/TF está implicado en el mecanismo patógeno en una diversidad de enfermedades trombóticas y el nivel circulante de TF es un factor de riesgo para ciertos pacientes. FVIIa y TF desempeñan papeles únicos en lesiones vasculares en el mantenimiento de la hemostasia y el inicio de la trombosis. El TF se expresa normalmente en la túnica adventicia, pero está regulado positivamente y expresado de forma inapropiada en la túnica media y la neoíntima en enfermedades vasculares. La expresión de TF en placas ateroscleróticas está aumentada y protegida de la sangre por una cubierta fibrosa fina que puede romperse exponiendo el TF. Las intervenciones quirúrgicas tales como angioplastia con globo, introducción de endoprótesis vasculares o endoarterectomía lesionan la pared de los vasos y exponen el TF subyacente. En la placa aterosclerótica, rica en lípidos y de pared fina, la ruptura espontánea o la erosión endotelial conduce a la exposición de TF y trombosis, dando como resultado una angina inestable e infarto de miocardio. El TF puede circular en micropartículas derivadas de células y los niveles de TF circulantes se elevan en la angina inestable, sugiriendo que este TF circulante puede contribuir a la formación de trombos (Soejima, H. y col. (1999) Circulation 99 (22): 2908-2913). Con frecuencia el cáncer se asocia con un estado hipercoagulable atribuido a la sobreexpresión de TF en células tumorales. Esto predispone al paciente a una trombosis venosa profunda, embolia pulmonar y coagulación intravascular diseminada ("CID") de bajo grado. La CID da como resultado una deposición de fibrina microvascular que contribuye a una insuficiencia multiorgánica.

Los anticoagulantes basados en proteínas que se dirigen al TF incluyen anticuerpos neutralizantes de TF, factor VIIa con sitio activo inhibido ("FVIIai"), inhibidor de la ruta del factor tisular ("TFPI") y proteína anticoagulante de nematodos ("NAPC2"). Los resultados de modelos de trombosis de lesión arterial aguda indican que los inhibidores basados en proteínas de factor FVIIa/TF son antitrombóticos eficaces con un sangrado menor en comparación con la heparina, inhibidores directos de la trombina, inhibidores de plaquetas e inhibidores del FXa (Himber, J. y col. (2001) Thromb. Haemost. 85: 475-481; Harker, L. A. y col. (1995) Thromb. Haemost. 74 (1): 464-472). Además, la inhibición de FVIIa/TF es superior a otros anticoagulantes (por ejemplo, heparina, inhibidores de FXa) en la prevención del engrosamiento de la neoíntima y la estenosis vascular después de una lesión con globo (Jang, Y. y col. (1995) Circulation 92 (10): 3041-3050).

La inhibición de TF, FVIIa o del complejo FVIIa/TF es un enfoque antitrombótico eficaz para prevenir la CID y reducir la mortalidad en modelos experimentales de septicemia. Los análogos de TFPI previenen tanto la CID inducida por tromboplastina como por endotoxina en conejos (Day, K. C. y col. (1990) Blood 76: 1538-1545; Bregengard, C. y col. (1993) Blood Coagul. Fibrinolysis 4: 699-706). Los anticuerpos monoclonales contra FVIIa (Biemond, B. J. y col. (1995) Thromb. Haemost. 73: 223-230) o (Levi, M. y col. (1994) J. Clin. Invest. 93: 114-120) previenen la CID inducida por entotoxina en monos. Los anticuerpos neutralizantes de TF, FVIIai y TFPI inhiben la CID y reducen la mortalidad en un modelo de babuino de septicemia inducida por E. coli (Creasey, A. A. y col. (1993) J. Clin. Invest. 91: 2850-2860; Taylor, F. B. y col. (1991a) Blood 78: 364-368; Taylor, F. B. y col. (1991b) Circ. Shock 33: 127-134; Taylor, F. B. (1996) Haemostasis Suppl. 1 26: 83-91). Se sabe que tanto el FXa libre como el complejo FVIIa/TF/FXa inducen la producción de citoquinas proinflamatorias que están asociadas con un riesgo aumentado de muerte en pacientes con septicemia (Riewald, M. y col. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7742-7747). De forma interesante, se ha demostrado que FVIIai disminuye los niveles plasmáticos de IL-6 e IL-8 en el modelo de babuino (Taylor, F. B. y col. (1998) Blood 91: 1609-1615), sugiriendo que la inhibición de FVIIa/TF puede tener efectos antiinflamatorios adicionales no compartidos por otros mecanismos anticoagulantes.

Se han descrito varios anticuerpos que son anticoagulantes eficaces que se unen a y neutralizan el TF o el complejo FVIIa/TF o ambos (véase, por ejemplo, Carson, S. D. y col. (1985) Blood 66 (1): 152-156; Tanaka, H. y col. (1985) Thromb. Res. 40 (6): 745-756; Kirchhofer, D. y col. (2000) Throomb. Haemost. 84 (6); 1072-1081; Kirchhofer, D. y col. (2001) Biochemistry 40 (3): 675-682; Faelber, K. y col. (2001) J. Mol. Biol. 313: 83-97; y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.506.134, 5.986.065 y 6.274.142) y adicionalmente los documentos WO 01/709 84, WO 88/07543, WO 98/40408 y WO 03/037911. Los anticuerpos dirigidos contra TF de la presente invención son anticoagulantes eficaces que tienen características mejoradas sobre los anticuerpos de TF descritos anteriormente. En particular, los anticuerpos de la invención se unen con una mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario y no compiten con FVII o FX por la unión a TF.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos que actúan como anticoagulantes, que se unen con mayor afinidad al complejo factor VIIa/factor tisular ("FVIIa/TF") que al factor tisular ("TF") en solitario. En una realización, los anticuerpos de la invención se unen con una afinidad al menos 2 veces superior al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario, como se mide en un ensayo de microcalorimetría. En una realización preferida, los anticuerpos de la invención se unen con una afinidad al menos 5 veces superior al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario. En una realización más preferida, los anticuerpos de la invención se unen con una afinidad al menos 10 veces superior al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario. En otra realización, los anticuerpos de la invención no compiten por la unión a TF con uno o más factores de coagulación seleccionados del grupo constituido por factores VII ("FVII") y X ("FX"). En una realización preferida, los anticuerpos de la invención no compiten por la unión a TF con FVII y con FX. En una realización más preferida, los anticuerpos de la invención se unen con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario y no compiten por la unión a TF con FVII y con FX.

El anticuerpo anticoagulante de esta invención se dirige y se une al complejo FVIIa/TF en el sitio de la lesión e inhibe la activación de factor X ("FX"), evitando de este modo la formación de trombos y, por lo tanto, funcionando eficazmente como anticoagulante en el tratamiento de ciertas enfermedades que incluyen, pero sin limitación, septicemia, coagulación intravascular diseminada, apoplejía isquémica, trombosis venosa profunda, síndromes coronarios agudos, complicaciones trombóticas después de una angioplastia y coagulopatía en el cáncer avanzado. Además, el anticuerpo tiene utilidad en la cirugía microvascular, injertos cutáneos y venosos y trasplantes de órganos.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los presentes anticuerpos.

En otro aspecto, la invención proporciona un uso del anticuerpo de esta invención para proteger frente a la formación de trombos.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso del anticuerpo de esta invención para reducir y tratar la trombosis venosa profunda ("DVT") o la coagulación intravascular diseminada ("CID") o el síndrome coronario agudo o una coagulopatía desarrollada en un cáncer.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso del anticuerpo de esta invención para regular la respuesta inflamatoria en un paciente.

En otro aspecto más, el anticuerpo de la invención puede usarse para formar un recubrimiento no trombogénico sobre la superficie de dispositivos médicos que entran en contacto con la sangre.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo de la invención que se une al complejo FVIIa/TF. Como alternativa, el kit puede comprender secuencias de ADN que codifican los componentes de anticuerpos.

También se describen procedimientos para preparar los anticuerpos de la invención, tanto de forma recombinante como sintética.

Descripción de las figuras

Figura 1. Actividad de anticuerpos de cadena sencilla que se unen a TF en el ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa. El ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando una mezcla en equilibrio de FVIIa (5 nM) y sTF (10 nM), basándose en la afinidad de FVIIa por sTF (K_{D(ap)} = \sim10 nM). La hidrólisis del sustrato peptídico cromogénico S2266 se controló como se describe. Se indican las concentraciones finales de los anticuerpos de cadena sencilla expresados en bacterias y las proteínas de control FVIIai (FVIIa inactivado por una clorometilcetona de un péptido, PPACK) y Mab#4504 (American Diagnostica).

Figura 2. La unión de scFv(TF)3e10 a sTF aumenta la afinidad aparente de sTF por FVIIa. El ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando FVIIa 2 nM en presencia y ausencia de scFv(TF)3e10 expresado en bacterias 800 nM. Se valoró el sTF en el ensayo y se determinó la velocidad de escisión del sustrato peptídico cromogénico S2266. La K_{D} aparente para sTF se calculó usando un ajuste de 4 parámetros convencional.

Figura 3. Actividad de anticuerpos de cadena sencilla que se unen a TF en el ensayo del tiempo de protrombina (TP). El ensayo de TP se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando tromboplastina humana recombinante (Dade, Inc.) que contenía el TF humano de longitud completa en vesículas fosfolipídicas. Se indican las concentraciones finales de los anticuerpos de cadena sencilla expresados en bacterias y la proteína de control FVIIai.

Figura 4. Medición de la afinidad de unión aparente de scFv(TF)3e10 por sTF. El ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando sTF 3 nM y FVIIa 2 nM. La concentración de sTF usada era inferior a la K_{D} para la unión a FVIIa. Se añadió scFv(TF)3e10 expresado en bacterias a concentraciones crecientes y se usó la velocidad de reacción aumentada para determinar la K_{D} aparente de este anticuerpo para sTF usando un ajuste de 4 parámetros convencional. La afinidad de scFv(TF)3e10 por el complejo sTF/FVIIa (K_{D(ap)} = 65 nM) es superior a la afinidad de scFv(TF)3e10 por sTF, medida usando BIAcore (K_{D(ap)} = 470 nM).

Figura 5. Medición de la afinidad de unión de scFv(TF)3e10 por TF y el complejo FVIIa/TF. El ensayo de microcalorimetría se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando scFv(TF)3e10 expresado en células CHO. Este ensayo muestra que el scFv(TF)3e10 tiene una afinidad \sim20 veces superior por el complejo sTF/FVIIa ("Complejo") que por sTF ("TF libre").

Figura 6. El scFv(TF)3e10 inhibe de forma dependiente de la dosis la activación de FX. El ensayo de activación de FX se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando concentraciones crecientes de scFv(TF)3e10 expresado en bacterias, FX 250 nM y el complejo FVIIa/TF en una superficie fosfolipídica (FVIIa 10 pM). La CI_{50} representa la dosis necesaria para alcanzar el 50% de la inhibición máxima.

Figura 7. El scFv(TF)3e10 inhibe de forma no competitiva la activación de FX por el complejo FVIIa/TF. El ensayo de activación de FX se realizó como se describe en el Ejemplo 4 usando scFv(TF)3e10 expresado en bacterias, FX de 25 nM a 400 nM y el complejo FVIIa/TF en una superficie fosfolipídica (FVIIa 10 pM). Se valoraron en el ensayo concentraciones crecientes de scFv(TF)3e10 (0 nM, cuadrados en blanco; 0,25 nM, rombos en blanco; 0,74 nM, triángulos en blanco, 2,2 nM, círculos en blanco; 6,7 nM, rombos rellenos, 20 nM, triángulos rellenos). Esta representación de Lineweaver-Burk de (1/[S], donde S (sustrato) = factor X (\muM); frente a 1/v, donde v (velocidad) = mDO/min de hidrólisis de S2222 por el FXa producido durante un intervalo de 5 min) indica que scFv(TF)3e10 es un inhibidor no competitivo con respecto al sustrato, FX. Todas las líneas cortan (o casi) el eje x, como se esperaba para un inhibidor no competitivo (para un inhibidor competitivo todas las líneas deberían cortar el eje y).

Figura 8. El scFv(TF)3e10 es eficaz en un modelo in vivo de coagulación intravascular diseminada ("CID"). El anticuerpo de TF scFV(TF)3e10 expresado en células CHO se evaluó en el modelo de tromboembolia de rata describo en el Ejemplo 6 para (A) porcentaje de mortalidad y (B) puntuación de morbilidad-mortalidad. (A) En el grupo tratado con vehículo, la dosis de TF usada daba como resultado una letalidad del 60% (DL_{60}). El scFv(TF)3e10 a 0,7 nmol/kg no afectaba a la mortalidad, pero a 7,0 nmol/kg reducía la letalidad hasta <40%. (B) En el grupo tratado con vehículo, la dosis in vivo de TF daba como resultado una puntuación de morbilidad-mortalidad media de 2,6. El scFv(TF)3e10 a 0,7 nmol/kg no afectaba a la mortalidad y tenía un escaso o ningún efecto sobre la disnea, pero a 14 nmol/kg, la puntuación de morbilidad-mortalidad media se reducía hasta -1,5.

Descripción detallada de la invención

El anticuerpo anticoagulante de la presente invención es un anticuerpo que se une con mayor afinidad al complejo factor VIIa/factor tisular ("FVIIa/TF") que al factor tisular ("TF") en solitario. El anticuerpo de la invención se une con una afinidad al menos 2 veces superior, preferiblemente una afinidad al menos 5 veces superior y, más preferiblemente, una afinidad al menos 10 superior al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario. El anticuerpo de la invención tampoco compite por la unión a TF con uno o más factores de coagulación seleccionados del grupo constituido por factor VII ("FVII") y factor X ("FX"). Preferiblemente, el anticuerpo de la invención no compite por la unión a TF con FVII y con FX.

Definiciones

En la descripción de la presente invención, los siguientes términos se definen como se indica a continuación.

La expresión "proteínas o polipéptidos recombinantes" se refiere a proteínas o polipéptidos producidos por técnicas de ADN recombinante, es decir, producidos a partir de células, microbianas o de mamíferos, transformadas mediante una construcción de ADN exógeno que codifica el polipéptido deseado. Las proteínas o polipéptidos expresados en la mayoría de cultivos bacterianos carecerán de glucanos. Las proteínas o polipéptidos expresados en levaduras pueden tener un patrón de glicosilación diferente del expresado en células de mamífero.

Las proteínas o polipéptidos "nativos" se refieren a proteínas o polipéptidos recuperados de una fuente de origen natural. La expresión "anticuerpo nativo" incluiría anticuerpos de origen natural y fragmentos de los mismos.

Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN que se transcribe en ARNm y se traduce en un polipéptido en una célula huésped cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo N-terminal 5' y un codón de terminación de la traducción en el extremo C-terminal 3'. Una secuencia codificante puede incluir secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota y secuencias de ADN sintéticas. Habitualmente se localizará una secuencia de terminación de la transcripción 3' a la secuencia codificante.

La expresión "secuencia de nucleótidos" es un heteropolímero de desoxirribonucleótidos (bases de adenina, guanina, timina o citosina). Las secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de esta invención pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADN procedentes de ADNc sintético y engarces oligonucleotídicos cortos para proporcionar un gen sintético que sea capaz de expresarse en un vector de expresión recombinante. En el análisis de la estructura de moléculas de ADN bicatenarias particulares, las secuencias pueden describirse en este documento de acuerdo con la convención normal de proporcionar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADNc no transcrita.

Un "vector de expresión recombinante" es una construcción de ADN replicable usada para amplificar o para expresar el ADN que codifica los anticuerpos de la presente invención. Un vector de expresión contiene secuencias de control de ADN y una secuencia codificante. Las secuencias de control de ADN incluyen secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores cadena arriba y potenciadores. Los sistemas de expresión recombinantes, como se definen en este documento, expresarán los anticuerpos tras la inducción de los elementos reguladores.

La expresión "células huésped transformadas" se refiere a células que se han transformado y transfectado con ADN exógeno. El ADN exógeno puede o no integrarse (unirse covalentemente) en el ADN cromosómico que compone el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plásmido, o integrarse de forma estable en el ADN cromosómico. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de forma estable es una en la que el ADN exógeno se ha integrado en la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de las líneas celulares eucariotas o clones para producir una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

Los términos "análogo", "fragmento", "derivado" y "variante", cuando se refieren a los anticuerpos de esta invención, se refieren a análogos, fragmentos, derivados y variantes de los anticuerpos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica, como se describe adicionalmente a continuación.

Un "análogo" incluye un pro-polipéptido que incluye en su interior la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de esta invención. El anticuerpo activo de esta invención puede escindirse de los aminoácidos adicionales que completan la molécula de pro-anticuerpo por procedimientos naturales in vivo o por procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como por escisión enzimática o química. Por ejemplo, el polipéptido scFV(TF)3e10 recombinante (SEC ID Nº: 1) se expresa como un pro-polipéptido de 282 aminoácidos que después se procesa in vivo para liberar el polipéptido maduro activo de 264 aminoácidos.

Un "fragmento" es una porción del anticuerpo de la invención que conserva una actividad funcional sustancialmente similar, como se muestra en los ensayos in vitro descritos en este documento que se describen adicionalmente a continuación.

Un "derivado" incluye todas las modificaciones en los anticuerpos de esta invención que conservan sustancialmente las funciones descritas en este documento e incluyen una estructura adicional y una función consiguiente, por ejemplo, anticuerpos PEGilados que tienen una mayor semivida y anticuerpos biotinilados, como se describen adicionalmente a continuación. Un derivado también incluye anticuerpos glicosilados ligados a N o a O que pueden generarse por inserción de sitios de N- u O-glicosilación en las secuencias de anticuerpo mediante tecnología de ADN recombinante convencional.

Las expresiones "actividad funcional sustancialmente similar" y "sustancialmente la misma función o actividad biológica " significan cada una el grado de actividad biológica que está entre aproximadamente el 30% y el 100% o más de la actividad biológica demostrada por el polipéptido con el que se está comparando, cuando la actividad biológica de cada polipéptido se determina mediante el mismo procedimiento o ensayo. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad funcional sustancialmente similar al anticuerpo del Ejemplo 1 (SEC ID Nº: 1) es uno que, cuando se ensaya en los ensayos de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa y de activación de FX descritos en el Ejemplo 4, demuestra la capacidad de unirse a y neutralizar el complejo FVIIa/TF.

La "similitud" entre dos polipéptidos se determina por comparación de la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Dichas sustituciones conservativas incluyen las descritas anteriormente en The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 por Dayhoff (1978) y por Argos (1989) EMBO J. 8: 779-785. Por ejemplo, los aminoácidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos:

- Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr;

- Cys, Ser, Tyr, Thr;

- Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;

- Lys, Arg, His;

- Phe, Tyr, Trp, His; y

- Asp, Glu.

El término "anticuerpo", como se usa en este documento, incluye moléculas de inmunoglobulina ("Ig") intactas, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2} y Fv, que son capaces de unirse a un epítope de la proteína diana seleccionada, por ejemplo, TF soluble ("sTF"). Típicamente, son necesarios al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítope. Sin embargo, los epítopes que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos.

Todos los demás términos técnicos usados en este documento tienen el mismo significado que usan comúnmente los especialistas en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Anticuerpos de la invención y su generación

Los anticuerpos anticoagulantes de esta invención se unen con mayor afinidad al complejo factor VIIa/factor tisular ("FVIIa/TF") que al factor tisular ("TF") en solitario. En una realización preferida, los anticuerpos de la invención se unen con una afinidad al menos 2 veces superior al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario, más preferiblemente con una afinidad al menos 5 veces superior y, aún más preferiblemente, con una afinidad al menos 10 veces superior, como se mide en un ensayo de microcalorimetría. En otra realización preferida de esta invención, los anticuerpos tampoco compiten con uno o más factores de coagulación seleccionados del grupo constituido por factores VII ("FVII") y X ("FX") por la unión a TF. En una realización más preferida, los anticuerpos de la invención no compiten con FVII y con FX por la unión a TF. En la realización más preferida, los anticuerpos de la invención se unen con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario y no compiten por la unión a TF con FVII ni con FX.

Hablando en general, un anticuerpo que se une específicamente a una proteína diana seleccionada (por ejemplo, el complejo FVIIa/TF o TF) proporciona una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces superior a una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usa en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína diana seleccionada no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar la proteína diana de la solución.

La proteína diana seleccionada puede usarse para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, mono o ser humano para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, la proteína diana puede conjugarse con una proteína transportadora, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de la especie de huésped, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, pero sin limitación, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, son especialmente útiles el BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada pueden prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares en cultivo continuo. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma con EBV (Kohler y col. (1985) Nature 256: 495-497; Kozbor y col. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; y Cote y col. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).

Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con una especificidad antigénica y una actividad biológica apropiadas (Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger y col. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda y col. (1985) Nature 314: 452-454). También pueden "humanizarse" anticuerpos monoclonales y otros para evitar que un paciente desarrolle una respuesta inmune frente al anticuerpo cuando se use terapéuticamente. Dichos anticuerpos pueden tener una secuencia lo suficientemente similar a la de anticuerpos humanos para usarse directamente o pueden requerir la modificación de unos pocos restos clave. Pueden minimizarse las diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedores y secuencias humanas por sustitución de restos que difieren de los que aparecen en las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida de restos individuales o por injerto de regiones determinantes de complementariedad completas. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos humanizados usando procedimientos recombinantes como se describen en el documento GB2188638B. Los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada pueden contener sitios de unión a antígeno
que estén parcialmente o totalmente humanizados, como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.565.332.

Como alternativa, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla usando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de cadena sencilla ("scFv") que se unan específicamente a una proteína diana seleccionada. Pueden generarse anticuerpos con una especificidad relacionada, pero de composición idiotípica diferente, por barajado de cadena a partir de genotecas combinatorias aleatorias de Ig (Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123).

También pueden construirse anticuerpos de cadena sencilla usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, usando ADNc de hibridoma como molde (Thirion y col. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5: 507-511). Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser mono- o biespecíficos y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos tetravalentes se muestra, por ejemplo, en Coloma y Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15: 159-163. La construcción de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos bivalentes se muestra en Mallendar y Voss (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-216.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de cadena sencilla puede construirse usando síntesis de nucleótidos manual o automática, clonarse en una construcción de expresión usando procedimientos de ADN recombinantes convencionales e introducirse en una célula para expresar la secuencia codificante. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos de cadena sencilla directamente usando, por ejemplo, tecnología de presentación en fagos fila-
mentosos (Verhaar y col. (1995) Int. J. Cancer 61: 497-501; y Nicholls y col. (1993) J. Immunol. Meth. 165: 81-91).

También pueden producirse anticuerpos que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada por inducción de la producción in vivo en la población de linfocitos o por exploración de genotecas o paneles de Ig de reactivos de unión altamente específicos, como se describe en la bibliografía (Orlandi y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837; Winter y col. (1991) Nature 349: 293-299).

El ADN que codifica el anticuerpo de la invención puede clonarse en ADNc o en forma genómica por cualquier procedimiento de clonación conocido para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. F. y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

En el caso en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, una vez que se haya identificado una secuencia de ADN que codifica una región Fv que cuando se expresa muestra una actividad de unión específica, pueden prepararse anticuerpos que comprendan esa región Fv por procedimientos conocidos para un especialista en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, Chaudhary, V. K. y col. (1989) Nature 339 (6223): 394-397; Batra, J. K. y col. (1990) J. Biol. Chem. 265 (25): 15198-15202; Batra, J. K. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (21): 8545-8549; Chaudhary, V. K. y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (3): 1066-1070, describen la preparación de diversas proteínas de anticuerpos de cadena sencilla.

En un enfoque preferido, los anticuerpos que se unen a TF de la invención son anticuerpos de cadena sencilla que se preparan usando una biblioteca de presentación en fagos. La región de unión a epítope de un anticuerpo de cadena sencilla se compone de dos dominios de región variable: uno de la cadena pesada y el otro de la cadena ligera. En la primera etapa de la construcción de una biblioteca de presentación en fagos, los genes variables (V_{H} (de IgM) V_{\kappa} y V_{L}) se clonan por PCR a partir de ARNm combinado de médula ósea, ganglio linfático y bazo humano, usando un conjunto de cebadores específicos de familia. Las genotecas pCITE-V_{H} (3,8 x 10^{9} miembros), pZ604-V_{\kappa} (1,6 x 10^{7}) y pZ604-V_{L} (3,2 x 10^{7}) resultantes representan una diversidad elevada y permanente de genes V. Los genes V_{H} se amplifican después a partir de la genoteca pCITE-V_{H}. Los genes V_{\kappa} y V_{L} se amplifican por PCR a partir de la genoteca pZ604-V_{\kappa} y pZ604-V_{L} con una secuencia J_{H} inversa y de engarce en el extremo 5'. Después, los productos de PCR que contienen V_{H}, V_{\kappa} y V_{L} purificados en gel se cortan y empalman entre sí para generar el repertorio de genes de scFv. El repertorio de genes de scFv se clona en un vector fagémido pZ603 y el producto de ligación se usa para electroporación en células E. coli TG1 competentes para generar la biblioteca de presentación en fagos de scFv, HuPhabL3, con 5,2 x 10^{9} transformantes individuales (Kay, B. K. y col. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J. D. y col. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3): 581-597; Sheets, M. O. y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-6162).

El fago que se une a TF de la biblioteca de presentación en fagos de scFv se selecciona, se amplifica y posteriormente se identifica usando técnicas de selección que son bien conocidas en la técnica. El TF soluble se inmoviliza en tubos de plástico y puede usarse leche desnatada para reducir la unión inespecífica al plástico. La población de fagos de scFv se expone al sTF inmovilizado en los tubos de plástico y el fago no unido se retira mediante un lavado exhaustivo. El fago de scFv que se une a TF se eluye de los tubos y después se amplifica por infección de células de E. coli TG1 en solución. Este procedimiento de selección se repite tres veces y el fago de scFv que se une a TF resultante se aísla mediante transformación de células TG1. Se identifican los transformantes que expresan anticuerpos de unión a TF usando un ELISA convencional con sTF inmovilizado sobre plástico en placas de 96 pocillos. Se secuencia el ADN de los insertos de anticuerpos de cadena sencilla de los transformantes positivos por ELlSA. Basándose en la secuenciación del ADN, se identifican en este documento seis anticuerpos únicos de cadena sencilla, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 y scFv(TF)3h2, y se expresaron y purificaron a partir de E. coli, y se caracterizaron como se describe a continuación en el Ejemplo 5.

Expresión y purificación de anticuerpos de la invención

Existen varias formas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención in vitro, incluyendo E. coli, baculovirus, células de levaduras y de mamíferos u otros sistemas de expresión. Se conocen bien procedimientos para la expresión de genes clonados en bacterias. Para obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado en un sistema procariota, es esencial construir vectores de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte para dirigir la terminación de la transcripción del ARNm. Son ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para este fin la región promotora y operadora del gen de la beta-glucosidasa de E. coli, la ruta biosintética del triptófano de E. coli o el promotor hacia la izquierda del fago Lambda. Es útil a inclusión de marcadores de selección en vectores de ADN transformados en E. coli. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen los genes que determinan la resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol.

Existen numerosos sistemas celulares de entre los que seleccionar de los sistemas celulares eucariotas superiores útiles para la expresión de los anticuerpos de la invención y análogos, fragmentos, derivados o variantes de los mismos. Los ejemplos ilustrativos de líneas celulares de mamíferos incluyen, pero sin limitación, células RPMI 7932, VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares W138, BHK, COS-7, C127 o MDCK. Una línea celular de mamíferos preferida es CHL-1. Cuando se usa CHL-1 se incluye higromicina como un marcador de selección eucariota. Las células CHL-1 proceden de células de melanoma RPMI 7032, una línea celular humana fácilmente disponible. La línea celular CHL-1 se ha depositado en la ATCC de acuerdo con las condiciones del Tratado de Budapest y se le ha asignado el nº CRL 9446, depositada el 18 de junio de 1987. Están disponibles en el mercado en la ATCC células adecuadas para usar en esta invención. Las líneas celulares ilustrativas incluyen Spodoptera frugiperda y Bombyx mori.

El sistema procariota, E. coli, no es capaz de realizar modificaciones post-traduccionales tales como glicosilación. Además, las proteínas con patrones de disfulfuros complejos con frecuencia se pliegan erróneamente cuando se expresan en E. coli. Con el sistema procariota, la proteína expresada está presente en el citoplasma celular en una forma insoluble denominada cuerpos de inclusión, se encuentra en la fracción soluble después de que se haya lisado la célula o se dirige hacia el periplasma por adición de secuencias señal de secreción apropiadas. Si la proteína expresada está en cuerpos de inclusión insolubles, habitualmente es necesaria la solubilización y posterior replegamiento de los cuerpos de inclusión.

Los especialistas en la técnica conocen muchos vectores de expresión procariotas por tales como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos) y pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, Estados Unidos), que están disponibles en el mercado.

Los promotores usados comúnmente en sistemas de expresión microbiana recombinantes incluyen el sistema promotor de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang, A. C. y col. (1978) Nature 275 (5681): 617-624; Goeddel, D. V. y col. (1979) Nature 281 (5732): 544-548), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel, D. V. y col. (1980) Nucl. Acids Res. 8 (18): 4057-4074) y el promotor tac (Maniatis, T. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Otro sistema de expresión bacteriano útil emplea el promotor pL de fago lambda y el represor termoinducible clts857 (Bernard, H. U. y col. (1979) Gene 5 (1): 59-76; Love, C. A. y col. (1996) Gene 176 (1-2): 49-53). También pueden expresarse anticuerpos recombinantes en huéspedes de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae. Habitualmente proporciona la capacidad para realizar diversas modificaciones post-traduccionales. El anticuerpo expresado puede secretarse hacia el sobrenadante de cultivo donde no existen muchas otras proteínas, haciendo más sencilla la purificación. Los vectores de levaduras para la expresión de los anticuerpos en esta invención contienen ciertas características necesarias. Los elementos del vector proceden generalmente de levaduras y bacterias para permitir la propagación del plásmido en ambos. Los elementos bacterianos incluyen un origen de replicación y un marcador de selección. Los elementos de levaduras incluyen una secuencia de origen de replicación (ARS), un marcador de selección, un promotor y un terminador de la transcripción.

Los promotores adecuados en vectores de levaduras para la expresión incluyen los promotores del gen TRP1, el gen ADH1 o ADHII, el gen de la fosfatasa ácida (PH03 o PH05), el gen del isocitocromo o los promotores implicados con la ruta glucolítica, tales como el promotor de enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH), 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), hexoquinasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa y fosfoglucosa isomerasa (Hitzeman, R. A. y col. (1980) J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-12080; Hess, B. y col. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149-167; y Holland, M. J. y Holland, J. P. (1978) Biochemistry 17 (23): 4900-4907).

Los vectores de levaduras disponibles en el mercado incluyen pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC nº 67255) y YpGX265GAL4 (ATCC nº 67233). Pueden emplearse líneas celulares de mamíferos incluyendo, pero sin limitación, COS-7, células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO y HEK293, para expresar los anticuerpos recombinantes en esta invención. Normalmente, las proteínas recombinantes producidas en células de mamíferos son solubles y están glicosiladas y tienen extremos N-terminales auténticos. Los vectores de expresión de mamíferos pueden contener elementos no transcritos tales como un origen de replicación, promotor y potenciador y secuencias no traducidas 5' o 3' tales como sitios de unión al ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitio aceptor y donador de corte y empalme, y secuencias de terminación de la transcripción. Habitualmente, los promotores para usar en vectores de expresión de mamíferos son, por ejemplo, promotores virales tales como de polioma, adenovirus, HTLV, virus de los simios 40 (SV 40) y citomegalovirus humano (CMV).

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, puede obtenerse un anticuerpo recombinante homogéneo usando diversas combinaciones de cromatografía convencional usada para purificación de proteínas. Estas incluyen: cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel y HPLC. Si el sistema de expresión secreta el anticuerpo al medio de cultivo, la proteína puede purificarse directamente a partir del medio. Si el anticuerpo no se secreta, se aísla a partir de lisados celulares. La ruptura de las células puede realizarse por cualquier procedimiento convencional, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes lisantes de células.

La construcción plasmídica basada en pCANTAB5 (Pharmacia) se usó para la expresión bacteriana de los anticuerpos de cadena sencilla de esta invención. Por ejemplo, un plásmido que contiene el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 es pZ612/3e10 y codifica la secuencia del anticuerpo de cadena sencilla seguida de una secuencia de etiqueta e que puede usarse para purificar la proteína. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFV(TF)3e10 se corresponde con la SEC ID Nº: 1 (Ejemplo 1) y la secuencia de ADN que codifica scFv(TF)3e10 se corresponde con la SEC ID Nº: 2.

La construcción plasmídica basada en pTHR525 (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.827.824) se usó para la expresión en mamíferos de los anticuerpos de cadena sencilla de esta invención. Por ejemplo, se diseñaron cebadores para generar un fragmento de ADN que abarcaba la secuencia de aminoácidos de pro-scFv(TF)3e10, incluyendo la secuencia señal N-terminal y la secuencia de etiqueta e C-terminal, en el plásmido de expresión bacteriana. Se realizó una PCR para generar un fragmento de ADN que se insertó en el plásmido de expresión en mamíferos, que contiene el gen de resistencia a ampicilina y los marcadores de selección de higromicina y DHFR. La expresión de los anticuerpos de cadena sencilla de la invención se dirigió mediante el promotor LTR de MPSV.

En una realización preferida de esta invención, las construcciones de expresión en mamíferos se transfectaron en células CHO DXB11. Se seleccionaron poblaciones estables usando higromicina B 400 \mug/ml en medio de HAMS/F12. Los niveles de expresión eran de aproximadamente 500 \mug/l. Para aumentar los niveles de expresión se seleccionó una población usando metotrexato 100 nM en medio alfa MEM. El nivel de expresión aproximado de esta población era de 5 mg/l.

Los anticuerpos de esta invención pueden purificarse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad haciéndolos pasar por una columna a la que está unido TF. Después, el TF unido-anticuerpos pueden eluirse de la columna usando un tampón con una alta concentración de sal.

Los anticuerpos de cadena sencilla descritos en este documento contienen la secuencia de etiqueta e en el extremo C-terminal de la proteína. Se adquirieron columnas de afinidad anti-etiqueta e en American/Pharmacia Biotech. Los medios de cultivo de células se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum y se cargaron en una columna de etiqueta e de 5 ml a 2 ml/min. La columna se lavó con tampón fosfato 0,2 M, NaN_{3} al 0,05%, pH 7,0 y después se recogió en tubos que contenían 0,1 volúmenes de tampón Tris 1 M a pH 8,2 para neutralizar el tampón de elución. Como alternativa, el medio de cultivo filtrado se cargó en una columna de proteína A. En este caso, la columna se lavó con ácido cítrico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 6,5 y se eluyó con el mismo tampón a pH 3,0. En ambos casos, las muestras purificadas se cargaron posteriormente en una columna de Sephadex 200 para separar las formas monoméricas de las diméricas del anticuerpo.

Selección de anticuerpos de la invención

Una vez que se generan, expresan y purifican los anticuerpos pueden caracterizarse adicionalmente usando BIAcore, un ensayo de factor VIIa dependiente de sTF (un ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa), un ensayo de activación de FX y el ensayo de TP descrito en el Ejemplo 4 para identificar los anticuerpos de esta invención.

En una realización preferida de esta invención, los anticuerpos scFv que se unen a TF que se unen con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario se seleccionan usando el ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa. En este ensayo, se espera que los anticuerpos de TF que se unen con mayor afinidad al complejo FVIIa/TF que al TF aumenten la K_{D(ap)}. La Figura 2 muestra que el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 aumentaba la K_{D(ap)} \sim5 veces. Se usó un ensayo de microcalorimetría para medir la afinidad de los anticuerpos de TF por el complejo FVIIa/TF en comparación con el TF en solitario. La Figura 5 muestra que el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 tiene una K_{D} de unión al complejo FVIIa/TF y al TF libre de 600 nM y 33 nM, respectivamente, que se corresponde con una afinidad \sim20 veces superior por el complejo FVIIa/TF en comparación con el TF en solitario. Los anticuerpos de esta invención tienen una afinidad al menos 2 veces, preferiblemente al menos 5 veces y, más preferiblemente, al menos 10 veces superior por el complejo FVIIa/TF que por TF.

Los anticuerpos scFv que se unen a TF que no compiten con FVII por la unión a TF se seleccionan usando el ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa. En este ensayo, se espera que los anticuerpos de TF que compiten con FVIIa por la unión a TF inhiban la hidrólisis del sustrato cromogénico S2266. La Figura 1 muestra que el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 no inhibía y, en realidad, aumentaba la actividad de FVIIa.

Los anticuerpos scFv que se unen a TF que inhiben la activación de FX se seleccionan usando el ensayo de TP y el ensayo de activación de FX. En el ensayo de TP, se espera que los anticuerpos de TF que prolongan el TP inhiban la activación de FX. La Figura 3 muestra que el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 prolongaba el TP, indicando que este anticuerpo inhibe la activación de FX. En el ensayo de activación de FX, se espera que los anticuerpos de TF que inhiben la actividad de FXa inhiban la hidrólisis del sustrato cromogénico S2222. La Figura 6 muestra que el anticuerpo de cadena sencilla scFV(TF)3e10 inhibía la actividad de FXa.

Se seleccionan anticuerpos scFv que se unen a TF que no compiten con FX por la unión a TF usando el ensayo de activación de FX. En este ensayo, se espera que los anticuerpos de TF que no compitan con FX inhiban la activación de FX independientemente de la concentración de FX que se use. La Figura 7 muestra que el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 inhibía la actividad de FXa de una forma independiente de la concentración de FX.

En una realización preferida de la presente invención, se identificó un anticuerpo de cadena sencilla (scFv(TF)3e10) que tenía un solo sitio de unión V_{H}/V_{L} para TF. La secuencia de aminoácidos de scFv(TF)3e10, se muestra en el Ejemplo 1 y se corresponde con la SEC ID Nº: 1. La secuencia de ADN que codifica scFv(TF)3e10 se corresponde con la SEC ID Nº: 2.

Análogos, fragmentos, derivados y variantes de anticuerpos de la invención

Un análogo, fragmento, derivado o variante de los anticuerpos de la presente invención puede ser: (i) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos se sustituyen con un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferiblemente, un resto aminoacídico conservado) y dicho resto aminoacídico sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético; o (ii) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos incluye un grupo sustituyente o (iii) uno en el que el anticuerpo maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del anticuerpo (por ejemplo, polietilenglicol) o (iv) uno en el que se fusionan aminoácidos adicionales con el anticuerpo maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del anticuerpo maduro. Se considera que dichos análogos, fragmentos, derivados y variantes están dentro del alcance de los especialistas en la técnica a partir de los contenidos de este documento.

Preferiblemente, los derivados de la presente invención contendrán sustituciones de aminoácidos conservativas (definidas adicionalmente a continuación) realizadas en uno o más restos aminoacídicos predichos, preferiblemente no esenciales. Un resto aminoacídico "no esencial" es un resto que puede modificarse a partir de la secuencia de tipo silvestre de una proteína sin alterar la actividad biológica, mientras que un resto aminoacídico "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto aminoacídico se sustituye con un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Se han identificado en la técnica familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). No se realizarán sustituciones no conservativas de restos aminoacídicos conservados o de restos aminoacídicos que residen en un dominio proteico conservado a menos que las sustituciones se realizasen con el fin de seleccionar anticuerpos variantes, como se describen adicionalmente a continuación. Los fragmentos o porciones biológicamente activas incluyen fragmentos polipeptídicos adecuados para el uso como medicamento, como un reactivo de investigación. Los fragmentos incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares a o derivadas de las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo de esta invención y que presentan al menos una actividad de ese polipéptido, pero que incluyen menos aminoácidos que los polipéptidos de longitud completa descritos en este documento.

Además, los derivados preferidos de la presente invención incluyen anticuerpos maduros que se han fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido y/o para reducir la inmunogenicidad potencial del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol, "PEG"). El PEG puede usarse para conferir solubilidad en agua, tamaño, velocidad lenta de aclaramiento renal e inmunogenicidad reducida para el anticuerpo. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.214.966. En el caso de PEGilaciones, la fusión del anticuerpo con PEG puede efectuarse por cualquier medio conocido por un especialista en la técnica. Por ejemplo, la PEGilación puede lograrse introduciendo primero una mutación de cisteína en el anticuerpo, seguida de derivatización específica de sitio con PEG-maleimida. La cisteína puede añadirse al extremo C-terminal de los péptidos. Véase, por ejemplo, Tsutsumi y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15): 8548-8553. Otra modificación que puede realizarse en el anticuerpo implica biotinilación. En ciertos casos, puede ser útil tener el anticuerpo biotinilado de modo que pueda reaccionar fácilmente con estreptavidina. Se conocen bien en la técnica procedimientos para biotinilación de proteínas. Además, pueden introducirse sitios de N- u O-glicosilación en las secuencias de anticuerpos de modo que pueda producirse in vivo la glicosilación ligada a N u O post-traduccional de los anticuerpos.

Las variantes de los anticuerpos de esta invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos originales. La expresión "suficientemente similar" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de restos aminoacídicos idénticos o equivalentes con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 45%, preferiblemente de aproximadamente el 75% al 98%, se definen en este documento como suficientemente similares. Preferiblemente, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos preferidos de esta invención. Las variantes incluyen variantes de anticuerpos codificados por un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido de esta invención o un complementario del mismo en condiciones rigurosas. Generalmente, dichas variantes conservan la actividad funcional de los anticuerpos de esta invención. Pueden usarse genotecas de fragmentos de los polinucleótidos para generar una población variada de fragmentos para la exploración y posterior selección. Por ejemplo, puede generarse una genoteca de fragmentos por tratamiento de un fragmento de PCR bicatenario de un polinucleótido con una nucleasa en condiciones en las que se produzca el mellado sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del ADN bicatenario, renaturalización del ADN para formar un ADN bicatenario que puede incluir parejas sentido/antisentido de diferentes productos mellados, eliminación de las porciones de cadena sencilla de dúplex vueltos a formar por tratamiento con nucleasa S1 y ligación de la genoteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este procedimiento, se puede obtener una genoteca de expresión que codifique fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de los anticuerpos de esta invención.

Las variantes incluyen anticuerpos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Por ejemplo, puede realizarse mutagénesis de acuerdo con técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica para modificar los dominios V_{L} y V_{H} de las cadenas ligera y pesada de Ig para generar variantes que tengan una afinidad de unión aumentada por el complejo FVIIa/TF en comparación con TF libre. Las variantes particularmente preferidas incluyen anticuerpos con modificaciones dentro de las regiones determinantes de complementariedad de los dominios V_{L} y V_{H}.

Las variantes también incluyen anticuerpos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la inserción o deleción de restos aminoacídicos por mutagénesis. Por ejemplo, puede realizarse mutagénesis de acuerdo con técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica para insertar o delecionar aminoácidos en las porciones N-terminal o C-terminal de los dominios V_{H} o V_{L} de las cadenas ligera y pesada de Ig para generar variantes que conserven una actividad funcional sustancialmente similar. Las variantes particularmente preferidas incluyen anticuerpos de cadena sencilla con inserciones o deleciones de restos aminoacídicos en el engarce V_{H}-V_{L} entre los dominios V_{H} y V_{L}. La secuencia de engarce V_{H}-V_{L} en el anticuerpo de cadena sencilla representada en el Ejemplo 1 es de una longitud de 5 restos aminoacídicos. Será evidente que pueden usarse otras secuencias de engarce cortas de 0 a 20 aminoácidos en las que el anticuerpo conserva una actividad funcional sustancialmente similar. Pueden fijarse como objetivo modificaciones del engarce V_{H}-V_{L} existente para aumentar la estabilidad de la forma dimérica del anticuerpo de cadena sencilla.

En una realización, se genera una genoteca variada de variantes mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y está codificada por una genoteca de genes variada. Puede producirse una genoteca variada de variantes, por ejemplo, por ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de modo que un conjunto degenerado de secuencias de aminoácidos variantes potenciales puede expresarse como polipéptidos individuales o, como alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión de mayor tamaño (por ejemplo, para presentación en fagos) que contienen el conjunto de secuencias en las mismas. Existen una diversidad de procedimientos que pueden usarse para producir genotecas de variantes potenciales a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático y el gen sintético ligarse después en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite el suministro, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias variantes potenciales. Se conocen en la técnica procedimientos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura y col. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y col. (1984b) Science 198: 1 056; Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477).

Se conocen en la técnica varias técnicas para explorar productos génicos de genotecas combinatorias generadas por mutaciones puntuales o truncamiento y para explorar genotecas de ADNc para productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables a la exploración rápida de las genotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de anticuerpos para actividad de unión a TF o complejo FVIIa/TF o actividad inhibidora de la activación de FX. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento para la exploración de grandes genotecas de genes incluyen típicamente clonar la genoteca de genes en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la genoteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjuntos recursivos (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de exploración para identificar las variantes deseadas.

El Ejemplo 1 representa la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de cadena sencilla que se une a TF, scFv(TF)3e10 (SEC ID Nº: 1) y define el engarce V_{H}-V_{L} y los dominios V_{H} y V_{L}. Pueden identificarse variantes que tienen actividad de unión a TF o complejo FVIIa/TF o inhiben la activación de FX por exploración de genotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de inserción, truncamiento o puntuales de los anticuerpos de esta invención, usando la hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa o ensayos de activación de FX descritos en el Ejemplo 4. Los anticuerpos de la presente invención incluyen los anticuerpos del Ejemplo 1 y 3 (SEC ID Nº: 1 y 3), así como los anticuerpos que tienen variaciones insustanciales en la secuencia de los mismos. Una "variación insustancial" incluiría cualquier variante de secuencia, sustitución o deleción que mantiene sustancialmente al menos una función biológica de los anticuerpos de esta invención, por ejemplo, la capacidad para inhibir la activación de FX. Estos equivalentes funcionales pueden incluir preferiblemente anticuerpos que tienen una identidad de al menos aproximadamente el 90% con los dominios de las regiones V_{L} y V_{H} del anticuerpo de cadena sencilla de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 3 y, más preferiblemente, una identidad de al menos el 95% con los dominios de las regiones V_{L} y V_{H} del anticuerpo de cadena sencilla de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3 y, aún más preferiblemente, una identidad de al menos el 97% con los dominios de las regiones V_{L} y V_{H} del anticuerpo de cadena sencilla de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3, y también incluyen porciones de dichos anticuerpos que tienen sustancialmente la misma actividad biológica. Sin embargo, cualquier anticuerpo que tenga una variación insustancial en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 que demuestre equivalencia funcional, como se describe adicionalmente en este documento, se incluye en la descripción de la presente invención.

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Composiciones farmacéuticas

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que pueden administrarse a un paciente para lograr un efecto terapéutico. Pueden prepararse composiciones farmacéuticas de esta invención para administración combinando el anticuerpo de esta invención que tiene el grado de pureza deseado y la cantidad farmacéuticamente eficaz con vehículos fisiológicamente aceptables.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en composiciones farmacéuticas para administración intravenosa o administración subcutánea o administración intratecal. Por lo tanto, los anticuerpos descritos anteriormente se combinarán preferiblemente con un vehículo farmacéutico estéril aceptable, tal como dextrosa al cinco por ciento, solución de Ringer lactato, solución salina normal, agua estéril o cualquier otra solución tampón fisiológica preparada comercialmente diseñada para la infusión intravenosa. Se entenderá que la selección de la solución de vehículo y la dosificación y administración de la composición variarán con el sujeto y el entorno clínico particular y estará dirigida por procedimientos médicos convencionales.

De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cantidades eficaces para inhibir las consecuencias patológicas asociadas con la generación excesiva de trombina en el sujeto.

La administración del anticuerpo puede ser mediante una inyección intravenosa embolada, mediante una infusión intravenosa constante o mediante una combinación de ambas vías. Como alternativa, o además, el anticuerpo mezclado con excipientes apropiados puede pasar a la circulación desde un sitio intramuscular. El tratamiento sistémico con anticuerpo puede controlarse determinando el tiempo de tromboplastina parcial activada (TP) en muestras seriadas de sangre extraídas del paciente. El tiempo de coagulación observado en este ensayo está prolongado cuando se consigue un nivel suficiente del anticuerpo en la circulación.

Los anticuerpos recombinantes y composiciones farmacéuticas de esta invención son útiles para administración parenteral, tópica, intravenosa, oral o local. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una diversidad de formas de dosificación unitaria dependiendo del procedimiento de administración. Por ejemplo, pueden administrarse formas de dosificación unitaria en formas que incluyen, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, polvos, soluciones y emulsiones.

Los anticuerpos recombinantes y composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para administración intravenosa. Las composiciones para administración comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo de cadena sencilla disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en un vehículo acuoso. Pueden usarse una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de sustancias indeseables. Las composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas.

Una composición farmacéutica típica para administración intravenosa puede determinarse fácilmente por un especialista en la técnica. Las cantidades administradas son claramente específicas de proteína y dependen de su potencia y perfil farmacocinético. Los procedimientos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los especialistas en la técnica y se describen en más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980).

Las composiciones que contienen los presentes anticuerpos de la invención o una combinación de los mismos (es decir, con otras proteínas) pueden administrarse como tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece un trastorno de sangrado o enfermedad en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente el sangrado. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de la salud del paciente.

Pueden administrarse administraciones únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosificación y de la frecuencia según requiera y tolere el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar eficazmente al paciente.

Los anticuerpos de la invención o sus composiciones farmacéuticamente aceptables se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz que variará dependiendo de una diversidad de factores incluyendo la actividad del anticuerpo específico empleado; la estabilidad metabólica y la duración de la acción del anticuerpo, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el modo y el momento de administración; la velocidad de excreción; la combinación farmacológica; la gravedad de las patologías particulares; y el huésped que se está sometiendo a terapia. Generalmente, una cantidad diaria terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 0,14 mg a aproximadamente 14,3 mg/kg de peso corporal por día de un anticuerpo de la invención o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo; preferiblemente de aproximadamente 0,7 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día; y más preferiblemente, de aproximadamente 1,4 mg a aproximadamente 7,2 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, para la administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosificación será de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1,0 gramos por día de un anticuerpo de la invención o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 700 mg por día, y más preferiblemente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg por día.

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Terapia celular y génica

Un anticuerpo de la invención puede emplearse de acuerdo con la presente invención mediante la expresión de dicho anticuerpo in vivo por un procedimiento denominado "terapia celular". Por lo tanto, por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética células con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica el anticuerpo ex vivo y las células modificadas se suministran después a un paciente que se va a tratar con el anticuerpo. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden modificarse células por ingeniería genética mediante procedimientos conocidos en la técnica usando una partícula retroviral que contiene ARN que codifica el anticuerpo de la presente invención.

También puede emplearse un anticuerpo de la invención de acuerdo con la presente invención mediante la expresión de dicho anticuerpo in vivo por un procedimiento denominado "terapia génica". Por lo tanto, por ejemplo, un virus puede modificarse por ingeniería genética con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica el anticuerpo y el virus modificado por ingeniería genética se suministra después a un paciente que se va a tratar con el anticuerpo. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética adenovirus recombinantes por procedimientos conocidos en la técnica que contienen ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención.

La administración local de los anticuerpos anticoagulantes de la presente invención usando terapia celular o génica puede proporcionar el agente terapéutico en el área diana, las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos.

Se contemplan metodologías de terapia celular y génica tanto in vitro como in vivo. Se conocen varios procedimientos para transferir genes potencialmente terapéuticos a poblaciones celulares definidas. Véase, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260: 926-931. Estos procedimientos incluyen:

1): Transferencia génica directa. Véase, por ejemplo, Wolff y col. (1990) Science 247: 1465-1468;

2): Transferencia de ADN mediada por liposomas. Véase, por ejemplo, Caplen y col. (1995) Nature Med. 3: 39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1: 15-17; Gao y Huang (1991) Biochem. Blophys. Res. Comm. 179: 280-285;

3): Transferencia de ADN mediada por retrovirus. Véase, por ejemplo, Kay y col. (1993) Science 262: 117-119; Anderson (1992) Science 256: 808-813.

4): Transferencia de ADN mediada por virus de ADN. Dichos virus de ADN incluyen adenovirus (preferiblemente vectores basados en Ad2 o Ad5), herpesvirus (preferiblemente vectores basados en el virus herpes simple) y parvovirus (preferiblemente vectores basados en parvovirus "defectuosos" o no autónomos, más preferiblemente vectores basados en virus adenoasociados, más preferiblemente vectores basados en AAV-2). Véase, por ejemplo, Ali y col. (1994) Gene Therapy 1: 367-384; Patente de Estados Unidos 4.797.368 y Patente de Estados Unidos 5.139.941.

La selección de un sistema vector particular para transferir el gen de interés dependerá de una diversidad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población celular diana. Aunque los vectores retrovirales se han estudiado exhaustivamente y usado en varias aplicaciones de terapia génica, generalmente estos vectores no son adecuados para infectar células que no están en división. Además, los retrovirus tienen el potencial de oncogenicidad. Sin embargo, desarrollos recientes en el campo de los vectores lentivirales pueden salvar algunas de estas limitaciones. Véase, Naldini y col. (1996) Science 272: 263-267.

Los retrovirus de los que pueden proceder los vectores plasmídicos retrovirales mencionados en este documento anteriormente incluyen, pero sin limitación, virus de la leucemia murina de Moloney, virus de la necrosis esplénica, retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia del mono gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor de mama. En una realización, el vector plasmídico retroviral procede del virus de leucemia murina de Moloney.

Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen un amplio intervalo de huéspedes, pueden infectar células quiescentes o terminalmente diferenciadas, tales como neuronas o hepatocitos, y parecen ser esencialmente no oncogénicos. Véase, por ejemplo, Ali y col. (1994), anteriormente, pág. 367. Los adenovirus no parecen integrarse en el genoma del huésped. Debido a que aparecen extracromosómicamente, el riesgo de mutagénesis insercional se reduce enormemente. Ali y col. (1994), anteriormente, pág. 373.

Los virus adenoasociados presentan ventajas similares como vectores basados en adenovirus. Sin embargo, los AAV presentan integración específica de sitio en el cromosoma humano 19 (Ali y col. (1994), anteriormente, pág. 377).

En una realización preferida, el ADN que codifica los anticuerpos de esta invención se usa en terapia celular o génica para trastornos que incluyen, pero sin limitación, trombosis venosa profunda, coagulación intravascular diseminada, síndrome coronario agudo o cáncer con evidencias de coagulopatía.

De acuerdo con esta realización, se suministra a un paciente que lo necesite una terapia celular o génica con ADN que codifica los anticuerpos de esta invención, al mismo tiempo o inmediatamente después del diagnóstico.

El especialista apreciará que cualquier vector de terapia génica adecuado que contiene ADN que codifica el anticuerpo de la invención o ADN que codifica análogos, fragmentos, derivados o variantes del anticuerpo de la invención puede usarse de acuerdo con esta realización. Se conocen las técnicas para construir dicho vector. Véase, por ejemplo, Anderson, W. F. (1998) Nature 392: 25-30; Verma I. M. y Somia, N. (1998) Nature 389: 239-242. La introducción del vector que contiene ADN de anticuerpo en el sitio diana puede lograrse usando técnicas conocidas.

El vector de terapia celular o génica incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, la LTR retroviral; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller y col. (1989) Biotechniques 7 (9): 980-990, o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucariotas que incluyen, pero sin limitación, los promotores de histona, pol III y \beta-actina). Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en este documento.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal de adenovirus; o promotores heterólogos tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus respiratorio sincitial (RSV); promotores inducibles tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneína; promotores de choque cardiaco; el promotor de la albúmina, el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina quinasa viral, tales como el promotor de timidina quinasa de herpes simple; LTR retrovirales (incluyendo las LTR retrovirales modificadas descritas en este documento anteriormente); el promotor de \beta-actina; y el promotor de la hormona de crecimiento humana.

El vector plasmídico retroviral se emplea para translucir líneas celulares de empaquetamiento para formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células de empaquetamiento que pueden transfectarse incluyen, pero sin limitación, las líneas celulares PE501, PA317, \Psi-2, \Psi-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, \PsiCRE, \PsiCRIP, GP+#-86, GP+envAm12 y DAN, como se describen en Miller (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14. El vector puede transducir las células de empaquetamiento por cualquier medio conocido en la técnica. Dichos medios incluyen, pero sin limitación, electroporación, el uso de liposomas y precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede encapsularse en un liposoma o acoplarse a un lípido y después administrarse a un huésped. La línea celular productora genera partículas infecciosas de vectores retrovirales que incluyen la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Dichas partículas de vectores retrovirales pueden emplearse después para transducir células eucariotas in vitro o in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Las células eucariotas que pueden transducirse incluyen, pero sin limitación, células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.

Un enfoque diferente para terapia génica es la "terapia transcariótica", en la que las células del paciente se tratan ex vivo para inducir los genes cromosómicos latentes para producir la proteína de interés después de la reintroducción en el paciente. La terapia transcariótica supone que el individuo tiene una dotación normal de genes necesaria para la activación. La terapia transcariótica implica introducir un promotor u otra secuencia reguladora exógena capaz de activar los genes nacientes en el ADN cromosómico de las células del paciente ex vivo, cultivar y seleccionar células productoras de proteína activas y después reintroducir las células activadas en el paciente con la intención de que se establezcan totalmente. Las células "de genes activados" fabrican después la proteína de interés durante cierta cantidad de tiempo significativa, quizá durante tanto tiempo como la vida del paciente. Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.641.670 y 5.733.761 describen en detalle este concepto.

Kits

Esta invención se refiere además a kits para fines de investigación o diagnóstico. Los kits incluyen típicamente uno o más recipientes que contienen los anticuerpos de la presente invención. En una realización preferida, los kits comprenden recipientes que contienen anticuerpos de cadena sencilla en una forma adecuada para derivatizarse con una segunda molécula. En una realización más preferida, los kits comprenden recipientes que contienen el anticuerpo de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3.

En otra realización, los kits pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Preferiblemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se suministran en un plásmido adecuado para la transfección en y para la expresión por una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (con frecuencia un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido también puede contener sitios de restricción apropiados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido para producir diversos anticuerpos. Los plásmidos también pueden contener numerosos otros elementos para facilitar la clonación y expresión de las proteínas codificadas. Dichos elementos son bien conocidos para los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores de selección, codones de inicio, codones de terminación. En una realización más preferida, el kit comprende recipientes que contienen las secuencias de ADN de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.

Indicaciones terapéuticas

Las enfermedades en las que la formación de trombos desempeña un papel etiológico significativo incluyen infarto de miocardio, coagulación intravascular diseminada, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, apoplejía isquémica, choque séptico, síndrome disneico agudo, angina inestable y otras afecciones oclusivas arteriales y venosas. Los anticuerpos de esta invención son útiles en todas estas, así como en otras enfermedades en las que la formación de trombos sea patológica. Otras afecciones patológicas en las que el anticuerpo de esta invención puede ser útil incluyen cáncer con coagulopatía e inflamación. Los anticuerpos también pueden encontrar utilidad en injertos cutáneos y venosos y trasplantes de órganos. Por utilidad se entiende que los anticuerpos son útiles para el tratamiento, para prevenir la enfermedad o para evitar su avance hacia un estado más grave. Los anticuerpos de esta invención también proporcionan un anticoagulante seguro y eficaz, por ejemplo, en pacientes que reciben bioprótesis tales como válvulas cardiacas. Estos anticuerpos pueden sustituir a la heparina y warfarina en el tratamiento de, por ejemplo, una embolia pulmonar o infarto de miocardio agudo. Los anticuerpos de esta invención también pueden encontrar utilidad en el recubrimiento de dispositivos médicos en los que la coagulación es una cuestión preocupante.

Ensayos

Están disponibles varios ensayos de laboratorio para medir la actividad anticoagulante in vitro de un anticuerpo de esta invención. El efecto anticoagulante de un anticuerpo puede medirse usando ensayos del tiempo de coagulación plasmática tales como el tiempo de tromboplastina parcial activada ("TTPA"), el tiempo de coagulación de trombina ("TCT") y/o el tiempo de protrombina ("TP"). Estos ensayos distinguen entre diferentes mecanismos de inhibición de la coagulación e implican la activación de proteína C. La prolongación del tiempo de coagulación en uno cualquiera de estos ensayos demuestra que la molécula puede inhibir la coagulación en el plasma.

Los ensayos anteriores se usan para identificar anticuerpos con actividad anticoagulante que son capaces de unirse a TF tanto en sistemas purificados como en un entorno plasmático. Después se usan ensayos adicionales para evaluar otras actividades de los anticuerpos de la invención, tales como inhibición de la formación catalizada por trombina de fibrina a partir de fibrinógeno (Jakubowski, H. V. y col. (1986) J. Biol. Chem. 261 (8): 3876-3882), inhibición de la activación por trombina del factor V (Esmon, C. T. y col. (1982). J. Biol. Chem. 257 (14): 7944-7947), inhibición acelerada de trombina por antitrombina III y cofactor II de heparina (Esmon, N. L. y col. (1983) J. Biol. Chem. 258 (20): 12238-12242), inhibición de la activación por trombina del factor XIII (Polgar, J. y col. (1987) Thromb. Haemost. 58 (1): 140), inhibición de la inactivación mediada por trombina de proteína S (Thompson, E. A. y Salem, H .H. (1986); J. Clin. Inv. 78 (1): 13-17) e inhibición de la activación y la agregación plaquetaria mediada por trombina (Esmon, N. L. y col. (1983), anteriormente).

Los siguientes ensayos, que se describen en detalle en el Ejemplo 4, se usan para medir la potencia in vitro o la afinidad de unión in vitro de los anticuerpos de la invención: 1) ensayo de hidrólisis peptídica de sT F/FVIIa; 2) ensayo de activación de factor X; 3) ensayo de TP; y 4) ensayo de microcalorimetría.

Al llevar a cabo los procedimientos de la presente invención se entiende por supuesto que las referencias a tampones, medios, reactivos, células y condiciones de cultivo particulares no pretenden ser limitantes sino que deben leerse de modo que incluyan todos los materiales relacionados que un especialista en la técnica reconocerá que son de interés o valor en el contexto particular en el que se presenta esa discusión. Por ejemplo, con frecuencia es posible sustituir un sistema tampón o medio de cultivo por otro y aun así conseguir resultados similares, si no idénticos. Los especialistas en la técnica tendrán suficientes conocimientos de dichos sistemas y metodologías de modo que serán capaces, sin una experimentación excesiva, de hacer dichas sustituciones según sirvan óptimamente a sus propósitos en el uso de los métodos y procedimientos descritos en este documento.

La presente invención se describirá a continuación adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes como guía para ayudar a la práctica de la invención. En la aplicación de la descripción del ejemplo debe tenerse claro en la mente que se sugerirán sin duda por sí mismas otras y diferentes realizaciones de los procedimientos descritos de acuerdo con la presente invención a los especialistas en la técnica pertinente.

En los ejemplos anteriores y siguientes, todas las temperaturas se exponen sin corregir en grados Celsius y todas las partes y porcentajes son en peso a menos que se indique otra cosa.

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Ejemplo 1 Construcción de anticuerpo anti-TF de cadena sencilla ScFv(TF)3e10

1

El anticuerpo anti-TF de cadena sencilla scFv(TF)3e10 (SEC ID Nº: 1) está constituido por un péptido señal (-18 a -1), dominio V_{H} (1 a 126), engarce V_{H}-V_{L} (127 a 131), dominio V_{L} (132 a 246) y secuencia de etiqueta e (247 a 264). La secuencia de ADN de scFv(TF)3e10 (SEC ID Nº: 2) codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.

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Ejemplo 2 Construcción de anticuerpo anti-TF de cadena sencilla scFv(TF)3e10\Delta

2

El anticuerpo anti-TF de cadena sencilla scFv(TF)3e10\Delta (SEC ID Nº: 3) está constituido por un péptido señal (-18 a -1), dominio V_{H} (1 a 126), engarce V_{H}-V_{L} (127 a 131) y dominio V_{L} (132 a 243). El scFv(TF)3e10\Delta difiere de scFv(TF)3e10 por una deleción de 3 aminoácidos (GAP) en el extremo N-terminal del dominio V_{L} y por deleción de la secuencia de etiqueta e C-terminal. La secuencia de ADN de scFv(TF)3e10\Delta (SEC ID Nº: 4) codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.

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Ejemplo 3 Expresión de los anticuerpos anti-TF en células bacterianas y de mamífero

Se identificaron seis anticuerpos de cadena sencilla diferentes scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 y scFv(TF)3h2 a partir de un fago de unión a TF sobreexpresado en E. coli y se purificaron por afinidad usando una columna de afinidad de etiqueta e como se ha descrito anteriormente. Las afinidades de los seis anticuerpos purificados por sTF se midieron usando BIAcore y después estos anticuerpos se caracterizaron en los ensayos de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa, activación de FX, TP y microcalorimetría que se describen en el Ejemplo 4, cuyos resultados se describen en el Ejemplo 5.

El anticuerpo scFv(TF)3e10 (SEC ID Nº: 1) también se expresó en células CHO. El plásmido de expresión contenía la secuencia de ADN que codifica scFv(FT)3e10 (SEC ID Nº: 2) y los marcadores de selección tanto de higromicina B como de DHFR. Se realizó la selección original en higromicina 400 \mug/ml para seleccionar una población. Después, la población resultante se sometió a selección con metotrexato 100 nM. Durante esta selección, las células que tenían copias amplificadas de la región de ADN que contenía el marcador de selección y el gen diana se seleccionaron de entre la población. Los niveles de expresión se aumentaron de aproximadamente 0,3 mg/l a aproximadamente 6 mg/l como resultado de esta selección.

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Ejemplo 4 Ensayos de potencia y afinidad de unión in vitro 1. Ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa

El principio de este ensayo se representa a continuación. El enlace amida de tripéptido y p-nitroanilida del sustrato se hidroliza por el complejo sTF/FVIIa. El producto cromóforo liberado, p-nitroanilida, se controla a 405 nm y se calcula la concentración de producto formado por unidad de tiempo usando un coeficiente de extinción molar de 9920 M^{-1} cm^{-1}. Los valores de CI_{50} (C) se determinan por ajuste de las proporciones iniciales en la ecuación de 4 parámetros: Y = (A - D)/(1 + (x/C)^B) + D

3

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Reactivos y soluciones

1. Tampón de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM, BSA al 0,1%, pH 7,5.

2. FVIIa humano (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 10 x - preparar una solución 20 nM en tampón de ensayo antes del uso.

3. TF soluble (Berlex): solución de trabajo 10x - preparar una solución 30 nM en tampón de ensayo antes de uso.

4. Sustrato cromogénico S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): Solución madre: 10 mM en H_{2}O, almacenada a 4ºC. Solución de trabajo 2,5x - preparar una solución 2,5 mM en tampón de ensayo antes del uso.

5. Anticuerpo: Preparar diluciones 2,5x en tampón de ensayo antes del uso.

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Condiciones de ensayo

Los ensayos se realizaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos a temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los componentes son las siguientes:

4

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Procedimiento de ensayo

1. Pipetear 0,1 ml de AB 2,5x (o tampón de control) en cada pocillo.

2. Añadir 0,025 ml de sTF 10x e incubar 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.

3. Añadir 0,025 ml de FVIIa 10x, incubar 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.

\newpage

4. Añadir 0,1 ml de sustrato S2266 2,5x, transferir inmediatamente la placa a un lector de placas y medir la cinética enzimática a 405 nm a intervalos de 10 segundos durante 15 minutos.

Este ensayo puede usarse para medir una K_{D} aparente de unión de los anticuerpos de la invención a sTF o al complejo FVIIa/TF y determinar si los anticuerpos de la invención compiten con FVII por la unión a TF.

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2. Ensayo de activación de factor X

El principio de este ensayo se representa a continuación. Se incuba FVIIa con vesículas de TF humano recombinante para formar un complejo de proteasa capaz de activar sustrato, FX. Este complejo se forma en presencia (o ausencia) de diferentes concentraciones de anticuerpo, después se introduce el sustrato FX y se deja que se desarrolle la reacción para formar el producto, proteasa activa FXa, que es capaz de hidrolizar el enlace amida de p-nitroanilida del sustrato cromogénico S2222. El producto cromóforo liberado, p-nitroanilida, se controla a 405 nm y la concentración de producto formado por unidad de tiempo se calcula usando un coeficiente de extinción molar 9920 M^{-1}cm^{-1}. Los valores de CI_{50} (C) se determinan por ajuste de las proporciones iniciales en la ecuación de 4 parámetros: Y = (A - D)/(1 + (x/C)^B) + D

5

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Reactivos y soluciones

2. FVIIa humano (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 10x - preparar una solución 100 pM en tampón de ensayo antes del uso.

3. TF humano recombinante (reconstruido en el laboratorio a partir de Innovin, Dade): solución de trabajo - preparar una dilución 1:480 en tampón de ensayo antes del uso.

4. Factor X humano (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 4x - preparar una solución 1000 mM en tampón de ensayo antes del uso.

5. Sustrato cromogénico S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):

Solución madre: 6 mM en H_{2}O, almacenada a 4ºC.

Solución de trabajo - preparar una solución de 0,78 mM en EDTA 3,57 mM (para detener la reacción), NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 antes del uso.

6. Anticuerpo:

Preparar diluciones 4x en tampón de ensayo antes del uso.

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Condiciones de ensayo

6

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Procedimiento de ensayo

1. Pipetear 0,015 ml de AB 4x (o tampón de control) en cada pocillo.

2. Añadir 0,015 ml de vesículas de rTF 4x.

3. Añadir 0,015 ml de FVIIa 4x, incubar 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.

4. Añadir 0,15 ml de FX 4x, incubar 5 min a temperatura ambiente con agitación suave.

5. Añadir 0,14 ml de sustrato S2222, transferir inmediatamente la placa a un lector de placas y medir la cinética enzimática a 405 nm a intervalos de 10 segundos durante 15 minutos.

Este ensayo puede usarse para determinar si los anticuerpos de la invención inhiben que el complejo FVIIa/TF active al FX y para determinar si los anticuerpos de la invención compiten con FX por la unión al complejo FVIIa/TF.

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3. Ensayo de tiempo de protrombina (TP)

Para la reacción de TP convencional, se añaden 90 \mul de una concentración apropiada del anticuerpo o PBS a 20 \mul de tromboplastina IS (Dade) y 90 \mul de CaCl_{2} 25 mM en una cubeta. La mezcla se incuba durante 1 min a 37ºC, después 100 \mul de plasma tratado con citrato (Helena Laboratories). Como alternativa, se añade un volumen apropiado de anticuerpo concentrado a 100 \mul de tromboplastina humana recombinante (Ortho Recombiplastin) y, aproximadamente 2 min después, se añaden 100 \mul de plasma humano reconstituido. Se mide el tiempo de coagulación para cada ensayo de coagulación individual tomando el promedio de dos mediciones usando un Electra 900C Coagulometer (Hemoliance) y los valores promedio determinados a partir de ensayos repetidos (n = 3 ó 4). Se generaron curvas de respuesta a la dosis para cada inhibidor y después se usó un análisis de regresión para calcular la concentración (en nM) necesaria para una prolongación de dos veces del tiempo de coagulación.

Este ensayo puede usarse para evaluar el efecto de los anticuerpos de la invención sobre la ruta de coagulación sanguínea extrínseca. Se determina la cantidad de anticuerpo necesaria para duplicar el TP y puede compararse con otros anticoagulantes para evaluar la potencia relativa de los anticuerpos de la invención.

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4. Ensayo de microcalorimetría

El ensayo de microcalorimetría (colorimetría de valoración isotérmica) se usó para medir la afinidad de unión (K_{D}) de los anticuerpos de la invención a TF en solitario o al complejo FVIIa/TF. Este ensayo se realizó usando un instrumento MicroCal VP-ITC. El complejo FVIIa/TF se formó previamente por adición de un exceso molar de 2,3 veces de FVIIai a sTF. Se usó cromatografía de exclusión por tamaños para verificar que el sTF en el ensayo estaba en su totalidad formando complejos. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo por el complejo, se añadió complejo VIIa/TF 1,2 \muM a la celda microcalorimétrica y se añadió anticuerpo 65 \muM a la jeringa. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo por sTF en solitario, se añadió sTF 10 \muM a la celda y se añadió anticuerpo 141 \muM a la jeringa. El análisis de datos se realizó usando el programa informático MicroCal Origin. Los datos se ajustan a un solo sitio de unión.

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Ejemplo 5 Características in vitro de los anticuerpos anti-TF de esta invención

Se aislaron seis anticuerpos de unión a TF diferentes a partir de una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos de cadena sencilla totalmente humanos: scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6, scFv(TF)3e10 y scFv(TF)3h2. Las afinidades de estos anticuerpos de unión a sTF expresados en E. coli, como se midieron usando el BIAcore, estaban entre 35 y 470 nM. El ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/VIIa descrito en el Ejemplo 4 se usó para determinar si estos anticuerpos bloqueaban la formación de un complejo VIIa/TF activo. En este ensayo, la unión de VIIa a sTF acelera la velocidad de escisión contra el sustrato peptídico cromogénico S2266 en >20 veces. Los anticuerpos que inhiben la unión de FVIIa a TF bloquean esta aceleración. Cinco de los anticuerpos de cadena sencilla scFv(TF)2c1, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 y scFv(TF)3h2, inhibían la hidrólisis de S2266, sugiriendo que inhiben la unión de FVIIa a sTF (Figura 1). Por el contrario, el anticuerpo de cadena sencilla scFv(TF)3e10 no inhibía el ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/VIIa y, de hecho, este anticuerpo aumentaba la velocidad de hidrólisis del S2266, sugiriendo que el scFv(TF)3e10 aumenta la afinidad de sTF por FVIIa. Usando el ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/VIIa, el anticuerpo scFv(TF)3e10 aumentaba la afinidad de FVIIa por sTF, disminuyendo la K_{D} aparente 5 veces (Figura 2). El scFv(TF)3e10 no afectaba a la velocidad de hidrólisis por FVIIa en ausencia de sTF, indicando que este anticuerpo no interacciona con FVIIa en solitario. La K_{D} del anticuerpo scFv(TF)3e10 por sTF, medida usando el ensayo de hidrólisis peptídica de sTF/FVIIa, era de 65,4 nM (Figura 4). Se usó un ensayo de microcalorimetría para comparar la afinidad de scFv(TF)3e10 por TF en comparación con el complejo FVIIa/TF. Estos experimentos revelaron que el scFV(TF)3e10 expresado en células de mamífero tenía una afinidad \sim20 veces superior por el complejo TF/FVIIa en comparación con el sTF libre (33 nM frente a 600 nM, Figura 5).

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Los seis anticuerpos de cadena sencilla que se unen a TF, expresados en bacterias, se compararon usando el ensayo de activación de FX y el ensayo de TP. Ninguno de los cinco anticuerpos que inhibían la velocidad de hidrólisis de S2266 por el complejo sTF/FVIIa, scFv(TF)2c1, scFv(TF)2c11, scFv(TF)2d3, scFv(TF)2h6 y scFv(TF)3h2, prolongaban el TP más allá que el control de tampón PBS (Figura 3). Por el contrario, aunque el anticuerpo scFV(TF)3e10 no tenía la mayor afinidad, medida mediante BIAcore, y aumentaba la afinidad de FVIIa por sTF, el scFv(TF)3e10 era el único anticuerpo en el grupo que inhibía la activación de FX (Figura 6 y no se muestran los datos) y prolongaba el tiempo de coagulación en el ensayo de TP (Figura 3). La CI_{50} del anticuerpo scFv(TF)3e10 (dímero) para la inhibición en el ensayo de activación de FX era de 0,44 nM (Figura 6). Por último, el ensayo de activación de FX se usó para determinar si el anticuerpo scFv(TF)3e10 compite con FX por la unión al complejo FVIIa/TF. El scFv(TF)3e10 inhibía de forma dependiente de la dosis la activación de FX con la misma con K_{D(ap)} a todas la concentraciones del sustrato FX, indicando que el scFv(TF)3e10 no compite con FX y no se une a TF o al complejo de FVIIa/TF en el mismo sitio que FX (Figura 7).

El anticuerpo scFv(TF)3e10 se identificó en base a la unión a TF soluble humano recombinante. La homología de secuencia de TF entre el humano y el murino o el humano y el de conejo es del 58% y del 71%, respectivamente. El anticuerpo parece unirse a un epítope único sobre el TF humano que interfiere con la activación de FX por el complejo FVIIa/TF. Fisiológicamente, este anticuerpo tiene una ventaja sobre los anticuerpos que compiten con FVII o FVIIa en la unión a TF. La K_{D} de FVIIa por TF soluble es de \sim10 nM (Figura 2), un valor que concuerda con los valores publicados para la unión de FVIIa a sTF (4,8 nM, Neuenschwander, P. F. y Morrissey, J. H. (1994) J. Biol. Chem. 269 (11): 8007-8013) o la unión de FVII, FVIIa y FVIIai inactivado por DIP a TF de longitud completa reconstituido en vesículas neutras de fosfatidilcolina (Bach R. y col. (1986) Biochemistry 25: 4007-4020). La afinidad de la unión de FVII o FVIIa a TF de longitud compleja aumenta enormemente cuando se incluye una fosfatidilserina cargada en las vesículas fosfolipídicas (Bach R. y col., (1996) anteriormente), debido a la interacción del dominio GLA de FVII o FVIIa con la superficie de membrana cargada (Neuenschwander, P. F. y Morrissey, J. H. (1994) anteriormente). En estas condiciones óptimas, el FVIIa se une al TF de longitud completa con una afinidad muy alta (41 pM). Un anticuerpo de TF que compite con la unión de FVII o FVIIa tendrá dificultades para competir por su complejo FVIIa/TF de alta afinidad. Por el contrario, el anticuerpo scFv(TF)3e10 no sólo tiene una mayor afinidad por el complejo FVIIa/TF que por TF, sino que no compite con FVIIa por la unión a TF. Un anticuerpo tal como scFv(TF)3e10 que no compite con FVIIa, inhibirá la activación de FX independientemente de la concentración plasmática de FVII, que es -10 nM.

El anticuerpo scFv(TF)3e10 también tiene una ventaja sobre los anticuerpos que compiten con FX por la unión a TF. La K_{m} de FX por el complejo VIIa/TF está entre 0,0621 y 0,099 \muM basándose en los datos que se muestran en la Figura 7, que concuerdan con valores publicados (0,1 \muM, Baugh, R. J. y col. (2000) J. Biol. Chem. 275 (37): 28826-28833). La concentración de FX en plasma humano es de 140 nM (1,4 a 2 veces K_{m}). Un anticuerpo tal como scFv(TF)3e10, que no compite con FX como se muestra en la Figura 7, inhibirá la activación de FX independientemente de la concentración plasmática de FX.

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Ejemplo 6 Modelo in vivo de tromboembolia en rata

El anticuerpo de cadena sencilla que se une a TF scFv(TF)3e10 es específico para TF de primates. Se desarrolló un modelo de tromboembolia desencadenada por TF humano (reactivo de tromboplastina que contiene TF humano recombinante, Ortho) en ratas Sprague Dawley macho conscientes (350-400 g, n > 7/grupo). En este modelo de coagulación intravascular diseminada (CID), el TF, mediante la inyección de tromboplastina, induce la deposición de fibrina pulmonar, disnea y muerte. Se inyectaron dosis de scFv(TF)3e10 expresado en células de mamífero o vehículo en la vena de la cola seguido, 15 minutos después, de una inyección embolada de tromboplastina (0,5 ml/kg). En el grupo tratado con vehículo, esta dosis de TF dio como resultado una letalidad del 60% (DL_{60}), habitualmente en 5 min desde la inyección de tromboplastina. Las ratas se puntuaron de acuerdo con el siguiente sistema de puntuación de morbilidad-mortalidad: 0 = no afectadas; 1 = disnea moderada (recuperación en 30 min); 2 = disnea grave (moribundas, la recuperación requirió más de 60 minutos); y 3 = muerte. La puntuación promedio se usó para comparar la eficacia de los diferentes grupos de tratamiento. Los resultados usando este ensayo in vivo se representan en la Figura 8. El anticuerpo de la invención era capaz de reducir la mortalidad y reducir la disnea en este ensayo.

Los ejemplos anteriores pueden repetirse con un éxito similar sustituyendo los reactivos y/o condiciones de funcionamiento descritos en general o específicamente de esta invención a los usados en los ejemplos anteriores.

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<110> Light, David

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McLean, Kirk

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<120> Nuevos anticuerpos dirigidos contra factor tisular como anticoagulantes

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<130> 52295AWOM2

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<150> US 60/376.566

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<151> 01-05-2002

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<160> 4

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 282

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de anticuerpo scFv(TF)3e10

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<400> 1

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7

70

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<210> 2

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<211> 849

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ADN que codifica el anticuerpo scFv(TF)3e10

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<400> 2

8

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<210> 3

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<211> 261

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos del anticuerpo SCFV(TF)3e10delta

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 783

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ADN que codifica el anticuerpo SCFV(TF)3e10delta

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<400> 4

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10

Claims

1. Un anticuerpo anticoagulante que se une con mayor afinidad al complejo de factor FVIIa/factor tisular (FVIIa/TF) que al factor tisular (TF) en solitario, en el que dicho anticuerpo tiene una identidad de al menos aproximadamente el 90%, o una identidad de al menos el 95%, o una identidad de al menos el 97% con los dominios de las regiones V_{L} y V_{H} de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3, y en el que dicho anticuerpo no compite por la unión a TF con uno o más de los factores de coagulación seleccionados del grupo constituido por factor VII (FVII) y factor X (FX).

2. El anticuerpo anticoagulante de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 3.

3. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se une con una afinidad al menos 2 veces superior, o con una afinidad al menos 5 veces superior, o con una afinidad al menos 10 veces superior al complejo FVIIa/TF que al TF en solitario, medida en un ensayo de microcalorimetría.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo dimérico Fab o un anticuerpo IgG.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que dichos factores de coagulación son FVII y FX.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo está glicosilado, está modificado por la adición de polietilenglicol o está biotinilado para unirse a estreptavidina.

8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo dicha composición un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo.

9. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar en la protección frente a la formación de trombos.

10. Uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de una composición farmacéutica para proteger frente a la formación de trombos.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que dicho procedimiento es para proteger frente a la formación de trombos en una apoplejía isquémica, complicaciones trombóticas después de una angioplastia o cirugía microvascular.

12. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usar en el tratamiento de una trombosis venosa profunda (DVT), coagulación intravascular diseminada (CID), síndrome coronario agudo o una coagulopatía desarrollada en un cáncer.

13. Uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una trombosis venosa profunda (DVT), coagulación intravascular diseminada (CID), síndrome coronario agudo o una coagulopatía desarrollada en un cáncer.

14. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usar en la regulación de la respuesta inflamatoria en un paciente.

15. Uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de una composición farmacéutica para regular la respuesta inflamatoria en un paciente.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicha respuesta inflamatoria se selecciona del grupo constituido por septicemia, injertos cutáneos y venosos y transplantes de órganos.

17. Uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la formación de un recubrimiento no trombogénico sobre la superficie de un dispositivo médico.

18. Un kit que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

19. Un kit que comprende secuencias de ADN que codifican el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

20. Una composición de terapia génica que comprende la secuencia de polinucleotídica de la SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4, que codifica el anticuerpo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3 en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de terapia génica, en la que dicho anticuerpo no compite por la unión a TF con uno o más de los factores de coagulación seleccionados del grupo constituido por factor VII (FVII) y factor X (FX).

21. Una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha secuencia polinucleotídica comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4.

22. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en terapia.