PT1503785E

PT1503785E - Novas proteínas de fusão de trombomodulina que têm como alvo o factor tecidular e que actuam como anticoagulantes

Info

Publication number: PT1503785E
Application number: PT03721975T
Authority: PT
Inventors: David Light; Kirk Mclean
Original assignee: Bayer Schering Pharma Ag
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2011-01-17
Also published as: ATE484524T1; BR0304660A; AU2003225256B2; JP4460443B2; IL164733A0; IL164733A; NZ536243A; WO2003092602A2; NO20035849L; KR20050045945A; US7622122B2; CR7584A; MXPA04010795A; ES2354419T3; RU2345789C2; DK1549341T3; DE60326970D1; UA81114C2; NZ536242A; NO20035848L

Description

1

DESCRIÇÃO "NOVAS PROTEÍNAS DE FUSÃO DE TROMBOMODULINA QUE TÊM COMO ALVO O FACTOR TECIDULAR E QUE ACTUAM COMO ANTICOAGULANTES"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Conservar o devido equilíbrio entre a actividade pró-coagulante e anti-coagulante nos vasos sanguíneos é essencial para a hemóstase normal (Davie, E.W. et al. (1991) Biochemistry, 30(43):10363-10370). A perturbação do equilíbrio no sentido da coagulação conduz à trombose, o que pode provocar ataques cardíacos, AVCs, embolismo pulmonar e trombose venosa. Há a necessidade de anti-coagulantes mais eficazes e seguros para o tratamento de distúrbios trombóticos específicos. O factor tecidular ("FT") é uma glicoproteína transmembranar que é o principal iniciador da cascata da coagulação (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1):180-184) . Em condições fisiológicas normais, o FT activo não está em contacto com o sangue. Durante lesões vasculares, a exposição do sangue a FT subendotelial e ao colagénio conduz à activação de factores de coagulação e plaquetas e subsequentemente à formação de um tampão hemostático. A indução inapropriada da expressão de FT numa variedade de situações clínicas pode conduzir a tromboses potencialmente fatais e/ou contribuir para complicações patológicas. Acredita-se que a exposição a FT na sequência de ruptura da placa seja responsável pela oclusão trombótica que conduz ao enfarte agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral. 2

Nestas situações, as vias de sinalização pró-inflamatórias activadas por factores de coagulação contribuem também para a formação de edemas e aumento da dimensão do enfarte. A lesão vascular associada à angioplastia conduz à regulação positiva do FT nas células musculares lisas (SMCs, do inglês Smooth Muscle Cells) . Pensa-se que isso induz vias de sinalização celular associadas à restenose. A sobre-expressão de FT em caso de cancro e sépsis por bactérias gram-negativas conduz a tromboses potencialmente fatais e a activação das vias inflamatórias. 0 complexo factor Vila ("FVIIa")/FT está envolvido no mecanismo patogénico numa variedade de doenças trombóticas e o nivel circulante de FT constitui um factor de risco para determinados doentes. FVIIa e FT desempenham papéis únicos em lesões vasculares na manutenção da hemóstase e no inicio de tromboses. FT é expresso normalmente na adventícia, mas é regulado positivamente e inadequadamente expresso na média e neoíntima em doenças vasculares. A expressão de FT é aumentada em placas ateroscleróticas e é protegida do sangue por uma cobertura fibrosa fina que pode romper-se expondo o FT. Intervenções cirúrgicas, tais como angioplastia com balão, aplicação de stent ou endarterectomia danificam a parede do vaso e expõem o FT subjacente. Na placa aterosclerótica, rica em lípidos, de parede fina, uma ruptura espontânea ou erosão endotelial conduz à exposição do FT e à trombose, resultando em angina instável e enfarte do miocárdio. 0 FT pode circular em micropartículas derivadas de células e os níveis de FT circulante são elevados em caso de angina instável, sugerindo que este FT circulante pode contribuir para a formação de trombos (Soejima, H. et al. (1999) Circulation 3 99(22):2908-2913). Frequentemente o cancro está associado a um estado de hipercoagulação, atribuído à sobre-expressão do FT em células de tumor. Este facto predispõe o doente para tromboses venosas profundas, embolia pulmonar e coagulação intravascular disseminada de baixo grau ("CID"). A CID resulta em deposição microvascular de fibrina, contribuindo para falência orgânica múltipla. Os resultados de modelos de lesões arteriais agudas de trombose indicam que os inibidores à base de proteínas de FVIIa/FT, tal como factor Vila inibido no sítio activo ("FVIIal") e inibidor da via do factor tecidular ("IVFT") são antitrombóticos eficazes com menores hemorragia em comparação com os inibidores da trombina e do factor Xa ("FXa") . Foram divulgadas composições com um domínio inibidor do sítio activo do factor vila e um domínio de factor tecidular para a inibição de FVIIa para utilização em métodos de diagnóstico, terapêuticos e profiláticos (patente norte-americana 5 874 407). Além disso, a inibição de FVIIa/FT é superior a outros anticoagulantes (por exemplo, heparina, inibidores de FXa) na prevenção do espessamento da neoíntima e estenose vascular na sequência de lesões provocadas por balão (Jang, Y. et al. (1995) Circulation 92 (10) :3.041-3050) . A trombomodulina ("TM") é uma glicoproteína transmembranar que possui propriedades anticoagulantes e é expressa predominantemente na superfície do lúmen de células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos (Esmon, N.L et al. (1982) J. Biol. Chem. 257 (2) :859—864; Salem, H.H. et al. (1983) J. Biol. Chem. 259(19):12246-12251) . A TM matura, de sequência completa (full length) é uma proteína modular de 557 resíduos de aminoácidos, 4 constituída por 5 domínios estruturais: uma região hidrófoba N-terminal (resíduos 1-226), uma região rica em cisteína (resíduos 226-462), uma região rica em Ser/Thr 0-glicosilada (resíduos 463-497), uma região transmembranar hidrófoba (resíduos 498-521) e uma cauda citoplasmática C-terminal (resíduos 522-557). A região rica em cisteína inclui seis estruturas repetidas homólogas do precursor do factor de crescimento epidérmico ("EGF"), que são designadas por domínios tipo EGF, domínios de homologia EGF ou domínios EGF. A região rica em cisteína pode ainda ser dividida em 3 domínios: as repetições tipo EGF 1, 2 e 3 ("EGF123", resíduos 226-344), a ansa interdomínios localizada entre EGF3 e EGF4 (resíduos 345-349) e os domínios tipo EGF 4, 5 e 6 ("EGF456", resíduos 350-462). A função de EGGF456 consiste em mediar a ligação da trombina e a activação da proteína C. Um estudo sugeriu que a quinta e sexta repetições tipo EGF ("EGF5", resíduos 390-407 e "EGF6", resíduos 427-462, respectivamente) possuem a capacidade de ligar a trombina (Kurosawa, S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263 (13):5993-5996); outro estudo sugere que o domínio EGF456 é suficiente para actuar como cofactor da actividade de activação da proteína C mediada por trombina (Zushi, M. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(18):10351-10353). O domínio rico em Ser/Thr intensifica a ligação de trombina mediada por EGF456. A terceira repetição tipo EGF ("EGF3", resíduos 311-344) é necessária para a activação do inibidor da fibrinólise activável pela trombina ("TAFI"). Têm sido descritas várias mutações pontuais em EGF3 que interferem com a activação de tafi (Wang, w. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(30):22942-22947). Análogos de TM com a capacidade 5 para intensificar a activação mediada por trombina da proteína C, mas que têm uma capacidade significativamente reduzida de promoção da activação de TAFI são úteis na terapêutica antitrombótica (WO 01/98352). O complexo trombina/TM converte a proteína C em proteína C activada ("APC") que por seu lado degrada os factores Va e Vllla, prevenindo assim a produção de mais trombina. Por conseguinte, a TM funciona como um interruptor molecular que converte a trombina de um pró-coagulante num anti-coagulante. O Km da proteína C para o complexo trombina/TM é reduzido em 10 vezes quando a TM está localizada na superfície de uma membrana (Esmon, C.T. (1995) FASEB J. 9(10):946-955). As concentrações de proteína C no sangue (0,065 μΜ) encontram-se significativamente abaixo do Km descrito (5 μΜ) para o complexo TM/trombinha solúvel, estabelecendo assim que a TM na superfície da membrana pró-coagulante irá resultar numa intensificação local acentuada da taxa de produção de proteína C. A TM inibe tromboses por meio de um mecanismo diferente da heparina e seus derivados. A heparina é um cofactor da antitrombina III e inibi Fz e trombina através de um mecanismo dependente da trombina III. A trombina ligada ao trombo está protegida da acção da antitrombina m, o que limita a eficácia antitrombótica da heparina ou heparina de baixo peso molecular ("LMWH") em coágulos pré-existentes. Este facto explica a incapacidade da heparina ou LMWH para inibir o crescimento de trombos desencadeado pela trombina ou protrombinase ligada a coágulos ou em estudos com primatas não humanos. Em contraste, a TM recombinante atenua a produção de trombina induzida pelo coágulo e a 6 formação de fibrina de um modo dependente da dose (Mohrl, M. et al. (1998) Thromb. Haemost. 80(6):925-929). O efeito inibidor da TM é abolido pelo anticorpo anti-proteina C. A inibição da actividade pró-coagulante ligada ao coágulo é clinicamente relevante porgue a actividade pró-coagulante ligada ao coágulo resulta num crescimento mais rápido do trombo e, em última análise, na oclusão vascular ou complicações tromboembólicas. A inibição do crescimento do trombo permite aos sistemas fibrinoliticos endógenos remover coágulos mais rapidamente e integralmente. Além disso, prevê-se que a TM seja mais eficaz do que a heparina em estados patológicos em caso de depleção da antitrombina plasmática, tal como DIC. Enquanto tanto a TM como a heparina inibem o consumo de plaquetas e fibrinogénio em DIC experimental, apenas a TM foi eficaz em casos de depleção dos niveis de antitrombina III.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona novas proteínas de fusão que actuam como anticoagulantes e compreende uma proteína ou um seu análogo, fragmento, derivado ou variante que tem por alvo e se liga ao factor tecidular ("FT") ou ao complexo factor vila/factor tecidular ("FVIla/FT") e que está ligada de forma funcional ao domínio EGF456 da trombomodulina ("TM") ou a um seu análogo, fragmento, derivado ou variante, sendo que a proteína de fusão anticoagulante se liga ao factor tecidular ("TF") ou ao complexo factor VII/FT ("FVIIa/FT"). A proteína de fusão anticoagulante da presente invenção tem por alvo e liga-se ao FT ou ao complexo FVIIa/FT no 7 sítio da lesão, localizando a TM no sítio da lesão, prevenindo assim a formação de trombos e apresentando um desempenho mais eficaz como anticoagulante em comparação com o anticorpo anti-FT solúvel ou a TM solúvel ou fragmentos de TM. A proteína de fusão é mais eficaz do que a heparina de baixo peso molecular ("LMWH") no tratamento de determinadas doenças, incluindo, mas sem que isso constitua uma limitação, sépsis, coagulação intravascular disseminada, AVC isquémico, trombose venosa profunda, síndromes coronárias agudas, complicações trombóticas na sequência de angioplastia e coagulopatia em cancro avançado. Além disso, a proteína de fusão pode ser aplicada em cirurgia microvascular, enxertos de pele e venosos e transplantes de órgãos.

Noutro aspecto, a invenção apresenta composições farmacêuticas incluindo as proteínas de fusão em questão.

Noutro aspecto, a invenção apresenta uma utilização na protecção de um doente contra a formação de trombos.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma utilização na prevenção e tratamento de trombose venosa profunda ("DVT") ou coagulação intravascular disseminada ("DIC") ou síndrome coronária aguda ou cancro com sinais de coagulopatia.

Noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização na regulação da resposta inflamatória num doente.

Ainda noutro aspecto, a proteína de fusão da invenção pode ser utilizada para formar um revestimento não-trombogénico na superfície de dispositivos médicos que estão em contacto com sangue.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um kit que compreende proteínas de fusão compreendendo uma proteína que tem como alvo e se liga ao FT ou ao complexo FVIIa/FT e a domínios da TM. Em alternativa, o kit pode compreender sequências de ADN que codificam os componentes da proteína de fusão. São também apresentados métodos de preparação das proteínas de fusão da invenção, tanto recombinantes como sintéticas.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. A ligação de scFv(TF)3elO a sTF aumenta a afinidade aparente de sTF para FVIIa. 0 ensaio de activação de sTF/FVIIa foi realizado como descrito no exemplo 5, intitulado "ensaio de activação de sTF/FVIIa" utilizando FVIIa 2 nM na presença e ausência de scFv(TF)3elO 800 nM. O sTF foi titulado na ensaio e foi determinada a taxa de clivagem do substrato cromogénico (S-2266). O KD aparente para o sTF foi calculado utilizando-se um ajuste padrão com 4 parâmetros.

Figura 2. Medição da afinidade de ligação de scFv(TF)3elO para sTF. O ensaio de sTF/FVIIa foi como descrito no exemplo 5 intitulado "ensaio de activação de sTF/PVIIa" utilizando sTF 3 nM e FVIIa 2 nM. A concentração de sTF utilizada encontrava-se abaixo do KD para ligação a FVIIa. A ligação do anticorpo scFv(TF)3elO reduziu o KD de sTF para ligação a FVllz, conduzindo a uma maior formação de complexo sTF/FVIIa e, por conseguinte, a taxa de clivagem do substrato cromogénico S2266. Adicionou-se scFv(TF)3elO a concentrações crescentes e utilizou-se a 9 velocidade crescente da reacção para determinar o KD aparente do anticorpo para sTF utilizando um ajuste padrão com 4 parâmetros.

Figura 3. A análise por microcalorimetria revela que scFv(TF)3elO possui uma afinidade 20 vezes maior para o complexo sTF/FVIIa do que para o sTF isoladamente. Executou-se a calorimetria de titulação isotérmica utilizando um instrumento MicroCal VP-ITC. O complexo sTF/FViia foi pré-formado adicionando-se um excesso molar 2,3 vezes de FVIIai ao sTF. Foi empregue cromatografia de exclusão de tamanho para verificar que o sTF foi completamente integrado no complexo. Para determinação da afinidade dos anticorpos para o complexo, adicionou-se 1,2 μΜ de complexo sTF/VIIa à célula microcalorimétrica e adicionou-se 65 μΜ de anticorpo scFv(TF)3elO à seringa. Para determinação da afinidade dos anticorpos para sTF isoladamente, adicionou-se 10 μΜ de sTF à célula e adicionou-se 141 μΜ de scFv(TF)3elO à seringa. Efectuou-se a análise dos dados utilizando-se o software MicroCal Origin. Os dados foram ajustados para um sitio de ligação único.

Figura 4. O scFv(TF)3elO inibe de forma dependente da dose o ensaio de activação de FX. Os pormenores deste ensaio encontram-se descritos no exemplo 5, intitulado "ensaio de activação do factor X". O IC5o representa a dose necessária para atingir 50% da inibição máxima.

Figura 5. A proteína de fusão inibe de forma mais potente a coagulação do que o anticorpo FT ou TMÍ456 isoladamente. Foi realizada um ensaio do tempo de protrombina (PT) para comparar a proteína de fusão com o 10 anticorpo FT ou TMÍ456 isoladamente. Um volume apropriado de inibidor concentrado, seja anticorpo FT (scFv(TF)3el0), TMÍ456 ou a proteína de fusão (scFv(TF)3elO-TMi456) foi adicionado a 100 μΐ de tromboplastina humana recombinante (Ortho Recombiplastin). Aproximadamente 2 minutos depois foram adicionados 100 μΐ de plasma humano reconstituído. O tempo de coagulação foi determinado num coagulómetro Haemoliance. As curvas de resposta à dose foram geradas para cada inibidor e depois aplicou-se análise de regressão para calcular a concentração (em nM) necessária para um prolongamento para o dobro do tempo de coagulação.

Figura 6. A proteína de fusão retém actividade de cofactor integral para a activação da proteína C. O ensaio descrito no exemplo 5 intitulado "ensaio de activação da proteína C (cromogénico)" continha uma amostra de 20 μΐ TM, quer TMÍ4 56, que contém os domínios EGF 4-6 e a ansa interdomínios localizada entre EGF3 e EGF4 ou a proteína de fusão (scFv(TF)3elO-TMi456), 20 μΐ de 1,5 μΜ de proteína C e 20 μΐ de 3 nM de alfa trombina. Deixou-se ocorrer a activação durante 1 hora. A fase de activação foi interrompida adicionando-se 20 μΐ de hirudina 0,16 u/ml. 100 μΐ de S2266 1 mM foi depois adicionado e determinou-se a A405 a cada 10 segundos durante 30 minutos. A velocidade de reacção depende da quantidade de proteína C activada gerada. Os dados são expressos em mDO/min.

Figura 7. A taxa da activação da proteína C pela proteína de fusão é aumentada em superfícies fosfolipídicas contendo FT. A taxa da activação da proteína C por TMÍ456 não é afectada pela adição de vesículas FT. O ensaio descrito no exemplo 5 intitulado "ensaio de activação da proteína C (em superfície rica em FT)" continha uma amostra 11 de 20 μΐ de TM, tanto TMÍ456 como da fusão (scFv(TF)3el0-TMÍ456), 20 μΐ de proteína C 1,5 μΜ, 20 μΐ de alfa trombina 30 nM e 20 μΐ de tampão ou vesículas FT (Innovin, FT recombinante humano, 4x concentração normal para PT). Deixou-se ocorrer a activação durante 1 hora. A fase de activação foi interrompida adicionando-se 20 μΐ de hirudina 0,16 u/ml. 100 μΐ de S2266 1 mM foi depois adicionado e determinou-se a A405 a cada 10 segundos durante 30 minutos. A velocidade de reacção depende da quantidade de proteína C activada gerada. Os dados são expressos em mDO/min.

Figura 8. A proteína de fusão mostra maior especificidade para coagulação induzida por FT do que ΤΜί45β. O ensaio do tempo de tromboplastina parcial activado (APTT) é sensível a inibidores das vias intrínsecas e centrais de coagulação. A coagulação que ocorre neste ensaio é independente de FT. Os inibidores, tanto o anticorpo para FT (scFv(TF)3el0), TMÍ456 ou a proteína de fusão (scFv(TF)3elO-TMi4456) foram diluídos em 50 μΐ de plasma humano reconstituído para se obter uma concentração final que produziu um prolongamento para o dobro no ensaio de PT. O coagulómetro adicionou então 50 μΐ de reagente APTT (Alexin HS) e 50 μ de reagente CaCl2 (0,02 mol/L) e determinou-se o tempo de coagulação em segundos.

Figura 9. A proteína de fusão inibe de forma mais potente a coagulação do sangue total induzida por FT do que qualquer um dos seus componentes isoladamente. A coagulação do sangue total foi analisada utilizando um analisador Haemoscope Thromboelastogragh (TEG). A sangue total citratado, adicionou-se 120 nM de anticorpo FT (scFv(TF)3el0), TMÍ456 ou proteína de fusão (scFv(TF)3el0-TMÍ456) em conjunto com 10 μΐ de reagente tromboplastina 12 (diluição 1:64) e 20 μΐ de CaCl2 0,2 M. Obteve-se o valor R (tempo até formação inicial de fibrina) para cada amostra. Este valor foi depois convertido num valor R de controlo não inibido percentual.

Figura 10. A proteína de fusão revela uma resposta à dose mais previsível do que LMWH num ensaio de coagulação do sangue total (TEG). Adicionaram-se a sangue total citratado concentrações crescentes (começou-se com uma concentração de 15 nM que foi sendo aumentada em incrementos de 2x) da proteína de fusão (scFv(TF)3el0-TMÍ456) ou concentrações crescentes (começou-se com uma concentração de 0,15 u/ml de início, que foi sendo aumentada em incrementos de 2x) de enoxaparina (LMWH) em conjunto com 10 μΐ de um reagente de tromboplastina (diluição 1:64) e 20 μΐ de CaCl2 0,2 Μ. O valor R (tempo até formação inicial de fibrina) foi obtido para cada amostra e registado em gráfico contra a concentração relativa (atribuiu-se o valor de 1 a concentração mais baixa para cada amostra (valor R similar) e a seguir aumentaram-se as concentrações subsequentes 2x).

Figura 11. A proteína de fusão scFv(TF)3el0—Tmi456 é eficaz num modelo in vivo de coagulação intravascular disseminada ("DIC"). O anticorpo TF (scFv(TF)3el0) e a proteína de fusão (scFv(TF)3elO-TMi456) foram avaliados no modelo de tromboembolismo em rato, descrito no exemplo 8 para pontuação quanto a (A) percentagem de mortalidade e (B) morbilidade-mortalidade. (A) no grupo tratado com veículo, a dose de ft utilizada resultou numa letalidade de 60% (LD6o), scFv(TF)3elO-TMi456 a 0,7 nmol/kg preveniu completamente a morte. Em contraste, scFv(TF)3elO a 0,7 nmol/kg não teve qualquer impacto na morte. scFv(TF)3el0- 13 TMÍ456 foi mais eficaz do que uma dose 10 vezes maior de scFv(TF)3el0. (B) No grupo tratado com veiculo, a dose in vivo de FT resultou numa pontuação média de morbilidade-mortalidade de 2,6 com base no seguinte sistema de pontuação: 0 = não afectado; 1 = dificuldade respiratória ligeira (recuperação no espaço de 30 min); 2 = dificuldade respiratória grave (moribundo, recuperação requer mais do que 60 min.) e 3 = morte, scFv(TF)3el03-TMi456 preveniu, de forma dependente da dose, a morte e a dificuldade respiratória induzidas por FT com um valor ED50 de 0,46 nmol/kg (0,019 mg/kg), scFv(TF)3elO-TMi456 a 7,0 nmol/kg preveniu completamente tanto a morte como a dificuldade respiratória e a 0,7 nmol/kg preveniu completamente a morte e reduziu significativamente a dificuldade respiratória. Em contraste scFv(TF)3elO a 0,7 nmol/kg não teve qualquer impacto na morte e teve pouco ou nenhum efeito na dificuldade respiratória. scFv(TF)3elO-TMi456 foi mais eficaz do que uma dose 10 vezes maior de scFv(TF)3el0.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A proteína de fusão anticoagulante da presente invenção é constituída por uma proteína direccionada contra um alvo ou um análogo, fragmento, derivado ou variante desta que se liga ao factor tecidular ("FT") ou ao complexo factor Vlla/factor tecidular ("FVIIa(FT"), que está ligada de modo funcional ao domínio EGF456 da trombomodulina ("TM") ou seu um análogo, fragmento, derivado ou variante, sendo que a proteína de fusão anticoagulante se liga ao factor tecidular ("TF") ou ao complexo factor VII/FT ("FVIIa/FT"). 14

Definições:

Na descrição da presente invenção são definidos os seguintes termos como indicado abaixo. "Proteínas ou polipeptídeos recombinantes" designa proteínas ou polipeptídeos produzidos por técnicas de ADN recombinante, isto é, produzidos a partir de células, micróbios ou mamíferos, transformados por uma construção exógena de ADN que codifica o polipeptídeo desejado. Proteínas ou polipeptídeos expressos na maioria das culturas bacterianas estarão isentos de glicano. Proteína ou polipeptídeos expressos em levedura poderão apresentar um padrão de glicosilação diferente do expresso em células de mamifero.

Proteínas ou polipeptídeos "nativos" referem-se a proteínas ou polipeptídeos recuperados a partir de uma fonte que ocorre na natureza. 0 termo "TM nativa" inclui TM que ocorre de forma natural e respectivos fragmentos.

Uma "sequência codificante" de ADN é uma sequência de ADN que é transcrita em mARN e traduzida num polipeptídeo numa célula hospedeira quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência codificante são determinados por um codão de iniciação no terminal N 5' e um codão de terminação da tradução no terminal 3' . Uma sequência codificante pode incluir sequências procariotas, cADN de mARN eucariota, sequências de ADN genómicas de ADN eucariota e sequências de ADN sintéticas. Uma sequência de terminação da transcrição 15 ficará normalmente localizada a 3' em relação à sequência codificante.

Uma "proteína de fusão" é uma proteína que resulta da expressão de pelo menos duas sequências codificantes heterólogas ligadas de modo funcional. A proteína de fusão da presente invenção é constituída por uma proteína direccionada contra um alvo ou um análogo, fragmento, derivado ou variante desta que se liga ao FT ou ao FVIIa/FT, que está ligada de modo funcional ao domínio EGF456 da trombomodulina ("TM") ou a um seu análogo, fragmento, derivado ou variante, sendo que a proteína de fusão anticoagulante se liga ao factor tecidular ("TF") ou ao complexo factor vila/FT ("FViia/FT"). "Proteína direccionada contra um alvo" é uma proteína que se liga ou interage com outra proteína ou complexo proteico. A proteína direccionada contra um alvo da presente invenção é uma proteína que se liga a ou interage com FT ou o complexo FVIIa/FT. Por exemplo, um anticorpo anti-FT ou anti-complexo FVIIa/FT é uma proteína direccionada contra um alvo da presente invenção. Dois outros exemplos de proteínas direccionadas contra um alvo são o factor Vila com sítio activo inibido ("FVIIai"), que se pode ligar a FT para formar um complexo FVIIa/FT inactivo e inibidor da via do factor tecidular ("tfpi") que se pode ligar ao complexo FVIIa/FT e inactivá-lo. "Sequência de nucleótidos" é um heteropolímero de desoxirribonucleótidos (bases adenina, guanina, timina ou citosina). As sequências de ADN que codificam as proteínas de fusão da invenção podem ser montadas a partir de fragmentos sintéticos de ADN derivados de cADN e 16 oligonucleótidos de ligação curtos para proporcionar um gene sintético que possa ser expresso num vector de expressão recombinante. Na discussão da estrutura de moléculas de ADN de cadeia dupla especificas, poderão ser aqui descritas sequências em conformidade com a convenção comum de se apresentar apenas a sequência na direcção 5' para 3', ao longo da cadeia de cADN não transcrita. "Vector de expressão recombinante" é uma construção de ADN replicável utilizada para amplificar ou expressar o ADN que codifica as proteínas de fusão da presente invenção. Um vector de expressão contém sequências de controlo de ADN e uma sequência codificante. As sequências de controlo de ADN incluem sequências promotoras, sítios de ligação ao ribossoma, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores a montante e intensificadores. Sistemas de expressão recombinantes conforme presentemente definidos expressam as proteínas de fusão mediante indução dos elementos reguladores. "Células hospedeiras transformadas" designam células que foram transformadas e transfectadas com ADN exógeno. 0 ADN exógeno pode ou não ser integrado (por ligação covalente) ao ADN cromossómico que constitui o genoma da célula. Em procariotas e leveduras, por exemplo, o ADN exógeno pode ser mantido num elemento epissomal, tal como um plasmídeo ou ser integrado de forma estável no ADN cromossómico. No que respeita às células eucariotas, uma célula transformada de modo estável é uma em que o ADN exógeno se integrou na replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pelo capacidade das linhas de células eucariotas ou clones para produzir uma população de células filhas contendo o ADN exógeno. 17 "Trombomodulina (TM)" designa uma glicoproteína da superfície da célula endotelial que forma um complexo de afinidade elevada com a trombina. Os genes que codificam a TM nativa (ambos sob forma genómica e como cADN) foram isolados e sequenciados em bovinos e seres humanos (Jackman, R.W. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83(23):8834-8838 e Jackman, R.W. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(18):6425-6429). As sequências de TM bovina, humana e de ratinho exibem um grau elevado de homologia entre si. 0 cADN da TM humana codifica uma proteína de 60,3 kDa de 575 aminoácidos, incluindo uma sequência sinal de cerca de 18 aminoácidos, ver, por exemplo patente norte-americana 5 827 824.

Quando a trombina se liga a TM pode dar-se um aumento de mil vezes ou mais na taxa de activação da proteína C, o que forma a proteína C enzimaticamente activada anticoagulante. Além disso, quando a trombina se liga a TM deixa de funcionar como enzima pró-coagulante.

Especificamente, a formação de fibrina catalisada pela

trombina, a activação do factor V e a activação de plaquetas são inibidas na presença da TM. Assim, a TM converte a trombina num anticoagulante fisiológico. "Domínio de trombomodulina (TM)" designa uma sequência de aminoácidos discreta que pode ser associada a uma função particular ou característica da TM, tal como uma unidade estrutural terciária característica. O gene da TM completo codifica um precursor ou pró-polipeptídeo contendo os seguintes domínios: os aminoácidos 18-1 constituem a sequência sinal; os aminoácidos 1-228 constituem a região hidrófoba N-terminal, os aminoácidos 227-462 constituem a região rica em cisteína, consistindo em 6 repetições tipo 18 EGF em tandem unidas por pequenos peptídeos ou ansas localizados entre os domínios; os aminoácidos 463-497 constituem a região rica em Ser/Thr O-glicosilada; os aminoácidos 498-521 correspondem a uma região transmembranar hidrófoba e os aminoácidos 522-557 representam a cauda citoplasmática C-terminal. A região rica em cisteína pode ainda ser dividida em 3 domínios: os aminoácidos 226-344 constituem o domínio EGF123, consistindo nas repetições tipo EGF 1, 2 e 3 (resíduos 226— 344) ; os aminoácidos 345-349 correspondem à ansa interdomínios, localizada entre EGF3 e EGF 4, e os aminoácidos 350-462 constituem a região EGF456, consistindo nos domínios tipo EGF 4, 5 e 6. Ver por exemplo Yost, C.S. et al. (1983) Cell 34 (3) : 759-766; Wen, D.Z. et al. (1987) Biochemistry 26(14):4350-4357; e Wang, W. et al. (2000), supra.

Os termos "análogo", "fragmento", "derivado" e "variante", quando designam as proteínas de fusão da presente invenção, bem como as proteínas direccionadas contra um alvo e o(s) domínio(s) da TM, significam análogos, fragmentos, derivados e variantes das proteínas de fusão, proteínas direccionadas contra um alvo e domínio(s) da TM que retêm substancialmente a mesma função ou actividade biológica, como descrito posteriormente, isto é, a ligação a ft ou ao complexo FVlla/FT.

Um "análogo" inclui um pró-polipeptídeo que inclui em si a sequência de aminoácidos da proteína de fusão da presente invenção. A proteína de fusão activa da presente invenção pode ser clivada dos aminoácidos adicionais que completam a molécula da proteína pró-fusão mediante processos naturais, in vivo, ou por procedimentos bem 19 conhecidos na técnica, tal como clivagem enzimática ou quimica. Por exemplo, a TM nativa é expressa naturalmente como um pró-polipeptídeo de 575 aminoácidos, que é depois processado in vivo para libertar o polipeptideo maturo activo de 557 aminoácidos.

Um "fragmento" é uma porção da proteína de fusão, proteína direccionada contra um alvo ou domínio(s) da TM que retém actividade funcional substancialmente similar, como demonstrado nos ensaios in vitro divulgados no presente documento, como descrito mais abaixo.

Um "derivado" inclui todas as modificações à proteína de fusão que conservam substancialmente as funções divulgadas no presente documento e inclui uma estrutura adicional e função auxiliar, por exemplo proteínas de fusão peguiladas que possuem uma semi-vida maior, proteínas de fusão O-glicosiladas, modificadas mediante a adição de sulfato de condroitina e proteínas de fusão biotiniladas, como descrito mais abaixo. "Actividade funcional substancialmente similar" e "substancialmente a mesma função ou actividade biológica" significam que o grau de actividade biológica que se encontra entre 30% e 100% ou mais da actividade biológica demonstrada pelo polipeptideo com o qual está a ser comparada quando a actividade biológica de cada polipeptideo é determinada pelo mesmo procedimento ou ensaio. Por exemplo, uma proteína de fusão ou domínio(s) da TM que possui actividade funcional substancialmente semelhante à da proteína de fusão do Exemplo 2 (SEQ ID NO:2)é aquela que, quando testada no ensaio de activação da proteína C (cromogénico), descrito no Exemplo 5, demonstra 20 acumulação de proteína C activada. Uma proteína direccionada contra um alvo que possui actividade funcional substancialmente semelhante ao anticorpo anti-FT do Exemplo 1 (SEQ ID NO:l) é aquela que, quando testada no ensaio sFT/FVIIa ou ensaio de activação FX descrita no exemplo 5 demonstra a capacidade para se liqar ao FT ou ao complexo FVIIa/FT ou para neutraliza-los. "A similaridade" entre dois polipeptídeos é determinada pela comparação da sequência de aminoácidos e respectivos aminoácidos substitutos conservados de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. Estas substituições conservadoras incluem as descritas anteriormente no The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 por Dayhoff (1978) e por Argos (1989) EMBO J. 8:779-785. Por exemplo, aminoácidos pertencentes a um dos grupos seguintes representam alterações conservadoras: -Ala, Pro, >1 1—1 O Gin, Asn, Ser, -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Vai, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; e -Asp, Glu.

Todos os outros termos técnicos utilizados possuem o mesmo significado vulgarmente utilizado pelos peritos na técnica pertencente à presente invenção. 21

Proteína direccionadas contra um alvo: A proteína direccionada contra um alvo da presente invenção é uma proteína que tem capacidade para se ligar especificamente a uma molécula alvo pré-seleccionada específica, por exemplo o ft ou o complexo FVila/FT e depois serve para orientar a proteína de fusão para uma célula ou tecido possuidor da molécula alvo pré-seleccionada.

Numa forma de realização da presente invenção, a proteína direccionada contra um alvo é um anticorpo que pode ligar-se ao FT ou ao complexo FVlla/FT e neutraliza-los. "Anticorpo", tal como presentemente utilizado, inclui moléculas intactas de imunoglobulina ("Ig"), bem como respectivos fragmentos, tal como Fab, F(abn')2 e Fv, que são capazes de se ligar a um epítopo de FT ou ao complexo FVlla/FT. Tipicamente, são necessários pelo menos 6, 8, 10 ou 12 aminoácidos contíguos para formar um epítopo. No entanto, os epítopos que envolvem aminoácidos não contíguos podem necessitar mais, por exemplo pelo menos 15, 25 ou 50 aminoácidos.

Tipicamente, um anticorpo que se liga especificamente ao FT ou ao complexo FVlla/FT proporciona um sinal de detecção pelo menos 5, 10 ou 20 vezes maior do que o sinal de detecção proporcionado com outras proteínas quando utilizado num ensaio imunoquímico. De preferência, os anticorpos que se ligam especificamente ao FT ou ao complexo FVlla/FT não detectam outras proteínas em ensaios imunoquímicas e podem imunoprecipitar o FT ou o complexo FVIIa/FT da solução. 22 0 FT ou o complexo FVIIa/FT podem ser utilizados para imunizar um mamífero, tal como um ratinho, rato, coelho ou cobaia, macaco ou ser humano para produzir anticorpos policlonais. Se desejado, o FT ou o complexo FVIIa/FT pode ser conjugado com uma proteína transportadora, tal como albumina de soro bovino, tiroglobulina e hemocianina de Megathura crenulata. Conforme a espécie hospedeira, podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica. Estes adjuvantes incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, adjuvante de Freund, géis minerais (por exemplo hidróxido de alumínio) e substâncias tensioactivas (por exemplo lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, peptídeos, emulsões de óleos, hemocianina de Megathura crenulata e dinitrofenol) . Entre os adjuvantes utilizados em seres humanos são especialmente úteis BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Cornybacterium parvum.

Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a FT ou complexo FVIIa/FT podem ser preparados utilizando-se qualquer técnica que possibilite a produção de moléculas de anticorpos por meio de linhas de células contínuas em cultura. Estas técnicas incluem, sem constituir limitação, a técnica de hibridomas, a técnica de hibridomas de células B humanas e a técnica de hibridomas de vírus Epstein-Barr (EBV) (Kohler et al. (1985) Nature 256:495-497; Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:202 6-2030; e Cote et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120).

Para além disso, podem ser utilizadas técnicas desenvolvidas para a produção dos "anticorpos quiméricos", pode ser utilizado o splicing dos genes de anticorpos de 23 ratinho para genes de anticorpos humanos, para obter uma molécula com especificidade antigénica e actividade biológica apropriada (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454). Anticorpos monoclonais e outros podem também ser "humanizados" para evitar que um doente desenvolva uma resposta imunitária contra o anticorpo quando é utilizado terapeuticamente. Estes anticorpos podem ser suficientemente semelhantes, quanto à sequência, com anticorpos humanos para ser utilizados directamente na proteína de fusão ou pode exigir a alteração de alguns resíduos chave. As diferenças ao nível da sequência entre anticorpos de roedores e sequências humanas podem ser minimizadas substituindo-se os resíduos que diferem dos que se encontram nas sequências humanas por mutagénese dirigida de resíduos individuais ou enxertando regiões determinantes de complementaridade inteiras. Em alternativa, os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando métodos recombinantes como descrito em GB2188638B. Os anticorpos que se ligam especificamente ao FT ou ao complexo FVIIa/FT podem conter sítios de ligação ao antigénio que se encontram parcialmente ou totalmente humanizados como divulgado na patente norte-americana US 5 565 332.

Em alternativa, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas utilizando métodos conhecidos na técnica para produzir anticorpos de cadeia simples que se ligam especificamente ao ft ou ao complexo FVlla/FT. Os anticorpos com especificidade relacionada mas com composição idiotípica 24 distinta podem ser produzidos por rearranjo das cadeias (chain shuffling) a partir de bibliotecas de Ig combinatórias aleatórias (Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:11120-11123).

Os anticorpos de cadeia simples podem também ser construídos utilizando um método de amplificação de ADN, tal como o PCR, utilizando cADN de hibridomas como molde (Thirion et al. (1996) Eur. J. Câncer Prev. 5:507-511). Os anticorpos de cadeia simples podem ser monoespecíficos ou biespecíficos e podem ser bivalentes ou tetravalentes. A construção de anticorpos tetravalentes, biespecíficos de cadeia simples é explicada, por exemplo, em Coloma e Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15:159-163. A construção de anticorpos bivalentes, biespecíficos de cadeia simples é explicada em Mallendar e Voss (1994) J. Biol. Chem. 269:199-216.

Uma sequência de nucleótidos que codifica dum anticorpo de cadeia simples pode ser construída utilizando síntese de nucleótidos manual ou automatizada, e pode ser clonada numa construção de expressão utilizando métodos de ADN recombinante convencionais e introduzida numa célula para expressar a sequência codificante. Em alternativa, os anticorpos de cadeia simples podem ser produzidos directamente utilizando-se, por exemplo, tecnologia de apresentação em fagos filamentosos, ou seja phage display (Verhaar et al. (1995) Int. J. Câncer 61:497-501; e Nicholls et al. (1993) J. Immunol. Meth. 165:81-91).

Os anticorpos que se ligam especificamente ao FT ou ao complexo FVIIa/FT podem ainda ser produzidos por meio da indução da produção in vivo na população de linfócitos ou 25 por meio de rastreio de bibliotecas de Ig ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos como divulgado na literatura. (Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad . Sei. USA 86:3833-3837; Winter et al. (1991) Nature 349:293— 299) .

Noutra forma de realização da presente invenção, a proteína direccionada contra um alvo é um grupo diferente de um anticorpo que se pode ligar ao FT e neutralizá-lo. Dois exemplos dessa proteína são o factor FViia com sítio activo inibido (FVIIai) e o inibidor da via do factor tecidular (TFPI) .

Tanto FVHa como FVIIai formam um complexo com uma afinidade elevada para FT (Sorenson, B.B. e Rao, L.V. (1998) Blood Coagul. Fibrinolysis 9(Suppl 1):S67-71). FVIIai é um anticoagulante que neutraliza o FT que age competindo com o FVlla endógeno pela ligação ao FT exposto. 0 FVIIai inibe a capacidade do FVIIa proteoliticamente activo para formar um complexo FVIIa/FT competente e inibe deste modo a iniciação da coagulação. Fundindo geneticamente os domínios da TM ao FVIIai, a TM poderia ter como alvo superfícies pró-trombóticas ricas em FT. O cADN que codifica o FVII humano foi isolado e sequenciado (Hagen, H.S. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83(8):2412-2416). 0 cADN de FVII humano pode ser preparado por meio de técnicas de ADN recombinante convencionais a partir de mARN isolado de fígado humano. O FVIIai pode ser preparado mediante a mutação da serina do sítio activo mediante técnicas de ADN recombinantes convencionais ou tratamento químico de FVIIa 26 cataliticamente activo com peptidil-clorometilcetona que modifica irreversivelmente e inibe o sitio activo. 0 TFPI tem como alvo o complexo FVIIa/FT e inibe-o de modo dependente de FXa (Salemink, I. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(40):28225-28232). O TFPI liga-se em primeiro lugar ao FXa e depois o complexo TFPI-FXa liga-se ao complexo FVIa/FT, inibindo-o. Fundindo-se geneticamente os domínios da TM ao TFPI, a TM poderia ter como alvo superfícies pró-trombóticas ricas em FT. O cADN que codifica TFPI humano pode ser isolado e sequenciado (Wun, T.C. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004). O cADN de TFPI humano pode ser preparado por meio de técnicas de ADN recombinante convencionais a partir de mARN isolado de fígado humano. A proteína direccionada contra um alvo da presente invenção (isto é, anticorpos ou outras proteínas relevantes) pode ser expressa e purificada por meio de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos e proteínas podem ser purificados por afinidade, mediante passagem por uma coluna à qual está ligado o FT. Os anticorpos ou proteínas ligados podem então ser eluidos da coluna utilizando um tampão com uma elevada concentração salina.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, a proteína direccionada contra um alvo é um anticorpo scFv que se liga ao FT e que inibe a activação de FX pelo complexo FVIIa/FT e que não compete com a ligação a FVlla. A fim de produzir o anticorpo scFv que se liga ao TF, a biblioteca de anticorpo humano HuPhaBL3, que foi apresentada no fago filamentoso (técnica de phage display), 27 foi seleccionada contra FT solúvel imobilizado. Os anticorpos de fagos que se ligaram a FT foram sobre-expressos em E. coli e purificados por afinidade utilizando uma coluna e-tag. Os anticorpos purificados foram ainda caracterizados utilizando BIAcore, um ensaio do factor Vila dependente do sTF (ensaio de sTF/FVIIa), um ensaio de activação do FX e o ensaio do PT (tempo da protrombina). A sequência do anticorpo scFv que se liga ao TF, designado scFv(TF)3el0, encontra-se apresentada no Exemplo 1 e corresponde à SEQ ID N0:1. O isolamento, produção e caracterização do anticorpo scFV que se liga ao TF encontram-se descritos mais pormenorizadamente em seguida.

Trombomodulina: A porção do(s) domínio(s) da TM presentes na proteína de fusão age como um co-factor para a activação da proteína C catalisada pela trombina; a proteína C activada degrada por sua vez os factores Va e vma prevenindo assim a formação de mais trombos. Os domínios da TM incluem, por exemplo, o domínio da região hidrófoba N-terminal, o domínio EGF123, a ansa interdomínios, localizada entre EGF3 e EGF4, o domínio EGF456 e o domínio da região rica em Ser/Thr O-glicosilada. 0 domínio EGF456, em particular, medeia a ligação da trombina e activação da proteína C (Kurosawa, S. et al. (1988), supra; e Zushi, M. et al. (1989) supra). Em formas de realização preferidas da presente invenção, o(s) domínio(s) da TM presentes na proteína de fusão compreende (m) apenas o domínio EGF456 isoladamente ou em combinação com um ou mais outros domínios da TM. Ainda noutras formas de realização 28 preferidas da presente invenção, o dominio EGF456 contém mutações pontuais que tornam a proteína mais resistente a danos por oxidação e por proteases e/ou aumenta a sua eficiência catalítica. A sequência de ADN completa que codifica a TM humana facilita a preparação de genes e é utilizada como ponto de partida para a construção de sequências de ADN que codificam peptídeos de TM e proteínas de fusão contendo TM e fragmentos/peptídeos de TM. 0 gene completo para TM pode ser preparado por vários métodos. As bibliotecas genómicas humanas encontram-se disponíveis comercialmente. Sondas oligonucleotídicas, específicas para estes genes, podem ser sintetizadas utilizando-se a sequência genética publicada. São conhecidos métodos de rastreio de bibliotecas genómicas com sondas oligonucleotídicas. A publicação da sequência génica para TM demonstra que não existem intrões na região codificante. Deste modo, um clone genómico proporciona o material de partida necessário para construir um plasmídeo de expressão para a TM utilizando os métodos conhecidos.

Um fragmento de ADN que codifica a TM pode ser obtido tirando partido dos sítios reconhecidos pelas endonucleases de restrição que foram identificados em regiões que flanqueiam ou são internas ao gene. (Jackman, R.W. et al. (1987), supra). Em alternativa, os genes completos podem ainda ser obtidos a partir de um banco de cADN. Por exemplo, o ARN mensageiro preparado a partir de células endoteliais proporciona material de partida adequado para a preparação de cADN. Métodos de produção de bancos de cADN são bem conhecidos (ver por exemplo Sambrook, j. F. et al., 29

Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), que é incorporado no presente documento por referência).

Proteína de fusão: A proteína de fusão anticoagulante da presente invenção é constituída por uma proteína direccionada contra um alvo ou um análogo, fragmento, derivado ou variante desta que se liga ao FT ou ao FVlla/FT e que está ligada de forma funcional ao domínio EGF456 da TM ou a um seu análogo, fragmento, derivado ou variante, sendo que a proteína de fusão anticoagulante se liga ao factor tecidular ("TF") ou ao complexo factor VIIa/FT ("FVlla/FT") . A proteína de fusão pode compreender a proteína direccionada contra um alvo ligada aos domínios da TM em qualquer combinação.

Numa forma de realização preferida particular, a proteína de fusão compreende um anticorpo que se liga ao FT ligado de modo funcional ao domínio EGF456 da TM e à ansa interdomínios, localizada entre EGF3 e EGF4 ("TMÍ456"), ou seus análogos, fragmentos, derivados ou variantes. A proteína de fusão da presente invenção inclui, mas sem que isso constitua uma limitação, construções em que a porção C-terminal de um anticorpo de cadeia simples é fundida à porção N-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais domínios da TM, a porção C-terminal de um anticorpo de igG é fundida à porção N-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais domínios da TM, a porção C-terminal de um anticorpo Fab é fundida à porção N-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais domínios da 30 TM, a porção N-terminal de um anticorpo de cadeia simples é fundida à porção C-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM, a porção N-terminal de um anticorpo IgG é fundida à porção C-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM, a porção N-terminal de um anticorpo Fab é fundida à porção C-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM, mais do que um anticorpo de cadeia simples é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um análogo, fragmento ou variante de um ou mais dominios da TM, mais do que um anticorpo IgG é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM, mais do que um anticorpo Fab é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um análogo, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM, mais do que um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um anticorpo de cadeia simples, mais do que um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais dominios da TM é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um anticorpo de IgG, mais do que um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais domínios da TM é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um anticorpo Fab, um ou mais do que um análogo, fragmento, derivado ou variante de um ou mais domínios da TM é fundido às porções N-terminal e C-terminal de um anticorpo de cadeia simples dimérico.

As proteínas de fusão da presente invenção incluem as proteínas de fusão dos Exemplos 2 (SEQ id NO:2) e 3 (SEQ id NO:3), bem como as proteínas de fusão com variações 31 insubstanciais ao nível da sequência em comparação com aquelas proteínas. Uma "variação insubstancial" inclui qualquer variante de sequência, substituição ou deleção que mantém substancialmente pelo menos uma função biológica dos polipeptídeos da invenção, de preferência actividade como co-factor para activação da proteína C mediada pela trombina. Estes equivalentes funcionais podem incluir preferencialmente proteínas de fusão que possuem pelo menos uma identidade de 90% com as proteínas de fusão das SEQ ID NOs:2 ou 3, e mais preferencialmente pelo menos uma identidade de 95% com as proteínas de fusão das SEQ ID NOs:2 ou 3 e ainda mais preferencialmente uma identidade de 97% com as proteínas de fusão das SEQ ID NOs:2 ou 3 e ainda incluem porções destas proteínas de fusão que possuem substancialmente a mesma actividade biológica. No entanto, qualquer proteína de fusão com uma variação insubstancial ao nível da sequência de aminoácidos relativamente às proteínas de fusão das SEQ ID NOs:2 ou 3 que demonstre equivalência funcional como descrito mais adiante é incluída na descrição da presente invenção.

Noutra forma de realização, a proteína de fusão compreende um anticorpo que se liga ao FT ligado de modo funcional ao domínio EGF3 da TM que é necessário para activar o activador de fibrinólise activável por trombina (TAFI) .

Análogos, fragmentos, derivados e variantes:

Um análogo, fragmento, derivado ou variante das proteínas de fusão, bem como de proteínas direccionadas contra um alvo ou domínio(s) da TM da presente invenção 32 pode ser: (i) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência um resíduo aminoácido conservado) e este resíduo de aminoácido substituído pode ser ou não codificado pelo código genético ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclui um grupo substituinte ou (iii) um em que a proteína de fusão matura é fundida com outro composto, tal como um composto para aumentar a semi-vida da proteína de fusão (por exemplo, polietilenoglicol) ou (iv) um em que são fundidos aminoácidos adicionais á proteína de fusão matura, tal como uma sequência líder ou de secreção ou uma sequência que é utilizada para a purificação da proteína de fusão matura ou (v) uma em que a sequência de polipeptídeos é fundida com um polipeptídeo maior, por exemplo albumina humana, um anticorpo ou Fc, para aumentar a duração do efeito. Subentende-se que estes análogos, fragmentos, derivados e variantes estão dentro do âmbito das competências dos peritos na técnica a partir dos ensinamentos incluídos no presente documento.

De preferência, os derivados da presente invenção irão conter substituições de aminoácidos conservadoras (definidas mais abaixo) num ou mais resíduos de aminoácidos preferencialmente não-essenciais, previstos. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem de uma proteína sem alteração da actividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a actividade biológica. Uma "substituição de aminoácidos conservadora" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia 33 lateral similar. Foram definidas na técnica famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Não deverão ser feitas substituições não conservadoras para resíduos de aminoácidos conservados ou para resíduos de aminoácidos situados no interior de um domínio proteico conservado, excepto se as substituições não conservadoras forem feitas para tornar a proteína de fusão resultante mais resistente aos danos por oxidação e por proteases e/ou para aumentar a sua eficiência catalítica. Os fragmentos ou porções biologicamente activas incluem fragmentos polipeptídicos adequados para utilização como medicamento, como reagente de pesquisa. Os fragmentos incluem peptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente similares a uma proteína de fusão da presente invenção ou derivadas das sequências de aminoácido de uma proteína de fusão da presente invenção e exibindo pelo menos uma actividade desse polipeptídeo, mas que inclui menos aminoácidos do que os polipeptídeos completos divulgados no presente documento. Tipicamente, as porções biologicamente activas compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma 34 actividade do polipeptídeo. Uma porção biologicamente activa de um polipeptídeo pode ser um peptídeo que tem, por exemplo, 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Estas porções biologicamente activas podem ser preparadas sinteticamente ou mediante técnicas recombinantes e podem ser avaliadas para a presença de uma ou mais das actividades funcionais de um polipeptídeo da presente invenção por meio divulgados no presente documento e/ou bem conhecidos na técnica.

Além disso, os derivados preferidos da presente invenção incluem proteínas de fusão maturas que foram fundidas a outro composto, tal como um composto para aumentar a semi-vida do polipeptídeo e/ou para reduzir a imunogenicidade potencial do polipeptídeo (por exemplo, polietilenoglicol, "PEG"). 0 PEG pode ser utilizado para conferir à proteína de fusão hidrossolubilidade, tamanho, taxa reduzida de depuração renal e imunogenicidade reduzida. Ver patente norte-americana US 6 214 966. No caso de peguilação, a fusão da proteína de fusão com PEG pode ser conseguida por meios conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, a peguilação pode ser conseguida introduzindo-se primeiro uma mutação de cisteína na proteína de fusão, seguido de derivatização sítio-específica com PEG-maleimida. A cisteína pode ser adicionada ao C-terminal dos peptídeos. Ver, por exemplo Tsutsumi et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97(15):8548-8553. Outra modificação que pode ser feita na proteína de fusão envolve a biotinilação. Nalguns casos poderá ser útil a biotinilação da proteína de fusão de forma a que esta reaja rapidamente com a estreptavidina. Os métodos de biotinilação de 35 proteínas são bem conhecidos na técnica. Além disso, pode ligar-se sulfato de condroitina à proteína de fusão.

As variantes das proteínas de fusão, proteínas direccionadas contra um alvo e domínio(s) da TM da invenção incluem polipeptídeos com uma sequência de aminoácidos suficientemente semelhante à sequência de aminoácidos das proteínas de fusão originais, proteínas direccionadas contra um alvo e domínios da TM. 0 termo "suficientemente similar" significa uma primeira sequência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos idênticos ou equivalentes relativamente a uma segunda sequência de aminoácidos, de forma a que as primeira e segunda sequências de aminoácidos possuam um domínio estrutural comum e/ou actividade funcional comum. Por exemplo, as sequências de aminoácidos que contêm um domínio estrutural comum que é idêntico em pelo menos cerca de 45%, de preferência cerca de 75% até 98% são definidas no presente documento como suficientemente similares. De preferência, as variantes serão suficientemente similares à sequência de aminoácidos das proteínas de fusão preferidas desta invenção. As variantes incluem variantes de proteínas de fusão codificadas por um polinucleótido que híbrida com um polinucleótido desta invenção ou uma sua sequência complementar em condições restringentes. Estas variantes retêm geralmente a actividade funcional das proteínas de fusão da presente invenção. Pode utilizar-se bibliotecas de fragmentos dos polinucleótidos para gerar uma população variada de fragmentos para rastreio e selecção posterior. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos pode ser gerada por meio de tratamento de um fragmento de cadeia dupla obtido por PCR de um polinucleótido com uma nuclease em 36 condições em que ocorre o corte (nicking) apenas uma vez por molécula, desnaturando o ADN de cadeia dupla, renaturando o ADN para formar ADN de cadeia dupla que pode incluir pares sense/antisense de diferentes produtos cortados (nicked) removendo porções de cadeia simples de cadeias duplas que foram novamente formadas por tratamento com nuclease SI e ligação da biblioteca de fragmentos resultante num vector de expressão. Com este método, é possível derivar uma biblioteca de expressão que codifica fragmentos N-terminais e internos de vários tamanhos das proteínas de fusão da presente invenção.

As variantes incluem proteínas de fusão, bem como proteínas direccionadas contra um alvo e domínio(s) da TM que diferem quanto à sequência de aminoácidos devido a mutagénese. As variantes que possuem uma actividade de co-factor da activação da proteína C mediada pela trombina podem ser identificadas mediante o rastreio de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, por truncagem ou por mutações pontuais, das proteínas de fusão ou de domínio(s) da TM da presente invenção, utilizando o ensaio de activação da proteína C descrito no Exemplo 5. As variantes que têm actividade de ligação ao FT ou ao complexo FVIIa/FT podem ser identificadas por meio do rastreio de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, por truncagem ou por mutações pontuais, das proteínas de fusão ou proteínas direccionadas contra um alvo da presente invenção utilizando o ensaio do complexo FVIIa/FT ou os ensaios de activação do FX do exemplo 5 descritos no Exemplo 5. Além disso, análogos bioequivalentes das proteínas de fusão podem também ser preparados introduzindo várias substituições em resíduos ou 37 sequências na porção da proteína de fusão que contém o(s) domínio (s) da TM, o que pode tornar a proteína de fusão mais resistente a danos por oxidação ou à protease, ver, por exemplo patente norte-americana US 5 827 824 ou aumentar a eficiência catalítica da proteína de fusão, ver por exemplo Adler, M. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(40):23366-23372 e pedido de patente PCT WOOl/98352, publicado a 27 de Dezembro de 2001.

Numa forma de realização, é gerada uma biblioteca variada de variantes por mutagénese combinatória ao nível dos ácidos nucleicos e é codificada por uma biblioteca genética variada. Pode ser produzida uma biblioteca variada de variantes, por exemplo, ligando enzimaticamente uma mistura de oligonucleótidos sintéticos em sequências genéticas de forma a ser possível expressar um conjunto degenerado de variantes potenciais de sequências de aminoácidos como polipeptídeos individuais ou, em alternativa, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para apresentação em fagos, phage display), que contêm o conjunto de sequências. Existe uma variedade de métodos que podem ser utilizados para produzir bibliotecas de possíveis variantes a partir de sequências de oligonucleótidos degeneradas. A síntese química de uma sequência génica degenerada pode ser executada num sintetizador de ADN automático e o gene sintético pode então ser ligado num vector de expressão apropriado. A utilização de um conjunto degenerado de genes permite a obtenção, numa mistura, de todas as sequências codificantes do conjunto desejado de sequências variantes potenciais. Os métodos para a síntese de oligonucleótidos degenerados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo Narang (1983) 38

Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984b) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). São conhecidas várias técnicas de rastreio de produtos génicos de bibliotecas combinatórias obtidas mediante mutações pontuais ou truncagem e para rastreio de bibliotecas de cADN para produtos génicos que possuem uma propriedade seleccionada. Estas técnicas são adaptáveis para um rastreio rápido das bibliotecas génicas geradas por mutagénese combinatória de proteínas de fusão, bem como proteínas direccionadas contra um alvo e domínio(s) da TM, para actividade de co-factor da activação da proteína C mediada pela trombina ou actividade de ligação ao ft ou ao complexo FVIIa/FT. As técnicas mais amplamente usadas que são propícias a análise em larga escala usadas para o rastreio de grandes bibliotecas génicas, incluem tipicamente a clonagem da biblioteca génica em vectores de expressão replicáveis, a transformação de células apropriadas com a biblioteca resultante de vectores e a expressão dos genes combinatórios em condições em que a detecção de uma actividade desejada facilita o isolamento do vector que contém o gene cujo produto foi detectado. A mutagénese recursiva do conjunto (REM, do inglês recursive ensemble mtagenesis), uma técnica que intensifica a frequência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser empregue em combinação com ensaios de rastreio para identificar as variantes desejadas. 39

Produção de proteínas de fusão: A proteína de fusão da presente invenção é produzida por meio de fusão da proteína direccionada contra um alvo ou então ligando-a ao(s) domínio(s) da TM ou seus análogos, fragmentos, derivados ou variantes mediante qualquer método conhecido dos peritos na técnica. Dois componentes podem ser ligados quimicamente entre si mediante qualquer uma de uma variedade de procedimentos químicos bem conhecidos. Por exemplo, a ligação pode ser realizada através de reticulantes heterobifuncionais, por exemplo SPDP, carbodiimida, glutaraldeído ou afins.

Numa forma de realização preferida, a proteína direccionada contra um alvo da presente invenção pode ser fundida ao(s) domínio(s) da TM por meios recombinantes, tal como por meio da utilização de técnicas de ADN recombinante para produzir um ácido nucleico que codifica tanto a proteína direccionada contra um alvo como o polipeptídeo que contém o(s) domínio(s) da TM e expressar a sequência de ADN numa célula hospedeira, tal como E. coli ou uma célula de mamífero. 0 ADN que codifica a proteína de fusão pode ser clonado em cADN ou em forma genómica por qualquer procedimento de clonagem conhecido dos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, J.F. et al. (1989) supra.

No caso em que a proteína direccionada contra um alvo é um anticorpo, após a identificação da sequência de ADN que codifica uma região Fv que, quando expressa, demonstra actividade de ligação específica, as proteínas de fusão compreendendo essa região Fv podem ser preparadas por meio de métodos conhecidos dos peritos na técnica. Assim, por exemplo Chaudhary, V. K. et al. (1989) Nature 339(6223): 40 394-397; Batra, J.K. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (25):15198-15202; Batra, J.K. et al. (1989) Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 86(21) :8545-8549; Chaudhary, V.K. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87(3): 1066-1070 descrevem a preparação de várias proteínas de fusão de anticorpos de cadeia simples. A região Fv pode ser fundida directamente com o(s) domínio (s) da TM ou pode ser unida por uma sequência de ligação, um linker. A sequência de ligação (linker) pode estar presente apenas para proporcionar espaço entre a fraeção dirigida ao alvo e o(s) domínio(s) da TM ou para facilitar a mobilidade entre estas regiões para permitir que atinjam a conformação óptima. A sequência de ADN que compreende o conector pode ainda proporcionar sequências (tal como um iniciador ou sítios reconhecidos por enzimas de restrição) para facilitar a clonagem ou pode conservar a grelha de leitura entre a sequência que codifica a fraeção dirigida ao alvo e a sequência que codifica o(s) domínio(s) da TM. A concepção desses peptídeos conectores será bem conhecida dos peritos na técnica.

Na presente invenção, as sequências de ligação (linker) podem ser utilizadas para ligar a proteína direccionada contra um alvo ao(s) domínio (s) da TM. Numa forma de realização preferida da presente invenção, podem ser utilizadas duas sequências de ligação na construção de uma proteína de fusão constituída por um anticorpo de cadeia simples e o domínio EGF456 e a ansa interdomínios localizada entre EGF3 e EGF4 (TMÍ456). A primeira sequência liga os domínios pesado e leve do anticorpo de cadeia simples. A primeira sequência de ligação tem 5 aminoácidos de comprimento. Será evidente que podem ser empregues 41 outras sequências de ligação curtas com um comprimento entre 0 e 10 aminoácidos. A segunda sequência de ligação na presente invenção possui 15 aminoácidos e liga o anticorpo ao(s) domínio (s) da TM. Será evidente para os peritos na técnica que podem ser empreques muitas sequências de ligação diferentes e obter-se ainda uma proteína de fusão que retém a actividade anticoagulante e a activação da proteína C. As modificações da sequência de ligação existente terão por objectivo a maximização do aumento da activação da proteína C em superfícies fosfolipidicas contendo FT.

Numa abordagem preferida, o anticorpo de cadeia simples foi preparado utilizando uma biblioteca apresentada em fagos (phage display) . Numa primeira fase da construção de uma biblioteca apresentada em fagos, os genes variáveis (VH, de IgM, Vk e VL) foram clonados por PCR de mARN recolhido de medula óssea humana, nódulos linfáticos e baço, utilizando um conjunto de iniciadores específicos da família. As bibliotecas resultantes pCiTE-vH (3,8 χ109 membros), pZ604-VK (l,6xl07) e pZ604-VL (3,2xl07) representam uma diversidade permanente e elevada de genes V. Os genes VH foram amplificados a partir da biblioteca pClTE-VH. Os genes Vk e VL foram amplificados por PCR a partir da biblioteca pZ604-Vx e pZ604-VL com JH reverso e sequência de ligação na extremidade 5'. VH, Vk e VL purificados em gel, contendo os produtos do PCR foram então sujeitos conjuntamente a splicing para perfazer o repertório do gene scFv. O repertório do gene scFV foi clonado num vector fagemídeo pZ603 e o produto da ligação foi sujeito a electroporação para incorporação em células 42 TG1 de E. coli para gerar a biblioteca apresentada em fagos scFV, HuPhabL3 com 5,2xl09 transformantes individuais (Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3):581-597; Sheets, M.D. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(11):6157-6162) .

Numa forma de realização preferida da presente invenção, foi preparado um anticorpo de cadeia simples (scFv(TF)3el0) que possui um sitio de ligação único VH/VL ao FT. A sequência de aminoácidos de scFv(TF)3elO (SEQ ID N0:1) encontra-se descrita no Exemplo 1.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, um fragmento obtido por PCR contendo a sequência TMÍ456 (com mutações M388L e H381 G), flanqueado por sitios reconhecidos pela Notl, foi subclonado no sítio reconhecido pela Notl de pZ612/3elO (um vector de expressão bacteriano para scFv(TF)3elO baseado em pCANTAB5 da Pharmacia). Neste caso, as mutações pontuais nas porções de TM das proteínas de fusão da invenção são especificadas: a designação com uma letra do resíduo de aminoácido da TM nativa, seguido do número da posição do aminoácido na TM matura e a designação de letra única da mutação do aminoácido. Por exemplo, M388L indica que a metionina na posição de aminoácido 388 da TM matura foi alterada para leucina. 0 sitio reconhecido pela Notl encontra-se entre a sequência do anticorpo e a sequência e-tag. Foi então gerada uma construção bacteriana (pKMlOl) para uma proteína de fusão constituída pelo scFv(TF)3el0, uma sequência de ligação de 15 aminoácidos, TMÍ456, seguido da sequência e-tag. Para gerar um vector de expressão mamífero gerou-se primeiro um fragmento por PCR a 43 partir do molde pKMlOl. Este fragmento foi concebido para ligação aos sítios reconhecidos por Stul/Mscl do vector de expressão pTHR525. Gerou-se assim um vector (pKMH3) que possuía a sequência de sinal da Solulin, seguida da sequência para a proteína de fusão matura, seguida da sequência e-tag. 0 vector contém o gene de resistência à ampicilina e os marcadores de selecção de hidromicina e DHFR. A expressão é controlada pelo promotor MPSV LTR. Foi executada neste vector a mutagénese dirigida para incluir as mutações R456G e H457Q que conferem resistência à protease à porção da TM. 0 vector resultante é designado pKMH5. 0 vector pMKH5 possui uma Sequência de ligação de 15 aminoácidos a separar os domínios VH e VL e outra sequência de ligação de 15 aminoácidos a separar o domínio VL do TMÍ456. A sequência de ligação que separa VH e VL foi reduzida para 5 aminoácidos para conduzir à formação de um dímero de maior avidez, designado pHM115.5. A proteína de fusão codificada por pHMH5.5, scFv (TF) 3elO-Tmi456 (SEQ ID NO: 2) encontra-se descrita no Exemplo 2. Um vector adicional, pKMl25, foi gerado utilizando-se tecnologia de ADN recombinante convencional, por meio da deleção de 3 aminoácidos (GAP) entre a sequência de ligação de 5 aminoácidos, separando os domínios vH e VL e eliminando a sequência e-tag no terminal C da proteína de fusão. A proteína de fusão resultante, scFv (TF)3elO-Tmi456A (SEQ ID NO:3) encontra-se descrita no Exemplo 3.

Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão:

Existem vários modos de expressar as proteínas de fusão recombinantes in vitro, incluindo E. coli, baculovirus, 44 levedura, células de mamífero e outros sistemas de expressão. Os métodos de expressão de genes clonados em bactérias são bem conhecidos. Para obter um nível elevado de expressão de um gene clonado num sistema procariota é essencial construir vectores de expressão que contenham, no mínimo, um forte promotor para controlar o fim da transcrição do mARN. Constituem exemplos de regiões reguladoras adequadas para este fim a região promotora e operadora do gene da beta-glucosidase de E. coli, a via biossintética do triptofano de E. coli ou o promotor do fago lambda a montante da sequência codificante. A inclusão de marcadores de selecção em vectores de ADN transformados em E. coli é útil. Exemplos destes marcadores incluem genes que especificam a resistência à ampicilina, tetraciclina ou cloranfenicol.

Existem inúmeros sistemas celulares eucariotas superiores, úteis para expressão das proteínas de fusão e seus análogos, que podem ser seleccionados. Constituem exemplos ilustrativos de linhas celulares de mamífero, mas sem que isso constitua uma limitação, células RPMI 7932, VERO e HeLa, linha celular de ovário de Hamster chinês (CHO), linhas celulares W138, BHK, COS-7, C127 ou MDCK. Uma linha celular de mamífero preferida é a CHL-1. Quando se utiliza a linha celular CHL-1, inclui-se higromicina como marcador de selecção em sistemas eucariotas. As células CHL-1 são derivadas de células de melanoma RPMI 7032, uma linha celular humana facilmente disponível. A linha celular CHL-1 encontra-se depositada na ATCC em conformidade com as condições do Tratado de Budapeste, tendo sido atribuída a referência #CRL 9446, depositada a 18 de Junho de 1987. As células adequadas para aplicação na presente invenção 45 encontram-se comercialmente disponíveis junto da ATCC. Linhas celulares exemplificativas incluem Spodoptera frugiperda e Bombyx mori. 0 sistema procariota, E. coli, é incapaz de modificações pós-traducionais, como glicosilação. Além disso, as proteínas com padrões dissulfureto complexos são frequentemente enroladas de modo incorrecto quando expressas em E. coli. No caso da proteína de fusão descrita no presente documento, verificou-se uma marcada redução na actividade de cofactor da trombomodulina quando expressa em E. coli, embora ambas as actividades permanecessem presentes. Com o sistema procariota, a proteína expressa tanto se encontra presente no citoplasma da célula numa forma insolúvel chamada corpos de inclusão, encontrados na fracção solúvel após a lise da célula, como é enviada para o periplasma mediante a adição das sequências sinal de secreção apropriadas. Se a proteína expressa se encontra em corpos de inclusão insolúveis, é normalmente necessário a solubilização e posterior re-enrolamento dos corpos de inclusão.

Muitos vectores de expressão procariotas são conhecidos dos peritos na técnica, como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), pKK233-2 (Clontech, Paio Alto, CA, EUA) e pGEMl (Promega Biotech, Madison, wi, EUA), que se encontram comercialmente disponíveis.

Os promotores vulgarmente utilizados em sistemas de expressão recombinantes microbianos incluem o sistema promotor da beta-lactamase (penicilinase) e da lactose (Chang, A.C. et al. (1978) Nature 275(5681):617-624; Goeddel, D.V. et al. (1979) Nature 281(5732):544-548), the 46 tryptophan (trp) promoter system (Goeddel, D.V. et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8(18):4057-4074) and tac promoter (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Outro sistema de expressão bacteriano útil utiliza o promotor pL do fago lambda e o repressor termoinduzivel clts857 (Bernard, H.U. et al. (1979) Gene 5(1):59—76; Love, C.A. et al. (1996) Gene 176(1-2):49-53). Podem também ser expressas proteínas de fusão recombinantes em hospedeiros de levedura, como Saccharomyces cerevisiae. Isso confere normalmente a capacidade de efectuar várias modificações pós-traducionais. A proteína de fusão expressa pode ser secretada no sobrenadante da cultura onde não residem muitas outras proteínas, tornando a purificação mais fácil. Os vectores de levedura para expressão das proteínas de fusão na presente invenção contêm determinadas características obrigatórias. Os elementos do vector são geralmente derivados da levedura e de bactérias para permitir a propagação do plasmídeo em ambos. Os elementos bacterianos incluem uma origem de replicação e um marcador de selecção. Os elementos bacterianos incluem uma sequência de origem de replicação (ARS), um marcador de selecção, um promotor e um terminador da transcrição.

Os promotores adequados para expressão em vectores de levedura incluem os promotores do gene TRPl, do gene ADHl ou ADHII, do gene da fosfatase ácida (PH03 ou PH05), do gene isocitocromo ou os promotores envolvidos na via glicolítica tal como o promotor da enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GADPH), 3-fosfoglicerato quinase (PGK), hexoquinase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase e fosfoglucose isomerase (Hitzeman, R.A. et al. 47 (1980) J. Biol. Chem. 255 (24):12073-12080; Hess, B. et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149-167; e Holland, M.J. e Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17(23):4900-4907).

Os vectores de levedura comercialmente disponíveis incluem pYES2, pPlC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255) e YpGX265GAL4 (ATCC # 67233) . As linhas celulares de mamífero incluindo, mas sem que isso constitua uma limitação, células COS-7, L, C127, 3T3, de ovário de Hamster Chinês (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO e HEK293 podem ser usadas para expressar as proteínas de fusão recombinantes na presente invenção. As proteínas recombinantes produzidas em células de mamífero são normalmente solúveis e glicosiladas e possuem N-terminais autênticos. Os vectores de expressão de mamífero podem conter elementos não-transcritos, tal como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador e sequências não traduzidas 5' ou 3', tal como sítios de ligação ao ribossoma, um sítio de poliadenilação, sítio aceitador e dador de splicing e sequências de terminação da transcrição. Os promotores para utilização em vectores de expressão mamíferos são normalmente, por exemplo, promotores virais, tal como polioma, Adenovírus, HTLV, vírus Simian 40 (SV 40) e citomegalovírus (CMV).

Conforme o sistema de expressão e o hospedeiro seleccionado, uma proteína de fusão recombinante pode ser obtida utilizando-se várias combinações de cromatografia convencional utilizada para purificação de proteínas. Estas incluem: cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de fase reversa, cromatografia de permuta catiónica, cromatografia de permuta aniónica, cromatografia de 48 interacção hidrófoba, cromatografia de filtração em gel e hplc . Se o sistema de expressão secretar a proteína de fusão para o meio de cultura, a proteína pode ser purificada directamente a partir do meio. Se a proteína de fusão não for secretada, é isolada a partir de lisados celulares. A disrupção celular pode ser efectuada por qualquer método convencional, incluindo ciclos congelação-descongelação, sonicação, disrupção mecânica ou utilização de outros agentes que provocam a lise celular.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, as construções para expressão em mamíferos foram transfectadas para células CHO DXBll. Foram seleccionadas populações estáveis utilizando-se 400 pg/ml de higromicina B em meio de HAMS/F12. Os níveis de expressão eram aproximadamente 500 pg/L. Para aumentar os níveis de expressão, foi seleccionada uma população utilizando-se 100 nM de metotrexato em meio alfa MEM. O nível de expressão aproximado desta população era 5 mg/L. A construção de fusão contém a sequência e-tag no terminal C da proteína. Foram adquiridas colunas de afinidade anti-e-tag junto da American/Pharmacia Biotech. O meio de cultura celular foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm e carregado numa coluna e-tag de 5 ml a 2 ml/min. A coluna foi lavada com 0,2 M de tampão fosfato, 0,05% de NaN3, pH 7,0 e depois foi recolhida em tubos de ensaio contendo um volume de 0,1 de tampão Tris 1M, pH 8,2 para neutralizar o tampão de eluição. Em alternativa, o meio de cultura filtrado foi carregado numa coluna de proteína A. Neste caso, a coluna foi lavada com 50 mM de ácido cítrico, 300 mM de NaCl, pH 6,5 e eluída com o mesmo tampão a pH 3,0. Em ambos os casos, as amostras purificadas 49 foram posteriormente carregadas numa coluna Sephadex 200 para separar os monómeros dos dímeros da proteína de fusão.

Composições farmacêuticas: A invenção apresenta também composições farmacêuticas que podem ser administradas a um doente para se obter um efeito terapêutico. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas para administração combinando-se a proteína de fusão que possui o grau desejado de pureza e a quantidade farmaceuticamente eficaz com veículos fisiologicamente aceitáveis.

As proteínas de fusão da presente invenção podem ser utilizadas em composições farmacêuticas para administração intravenosa ou administração subcutânea ou administração intratecal. Deste modo, as proteínas de fusão anteriormente descritas serão preferencialmente combinadas com um veículo farmacêutico estéril aceitável, tal como dextrose a 5%, solução de lactato de Ringer, soro fisiológico normal, água estéril ou qualquer outra solução tampão fisiológica preparada comercialmente, concebida para infusão intravenosa. Subentende-se que a selecção da solução de veículo e a dosagem e administração da composição irá variar com o sujeito e cenário clínico específico e será governada por procedimentos clínicos padronizados.

De acordo com os métodos da presente invenção, estas composições farmacêuticas podem ser administradas em quantidades eficazes para inibir as consequências patológicas associadas à produção excessiva de trombina no doente. 50 A administração da proteína de fusão pode ser efectuada mediante uma injecção intravenosa de bólus, perfusão intravenosa constante ou combinação de ambas as vias. Em alternativa, ou para além disso, a proteína de fusão misturada com excipientes apropriados pode entrar na circulação a partir de uma zona intramuscular. O tratamento sistémico com proteína de fusão pode ser monitorizado, determinando-se o tempo de tromboplastina parcial (TP) activada em amostras de sangue em série recolhidas do doente. O tempo de coagulação observado neste ensaio é prolongado quando é atingido um nível suficiente da proteína de fusão na circulação.

As proteínas de fusão recombinantes e composições farmacêuticas da presente invenção são úteis para administração parentérica, tópica, intravenosa, oral ou local. As composições farmacêuticas podem ser administradas numa variedade de formas farmacêuticas unitárias dependendo do método de administração. Por exemplo, as formas farmacêuticas unitárias podem ser administradas sob a várias formas que incluem, mas sem que isso constitua um limitação, comprimidos, cápsulas, pós, soluções e emulsões.

As proteínas de fusão recombinantes e composições farmacêuticas da presente invenção são particularmente úteis para administração intravenosa. As composições para administração irão compreender vulgarmente uma solução do anticorpo de cadeia simples ou uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo de cadeia simples dissolvido num veículo farmaceuticamente aceitável, de preferência um veículo aquoso. Pode utilizar-se uma variedade de veículos aquosos, por exemplo soro fisiológico tamponado. Estas soluções são estéreis e normalmente livres de matéria 51 indesejada. As composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais bem conhecidas.

Uma composição farmacêutica típica para administração intravenosa pode ser facilmente determinada por alguém com formação normal na técnica. As quantidades administradas são nitidamente específicas para a proteína e dependem da sua potência e perfil farmacocinético. Os métodos actuais de preparação de composições de administração parentérica são conhecidos ou evidentes para os peritos na técnica e encontram-se descritos mais pormenorizadamente em publicações como Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980).

As composições que contêm as presentes proteínas de fusão ou uma mistura destas proteínas (isto é, em combinação com outras proteínas) podem ser administradas como tratamentos terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um doente que sofra de perturbação ou doença hemorrágica numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente a hemorragia. Uma quantidade adequada para se obter tais efeitos é definida como "quantidade terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para esta utilização irão depender da gravidade da doença e do estado geral de saúde do doente.

Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser administradas dependendo da dosagem e frequência consoante requerido e tolerado pelo doente. Em qualquer caso, a composição deverá facultar uma quantidade suficiente das proteínas da presente invenção para tratar o doente de forma eficaz. 52

As proteínas de fusão da invenção ou respectivas composições farmaceuticamente aceitáveis são administradas numa quantidade terapeuticamente eficaz que pode variar de acordo com uma variedade de factores, incluindo a actividade da proteína de fusão específica utilizada, a estabilidade metabólica e a extensão da acção da proteína de fusão, a idade, peso corporal, estado de saúde geral, sexo e dieta do doente, modo e tempo de administração, taxa da excreção, combinação com outros fármacos, gravidade dos estados patológicos específicos e o hospedeiro a ser submetido à terapêutica. Em geral, uma dose terapeuticamente eficaz está compreendida entre cerca de 0,14 mg e cerca de 14,3 mg/kg de peso corporal por dia de uma proteína de fusão da invenção ou uma composição farmaceuticamente aceitável desta; de preferência entre cerca de 0,7 mg e cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia e mais preferivelmente entre cerca de 1,4 mg e cerca de 7,2 mg/kg de peso corporal por dia. Por exemplo, para administração a um indivíduo de 7 0 kg, a dosagem estaria compreendida entre cerca de 10 mg e cerca de 1,0 grama por dia de uma proteína de fusão da invenção ou uma composição farmaceuticamente aceitável desta; de preferência entre cerca de 50 mg e cerca de 7 00 mg por dia e mais preferivelmente entre cerca de 100 mg e cerca de 500 mg por dia.

Terapêutica Genética:

Uma proteína de fusão da invenção pode ainda ser utilizada de acordo com a presente invenção mediante expressão dessa proteína de fusão in vivo, o que é 53 frequentemente designado por "terapêutica genética". Deste modo, por exemplo, as células podem ser manipuladas com um polinucleótico (ADN ou ARN) que codifica a proteina de fusão ex vivo, sendo as células manipuladas aplicadas depois num doente a tratar com a proteina de fusão. Estes métodos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser manipuladas mediante procedimentos conhecidos na técnica para uso de uma partícula retroviral contendo o ARN que codifica a proteina de fusão da presente invenção. A administração local das proteínas de fusão anticoagulantes da presente invenção, recorrendo à terapêutica genética pode aplicar o agente terapêutico na área alvo, as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos. São contempladas metodologias de terapêutica genética tanto in vitro como in vivo. São conhecidos vários métodos para a transferência de genes potencialmente terapêuticos para populações de células definidas. Ver, por exemplo, Mulligan (1993) Science 260:926-931. Estes métodos incluem: 1) Transferência directa de genes. Ver, por exemplo, Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468; 2) Transferência de ADN mediada por lipossomas. Ver, por exemplo, Caplen et al. (1995) Nature Med 3:39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17; Gao e Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285; 3) Transferência de ADN mediada por retrovírus. Ver, por exemplo, Kay et al. (1993) Science 262:117-119; Anderson (1992) Science 256:808-813. 54 4) Transferência de ADN mediada por virus de ADN. Estes virus de ADN incluem adenovirus (de preferência vectores à base de Ad2 ou Ad5) virus do herpes (de preferência vectores à base do virus herpes simplex) e parvovirus (de preferência vectores à base de parvovirus "defectivos" ou não autónomos, mais preferencialmente vectores à base de virus adeno-associados, mais preferivelmente vectores à base de AAV-2) . Ver, por exemplo, Ali et al. (1994) Gene Therapy 1:367-384; patente norte-americana US 4 797 368 e patente norte-americana US 5 139 941. A escolha de um determinado sistema vector para a transferência do gene de interesse irá depender de uma variedade de outros factores. Um factor importante consiste na natureza da população da célula alvo. Embora os vectores retrovirais tenham sido extensivamente estudados e utilizados numa série de aplicações em terapêutica genética, estes vectores são geralmente inadequados para infectar células que não se dividem. Além disso, os retrovirus têm potencial oncogénico. No entanto, desenvolvimentos recentes no domínio dos vectores lentivirais podem ultrapassar algumas destas limitações. Ver, Naldini et al. (1996) Science 272:263-267.

Os retrovirus dos quais se podem derivar os vectores plasmídicos anteriormente mencionados incluem, sem que isso constitua uma limitação, vírus da leucemia murina de Moloney, vírus da necrose do baço, retrovirus tais como, vírus do sarcoma de Rous, vírus do sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da leucemia de gibões, vírus da imunodeficiência humana, adenovirus, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário. Numa forma de 55 realização, o vector plasmídico retroviral é derivado do vírus da leucemia murina de Moloney.

Os adenovírus têm a vantagem de ter um amplo espectro de hospedeiros, poderem infectar células quiescentes ou diferenciadas terminalmente, tal como neurónios ou hepatócitos e aparentemente são essencialmente não oncogénicos. Ver, por exemplo, Ali et al. (1994), supra, p. 367. Os adenovírus não parecem integrar-se no genoma hospedeiro. Como existem como elementos extracromossómicos, o risco de mutagénese insercional diminui muito. Ali et al. (1994) , supra, p. 373.

Os vírus adeno-associados exibem vantagens semelhantes às dos vectores à base de adenovírus. No entanto, os AAVs exibem uma integração sítio-específica no cromossoma humano 19 (Ali et al. (1994), supra, p. 377).

Numa forma de realização preferida, o ADN que codifica as proteínas de fusão da presente invenção é utilizado em terapêutica genética para doenças incluindo, mas sem que isso constitua uma limitação, trombose venosa profunda, coagulação intravascular disseminada, síndromes coronárias agudas ou cancro com sinais de coagulopatia.

De acordo com esta forma de realização, a terapêutica genética com ADN que codifica as proteínas de fusão da presente invenção é fornecida a um doente que dela necessite, em simultâneo com ou imediatamente após o diagnóstico. 0 especialista observará que qualquer vector de terapêutica genética adequado que contenha ADN que codifica a proteína de fusão da invenção ou ADN que codifica análogos, fragmentos, derivados ou variantes da proteína de 56 fusão da invenção pode ser utilizado de acordo com esta forma de realização. As técnicas para a construção deste vector são conhecidas. Ver, por exemplo, Anderson, W.F. (1998) Nature 392:25-30; Verma I.M. e Somia, N. (1998) Nature 389:239-242. A introdução do vector que contém o ADN da proteína de fusão no sítio alvo pode ser concretizada recorrendo a técnicas conhecidas. O vector de terapêutica genética inclui um ou vários promotores. Os promotores adequados que podem ser empregues incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, o LTR retroviral, o promotor SV40 e o promotor do citomegalovírus humano (CVM) descritos em Miller et al. (1989) Biotechniques 7(9):980-990, ou quaisquer outros promotores (por exemplo promotores celulares, como promotores celulares eucariotas, mas sem que isso constitua uma limitação, promotores da histona, pol III e β-actina). Outros promotores virais que podem ser utilizados incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, promotores de adenovírus, promotores de timidina quinase (TK) e promotores de parvovírus B19. A selecção de um promotor adequado será evidente para os peritos na técnica a partir dos ensinamentos contidos no presente documento. A sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína de fusão da presente invenção encontra-se sob o controlo de um promotor adequado. Os promotores adequados que podem ser empregues incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, promotores adenovirais, tais como o promotor major de expressão tardia de adenovírus, ou promotores heterólogos, tais como o promotor de citomegalovírus (UCMV), o promotor do vírus sincicial respiratório (RSV), promotores induzíveis, tais como o promotor MMT, o promotor 57 da metalotioneína, promotores de genes de choque térmico, o promotor da albumina, o promotor ApoAI, promotores da globina humana, promotores da timidina quinase virai, tal como o promotor da timidina quinase do herpes simplex, LTRs (long terminal repeats) retrovirais (incluindo os LTRs retrovirais modificados descritos anteriormente), o promotor da β-actina e o promotor da hormona de crescimento humana. 0 vector plasmídico retroviral é utilizada na transdução de linhas celulares de empacotamento para formar linhas celulares produtoras. Exemplos de células de empacotamento que podem ser transfectadas incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, linhas celulares PE501, PA317, ψ-2, ψ-ΑΜ, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, \|;CRE, i|/CRIP, GP+#-86, GP+envAml2 e DAN, conforme descrito em Miller (1990) Human Gene Therapy 1:5-14. O vector pode transduzir as células de empacotamento através de quaisquer meios conhecidos na técnica. Estes meios incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, electroporação, o uso de lipossomas e precipitação com CaP04. Numa alternativa, o vector plasmídico retroviral pode ser encapsulado num lipossoma ou acoplado a um lípido e depois administrado a um hospedeiro. A linha celular produtora produz partículas de vector retroviral infecciosas que incluem a (s) sequência(s) de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos. Estas partículas do vector retroviral podem ser então usadas para transduzir células eucariotas, seja in vitro ou in vivo. As células eucariotas transduzidas irão expressar a(s) sequência(s) de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo. As células eucariotas que podem ser transduzidas incluem, mas sem que isso constitua uma 58 limitação, células tronco embrionárias, células de carcinoma embrionárias bem como células tronco hematopoiéticas, hepatócitos, fibroblastos, mioblastos, queratinócitos, células endoteliais e células epiteliais brônquicas.

Uma abordagem diferente à terapêutica genética consiste na "terapêutica transcariota", em que as células do doente são tratadas ex vivo para induzir os genes cromossómicos "inactivos" a produzir a proteína de interesse depois da reintrodução no doente. A terapêutica transcariota assume que o indivíduo possui um complemento normal de genes necessários para a activação. A terapêutica transcariota envolve a introdução de uma sequência promotora ou outra sequência reguladora exógena capaz de activar os genes nascentes no ADN cromossómico das células do doente, ex vivo, cultivando e seleccionando células produtoras de proteínas activas e depois reintroduzindo as células activadas no doente a fim de que estas se tornem completamente estabelecidas. As células "com os genes activados" produzem então a proteína de interesse durante um período significativo, talvez chegando a durar o tempo de vida do doente. As patentes norte-americanas US 5 641 670 e US 5 733 761 divulgam pormenorizadamente este conceito.

Kits: A presente invenção refere-se ainda a kits para pesquisa ou diagnóstico. Os kits incluem tipicamente um ou vários recipientes que contêm os anticorpos de cadeia simples da presente invenção. Numa forma de realização 59 preferida, os kits incluem recipientes contendo anticorpos de cadeia simples sob uma forma adequada para derivatização com uma segunda molécula, por exemplo dominio(s) da TM ou respectivos fragmentos. Noutra forma de realização mais preferida, os kits incluem recipientes que contêm as proteínas de fusão da SEQ ID NO: 2 ou 3.

Noutra forma de realização, os kits podem compreender sequências de ADN que codificam as proteína de fusão. De preferência, as sequências de ADN que codificam estas proteínas de fusão encontram-se num plasmídeo adequado para transfecção numa célula hospedeira onde serão expressas. 0 plasmídeo pode conter um promotor (frequentemente um promotor induzível) para regular a expressão do ADN na célula hospedeira. 0 plasmídeo pode ainda conter sítios de restrição apropriados para facilitar a inserção de outras sequências de ADN no plasmídeo para produzir várias proteínas de fusão. Os plasmídeos podem ainda conter vários outros elementos para facilitar a clonagem e expressão das proteínas codificadas. Estes elementos são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem, por exemplo, marcadores de selecção, codões de iniciação, codões de terminação.

Indicações terapêuticas:

As doenças em que a formação de trombos desempenha um papel etiológico significativo incluem enfarte do miocárdio, coagulação intravascular disseminada, trombose venosa profunda, embolismo pulmonar, AVC isquémico, choque séptico, síndroma de dificuldade respiratória aguda, angina instável e outras condições oclusivas arteriais e venosas. As proteínas da invenção são úteis em todas estas doenças, 60 bem como noutras em que a formação de trombos é patológica. Outras condições patológicas em que a proteína de fusão da presente invenção pode ser útil incluem cancro com coagulopatia e inflamação. Os compostos podem ainda ser aplicados em enxertos cutâneos e venosos e transplantes de órgãos. Por útil pretende-se dizer que estes compostos são úteis para o tratamento, seja na prevenção da doença ou na prevenção do progresso desta até um estado mais grave. Os compostos da presente invenção proporcionam também um anticoagulante seguro e eficaz, por exemplo, em doentes que receberam biopróteses, tais como válvulas cardíacas. Estes compostos podem substituir a heparina e a varfarina no tratamento de, por exemplo, embolismo pulmonar ou enfarte agudo do miocárdio. As proteínas de fusão da invenção podem também ser aplicadas no revestimento de dispositivos médicos em que a coagulação é uma questão importante.

Ensaios:

Existem vários ensaios laboratoriais para medir a actividade de TM de uma proteína de fusão da invenção. A actividade da proteína C pode ser medida recorrendo-se ao ensaio descrito por Salem, H.H. et al. (1984), supra, e

Galvin, J.B. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262(5):2199-2205. Resumidamente, o ensaio consiste em duas etapas. A primeira etapa consiste na incubação da proteína de fusão a ser testada com trombina e proteína C em condições definidas. Numa segunda fase, a trombina é inactivada com hirudina ou antitrombina III e heparina e a actividade da proteína C recém-activada é determinada pelo uso de um substrato cromogénico, em que o cromóforo é libertado pela actividade 61 proteolítica da proteína C activada. Este ensaio é executado com os reagentes purificados.

Em alternativa, o efeito de uma proteína de fusão pode ser medido utilizando ensaios do tempo de coagulação em plasma, tais como o tempo de tromboplastina parcial activado (APTT), tempo de coagulação da trombina (TCT) e/ou tempo da protrombina (PT). Estes ensaios distinguem entre diferentes mecanismos de inibição da coagulação e envolvem a activação da proteína C. 0 prolongamento do tempo de coagulação em qualquer um destes ensaios demonstra que a molécula pode inibir a coagulação no plasma.

Os ensaios acima referidos são utilizados para identificar proteínas de fusão com actividade de TM que conseguem ligar-se à trombina e activar a proteína C tanto em sistemas purificados como em meio plasmático. Outros ensaios são a seguir utilizados para avaliar outras actividades da TM nativa, tal como a inibição da formação de fibrina a partir do fibrinogénio catalizada pela trombina (Jakubowski, H.V. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 (8): 3876-3882), inibição da activação pela trombina do factor V (Esmon, C.T. et al. (1982). J. Biol. Chem. 257(14):7944-7947), inibição acelerada da trombina por antitrombina III e cofactor II da heparina (Esmon, N.L. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258(20):12238-12242), inibição da activação do factor XIII pela trombinha (Polgar, J. et al. (1987) Thromb. Haemost. 58(1):140), inibição da inactivação mediada pela trombina da proteína S (Thompson, E.A. and Salem, H.H. (1986) J. Clin. Inv. 78(1):13-17) e inibição da activação e agregação de plaquetas mediada pela trombina (Esmon, N.L. et al. (1983), supra). 62

Os ensaios apresentados a seguir, descritos pormenorizadamente mais à frente no exemplo 5, são utilizados para medir a potência in vitro das proteínas de fusão da invenção: 1) ensaio de activação da proteina C (cromogénico); 2) ensaio de activação de sTF/FVIIa; 3) ensaio de activação do factor X e 4) ensaio de activação da proteina C (numa superfície rica em FT).

Subentende-se, evidentemente, durante a execução dos procedimentos da presente invenção que as referências a tampões, meios, reagentes, células, condições de cultura específicos não devem constituir uma limitação, devendo antes ser lidos pressupondo a inclusão de todos os materiais relacionados que alguém com um domínio normal da técnica identificaria como sendo de interesse ou valor no contexto especifico em que a discussão é apresentada. Por exemplo, é frequentemente possível substituir um sistema tampão ou meio de cultura por outro e obter igualmente resultados similares, se não idênticos. Os peritos na técnica terão conhecimentos suficientes desses sistemas e metodologias por forma a serem capazes, sem necessidade de recorrer a experimentação indevida, a proceder a essas substituições que satisfaçam de modo óptimo os seus objectivos na utilização dos métodos e procedimentos divulgados no presente documento. A presente invenção passa agora a ser descrita mais detalhadamente com referência aos seguintes exemplos não limitativos. Durante a aplicação da divulgação do exemplo, deve-se ter sempre consciência de que outras formas de realização dos métodos divulgados de acordo com a presente invenção serão sem dúvida evidentes para os peritos na técnica relevante. 63

Sem entrar em mais pormenores, acredita-se que qualquer especialista na técnica pode, utilizando a descrição anterior, usar a presente invenção integralmente. As formas de realização especificas preferidas seguintes devem, por conseguinte, ser encaradas como meramente ilustrativas e de forma alguma limitativas do restante divulgado no presente documento.

No exposto anteriormente e nos exemplos seguintes, todas as temperaturas são apresentadas sem correcção, em graus Celsius e, todas as partes e percentagens são em peso, excepto se indicado em contrário.

Os exemplos seguintes são apresentados como uma orientação para apoio na concretização da invenção e não se pretende que constituam uma limitação ao âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Construção do Anticorpo Anti-FT de Cadeia Simples scFv(TF)3el0 (- 18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q V N L R E s G G T L V Q P G G S L R L S C A A s G F S F T D A W M S n V R Q A P G K E L E W V s S I S G s G G s T Y Y A G S V K G R F T I S R D N s K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T V S A G G G G 5 G A P N F M L T Q P K S V S A S P G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R .P G s s P T T V I Y E D N H R P s G V P D R F S G S I D T 3 s N S A S L T 1 5 G L K T E D E A D Y Y c Q s Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (264) 64 EXEMPLO 2

Construção da Proteína de Fusão 1 - scFv(TF)3elO-TMi456

(-18) mlgvlvlgalalaglvfpemaqvnlresg

GTLVQPGGSLRLSCAASGFSFTDAWMSWVRQ

APGKELEWVSSISGSGGSTYYAGSVKGRFTISR

DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLSLTD

YYWYGMDVWGQGTLVTVSAGGGGSGAPNFML

TQPHSVSASPGKTVTISCTRSSGSVASYYVQW

YQQRPGSSPTTVIYEDNHRPSGVPDRFSGSIDT

SSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSNNLVV

FGGGTKLTVLGAAAGGGGSGGGGSGGGGSVE

PVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAP

IPGEPHRC QL FCNQTACPADCDPNTQASCECPE

GYILDDGFICTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTF

ECICGPDSALA2QIGTDCAAAGAPVPYPDPLE P R A A (400) A proteína de fusão scFv(TF)3elO-TMi456 (SEQ ID NO:2) consiste num peptídeo de sinal (-18 a -1), domínio VH (1 a 126), sequência de ligação (linker) VH-VL (127 a 131), domínio VL (132 a 246), sequência de ligação VL-TM (247 a 264), domínio TMÍ456 (265 a 382) e sequência e-tag (383 a 400). As mutações H381G, M388L, R456G e H457Q em TMÍ456 encontram-se sublinhadas. 65 EXEMPLO 3

Construção da Proteína de Fusão 2 - scFv(TF)3elO-TMi456

scFvfTF13elO

(-18) MLCVLVLOALALAGLVFPEMAQVNLRE

SGGTLVQPGGSLRLSCAASGFSFTDAWMS

WVRQAPGKELEWVSSISGSGGSTYYAGSV

KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY

YCARVLSLTDYYWYGMDVWGQGTLVTVSA

OOGGSNFMLTQPHSVSASPGK.TVTISCTRS

SGSVASYYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNHR psgvpdrfsgsidtssnsasltisglktede

ADYYCQSYDSNNLVVFGGGTKLTVLGAAA ggggsggggsggggsvepvdpcfrancey

QCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPQEPHRCQL

FCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDG

F1CTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICG PDSALAGQIGTDC (379) A proteína de fusão scFv(TF)3elO-TMi456 (SEQ ID NO:3) consiste num peptídeo de sinal (-18 a -1), domínio VH (1 a 126), sequência de ligação VH-VL (127 a 131), domínio VL (132 a 243), sequência de ligação VL-TM (244 a 261) e domínio TMÍ456 (265 a 379). As mutações H381G, M388L, R456G e H457Q em TMÍ456 encontram-se sublinhadas.

Foi possível a expressão bacteriana, mas produziu uma proteína com uma actividade de cofactor da TM muito 66 reduzida. A proteína de fusão foi expressa em células CHO. 0 plasmídeo de expressão contém os marcadores de selecção de higromicina B e DHFR. A selecção original foi realizada em 400 pg/ml de higromicina para seleccionar uma população. A população resultante foi sujeita a selecção em 100 nM de metotrexato. Durante esta selecção, foram seleccionadas da população células com cópias amplificadas da região de ADN que contém o marcador de selecção e o gene alvo. Os níveis de expressão foram aumentados desde aproximadamente 0,3 mg/L para cerca de 6 mg/L em resultado desta selecção. EXEMPLO 5

Ensaios in vitro 1. Ensaio de Activação da Proteína C (cromogénico)

Este ensaio foi realizado misturando-se 20 μΐ de cada uma das seguintes proteínas numa placa de microtitulação: amostra de TM (desconhecida ou padrão), trombina (3 nM) e proteína C (1,5 μΜ) . O diluente usado no ensaio para cada proteína foi 20 mM de Tris-HCl, 0,1 M de NaCL2, 2,5 mM de CaCl2, 2,5 mg/ml de BSA, pH 7,4. Os poços foram incubados durante 2 horas a 37 °C após o que foi interrompida a activação da proteína C com a adição de 20 μΐ de hirudina (0,16 unidades/μΐ 370 nM) no diluente de ensaio e incubação durante mais 10 minutos. A quantidade de proteína C activada formada foi detectada adicionando-se 100 μΐ de S2266 1 mM (em diluente de ensaio) e prosseguindo a incubação da placa a 37°C. A absorvência a 405 nm em cada poço foi lida a cada 10 67 segundos durante 30 minutos, utilizando um leitor de placas Molecular Devices. Os dados de absorvências foram gravados e foi calculada a alteração da absorvência por segundo (declive) em cada poço. A mudança em absorvência por segundo é proporcional a pmol/ml de proteína C activada.

Esta proporção foi determinada empiricamente utilizando várias concentrações de proteina C totalmente activada. Amostras contendo proteina C activada a 100% foram produzidas misturando-se a proteina C a 0 até 1,5 μΜ com 60 nM de TM de coelho e 30 nM de trombina, incubando-se a seguir durante 0 a 4 horas, adicionando-se hirudina e medindo-se a actividade de S2266, como anteriormente. As condições em que se observa 100% de activação da proteína C foram definidas como sendo aquelas em que a actividade de S2266 (A405/seg) atingiu o patamar.

Uma unidade de actividade é definida como 1 pmole de proteina C activada gerada por ml/min nas condições de reagentes definidas anteriormente. Em alternativa, os valores da actividade são apresentados em comparação com a TM de coelho nativa solubilizada em detergente. 2. Ensaio da Activação de sFT/FVIIa

O princípio deste ensaio encontra-se representado abaixo. A ligação amida tripeptideo p-nitroanilida do substrato é hidrolizada pelo complexo sFT/FVIIa. O produto cromóforo libertado, a p-nitroanilida, é monitorizado a 405 nm e a concentração do produto formado por unidade de tempo é calculada utilizando-se um coeficiente de extinção molar de 992 0 Μ_1αη_1. Os valores de IC50 (C) são determinados por ajuste das taxas iniciais à equação de 4 parâmetros: Y = (A-D)/ (1+ (x/C)ΛΒ)+ D 68 H-D-Val-Leu-Arg-p-NA —> H-D-Val-Leu-Arg + p-NA S2266 Substrato Tripeptídeo Cromóforo

Reagentes e soluções: 1. Tampão de ensaio: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5mM, 0,1% de BSA, pH 7,5 2. FViia humano (HCViiA-ΟΟβΟ, Haematologic Technologies Inc.): 10 x de solução de trabalho - preparar uma solução de 20 nM em tampão de ensaio antes de utilização. 3. FT solúvel (Berlex) : 10 x de solução de trabalho, preparar uma solução de 30 nM em tampão de análise antes de utilização. 4. Substrato cromogénico S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.) : Solução mãe: 10 mM em H20, armazenada a 4°C. 2,5 x de solução de trabalho - preparar uma solução de 2,5 mM em tampão de análise antes de utilização. 5. Anticorpo: Preparar diluições de 2,5x em tampão de ensaio antes da utilização.

Condições do ensaio:

Os ensaios foram executados em placa de microtitulação de 96 poços à temperatura ambiente. As concentrações finais dos componentes são as seguintes: 69

sTF 3 nM Anticorpo varia entre 1000 e 0,625 nM FVIIa 2 nM S2266 1 mM

Procedimento do ensaio: 1. Pipetar 0,1 ml de 2,5x AB (ou tampão de controlo) em cada poço. 2. Adicionar 0, 025 ml de sTF 10 x e incubar 10 min à temperatura ambiente com agitação suave. 3. Adicionar 0,025 ml de FVIIa 10 x e incubar 10 min à temperatura ambiente com agitação suave. 4. Adicionar 0,1 ml de 2,5x de substrato S2266, transferir imediatamente a placa para um leitor de placas e medir a cinética enzimática a 405 nm em intervalos de 10 segundos, durante 15 min. 3. Ensaio de Activação do Factor X: O principio deste ensaio encontra-se descrito abaixo. FVIIa é incubado com vesículas de FT humano recombinantes para formar um complexo de protease capaz de activar o substrato, FX. Este complexo é formado na presença (ou ausência) de diferentes concentrações de anticorpo, depois o substrato FX é introduzido e deixa-se que a reacção ocorra até formar o produto, a protease activa FXa, que é 70 capaz de hidrolizar a ligação amida da p-nitroanilida do substrato cromogénico S2222. O produto cromóforo libertado, a p-nitroanilida, é monitorizado a 405 nm e a concentração do produto formado por unidade de tempo é calculada utilizando um coeficiente de extinção molar de 9920 Μ_1αη_1. Os valores de IC50 (C) são determinados por ajuste das taxas iniciais à equação de 4 parâmetros: Y = (A-D)/(l+

(x/C)ΛΒ )+ D

Bz-lle-Glu-Gly-Arg-p-NA —> Bz-lle-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA S2222 Substrato Cromóforo

Reagentes e soluções: 1. Tampão de ensaio: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5mM, 0,1 % de BSA, pH 7,5 2. FVIIa humano (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4 x de solução de trabalho - preparar uma solução de 100 pM em tampão de ensaio antes de utilização. 3. FT humano recombinante (reconstituído no nosso laboratório a partir de Innovin, Dade): solução de trabalho - preparar uma diluição de 1:480 em tampão de ensaio antes da utilização. 4. Factor X (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4 x de solução de trabalho - preparar uma solução de 1000 nM em tampão de ensaio antes de utilização. 5. Substrato cromogénico S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.) :

Solução mãe: 6 mM em H20, armazenada a 4°C. 71

Solução de trabalho- preparar uma solução de 0,78 mM em edta 3,57 mM (para parar a reacção), 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 antes da utilização. 6. Anticorpo:

Preparar diluições de 4x em tampão de ensaio antes da utilização.

Condições do ensaio:

As análises foram executadas em placa de microtitulação de 96 poços à temperatura ambiente. As concentrações finais dos componentes são as seguintes:

vesículas de rTF de diluição 1:480 Anticorpo varia entre 1000 e 0,625 nM FVIIa 2 5 pM FX 2 50 nM S2222 0,546 mM

Procedimento do ensaio: 1. Pipetar 0,015 ml de 4x AB (ou tampão de controlo) em cada poço. 2. Adicionar 0,015 ml de 4x vesículas de rTF. 72 3. Adicionar 0,015 ml de FVIIa 4 x e incubar 10 min à temperatura ambiente com agitação suave. 4. Adicionar 0,015 ml de FX 4 x e incubar 5 min à temperatura ambiente com agitação suave. 5. Adicionar 0,14 ml de substrato S2222, transferir imediatamente a placa para um leitor de placas e medir a cinética enzimática a 405 nm em intervalos de 10 segundos, durante 15 minutos. 4. Análise de Activação da Proteína C (em superfície rica em FT)

Este ensaio é executado como para o ensaio cromogénico de activação da proteína C descrito anteriormente com excepção de que neste ensaio adicionam-se vesículas PC7PS contendo FT humano à proteína de fusão ou à TM de controlo, antes de se adicionar a trombina e a proteína C. EXEMPLO 6

Características dos Anticorpos Anti-FT

Sete diferentes anticorpos que se ligam ao FT foram isolados de uma biblioteca de apresentação em fagos (phage display) de anticorpos de cadeia simples humanos completos. As afinidades dos anticorpos que se ligam a sTF, medidas utilizando o BlAcore, situavam-se entre 35 e 470 nM. O ensaio sTF/VIIa pode ser utilizado para determinar se os anticorpos bloqueiam a formação de um complexo VIIa/FT activo. No ensaio sTF/VIIa, a ligação de Vila a sTF acelera a taxa de clivagem contra o substrato peptídico cromogénico 73 S2266 em >20 vezes. Os anticorpos que inibem a ligação de FVlla a FT bloqueiam esta aceleração. De entre sete diferentes anticorpos isolados, apenas um, o scFv(TF)3elO não inibiu o ensaio sTF/VIIa. Este anticorpo aumentou a afinidade de FVIIa para sTF, diminuindo o KD para um valor cinco vezes inferior (figura 1) . O KD do anticorpo scFv(TF)3elO para sTF, medido pelo ensaio de sTF/FVIIa foi de 65,4 nM (figura 2). A microcalorimetria foi utilizada para comparar a afinidade de scFv(TF)3elO para FT em comparação com o complexo FVIIa/FT. Estas experiências revelaram que o anticorpo possui uma afinidade 20 vezes maior para o complexo FVIIa/FT, em comparação com sTF livre (33 nM em comparação com 600 nM, figura 3) . Os anticorpos foram comparados recorrendo-se ao ensaio de activação de FX, que consiste em FT completo em vesículas fosfolipídicas, FVIIa e FX. A quantidade de FXa gerado é determinada utilizando-se o substrato cromogénico S2765. Embora o anticorpo scFv(TF)3elO não tenha tido a maior afinidade, conforme medido por BlAcore, e tenha aumentado a afinidade de FVIIa para sTF, foi o único anticorpo no grupo que inibiu a activação de FX e prolongou o tempo de coagulação no ensaio do PT. O IC50 do anticorpo scFv(TF)3elO (dímero) para inibição no ensaio de activação de FX foi 0,44 nM (figura 4) e observou-se uma extensão para o dobro do PT a 417 nM (figura 5). O anticorpo scFv(TF)3elO foi identificado com base na ligação ao FT solúvel humano recombinante. A homologia da sequência de FT entre a sequência humana e de murino ou humana e de coelho é de 58% e 71%, respectivamente. O anticorpo liga-se a um epítopo único no FT humano que interfere com a activação de FX pelo complexo FVIIa/FT. 74

Fisiologicamente, o anticorpo tem uma vantagem relativamente aos anticorpos que competem com a ligação de FVII ou FVlla a FT. 0 KD de FVII e FVIIa no plasma humano é igual a 10 nM ou entre 100 e 1000 vezes maior que o KD. A taxa de dissociação para o complexo de afinidade elevada será lenta (70 a 700 segundos, assumindo uma constante da taxa de associação kon = 108M_1sec_1) . Em contraste o Km de FX para o complexo VIIa/FT situa-se entre 0,200 e 4 μΜ e a concentração de FX no plasma humano é 130 nM (entre 0,03 e 0,65 vezes o KD). A principal função do complexo FVlIa/FT na coagulação consiste em converter FX em FXa. EXEMPLO 7

Características in vitro da Proteína de Fusão SCFv(TF)3elO-TMi456

As características de uma proteína de fusão da invenção scFv(TF)3elO-TMi456 foram avaliadas numa variedade de ensaios in vitro. A proteína de fusão, scFv(TF)3elO-TMi456, reteve a capacidade de inibir a activação de FX pelo complexo FVlla/FT (IC50 =0,5 nM, dados não apresentados) e actuou como cofactor para a activação da proteína C catalizada pela trombina (ensaio cromogénico, figura 6) . Não se observou qualquer diferença significativa na actividade de cofactor da TM entre a proteína de fusão e apenas TMÍ456 na ausência de vesículas fosfolipídicas contendo FT. Em contraste, a actividade de cofactor da TM da proteína de fusão, mas não de TMÍ456, aumentou >5 vezes na presença de vesículas fosfolipídicas contendo FT (figura 7). A potência in vitro da proteína de fusão, scFv(TF)3el0-TMÍ456 contra a coagulação induzida por FT (ensaio do PT, 75 via de coagulação extrínseca) foi 6 vezes melhor do que a do anticorpo scFv(TF)3elO e 17 vezes melhor do que apenas Tmi456 (figura 5) . Em contraste, a potência in vitro da proteína de fusão contra as vias de coagulação intrínsecas e comuns não foi significativamente afectada (ensaios de APTT e TCT, dados não apresentados). Por conseguinte, a dose de proteína de fusão que causou uma extensão para o dobro no PT apenas teve um efeito modesto no APTT, enquanto o TMÍ456, numa dose equivalente à do ensaio do PT, provocou um aumento para o quádruplo no APTT (figura 8). Este perfil in vitro é consistente com o que se esperava para os anticoagulantes dirigidos para FT/FVIIa que são conhecidos por terem uma eficácia superior às taxas de hemorragia em modelos animais de trombose. De acordo com os ensaios de coagulação à base de plasma, a proteína de fusão scFv(TF)3elO-TMi456 foi mais potente no ensaio de coagulação do sangue total induzida por FT (tromboelastógrafo, TEG) do que scFv(TF)3elO ou TMÍ456 individualmente (figura 9). Além disso, a proteína de fusão scFv(TF)3elO-TMi456 teve uma resposta ao nível da dose mais previsível no ensaio de coagulação do sangue total induzida por FT do que a heparina de baixo peso molecular (LMWH, figura 10). Em resumo, os dados apresentados anteriormente demonstram que as proteínas de fusão da invenção são anticoagulantes potentes e selectivos in vitro.

EXEMPLO

Modelo de Tromboembolismo em Ratos In Vivo A porção de anticorpo contra FT da proteína de fusão scFv(TF)3elO-TMi456 é específica para FT de primata. Um 76 modelo de tromboembolismo desencadeado por FT humano (reagente tromboplastina contendo FT recombinante humano, Ortho) foi desenvolvido em ratos Sprague-Dawley machos conscientes (350 a 400 g, n > 7/grupo) . Neste modelo de coagulação intravascular disseminada (DIC), o FT, por injecção de tromboplastina, induz deposição pulmonar de fibrina, falência respiratória e morte. Doses equimolares de scFv(TF)3elO-TMi456 ou scFv(TF)3elO ou veiculo foram injectadas na veia caudal seguidas, 15 min. depois, por uma injecção de bólus de tromboplastina (0,5 ml/kg). No grupo tratado com veiculo, esta dose de FT teve como resultado 60% de letalidade (LD60), normalmente no espaço de 5 min. após a injecção da tromboplastina. Os ratos foram classificados de acordo com o seguinte sistema de pontuação morbilidade-mortalidade: 0 = não afectado; 1 = dificuldade respiratória ligeira (recuperação no espaço de 30 min); 2 = dificuldade respiratória grave (moribundo, recuperação requer mais de 60 min.) e 3 = morte A classificação média foi utilizada para comparação da eficácia dos 4 diferentes grupos de tratamento. Os resultados da utilização destE ensaio in vivo encontram-se representados na figura 11. A proteina de fusão da invenção foi capaz de inibir a morte e dificuldade respiratória neste ensaio.

Os exemplos anteriores podem ser repetidos com resultados semelhantes, substituindo os reagentes descritos genericamente ou especificamente e/ou condições operacionais da presente invenção pelos utilizados nos exemplos anteriores.

Embora a invenção tenha sido ilustrada relativamente à produção de determinadas construções de proteina de fusão, é evidente que podem ser efectuadas variações e 77 modificações da invenção sem que se afastem do espirito ou âmbito da invenção.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Light, David McLean, Kirk <120> Proteína de Fusão de Trombomodulina e Anticorpo que tem como Alvo o Factor Tecidular Solúvel a qual actua como Anticoagulante <130> 52295AUSM1 <150> US 60/376 566 <151> 2002-05-01 <160> 3 <170> Patenteln versão 3,1 <210> 1 <211> 282

<212> PRT <213> Artificial < 4 0 0 > 1 78

Met Leu Gly vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Vai 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gin Vai Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Vai Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Vai Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 130 13S 140 79

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Aan Phe Met Leu Thr Gin Pro His 145 150 155 160 Ser Vai Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Vai Thr Ile Ser Cys Thr Arg 165 170 175 Ser Ser Gly Ser Vai Ala Ser Tyr Tyr Vai Gin Trp Tyr Gin Gin Arg 180 185 190' Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Vai Ile Tyr Glu Asp Asn Hls Arg Pro 195 200 205 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn 210 215 220 Ser Ua Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp 225 230 235 240 Tyr Tyr Cya Gin Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Vai Vai Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Vai Pro 260 265 270 Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala 275 280 < 210 > 2 <211> 418 <212> PRT <213> Artificial < 4 Ο Ο > 2 80

Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Vai 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gin Vai Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 £ 1—· Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lya 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Vai Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr £5 70 75 80 81

Tyr Ala Gly Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110

Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Vai Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125

Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His 145 150 155 160

Ser Vai Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Vai Thr Ile Ser Cys Thr Arg 165 170 175

Ser Ser Gly Ser Vai Ala Ser Tyr Tyr Vai Gin Trp Tyr Gin Gin Arg 180 185 190

Pro Gly Ser Ser pro Thr Thr Vai Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro 195 200 205

Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn 210 215 220

Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp 225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Vai vai Phe Gly Gly 245 250 255

Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Vai Glu Pro Vai Asp Pro 275 280 285

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr 290 295 300

Ser Tyr Leu Cys Vai Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 305 310 315 320

Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala cys Pro Ala Asp 325 330 335

Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 340 345 350 82

Leu Asp Asp Gly Phe He Cys Thr Aap Ile Aap Glu Cys Glu Asn Gly 355 360 365

Gly Phe Cys Ser Gly Vai Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 370 375 380

Ile Cya Gly pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gin Ile Gly Thr Asp Cys 385 390 395 400

Ala Ala Ala Gly Ala Pro Vai Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg 405 410 415

Ala Ala <210> 3 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial < 4 0 0 > 3

Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Vai 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gin Vai Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 2S 30 Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Vai Ser ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Vai Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 130 135 140 83

Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro Hia. Ser Val Ser 145 150 155 160 Ala Ser Pro Gly Lys Thr Vai Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly 165 170 175 Ser Vai Ala Ser Tyr Tyr Vai Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser 180 185 190 Ser Pro Thr Thr Vai Ile Tyr Glu Asp Asn Hia Arg Pro Ser Gly Val 195 200 205 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser 210 215 220 Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Gin ser Tyr Aap Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 245 250 255 Leu Thr Vai Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser val Glu Pro Val A3p Pro Cys Phe Arg 275 280 285 Ala Asn Cya Glu Tyr Gin Cya Gin Pro Leu Asn Gin Thr Ser Tyr Leu 290 295 300 Cys Vai Cya Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro Hia Glu Pro His Arg 305 310 315 320 Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro 325 330 335 Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cya Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp 340 345 350 Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Aap Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys 355 360 36S Ser Gly Vai Cya Hia Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly 370 375 380 Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gin Ile Gly Thr Aap Cys 385 390 395

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Light, David 84

McLean, Kirk <120> Proteína de Fusão de Trombomodulina e Anticorpo que tem como Alvo o Factor Tecidular Solúvel a qual actua como Anticoagulante

<130> BERLX 282WO <140> PCT/US03/13522 <141> 2003-04-30 <150> 60/376,566 <151> 2002-05-01 <160> 3

<170> Patenteln versão 3,1 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Proteína de Fusão Sintética <400> 1 85

Met Leu Gly Val Leu val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 1 5 10 15 phe Pro Glu Met Ala Gin val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ser phe 50 Thr ASP Ala Trp Met 55 Ser Trp val Arg Gin 60 Ala pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp val ser Ser ile Ser Gly Ser Gly Gly ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser val Lys Gly Arg Phe Thr 11 e Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gl n Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met ASP val Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro HÍS 145 150 155 160 Ser val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr val Thr Ile ser cys Thr Arg 165 170 175 ser Ser Gly Ser 180 val Ala ser Tyr Tyr 185 val Gin Trp Tyr Gin 190 Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val He Tyr Glu Asp Asn HÍS Arg Pro 195 200 205

Ser Gly val Pro Asp Arg Phe ser Gly Ser ile Asp Thr ser ser Asn 210 215 220 Ser Ala Ser Leu Thr ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala ASP 225 230 235 240 Tyr Tyr cys Gin Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu val val Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Thr val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro val pro 260 265 270 Tyr Pro ASP Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala 275 280 <210> 2 <2ll> 418 86

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Proteína de Fusão Sintética <400> 2

Met Leu Gly val Leu val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu val 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gin val Asn Leu Arg Glu ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly phe 35 40 45 Ser Phe 50 Thr Asp Ala Trp Met 55 Ser Trp val Arg Gin 60 Ala Pro Gly Lys Glu Leu GlU Trp val ser ser ile ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly ser val Lys Gly Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala vai Tyr 115 Tyr cys Ala Arg val 120 Leu Ser Leu Thr ASP 125 Tyr Tyr Trp Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala pro Asn phe Met Leu Thr Gin Pro HÍS 145 150 155 160 Ser Vai Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr val Thr ile Ser Cys Thr Arg 165 170 175 Ser Ser Gly Ser val Ala Ser Tyr Tyr val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg 180 185 190 Pro Gly ser Ser Pro Thr Thr val ile Tyr Glu Asp Asn HÍS Arg Pro 195 200 205 ser Gly val Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser ile Asp Thr ser ser Asn 210 215 220 87 ser Ala ser Leu Thr ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala ASP 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Gin ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro val Asp Pro 275 280 285 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr 290 295 300 ser Tyr Leu cys val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro Gly Glu 305 310 315 320 Pro HlS Arg Cys Gin Leu Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp 325 330 335 cys ASp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu cys pro Glu Gly Tyr ile 340 345 350 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr ASP Ile Asp Glu cys Glu Asn Gly 355 360 365 Gly Phe Cys Ser Gly Val cys His Asn Leu pro Gly Thr Phe Glu cys 370 375 380 ile Cys Gly pro ASP Ser Ala Leu Ala Gly Gin Ile Gly Thr Asp Cys 385 390 395 400 Ala Ala Ala Gly Ala Pro val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu pro Arg 405 410 415

Ala Ala

<210> 3 <211> 397 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Proteína de Fusão Sintética <400> 3 88

Met Leu Gly vai Leu vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu vai 15 10 15

Phe Pro Glu Met Ala Gin vai Asn Leu Arg Glu ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30

Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45

Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60

Glu Leu Glu Trp Vai Ser Ser lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80

Tyr Ala Gly Ser vai Lys Gly Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn ser 85 90 95 89

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr 100 105 110 Ala Vai Tyr Tyr cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly ser Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser val ser 145 150 155 160 Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser ser Gly 165 170 175 ser val Ala ser 180 Tyr Tyr val Gin Trp 185 Tyr Gin Gin Arg Pro 190 Gly Ser ser Pro Thr Thr val ile Tyr Glu ASP Asn HÍS Arg pro Ser Gly val 195 200 205 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser rle Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser 210 215 220 Leu Thr lie ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Gin ser Tyr Asp ser Asn Asn Leu val val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly ser Gly Gly Gly Gly ser val Glu Pro val Asp ΡΓΟ cys Phe Arg 275 280 285 Ala Asn Cys Glu Tyr Gin cys Gin pro Leu Asn Gin Thr ser Tyr Leu 290 295 300 Cys val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro Gly Glu Pro His Arg 305 310 315 320 Cys Gin Leu Phe cys Asn Gin Thr Ala cys Pro Ala ASp cys Asp Pro 325 330 335 Asn Thr Gin Ala ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp 340 345 350 Gly Phe ile Cys Thr ASp ile ASp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys 355 360 365 Ser Gly val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly 370 375 380 Pro A$p Ser Ala Leu Ala Gly Gin Ile Gly Thr ASP Cys 385 390 395 90

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Light, David McLean, Kirk que como <120> Proteína de Fusão de Trombomodulina e Anticorpo tem como Alvo o Factor Tecidular Solúvel a qual actua Anticoagulante <130> 52295AUSM1 <150> US 60/376 566 <151> 2002-05-01 <160> 3 <170> Patenteln versão 3,1 <210> 1 <211> 282

<212> PRT <213> Artificial <400> 1 91

Met Leu Gly Vai Leu val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gin Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 ser Phe Thr ASp Ala Trp Met ser Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp Vai ser ser lie Ser Gly ser Gly Gly ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser vai Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala GlU Asp Thr 100 105 110 Ala vai Tyr 115 Tyr cys Ala Arg val 120 Leu ser Leu Thr Asp 125 Tyr Tyr Trp Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly ser Gly Ala pro Asn Phe Met Leu Thr Gin pro His 145 150 155 160 Ser vai Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr val Thr ile Ser Cys Thr Arg 165 170 175 Ser Ser Gly Ser val Ala Ser Tyr Tyr val Gl n Trp Tyr Gin Gin Arg 180 185 190

Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr vai lie Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro 195 200 205 ser Gly vai Pro Asp Arg phe ser Gly ser ile Asp Thr ser ser Asn 210 215 220 ser Ala ser Leu Thr ile ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp 225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu vai vai Phe Gly Gly 245 250 255

Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro vai pro 260 265 270

Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala 275 280 92 < 210 > 2 <211> 418

<212> PRT <213> Artificial < 4 Ο Ο > 2

Met Leu Gly vai Leu vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu val 1 5 10 15 Phe Pro Glu Met Ala Gin vai Asn Leu Arg Glu ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 ser Phe Thr Asp Ala Trp Met ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Glu Leu Glu Trp vai ser ser ile ser Gly ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Gly Ser vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg vai Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met ASp vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala pro Asn phe Met Leu Thr Gin pro HlS 145 150 155 160 ser vai ser Ala ser Pro Gly Lys Thr vai Thr lie ser cys Thr Arg 165 170 175 ser ser Gly ser vai Ala Ser Tyr Tyr vai Gin Trp Tyr Gin Gin Arg 180 185 190 Pro Gly ser ser Pro Thr Thr Vai lie Tyr Glu ASp Asn HlS Arg Pro 195 200 205 ser Gly vai pro Asp Arg Phe ser Gly ser ile ASp Thr ser ser Asn 210 215 220 93 ser Ala ser Leu Thr lie ser Gly Leu Lys Thr Glu ASp Glu Ala ASp 225 230 235 240 Tyr Tyr cys Gin ser Tyr Asp ser Asn Asn Leu val val Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu 260 Thr vai Leu Gly Ala 265 Ala Ala Gly Gly Gly 270 Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser vai Glu pro val Asp pro 275 280 285 cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr 290 295 300 ser Tyr Leu cys vai cys Ala Glu Gly Phe Ala pro lie pro His Glu 305 310 315 320 Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys pro Ala Asp 325 330 335 Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys pro Glu Gly Tyr ile 340 345 350 Leu Asp Asp Gly Phe ile cys Thr ASP ile Asp Glu cys Glu Asn Gly 355 360 365 Gly Phe Cys Ser Gly vai Cys HÍS Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 370 375 380 ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gin ile Gly Thr Asp cys 385 390 395 400 Ala Ala Ala Gly Ala pro vai pro Tyr pro ASp pro Leu GlU pro Arg 405 410 415

Ala Ala <210> 3 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial < 4 0 0 > 3 94

Met Leu Gly vai Leu vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu vai 15 10 15

Phe Pro Glu Met Ala Gin vai Asn Leu Arg Glu ser Gly Gly Thr Leu 20 25 30 vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45

Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60

Glu Leu Glu Trp vai ser ser ile ser Gly ser Gly Gly ser Thr Tyr 65 70 75 80

Tyr Ala Gly Ser vai Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 95 Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser val Ser 145 150 155 160 Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly 165 170 175 Ser val Ala Ser Tyr Tyr val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser 180 185 190 Ser pro Thr Thr val ile Tyr Glu ASp Asn His Arg pro Ser Gly val 195 200 205 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser 210 215 220 Leu Thr ile Ser Gly Leu Lys Thr GlU Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Gin Ser Tyr ASp Ser Asn Asn Leu val val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 245 250 255 Leu Thr val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser val Glu Pro val Asp pro Cys phe Arg 275 280 285 Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr Ser Tyr Leu 290 295 300 Cys val Cys Ala Glu Gly phe Ala pro ile pro HIS Glu pro His Arg 305 310 315 320 cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala cys pro Ala Asp Cys Asp Pro 325 330 335 Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp 340 345 350 Gly phe ile cys Thr ASp ile ASp Glu cys Glu Asn Gly Gly phe cys 355 360 365 ser Gly 370 val cys His Asn Leu 375 Pro Gly Thr phe Glu 380 cys He cys Gly pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gin ile Gly Thr Asp Cys 385 390 395

Lisboa 10/01/2011. 96

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão anticoagulante compreendendo uma proteína direccionada contra um alvo ou um análogo, fragmento, derivado ou variante desta que se liga ao factor tecidular (FT) ou ao complexo factor Vlla/FT (FVlla/FT) e que está ligada de modo funcional ao domínio EGF456 da trombomodulina (TM) ou um análogo, fragmento, derivado ou variante deste, sendo que a proteína de fusão anticoagulante se liga ao factor tecidular (TF) ou ao complexo factor VII/FT (FVIIa/FT).

2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio da TM compreende a ansa interdomínios localizada entre EGF3 e EGF4.

3. Proteína de fusão de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o domínio EGF456 contém pelo menos uma mutação pontual seleccionada do grupo constituído por H381G, M388L, R456G e H457Q que torna a referida proteína de fusão mais resistente aos danos por oxidação ou à actividade da protease ou aumenta a eficiência catalítica da referida proteína de fusão.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 3, em que o domínio EGF456 consiste em mutações pontuais em H381 G, M388L, R456G e H457Q.

5. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida proteína 2 direccionada contra um alvo é um anticorpo que se liga ao FT.

6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 5, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.

7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 6, em que o referido anticorpo monoclonal se liga ao complexo FVIIa/FT com uma maior afinidade do que o FT isoladamente.

8. Proteína de fusão de acordo com as reivindicações 6 ou 7, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo dímero Fab ou um anticorpo de IgG.

9. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 8, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo de cadeia simples.

10. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que o referido anticorpo monoclonal se encontra ligado de modo funcional a mais do que um domínio da TM.

11. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em que o referido anticorpo monoclonal neutraliza o FT.

12. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida proteína de fusão é glicosilada, é modificada pela adição de 3 polietilenoglicol ou é biotinilada para ligação à estreptavidina.

13. Composição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, composição essa que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida proteína de fusão.~

14. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para utilização na protecção contra a formação de trombos.

15. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 14, em que a protecção contra a formação de trombos está relacionada com o AVC isquémico, complicações trombóticas na sequência de angioplastia ou cirurgia microvascular.

16. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para utilização na prevenção e tratamento de trombose venosa profunda (DVT), coagulação intravascular disseminada (DIC), síndrome coronária aguda ou cancro com sinais de coagulopatia num doente.

17. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para utilização na regulação da resposta inflamatória num doente, sendo a referida resposta inflamatória seleccionada do grupo constituído por sépsis, enxertos cutâneos e venosos e transplantes de órgãos. 4

18. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para utilização para formar um revestimento não trombogénico na superfície de um dispositivo médico.

19. Kit compreendendo a proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

20. Kit compreendendo sequências de ADN que codificam os componentes da proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

21. Composição para terapêutica genética compreendendo o ADN que codifica a proteína de fusão que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ id NO:2 ou SEQ ID NO:3 em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vector para terapêutica genética.

22. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 9, em que a referida proteína de fusão compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Lisboa, 10/01/2011. 1/11 FIGURA 1

Ο Ο Ί- Ο t'- (Ο « ^ ΓΟ CM Actividade S2266 ο Ο ο d Έ C U > '_3 Ο ΙΛ l·- η 3 •Ό ’ΰ (U I- l·- ο u ίϋ 2/11

Actividade S-2266 FIGURA 2 X3/11

’ 0 iro Kcal/volume de injectado ιη too iri IA o •'T 1/7 f*3 σ ri U7 ri o ri VA τ- Ο T- V) d o d IA d 0α o0. FIGURA 3

Kcal/volume de injectado 4/11

Actividade de FXa FIGURA 4 5/11 FIGURA 5

Extensão para o dobro do PT 6/11 FIGURA 6

(Ο ΙΟ Ο ' c ^ ' I-1 ο ICO (Λ 3 I **-3 00 Ο

7/11 FIGURA 7

(A O > I- 03 > LL Ι Ο 8/11 FIGURA 8

Ο !Γϋ (Λ 3 (Ο m Í F- LL hV LL Ο (0 οο Cου ΙΟ.ο Ό Ο ι_.Q Ο Οο ίϋ s_ Γϋαο Ηϋ ΙΛ C α> 4-> X (U rc i- (Cα ΙΛ (U ΙΟ θ' (C C (U υ Cο υ< (SD9S) lidV FIGURA 9 9/11

o iro 10 3 <0 "3- S H- % controlo sem inibição (TEGR)

> Li. U UI 10/11

CM <N Τ’ IValor R (TEG) 300 Concentração relativa 11/11

o £ Õ . ε ο ιη ο Ο ο d ο ο FIGURA 11