RS104504A - Novi trombomodulin fuzioni proteini koji ciljaju tkivni faktor kao aktikoagulanti - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na nove fuzione proteine koji se sastoje od proteina za ciljanje koji vezuje tkivo faktor (TF), koji je operativno vezan za trombomodulin (TM) EGF456 domen sam ili u kombinaciji sa bar još jednim TM domenom odabranom od grupe koja se sastoji od N-krajnjeg hidrofobicnog region domena, EGF 123 domena, interdomen obruča izmedju EGF3 i EGF4, i O-glikozilovanog Ser/Thr-bogatog domena, ili njihovih analoga, fragmenta, derivata i varijanti. Fuzioni protein se vezuje na položaju povrede i sprečava iniciranje tromboze. Fuzioni protein može biti upotrebljen da tretira različita tromboticna stanja uključujući ali ne limitirajuci na duboku vensku trombozu, raširenu intravaskularnu koagulaciju, i akutni koronarni sindrom.

Description

NOVI TROMBOMODULIN FUZIONI PROTEINI KOJI CILJAJU TKIVO

FAKTOR KAO ANTIKOAGULANTI

Ova prijava se poziva na U.S. Provisional Application Serial No. 60/376,566, podnesenu Lmaja 2002.godine koja je ovde u celini inkorporisana putem reference.

STANJE TEHNIKE

Održavanje odgovarajućeg balansa između prokoagulantne i antikoagulantne aktivnosti u okviru krvnog suda je esencijalna za normalnu hemostazu (Davie, E.W. et al. (1991)Biochemistry,30(43): 10363-10370). Remećenje balansa ka koagulaciji vodi do tromboze, koja može da izazove srčani udar, šlog, pulmonalnu emboliju, i vensku trombozu. Postoji potreba za efektnijim i sigurnijim antikoagulantima za lečenje specifičnih trombotičnih poremećaja.

Tkivo faktor ("TF") je glikoprotein transmembrane koji je glavni inicijator koagulacione kaskade (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost. 74(1): 180-184). Pod normalnim fiziološkim uslovima aktivni TF nije u kontaktu sa krvi. Tokom vaskularne povrede, izlaganje trombocita subendotelijalnog TF i kolagena vodi do aktivacije faktora koagulacije i trombocita i potom do hemostatičkog formiranja čepa. Neodgovarajuća indukcija TF ekspresije u različitim kliničkim podešavanjima može da vodi do opasne po život tromboze i/ili da doprinese patološkim komplikacijama. Za TF izlaganje praćeno sa prekidanjem koluta se veruje da je odgovorno za trombotičku okulziju koja vodi do akutnog miokardijačkog infakrta i šloga. U ovim podešavanjima, proinflamatorne signalne putanje aktivirane sa faktorima koagulacije takođe doprinose formiranju edema i povećanoj veličini infarkta. Vaskularna povreda povezana sa angioplastikom vodi do regulisanja na više TF na SMC-ove za šta se veruje da izaziva ćelijske signalne putanje povezane sa restenozom. TF prekomerna ekspresija kod kancera i gram-negativne sepse vodi do opasne po život tromboze i aktivacije inflamatornih putanji.

FVIIa/TF kompleks je umešan u patogeni mehanizam kod različitih trombotičnih bolesti i cirkulacioni nivo TF je faktor rizika za određene pacijente. FVIIa i TF igraju jedinstvene uloge kod vaskularne povrede u održavanju hemostaze i iniciranju tromboze. TF se ekspresuje u spoljašnji omotač normalno, ali je podešen naviše i ekspresovan neodgovarajuće u medijumu i neointimi kod vaskularne bolesti. TF ekspresija na aterosklerotičnim pločama se ovećava iz krvi putem tanke fibrozne kape koja može da se prekine i izloži dejstvu TF. Hirurške intervencije kao što je balon angioplastika, postavljanje stenta, ili endarterektomija oštećuje zid suda i izlaže dejstvu ispod postavljeni TF. U aterosklerotičnoj, bogatom lipidom, sa tankim zidom pločici, spontani prekid ili endotelijalna erozija vodi do izlaganja dejstvu TF i tromboze, rezultirajući i nestabilnoj angini ili miokardiačkom infarktu. TF može da cirkuliše u ćelijski izvedenim mikročesticama i cirkulišući TF nivoi se pojačavaju u nestabilnu anginu, sugerišući da ovaj cirkulišući TF može da doprinese formiranju tromboze (Soejima, H. et al. (1999)Circulation99(22):2905-2913). Često je kancer povezan sa hiperkoagulativnim stanjem pripisanom prekomernoj ekspresiji TF na ćelije tumora. Ovo predisponira pacijenta ka dubokoj venskoj trombozi, pulmonalnoj emboliji i niskom stepenu rasejane intravaskularne koagulacije ("DIC"). DIC rezultira u uklanjanju mikrovaskularnog fibrina što doprinosi prstanku rada više organa. Rezultati iz modela akutne arterijske povrede ukazuju dasu na proteinu zasnovani inhibitori FVIIa/TF, kao što su faktor Vila koji inhibira aktivni položaj ("FVIIai") i inhibitor putanje tkivo faktora ("TFPI"), efektivni antitrombotici sa manje krvarenja upoređeno prema trombin i faktor Xa ("FXa") inhibitorima. Dodatno, FVIIa/TF inhibicija je superiorna spram drugih antikoagulanata (n.pr., heparin, FXa inhibitori) u sprečavanju neointimnog zgušnjavanja i vaskularne stenoze posle balon povrede (Jang, Y. et al. (1995)Circulation92(10):3041 -3050).

Trombomodulin ("TM") je glikoprotein transmembrane koji ima antikoagulantne osobine i predominantno se ekspresuje na lumenalnoj površini entodelijalnih ćelija koje oblažu krvne sudove (Esmon, N.L. et al.

(1982)J. Biol. Chem.257(2):859-864; Salem, H.H: et al. (1983)J. Biol. Chem.259(19): 12246-12251). Zreli, TM pune dužine je modularni protein sa 557 ostataka amino kiseline sastavljen od 5 strukturalnih domena: N-krajnji, hidrofobični region (ostatci 1-226); cisteinom bogati region (ostatci 226-462); O-glikozilovani Ser/Thr-bogati region (ostatci 463-497); region hidrofobične transmembrane (ostatci 498-521); i C-krajni citoplazmični rep (ostatci 522-557).

Cisteinom bogati region uključuje šest ponovljenih struktura homogih epidermalnom faktor rasta ("EGF) prekursoru, nazvani EGF-slični, EGF-homologija ili EGF domeni. Cisteinom bogati region može biti dalje podeljen u 3 domena; EGF-sličan ponavljanja 1, 2 i 3 ("EGF123", ostatci 226-344), interdomenska omča između EGF3 i EGF4 (ostatci 345-349), i EGF-slični domeni 4, 5 i 6 ("EGF456", ostatci 350-462). Funkcija EGF456 je da posreduje u vezivanju trombina i aktiviranju proteina C. Jedno proučavanje sugeriše da peto i šesto EGF-slično ponavljanje ("EGF5", ostatci 390-407, i "EGF6", ostatci 427-462, svaki posebno) ima kapacitet da vezuje trombin (Kurosawa, S. et al. (1988)J. Biol. Chem.263(13):5993-5996); sledeće sugeriše da je EGF456 domen dovoljan da deluje kao kofaktor za trombin-posredovani protein C aktivirajuću aktivnost (Zushi, M. Et al. (1989)J. Biol. Chem.264(18):10351-10353). Ser/Thr-bogati domen pojačava sa EGF456 posredovano vezivanje trombina. Treće EGF-slično ponavaljanje ("EGF3", ostatci 311-344) je neophodno za aktiviranje trombin-aktivirajuća fibrinoliza inhibitora ("TAFI"). Nekoliko tački mutanata u EGF3 je opisano da se mešaju sa aktiviranjem TAFI (Wang, W. Et al.

(2000)J. Biol. Chem.275(30):22942-22947). Trombin™ kompleks konvertuje Protein C u aktivirani protein C ("APC"), koji povratno degradira faktore Va i VfNa, time sprečavajući dalje generisanje trombina. Prema tome, TM funkcioniše kao molkularni prekidač koji konvertuje trombin iz prokoagulanta u antikoagulant.

Kmproteina C za trombin/TM kompleks je smanjen 10 puta kada je TM lokalizovan na površini membrane (Esmon, C.T. (1995)FASEB J.9(10):946-955). Koncentracija proteina C u krvi (0,065\M) je značajno ispod izveštene Km(5 \ M) za rastvorljivi TM/trombin kompleks, te stoga utvrđuje da će TM na prokoagulantnoj površini membrane rezultirati u markiranom lokalnom pojačavaju brzine generisanja proteina C.

TM inhibira trombozu putem različitog mehanizma u odnosu na heparin ili njegove derivate. Heparin je kofaktor za antitrombin III i inhibira oba FXa i trombin kroz antitrombin lll-zavisni mehanizam. Za trombus-vezani trombin je zaštićen od dejstva antitrombina III, koji limitira antitrombotičnu efikasnost heparina ili heparina niske molekularne mase ("LMWH") na prethodno postojećim ugrušcima. Ovo objašnjava nemogućnost hparina ili LMWH da inhibira rast trombusa do koga dolazi zbog ugrušak-vezani trombin ili protrombinaza u proučavanjima na ne-humanim primatima. Nasuprot tome, rekombinantni TM smanjuje generisanjem trombina izazivanje ugruška i formiranje fibrina na način koji zavisi od doze (Mohri, M. et al. (1998)Thromb. Haemost.80(6):925-929). Inhibitorno dejstvo TM se ukida anti-protein C antitelom. Inhibiranje za ugrušak vezane prokoagulantne aktivnosti je klinički relevantno pošto prokoagulantna aktivnost vezivanja ugruška rezultira u bržem rastu trombusa i konačno do vaskularne okulzije ili tromboembolijskih komplikacija. Inhibicija rasta trombusa dopuštaju endogeni fibrinolitički sistemi da se ugrušci uklone brže i kompletnije. Dodatno, od TM se takođe očekuje da bude efektivniji od haparina kod patoloških stanja gde je plazma antitrombin ispražnjen, kao što je DIC. Dok su oba i TM i heparin inhibiraju trošenje krvnih pločica i fibrinogena kod eksperimentalnog DIC, samo je TM efektivan kada su nivoi antitrombina III ispražnjeni.

SUŠTINA PRONALASKA

Sadašnji pronalazak obezbeđuje nove fuzione proteine, koji se dejstvuju kao antikoagulantii sadrže protein za ciljanje, koji međusobno reaguje biolo sa tkivo faktorom ("TF") ili sa faktor Vila/tkivo faktor ("FVIIa/TF") kompleksom, koji je operativno povezan za trombomodulin ("TM") EGF456 domen sam ili u kombinaciji sa bar jednim drugim TM domenom odabranim od grupe koja se sastoji od N-završnog hidrofobičnog region domena, EGF123 domena, interdomena obruča između EGF3 i EGF4, i O-glikozilovanog Ser/Thr-bogatog domena, ili njihovih analoga, fragmenata, derivata i varijanti.

Antikoagulantno fuzioni protein ovog pronalaska cilja i vezuje se za TF ili FVIIa/TF kompleks na položaju povrede, lokalizujući TM za položaj povrede, tako sprečavajući formiranje trombusa, i prema tome ponaša se efektivnije kao antikoagulant upoređeno sa bilo rastvorljivim anti-TF antitelom ili rastvorljivim TM ili fragmentima TM. Fuzioni protein je efektivniji nego heparin niske molekularne mase ("LMVVH") u lečenju određenih bolesti uključujući, ali ne limitirajući na, sepsu, raširenu intravaskularnu koagulaciju, ishemični moždani udar, duboku vensku trombozu, akutne koronarne sindrome, trombotične komplikacije praćene posle angioplastike, i koagulopatiju kod uznapredovalog kancera. Dalje, fuzioni protein ima upotrebu kod mikrovaskularne operacije, presada kože i vene, i transplanta organa.

U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje sastave koji sadrže predmetne fuzione proteine.

U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak zaštite pacijenta spram formiranja tromba koji se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine fuzionog proteina ovog pronalaska navedenom pacijentu, i prema tome inhibiranja generisanja trombina bez direktnog uticanja na druge parametre osim koagulacije, kao što je aktiviranje i sakupljanje trombocita.

U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak smanjivanja i lečenja duboke venske tromboze ("DVT") ili raširene intravaskularne koagulacije ("DIC") ili akutnog koronarnog sindroma ili kancera sa podacima koagulopatije kod pacijenta koji se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine fuzionog proteina navedenom pacijentu.

U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak regulisanja inflamatornog odgovora kod pacijenta koji se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine fuzionog proteina navedenom pacijentu.

U još jednom aspektu, fuzioni protein pronalaska može se upotrebiti da se formira ne-trombogenična obloga na površini medicinskih uređaja koji dolaze u kontak sa krvlju.

U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na pribor koji sadrži fuzioni protein koji se vezuje za FVIIa/TF kompleks, i TM domene. Alternativno, pribor može sadržati DNK sekvence koje kodiraju komponente fuzionog proteina.

Takođe su otkriveni postupci za pravljenje fuzionih proteina pronalaska, i rekombinantnih i sintetičkih.

OPIS SLIKA

Slika1. Vezivanje scFv(TF)3e10 za sTF povećava očigledani afinitet sTF za FVIIa. Ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida se obavlja kao što je opisano u Primeru 5 pod nazivom "Ogled aktiviranja sTF/FVIIa" upotrebom 2 nM FVIIa u prisustvu i odsustvu 800 nM scFv(TF)3e10. sTF se titrira u ogledu i utvrđuje se brzina cepanja hromogenog supstrata (S2266). KDočigledan za sTF se izračunava upotrebom standarnog podudaranja 4-parametra.

Slika2. Merenje afiniteta vezivanja scFv(TF)3e10 za sTF. Ogled hidrolize sTF/FVIIa peptida se obavlja kao što je opisano u Primeru 5 pod naslovom "Ogled aktiviranja sTF/FVIIa" upotrebom 3 nM sTF i 2 nM FVIIa. Koncentracija sTF koja se upotrebljava se ispod KDza vezivanje za FVIIa. Vezivanje scFv(TF)3e10 antitelo smanjuje KDsTF vezivanja za FVIIa, vodeći do povećanog formiranja sTF/FVIIa kompleksa i, prema tome, brzine cepanje hromogenog supstrata S2266. ScFv(TF) se dodaje pri povećanim koncentracijama i povećana brzina reakcije se upotrebljava da se utvrdi očigledan KDantitela za sTF upotrebom standardnog podudaranja 4 parametra.

Slika3. Analiza mikrokalorimetrije pokazje da scFv(TF)3e10 ima 20-puta veći afinitet za sTF/FVIIa kompleks nego samo za sTF. Kalorimetrija izotermalne titracije se obavlja upotrebom MicroCal VP-ITC instrumenta. sTF/FVIIa kompleks se dobija doavanje 2,3 puta molarnog viška FVIIai sTF-u. Hromatografija isključivanja veličine se upotrebljava da se verifikuje daje sTF u potpunosti kompleksovan. Za utvrđivanje afiniteta antitela za kompleks, 1,2^M sTF/FVIIa kompleksa se dodaje u ćeliju mikrokalorimetra i 65 uM scFv(TF)3e10 antitela se dodaje brizgalici. Za utvrđivanje afiniteta antitela samo za sTF, dodaje se 10 uM sTF ćeliji i 141 uM scFv(TF)3e10 se dodaje brizgalici. Analiza podataka se radi upotrebom MicroCal Origin softvera. Podaci odgovaraju jediničnom položaju vezivanja.

Slika 4.scFv(TF)3e10 u zavisnosti od doze inhibira ogled aktiviranja FX. Detalji ovog ogleda su opisani u Primeru 5 pod nazivom "Ogled aktiviranja faktora X". IC50predstavlja dozu koja se zahteva da se postigne 50% maksimalne inhibicije.

Slika 5.Fuzioni protein potentnije inhibira koagulaciju nego TF antitelo ili Tmi456 sam. Ogled protrombinskog vremena se obavlja da se uporede fuzioni protein sa TF antitelom ili Tmi456 samima. Odgovarajuća zapremina koncentrovanog inhibitora, bilo TF antitela (scFv(TF)3e10), Tmi456, ili fuzionog (scFv(TF)3e10-Tmi456), se dodaje u 100\ xLrekombinantnog humanog tromboplastina (Ortho Recombiplastin). Otprilike 2 min kasnije, dodaje se 100[ iLrekonstituisane humane plazme. Vreme zgrušavanja se utvrđuje Haemoliance koagulometra. Krive odgovora na dozu se generišu za svaki inhibitor i potom se upotrebljava regresiona analiza da se izračuna koncentracija (u nM) neophodna za dvostruko produživanje vremena zgrušavanja.

Slika6. Fuzioni proteini zadržavaju punu kofaktor aktivnost za aktiviranje proteina C. Ogled opisan u Primeru 5 pod naslovom "Ogled aktiviranja proteina C (hromogeni)" sadrži 20\ xLTM uzorak, bilo TMi456, koji sadrži EGF domene 4-6 i interdomen obruč između EGF3 i EGF4, ili fuzioni (scFv(TF)3e10-Tmi456), 20 uL 1,5 uM protein C, i 20 u.L 3 nM alfa trombin. Aktiviranju se dopušta da se obavlja 1 sat. Faza aktiviranja se zaustavlja dodavanjem 20 uL 0,16 u/mL hirudina. 100 |J_ 1 mM S2266 se onda dodaje i A405 se utvrđuje svakih 10 sekundi tokom 30 minuta. Brzina reakcije je zavisna od količine generisanog aktiviranog proteina C. Podaci se izražavaju u mOD/min.

Slika7. Brzina aktiviranja proteina C fuzionim proteinom je pojačana na površinama TF-koji sadrže fosfolipid. Na brzinu aktiviranja proteina C sa Tmi456 ne utiče dodavanje TF vezikula. Ogled opisan u Primeru 5 pod naslovom "Ogled aktiviranja proteina C (na sa TF bogatom površinom)" sadrži 20 jiL TM uzorka, bilo Tmi456 ili fuzionog (scFv(TF)3e10-Tmi456), 20 uL 1,5 |uM proteina C, 20 uL 3 nM alfa trombina, i 20 uL pufera ili TF vezikula (Inovin, humani rekombinantni TF, 4X normalna koncentracija za PT). Aktiviranju se dopušta da se obavlja 1 sat. Faza aktiviranja se zaustavlja dodavanjem 20 jiL 0,16 u/mL hirudina. 100 uL 1 mM S2266 se onda dodaje i A405 se utvrđuje svakih 10 sekundi tokom 30 minuta. Brzina reakcije je zavisna od količine generisanog aktiviranog proteina C. Podaci se izražavaju u mOD/min.

Slika 8.Fuzioni protein pokazuje veću specifičnost za TF-izazvanu koagulaciju nako Tmi456. Ogled aktiviranog parcijalnog tromboplastin vremena (APTT) je osetljiv na inhibitore unutrašnjih i centralnih putanja koagulacije. Koagulacija koja se pojavljuje u ovom ogledu je nezavisna od TF. Inhibitori, bilo TF antitelo (scFv(TF)3e10), Tmi456, ili fuzioni (scFv(TF)3e10-Tmi456), se razblažuju u 50 \ iL rekonstituisane humane plazme do konačne koncentracije koja daje za dva puta produženje u PT ogledu. Kogulometar onda dodaje 50 )j.L APTT (Alexin HS) reagensa i 50 (j.L CaCI2reagensa (0,02 mol/L) i utvrđuje se vreme zgrušavanja u sekundama.

Slika 9.Fuzioni proteini potentnije inhibiraju TF-izazvanu koagulaciju cele krvi nego samo bilo koju od njenih komponenti. Koagulacija cele krvi se analizira upotrebom Haemoscope Tromboelastogragh-a (TEG) analizatora. Citratovana cela krv, 120 nM TF antitela (scFv(TF)3e10), Tmi456, ili fuzioni (scFv(TF)3e10-Tmi456) se dodaje zajedno sa 10 |j.L tromboplastin reagensa (1:64 razblaženje) i 20 jaL 0,2 M CaCI2. R-vrednost (vreme do inicijalnog formiranja fibrina) se dobija za svaki uzorak. Ova vrednost se onda konvertuje u % neinhibirane kontrolne R-vrednosti.

Slika 10.Fuzioni proteini prikazuju predvidljiviji odgovor na dozu nego LMWH u ogledu koagulacije cele krvi (TEG). Citratovana cela krv, povećane koncentracije (15 nM početna i povećana sa 2X povećanjima) fuzionog (scFv(TF)3e10-Tmi456), ili povećane koncentracije (15 nM početna i povećana sa 2X povećanjima) enoksaparina (LMVVH), se dodaju zajedno sa 10 uL tromboplastin reagensa (1:64 razblaženje) i 20 |al_ 0,2 M CaCI2. R-vrednost (vreme do inicijalnog formiranja fibrina) se dobija za svaki uzorak i podeljene spram relativne koncentracije (podešava se najniža koncentracija kao 1 za svaku (sličnu R-vrednost), onda se povećavaju potonje koncentracije 2X).

Slika 11. Fuzioni protein scFv(TF)3e10-Tmi456 je efikasan uin vivomodelu raširene intravaskularne koagulacije ("DIC"). TF-antitelo scFv(TF)3e10 i fuzioni (scFv(TF)3e10-Tmi456) se procenjuju u modelu tromboembolije kod pacova u Primeru 8 za (A) procenat smrtnosti i (B) bolesno stanje-smrtnost rezultat. (A) U sa nosačem tretiranoj grupi, upotrebljena doza TF rezultira u 60% smrtnosti (LD60). scFv(TF)3e10-Tmi456 pri 0,7 nmol/kg u potpunosti sprečava smrtnost. Za razliku od toga scFv(TF)3e10 pri 0,7 nmol/kg nema uticaja na smrt. (B) U sa nosačem tretiranoj grupi,in vivodoza TF rezultira u prosečnom rezultatu bolesno stanje-smrtnost od 2,6, zasnovano na sledećem bodovnom sistemu: 0 = bez uticaja; 1 = blagi respiratorni bol (oporavak u okviru 30 min); 2 = ozbiljni respiratorni bol (moribund, za oporavak se zahteva više od 60 min); i 3 = smrt. scFv(TF)3e10-Tmi456 od doze zavisno sprečava sa TF izazvanu smrt i respiratorni bol u okviru ED5ovrednosti od 0,46 nmol/kg (0,019 mg/kg). scFv(TF)3e10-Tmi456 pri 0,7 nmol/kg u potpunosti sprečava i smrt i respiratorni bol. Nasuprot tome, scFv(TF)3e10 pri 0,7 nmol/kg nema uticaja na smrt i mali ili nema uticaja na respiratorni bol. scFv(TF)3e10-Tmi456 je efikasniji nego 10-puta veća doza scFv(TF)3e10.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Fuzioni protein scFv(TF)3e10-Tmi456 sadašnjeg pronalaska se sastoji od proteina za ciljanje koji međusobno reaguje bilo sa tkivo faktorom ("TF") ili faktor Vila/tkivo faktor ("FVIIa/TF") kompleksom, koji je operativno vezan za trombomodulin ("TM") EGF456 domen samim ili u kombinaciji sa bar jednim drugim TM domenom odabranim od grupe koja se sastoji od N-završnog hidrofobičnog region domena, EGF123 domena, interdomen obruča između EGF3 i EGF4, i O-glikozilovanog Ser/Thr-bogatog domena, ili njihovih analoga, fragmenata, derivata ili varijanti.

Definicije:

U opisivanju sadašnjeg pronalaska, sledeći pojmovi su definisani kao što je dole naznačeno.

"Rekombinantni proteini ili polipeptidi" se odnose na proteine ili polipeptide proizvedene putem rekombinantnih DNK tehnika, odnosno, proizvedenih iz ćelija, mikrobskih ili sisarskih, transformisanih sa egzogenim DNK konstruktom koji kodira željeni polipeptid. Proteini ili polipeptidi ekspresovani u najvećem broju bakterijskih kultura će biti oslobođene od glikana. Proteini ili polipeptidi ekspresovani u kvascu mogu imati različit obrazac glikozilacije od onih ekspresovanih u sisarskim ćelijama.

"Matični" proteini ili polipeptidi se odnosi na proteine ili polipeptide dobijene iz izvora koji se pojavljuje u prirodi. Pojam "matični TM" će takođe uključiti prirodno nastali TM i njegove fragmente.

DNK "kodirajuća sekvenca" je DNK sekvenca koja se transkribuje na mRNK i prevodi u polipeptid u ćeliji domaćina kada se postavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence su utvrđene početnim kodonom na 5' N-završetku i kodonom za prekid prevođenja na 3' C-završetku. Kodirajuća sekvenca može da uključi prokariotske sekvence, cDNK iz eukariotske mRNK, genomne DNK sekvence iz eukariotske DNK, i sintetičke DNK sekvence. Sekvenca za prekid transkripcije će uobičajeno biti locirana 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu.

"Fuzioni protein" je protein koji rezultira iz ekspresije bar dve operativno homologne kodirajuće sekvence. Fuzioni protein ovog pronalaska se sastoji od proteina za ciljanje koji međusobno reaguje bilo sa TF ili FVIIa/TF kompleksom, koji je operativno povezan za trombomodulin ("TM") EGF 456 domen sam ili u kombinaciji sa bar jednim drugim TM domenom odabranim od grupe koja se sastoji od N-završnog hidrofobičnog region domena, EGF123 domena, interdomen obruča između EGF3 i EGF4, i O-glikozilovanog Ser/Thr-bogatog domena, ili njihovih analoga, fragmenata, derivata ili varijanti.

"Protein za ciljanje" je protein koji se vezuje za ili međusobno reaguje sa drugim proteinom ili protein kompleksom. Protein za ciljanje ovog pronalaska je protein koji se vezuje za ili međusobno reaguje sa TF ili FVIIa/TF kompleksom. Na primer, anti-TF ili anti-FVIIa/TF kompleks antitelo, je protein za ciljanje ovog pronalaska. Dva druga primera proteina za ciljanje su faktor Vila koji inhibira aktivni položaj ("FVIIai"), koji vezuje TF da formira neaktivni FVIlai/TF kompleks, i tkivo faktor inhibitor putanje ("TFPI"), koji moće da vezuje za i dezaktivira FVIIa/TF kompleks.

"Nukleotidna sekvenca" je heteropolimer deoksiribonukleotida (baze adenin, gvanin, timin, ili citozin). DNK sekvence koje kodiraju fuzione proteine ovog pronalaska mogu biti sakupljene iz sintetičkih cDNK-izvedenih DNK fragmenata i kratikh oligonukleotid linkera da se dobije sintetički gen koji je sposoban da bude ekspresovan u rekokombinantni ekspresioni vektor. U razmatranju strukture određenih dvostruko-vlaknastog DNK molekula, sekvence mogu biti ovde opisane prema normalnoj konvenciji dajući samo sekvence u 5' do 3' pravaca duž netranskribovanog vlakna cDNK.

"Rekombinantni ekspresioni vektor" je DNK konstrukt koji se može replicirati i koristi se bilo da pojača ili da ekspresuje DNK kodiranje fuzionih proteina sadašnjeg pronalaska. Ekspresioni vektor sadrži DNK kontrolne sekvence i kodirajuće sekvence. DNK kontrolne sekvence uključuju promoter sekvence, položaje vezivanja ribozoma, signale poliadenilacije, sekvence za prekid transkripcije, uzlazno regulatorne domene i pojačivače. Rekombinantni ekspresioni sistemi kako su ovde definisani će ekspresovati fuzione proteine posle indukcije regulatornih elemenata.

"Transformisane ćelije domaćina" se odnosi na ćelije koje su transformisane i izmenjene infekcijom sa egzogenom DNK. Egzogena DNK može ili ne mora biti integrisana (kovalentno povezana) za hromozomsku DNK sačinjavajući genom ćelije. U prokariotima i kvascu, na primer, egzogena DNK se može održati na epizomskom elementu, kao što je plazmid ili stabilno integrisana u hromozomski DNK. U pogledu eukariotskih ćelija, stabilno transformisane ćelija je jedna u kojoj egzogena DNK postaje integrisana u replikaciju hromozoma. Ova stabilnost je demonstrirana sposobnošću eukariotskih ćelijskih linija ili klonova da proizvedu populaciju ćelija ćerki koje sadrže egzogenu DNK.

"Trombomodulin (TM)" se odnosi na endotelijalni ćelijski površinski glikoprotein koji formira kompleks visokog afiniteta sa trombinom. Geni

koji kodiraju matični TM (i njegov genimski oblik i kao cDNK) su izolovani i sekvencirani iz volova i ljudi (Jackman, R.W. et al. (1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA83(23):8834-8838 i Jackman, R.W. etal. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84(18):6425-6429, koji su oba ovde inkorporisani putem reference). Sekvence TM vola, ljudi i miša prikazuju visoki stepen homologije jedan sa drugim. cDNK humanog TM kodira 60,3 kDa protein od 575 amino kiselina, uključujući signalnu sekvencu od oko 18 amino kiselina, videti n.pr., U.S. Patent 5,827,824.

Kada se trombin vezuje za TM može biti hiljadu puta ili više povećanje brzine aktiviranja proteina C što formira proteina C koji aktivira antikoagulantni enzim. Dodatno, kda je trombin vezan za TM, trombin više ne radi kao prokoagulantni enzim. Specifično, formiranje trombin-katalizovani fibrin, aktiviranje faktora V, i aktiviranje trombocita, su svi inhibirani u prisustvu TM. Tako, TM konvertuje trombin u fiziološki antikoagulant.

"Trombomodulin (TM) domen" se odnosi na odvojenu sekvencu amino kiseline koja može biti povezana sa određenom funkcijom ili karakteristikom TM, kao što je karakteristična tercijarna strukturalna jedinica. TM gen pune dužine kodira prekursor ili pro-polipeptid koji sadrži sledeće domene: amino kiseline -18—1 je signalna sekvenca; amino kiseline 1-226 je N-završni hidrofobični region; amino kiseline 227-462 je cisteinom-bogati region; koji se sastoji od 6 tandemskih EGF-sličnih ponavljanja zajedno sa malim interdomen peptidima i obručima; amino kiseline 463-497 je O-glikozilovani Ser/Thr-bogati region; amino kiseline

498-521 je hidrofobični transmembrana region; i amin kiseline 522-5557 je C-karjni citoplazmatični rep. Cisteinom-bogati region može biti dalje podeljen na 3 domena: amino kiseline 226-344 je EGF123, koji se sastoji od EGF-sličnih ponavljanja 1, 2 i 3 (ostatci 226-344); amino kiseline 345-349 je interdomen obruč između EGF3 i EGF4; i amino kiseline 350-462 je EGF456, koji se sastoji od EGF-sličnih domena 4, 5 i 6. Videti n.pr., Yost, C.S. et al. (1983)Cell34(3):759-766; Wen, D.Z. et al. (1987)Biochemistry26(14):4350-4357; i Wang, W. et al. (2000),supra,koji su svi inkorporisani ovde putem reference.

Pojmovi "analog", "fragment", "derivat", i "varijanta", kada se odnose na fuzione proteine ovog pronalaska, kao i na proteine za ciljanje i TM domen(e), znače analoge, fragmente, derivate i varijante fuzionih proteina, proteina za ciljanje i TM domena koji zadržavaju suštinski istu biološku funkciju ili aktivnost, kao što je dole dalje opisano.

"Analog" uključuje pro-polipeptid koji u okviru toga uključuje, sekvencu amino kiseline fuzionog proteina ovog pronalaska. Aktivni fuzioni protein ovog pronalaska može se cepati iz dodatnih amino kiselina da se završi stvaranje molekula pro-fuzionog proteina putem prirodnih,in vivopostupaka ili putem postupaka poznatim stručnjacima iz ove oblasti nauke kao što su enzimsko i hemijsko cepanje. Na primer, matični TM se prirodno ekspresuje kao 575 pro-polipeptid amino kiseline koji se onda procesuirain vivoda se oslobodi 575 aktivni zreli polipeptid amino kiseline.

"Fragment" je deo fuzionog proteina, proteina za ciljanje ili TM domena koji zadržava suštinski sličnu funkcionalnu aktivnost, kao što je prikazano uin vitroogledima ovde otkrivenim kao što je opisano dole u daljem tekstu.

"Derivat" uključuje sve modifikacije fuzionog proteina koji suštinski čuvaju funkcije koje su ovde otkrivene i uključuje dodatnu strukturu i zavisnu funkciju, n.pr. PEGilovane fuzione proteine koji imaju veći polu-život, O-glikozilovane fuzione proteine modifikovane dodavanjem hondroitin sulfata, i biotinilovane fuzione proteine, kao što je dole u daljem tekstu opisano.

"Suštinski slična funkcionalna aktivnost" i "suštinski ista biološka funkcija ili aktivnost" svaki znači da je stepen biološke aktivnosti koja je u okviru 30% do 100% ili više od biološke aktivnosti koja se demonstrira polipeptidom sa kojim se upoređuje kada je biološka aktivnosti svakog polipeptida utvrđena istim postupkom ili ogledom. Na primer, fuzioni protein ili TM domen(i) koji ima suštinski sličnu funkcionalnu aktivnost sa antitelom iz Primera 2 (SEQ ID NO:2) je ono koja, kada se testira u ogledu aktiviranja proteina C (hromogeni) opisanom u Primeru 5, demonstrira akumuliranje aktiviranog proteina C. Protein za ciljanje koji ima suštinski sličnu funkcionalnu aktivnost sa anti-TF antitelom Primera 1 (SEQ ID NO:1) je ono koje, kada se testira u ogledu sTF/FVIIa ili ogledima aktiviranja FX opisanim u Primeru 5, demonstrira sposobnost da se vezuje za ili neutrališe TF ili FVIIa/TF kompleks.

"Sličnost" između dva polipeptida se utvrđuje upoređivanjem sekvence amino kiseline i njenih konzervisane zamena amino kiseline polipeptida prema sekvenci drugog polipeptida. Takve konzervativne supstitucije uključuju one opisane gore uThe Atlas of Protein Sequence and Structure 5od strane Dayhoff-a (1978) i od strane Argos-a (1989) EMBO J. 8:779-785. Na primer, amino kiseline koje pripadaju jednoj od sledećih grupa predstavljaju konzervativne promene:

-Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, lle, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His;

-Phe, Tyr, Trp, His; i

-Asp, Glu.

Svi ostali tehnički pojmovi koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje kao što se uobičajeno upotrebljavaju od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke kojima sadašnji pronalazak i pripada.

Protein za ciljanje:

Protein za ciljanje ovog pronalaska je protein koji ima sposobnost da se specifično vezuje za određeni prethodno odabrani ciljani molekul, n.pr., TF ili FVIIa/TF kompleks, i potom služi da usmeri fuzioni protein ka ćeliji ili tkivu koje nosi prethodno odabrani ciljani molekul.

U jednoj realizaciji ovog pronalaska, ciljani protein je antitelo koje može da se vezuje za i neutrališe TF ili FVIIa/TF kompleks. "Antitelo" kako se to ovde koristi uključuje nedirnute molekule imunoglobulina ("Ig"), kao i njihove fragmente, kao što su Fab, F(ab')2, i Fv, koji su sposobni da vezuju epitop TF ili FVIIa/TF kompleksa. Tipično treba bar 6, 8, 10 ili 12 dodirnih amino kiseline da se formira epitop. Pa ipak, epitopi koji uključuju ne-dodirne amino kiseline mogu zahtevati više, n.pr. bar 15, 25 ili 50 amino kiselina.

Tipično, antitelo koje se vezuje specifično za TF ili FVIIa/TF kompleks obezbeđuje detekcioni signal bar 5-, 10-, ili 20-puta veći nego detekcioni signal koji je obezbešen sa drugim proteinima kada se koriste u imunohemijskom ogledu. Pretpostavljeno, antitela koja se ne vezuju specifično za TF ili FVIIa/TF kompleks ne detektuju druge proteine u imunohemijskim ogledima i mogu da imunotalože TF ili FVIIa/TF kompleks iz rastvora.

TF ili FVIIa/TF kompleks može biti upotrebljen da imunizuje sisara, kao što je miš, pacov, zec, zamorče, majmun, ili čovek da se proizvedu poliklonalna antitela. Ukoliko se to želi, TF ili FVIIa/TF kompleks mogu biti konjugovani za protein nosač, kao što je volovski serum albumin, tiroglobulin, i prilepak za praćenje hemocijanin. U zavisnosti od vrste domaćina, različiti adjuvanti se mogu upotrebiti da se poveća imunološki odgovor. Takvi adjuvanti uključuju, ali nisu limitirani na, Freund-ov adjuvant, mineralne gelove (n.pr., aluminijum hidroksid), i površinski aktivne supstance (n.pr., lizolecitin, pluronski polioli, polianjoni, peptidi, uljane emulzije, prilepak za praćenje hemocijanin, i dinitrofenol). Između adjuvanata upotrebljenih kod ljudi, BCG( bacilli Calmette- Guerin)iCornybacterium parvumsu posebno korisni.

Monoklonalna antitela koja se vezuju specifično na odabrani ciljani protein mogu se pripremiti upotrebom tehnike koja obezbeđuje proizvodnju molekula antitela putem kontinuiranih ćelijskih linija u kulturi. Ove tehnike uključuju, ali nisu limitirane na, hibridoma tehniku, humanu B-ćelija hibridoma tehniku, i EBV-hibridoma tehniku (Kohler et al. (1985)Nature256:495-497; Kozbor et al. (1985)J. Immunol. Methods81:31-42; Cote et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:2026-2030; i Cote et al. (1984)

Mol. CellBiol. 62:109-120).

Dodatno, mogu se upotrebiti tehnike razvijene za proizvodnju "himeričnih antitela", spletenih mišjih antitelo gena za humane antitelo gene da se dobije molekul sa odgovarajućom antigen specifičnošću i biološkom aktivnošću (Morrison et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855; Neubergeret al. (1984)Nature312:604-608; Takeda et al. (1985)Nature314:452-454). Monoklonalna i druga antitela mogu se "humanizovati" da se spreči kod pacijenta sklapanje imunog odgovora spram antitela kada se upotrebljava terapeutski. Takva antitela mogu biti dovoljno slična u sekvenci sa humanim antitelima da se mogu direktno upotrebiti u fuzionom proteinu ili mogu zahtevati menjanje nekoliko ključnih ostataka. Razlike u sekvenci između antitela glodara i humanih sekvenci mogu biti minimizirane zamenom ostataka koji se razlikuju od onih kod humanih sekvenci putem mutageneze usmerene na položaj individualnih ostataka ili putem presađivanja celih regiona koji određuju komplementarnost. Alternativno, humanizovana antitela mogu se proizvesti upotrebom rekombinantnih postupaka, kao što je opisano u GB2188638B. Antitela koja se vezuju specifično na odabrani ciljani protein mogu sadržati antigen-vezujuće položaje koji su bilo delimično ili u potpunosti humanizovani, kao što je otkriveno u U.S. Patent-u 5,565,332.

Alternativno, tehnike opisane za proizvodnju jedno-lančanih antitela mogu biti adaptirane upotrebom postupaka poznatih u nauci da se proizvedu jedno-lančana antitela koja se vezuju specifično na TF ili FVIIa/TF kompleks. Antitela sa odnosnom specifičnošću, ali sa različitim idiotipskim sastavom, mogu biti generisana putem povlačenja lanca iz nasumičnih kombinatornih Ig biblioteka (Burton (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:11120-11123).

Jedno-lančana antitela mogu takođe da se konstruišu upotrebom DNK postupka pojačavanja, kao što je PCR, upotrebom hibridoma cDNK kao uzorka (Thirion et al. (1996)Eur. J. CancerPrev.5:507-511). Jedno-lančana antitela mogu biti mono- ili bispecifična, i mogu biti bivalentna ili tetravalentna. Konstrukcija tatravalentnih, bispecifičnih jedno-lančanih antitela se uči, na primer, kod Coloma and Morrison (1997)Natl. Biotechnol.15:159-163. Konstrukcija bivalentnih, bispecifičnih jedno-lančanih antitela se uči kod Mallendar and Voss (1994)J. Biol. Chem.269:199-216.

Nukleotidna sekvenca koja kodira jedno-lančano antitelo može biti konstruisana upotrebom manualne ili automatizovane sinteze nukleotida, klonirana u ekspresioni konstrukt upotrebom standarnih rekombinantnih DNK postupaka, i uvedena u ćeliju da ekspresuje kodirajuću sekvencu. Alternativno, jedno-lančana antitela mogu biti proizvedena direktno upotrebom, na primer, tehnologije izlaganja filamentne fage (Verhaaret al.

(1995)Int. J. CancerM :497-501;i Nicholis et al. (1993)J. Immunol. Meth.165:81-91).

Antitela koja se vezuju specifično za TF ili FVIIa/TF kompleks mogu biti takođe proizvedena putem izazivanjain vivoproizvodnje u populaciji limfocita ili putem pretraživanja Ig biblioteka ili panela krajnje specifičnih reagensa za vezivanje kao što je otkriveno u literaturi (Orlandi et al.

(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:3833-3837; VVinter et al. (1991)Nature349:293-299).

U sledećoj realizaciji ovog pronalaska, protein za ciljanje je ostatak za ciljanje osim antitela koje se može vezati za i neutralisati TF. Dva takva primera su faktor Vila koji inhibira aktivni položaj (FVIIai) i inhibitor putanje tkivo faktora (TFPI).

I FVIIa i FVIIai formiraju kompleks visokog afiniteta sa TF (Sorenson, B.B. i Rao, L.V. (1998)Blood Coagul. Fibrinoliysis9(Suppl 1):S67-71). FVIIai je TF neutrališući antikoagulant koji deluje putem takmičenja sa endogenim FVIIa za vezivanje na izloženi TF. FVIIai inhibira sposobnost proolitički aktivnog FVIIa da formira kompetentni FVIIa-TF kompleks i na ovaj način inhibira iniciranje koagulacije. Putem gentskog spajanja TM domena za FVIIai, TM može biti ciljan ka TF-bogatim protrombotičkim površinama.

cDNK koja kodira humani FVII je izolovana i sekvencirana (Hagen, H.S. et al. (1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA83(8):2412-2416, koji je ovde inkorporisan putem reference). Humani FVII cDNK može biti napravljena putem standardnih rekombinantnih DNK tehnika počevši od mRNK izolovane iz humane jetre. FVIIai može biti napravljena mutiranjem aktivnog položaja serina standardnim rekombinantnim DNK tehnikama ili putem hemijskog tretiranja katalitički aktivnog FVIIa sa peptidil hlorometilketonom, koji ireverzibilno modifikuje i inhibira aktivni položaj.

TFPI cilja i inhibira FVIIa/TF kompleks na FXa zavisni način (Salemink, I.

et al. (1999)J. Biol. Chem.274(40):28225-28232). TFPI prvo vezuje FXa i potom TFPI-FXa kompleks vezuje za i inhibira FVIIa/TF kompleks. Putem genetičkog spajanja TM domena za TFPI, TM može da bude ciljan ka TF-bogatim protrombotičkim površinama.

cDNK koja kodira humani TFPI je izolovana i sekvencirana (Wun, T.C. et al. (1988)J. Biol. Chem.263(13):6001-6004, koji je ovde inkorporisan putem reference). Humani TFPI cDNK može biti napravljena putem standardnih rekombinantnih DNK tehnika počevši od mRNK izolovane iz humane jetre.

Protein za ciljanje ovog pronalaska (odnosno, antitela ili drugi relevantni proteini) mogu biti ekspresovani i prečišćeni postupcima dobro poznatim u nauci. Na primer, antitela i proteini mogu pročišćenog afiniteta putem prolaza kroz kolinu za koju se TF vezuje. Vezana antitela ili proteini mogu biti elutovani iz koline upotrebom pufera sa visokom koncentracijom soli.

U jednoj pretpostavljenoj realizaciji ovog pronalaska, protein za ciljanje je TF-vezujuće scFv antitelo koje inhibira aktiviranje FX sa FVIIa/TF kompleksom i ne takmiči se sa FVIIa vezivanjem. Da bi se proizvelo TF-vezujuće scFv antitelo, humana biblioteka antitela HuPhaBL3, koja je izložena u filamentnoj fagi, se odabire spram imobilisanog rastvoljivog TF. Antitela iz TF vezujuće fage se prekomerno ekspresuje u E. coli i afinitet se prečišćava upotrebom e-označene kolone. Prečišćena antitela se dalje karakterišu upotrebom BlAjezgra, ogleda sTF zavisnog faktora Vila (sTF/FVIIa ogled), ogleda aktiviranja FX, i PT ogleda. Sekvenca TF-vezujućeg scFv antitela, označenog kao scFv(TF)3e10, je prikazana u Primeru 1 i odgovara SEQ ID NO: 1. Izolovanje, proizvodnja i karakterizacija TF-vezujućeg scFv antitela je opisana u donjem tekstu detaljnije.

Trombomodulin:

Deo TM domena fuzionog proteina deluje kao kofaktor za trombinom katalizovano aktiviranje proteina C, koji povratno degradira faktore Va i Vllla time sprečavajući dalje formiranje trombusa. Domeni TM uključuju, n.pr., N-završni hidrofobični region domen, EGF123 domen, interdomen obruč između EGF3 i EGF4, EGF456 domen, i O-glikozilovan Ser/Thr-bogati region domen. EGF456 domen, posebno, posreduje vezivanje trombina i aktiviranje proteina C (Kurosavva, S. et al. (1988),supra;i Zushi, M. et al. (1989)supra).U pretpostavljenim realizacijama ovog pronalaska, deo TM domena fuzionog proteina se sastoji samo od EGF456 domena ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih TM domena. U još poželjnijoj realizaciji ovog pronalaska, EGF456 domen sadrži tačke mutacije koje stvaraju protein otpornijim na oksidativno oštećenje i proteaze i/ili povećava njegovu katalitičku efikasnost.

DNK sekvenca pune dužine koja kodira humani TM olakšava pripremanje gena i upotrebljava se kao početna tačka za konstrukt DNK sekvenci koje kodiraju TM peptide i fuzione proteine koji sadrže TM i fragmente/peptide

TM.

Gen pune dužine za TM može biiti pripremljen putem nekoliko postupaka. Humane genomne biblioteke su komercijalno dostupne. Oligonukleotidne probe, spicifične za ove gene, mogu biti sintetizovane upotrebom objavljene sekvence gena. Poznati su postupci za pretraživanje genomnih biblioteka sa oligonukleotidnim probama. Oobjavljivanje sekvence gena za TM demonstrira da ne postoje introni u okviru regiona za kodiranje. Tako, genomni klon obezbedjuje neophodni početni materijal za konstrukt i

plazmid ekspresije za TM upotrebom poznatih postupaka.

TM koji kodira DNK fragment može se povratiti korišćenjem prednosti restrikcije položaja endonukleaze koji su identifikovani u regionima koji su bočni ili unutrašnji za gen. (Jackman, R.W. et al.(1987), supra).Alternativno, geni pune dužine mogu takodje biti dobijeni iz banke cDNK. Na primer, mesendžer RNK pripremljena iz endotelijalnih ćelija obezbedjuje odgovarajući početni materijal iz pripremanja cDNK. Postupci za pravljenje banaka cDNK su dobro poznati (videti n.pr., Sambrook, J.F. et al., Molecular Cloning: A laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv (1989), koji je ovde inkorporisan putem reference).

Fuzioni protein:

Antikoagulantni fuzioni protein ovog pronalaska sadrži protein za ciljanje koji se vezuje bilo na TF ili na FVIIa/TF kompleks, i koji je operativno vezan za TM EGF456 domen sam ili u kombinaciji sa bar još jednim drugim TM domenom odabranim od grupe koja se sastoji od N-završnog hidrofobičnog region domena, EGF123 domena, interdomena obruča izmedju EGF3 i EGF4, i O-glikozilovanog Ser/Thr-bogatog domena, ili njihovih analoga, fragmenata, derivata ili varijanti. Fuzioni protein može da sadrži protein za ciljanje vezan sa domenima TM u bilo kojoj kombinaciji.

U jednoj posebno pretpostavljenoj realizaciji, fuzioni protein se sastoji od antitela koje vezuje TF, operativno vezanog za TM EGF456 domen i interdomena obruča izmedju EGF3 i EGF4 ("Tmi456"), ili njihovih analoga, fragmenata, derivata ili varijanti.

Fuzioni protein sadašnjeg pronalaska uključuje, ali nije limitiran na konstrukte u kojima je C-krajnji deo jedno-lančanog antitela spojen za N-krajnji deo analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, C-krajnji deo IgG antitela koje je spojeno za N-krajnji deo analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, C-krajnji deo Fab antitela koje je spojeno sa N-krajnjim delom analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, N-krajnji deo jedno-lančanog antitela koje je spojeno za C-krajnji deo analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, N-krajnji deo IgG antitela koji je spojen za C-krajnji deo analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, N-krajnji deo Fab antitela koje je spojeno za C-krajnji deo analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, više od jednog jedno-lančanog antitela koje je spojeno za oba N-krajnje i C-krajnje delove analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, više od jednog IgG antitela koje je spojeno za oba N-krajnje i C-krajnje delove analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, više od jednog Fab antitela koje je spojeno za oba N-krajnje i C-krajnje delove analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena, i sada više od jednog analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena koji je spojen za oba N-krajnje i C-krajnje delove jedno-lančanog antitela, više od jednog analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena koji je spojen za oba N-krajnje i C-krajnje delove IgG antitela, više od jednog analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena koji je spojen za oba N-krajnje 1 C-krajnje Fab antitela, jednog od više analoga, fragmenta, derivata ili varijante TM domena koji je spojen za oba N-krajnje i C-krajnje delove dimernog jedno-lančanog antitela.

Fuzioni proteini sadašnjeg pronalaska uključuju fuzione proteine iz primera 2 (SEQ ID NO:2) i 3 (SEQ ID NO:3), kao i sve one fuzione proteine koji imaju nesupstancijalne varijacije u sekvenci iz njih. "Nesupstancionalna varijacija" će uključivati bilo koju sekvencu, supstituciju, ili varijantu uklanjanja koja zadržava suštinski bar jednu biološku funkciju polipeptida ovog pronalaska, pretpostavljeno aktivnost kofaktora za aktiviranje proteina C sa trombinom posredovano. Ovi funkkcionalni ekvivalenti mogu pretpostavljeno uključiti fuzione proteine koji imaju bar oko 90% identičnost sa fuzionim proteinima od SEQ ID NO s:2 ili 3, i poželjnije bar 95% SEQ ID NO s:2 ili 3, i još pooželjnije bar 97% SEQ ID NOs:2 ili 3, a takodje uključuju delove takvih fuzionih proteina koji suštinski imaju istu biološku aktivnost. Pa ipak, bilo koji fuzioni protein koji ima nesupstancijalnu varijaciju u sekvenci aminokiseline iz fuzionih proteina od SEQ ID Nos:2 i 3 koji demonstrira funkcionalnu ekvivalenciju kao što je ovde dalje opisano je uključen u opis sadašnjeg pronalaska.

U sledećoj realizaciji, fuzioni protein sadrži antitelo koje vezuje TF operativno vezan za TM domen EGF3, koji je neophodan da se aktivira aktivator fibrinolize koji se trombinom može aktivirati (TAFI).

Analozi, fragmenti, derivati i verijante:

Analog, fragment, derivat ili varijanta fuzionih proteina mogu biti: (i) jedan u kome su jedan ili više ostataka amino kiseline supstituisani sa konzervisanim ili nekonzervisanim ostatkom amino kiseline (pretpostavljeno konzervisanim ostatkom amino kiseline) i takav supstituisani ostatak amino kiseline može ili ne mora biti onaj koji je kodiran putem genetičkog koda; ili (ii) jedan u kome jedan ili više ostataka amino kiseline uključuje supstituent grupu, ili (iii) jedan u kome je zreli fuzioni protein spojen sa drugim jedinjenjem, kao što je jedinjenje koja povećava polu-život fuzionog proteina (na primer, polietilen glikol), ili (iv) jedno u kom su dodatne amino kiseline spojene za zreli fuzioni protein, kao što su vodeća ili sekreciona sekvenca ili sekvenca koja se upošljava za prečišćavanje zrelog fuzionog proteina, ili (v) jedan u kome je polipeptidna sekvenca fuzionisana sa većim polipeptidom, odnosno, humanim albuminom, antitelom ili Fc, radi povećanog trajanja dejstva. Takvi analozi, fragmenti, derivati, i varijante se smatraju da su u okviru ovde datih učenja za stručnjaka iz ove oblasti nauke.

Pretpostavljeno, derivati sadašnjeg pronalaska će sadržati konzervativne supstitucije amino kiseline (dalje u donjem tekstu definisane) sačinje na jednom ili više predviđenih, pretpostavljeno ne-esencijalnih ostataka amino kiseline. "Ne-esencijalni" ostatak amino kiseline je ostatak koji može biti zamenjen iz sekvence divljeg tipa proteina bez druge biološke aktivnosti, pri čemu se zahteva "esencijalni" ostatak amino kiseline za biološku aktivnost. "Supstitucija konzervativne amino kiseline" je ona u kojoj je ostatak amino kiseline zamenjen sa ostatkom amino kiseline koja ima sličan bočni lanac. Familije ostataka amino kiseline koje imaju slične bočne lance su definisane u nauci. Ove familije uključuju amino kiseline sa osnovnim bočnim lancima (n.pr., lizin, arginin, histidin), kiseli bočni lanci (n.pr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenapunjeni polarni bočni lanci (n.pr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (n.pr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-račvasti bočni lanci (n.pr., treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (n.pr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Nekonzervisane supstitucije neće biti napravljene za konzervisane ostatke amino kiseline ili za ostatke amino kiseline koje se nalaze u okviru konzervisanog protein domena, osim ukoliko se nekonzervisane supstitucije ne čine da stvore rezultirajući fuzioni protein otpornijim na oksidativna oštećenja i proteaze i/ili povećava njegovu katalitičku efikasnost. Fragmenti ili biološki aktivni delovi uključuju fragmente polipeptida koji odgovaraju za upotrebu kao medikament, kao reagens za proučavanje, i slično. Fragmenti uključuju peptide koji sadrže sekvence amino kiseline dovoljno slične sa ili izvedene iz sekvenci amino kiseline fuzionog proteina ovog pronalaska i prikazuju bar jednu aktivnost tog polipeptida, ali koji uključuju manje amino kiselina nego polipeptidi pune dužine koji su ovde otkriveni. Tipično, biološki aktivni delovi se sastoje od domena ili motiva sa bar jednom aktivnošću polipeptida. Biološki aktivni deo polipeptida može biti peptid koji je, na primer, dužine 5 ili više amino kiselina. Takvi biološki aktivni delovi mogu biti pripremljeni sintetički ili putem rekombinantnih tehnika i mogu biti ocenjeni za jednu ili više funkcionalnih aktivnosti polipeptida ovog pronalaska putem sredstava koja su ovde otkrivena i/ili su dobro poznata u nauci.

Šta više, pretpostavljeni derivati sadašnjeg pronalaska uključuju zrele fuzione proteine koji su spojeni sa drugim jedinjenjem, kao što je jedinjenje za povećanje polu-života polipeptida i/ili smanjenje potencijalne imunogeničnosti polipeptida (na primer, polietilen glikol, "PEG"). PEG se može upotrebiti da daju rastvorljivost u vodi, veličinu, sporu brzinu čišćenja bubrega, i smanjenu imunogeničnost prema fuzionom proteinu. Videti n.pr., U.S. Patent 6,214,966. U slučaju PEGilacija, spajanje fuzionog proteina za PEG može se postići prvo uvođenjem cistein mutacije u fuzionom proteinu, praćeno sa po položaju specifičnom dervitaizacijom sa PEG-maleimidom. Cistein može biti dodat C-završetku peptida. Videti, n.pr., Tsutsumi et al. (2000)Proc. Natl. Sci. USA97(15):8548-8553. Sledeća modifikacija koja može biti načinjena fuzionom proteinu uključuje biotinilaciju. U određenim instancama, može biti korisno da se ima biotinilovan fuzioni protein tako da može spremno da reakuje sa streptavidinom. Postupci biotinilacije proteina su dobro poznati u nauci. Dodatno, hondroitin sulfat može biti povezan sa fuzionim proteinom.

Varijante antitela ovog pronalaska uključuju polipeptide koji imaju sekvencu amino kiseline dovoljno sličnu sekvenci amino kiseline originalnih fuzionih proteina, koji ciljaju proteine i TM domen(e). Pojam "dovoljno sličnu" znači da prva sekvenca amino kiseline sadrži dovoljan ili minimalan broj identičnih ili ekvivalentnih ostataka amino kiseline u odnosu na drugu sekvencu amino kiseline tako da prva i druga sekvenca amino kiseline imaju zajednički strukturalni domen i/ili zajedničku funkcionalnu aktivnost. Na primer, sekvence amino kiseline koje sadrže zajedinički strukturalni domen koji je bar 45%, pretpostavljeno 75% do 98% identičan, su ovde definisane kao dovoljno slične. Pretpostavljeno, varijante će biti dovoljno slične sekvenci amino kiseline pretpostavljenih fuzionih proteina ovog pronalaska. Varijante uključuju varijante fuzionih proteina koji su kodirani od strane polinukleotida koji hibridizuje na polinukleotid ovog pronalaska ili njegov komplement pod strogim uslovima. Takve varijante generalno zadržavaju funkcionalnu aktivnost fuzionih proteina ovog pronalaska. Biblioteke fragmenata polinukleotida mogu biti upotrebljene da se generišu raznolike populacija fragmenata za pretraživanje i potonje odabiranje. Na primer, biblioteka fragmenata može biti generisana tretiranjem dvostruko-vlaknastog PCR fragmenta polinukleotida sa nukleazom pod uslovima gde dolazi do slaganja samo oko jedanput po molekulu, denaturišući dvostruko-vlaknaste DNK, ponovo naturišući DNK da se formira dvostruko-vlaknasta DNK koja može da uključi sens/antisens parove iz različito složenih proizvoda, uklanjajući jedno-vlaknaste delove iz reformisanih dupleksa tretmanom sa S1 nukleazom, i ligatovanjem rezultirajuće biblioteke fragmenta u vektor ekspresije. Ovim postupkom, može se izvesti biblioteka ekspresije koja kodira N-završetak i unutrašnje fragmente različitih veličina fuzionih proteina ovog pronalaska.

Varijante uključuju fuzione proteine koji se razlikuju u sekvenci amino kiseline usled mutageneze. Varijante koje imaju aktivnost kofaktora za trombin-posredovana proteinom C aktivnost mogu biti identifikovanje pretraživanjem kombinatornih biblioteka mutanata, na primer mutanti odsecanja ili tačke, fuzionih proteina ili TM domena ovog pronalaska upotrebom ogleda aktiviranja proteina C opisanog u Primeru 5. Varijante koje imaju TF ili FVIIa/TF kompleks-vezujuću aktivnost mogu biti identifikovane pretraživanjem kombinatornih biblioteka mutanata, na primer mutanti odsecanja ili tačke, fuzionih proteina ili proteina za ciljanje ovog pronalaska upotrebom sTF/FVIIa ogleda ili ogleda FX aktiviranja iz Primera 5 opisanih u Primeru 5. Dodatno, bioekvivalentni analozi fuzionih proteina mogu takođe biti konstruisani putem pravljenja različitih supstitucija na ostatcima ili sekvencama u delu TM domena fuzionog proteina što može da učini fuzioni protein otpornijim na oštećenje od oksidacije ili proteaze, videti n.pr. U.S. Patent 5,827,824, ili da poveća katalitičku efikasnost fuzionog proteina, videti n.pr. Adler, M. et al. (1995)J. Biol. Chem.270(40):23366-23372, i PCT patentnu prijavu WO 01/98352, objavljenu 27. decembra 2001.godine a to je sve inkorporisano ovde putem reference.

U jednoj realizaciji, raznolika biblioteka varijanti se generiše kombinatornom mutagenezom na nivou nukleinske kiseline i kodira se putem biblioteke raznolikih gena. Raznolika biblioteka varijanti može biti proizvedena sa, na primer, enzimski ligatovanjem smeše sintetičkih oligonukleotida u sekvencama gena tako da se degenerisani set potencijalnih varijanti sekvenci amino kiseline može ekspresovati kao individualni polipeptidi, ili, alternativno, kao set većih fuzionih proteina (na primer, izložba fage) koji sadrži unutra set sekvenci. Postoje različiti postupci koji se mogu upotrebiti da se proizvedu biblioteke potencijalnih varijanti iz degenerisane oligonukleotid sekvence. Hemijska sinteza degenerisane gen sekvence može biti obavljena u automatskom DNK sintetizeru, i sintetički gen potom ligatovan u odgovarajući vektor ekspresije. Upotreba degenerisanog seta gena dopušta snabdevanje, u jednoj smeši, svih sekvenci koje kodiraju željeni set potencijalnih sekvenci varijanti. Postupci sintetizovanja degenerisanih oligonukleotida su poznati u nauci (videti, n.pr., Narang (1983)Tetrahedron39:3; Itakura et al.

(1984a)Annu. Rev. Biochem.53:323; Itakura et al. (1984b)Science198:1056; Ikeetal.(1983) Nucleic Acid Res.11:477).

Nekoliko tehnika je poznato u nauci za pretraživanje gen proizvoda kombinatornih biblioteka sačinjenih putem mutacija ili odsecanja, i za pretraživanje cDNK biblioteka za gen proizvode koji imaju odabranu osobinu. Takve tehnike se mogu adaptirati za brzo pretraživanje biblioteke gena generisanih putem kombinatorne mutageneze fuzionih proteina, kao i proteina za ciljanje i TM domena, za aktivnost kofaktora za trombin-posredovane proteinom C aktivnost ili TF- ili FVIIa/TF kompleks-vezujuću aktivnost. Najšire korištene tehnike, koje su podložne analizi visoke propustljivosti za pretraživanje velikih gen biblioteka tipično uključuju kloniranje gen biblioteke u vektore ekspresije koji se mogu replicirati, transformisanje odgovarajućih ćelija sa rezultujućom biblotekom vektora i ekspresovanje kombinatornih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti potpomaže izolovanje vektora koji kodira gen čiji je proizvod detektovan. Rekurzivna ansambl mutageneza (REM), tehnika koja pojačava frekvenciju funkcionalnih mutanata u bibliotekama, može biti upotrebljena u kombinaciji sa ogledima pretraživanja da se identifikuju željene varijante.

Proizvodnja fuzionih proteina:

Fuzioni protein ovog pronalaska je proizveden spajanjem proteina za ciljanje za, ili drugačije vezivanje njega na, TM domen(e) ili njegove analoga, fragmenta, derivata ili varijante putem postupka poznatog stručnjacima iz ove oblasti nauke. Dve komponente mogu biti hemijski vezane zajedno putem bilo koje od različitih vrlo dobro poznatih hemijskih procedura. Na primer, veza može biti putem heterobifunkcionalnih unakrsnih-linkera, n.pr., SPDP, karbodiimida, glutaraldehida, ili slično.

U poželjnijoj realizaciji protein za ciljanje ovog pronalaska može biti spojen za TM domen(e) putem rekombinantnih sredstava kao što je kroz upotrebu rekombinantnih DNK tehnika da se proizvede nukleinska kiselina koja kodira oba protein za ciljanje i polipeptid koji kodira TM domen(e) i ekspresuje DNK sekvencu u ćeliju domaćina kao što jeE. coliili sisarska ćelija. DNK koja kodira fuzioni protein može biti klonirana u cDNK ili u genomni oblik putem bilo kojeg postupka kloniranja poznatog stručnjacima iz ove oblasti nauke. Videti na primer, Sambrook, J.F. et al. (1989)supra.U slučaju gde je protein za ciljanje antitelo, jednom kada se DNK sekvenca identifikuje da kodira Fv region koji kada je ekspresovan pokazuje specifičnu aktivnost vezivanja, fuzioni proteini koji sadrže Fv region mogu biti pripremljeni postupcima poznatim stručnjaku iz ove oblasti nauke. Tako, na primer, Chaudharv, V.K.et al. (1989)Nature339(6223): 394-397; Batra, J.K. et al. (1990)J. Biol. Chem.265(25): 15198-15202; Batra, J.K. et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86(21 ):8545-8549; Chaudharv, V.K. et. al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87(3): 1066-1070, svi inkorporisani putem reference, opisuju pripremanje različitih fuzionih proteina jedno-lančanog antitela. Fv region može biti spojen direktno za Trn domen(e) ili može biti pridružen putem linker sekvence. Linker sekvenca može prosto biti prisutna da obezbedi prostor izmedju ostatka koji se cilja i TM domen(a) ili da olakša mobilnost izmedju ovih regiona da im omogući da svaki postigne njihovo optimalno ravnanje. DNK sekvenca koja sadrži konektor može takodje obezbediti sekvence (kao što su prajmer ili položaj restrikcije) da se olakša kloniranje ili mogu sačuvati ram za čitanje izmedju sekvence koja kodira ostatak za ciljanje i sekvence koja kodira TM domen(e). Dizajn takvih konektor peptida će biti dobro poznata stručnjacima iz ove oblasti nauke.

U sadašnjem pronalasku, linker sekvence mogu biti upotrebljene za vezivanje proteina za ciljanje sa TM domenom(ima) u jednoj pretpostavljenoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, dve linker sekvence se upotrebljavaju u konstruisanju fuzionog proteina koji sadrži jedno-lančano antitelo i TM EGF456 domen i interdomen obruč izmedju EGF3 i EGF4 (Tmi456). Prvi povezuje teške i lake domene jedno-lančanog antitela. Prva linker sekvenca je 5 amino kiselina u dužinu. Biće očigledno da druga kratka linker sekvenca, od 0 do 10 amino kiselina može biti upotrebljena. Drugi linker u sadašnjem pronalasku je linker od 15 amino kiselina koji povezuje antitelo sa TM domenom(ima). Biće očigledno stručnjacima iz ove oblasti nauke da mnoge različite linker sekvence mogu biti upotrebljene i da to i dalje rezultira u fuzionom proteinu koji zadržava antikoagulantnu aktivnost i aktiviranje proteina C. Modifikacije postojećeg linkera će biti usmerene ka maksimiziranju pojačavanja aktiviranja proteina C na fosfolipidnim površinama koje sadrže TF.

U pretpostavljenom pristupu, jedno-lančano antitelo se priprema upotrebom izložene biblioteke fage. U prvom koraku konstruisanja izložene biblioteke fage, varijabilni geni (VH(od IgM) VKi VL) su PCR klonirani iz potopljene mRNK od humane koštane srži, limfnog čvora i slezine upotrebom seta familije specifičnih prajmera. Rezultirajuće pCITE-VH(3,8 x 10<9>članova), pZ604-VK(1,6 x 10<7>) i pZ604-VL(3,2 x 10<7>) biblioteke predstavljaju permanentnu i visoku raznolikost V gena. VHgeni se onda pojačavaju iz pCITE-VHbiblioteke. VKi VLgeni se PCR pojačavaju iz pZ604-VKi pZ604-VLbiblioteke sa reversnim JHi linker sekvencom na 5' kraju. Gelom prečišćeni VH, V«i VLkoji sadrže PCR proizvode se onda upletene zajedno da se napravi raspored izlaganja scFv gena. Raspored izlaganja scFv se klonira na fagemid vektor pZ603, i proizvod ligacije se elektroporiše u kompetentne TG1E. coli ćelijeda se generiše scFv izložene biblioteke fage, HuPhabL3, sa 5,2 x 10<9>individualnim transformantima (Kay, B.K et al. (1996)Phage Displayof Peptides and Proteins:A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. et al.(1991) J. Mol. Biol.222(3):581-597; Sheets, M.D. et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA95(11 ):6157-6162).

U pretpostavljenoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, priprema se jedno-lančano antitelo (scFv(TF)3e10) koje ima jedan VHA/Lpoložaj vezivanja za TF. Sekvenca amino kiseline scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:1), je opisana u Primeru 1.

U pretpostavljenoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, PCR fragment koji sadrži Tmi456 sekvencu (sa M388L i H381G mutacijama) napadnut bočno od strane Noti položaja se podklonira u Noti položaj pZ612/3e10 (bakterijski vektor ekspresije za scFv(TF)3e10 zasnovan na pCANTAB5 od Pharmacia-e). Ovde su, mutacije tačke u TM delovima fuzionih proteina pronalaska specifikovane sa oznakom od jednog slova ostatka amino kiseline matičnog TM, praćeno brojem pozicije amino kiseline u zrelom TM i jednim slovom oznake mutacije amino kiseline. Na primer, M388L ukazuje da je metionin na poziciji amino kiseline 388 zrelog TM promenjen u leucin. Noti položaj je izmedju sekvence antitela i e-označene sekvence. Ovo generiše bakterijski ekspresioni konstrukt (pKM101) za fuzioni protein koji se sastoji od scFv(TF)3e10-linker od 15 amino kiselina-TMi456, prećeno e-označenom sekvencom. Da se generiše sisarski vektor ekspresije PCR fragment se prvo generiše iz pKM101 obrasca. Ovaj fragment se dizajnira za ligaciju u Stul/Mscl položaje TM vektora ekspresije pTHR525. Ovo generiše vektor (pKM113) koji ima Solulin signalnu sekvencu praćenu sekvencom za zreli fuzioni protein praćeno e-označenom sekvencom. Vektor sadrži gen otporan na ampicilin i hidromicin i DHFR selekcione markere. Ekspresija se vodi sa MPSV LTR promoterom. Položajem usmerena mutageneza se obavlja na ovom vektoru da uključi R456G i H457Q mutacije koje dozvoljavaju otpornost proteaze na TM i deo. Rezultirajući vektor se oobeležava kao pKM115. Vektor pKM115 ima linker od 15 amino kiselina koji odvaja VHi VLdomene i sledeći linker od 15 amino kiselina koji odvaja VLdomen od TMi456. Linker koji odvaja VHi VLse smanjuje do 5 amino kiselina da vodi formiranje dimera sa većom željom, označenom kao pHM115.5. Fuzioni protein kodiran sa pHM115.5, scFv(TF)3e10-TMi456 (SEQ ID NO:2), je opisan u Primeru 2. Dodatni vektor, pKM125, se generiše upotrebom standardne rekombinantne DNK tehnologije uklanjanjem 3 amino kiseline (GAP) izmedju linkera od 5 amino kiselina koji odvaja VHi VLdomene i uklanja e-oznaku na C-završetku fuzionog proteina. Rezultirajući fuzioni protein, scFv(TF)3e10-TMi456A (SEQ ID NO:3), je opisan u Primeru 3.

Ekspresija i prečišćavanje fuzionih proteina:

Postoji nekoliko načina da se ekspresuju rekombinantni fuzioni proteiniin vitro,uključujućiE. colibakulovirus, sisarske ćelije kvasca ili druge ekspresione sisteme. Dobro su poznati postupci ekspresije kloniranih gena u bakteriji. Da bi se obazbedio visok nivo ekspresije kloniranih gena u prokariotskom sistemu, osnovno je konstruisati vektore ekspresije koji sadrže, minimum, jak promoter da usmeri mRNK završetak transkripcije. Primeri regulatornih regiona odgovarajućih u ovu svrhu su promoter i operator regionE. coli beta-glukozidazagena,E. coli triptofanbiosintetička putanja, ili promoter nalevo od fage Lambda. Uključivanje selekcionih markera u DNK vektore transformisane uE. coli] ekorisno. Primeri takvih markera uključuju gene koji specifikuju otpornost na ampicilin, tetraciklin ili hloramfenikol.

Od viših eukariotskih ćelijskih sistema korisnih za ekspresiju fuzionih proteina, i njihovih analoga postoje brojni ćelijski sistemi od kojih se može odabirati. Ilustrativni primeri sisarskih ćelijskih linija uključuju ali nisu limitirani na RPMI 7932, VERO i HeLa ćelije, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka(CHO), WI38, BHK, COS-7, C127 ili MDCK ćelijske linije. Pretpostavljene sisarske ćelijske linije su CHL-1. Kada se CHL-1 upotrebljava uključuje se higromicin kao eukariotski selekcioni marker. CHL-1 ćelije su izvedene iz RPMI 7032 melanoma ćelija, već dostupne humane ćelijske linije. CHL-1 ćelijska linija je deponovana kod ATCC u skladu sa uslovima Budampeštanskog sporazuma i označena je kao #CRL 9446, deponovana 18. juna 1987. godine. Odgovarajuće ćelije za upotrebu u ovom pronalasku su komercijalno dostupne od ATCC. Ulustrativne ćelijske linije uključujuSpodoptera frugiperdaiBombyx mori.

Prokariotski sistem,E. coli,nije u stanju da učini post-translacione modifikacije, kao što je glikozilacija. Dodatno, proteini sa kompleksom disulfid uzoraka su često pogrešno savijeni kada se ekspresuju uE. coli.Za fuzioni protein koji je ovde opisan postoji označena redukcija u aktivnosti trombomodulin kofaktora kada se ekspresuje u E.coliiako su obe aktivnosti i dalje prisutne. Sa prokariotskim sistemom, ekspresovani protein je ili prisutan u ćelijskoj citoplazmi u nerastvorljivom takozvanom obliku uključenog tela, pronađenim u rastvorljivoj frakciji pošto se ćelija lizuje, ili je usmeren u periplazmu dodavanjem odgovarajućih sekvenci sekrecionog signala. Ukoliko je ekspresovani protein u nerastvoljivim uključenim telima, obično se zahteva rastvaranje i potonje ponovno uvijanje uključenih tela.

Mnogi prokariotski ekspresioni vektori su poznati stručnjacima u nauci kao što su pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švedska), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA), i pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, USA), koji su komercijalno dostupni.

Promoteri koji se uobičajeno upotrebljavaju u rekombinantnim mikrobskim ekspresionim sistemima uključuju beta-laktamaza (penicilinaza) i laktoza promoter sistem (Chang, A.C. et al. (1978)Nature275(5681 ):617-624; Goeddel, D.V. et al. (1979)Nature281(5732):544-548), triptofan (trp) promoter sistem (Goeddel, D.V. et al. (1980)Nucl. Acids Res.8(18):4057-4074) i tac promoter (Maniatis, T. Et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv (1982)). Sledeći korisni bakterijski ekspresioni sistem upošljava lambda fage pL promoter i cits857 represor koji se može termo izazvati (Bernard, H.U. et al. (1979)Gene5(1):59-76; Love, C.A. et al. (1996)Gene176(1-2):49-53). Rekombinantni fuzioni proteini mogu takođe biti ekspresovani u domaćinima kvascima kao što suSaccharomyces cerevisiae.To uobičajeno daje sposobnost da se rade različite post-translacione modifikacije. Ekspresovani fuzioni protein može biti sekretovan u u kulturu površinskog sloja gde nema mnogo drugih proteina, čineći prečišćavanje lakšim. Vektori kvasca za ekspresiju fuzionih proteina ovog pronalaska sadrže određene neophodne karakteristike. Elementi vektora su generalno izvedeni iz kvasca i bakterije da dopuste propagiranje plazmida u oba. Bakterijski elementi uključuju poreklo replikacije i marker koji je odabirljiv. Elementi kvasca uključuju poreklo od replikacione sekvence (ARS), markera koji odabirljiv, promoter, i transkripcioni terminator.

Odgovarajući promoteri u vektorima kvasca za ekspresiju uključuju promotereTRPI gena, ADH1 ili ADHII gen, kiseli fosfataza (PH03 ili

PH05) gen, izocitohrom gen, ili promoter uključen sa glikolitičkom putanjom, kao što je promoter enolaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GADPH), 3-fosfog lice rat kinaza (PGK), heksokinaza, piruvat kinaza, tirosefosfat izomeraza i fosfoglukoza izomaraza (Hitzeman, R.A. et al. (1980)J. Biol. Chem.255(24): 12073-12080; Hess. B. Et al.

(1968)J. Adv. Enzyme Reg.7:149-167; i Holland, M.J. i Holland, J.P.

(1978)Biochemistry17(23):4900-4907).

Komercijalno dostupni vektori kvasca uključuju pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (VVashington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC #67255), i YpGX265GAL4 (ATCC # 67233). Sisarske ćelijske linije uključuju ali nisu limitirane na COS-7, L ćelije, C127, 3T3, jajnik kineskog hrčka (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO, i HEK293 i mogu biti uposlene da ekspresuju rekombinantne fuzione proteine u ovom pronalasku. Rekombinantni proteini proizvedeni u sisarskim ćelijama su normalno rastvorljive i glokozilovane i imaju autentični N-završetak. Sisarski ekspresioni vektori mogu sadržati ne-transkribovane elemente kao što su poreklo replikacije, promoter i pojačivač, i 5' ili 3' neprevedene sekvence kao što su položaji vezivanja ribozoma, položaj poliadenilacije, akceptor položaj i upleteni davalac, i transkripcione sekvence terminacije. Promoteri za upotrebu u sisarskim vektorima ekspresije uobičajeno su na primer viralni promoteri kao što su Polioma, Adenovirus, HTLV, Simian Virus 40 (SV40), i humani citomegalovirus (CMV).

U zavisnosti od sistema ekspresije i odabranog domaćina, homogeno rekombinantni fuzioni protein može se dobiti upotrebom različitih kombinacija konvencionalne hromatografije upotrebljene za prečišćavanje proteina. Ovo uključuju: hromatografiju imunoafiniteta, hromatografuju reversne faze, hromatografija razmene katjona, hromatografija razmene anjona, hromatografija hidrofobične interakcije, hromatografija gel filtriranja, i HPLC. Ukoliko sistem ekspresije sekretuje fuzioni protein u medijum rasta, protein može biti prečišćen direktno iz medijuma. Ukoliko fuzioni protein nije sekretovan, izoluje se iz ćelijskih lizata. Ćelijski prekid može biti učinjen putem bilo kog konvencionalnog postupka, uključujući cikluse zamrznuto-odmrznuto, sonikacije, mehanički prekid, ili uz pomoć sredstava za ćelijsko lizovanje.

U pretpostavljenoj realizaciji ovog pronalaska, sisarski ekspresioni konstrukti se izmene infekcijom u CHO DXB11 ćelijama. Stabilne populacije se odabiru upotrebom 400 jag/mL higormicina B u HAMS/F12 midijum. Nivoi ekspresije su otprilike 500 \ xg/ L. Da se povećaju nivoi ekspresije odabire se populacija upotrebom 100 nM metotreksata u alfa MEM medijumu. Aproksimativni nivo ekspresije ove populacije je 5 mg/L.

Fuzioni konstrukt sadrži e-označenu sekvencu na C-završetku proteina. Anti-e-označene kolone afiniteta se kupuju od American/Pharmacia

Biotech. Medijum ćelijske kulture se filtrira kroz 0,22 nm filter i puni u 5 mL e-označenu kolonu pri 2 mL/min. Kolona se opere sa 0,2 M fosfat puferom 0,05% NaN3, pH 7,0, i potom sakuplja u cevčice koje sadrže 0,1 zapremine 1M Tris pufer, pH 8,2 da se neutrališe elucioni pufer. Alternativno, filtrirani medijum kulture se puni na protein A kolonu. U ovom slučaju, kolona se opere sa 50 mM limunovom kiselinom, 300 mM NaCI, pH 6,5 i elutuje sa istim puferom pri pH 3,0. U oba slučaja, prečišćeni uzorci se potom pune na Sephadex 200 kolonu da se odvoji monomerni od dimernih oblika fuzionog proteina.

Farmaceutskisastavi:

Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske sastave koji se mogu davati pacijentu da se postigne terapeutsko dejstvo. Farmaceutski sastavi ovog pronalaska mogu biti pripremljeni za davanje kombinovanjem fuzionog proteina koji imaju željeni stepen čistoće i famraceutski efektivne količine sa fiziološki prihvatljvim nosačima.

Fuzioni proteini sadašnjeg pronalaska mogu biti upotrebljeni u

farmaceutskim sastavima, za intravenozno davanje ili potkožno davanje ili intratekalno davanje. Tako će gore opisani fuzioni proteini pretpostavljeno biti kombinovani sa prihvatljivim sterilnim farmaceutskim nosačem, kao što je peto-procentna dekstroza, laktatovani Ringer-ov rastvor, normalni slani rastvor, sterilna voda, ili bilo koji drugi komercijalno pripremljeni fiziološki pufer rastvor dizajniran za intravenoznu infuziju. Razume se da će odabiranje rastvora nosača i doze i davanja sastava varirati sa subjektom i određenim kliničkim podešavanjem, i da će se njime upravljati standarnim medicinskim procedurama.

U skladu sa postupcima sadašnjeg pronalaska, ovi farmaceutski sastavi mogu biti davani u količinama koje su efektivne da inhibiraju patološke konsekvence povezane sa viškom generisanja trombina u subjektu.

Davanje fuzionog proteina može biti putem intravenoznog ubrizgavanja velike pilule, putem konstantne intravenozne infuzije ili putem kombinovanja oba pravca. Alternativno, ili dodatno, fuzioni protein pomešan sa odgovarajućim vezivnim sredstvima može biti unesen u cirkulaciju iz intramuskularnog položaja. Sistemski tretman sa fuzionim proteinom može se pratiti utvrđivanjem aktiviranog delimičnog tromboplastin vremena (PT) na serijama uzoraka krvi uzetih od pacijenta. Vreme koagulacije primećeno u ovom ogledu se produžava kada se dovoljan nivo fuzionog proteina postigne u cirkulaciji.

Rekombinantni fuzioni proteini i farmaceutski sastavi ovog pronalaska su korisni za parenteralno, topično, intravenozno, oralno i lokalno davanje. Farmaceutski sastavi mogu biti davani u različitm jediničnim oblicima doza u zavisnosti od postupka davanja. Na primer, jedinični oblici doza mogu biti dati u obliku uključujući ali ne limitirajući na, tablete, kapsule, puder, rastvore, i emulzije.

Rekombinantni fuzioni proteini i farmaceutski sastavi ovog pronalaska su posebn korisni za intravenozno davanje. Sastavi za davanje će uobičajeno sadržati rastvor jedno-lančanog antitela ili fuzionog proteina koji se sastoji od jedno-lančanog antitela rastvoren u farmaceutski prihvatljivom nosaču, pretpostavljeno u vodenom nosaču. Različiti vodeni nosači se mogu upotrebiti, n.pr., puferovani slani rastvor i slično. Ovi rastvori su generalno oslobođeni od neželjene materije. Ovi sastavi mogu biti sterilizovani putem konvencionalnih, dobro poznatih tehnika sterilizacije.

Tipični farmaceutski sastav za intravenozno davanje može biti lako utvrđen od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke. Količine koje se daju su jasno protein specifične i zavise od njegove potentnosti i farmakokinetičkog profila. Aktuelni postupci za pripremanje sastava koji se mogu parenteralno davati će biti poznati ili očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke i opisani su detaljnije u takvi publikacijama kao što jeRemington' s Pharmaceutical Science,15th ed., Mack Publishin Companv, Easton, Pa

(1980).

Sastavi koji sadrže sadašnja antitela pronalaska ili njihov koktel (odnosno, sa drugim proteinima) mogu biti davani kao terapeutski tretmani. U terapeutskim primenama, sastavi se daju pacijentu koji pati od poremećaja ili bolesti krvarenja u količini dovoljnoj leči ili barem delimično zaustavi krvarenje. Količina adekvatna da se ovo postigne je definisana kao "terapeutski efektivna količina". Efektivne količine za ovu upotrebu će zavisiti od ozbiljnosti bolesti i opšteg stanja pacijentovog zdravlja.

Jedinično ili višestruko davanje sastava može biti dato u zavisnosti od doze i frekvencije koja se zahteva i toleriše od strane pacijenta. U bilo kom slučaju, sastav treba da obezbedi dovoljnu količinu proteina ovog pronalaska da efektivno leči pacijenta.

Fuzioni proteini pronalaska, ili njihovi farmaceutski prihvatljivi sastavi, se daju u terapeutski efektivnoj količini, koja će varirati u zavisnosti od različitih faktora uključujući aktivnost specifičnog proteina koji je uposlen; metabolitičke stabilnosti i dužine dejstva fuzionog proteina; starosti, telesne težine, opšteg stanja zdravlja, pola i dijete pacijenta; načina i vremena davanja; brzine ekskrecije; kombinacije leka; ozbiljnosti određene bolesti-stanja; i domaćina koji je podvrgnut terapiji. Generalno, dnevna terapeutski efektivna količina je od oko 0,14 mg do oko 14,3 mg/kg telesne težine na dan fuzionog proteina pronalaska, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog sastava; pretpostavljeno od oko 0,7 mg do oko 10 mg/kg telesne težine na dan; i najpoželjnije od oko 1,4 mg do oko 7,2 mg/kg telesne težine na dan. Na primer, za davanje osobi koja ima težinu od 70 kg, raspon doze će biti od 10 mg do oko 1,0 g na dan fuzionog proteina pronalaska, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog sastava, pretpostavljeno od oko 50 mg do oko 700 mg na dan, i najpoželjnije od oko 100 mg do oko 500 mg na dan.

Genska terapija:

Fuzioni protein pronalaska može takođe biti uposlen u skladu sa sadašnjim pronalaskom putem ekspresije takvog fuzionog proteinain vivopostupkom koji se često naziva "genska terapija". Tako, na primer, ćelije mogu biti izgrađene sa polinukleotidom (DNK ili RNK) koji kodira fuzioni proteinex vivo,i izgrađene ćelije se onda obezbeđuju za pacijenta da bude tretiran sa fuzionim proteinom. Takvi postupci su dobro poznati u nauci. Na primer, ćelije mogu biti izgrađene postupcima poznatim u nauci upotrebom retroviralne čestice koja sadrži RNK koja kodira fuzioni protein sadašnjeg pronalaska.

Lokalna isporuka antikoagulantnih fuzionih proteina sadašnjeg pronalaska upotrebom genske terapije može obezbediti terapeutsko sredstvo za ciljanu oblast, entodelijalne ćelije koje oblažu krvne sudove.

Razmatrane su iin vitroiin vivometodologije genske terapije. Poznato je nekoliko postupaka za transfer potencijalno terapeutskih gena definisanim ćelijskim populacijama. Videti, n.pr., Mulligan (1993)Science260:926-931. Ovi postupci uključuju: 1) Direktni transfer gena. Videti, n.pr. Wolff et al. (1990)Science247:1465-1468; 2) Lipozomom-posredovani DNK transfer. Videti, n.pr., Caplen et al. (1995)Nature Med.3:39-46; Crvstal (1995)Nature Med.1:15-1; Gao i Huang (1991)Biochem. Biophys. Res. Comm.179:280-285; 3) Retrovirusom-posredovani DNK transfer. Videti, n.pr., Kay et al. (1993)Science262:117-119; Anderson (1992)Science256:808-813. 4) DNK virusom-posredovani DNK transfer. Takvi DNK virusi uključuju adenoviruse (pretpostavljeno Ad2 ili Ad5 zasnovane vektore), herpes viruse (pretpostavljeno herpes simpleks virus zasnovani vektor), i parvoviruse (pretpostavljeno "defektne" ili ne-autonomne parvovirus zasnovane vektore, poželjnije

adeno-povezani virus zasnovani vektori, najpoželjnije AAV-2 zasnovani vektori). Videti, n.pr., Ali et al. (1994)Gene Therapy1:367-384; U.S. Patent 4, 797,368, inkorporisan ovde putem reference, i U.S. Patent 5,139,941, inkorporisan ovde putem reference.

Izbor određenog vektorskog sistema za transferisanje gena od interesa će zavisiti od različitih faktora. Jedan važan faktor je priroda ciljane ćelijske populacije, lako su retroviralni vektori ekstenzivno proučavani i upotrebljavani u brojnim primenama genske terapije, ovi su vektori generalno neodgovarajući za inficiranje ne-deljivih ćelija. Dodatno, retrovirusi imaju potencijalnu onkogeničnost. Pa ipak, skoriji uspesi na polju lentiviralnih vektora mogu da ponište neke od ovih limitacija. Videti Naldini et al. (1996) Science 272:263-267.

Retrovirusi iz kojih ovde i gore pomenuti retroviralni plazmid vektori mogu biti izvedeni uključuju, ali nisu limitirani na, Moloney mišji virus leukemije, nekroza virus slezine, retroviruse kao što su Rous virus sarkoma, Harvey virus sarkoma, virus avian leukoza, virus leukemije gibon majmuna, humani virus imunonedostatka, adenovirus, Mijeloproliferativni virus sarkoma, sisarski virus tumora. U jednoj realizaciji, retroviralni plazmid vektor se izvodi iz Molonev mišjeg virusa leukemije.

Adenovirusi imaju prednost da imaju širok raspon domaćina, mogu inficirati nepokretne ili krajnje diferencirane ćelije, kao što su neuroni ili hepatociti, i pojavljuju se generalno ne-onkogeno. Videti, n.pr., Ali et al. (1994),supra,p. 367. Izgleda da se adenovirusi ne integrišu u genomu domaćina. Pošto postoje ekstrahromozomno, rizik mutageneze umetanjem je uveliko

smanjena. Ali etal. (1994)supra.p. 373.

Adeno-povezani virusi prikazuju slične prednosti kao adenovirus-zasnovani vektori. Pa ipak, AAV-ovi prikazuju položajem specifičnu integraciju na humani hromozom 19 (Ali et al. (1994)supra,p. 377).

U pretpostavljenoj realizaciji, DNK koja kodira fuzione proteine ovog pronalaska se upotrebljava genskoj terapiji za poremećaje uključujući, ali ne limitirajući na, duboku vensku trombozu, razdvojenu intravaskularnu koagulaciju, akutni koronarni sindrom ili kancer sa dokazom koagulopatije.

Prema ovoj realizaciji, genska terapija sa DNK koja kodira antitela ovog pronalaska se obezbeđuje pacijentu kome je neophodna, zajedno sa, ili neposredno posle dijagnoze.

Vešt stručnjak će ceniti da bilo koji odgovarajući vektor genske terapije koji sadrži DNK koja kodira fuzioni protein pronalaska ili DNK koja kodira analoge, fragmente, derivate ili varijante fuzionog proteina pronalaska može biti upotrebljen u skladu sa ovom realizacijom. Poznate su tehnike konstruisanja takvog vektora. Videti, n.pr., Anderson, W.F. (1998)Nature392:25-30; Verma I.M. i Somia, N. (1998)Nature389:239-242. Uvođenje fuzionog proteina DNK koji sadrži vektor na ciljani položaj može biti postignuto upotrebom poznatih tehnika.

Vektor genske terapije uključuje jedan ili više promotera. Odgovarajući promoteri koji se mogu uposliti uključuju, ali nisu limitirani na, retroviralni LTR; SV40 promoter; i humani citomegalovirus (CMV) promoter opisano kod Miller et al. (1989)Biotechniques 7(9):980-990.ili bilo koji drugi promoter (n.pr., ćelijski promoteri kao što su eukariotski ćelijski promoteri uključujući, ali ne limitirajući na, histon, pol III, i p-aktin promotere). Drugi viralni promoteri koji mogu biti uposleni uključuju, ali nisu limitirani na, adenovirus promotere, timidin kinaza (TK) promotere, i B19 parvovirus promotere. Odabiranje odgovarajućeg promotera će biti očigledno stručnjacima iz ove oblasti nauke iz tehnika koje se ovde sadrže.

Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein sadašnjeg pronalaska je pod kontrolom od strane odgovarajućeg promotera. Odgovarajući promoteri koji se mogu uposliti uključuju, ali nisu limitirani na, adenoviralne promotere, kao što je adenoviralni glavni kasni promoter; ili heterologe promotere, kao što je citomegalovirus (CMV) promoter; respiratorni sincitijalni virus (RSV) promoter; promotere koji se mogu indukovati, kao što je MMT promoter, metalotionein promoter; promoteri temperaturnog šoka; albumin promoter; ApoAI promoter; humani globin promoteri; viralni timidin kinaza promoteri, kao što je Herpes Simplex timidin kinaza promoter; retroviralni LTR-ovi (uključujući modifikovane retroviralne LTR-ove koji su ovde i u gornjem tekstu opisani); p-aktin promoter; i humani hormon rasta promoter.

Retroviralni plazmid vektor se upošljava da transdukuje pakovanje ćelijskih linija da se formiraju proizvodne ćelijske linije. Primeri ćelija za pakovanje koji mogu biti izmenjene infekcijom uključuju, ali nisu limitirani na, PE501, PA317, v|/-2, v|/-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, yCRE, vj;-CRIP, GP+#-86, GP+envAm12, i DAN ćelijske linije kao što je opisano kod Miller (1990)Human Gene Therapy1:5-14, koji je uključen ovde putem reference u celosti. Vektor može transdukovati ćelije za pakovanje putem sredstava poznatih u nauci. Takva sredstva uključuju, ali nisu limitirana na, elktroporaciju, upotrebu lipozoma, i CaP04taloženje. U jednoj alternativi, retroviralni plazmid vektor može biti inkapsulirane u lipozom, ili sparen za lipid, i potom dat domaćinu. Proizvodne ćelijske linije generišu čestice retroviralnog vektora koje uključuju sekvencu(e) nukleinske kiseline koja kodira polipeptide. Takve čestice retroviralnog vektora onda mogu biti uposlene, da transdukuju eukariotske ćelije, biloin vitroiliin vivo.Transdukovane eukariotske ćelije će ekspresovati sekvencu(e) nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Eukariotske ćelije koje mogu biti transdukovane uključuju, ali nisu limitirane na, embrionalne stem ćelije, embrionalne ćelije karcinoma, kao i hematopoetične stem ćelije, hepatocite, fibroblaste, mioblaste, keratinocite, endotelijalne ćelije, i bronhijalne epitelijalne ćelije.

Različit pristup genskoj terapiji je "transkariotska terapija" pri čemu su pacijentove ćelije tretiraneex vivoda se izazovu pospani hromozomski geni da se proizvede protein od interesa posle reindukcije pacijentu. Transkariotska terapija podrazumeva da individua ima komplementarne gene neophodne za aktiviranje. Transkariotska terapija uključuje uvođenje promotera ili druge egzogene regulatorne sekvence sposobne da aktivira stvoreni gene, u hromozomsku DNK pacijentovih ćelija ex vivo, kultivišući i odabirajući aktivne protein-proizvodeće ćelije, i potom ponovnim uvođenjem aktiviranih ćelija u pacijenta nameru da tamo postanu u potpunosti uspostavljene. "Gen aktivirane" ćelije onda proizvode protein od interesa u nekoj značajnoj količini vremena, pretpostavljeno sve dok traje život pacijenta. U.S. Patent Nos. 5,641,670 i 5,733,761 otkrivaju detaljno ovaj koncept, i ovde su inkorporisani putem reference u celosti.

Pribori:

Pronalazak se dalje odnosi na pribore za istraživanje ili u dijagnostičke svrhe. Pribori tipično uključuju jedan ili više kontejnera koji sadrže jedno-lančana antitela sadašnjeg pronalaska. U pretpostavljenoj realizaciji, pribori se sastoje od kontejnera koji sadrže jedno-lančana atnitela u obliku koji odgovara za derivatizaciju sa drugim molekulom. U još poželjnijoj realizaciji pribori se sastoje od kontejnera koji sadrže fuzione proteine SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3.

U sledećoj realizaciji, pribori mogu sadržati DNK sekvence koje kodiraju fuzione proteine . Pretpostavljeno DNK sekvence koje kodiraju fuzione proteine se obezbeđuju u plazmidu koji je pogodan za transfekciju u i ekspresiju od strane ćelije domaćina. Plazmid može sadržati promoter (često promoter koji se može indukovati) da reguliše ekspresiju DNK u ćeliji domaćina. Plazmid može takođe sadržati odgovarajuće položaje restrikcije da se potpomogne umetanje drugih DNK sekvenci u plazmid da se proizvedu različiti fuzioni proteini. Plazmidi mogu takođe sadržati brojne druge elemente da potpomognu kloniranje i ekspresiju kodiranih proteina. Takvi elementi su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke i uključuju, na primer, markere koji se mogu odabirate, kodone za inicijaciju, kodone za prekidanje, i slično.

Terapeutske indikacije:

Bolesti u kojima formiranje tromba igra značajnu etiološku ulogu uključuju infarkt miokarda, razdvojenu intravaskularnu koagulaciju, duboku vensku trombozu, pulmonalnu emboliju, ishemični šlog, septički šok, sindrom akutnog respiratornog bola, nestabilnu anginu i druga arterijska i venska okulzivna stanja. Fuzioni proteini ovog pronalaska su korisni u svemu ovome, kao i kod drugih bolesti u kojima je formiranje tromba patološko. Druga patološka stanja gde fuzioni protein ovog pronalaska može biti korisan uključuju kancer sa koagulopatijom i inflamacijom. Jedinjenja mogu takođe da nađu primenu kod presađivanja kože i vena i kod transplantiranih organa. Pod korisnim se misli da su jedinjenja korisna za lečenje, bilo da se bolest spreči ili da se spreči progresija kao pogoršanom stanju. Jedinjenja ovog pronalaska takođe obezbeđuju sigurno i efektivno koagulantno sredstvo, na primer, kod pacijenata koji dobijaju bioproteze kao što su srčani ventili. Ova jedinjenja mogu zameniti heparin i varfarin u lečenju, na primer, pulmonalne embolije ili akutnog infarkta miokarda. Fuzioni proteini ovog pronalaska mogu takođe da nađu primenu u oblaganju medicinskih uređaja gde je problematično pitanje koagulacija.

Ogledi:

Dostupni su brojni laboratorijski ogledi za merenje TM aktivnosti fuzionog proteina ovog pronalaska. Aktivnost proteina C se može meriti u ogledu opisanom od strane Salem, H.H. et al. (1984),supra,i Galvin, J.B. et al.

(1987)J. Biol. Chem.262(5):2199-2205. Ukratko, ogled se sastoji od 2 koraka. Prvi korak je inkubacija testiranog fuzionog proteina sa trombinom i proteinom C pod definisanim uslovima. U drugom koraku, trombin je inaktiviran sa hirudinom ili antitrombinom III i heparinom, i aktivnost novo aktiviranog proteina C se utvrdjuje upotrebljenim hromogenim supstratom, pri čemu je hromofora oslobodjena proteolitičkom aktivnošću aktiviranog proteina C. Ovaj ogled se obavlja sa preičišćenim reagensima.

Alternativno, dejstvo fuzionog proteina može biti mereno upotrebom ogleda vremena zgrušavanja plazme kao što je aktiviranje parcijalnog tromboplastin vremena ("APTT"), vremena zgrušavanja trombina ("TCT") i/ili protrombinsko vreme ("PT"). Ovi ogledi se razlikuju između različitih mehanizama inhibicije koagulacije, i uključuju aktiviranje proteina C. Prolongiranje vremena zgrušavanja u bilo kom od ovih ogleda demonstrira da molekul može da inhibira koagulaciju u plazmi.

Gornji ogledi se upotrebljavaju da se identifikuju fuzioni proteini sa antikoagulantnom aktivnošću koji su sposobni da aktiviraju trombin i vežu TF u oba prečišćena sistema i u miljeu plazme. Dalji ogledi se potom upotrebljavaju da se procene druge aktivnosti matičnog TM, kao što su inhibicija trombinom katalizovanog formiranje fibrina iz fibrinogena (Jakubovvski, H:V: et al. (1986)J. Biol. Chem.261(8):3876-3882), inhibicija trombinskog aktivaciranja faktora V (Esmon, C.T. et al. (1982).J. Biol. Chem.257(14):7944-7947), ubrzana inhibicija trombina sa antitrombinom III i heparin kofaktorom II (Esmon, N.L etal. (1983)J. Biol. Chem.258(20): 12238-12242), inhibicija trombinskog aktiviranja faktora XIII (Polgar, J. et al. (1987)Thromb. Haemost.58(1):140), inhibicija trombinom posredovanog inaktiviranja proteina S (Thompson, E.A. i Salem, H.H.

(1986)J. Clin. Inv.78(1 ):13-17), i inhibicija trombinom posredovanog aktiviranja trombocita i agregacije (Esmon, N.L. et al. (1983),supra).Sledeći ogledi, opisani detaljno u Primeru 5, se upotrebljavaju da se meriin vivopotencija fuzionog proteina pronalaska: 1) ogled aktiviranja proteina C (hromogeni); 2) ogled aktiviranja sTF/FVIIa; 3) ogled aktiviranja faktora X; i 4) ogled aktiviranja proteina C (na sa TF-bogatoj površini).

U obavljanju postupaka sadašnjeg pronalaska naravno da se ima razumeti da upućivanje na određene pufere, medijume, reagense, uslove kulture i slično ne treba razumeti kao limitirajuće, već ih čitati na takav način da uključuju sve povezane materijale koji stručnjak iz ove oblasti nauke može prepoznati kao od interesa ili vrednosti u određenom kontekstu u kojem je razmatranje prezentovano. Na primer, često je moguće supstituisati jedan sistem pufera ili medijum kulture za drugi i opet postići slične ili identične rezultate. Stručnjaci iz ove oblasti nauke koji imaju dovoljno znanja o takvim sistemima i metodologijama da mogu bez nepotrebnog eksperimentisanja učine takve supstitucije koje će optimalno služiti njihovoj svrsi u korišćenju postupaka i procedura koje su ovde otkrivene.

Sadašnji pronalazak će dalje biti opisan putem sledećih nelimitirajućih primera kao vodiča za asistiranje u praktičnoj primeni pronalaska. U primeni otkrića iz primera traba imati jasno u glavi da će se druge i različite realizacije postupaka otkrivenih prema sadašnjem pronalasku bez sumnje sugerisati stručnjacima iz ove oblasti nauke.

Bez daljeg elaboriranja, veruje se da stručnjak iz ove oblasti nauke može, upotrebom prethodnog opisa, iskoristiti sadašnji pronalazak do krajnih granica. Sledeće pretpostavljene specifične realizacije se, prema tome, imaju smatrati samo kao ilustrativne, a ne limitirajuće na bilo koji način.

U prethodnom i primerima koji slede, sve temperature su podešene nekorigovane u stepenima Celzijusa i, svi delovi i procenti su maseni, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

Celokupno otkriće(a) svih primena, patenata i publikacija, koji su gore citirani su ovde inkorporisani putem reference.

*<*>

Sledeći primeri su obezbeđeni kao vodič da se asistira u praksi pronalaska, i nemaju nameru da limitiraju obim pronalaska. Jedno-lančano anti-TF antitelo scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:1) se sastoji od signalnog peptida (-18 do -1), VHdomena (1 do 126), VH-VLlinkera (127 do 131), VLdomena (132 do 246), i e-označene sekvence (247 do 264). scFv(TF)3e10-Tmi456 fuzioni protein (SEQ ID NO:2) se sastoji od signalnog peptida (-18 do -1), VHdomena (1 do 126), VH-VLlinkera (127 do 131), i VLdomena (132 do 246), VL-TM linkera (247do 264), Tmi456 domena (265 do 382), i e-označene sekvence (383 do 400). H381G, M388L, R456G i H457Q mutacije u Tmi456 su podvučene.

scFv(TF)3e10-Tmi456A fuzioni protein (SEQ ID NO:3) se sastoji od signalnog peptida (-18 do -1), VHdomena (1 do 126), VH-VLlinkera (127 do 131), i VLdomena (132 do 243), VL-TM linkera (244do 261), Tmi456 domena (262 do 379). H381G, M388L, R456G i H457Q mutacije u Tmi456 su podvučene.

PRIMER 4

Ekspresija fuzionog proteina u bakterijskim/sisarskim ćelijama

Bakterijska ekspresija je moguća, ali prinosi protein koji ima značajno smanjenu aktivnost TM kofaktora. Fuzioni protein se ekspresuje u CHO ćelijama. Plazmid ekspresije sadrži oba higromicin B i DHFR selekcione markere. Originalno odabiranje se uradi u 400 |ig/mL higromicina da se odabere populacija. Rezultirajuća populacija se onda podvrgne odabiranju sa 100 nM metotreksata. Tokom odabiranja, ćelije koje imaju pojačane kopije regiona DNK koji sadrži selekcioni marker, i ciljani gen, se odabiru između populacije. Nivoi ekspresije se povećavaju od otprilike 0,3 mg/L do oko 6 mg/L kao rezultat ovog odabiranja.

PRIMER 5

In vitroogledi

1, Ogled aktiviranja Proteina C (Hromogeni)

Ovaj ogled se obavlja mešanjem 20 pi. svakog od sledećih proteina na mikrotitar ploči: TM uzorak (nepoznati ili standardni), trombin (3nM), i protein C (1,5 fxM). Ogledni razređivač za svaki protein je 20 mM Tris-HCI, 0,1 M NaCI, 2,5 mM CaCI2, 2,5 mg/mL BSA, pH 7,4. Bazenčići se inkubiraju 2 sata na 37°C posle čega se prekida aktiviranje proteina C dodavanjem 20 uL hirudina (0,16 jednica/uL 370 nM) u ogledni razređivač i inkubacijom dodatnih 10 minuta.

Formirana količina aktiviranog proteina C se detektuje dodavanjem 100 fal_ 1 mM S2266 (u ogledni razređivač), i nastavlja se inkubiranje ploče na 37°C. Absorbanca pri 405 nm u svakom bazenčiću se čita svakih 10 sekundi tokom 30 minuta, upotrebom Molecular Device čitača ploče. Podaci o absorbanci se sakupljaju, i promena u absorbanci po sekundi (pada) u svakom bazenčiću se izračunava. Promena absorbance po sekundi je proporcionalna pmol/mL aktiviranog proteina C.

Ovaj odnos se utvrđuje empirijski upotrebom različitih koncentracija totalno aktiviranog proteina C. Uzorci koji sadrže 100% aktiviranog proteina C se generišu mešanjem proteina C pri 0 do 1,5 uM sa 60 nM zečjeg TM i 30 nM trombina, inkubiranjem 0 do 4 sata, dodavanjem hirudina i merenjem S2266 aktivnosti kao gore. Ulovi pod kojim se 100% proteina C aktivira se definišu kao oni u kojima S2266 aktivnost (A405/sec) dostiže vrednost koja se ne menja.

Jdinica aktivnosti se definiše kao 1 pmol aktiviranog proteina C generisanog po mL/min pod reagujućim uslovima kao što je gore definisano. Alternativno, vrednosti aktivnosti se izveštavaju u poređenju sa matičnim efektom pranja rastvorljivog zečjeg TM.

2. Ogled aktiviranja sTF/FVIIa

Princip ovog ogleda je dole opisan. Tripeptid p-nitroanilid amid veza supstrata se hidrolizuje sa sTF/FVIIa kompleks. Oslobođeni proizvod hromofone, p-nitroanilid, se prati na 405 nm i koncentracija formiranog proizvoda po jedinici vremena se izračunava upotrebom molarnog koeficijenta izumiranja od 9920 m"<1>cm"<1>. IC50vrednosti (C) se utvrđuju putem umetanja inicijalnih odnosa u jednačinu sa 4 parametra: Y = (A-D)/(1+(x/C)<A>B)+D

Reagensi i rastvori:

1. Pufer ogleda: 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2) 0,1%

BSA, pH 7,5

2. Humani FVIIa (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.): 10 x radni rastvor - pripremiti 20 nM rastvora u ogledu pufera pre

upotrebe.

3. Rastvorljivi TF (Berlex): 10 x radni rastvor - pripremiti 30 nM rastvora u ogledu pufera pre upotrebe. 4. Hromogeni supstrat S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): Stok rastvor: 10 mM u H20, uskladišteno na 4 C, 2,5 x radni rastvor-pripremiti 2,5 mM rastvora u ogledu pufera pre upotrebe. 5. Antitelo: Pripremiti 2,5X razblaženja u oglednom puferu pre upotrebe.

Uslovi ogleda:

Ogledi se obavljaju na mikrotiter ploči sa 96 bazenčića na sobnoj temperaturi. Konačne koncentracije komponenti su sledeće:

STF 3 nM

Antitelo varira od 1000 do 0,625 nM

FVIIa 2 nM

S2266 1 mM

Postupak ogleda:

1. Pipetovati 0,1 ml_ 2,5x AB (ili pufer kontrola) u svaki bazenčić.

2. Dodati 0,025 ml_ 10x sTF i inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 3. Dodati 0,025 ml_ 10x FVIIa, inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 4. Dodati 0,1 ml_ 2,5x S2266 supstrat, trenutno transferisati ploču u čitač ploče i izmeriti kinetiku enzima na 405 nm u 10-sekundnom intervalu tokom 15 minuta.

Ovaj ogled se može upotrebiti da se meri očigledna KDvezivanja antitela pronalaska za sTF ili FVIIa/TF kompleks, i da se utvrdi da li se antitela pronalaska takmiče sa FVII za vezivanje za TF.

3.Ogled aktiviranja faktora X

Princip ovog ogleda je dole opisan. FVIIa se inkubira sa rekombinantnim humanim TF vezikulama da se formira kompleks proteaze sposoban za aktiviranje supstrata, FX. Ovaj kompleks je formiran u prisustvu (ili odsustvu) različitih koncentracija antitela, onda se supstrat FX uvodi i reakciji se dopušta da se nastavi da se formira proizvod, aktivna proteaza FXa, koja je sposobna da hidrolizuje p-nitroanilid amid vezu hromogenog supstrata S2222. Oslobođeni proizvod hromofore, p-nitroanilid, se prati na 405 nm i formirana koncentracija proizvoda po jedinici vremena se izračunava upotrebom molarnog koeficijenta izumiranja od 9920 M"<1>cm"<1>.. IC50vrednosti (C) se utvrđuju putem umetanja inicijalnih odnosa u jednačinu sa 4 parametra: Y = (A-D)/(1+(x/C)<A>B)+D

Bz-lle-Glu-Gly-Arg-p-NA -? By-lle-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA

S2222 Supstrat Hromofora

Reagensi i sastavi:

1. Pufer ogleda: 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2, 0,1%

BSA, pH 7,5

2. Humani FVIIa (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4 x radni rastvor - pripremiti 100 pM rastvora u ogledu pufera pre

upotrebe.

3. Rekombinantni humani TF (rekonstituisani u našoj laboratoriji od Innovin, Dade): radni rastvor - pripremiti 1:480 razređenje u ogledu

pufera pre upotrebe.

4. Humani faktor X (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4 x radni rastvor- pripremiti 1000 nM rastvor u ogledu pufera pre

upotrebe.

5. Hromogeni supstrat S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):

Stok rastvor: 6 mM u H20, uskladišteno na 4 C.

Radni rastvor - pripremiti 0,78 mM rastvor u 3,57 mM EDTA (da se zaustavi reakcija), 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7,5 pre

upotrebe.

6. Antitelo:

Pripremiti 4x razređenje u ogledu pufera pre upotrebe.

Uslovi ogleda:

Ogledi se obavljaju na mikrotiter ploči sa 96 bazenčića na sobnoj temperaturi. Konačne koncentracije komponenti su sledeće:

Postupak ogleda:

1. Pipetovati 0,15 mL 4x AB (ili pufer kontrola) u svaki bazenčić.

2. Dodati 0,015 mL 4x rTF vezikule.

3. Dodati 0,015 mL 4x FVIIa, inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 4. Dodati 0,015 mL 4x FX, inkubirati 5 min na sobnoj temperaturi sa blagim mešanjem. 5. Dodati 0,14 mL S2222 supstrat, trenutno transferisati ploču u čitač ploče i izmeriti kinetiku enzima na 405 nm u 10-sekundnom intervalu tokom 15 minuta.

4. Ogled aktiviranja proteina C (na sa TF-bogatoj površini)

Ovaj ogled se obavlja kao i za ogled aktiviranja hromogenog proteina C koji je gore naveden sa izuzetkom da se u ovom ogledu humani TF-koji sadrži PC/PS vezikule dodaje fuzionom proteinu, ili kontroli TM, pre dodavanja trombina i proteina C.

PRIMER 6

Karakteristike anti-TF antitela ovog pronalaska

Sedam različitih TF-vezujučih antitela se izoluju iz potpune humane jedno-lančano antitelo izložene biblioteke fage. Afiniteti ovih TF-vezujućih antitela, merenih upotrebom BlAjezgra, su između 35 i 470 nM. Ogled sTF/FVIIa se upotrebljava da se utvredi da li ova antitela blokiraju formiranje aktivnog Vlla/TF kompleksa. U ogledu sTF/FVIIa vezivanje Vila za sTF ubrzava brzinu cepanja spram supstrata hromogenog peptid supstrata S2266 za >20 puta. Antitela koja inhibiraju vezivanje FVIIa za TF blokiraju ovo ubrzanje. Od sedam različitih izolovanih antitela, samo jedno od njih, scFv(TF)3e10 ne inhibira ogled sTF/Vlla. Ovo antitelo povećava afinitet FVIIa za sTF, smanjujući KD5 puta (Slika 1). KDscFv(TF)3e10 antitela za sTF, mereno upotrebom ogleda sTF/FVIIa, je 65,4 nM (Slika 2). Mikrokalorimetrija se upotrebljava da uporedi afinitet scFv(TF)3e10 za TF upoređeno sa FVIIa/TF kompleks. Ovi eksperimenti otkrivaju da antitelo ima~20 puta veći afinitete za TF/FVIIa kompleks upoređeno sa slobodnim sTF (33 nM spram 600 nM, Slika 3). Antitela se upoređuju upotrebom ogleda aktiviranja FX, koji se sastoji od pune dužine TF u fosfolipidnim vezikulama, FVIIa i FX. Količina generisanogFXa se utvrđuje upotrebom hromogenog supstrata S2765. lako scFv(TF)3e10 antitelo nema najveći afinitet mereno sa BlAjezgrom, i što povećava afinitet FVIIa za sTF, scFv(TF)3e10 je jedino antitelo u grupi koje inhibira aktiviranje FX i produžava vreme zgrušavanja u PT ogledu. IC50scFv(TF)3eq10 (dimer) antitela za inhibiciju u ogledu aktiviranje FX je 0,44 nM (Slika 4) i dolazi do dva puta veće ekstenzije PT pri 417 nM (Slika 5)..

scFv(TF)3e10 antitelo se identifikuje na bazi vezivanja za rekombinantni humani rastvorljivi TF. Homologija sekvence TF između humanog i mišjeg ili humanog i zečjeg je 58% i 71%, svaka posebno. Antitelo se vezuje za jedinstveni epitop na humanom TF koji se meša sa aktiviranjem FX sa FVIIa/TF kompleksom. Fiziološki, ovo antitelo ima prednost spram antitela koja se takmiče sa FVII ili FVIIa vezivanjem za TF. KDza oba FVII i FVIIa u humanoj plazmi je ili između 100- i 1000-puta veća neko KD. Mera za kompleks visokog afiniteta će biti spora (70 do 700 sekundi, pod pretpostavkom daje Kon= 108M"<1>sec"<1>). Nasuprot tome, Km od FX za Vlla/TF kompleks je između 0,200 do 4 \ xM i koncentracija FX u humanoj

plazmi je 130 nM (između 0,03- i 0,65-puta KD). Primarna funkcija FVIIa/TF kompleksa u koagulaciji je konvertuje FX u FXa.

PRIMER7

In vitrokarakteristikefuzionog proteina scFv(TF)3e10-Tmi456

Karakteristike fuzionog proteina pronalaska, scFv(TF)3e10-TMi456, se ocenjuju u različitimin vitroogledima. Fuzioni protein, scFv(TF)3e10-TMi456, zadržava sposobnost da inhibira aktiviranje FX sa FVIIa/TF kompleksom (IC50= 0,5 nM, podaci nisu prikazani) i deluje kao kofaktor za trombinom katalizovano aktiviranje proteina C (hromogeni ogled, Slika 6). Nije primećeno da ima značajne razlike u aktivnosti TM kofaktora izmedju fuzionog proteina i samog TMi456 u odsustvu fosfolipidnih vezikula koje sadrže TF. Nasuprot tome aktivnost TM kofaktora fuzionog proteina, ali ne TMi456 se pojačava >5 puta u prisustvu fosfolipidnih vezikula koje sadrže TF (Slika 7).In vitropotencija fuzionog proteina, scFv(TF)3e10-TMi456, spram sa TF-izazvane koagulacije (PT ogled, spoljašnja putanja koagulacije) je 6-puta bolja nego za antitelo scFv(TF)3e10 i 17-pputa bolja nego za TMMi456 sam (Slika 5). Nasuprot tome, nain vitropotencija fuzionog proteina spram unutrašnjih i uobičajenih putanja koagulacije se ne utiču značajnije (APTTiTCT ogledi, podaci nisu dati). Prema tome, doza fuzionog proteina koja izaziva dvostruko produženje u PT ima samo skromno dejstvo na APTT, dok TMi456, pri ekvivalentnoj dozi u PT izaziva 4-puta povećanje u APTT (Slika 8). Ovajin vitro jekonzistentan sa očekivanim za TF/FVIIa-usmerene antikoagulante koji su poznati da imaju superiornu efikasnost na odnose krvarenja kod životinjskih modela tromboze. U skladu sa ogledima koagulacije na plazmi baziranim, fuzioni protein scFv(TF)3e10-TMi456 je potentniji u ogledu koagulacije cele krvi sa TF-izazvane (Thromboelastograph, TEG) nego bilo scFv(TF)3e10 ili TMi456 sami (Slika 9). Dodatno fuzioni protein, scFv(TF)3e10-TMi456 ima predvidiviji odgovor na dozu u ogledu koagulacije cele krvi sa TF-izazvane nego heparin niske molekularne mase (LMVVH, Slika 10). Kao zaključak gornji podaci demonstriraju da su fuzioni proteini pronalaska moćni i selektivni antikoagulantiin vitro.

PRIMER 8

In vivomodel tromboembolije kod pacova

TFdeo antitelo fuzionog proteina scFv(TF)3e10-Tmi456, je specifičan za TF primata. Model tromboembolije pokrenut sa humanim TF (tromboplastin reagens koji sadrži humani rekombinantni TF, Ortho) je razvijen kod svesnih mužjaka Sprague-Dawley pacova (350-400 g, n

>7/grupa). Ovde model raširene intravaskularne koagulacije (DIC), TF, putem ubrizgavanja tromboplastina, izaziva uklanjanje pulmonalnog fibrina, respiratorni bol, i smrt. Ekvimolarne doze scFv(TF)3e10-Tmi456 ili scFv(TF)3e10, ili nosač se ubrizgavaju u repnu venu praćeno, 15 min kasnije, ubrizgavanjem velike pilule tromboplastina (0,5 mL/kg). U sa nosačem tretiranoj grupi, ova doza TF rezultira u 60% smrtnosti (LD60), uobičajeno u okviru 5 min posle ubrizgavanja tromboplastina. Pacovi se ocenjuju prema sledećem morbidnost-mortalitet sistemu ocenjivanja: 0 = bez uticaja; 1 = blagi respiratorni bol (oporavak u okviru 30 min); 2 = ozbiljan respiratorni bol (umirući, zahtevani oporavak više od 60 min); i 3 = smrt. Prosečan rezultat se upotrebljava da se uporedi efikasnost 4 različitih tretiranih grupa. Rezultati upotrebomin vivoogleda su opisani na Slici 11. Fuzioni protein pronalaska je sposoban da smanji mortalitet i smanji respiratorni bol u ovom ogledu.

Prethodni primeri mogu biti ponovljeni sa sličnim uspehom supstituisanjem generički ili specifično opisanih reaktanata i/ili uslova rada ovog pronalaska upotrebljenih u prethodnim primerima.

Dok je pronalazak ilustrativan u pogledu proizvodnje određenih antitelo konstrukata, očigledno je da varijacije i modifikacije pronalaska mogu biti učinjene bez napuštanja duha i obima pronalaska.

Claims (29)

1. Antikoagulantni fuzioni protein,naznačen time,što sadrži protein za ciljanje koji međusobno reaguje sa tkivo faktorom (TF) ili faktor Vlla/TF (FVIIa/TF) kompleksom, koji je operativno vezan za trombomodulin (TM) EGF456 domen ili njegove analoge, fragmente, derivate ili varijante, sam ili u kombinaciji sa bar jednim dodatnim TM domenom odabranom od grupe koja se sastoji od interdomen obruča između EGF3 i EGF4, EGF123 domena, O-vezanog domena glikolizacije, i N-završnog hidrofobičnog region domena, ili njihovih analoga, fragmenata, derivata ili varijanti..

2. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što TM domen sadrži interdomen obruč između EGF3 i EGF4..

3. Fuzioni protein prema zahtevu 2,naznačen time,što navedeni EGF456 domen sadrži tačke mutacije koje čine fuzioni protein otpornijim na oksidativno oštećenje ili aktivnost proteaze ili povećanje katalitičke efikasnosti navedenog fuzionog proteina..

4. Fuzioni protein prema zahtevu 3,naznačen time,što navedeni EGF456 domen sadrži bar jednu tačke mutacije odabranu od grupe koja se sastoji od H381G, M388L, R456G i H457Q.

5. Fuzioni protein prema zahtevu 4,naznačen time,što se navedeni EGF456 domen sastoji od tačaka mutacije na H381G, M388L, R456G i H457Q.

6. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što je navedeni protein za ciljanje.antitelo koje vezuje TF.

7. Fuzioni protein prema zahtevu 6,naznačen time,što je navedeno antitelo monoklonalno antitelo.

8. Fuzioni protein prema zahtevu 7,naznačen time,što se navedeno monoklonalno antitelo vezuje za FVIIa/TF kompleks sa većim afinitetom nego samo za TF.

9. Fuzioni protein prema zahtevu 8,naznačen time,što je navedeno monoklonalno antitelo jedno-lančano antitelo, Fab dimer antitelo ili IgG antitelo.

10. Fuzioni protein prema zahtevu 9,naznačen time,što je navedeno monoklonalno antitelo jedno-lančano antitelo.

11. Fuzioni protein prema zahtevu 7,naznačen time,što je navedeno monoklonalno antitelo operativno vezano za više od jedan TM domen..

12. Fuzioni protein prema zahtevu 7,naznačen time,što navedeno monoklonalno antitelo neutrališe TF.

13. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što je navedeni fuzioni protein glikozilovan.

14. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što je navedeni fuzioni protein modifikovan dodavanjem polietilen glikola.

15. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što je navedeni fuzioni protein biotinilovan za vezivanje streptavidina.

16. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što je navedeni protein za ciljanje FVIIai.

17. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što je navedeni protein za ciljanje TFPI.

18. Farmaceutski sastav koji sadrži fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što se sastav sastoji od farmaceutski prihvatljivog inertnog punioca i terapeutski efektivne količine navedenog fuzionog proteina.

19. Postupak za zaštitu od formiranja trombusa,naznačen time,što se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine fuzionog proteina prema zahtevu 1, pri čemu navedeni fuzioni protein inhibira generisanje trombina bez direktnog uticaja na druge parametre koagulacije kao što su aktiviranje i agregacija krvnih pločica.

20. Postupak prema zahtevu 19,naznačen time,što navedeni postupak izma svrhu da zaštiti od formiranja trombusa kod ishemičnog šloga, trombotičnih komplikacija posle angioplastike, ili mikrovaskularne operacije.

21. Postupak za prevenciju i lečenje duboke venske tromboze (DVT), raširene intravaskularne koagulacije (DIC), akutnog koronarnog sindroma, ili kancera sa evidencijom koagulopatije kod pacijenta,naznačen time,što se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine fuzionog proteina prema zahtevu 1 navedenom pacijentu.

22. Postupak za regulisanje inflamatornog odgovora kod pacijenta,naznačen time,što se sastoji od davanja terapeutski efektivne količine fuzionog proteina prema zahtevu 1 navedenom pacijentu.

23. Postupak prema zahtevu 22,naznačen time,što je navedeni inflamatorni odgovor odabran od grupe koja se sastoji od sepse, presada kože i vena, i transplanta organa.

24. Fuzioni protein prema zahtevu 1,naznačen time,što se navedeni fuzioni protein može upotrebiti da formira ne-trombogeničnu oblogu na površini medicinskog uređaja, pri čemu navedeni medicinski uređaj dolazi u kontakt sa krvlju.

25. Pribor,naznačen time,što se sastoji od fuzionog proteina prema zahtevu 1.

26. Pribor,naznačen time,što sadrži DNK sekvence koje kodiraju komponente fuzionog proteina prema zahtevu 1.

27. Sastav za gensku terapiju,naznačen time,što sadrži DNK koja kodira fuzioni protein i koji se sastoji od sekvence amino kiseline SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO:3, u kombinaciji sa terapeutski efektivnom količinom vektora genske terapije.

28. Antikoagulantni fuzioni protein,naznačen time,što sadrži protein za ciljanje koji međusobno reaguje TF ili FVIIa/TF kompleksom pri čemu je navedeni protein za ciljanje jedno-lančano antitelo koje vezuje TF, koji je operativno vezan za TM EGF456 domen i interdomen obruč između EGF3 i EGF4, pri čemu navedeni EGF456 domen sadrži tačke mutacije na H381G, M388L, R456G i H457Q.

29. Fuzioni protein prema zahtevu 28,naznačen time,što navedeni fuzioni protein sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3.