ES2325877T3 - Moleculas de tipo factor vii o viia. - Google Patents

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ES2325877T3 ES01903611T ES01903611T ES2325877T3 ES 2325877 T3 ES2325877 T3 ES 2325877T3 ES 01903611 T ES01903611 T ES 01903611T ES 01903611 T ES01903611 T ES 01903611T ES 2325877 T3 ES2325877 T3 ES 2325877T3
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Abstract

Un conjugado polipeptídico que comprende al menos un resto azúcar unido covalentemente a un sitio de Nglicosilación introducido in vivo, en el que la secuencia de aminoácidos de la parte polipeptídica de dicho conjugado difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y en la que se ha introducido un sitio de N-glicosilación in vivo mediante la sustitución V253N.

Description

Moléculas de tipo factor VII o VIIa.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos conjugados polipeptídicos del Factor VII (FVII) o Factor VIIa (FVIIa), a su preparación y a su uso en terapia, en particular para el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la coagulación.
Antecedentes de la invención
La coagulación de la sangre es un proceso que consiste en una interacción compleja de diversos componentes (o factores) sanguíneos que eventualmente da lugar a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en lo que se ha denominado la "cascada" de la coagulación son proenzimas o cimógenos, es decir, proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten en una forma activa mediante la acción de un activador. Uno de estos factores de la coagulación es el FVII.
El FVII es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y segregada a la sangre en forma de glicoproteína de cadena sencilla con un peso molecular de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255: 1242-1247). El cimógeno FVII se convierte en una forma activada (FVIIa) mediante la escisión proteolítica en un único sitio, R152-I153, que da como resultado dos cadenas unidas por un único puente disulfuro. El FVIIa en un complejo con el factor tisular (complejo FVIIa) es capaz de convertir al factor IX y al factor X en sus formas activadas, seguido de reacciones que dan lugar a la producción rápida de trombina y la formación de fibrina (\diametersterud & Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5260-5264).
El FVII es sometido a modificaciones post-traduccionales, incluyendo la carboxilación dependiente de vitamina K, que da como resultado 10 residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. Así, los residuos número 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 mostrados en la SEQ ID NO: 1 son los residuos ácidos \gamma-carboxiglutámicos en el dominio Gla importantes para la actividad del FVII. Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la adición de un resto azúcar en dos sitios de N-glicosilación de origen natural en la posición 145 y 322, respectivamente, y en dos sitios de O-glicosilación de origen natural en la posición 52 y 60, respectivamente. El gen que codifica para el FVII humano (hFVII) se ha mapeado para el cromosoma 13 en q34-qter 9 (de Grouchy y col., Hum Genet 1984; 66: 230-233). Contiene nueve exones y se extiende 12,8 Kb (O'Hara y col., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 5158-5162). La organización del gen y la estructura de la proteína del FVII son similares a las de otras proteínas procoagulantes dependientes de la vitamina K, con los exones 1a y 1b que codifican para la secuencia señal; el exón 2 el propéptido y el dominio Gla; el exón 3 una región hidrófoba corta; los exones 4 y 5 los dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico; y el exón 6 a 8 el dominio catalítico serin-proteasa (Yoshitake y col., Biochemistry 1985; 24: 3736-3750).
Existen informes sobre las estructuras tridimensionales experimentales del hFVIIa (Pike y col., PNAS. U.S.A., 1999; 96: 8925-30 y Kemball-Cook y col., J. Struct. Biol, 1999; 127: 213-223), del hFVIIa formando un complejo con el factor tisular soluble usando procedimientos cristalográficos por rayos X (Banner y col., Nature, 1996; 380: 41 y Zhang y col., J.Mol.Biol, 1999; 285: 2089), y de fragmentos más pequeños del hFVII (Muranyi y col., Biochemistry, 1998; 37: 10605 y Kao y col., Biochemistry, 1999; 38: 7097).
Se ha informado de relativamente pocas variantes de la proteína del FVII obtenidas por ingeniería genética (Dickinson & Ruf, J Bio Chem, 1997; 272: 19875-19879, Kemball-Cook y col., J Biol Chem, 1998; 273: 8516-8521, Bharadwaj y col., J Biol Chem, 1996; 271: 30685-30691, Ruf y col., Biochemistry, 1999; 38: 1957-1966).
Existen informes sobre la expresión del FVII en BHK u otras células de mamífero (WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y la co-expresión del FVII y la endoproteasa kex2 en células eucariotas (WO 00/28065).
Las preparaciones comerciales de FVIIa recombinante humana se venden como NovoSeven®. NovoSeven® está indicado para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rFVIIa disponible en el mercado para el tratamiento eficaz y fiable de episodios de sangrado.
En el documento WO 91/1154 se ha informado de una forma inactiva del FVII en la que se ha(n) modificado la arginina 152 y/o la isoleucina 153. Estos aminoácidos están localizados en el sitio de activación. El documento WO 96/12800 describe la inactivación del FVIIa mediante un inhibidor serin-proteinasa; la inactivación mediante carbamilación del FVIIa en el grupo \alpha-aminoácido I153 ha sido descrita por Petersen y col., Eur J Biochem, 1999; 261: 124-129. La forma inactivada es capaz de competir con el FVII o FVIIa de tipo silvestre por la unión al factor tisular e inhibe la actividad coagulante. Se ha sugerido el uso de la forma inactivada del FVIIa para el tratamiento de pacientes que estén en estados hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis, en riesgo de infarto de miocardio o de ictus trombótico.
En el "Summary Basis for Approval for NovoSeven®" se ha informado de una semi-vida del rFVIIa circulante de 2,3 horas, número de referencia 96-0597 de la FDA. Para alcanzar y mantener el efecto terapéutico o profiláctico deseado son necesarias dosis relativamente altas y la administración frecuente. Como consecuencia, es difícil de obtener la regulación de la dosis adecuada y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones sobre la calidad de vida del paciente.
Otro problema en el tratamiento actual del rFVIIa es la inestabilidad relativa de la molécula con respecto a la degradación proteolítica. La degradación proteolítica es un obstáculo importante para la obtención de una preparación en disolución frente a un producto liofilizado. La ventaja de obtener una preparación soluble estable reside en una manipulación más fácil para el paciente, y, en el caso de emergencias, una acción más rápida, que potencialmente le puede salvar la vida. En el documento WO 88/10295 se han descrito intentos para prevenir la degradación proteolítica mediante mutagénesis dirigida en los sitios proteolíticos principales.
Una molécula con una semi-vida en circulación más prolongada reduciría el número de administraciones necesarias. Dada la asociación del producto FVIIa actual a inyecciones frecuentes, y el potencial para obtener niveles terapéuticos de FVIIa más óptimos, con un efecto terapéutico mejorado simultáneo, existe una clara necesidad de moléculas de tipo FVII o FVIIa mejoradas. Una forma de incrementar la semi-vida en circulación de una proteína es asegurar que se reduce el aclaramiento renal de la proteína. Esto se puede conseguir conjugando la proteína con un resto químico, que sea capaz de conferir un aclaramiento renal reducido a la proteína.
Además, la unión de un resto químico a la proteína o la sustitución de aminoácidos expuestos a proteolisis pueden bloquear de forma eficaz a una enzima proteolítica del contacto que da lugar a la degradación proteolítica de la proteína. El polietilenglicol (PEG) es uno de esos restos químicos que se ha usado en la preparación de productos de proteínas terapéuticas.
El documento WO 98/32466 sugiere que el FVII, entre muchas otras proteínas, se puede PEGilar, pero no contiene ninguna información adicional al respecto.
El documento EP 0370205A describe un procedimiento para la adición de cadenas de carbohidratos a polipéptidos introduciendo un tripéptido Asn-X-Thr/Ser.
La patente de EE.UU. 5.580.560 describe un factor VII o VIIa modificado con al menos una sustitución y/o supresión de un residuo lisina, arginina, isoleucina, fenilalanina o tirosina en posición 38, 32, 290, 315, 341, 304, 42, 44, 278 ó 332.
Breve descripción de la invención
Esta solicitud describe moléculas FVII y FVIIa mejoradas, en particular moléculas hFVII y hFVIIa recombinantes, que proporcionan uno o más de los beneficios deseados anteriormente mencionados. Así, el conjugado de la presente invención tiene una o más propiedades mejoradas comparado con el rFVIIa disponible comercialmente, incluyendo una semi-vida funcional in vivo incrementada y/o una semi-vida plasmática incrementada, y/o una biodisponibilidad incrementada y/o una sensibilidad reducida a la degradación proteolítica. En consecuencia, el tratamiento médico con un conjugado de la invención ofrece una serie de ventajas sobre el compuesto rFVIIa disponible actualmente, tal como una duración más prolongada entre inyecciones.
Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a un conjugado polipeptídico de comprende al menos un resto azúcar unido covalentemente a un sitio de N-glicosilación introducido in vivo, en el que la secuencia de aminoácidos de la parte polipeptídica de dicho conjugado difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrado en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y en el que se ha introducido un sitio de N-glicosilación in vivo mediante la sustitución V253N.
En aspectos adicionales la invención se refiere a: una secuencia de nucleótidos que codifica la parte polipeptídica del conjugado de la invención; un vector de expresión que alberga la secuencia de nucleótidos de la invención; una célula hospedadora que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención o el vector de expresión de la
invención.
En otros aspectos adicionales la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado de la invención así como al uso de los conjugados.
Descripción detallada de la invención Definiciones
En el contexto de la presente solicitud e invención se aplican las siguientes definiciones:
El término "conjugado" (o de manera intercambiable "polipéptido conjugado") está previsto que indique una molécula heterogénea (en el sentido de compuesta o quimérica) formada por la unión covalente de uno o más polipéptidos a uno o más restos no polipeptídicos tales como moléculas poliméricas, compuestos lipófilos, restos azúcares o agentes derivantes orgánicos. Preferentemente, el conjugado es soluble en las concentraciones y condiciones pertinentes, es decir, soluble en fluidos fisiológicos tales como la sangre. Ejemplos de polipéptidos conjugados de la invención incluyen polipéptidos glicosilados y/o PEGilados. El término "unión covalente" significa que el polipéptido y el resto no polipeptídico están directamente unidos de manera covalente entre sí, o bien están indirectamente unidos de manera covalente entre sí mediante un resto o restos intermedios, tales como un puente, un espaciador, o un resto o restos de enlace.
El término "polipéptido no conjugado" se puede usar como la parte polipeptídica del conjugado.
Cuando se usa en el presente documento, el término "resto no polipeptídico" significa una molécula que es capaz de conjugarse con un grupo de unión del polipéptido de la invención. Ejemplos preferidos de esas moléculas incluyen moléculas poliméricas, restos azúcares, compuestos lipófilos, o agentes derivantes orgánicos. Cuando se usa en el contexto de un conjugado de la invención se entenderá que el resto no polipeptídico está unido a la parte polipeptídica del conjugado a través de un grupo de unión del polipéptido. Como se ha explicado anteriormente, el resto no polipeptídico puede estar directamente unido de manera covalente al grupo de unión o puede estar indirectamente unido de manera covalente al grupo de unión a través de un resto o restos intermedios, tales como un puente, un espaciador, o un resto o restos de enlace.
La "molécula polimérica" es una molécula formada por un enlace covalente de dos o más monómeros, en la que ninguno de los monómeros es un residuo aminoácido, excepto cuando el polímero es albúmina humana u otra proteína plasmática abundante.
El término "polímero" se puede usar de manera intercambiable con el término "molécula polimérica". Está previsto que el término cubra moléculas de carbohidratos unidas mediante glicosilación in vitro, es decir, una glicosilación sintética realizada in vitro que normalmente supone la unión covalente de una molécula de carbohidrato con un grupo de unión del polipéptido, opcionalmente usando un agente de entrecruzamiento.
Las moléculas de carbohidratos unidas mediante glicosilación in vivo, tal como N- u O-glicosilación (como se describe en profundidad a continuación) se denominan en el presente documento "resto azúcar". Excepto cuando en el conjugado esté expresamente indicado el número de restos no polipeptídicos, tales como molécula(s) polimérica(s) o restos azúcares, cada referencia a "un resto no polipeptídico" contenido en un conjugado o usado de otra forma en la presente invención hará referencia a uno o más restos no polipeptídicos, tales como molécula(s) polimérica(s) o restos azúcares.
El término "grupo de unión" está previsto que indique un grupo funcional del polipéptido, en particular uno de sus residuos aminoácidos o un resto carbohidrato, capaz de unirse a un resto no polipeptídico tal como una molécula polimérica, una molécula lipófila, un resto azúcar o un agente derivante orgánico. Los grupos de unión útiles y sus restos no polipeptídicos correspondientes son evidentes de la tabla siguiente.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Para la N-glicosilación, el término "grupo de unión" se usa de una forma no convencional para indicar los residuos aminoácidos que constituyen un sitio de N-glicosilación (con la secuencia N-X-S/T/C, en la que X es un residuo aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es serina, treonina o cisteína, preferentemente serina o treonina, y lo más preferentemente treonina). Aunque el residuo asparagina del sitio de N-glicosilación es al que se une el resto azúcar durante la glicosilación, dicha unión no se puede llevar a cabo a menos que estén presentes los otros residuos aminoácidos del sitio de N-glicosilación.
Por consiguiente, cuando el resto no polipeptídico es un resto azúcar y la conjugación se debe llevar a cabo mediante N-glicosilación, el término "residuo aminoácido que comprende un grupo de unión para el resto no polipeptídico" como se usa en relación con alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés se debe entender que significa que se deben alterar uno o más residuos aminoácidos que constituyen un sitio de N-glicosilación, de tal forma que se introduce un sitio de N-glicosilación funcional en la secuencia de aminoácidos o se elimina de dicha secuencia.
En la presente solicitud, los nombres de los aminoácidos y los nombres de los átomos (por ejemplo, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, etc) se usan según está definido en el Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org) basados en la nomenclatura de la IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (nombres de los residuos, nombres de átomos, etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) junto con sus correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)).
El término "residuo aminoácido" pretende indicar un residuo aminoácido contenido en el grupo que consta de residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W), y tirosina (Tyr o Y).
La terminología usada para la identificación de las posiciones de los aminoácidos se ilustra a continuación: G124 indica que la posición 124 está ocupada por un residuo de glicina en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. G124R indica que el residuo de glicina de la posición 124 ha sido sustituido con un residuo de arginina. Las sustituciones alternativas están indicadas con una "/", por ejemplo, K32D/E significa una secuencia de aminoácidos en la que la lisina en posición 32 se sustituye con ácido aspártico o ácido glutámico. Las sustituciones múltiples están indicadas con un "+", por ejemplo, K143N+N145S/T significa una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución del residuo lisina en posición 143 con un residuo asparagina y una sustitución del residuo asparagina en posición 145 con un residuo serina o treonina. La inserción de un residuo aminoácido adicional, tal como la inserción de un residuo alanina después de G124 está indicada mediante G124GA. Una supresión de un residuo aminoácido está indicada mediante un asterisco. Por ejemplo, la supresión de una glicina en posición 124 está indicada mediante G124*. A menos que se indique otra cosa, la numeración de los residuos aminoácidos del presente documento se realiza en relación a la secuencia de aminoácidos del FVII/FVIIa de tipo silvestre mostrado en la SEQ ID NO: 1.
El término "difiere de" como se usa en relación con mutaciones específicas pretende indicar que permita que estén presentes diferencias adicionales aparte de la diferencia en aminoácidos especificada. Por ejemplo, además de la eliminación y/o introducción de residuos aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el resto no polipeptídico, el polipéptido FVII o FVIIa puede comprender otras sustituciones que no están relacionadas con la introducción y/o eliminación de tales residuos aminoácidos. Así, además de las alteraciones en los aminoácidos descritas en el presente documento dirigidas a la eliminación y/o introducción de sitios de unión para el resto no polipeptídico, se entenderá que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención puede, si se desea, contener otras alteraciones que no necesariamente están relacionadas con la introducción o eliminación de sitios de unión, es decir, otras sustituciones, inserciones o supresiones. Esto puede incluir, por ejemplo, el truncamiento del N- y/o C-término por uno o más residuos aminoácidos, o la adición de uno o más residuos extras en el N- y/o C-término, por ejemplo, la adición de un residuo metionina en el N-término así como "sustituciones de aminoácidos conservativas", es decir, sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos.
Las sustituciones preferidas en la presente invención se pueden seleccionar, en particular, de los grupos de sustituciones conservativas listadas en la tabla siguiente.
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Los términos "mutación" y "sustitución" se usan de manera intercambiable en el presente documento.
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El término "secuencia de nucleótidos" pretende indicar una extensión consecutiva de dos o más moléculas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquiera de sus combinaciones. El término "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" generalmente se refiere a un procedimiento para la amplificación in vitro de una secuencia deseada de nucleótidos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 4.683.195. En general, el procedimiento de la PCR supone ciclos repetidos de síntesis de extensión del cebador, usando cebadores de oligonucleótidos capaces de hibridarse preferentemente a un ácido nucleico molde. "Célula", "célula hospedadora", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable en el presente documento y todos esos términos se debe entender que incluyen la progenie que resulta del crecimiento o el cultivo de una célula. "Transformación" y "transfección" se usan de manera intercambiable para referirse al proceso de introducción de ADN en una célula.
"Unido de manera operable" se refiere a la unión covalente de dos o más secuencias de nucleótidos, por medio de ligación enzimática u otra forma, en una configuración relativa entre sí tal que se puede llevar a cabo la función normal de las secuencias. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una presecuencia o una secuencia líder secretora está unida de manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido de manera operable a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; un sitio de unión del ribosoma está unido de manera operable a una secuencia codificante si está situado de manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido de manera operable" significa que las secuencias de nucleótidos que están unidas son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. La unión se consigue por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos, junto con procedimientos de recombinación de ADN habituales.
El término "introducir" se refiere a la introducción de un residuo aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico, en particular, mediante la sustitución de un residuo aminoácido existente, o alternativamente, mediante la inserción de un residuo aminoácido adicional.
El término "eliminar" se refiere a la eliminación de un residuo aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico, en particular, mediante la sustitución del residuo aminoácido a eliminar por otro residuo aminoácido, o alternativamente, mediante la supresión (sin sustitución) del residuo aminoácido a eliminar.
El término "FVII" o "polipéptido FVII" se refiere a una molécula FVII proporcionada en forma de cadena sencilla.
El término "FVIIa" o "polipéptido FVIIa" se refiere a una molécula FVII proporcionada en su forma bicatenaria activada, en la que se ha escindido el enlace peptídico entre R152 e I153 de la forma de cadena sencilla. Cuando en el presente documento se usa la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 para describir la secuencia de aminoácidos del FVIIa, se entenderá que una de las cadenas comprende los residuos aminoácidos 1-152, y la otra cadena los residuos aminoácidos 153-406.
Los términos "rFVII" y "rFVIIa" se refieren a moléculas FVII y FVIIa producidas mediante técnicas recombinantes, respectivamente.
Los términos "hFVII" y "hFVIIa" se refieren al FVII y FVIIa humano silvestre, respectivamente.
El término "sitio catalítico" se usa para referirse a la tríada catalítica que consta de S344, D242 y H193 del polipéptido FVII. El término "FVIIa activo", "polipéptido FVIIa activo", "conjugado FVIIa activo" o "conjugado activo" se usa para referirse a un polipéptido o conjugado FVIIa que posee al menos el 10% de la actividad catalítica del FVIIa de tipo silvestre. La actividad catalítica, como se usa en el presente documento, se puede determinar de manera conveniente en el ensayo descrito en la sección titulada Procedimiento de medición de la actividad catalítica o en el ensayo titulado Procedimiento de medición de bajos niveles de actividad catalítica (véase la sección Materiales y procedimientos del presente documento). Preferentemente, un conjugado activo tiene al menos el 15%, tal como al menos el 20%, por ejemplo, al menos el 25%, más preferentemente al menos el 30%, tal como al menos el 40%, lo más preferentemente al menos el 50%, por ejemplo, al menos el 60% de la actividad catalítica del hFVIIa de tipo silvestre, cuando se somete a pruebas en los ensayos descritos anteriormente.
Preferentemente, un conjugado activo es capaz de unirse al factor tisular y activar posteriormente el factor plasmático X y/o IX. Así, en una forma de realización preferida, el polipéptido FVIIa o uno de sus conjugados tiene una actividad coagulante de al menos el 25%, comparada con el FVIIa de tipo silvestre, tal como una actividad coagulante de al menos el 50% comparada con el FVIIa, por ejemplo, una actividad coagulante de al menos el 75% comparada con el FVII de tipo silvestre. Así, la actividad coagulante del polipéptido FVIIa activo o uno de sus conjugados está preferentemente en el intervalo del 25-200% comparada con el FVIIa de tipo silvestre. En particular, se prefiere que el polipéptido o el conjugado FVIIa tengan una actividad coagulante en el intervalo del 30-150% comparada con el FVIIa de tipo silvestre, tal como una actividad coagulante en el intervalo del 30-100% comparada con el FVIIa de tipo silvestre. La actividad coagulante se puede determinar mediante cualquier procedimiento conocido en la materia, como se describe en profundidad en la sección de Materiales y procedimientos posteriormente. No obstante, se prefiere particularmente que la actividad coagulante se determine de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección titulada "Medición de la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica" (véase sección de Materiales y procedimientos).
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El término "semi-vida funcional in vivo" se usa con su significado normal, es decir, el tiempo al cual el 50% de la actividad biológica del polipéptido o el conjugado aún está presente en el cuerpo/órgano diana, o el tiempo al cual la actividad del polipéptido o el conjugado es el 50% del valor inicial. Como alternativa a la determinación de la semi-vida funcional in vivo, se puede determinar la "semi-vida sérica", es decir, el tiempo al cual el 50% de las moléculas de polipéptido o de conjugado circulan en plasma o en el torrente sanguíneo antes de ser aclaradas. La determinación de la semi-vida sérica a menudo es más simple que la determinación de la semi-vida funcional in vivo y la magnitud de la semi-vida sérica normalmente es una buena indicación de la magnitud de la semi-vida funcional in vivo. Términos alternativos a la semi-vida sérica incluyen "semi-vida plasmática", "semi-vida en circulación", "aclaramiento sérico", "aclaramiento plasmático" y "semi-vida de aclaramiento". El polipéptido o el conjugado se aclaran por la acción de uno o más de los sistemas reticuloendoteliales (RES), riñón, bazo o hígado, por la eliminación mediada por el factor tisular, por el receptor SEC o por otro receptor, y por proteolisis específica o inespecífica. Normalmente, el aclaramiento depende del tamaño (en relación al límite para la filtración glomerular), la carga, cadenas de carbohidratos unidas, y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad a retener normalmente se selecciona de la actividad procoagulante, proteolítica o de unión al receptor. La semi-vida funcional in vivo y la semi-vida sérica se pueden determinar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la materia como se describe en profundidad en la sección de Materiales y procedimientos a continuación.
El término "incrementado" como se usa en relación a la semi-vida funcional in vivo o la semi-vida plasmática se usa para indicar que la semi-vida relevante del conjugado o del polipéptido está estadísticamente incrementada de forma significativa en relación a la de la molécula de referencia, tal como un rFVIIa no conjugado (por ejemplo, NovoSeven®) según se determina en condiciones comparables. Por ejemplo, la semi-vida relevante se puede incrementar en al menos el 25% aproximadamente, tal como en al menos el 50% aproximadamente, por ejemplo, en al menos el 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 500% o 1000% aproximadamente.
El término "aclaramiento renal" se usa con su significado normal para indicar todo aclaramiento que tiene lugar en los riñones, por ejemplo, mediante filtración glomerular, excreción o degradación tubular en las células tubulares. El aclaramiento renal depende de las características físicas del conjugado, incluyendo el tamaño (diámetro), el volumen hidrodinámico, la simetría, la forma/rigidez, y la carga. Normalmente, un peso molecular de 67 kDa aproximadamente se considera que es un valor límite para el aclaramiento renal. El aclaramiento renal se puede establecer mediante cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo in vivo establecido. Normalmente, el aclaramiento renal se determina administrando un conjugado polipeptídico marcado (por ejemplo, radiomarcado o marcado por fluorescencia) a un paciente y midiendo la actividad marcada en la orina recogida del paciente. El aclaramiento renal reducido se determina en relación a un polipéptido de referencia correspondiente, por ejemplo, el polipéptido no conjugado correspondiente, un polipéptido silvestre no conjugado correspondiente u otro polipéptido conjugado (tal como un polipéptido conjugado no según la invención), en condiciones comparables. Preferentemente, la velocidad de aclaramiento renal del conjugado se reduce en al menos el 50%, preferentemente en al menos el 75%, y lo más preferentemente en al menos el 90% comparada con un polipéptido de referencia relevante.
La capacidad de los conjugados de la invención para presentar una sensibilidad reducida a la degradación proteolítica es de máxima importancia. Las composiciones que comprenden productos de degradación normalmente tendrán menos actividad específica comparada con composiciones en las que ninguna o sólo una pequeña parte del conjugado se ha degradado. Además, el contenido de productos de degradación no fisiológicos en la composición a administrar puede disparar el sistema inmunitario del paciente. El término "sensibilidad reducida a la degradación proteolítica" está previsto que signifique principalmente que el conjugado tiene una sensibilidad reducida a la degradación proteolítica en comparación con un FVIIa de tipo silvestre no conjugado según se determina en condiciones comparables. Preferentemente, la degradación proteolítica se reduce en al menos el 10%, tal como al menos el 25% (por ejemplo, el 10-25%), más preferentemente en al menos el 35%, tal como al menos el 50% (por ejemplo, el 10-50%, tal como el 25-50%), incluso más preferentemente en al menos el 60%, tal como en al menos el 75% o incluso en al menos el 90%. Más preferentemente, la degradación proteolítica se reduce en un 100%. Así, preferentemente el conjugado de la invención es sometido a degradación proteolítica en un menor grado que el FVIIa de tipo silvestre, es decir, comparado con el FVIIa de tipo silvestre no conjugado, la degradación proteolítica del conjugado de la invención se reduce preferentemente en un 10-100%, tal como en un 25-100%, más preferentemente en un 50-100%, y lo más preferentemente en un 75-100%. Los presentes inventores han desarrollado una prueba preliminar in vitro adecuada, que se puede emplear en la valoración de si tales conjugados poseen una sensibilidad reducida a la escisión proteolítica (autoproteolisis reducida). Así, en una forma de realización preferida de la invención, el conjugado de la invención tiene una sensibilidad reducida a la degradación proteolítica (como se ha definido anteriormente) comparada con el FVIIa de tipo silvestre cuando se determina mediante el procedimiento descrito en la sección titulada "Medición de la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica", cuando se determina mediante el procedimiento descrito en la sección titulada Procedimiento de medición de la actividad catalítica o cuando se determina mediante el procedimiento descrito en la sección titulada Procedimiento de medición de bajos niveles de actividad catalítica (véase sección de Materiales y procedimientos del presente documento).
El término "FVII parental" o "polipéptido parental" está previsto que indique la molécula a modificar de acuerdo con la presente invención. Un FVII parental típico es el hFVII o el hFVIIa (incluyendo rFVIIa (NovoSeven®)) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
Una "variante" es un polipéptido, que difiere en uno o más residuos aminoácidos del polipéptido parental, normalmente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos aminoácidos.
Conjugado de la invención
Los conjugados de la invención son el resultado de una nueva estrategia general para el desarrollo de moléculas FVII o FVIIa mejoradas. Más específicamente, mediante la eliminación y/o introducción de un residuo aminoácido que comprende un grupo de unión para el resto no polipeptídico es posible adaptar específicamente el polipéptido para así hacer la molécula más susceptible a la conjugación con el resto no polipeptídico elegido, optimizar el patrón de conjugación (por ejemplo, asegurar una distribución y un número de restos no polipeptídicos óptimos en la superficie de la molécula FVII o FVIIa y asegurarse de que sólo están presentes en la molécula los grupos de unión previstos para ser conjugados) y así obtener una nueva molécula conjugada, que tiene o no tiene actividad FVII y además una o más propiedades mejoradas comparadas con las moléculas FVII o FVIIa disponibles actualmente. Por ejemplo, cuando el número total de residuos aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el no polipéptido elegido se incrementa o se reduce hasta un nivel optimizado, el aclaramiento renal del conjugado normalmente se reduce significativamente debido a la forma, tamaño y/o carga alterada de la molécula obtenida mediante la conjugación.
En formas de realización preferidas de la presente invención se altera más de un residuo aminoácido del polipéptido FVII o FVIIa, por ejemplo, la alteración comprende la eliminación y la introducción de residuos aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el resto no polipeptídico elegido. Además de la eliminación y/o introducción de residuos aminoácidos, el polipéptido puede comprender otras sustituciones o glicosilaciones que no estén relacionadas con la introducción y/o eliminación de residuos aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el resto no polipeptídico. Además, el polipéptido puede estar unido, por ejemplo, a un inhibidor serinproteinasa para inhibir el sitio catalítico del polipéptido.
El residuo aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico, ya sea eliminado o introducido, se selecciona en base a la naturaleza del resto no polipeptídico elegido y, en la mayoría de los casos, en base al procedimiento con el cual se tiene que llevar a cabo la conjugación entre el polipéptido y el resto no polipeptídico. Por ejemplo, cuando el resto no polipeptídico es una molécula polimérica tal como polietilenglicol o un óxido de polialquileno, los residuos aminoácidos derivados que comprenden un grupo de unión se pueden seleccionar del grupo constituido por lisina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, y tirosina, preferentemente cisteína y lisina, en particular lisina.
Siempre que se debe introducir o eliminar un grupo de unión para un resto no polipeptídico del polipéptido FVII o FVIIa de acuerdo con la presente invención, la posición del polipéptido a modificar preferentemente está localizada en la superficie del polipéptido, y más preferentemente está ocupada por un residuo aminoácido que tiene más del 25% de su cadena lateral expuesta al disolvente, preferentemente más del 50% de su cadena lateral expuesta al disolvente. Tales posiciones se han identificado en base a un análisis de la estructura tridimensional de la molécula FVII o FVIIa humana como se describe en la sección de Materiales y procedimientos en el presente documento. Además, la posición se selecciona preferentemente de una parte de la molécula FVII que está localizada fuera de la región del sitio de unión del factor tisular y/o la región del sitio activo. Estas regiones están identificadas en la sección de Materiales y procedimientos en el presente documento. No obstante, se debe subrayar que en ciertas situaciones, por ejemplo, en el caso de que se desee un conjugado inactivado, puede ser ventajoso realizar modificaciones dentro o cerca de esas regiones. Por ejemplo, está contemplado que se puedan insertar de manera ventajosa uno o más grupos de unión para los restos no polipeptídicos, tales como grupos de unión para sitios de N-glicosilación in vivo, en la región del sitio activo o en el borde de la hendidura de unión del sitio activo de la molécula FVII. La región del sitio activo y el borde de la hendidura de unión del sitio activo están definidos en la sección de Materiales y procedimientos del presente documento y está constituido por los siguientes residuos:
I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y F405 (región del sitio activo); y N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 y T370 (borde de la hendidura de unión del sitio activo).
Para determinar una distribución óptima de los grupos de unión, la distancia entre los residuos aminoácidos localizados en la superficie de la molécula FVII o FVIIa se calcula en base a la estructura tridimensional del polipéptido. Más específicamente, se determina la distancia entre los CBs de los residuos aminoácidos que comprenden tales grupos de unión, o la distancia entre el grupo funcional (NZ para la lisina, CG para el ácido aspártico, CD para el ácido glutámico, SG para la cisteína) de uno y el CB de otro residuo aminoácido que comprende un grupo de unión. En el caso de la glicina, se usa CA en lugar de CB. En la parte del polipéptido FVII o FVIIa de un conjugado la invención, cualquiera de dichas distancias preferentemente es superior a 8 \ring{A}, en particular superior a 10 \ring{A} para evitar o reducir una conjugación heterogénea.
En el caso de la eliminación de un grupo de unión, el residuo aminoácido relevante que comprende tal grupo, y que ocupa una posición como se ha definido anteriormente, se sustituye preferentemente con un residuo aminoácido diferente que no comprende un grupo de unión para el resto no polipeptídico en cuestión. Normalmente, el residuo aminoácido a eliminar es uno para el que la conjugación supone una desventaja, por ejemplo, un residuo aminoácido localizado en o cerca de un sitio funcional del polipéptido (puesto que la conjugación en ese sitio puede dar como resultado la inactivación o una actividad FVII o FVIIa reducida del conjugado resultante debido a un reconocimiento deteriorado del receptor). En el presente contexto, el término "sitio funcional" está previsto que indique uno o más residuos aminoácidos que es/son esenciales o están involucrados de otra forma en el funcionamiento o comportamiento del FVII o FVIIa. Tales residuos aminoácidos son una parte del sitio funcional. El sitio funcional se puede determinar mediante procedimientos conocidos en la materia y preferentemente se identifica mediante el análisis de la estructura del complejo FVII-factor tisular (véase Banner y col., Nature 1996; 380: 41-46).
En el caso de la introducción de un grupo de unión, un residuo aminoácido que comprende ese grupo se introduce en la posición, preferentemente mediante la sustitución del residuo aminoácido que ocupa esa posición.
El número exacto de grupos de unión presentes disponibles para la conjugación en el polipéptido FVII o FVIIa depende del efecto deseado a conseguir mediante la conjugación. El efecto a obtener depende, por ejemplo, de la naturaleza y el grado de conjugación (por ejemplo, la identidad del resto no polipeptídico, el número de restos no polipeptídicos deseables o posibles para conjugar al polipéptido, dónde se deben conjugar y dónde se debe evitar la conjugación, etc.).
La semi-vida funcional in vivo depende del peso molecular del conjugado, y el número de grupos de unión necesarios para proporcionar una semi-vida incrementada, que depende así del peso molecular del resto no polipeptídico en cuestión. En una forma de realización, el conjugado de la invención tiene un peso molecular de al menos 67 kDa, en particular de al menos 70 kDa, por ejemplo, como se mide por SDS-PAGE según Laemmli, U.K., Nature Vol 227 (1970), p680-85. El FVII tiene un peso molecular de 53 kDa aproximadamente, y por tanto son necesarios 10-20 kDa adicionales para obtener el efecto deseado. Esto se puede conseguir, por ejemplo, conjugando 2-4 moléculas de PEG de 10 kDa o como se describe en otra parte del presente documento.
Para evitar demasiada interrupción en la estructura y la función de la molécula parental, la parte polipeptídica del conjugado normalmente tendrá una secuencia de aminoácidos con una identidad a la SEQ ID NO: 1 superior al 90%, preferentemente superior al 95%, tal como superior a 96%. En particular, la parte polipeptídica del conjugado normalmente tendrá una secuencia de aminoácidos con una identidad a la SEQ ID NO: 1 superior al 97%, tal como superior al 98%, superior al 99%, superior al 99,25% o superior al 99,5%.
La homología/identidad de la secuencia de aminoácidos se determina convenientemente a partir de secuencias alineadas, usando por ejemplo, el programa ClustalW, versión 1.8, Junio 1999, usando los parámetros por defecto (Thompson y col., 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680) o a partir de la base de datos de las familias PFAM versión 4.0 (http://pfam.wustl.edu/) (Nucleic Acids Res. 1 Enero 1999; 27 (1): 260-2) mediante el uso de GENEDOC versión 2.5 (Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., y Deerfield, D.W. II. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW. NEWS 4: 14; Nicholas, K.B. y Nicholas H.B. Jr. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation).
Planteado de manera diferente, el número total de residuos aminoácidos a alterar de acuerdo con la presente invención (comparado con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1) normalmente no excederá de 15. Preferentemente, la parte polipeptídica de FVII o FVIIa del conjugado de la invención o del polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en 1-15 residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, normalmente en 1-10 o en 2-10 residuos aminoácidos, por ejemplo, en 1-8 o en 2-8 residuos aminoácidos, tal como en 3-7 o en 4-6 residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Así, normalmente la parte polipeptídica del conjugado o del polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en un máximo de 15 residuos aminoácidos (tal como 15 residuos aminoácidos), en un máximo de 14 residuos aminoácidos (tal como 14 residuos aminoácidos), en un máximo de 13 residuos aminoácidos (por ejemplo 13 residuos aminoácidos), en un máximo de 12 residuos aminoácidos (tal como 12 residuos aminoácidos), en un máximo de 11 residuos aminoácidos (tal como 11 residuos aminoácidos), en un máximo de 10 residuos aminoácidos (por ejemplo 10 residuos aminoácidos), en un máximo de 9 residuos aminoácidos (tal como 9 residuos aminoácidos), en un máximo de 8 residuos aminoácidos (tal como 8 residuos aminoácidos), en un máximo de 7 residuos aminoácidos (tal como 7 residuos aminoácidos), en un máximo de 6 residuos aminoácidos (tal como 6 residuos aminoácidos), en un máximo de 5 residuos aminoácidos (tal como 5 residuos aminoácidos), en un máximo de 4 residuos aminoácidos (tal como 4 residuos aminoácidos), en un máximo de 3 residuos aminoácidos (tal como 3 residuos aminoácidos) o en un máximo de 2 residuos aminoácidos (tal como 2 residuos aminoácidos).
Análogamente, el conjugado de la invención normalmente contiene, por ejemplo, 1-15 restos no polipeptídicos, normalmente 1-10 restos no polipeptídicos o 2-10 restos no polipeptídicos, tal como 1-8 ó 2-8 restos no polipeptídicos, por ejemplo, 1-6, 1-4, 3-7 ó 4-6 restos no polipeptídicos.
Preferentemente, el conjugado de la invención tiene una o más de las siguientes propiedades mejoradas: semi-vida funcional in vivo incrementada, semi-vida plasmática incrementada, aclaramiento renal reducido y sensibilidad reducida a la degradación proteolítica comparada con rFVIIa (por ejemplo, NovoSeven®).
Es sabido de, entre otros, el documento WO 88/10295 que la degradación proteolítica del FVII/FVIIa principalmente tiene lugar en diversos sitios proteolíticos en la molécula, a saber, en las posiciones K32, K38, I42, Y44, K143, R290, R315, K341, R392, R396 y R402 (o mejor dicho, entre las posiciones K32-D33, K38-L39,142-S43, Y44-S45, K143-R144, R290-G291, R315-K316, K341-G342, R392-S393, R396-P397 y R402-A403). Así, una estrategia para incrementar, por ejemplo, la semi-vida funcional in vivo, la semi-vida plasmática incrementada o para reducir la sensibilidad a la degradación proteolítica es modificar el polipéptido parental en y/o alrededor de uno o más de estos sitios de degradación proteolíticos, por ejemplo, mediante la introducción de restos no polipeptídicos en y/o alrededor de estos sitios. Así, se puede introducir un grupo de unión en una o más de las posiciones identificadas anteriormente mencionadas o en la posición -4, -3, -2, -1, 1, 2, 3, 4, preferentemente en la posición 2, -1, 1, 2, tal como la posición -1, 1, en relación con la posición directamente involucrada en la degradación proteolítica.
Más específicamente, se puede introducir un sitio de glicosilación in vivo no de origen natural, en particular, un sitio de N-glicosilación in vivo no de origen natural (véase con detalle a continuación) en posiciones seleccionadas del grupo constituido por 28-48,139-147, 286-294, 311-319, 338-345, y 388-406. En particular, se puede introducir el sitio de glicosilación in vivo, tal como el sitio de N-glicosilación in vivo (véase con detalle a continuación) en posiciones seleccionadas del grupo constituido por 30-34, 36-46, 141-144, 288-292, 313-317, 341-343, 390-398 y 400-404. Se puede introducir el sitio de glicosilación in vivo, tal como el sitio de N-glicosilación in vivo (véase con detalle a continuación) en posiciones seleccionadas del grupo constituido por 31-33 (por ejemplo, posiciones 31, 32 ó 33), 37-39 (por ejemplo, posiciones 37, 38 ó 39), 41-46 (por ejemplo, posiciones 41, 42, 43, 44, 45 ó 46), 142-144 (por ejemplo, posiciones 142,143 ó 144), 289-291 (por ejemplo, posiciones 289, 290 ó 291), 314-316, (por ejemplo, posiciones 314, 315 ó 316), 341-342 (por ejemplo, posiciones 341, 342 ó 343), 391-393 (por ejemplo, posiciones 391, 392 ó 393), 395-397 (por ejemplo, posiciones 395, 396 ó 397) y 401-403 (por ejemplo, posiciones 401, 402 ó 403). La introducción se realiza preferentemente mediante sustitución.
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Conjugado de la invención en el que el resto no polipeptídico es un resto azúcar
El conjugado de la invención es uno que comprende al menos un resto azúcar unido covalentemente a un polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 en que se ha introducido al menos un sitio de glicosilación no de origen natural mediante la sustitución V253N. Se puede introducir un sitio de glicosilación no de origen natural en combinación con la eliminación de un sitio de glicosilación de origen natural. El sitio de glicosilación introducido es, en particular, un sitio de N-glicosilación in vivo.
Cuando se usa en el presente contexto, el término "sitio de glicosilación de origen natural" cubre los sitios de glicosilación en las posiciones N145, N322, S52 y S60. De forma similar, el término "sitio de O-glicosilación in vivo de origen natural" incluye las posiciones S52 y S60, mientras que el término "sitio de N-glicosilación in vivo de origen natural" incluye las posiciones N145 y N322.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido FVII o FVIIa difiere de la mostrada en la SEQ ID NO: 1 en que se ha introducido al menos un sitio de glicosilación no de origen natural (por ejemplo, al menos un sitio de N-glicosilación in vivo no de origen natural), tal como 1-15 sitios de glicosilación no de origen natural (por ejemplo, 1-15 sitios de N-glicosilación in vivo no de origen natural), en particular, 1-10, 1-6 ó 2-4 sitios de glicosilación no de origen natural (por ejemplo, 1-10, 1-6 ó 2-4 sitios de N-glicosilación in vivo no de origen natural), preferentemente mediante sustitución.
Se debe entender que para preparar un conjugado, en el que el polipéptido del conjugado comprende uno o más sitios de glicosilación, el polipéptido se debe expresar en una célula hospedadora capaz de unir restos azúcar (oligosacáridos) al sitio(s) de glicosilación o alternativamente se debe someter a glicosilación in vitro. Ejemplos de células hospedadoras glicosilantes se dan en la sección a continuación titulada "Acoplamiento a un resto azúcar".
En una forma de realización interesante de este aspecto, se introduce un sitio de glicosilación in vivo en una posición de la molécula FVII o FVIIa parental ocupada por un residuo aminoácido expuesto a la superficie de la molécula, preferentemente con más del 25% de la cadena lateral expuesta al disolvente, en particular más del 50% expuesta al disolvente (estas posiciones se identifican en la sección de Procedimientos del presente documento). A continuación se introduce el sitio de N-glicosilación de tal forma que el N-residuo de dicho sitio está localizado en dicha posición. Análogamente, se introduce un sitio de O-glicosilación de manera que el residuo S o T que genera ese sitio está localizado en dicha posición. Ejemplos de tales posiciones incluyen K32S/T, I42S/T, Y44S/T, K143S/T, R290S/T, R315S/T, K341S/T, R392S/T, R396S/T, R402S/T y sus combinaciones.
Con respecto a la N-glicosilación, el sitio de glicosilación in vivo se introduce en una posición en la que sólo es necesaria una mutación para crear el sitio (es decir, donde cualquier otro residuo aminoácido necesario para crear un sitio de glicosilación funcional ya está presente en la molécula).
En otras palabras, el conjugado según la invención es preferentemente un conjugado, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEQ ID NO: 1 en que al menos una secuencia N-X'-X de origen natural se sustituye con una secuencia N-X'-S o N-X'-T, en la que X' es cualquier aminoácido excepto P, y X es cualquier aminoácido excepto S y T.
De manera similar, el conjugado según la invención es preferentemente un conjugado, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEQ ID NO: 1 en que al menos una secuencia X-X'-S o X-X'-T de origen natural presente de manera natural en la SEQ ID NO: 1 se sustituye con una secuencia N-X'-S o N-X'-T, en la que X' es cualquier aminoácido excepto P, y X es cualquier aminoácido excepto N.
Ejemplos específicos de tales sustituciones que crean un sitio de N-glicosilación in vivo incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por F4S/T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S/T, E82S/T, N95S/T, G97S/T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S/T, G179N, I186S/T, V188N, R202S/T, I205S/T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S/T, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, y sus combinaciones. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por F4S/T, P10N, Q21N, W41N, A51N, G58N, G59S/T, N95S/T, G97S/T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S/T, I186S/T, V188N, R202S/T, I205S/T, D212N, E220N, V253N, E265N, T267N, E270N, L280N, G291N, P303S/T, G318N, G331N, D334N, K337N, R353N, Y357N, M391N, y sus combinaciones.
Alternativamente, se puede introducir un sitio de glicosilación in vivo en una posición ocupada por un residuo lisina o un residuo arginina, preferentemente ocupada por un residuo lisina, en particular de manera que el N-residuo del sitio de N-glicosilación o el residuo S o T de un sitio de O-glicosilación sustituya al residuo lisina.
Planteado de otra forma, el conjugado puede ser uno en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEQ ID NO: 1 en que al menos una secuencia K-X'-X o una secuencia R-X'-X, preferentemente una secuencia K-X'-X, presente de manera natural en la SEQ ID NO: 1 se sustituye por una secuencia N-X'-S o N-X'-T, en la que X' es cualquier aminoácido excepto P, y X es cualquier aminoácido excepto S y T.
Ejemplos específicos de tales sustituciones que crean un sitio de N-glicosilación in vivo incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+P40S/T, K62N+Q64S/T, K85N+D87S/T, K137N+P139S/
T, K143N+N145S/T, K148N+Q149S/T, K161N+E163S/T, K197N+K199S/T, K199N+W201S/T, K316N+G318S/T,
K337N, K341N+D343S/T, K389N+M391S/T y sus combinaciones.
En una forma de realización más interesante del aspecto de la glicosilación descrito anteriormente, se puede introducir un sitio de glicosilación, en particular un sitio de N-glicosilación, en posiciones en o en los alrededores de los sitios de degradación proteolíticos descritos anteriormente (véase la sección titulada "Conjugado de la invención").
Así, ejemplos específicos de tales sustituciones que crean un sitio de N-glicosilación in vivo incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por K32N+A34S/T, F31N+D33S/T, I30N+K32S/T, A34N+R36S/T, K38N+
F40S/T, T37N+L39S/T, R36N+K38S/T, L39N+W41S/T, F40N+I42S/T, W41N, I42N+Y44S/T, S43N, Y44N+D46S/
T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T, K143N+N145S/T, E142N+R144S/T, L141N+K143S/T, I140N+
E142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, R290N+A292S/T, D289N+G291S/T, L288N+
R290S/T, L287N+D289S/T, G291N, A292N+A294S/T, T293N+L295S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T,
Q313N+R315S/T, Q312N, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, K341N+D343S/T, S339N+K341S/T,
G342N, D343N+G345S/T, R392N+E394S/T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T,
E394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+I400S/T, V399N+L401S/T,
L400N+R402S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+F405S/T, P404N+P406S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+N145S/T, R290N+A292S/T, R315N+V317S/T, K341N+
D343S/T, R392N+E394S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Más preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34T, K38N+
F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R290N+A292T, R315N+V317T, 341N+D343T, R392N+E394T, R396N+
G398T, R402N+P404T y sus combinaciones, en particular K143N+N145T+ R315N+V317T.
En una forma de realización adicional más interesante de la invención, se prefiere que el sitio de glicosilación in vivo se introduzca en una posición que no forme parte de la región de unión del factor tisular ni forme parte de la región del sitio activo y el borde de la hendidura de unión del sitio activo como se ha definido en el presente documento. Está contemplado que esas variantes de glicosilación pertenecerán principalmente a la clase de conjugados activos como se ha definido anteriormente.
Así, ejemplos específicos de sustituciones que crean dicho sitio de N-glicosilación in vivo incluyen sustituciones seleccionadas del grupo constituido por K32N+A34S/T, I30N+K32S/T, A34N+R36S/T, K38N+F40S/T, T37N+L39S/T, W41N, Y44N+D46S/T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T, K143N+N145S/T, E142N+R144S/T,
L141N+K143S/T, I140N+B142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, L288N+R290S/T,
L287N+D289S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, R392N+E394S/
T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T, B394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+
G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+L400S/T, V399N+L401S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+
F405S/T, P404N+P406S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+
N145S/T, R315N+V317S/T, R392N+E294S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+R315N+V317S/T. Más preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34T, K38N+F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R315N+V317T, R392N+E394T, R396N+G398T, R402N+
P404T y sus combinaciones, en particular K143N+N145T+ R315N+V317T.
Además de un resto azúcar, el conjugado según el aspecto de la invención descrito en la presente sección puede contener restos no polipeptídicos adicionales, en particular una molécula polimérica, como se describe en la presente solicitud, conjugada a uno o más grupos de unión presentes en la parte polipeptídica del conjugado.
Se debe entender que cualquiera de los cambios de los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en esta sección se pueden combinar con cualquiera de los cambios de los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en las otras secciones del presente documento que describen cambios específicos de los aminoácidos.
Por ejemplo, cualquiera de las variantes glicosiladas descritas en la presente sección que han introducido y/o eliminado al menos un sitio de glicosilación, tal como una variante que comprende las sustituciones R315N + V317T y/o K143N + N145T, se puede conjugar adicionalmente a una molécula polimérica, tal como PEG, o cualquier otro resto no polipeptídico. Para este propósito, la conjugación se puede conseguir mediante el uso de grupos de unión ya presentes en el polipéptido FVII o FVIIa o grupos de unión que pueden haber sido introducidos y/o eliminados, en particular, tal que para la conjugación hay disponibles un total de 1-6, en particular 3-4 ó 1,2,3,4,5, ó 6 grupos de unión.
Preferentemente, en un conjugado de la invención en el que el polipéptido FVII o FVIIa comprende dos sitios de glicosilación, el número y el peso molecular del resto no polipeptídico se selecciona de manera que el peso molecular total añadido por el resto no polipeptídico esté en el intervalo de 5-25 kDa, tal como en el intervalo de 10-25 kDa, en particular de 5 kDa aproximadamente, 12 kDa aproximadamente, 15 kDa aproximadamente o 20 kDa aproximadamente.
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Procedimientos de preparación de un conjugado de la invención
En general, un conjugado polipeptídico según la invención se puede producir cultivando una célula hospedadora apropiada en condiciones que contribuyen a la expresión del polipéptido, y recuperando el polipéptido, en el que a) el polipéptido comprende al menos un sitio de N- u O-glicosilación y la célula hospedadora es una célula hospedadora eucariota capaz de la glicosilación in vivo, y opcionalmente b) el polipéptido se somete a conjugación con un resto no polipeptídico in vitro. Se entenderá que la conjugación se debe diseñar para así producir la molécula óptima con respecto al número de restos no polipeptídicos unidos, el tamaño y la forma de tales moléculas (por ejemplo, si son lineales o ramificadas), y el sitio(s) de unión en el polipéptido. El peso molecular del resto no polipeptídico a usar se puede seleccionar, por ejemplo, en base al efecto deseado a conseguir. Por ejemplo, si el propósito primario de la conjugación es conseguir un conjugado con un elevado peso molecular (por ejemplo, para reducir el aclaramiento renal) normalmente es deseable conjugar tan pocos restos no polipeptídicos de elevado peso molecular como sea posible para obtener el peso molecular deseado. Cuando es deseable un elevado grado de protección esto se puede obtener mediante el uso de un número suficientemente elevado de restos no polipeptídicos de bajo peso molecular (por ejemplo, con un peso molecular de entre 300 Da aproximadamente y 5 kDa aproximadamente, tal como un peso molecular de entre 300 Da y 2 kDa) para proteger eficazmente todos o la mayor parte de sitios de escisión de la proteasa u otros sitios vulnerables del polipéptido.
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Acoplamiento a un resto azúcar
Para conseguir la glicosilación in vivo de una molécula FVII que comprende uno o más sitios de glicosilación, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido debe estar insertada en un hospedador de expresión eucariota glicosilante. La célula hospedadora de expresión se puede seleccionar entre células fúngicas (hongos filamentosos o levaduras), células de insectos o animales o de células de plantas transgénicas. En una forma de realización la célula hospedadora es una célula del mamífero, tal como una célula CHO, BHK o HEK, por ejemplo, célula HEK 293, o una célula de insecto, tal como una célula SF9, o una célula de levadura, por ejemplo, S. cerevisiae o Pichia pastoris, o cualquiera de las células hospedadoras mencionadas en lo sucesivo.
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Procedimientos de preparación de un polipéptido de la invención o del polipéptido del conjugado de la invención
El polipéptido de la presente invención o la parte polipeptídica de un conjugado de la invención, en forma glicosilada, se puede producir mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la materia. Tales procedimientos incluyen la construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y la expresión de la secuencia en un hospedador transformado o transfectado adecuado. La célula hospedadora es una célula hospedadora \gamma-carboxilante tal como una célula de mamífero.
Se puede construir una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o la parte polipeptídica de un conjugado de la invención aislando o sintetizando una secuencia de nucleótidos que codifica el FVII parental, tal como el hFVII con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y a continuación cambiando la secuencia de nucleótidos para así llevar a cabo la introducción (es decir, inserción o sustitución) o eliminación (es decir, supresión o sustitución) del residuo(s) aminoácido relevante.
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La secuencia de nucleótidos se modifica de manera conveniente mediante mutagénesis dirigida de acuerdo con procedimientos convencionales. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos se prepara mediante síntesis química, por ejemplo, usando un sintetizador de oligonucleótidos, en el que los oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y preferentemente seleccionando aquellos codones que están favorecidos en la célula hospedadora en la que se producirá el polipéptido recombinante. Por ejemplo, se pueden sintetizar varios oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado y se pueden ensamblar mediante PCR, ligación o reacción en cadena de ligación (LCR) (Barany, PNAS 88: 189-193, 1991). Los oligonucleótidos individuales normalmente contendrán protuberancias 5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Están disponibles procedimientos alternativos de modificación de secuencias de nucleótidos para la producción de variantes de polipéptidos para la selección de alto rendimiento, por ejemplo, procedimientos que suponen el entrecruzamiento homólogo tal como se describe en la patente de EE.UU. 5.093.257, y procedimientos que suponen la recomposición de genes, es decir, la recombinación entre dos o más secuencias de nucleótidos homólogas que resultan en nuevas secuencias de nucleótidos que tienen una serie de alteraciones en los nucleótidos cuando se comparan con las secuencias de nucleótidos de partida. La recomposición de genes (también conocido como recomposición de ADN) supone uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y re-ensamblaje de las secuencias de nucleótidos, seguido de la selección para seleccionar secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con las propiedades deseadas.
Una vez ensamblados (mediante síntesis, mutagénesis dirigida u otro procedimiento), la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector recombinante y se une de manera operable a secuencias control necesarias para la expresión del FVII en la célula hospedadora transformada deseada.
Naturalmente, se debe entender que no todos los vectores y secuencias para el control de la expresión funcionan igual de bien a la hora de expresar la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en el presente documento. Tampoco todos los hospedadores funcionan igual de bien con el mismo sistema de expresión. No obstante, alguien experto en la materia puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias para el control de la expresión y hospedadores sin una experimentación innecesaria. Por ejemplo, en la selección de un vector, se debe considerar el hospedador debido a que el vector se debe replicar en él o debe ser capaz de integrarse en el cromosoma.
También se debe considerar el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias, y la expresión de otras proteínas codificadas por el vector, tales como marcadores antibióticos. En la selección de una secuencia para el control de la expresión, también se deben considerar una variedad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa de la secuencia, la capacidad para su control, y su compatibilidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en particular en lo que respecta a estructuras secundarias potenciales. Los hospedadores se deben seleccionar con la consideración de su compatibilidad con el vector seleccionado, la toxicidad del producto codificado por la secuencia de nucleótidos, sus características de secreción, su capacidad para plegar correctamente el polipéptido, sus requerimientos en fermentación o en cultivo, y la facilidad de purificación de los productos codificados por la secuencia de nucleótidos.
El vector recombinante puede ser un vector que se replica autónomamente, es decir, un vector, que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector es uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el cromosoma(s) en el cual se ha integrado.
El vector es preferentemente un vector de expresión, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención está unida de manera operable a segmentos adicionales necesarios para la transcripción de la secuencia de nucleótidos. El vector normalmente procede de un plásmido o ADN vírico. Una serie de vectores de expresión adecuados para la expresión en las células hospedadoras mencionadas en el presente documento están disponibles comercialmente o están descritos en la bibliografía. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias para el control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Vectores específicos son, por ejemplo, pCDNA3.1 (+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y pCIneo (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Vectores de expresión útiles para células de levaduras incluyen el plásmido 2P y sus derivados, el vector POT1 (patente de EE.UU. 4.931.373), el vector pJSO37 descrito en Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, y pPICZ A, B o C (Invitrogen). Vectores útiles para células de insecto incluyen pVL941, pBG311 (Cate y col., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 y pMelbac (ambos disponibles en Invitrogen). Vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, incluyendo pBR322, pET3a y pET12a (ambos de Novagen Inc., WI, EE.UU.), plásmidos de un rango de hospedadores más amplio, tales como RP4, fagos de ADN, por ejemplo, los numerosos derivados del fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN, tales como M13 y los fagos de ADN de cadena sencilla filamentosos.
Otros vectores para su uso en esta invención incluyen aquellos que permiten la amplificación en número de copias de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales vectores amplificables son muy conocidos en la materia. Incluyen, por ejemplo, vectores capaces de ser amplificados mediante amplificación DHFR (véase, por ejemplo, Kaufman, patente de EE.UU. Nº 4.470.461, Kaufman y Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) y amplificación con glutamina sintetasa ("GS") (véase, por ejemplo, documentos de EE.UU. 5.122.464 y EP 338.841).
El vector recombinante además puede comprender una secuencia de ADN que permite al vector replicarse en la célula hospedadora en cuestión. Un ejemplo de esa secuencia (cuando la célula hospedadora es una célula de mamífero) es el origen de replicación de SV40. Cuando la célula hospedadora es una célula de levadura, las secuencias adecuadas que permiten al vector replicarse son el plásmido de levaduras 2\mu, los genes de replicación REP 1-3 y el origen de replicación.
El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula hospedadora, tal como el gen que codifica para la dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen TPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130), o uno que confiera resistencia a un fármaco, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato. Para Saccharomyces cerevisiae, los marcadores seleccionables incluyen ura3 y leu2. Para hongos filamentosos, los marcadores seleccionables incluyen amdS, pyrG, arcB, niaD y sC.
El término "secuencias control" se define en el presente documento para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos, para la expresión del polipéptido de la invención. Cada secuencia control puede ser nativa o exógena a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Tales secuencias control incluyen, pero no están limitadas a, una secuencia líder, una secuencias de poliadenilación, una secuencia propeptídica, una secuencia promotora, potenciadora o activadora aguas arriba, una secuencia del péptido señal, y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen un promotor.
En la presente invención se pueden usar una amplia variedad de secuencias control de la expresión. Tales secuencias control de la expresión útiles incluyen las secuencias control de la expresión asociadas a genes estructurales de los anteriores vectores de expresión, así como cualquier secuencia conocida por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas y sus virus, y sus diversas combinaciones.
Ejemplos de secuencias control adecuadas para dirigir la transcripción en células de mamífero incluyen los promotores tempranos y tardíos de SV40 y adenovirus, por ejemplo, el promotor principal tardío de adenovirus 2, el promotor de MT-1 (gen de metalotienina), el promotor génico intermedio-temprano de citomegalovirus humano (CMV), el promotor del factor de elongación humano 1\alpha (EF-1\alpha), el promotor de la proteína de choque térmico 70 mínimo de Drosophila, el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de la ubiquitina C humana (UbC), el terminador de la hormona del crecimiento humana, las señales de poliadenilación de la región Elb de adenovirus o SV40 y la secuencia consenso de Kozak (Kozak, M., J. Mol. Biol., 20 agosto de 1987; 196 (4): 947-50).
Para mejorar la expresión en células de mamífero se puede insertar un intrón sintético en la región sin traducir 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un ejemplo de un intrón sintético es el intrón sintético del plásmido pCI-Neo (disponible en Promega Corporation, WI, EE.UU.).
Ejemplos de secuencias control adecuadas para dirigir la transcripción en células de insecto incluyen el promotor de polihedrina, el promotor P10, el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis en Autographa californica, el promotor del gen 1 inmediato-temprano de baculovirus y el promotor génico retardado-temprano 39K de baculovirus, y la secuencia de poliadenilación de SV40. Ejemplos de secuencias control adecuadas para su uso en células hospedadoras de levadura incluyen los promotores del sistema de \alpha-acoplamiento de levaduras, el promotor de la triosafosfatoisomerasa (TPI) de levaduras, promotores de genes glicolíticos o genes de la alcoholdeshidrogenasa de levaduras, el promotor ADH2-4c, y el promotor GAL inducible. Ejemplos de secuencias control adecuadas para su uso en células hospedadoras de hongos filamentosos incluyen el promotor y terminador ADH3, un promotor derivado de los genes que codifican la amilasa triosa fosfato isomerasa o proteasa alcalina TAKA de Aspergillus oryzae, una \alpha-amilasa de A. niger, una glucoamilasa de A. niger o A. nidulans, la acetamidasa de A. nidulans, la proteinasa o lipasa aspártica de Rhizomucor miehei, el terminador TPI1 y el terminador ADH3.
La presencia o ausencia de un péptido señal dependerá, por ejemplo, de la célula hospedadora de expresión usada para la producción del polipéptido a expresar (si es un polipéptido intracelular o extracelular) y si es deseable obtener la secreción. Para su uso en hongos filamentosos, el péptido señal puede proceder de manera conveniente de un gen que codifica una amilasa o glucoamilasa de la especie Aspergillus, un gen que codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido señal preferentemente procede de un gen que codifica una TAKA amilasa de A. oryzae, una \alpha-amilasa neutra de A. niger, una amilasa estable en medio ácido de A. niger, o una glucoamilasa de A. niger. Para su uso en células de insecto, el péptido señal puede proceder de manera conveniente de un gen de insecto (cf. documento WO 90/05783), tal como el precursor de la hormona adipocinética de Lepidopteran manduca sexta (cf. patente de EE.UU. 5.023.328), la melitina de abeja (Invitrogen), la UDPglucosiltransferasa ecdisteroide (egt) (Murphy y col., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993) o human pancreatic lipase (hpl) (Methodscin Enzymology 284, pp. 262-272, 1997). Un péptido señal preferido para su uso en células de mamífero es aquel del hFVII o el péptido señal de la cadena ligera kappa de Ig murina (Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152: 89-104). Para su uso en células de levadura se ha encontrado que los péptidos señal adecuados son el péptido señal del factor \alpha de S. cereviciae (cf. patente de EE.UU. 4.870.008), un péptido señal carboxipeptidasa modificado (cf. L.A. Valls y col., Cell 48, 1987, pp. 887-897), el péptido señal BAR1 de levadura (cf. documento WO 87/02670), el péptido señal de la proteasa aspártica 3 de levadura (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani y col., Yeast 6, 1990, pp. 127-137), y la secuencia líder sintética TA57 (documento WO 98/32867).
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La secuencia de nucleótidos de la invención que codifica un polipéptido FVII, ya sea preparada por mutagénesis dirigida, síntesis, PCR u otros procedimientos, puede incluir opcionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. El péptido señal está presente cuando el polipéptido se debe secretar de la célula en la cual se expresa. Ese péptido señal, si está presente, debe ser uno reconocido por la célula seleccionada para la expresión del polipéptido. El péptido señal puede ser homólogo (por ejemplo, ser aquél normalmente asociado al hFVII) o heterólogo (es decir, originado en otra fuente distinta de hFVII) al polipéptido o puede ser homólogo o heterólogo a la célula hospedadora, es decir, ser un péptido señal expresado normalmente en la célula hospedadora o uno que normalmente no se expresa en la célula hospedadora. Por consiguiente, el péptido señal puede ser procariota, por ejemplo, procedente de una bacteria tal como E. coli, o eucariota, por ejemplo, procedente de una célula de mamífero, insecto o levadura.
Se puede usar cualquier hospedador adecuado para producir el polipéptido o la parte polipeptídica del conjugado de la invención, incluyendo células de hongos (incluyendo levadura), plantas, insectos, mamíferos, u otras células o líneas celulares animales apropiadas, así como animales o plantas transgénicos. Ejemplos de células hospedadoras fúngicas filamentosas incluyen cepas de Aspergillus, por ejemplo, células de A. oryzae, A. niger, o A. nidulans, Fusarium o Trichoderma. Las células fúngica se pueden transformar mediante un proceso que supone la formación del protoplasto, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular de una forma conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus se describen en los documentos EP 238 023 y la patente de EE.UU. 5.679.543. Procedimientos adecuados para la transformación de especies de Fusarium se describen por Malardier y col., 1989, Gene 78: 147-156 y el documento WO 96/00787. Ejemplos de células hospedadoras de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, por ejemplo, S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, tales como P. pastoris o P. methanolica, Hansenula, tales como H. Polymorpha o Yarrowia. La levadura se puede transformar usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito y col., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen y col., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920: y como se describe por Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, EE.UU. (en el protocolo del producto para el Yeastmaker^{TM} Yeast Transformation System Kit). Ejemplos de células hospedadoras de insecto adecuadas incluyen una línea celular de Lepidoptora, tal como células de Spodoptera frugiperda (Sf9 o Sf21) o de Trichoplusioa ni (High Five) (patente de EE.UU. 5.077.214).
La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos heterólogos en ellas se puede realizar como se describe por Invitrogen. Ejemplos de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), (por ejemplo, CHO-K1; ATCC CCL-61), líneas celulares de mono verde (COS) (por ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de ratón (por ejemplo, NS/O), líneas celulares de riñón de cría de hámster (BHK) (por ejemplo, ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10), y células humanas (por ejemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)), así como células de plantas en cultivo de tejidos. Líneas celulares adecuadas adicionales son conocidas en la materia y están disponibles en repositorios públicos tales como la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Además, la célula de mamífero, tal como una célula CHO, se puede modificar para expresar sialiltransferasa, por ejemplo, 1,6-sialiltransferasa, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 5.047.335, para proporcionar una glicosilación mejorada del polipéptido FVII o FVIIa.
Para incrementar la secreción puede ser de interés particular producir el polipéptido de la invención junto con una endoproteasa, en particular una PACE (enzima conversora de aminoácidos básicos emparejados) (por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 5.986.079), tal como una endoproteasa Kex2 (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/28065).
Los procedimientos para la introducción de ADN exógeno en células hospedadoras de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, vectores víricos y el procedimiento de transfección descrito por Life Technologies Ltd, Paisley, RU, usando Lipofectamine 2000. Estos procedimientos son bien conocidos en la materia y, por ejemplo, están descritos por Ausubel y col. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, EE.UU. El cultivo de células de mamífero se realiza según procedimientos establecidos, por ejemplo, como se describe en (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, Nueva Jersey, EE.UU. y Harrison MA y Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
En los procedimientos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido usando procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, las células se pueden cultivar por cultivo en un matraz agitado, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, discontinuas, semi-continuas, o en estado sólido) en fermentadores industriales o de laboratorio realizadas en un medio adecuado y condiciones que permiten que el polipéptido se pueda expresar y/o aislar. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y de nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la materia. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se secreta al medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar de los lisados celulares.
El polipéptido resultante se puede recuperar mediante procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.
Los polipéptidos se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque, y exclusión molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
El FVII de cadena sencilla se puede purificar y se puede activar al FVIIa de doble cadena mediante una serie de procedimientos como se describen en la bibliografía (Broze y Majerus, 1980, J. Biol. Chem. 255: 1242-47 y Hedner y Kisiel, 1983, J. Clin. Invest. 71: 1836-41). Otro procedimiento mediante el cual se puede purificar el FVII de cadena sencilla es mediante la incorporación de iones Zn durante la purificación, como se describe en la patente de EE.UU. 5.700.914.
En una forma de realización, el polipéptido se purifica en forma de FVII de cadena sencilla, que posteriormente se PEGila. El polipéptido FVII de cadena sencilla PEGilado se activa mediante el uso de una enzima inmovilizada (por ejemplo, los factores IIa, IXa, Xa y XIIa) o mediante la autoactivación usando una matriz de intercambio iónico cargada positivamente o similar.
Es ventajoso purificar primero el FVII en su forma de cadena sencilla, a continuación PEGilarlo (si se desea) y por último activarlo mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente o mediante autoactivación como se describe por Pedersen y col., 1989, Biochemistry 28: 9331-36. La ventaja de llevar a cabo la PEGilación antes de la activación es que se evita la PEGilación del nuevo aminoterminal formado por la escisión de R152-I153. La PEGegilación de este nuevo aminoterminal volvería a la molécula inactiva, puesto que para la actividad es necesaria la formación de un puente de hidrógeno entre D242 y el amino terminal de I153.
Composición farmacéutica de la invención y su uso
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición, en particular a una composición farmacéutica, que comprende un cojugado polipeptídico de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. El conjugado o la composición farmacéutica según la invención se puede usar como medicamento. Preferentemente, el conjugado polipeptídico se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF en un mamífero. Por ejemplo, el conjugado polipeptídico se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades en las que es deseable una formación incrementada de coágulos, tales como el tratamiento de pacientes con enfermedades que dan como resultado una coagulación sanguínea inadecuada en respuesta a daños en los vasos sanguíneos. En particular, el conjugado polipeptídico se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes hemofílicos, hemofílicos con inhibidores para el FVIII y PIX, pacientes con trombocitopenia, pacientes con trombocitopatías, tales como trombastenia de Glanzmann, defectos en la liberación de plaquetas y defectos en la reserva de almacenamiento, pacientes con enfermedad de von Willebrand, pacientes con enfermedades hepáticas, o personas, por lo demás sanas, con problemas de sangrado graves, por ejemplo, debido a traumatismo o cirugía mayor, que han desarrollado inhibidores para el FVIIa, trastornos de sangrado tales como hemofílicos y otros normalmente asociados a daños tisulares graves.
En otro aspecto, el conjugado polipeptídico o la composición farmacéutica que comprende el conjugado (activo) de la invención se puede usar en un procedimiento para el tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF (tal como uno o más de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente), que comprende la administración a un mamífero que lo necesite de una cantidad eficaz de tal polipéptido, conjugado o composición.
Los conjugados polipeptídicos de la invención se administran a pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz, normalmente una aproximadamente equivalente a aquella empleada en terapia con el rFVII tal como NovoSeven®, o a una dosificación superior. Por "dosis terapéuticamente eficaz" en el presente documento se quiere decir una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados en relación con la dolencia por la cual se administra. La dosis exacta dependerá de las circunstancias, y alguien experto en la materia la puede determinar usando técnicas conocidas. Normalmente, la dosis debe ser capaz de prevenir o reducir la gravedad o propagación de la dolencia o indicación tratada. Será evidente para aquellos expertos en la materia que una cantidad eficaz de un polipéptido, conjugado o composición de la invención depende, entre otros, de la enfermedad, la dosis, el calendario de administración, si el polipéptido o conjugado o composición se administra solo o junto con otros agentes terapéuticos, la semi-vida plasmática de las composiciones, y el estado de salud general del paciente. Preferentemente, el polipéptido, conjugado, o composición de la invención se administra en una dosis eficaz, en particular, una dosis que es suficiente para normalizar el trastorno de la coagulación.
El conjugado polipeptídico de la invención preferentemente se administra en una composición que incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo o excipiente que no provoca ningún efecto adverso en los pacientes a los que se administra. Tales vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
El conjugado polipeptídico de la invención se puede formular en composiciones farmacéuticas mediante procedimientos muy conocidos. Las formulaciones adecuadas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences de E.W. Martin (Mark Publ. Co., 16ª Ed., 1980).
El conjugado polipeptídico de la invención se puede usar "como está" y/o en una de sus formas salinas. Las sales adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, sales con metales alcalinos o metales alcalino-térreos, tales como sodio, potasio, calcio y magnesio, así como, por ejemplo, sales de cinc. Estas sales y complejos pueden estar presentes en estructuras cristalinas y/o amorfas.
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la propia composición farmacéutica o se pueden administrar separadamente del polipéptido o conjugado de la invención, simultáneamente o de acuerdo con otro calendario de tratamiento. Además, el polipéptido, el conjugado o la composición farmacéutica de la invención se puede usar como adyuvante para otras terapias.
Un "paciente" a objeto de la presente invención incluye tanto humanos como otros mamíferos. Así, los procedimientos son aplicables tanto en terapia en humanos como en aplicaciones veterinarias. La composición farmacéutica del conjugado polipeptídico de la invención se puede formular en una variedad de formas, por ejemplo, en forma de líquido, gel, liofilizado, o en forma de sólido comprimido. La forma preferida dependerá de la indicación particular a tratar y será evidente para alguien experto en la materia.
En particular, la composición farmacéutica del conjugado polipeptídico de la invención se puede formular en forma liofilizada o soluble estable. El conjugado polipeptídico se puede liofilizar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Un conjugado polipeptídico puede ser una forma soluble estable por la eliminación o la protección de los sitios de degradación proteolíticos. La ventaja de obtener una preparación soluble estable radica en una manipulación más sencilla para el paciente y, en el caso de emergencias, una acción más rápida, que potencialmente le puede salvar la vida. La forma preferida dependerá de la indicación particular tratada y será evidente para alguien experto en la materia.
La administración de las formulaciones de la presente invención se puede realizar en una variedad de formas, incluyendo, pero no limitado a, oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocularmente, o cualquier otra forma aceptable. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua por infusión, aunque es aceptable inyección en bolo, usando técnicas muy conocidas en la materia, tales como bombas o implantes. En algunos casos, las formulaciones se pueden aplicar directamente en forma de disolución o pulverizador.
Parenterales
Un ejemplo preferido de una composición farmacéutica es una disolución diseñada para la administración por vía parenteral. Aunque en muchos casos las formulaciones farmacéuticas en disolución se proporcionan en forma líquida, apropiadas para su uso inmediato, tales formulaciones parenterales también se pueden proporcionar en forma congelada o en forma liofilizada. En este último caso, la composición se debe descongelar antes de su uso. Esta última forma a menudo se usa para mejorar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición en una variedad de condiciones de almacenamiento más amplia, como es reconocido por aquellos expertos en la materia que las preparaciones liofilizadas generalmente son más estables que sus homólogas líquidas. Tales preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.
En el caso de parenterales, para el almacenamiento se preparan en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas mezclando, según sea apropiado, el polipéptido con el grado de pureza deseado con uno o más vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables empleados normalmente en la materia (todos ellos que se denominan "excipientes"), por ejemplo, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, tensioactivos o detergentes no iónicos, antioxidantes y/o aditivos diversos.
Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en un intervalo próximo a las condiciones fisiológicas. Normalmente están presentes a una concentración comprendida entre 2 mM aproximadamente y 50 mM aproximadamente. Los agentes tamponantes adecuados para su uso con la presente invención incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sus sales, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampones de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). Posibilidades adicionales son tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.
Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden abarcar una función que va desde agente de relleno a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o que ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del contenedor. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, omitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclotoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, \alpha-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos tales como xilosa, manosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa, y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes normalmente están presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 partes en peso en base al peso de la proteína activa.
Los conservantes se añaden para retrasar el crecimiento microbiano, y normalmente se añaden en cantidades del 0,2-1% (en p/v) aproximadamente. Los conservantes adecuados para su uso con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio), cloruro de hexametonio, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.
Los isotonificantes se añaden para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas e incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferentemente alcoholes de azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihídricos pueden estar presentes en una cantidad entre el 0,1% y el 25% en peso, normalmente entre el 1% y el 5%, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los otros principios.
Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") pueden estar presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como para proteger al polipéptido terapéutico frente a la agregación inducida por la agitación, que también permite exponer a la formulación a tensión superficial de deslizamiento sin provocar la desnaturalización del polipéptido. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles Pluronic®, monoéteres de polioxietilensorbitán (Tween®-20, Tween®-80, etc.).
Otros excipientes adicionales incluyen agentes de relleno o cargas (por ejemplo, fécula), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y codisolventes.
El principio activo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina o poli-(metilmetacrilato), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Las formulaciones parenterales a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
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Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 muestra la proteína hFVII (incluyendo los residuos \gamma-carboxilados).
SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de ADNc que codifica la proteína hFVII.
SEQ ID NO: 3 muestra la proteína hFVII (sin los residuos \gamma-carboxilados).
SEQ ID NO: 4 muestra un casete de expresión para la expresión del FVII en células de mamífero.
SEQ ID NO: 5 muestra el cebador CBProFpr174.
SEQ ID NO: 6 muestra el cebador CBProFpr175.
SEQ ID NO: 7 muestra el cebador CBProFpr216.
SEQ ID NO: 8 muestra el cebador CBProFpr229.
SEQ ID NO: 9 muestra el cebador CBProFpr221.
SEQ ID NO: 10 muestra el cebador CBProFpr228.
SEQ ID NO: 11 muestra el cebador CBProFpr226.
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Materiales y procedimientos Procedimientos usados para determinar los aminoácidos a modificar Área superficial accesible (ASA)
Se usa el programa de ordenador Access (B. Lee y F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)) versión 2 (&copy; 1983 Universidad de Yale) para computar el área superficial accesible (ASA) de los átomos individuales en la estructura. Este procedimiento normalmente usa un tamaño de sonda de 1,4 \ring{A} y define el Área superficial accesible (ASA) como el área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno se deben eliminar del grupo coordinado, así como otros átomos no directamente relacionados con la proteína.
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ASA fraccional de la cadena lateral
El ASA fraccional de los átomos de cadena lateral se computa por la división de la suma del ASA de los átomos en la cadena lateral con el valor que representa el ASA de los átomos de cadena lateral de ese tipo de residuo en un tripéptido Ala-x-Ala extendido (véase, Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507-530). Para este ejemplo el átomo CA es considerado como parte de la cadena lateral de residuos de glicina, pero no para los residuos restantes. La tabla siguiente se usa como patrón 100% ASA para la cadena lateral:
4
Los residuos no detectados en la estructura se definen como con una exposición del 100% puesto que se piensa que se encuentran en regiones flexibles. Los ácidos \gamma-carboxiglutámicos en las posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 se definen todos como expuestos al 100%.
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Determinación de las distancias entre átomos
La distancia entre átomos se determina de la manera más sencilla usando software de gráficos moleculares, por ejemplo, InsightII® v. 98.0, MSI INC.
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Región del sitio catalítico
La región del sitio catalítico se define como cualquier residuo que tenga al menos un átomo a 10 \ring{A} de cualquier átomo de la tríada catalítica (residuos H193, D242, S344).
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Determinación del sitio de unión del factor tisular
El sitio de unión del receptor se define como que comprende todos los residuos que varían su área superficial accesible tras la unión del receptor. Esto se determina mediante, al menos, dos cálculos del ASA; uno sobre el ligando(s)
aislado en el complejo ligando(s)/receptor(es) y otro sobre el complejo ligando(s)/receptor(es) completo.
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Procedimientos para probar las propiedades del FVII y FVIIa Medición de la semi-vida funcional in vivo
La medición de la semi-vida biológica in vivo se puede llevar a cabo en una serie de ensayos como se describe en la bibliografía. Un ejemplo de un ensayo para la medición de la semi-vida in vivo del rFVIIa o de sus variantes se describe en la referencia de la FDA número 96-0597. Resumiendo, la actividad coagulante del FVII se mide en plasma extraído antes de y durante un periodo de 24 horas después de la administración del conjugado, polipéptido o composición. Se mide el volumen aparente medio de la distribución en el estado constante y se determina el aclaramiento medio.
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Medición de la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica
Se prepara una composición que contiene el conjugado (100-750 \mug/ml, preferentemente 600 \mug/ml), 1,5 mg de Ca^{2+}/ml (en forma de cloruro cálcico), manitol (30 mg/ml), polisorbato 80 (0,1 mg/ml), cloruro sódico (3 mg/ml) y tampón de glicilo-glicina(1,3 mg/ml, pH 5,5).
Se prepara una composición similar que contiene el rFVIIa de tipo silvestre.
A continuación se determina la actividad coagulante inicial o, alternativamente, la actividad amidolítica inicial, como se describe en la sección titulada "Procedimiento de medición de la actividad coagulante" o como se describe en la sección titulada "Procedimiento de medición de niveles bajos de actividad catalítica" o "Procedimiento de medición de la actividad catalítica".
A continuación las composiciones se incuban a 37ºC hasta que la composición que contiene el rFVIIa de tipo silvestre haya perdido al menos el 25%, preferentemente al menos el 50%, de su actividad coagulante o amidolítica inicial.
A continuación se mide la actividad coagulante o amidolítica de la composición que contiene el conjugado de la invención.
A continuación se expresa en porcentaje la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica del conjugado de la invención comparada con el rFVIIa de tipo silvestre.
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Procedimientos alternativos para medir la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica
La degradación proteolítica se puede medir usando el ensayo descrito en la patente de EE.UU. 5.580.560, Ejemplo 5, en el que la proteolisis es autoproteolisis.
Además, la proteolisis reducida se puede probar en un modelo in vivo usando muestras radiomarcadas y comparando la proteolisis del tipo silvestre y de los conjugados extrayendo muestras de sangre y sometiéndolas a SDS-PAGE y autorradiografía. Independientemente del ensayo usado para determinar la degradación proteolítica, "degradación proteolítica reducida" está previsto que signifique una reducción medible en la escisión comparada con aquella obtenida con el FVIIa de tipo silvestre no conjugado según se mide con barrido de geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie, HPLC o según se mide mediante la actividad catalítica conservada en comparación con el tipo silvestre usando el ensayo cromogénico descrito a continuación.
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Determinación del peso molecular del rFVIIa y sus conjugados
Se determina el peso molecular del rFVIIa conjugado o sin conjugar, o de sus conjugados por SDS-PAGE, filtración en gel, transferencias Western, espectroscopia de masas láser de desorción asistida por matriz o centrifugación en equilibrio, por ejemplo, SDS-PAGE según Laemmli, U.K., Nature Vol 227 (1970), pp. 680-85.
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Procedimiento de medición de bajos niveles de actividad catalítica
La actividad amidolítica en muestras diluidas de FVII/FVIIa y medio líquido/acondicionado de fermentación se puede determinar usando COASET® FVII (Chromogenix, Art. No 82 19 00). La actividad amidolítica se determina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, el FX está presente en exceso y se convierte en FXa mediante el FVIIa a 37ºC. El FXa generado a continuación hidroliza el sustrato cromogénico S2765 (N-\alpha-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA) dando como resultado la liberación de la molécula cromófora, para-nitroanilina (pNA) que absorbe luz a una longitud de onda de 405 nm. La reacción se detiene mediante la adición de ácido acético. La cantidad de FVII/FVIIa en la muestra se determina por comparación con una curva patrón preparada a partir de FVIIa (que abarca entre 125 \mug/ml y 1 ng/ml en tampón de ensayo).
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Procedimiento de medición de la actividad catalítica
La capacidad de los conjugados para escindir sustratos peptídicos pequeños se puede medir usando el sustrato cromogénico S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida). El FVIIa recombinante se diluye en Tris 0,1 M, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 5 mM, pH 8,3 que contiene BSA al 0,1%. La reacción se inicia mediante la adición del sustrato S-2288 a 1 mM y la absorción a 405 nm se mide después de incubar durante 30 minutos a 37ºC.
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Procedimiento de medición de la actividad coagulante
La actividad del FVIIa se mide usando un ensayo de coagulación patrón de una fase esencialmente como se describe en el documento WO 92/15686. Resumiendo, la muestra a probar se diluye en Tris 50 mM (pH 7,5), BSA al 0,1% y se incuban 100 \mul con 100 \mul de plasma deficiente en FVII y 200 \mul de tromboplastina C que contiene Ca^{2+} 10 mM. Se miden los tiempos de coagulación y se compara con una curva patrón usando una reserva de plasma humano normal citrado en diluciones seriadas.
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Ejemplos Ejemplo 1
Para este ejemplo se usa la estructura de rayos X del rFVIIa en un complejo con el factor tisular soluble de Banner y col., J Mol Biol, 1996; 285: 2089. Nótese que la numeración de los residuos en la referencia no sigue la secuencia. Aquí hemos usado la numeración secuencial según la SEQ ID NO: 1. Los ácidos \gamma-carboxiglutámicos en las posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 aquí se denominan todos GLU (abreviatura de tres letras) o B (abreviatura de una letra).
Los residuos 143-152 no están presentes en la estructura.
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Exposición de la superficie
La realización de cálculos del ASA fraccional de fragmentos de FVII solos combinados con la definición de las accesibilidades de residuos no estándar y/o desaparecidos descrita en los procedimientos dio como resultado los siguientes residuos con más del 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1, N2, A3, F4, L5, B6, B7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35, R36, K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109, S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131, B132, I140, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158, P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, I186, H193, K197, K199, N200, R202, N203,1205, S214, B215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251, V253, T255, D256, B265, R266, T267, E270, R271, F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321, N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353, G354, Q366, G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404 y P406.
Los siguientes residuos tenían más del 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107, T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131, E132, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249, Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, N301, M306, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341, G354, G367, V371, E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 y P406.
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Sitios de unión del factor tisular
Al realizar los cálculos del ASA fraccional los siguientes residuos en el FVII humano cambian su ASA en el complejo. Estos residuos estaban definidos como los constituyentes del sitio de unión al receptor: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65,I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 y R379.
Región del sitio activo
La región del sitio activo se define como cualquier residuo que tenga al menos un átomo a una distancia de 10 \ring{A} de cualquier átomo de la tríada catalítica (residuos H193, D242, S344): I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y F405.
El borde de la hendidura de unión del sitio activo
El borde de la región de la hendidura de unión del sitio activo se definió mediante inspección visual de la estructura 1FAK.pdb del FVIIa como: N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 y T370.
Ejemplo 2 Diseño de un casete de expresión para la expresión del factor VII humano de coagulación de la sangre en células de mamífero
La secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 2, que engloba la forma corta del ADNc de longitud completa que codifica el factor VII humano de coagulación de la sangre con su péptido señal corto nativo (Hagen y col., 1986. PNAS 83: 2412), se sintetizó para facilitar una alta expresión en células de mamífero. Primero, el contexto del codón de iniciación ATG se modificó según la secuencia consenso de Kozak (Kozak, M. J Mol Biol, 20 agosto de 1987; 196 (4): 947-50), de manera que hay un emparejamiento perfecto con la secuencia consenso corriente arriba del codón de iniciación ATG. En segundo lugar, se modificó el marco de lectura abierto del ADNc del factor humano de coagulación de la sangre nativo predisponiendo en el uso del codón hacia los codones usados frecuentemente en genes humanos altamente expresados. Además, se insertaron dos codones de detención de la traducción al final del marco de lectura abierto para facilitar una detención eficiente de la traducción. El gen completamente sintético y el gen del FVII humano optimizado para la expresión se ensamblaron en oligonucleótidos de ADN 70-meros y en último término se amplificaron usando cebadores terminales insertando sitios BamHI y HindIII en los extremos 5' y 3' respectivamente, usando técnicas de PCR convencionales, que dio como resultado la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 4):
5 
\newpage
Se preparó un vector para la clonación del producto de la PCR generado que engloba el casete de expresión para el factor VII humano de coagulación de la sangre nativo clonando el intrón en pCINeo (Promega). El intrón sintético en pCINeo se amplificó usando condiciones de PCR convencionales como se ha descrito anteriormente y los cebadores:
50
que da como resultado un fragmento de PCR de 332 pb. El fragmento se cortó con NheI y BamHI antes de clonar en pCDNA3.1/HygR (obtenido de InvitroGen) que da como resultado PF#34.
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El casete de expresión para el factor VII humano de coagulación de la sangre nativo se clonó entre los sitios BamHI y HindIII de PF#34, que da como resultado el plásmido PF#226.
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Ejemplo 3 Construcción de casetes de expresión que codifican formas variantes del factor VII humano de coagulación de la sangre que tienen un sitio de glicosilación in vivo adicional
Se usó PCR con extensión de las protuberancias de secuencias (SOE) para generar construcciones que tienen variantes de los marcos de lectura abiertos del factor humano de coagulación de la sangre con codones sustituidos. En la SOE-PCR tanto la parte N-terminal como la parte C-terminal del marco de lectura abierto de FVII primero se amplificó en PCRs primarias individuales.
Por ejemplo, para cambiar los codones para R315 y V317 por los codones para N315 y T317 se usaron los siguientes cebadores emparejados para las PCR primarias:
6
A continuación los productos de la PCR primaria se combinaron y se añadieron los cebadores terminales (CBProPpr216 y CBProFpr221) dando como resultado el producto secundario de longitud completa que codifica la variante R315N + V317T FVII deseada. El producto de la PCR secundaria se digirió con BamHI y HindIII antes de la clonación en el vector PF#34 entre los sitios BamHI y HindIII que da como resultado PF#249.
Además, en los casos en los que la mutación(es) introducida estaban suficientemente próximas a un único sitio de restricción de las endonucleasas en la variante del plásmido de expresión, se construyeron genes usando un procedimiento de construcción que engloba una única etapa de PCR y una clonación posterior. Por ejemplo, la sustitución K143N+N145T se introdujo mediante el uso de los cebadores de PCR:
7
en una sola reacción de PCR.
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El producto de la PCR se clonó posteriormente usando los sitios de restricción de las endonucleasas XbaI y HindIII.
Usando la estrategia anterior, se prepararon los siguientes conjugados de glicosilación y sus actividades amidolíticas se probaron como se ha descrito en la sección titulada Procedimiento de medición de bajos niveles de actividad catalítica. Además, parte de los conjugados se sometieron a un ensayo de coagulación de una sola etapa descrito en la sección titulada Medición de la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica. Los resultados obtenidos se compilan en la tabla siguiente.
8
Ejemplo 4 Mejora de la utilidad del sitio de glicosilación mediante la introducción de otro sitio de glicosilación próximo (localizado N-terminalmente)
Para evitar la autolisis del FVII humano de tipo silvestre se introdujo un sitio de glicosilación en posición 315 realizando las sustituciones R315N y V317T como se ha descrito anteriormente, que da como resultado PF#249.
Tras la transfección de células CHO K1, usando Lipofactamine 2000, se obtuvieron bajos niveles de expresión transitorios. La realización del ensayo sobre el sobrenadante transitorio a las 24 horas mediante el ensayo amidolítico, COASET® FVII, indicó que la variante era activa. Después de seleccionar usando 400 \mug/ml de higromicina B se obtuvo una reserva de clones estables. Esta reserva expresa la variante R315N+V317T a 0,2 \mug/ml aproximadamente, permitiendo el análisis de transferencia Western para la determinación del grado de uso del sitio de glicosilación introducido. Se sometió a ensayo un sobrenadante de 24 horas de la reserva estable mediante transferencia Western y reveló el uso parcial del sitio de glicosilación introducido en la posición 315, está glicosilada aproximadamente la mitad de la proteína secretada completamente procesada. No obstante, si el sitio de glicosilación nativo se mueve de la posición 145 a la posición 143, realizando las sustituciones K143N+N145T, el sitio de glicosilación introducido en la posición 315 está completamente glicosilado como se comprueba mediante transferencia Western.
Ejemplo 5 Expresión del FVII en células HEK 293
Se sembró la línea celular (ATCC # CRL-1573) a una confluencia del 20% en matraces T-25 usando DMEM, FCS al 10% inactivado por calor con elevado contenido en glucosa (Gibco/BRL Cat # 10091), 5 \mug/ml de filoquinona y se dejó crecer hasta confluencia. La monocapa de células confluentes se transfectó con 1, 2, 5, 10 y 20 \mug del plásmido p226 descrito anteriormente usando el agente de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas tras la transfección se extrajo una muestra del medio. La concentración del FVII en los experimentos de expresión transitorios a las 24 horas fue, de media, 0,15 \mug/ml.
Posteriormente, se administró a las células medio de selección que contiene 100 \mug/ml de higromicina B. Después de tres semanas de selección, con la renovación del medio cada tres o cuatro días, las células resistentes a higromicina se transfectaron hasta confluencia en los matraces con 1 \mug de ADN del plásmido y 2 \mug de ADN del plásmido. Las células de cada uno de los cinco matraces se recogieron y se reunieron. La reserva estable resultante de transfectantes que expresan el factor VII humano de coagulación de la sangre nativo se congeló en nitrógeno líquido según los procedimientos habituales.
Ejemplo 6 Generación de células HEK que expresan FVII de manera estable
Se descongeló un vial de la reserva de transfectantes HEK293 PF#226 y las células se sembraron en un matraz de tejidos de 75 cm^{2} que contiene 15 ml de DMEM con un elevado contenido glucosa, FCS al 10%, filoquinona (5 mg/ml), 100 U/l de penicilina, 100 \mug/l de estreptomicina, que se usó para todos los experimentos siguientes, y se cultivó durante 24 horas. Las células se recogieron, se diluyeron y se pusieron en placas de microtitulación de 96 pocillos a una densidad celular de 1/2 célula/pocillo. Después de 12 días había presentes en los pocillos colonias de 20-100 células aproximadamente y se marcaron aquellos pocillos que contenían sólo una colonia. Después de crecer durante dos días más, se añadió 100 \mul de medio a todos los pocillos. Dos días después, se cambió el medio en todos los pocillos que sólo contenían una colonia. Las primeras colonias se transfirieron a matraces de cultivo de tejidos de 25 cm^{2} después de tres días y dependiendo del nivel de confluencia las colonias se transfirieron a matraces de cultivo de tejidos de 25 cm^{2} en los siguientes 11 días. Cuando llegaron a confluencia en los matraces de tejidos T-25 el medio se cambió y se permitió a los clones segregar el FVII al medio de cultivo durante 24 horas, tras las cuales los sobrenadantes se recogieron y se sometieron a ensayo para la presencia del factor VII usando el ensayo amidolítico COASET FVII. Se encontró que un clon, C18, expresa 29 \mug/ml del FVII.
Ejemplo 7 Expresión de variantes de glicosilación del FVII sin actividad amidolítica capaz de inhibir la función del FVII
Se construyeron, esencialmente como se describe en el ejemplo 3, los plásmidos de expresión para la expresión de los mutantes R290N+A292T y G291N del borde del sitio activo.
Usando el ensayo amidolítico COASET® FVII (véase anteriormente) se evaluó la capacidad de las dos variantes de glicosilación del FVII, R290N+A292T y G291N, para inhibir la actividad del rFVIIa. Los plásmidos PF#250 que codifican R290N+A292T y el plásmido PF#294 que codifica G291N se transfectan en células HEK293 cultivadas en suero casi confluentes usando Lipofectamine 2000. Las células transfectadas se incubaron a 37ºC con el 5% de CO_{2} durante tres horas después de la transfección antes de cambiar el medio a medio exento de suero (DMEM, ITS-A, ExCyte, filoquinona, P/S). 40 horas después de la transfección el medio acondicionado se recogió y se aclaró por centrifugación para el análisis.
Se preparó una curva patrón a partir de rFVIIa: 0,0125 ng, 0,025 ng, 0,05 ng, 0,075 ng y 0,1 ng. A alícuotas de 50 \mul de medio acondicionado sin diluir, diluido 2 veces, diluido 5 veces, diluido 10 veces y diluido 50 veces de las dos variantes de glicosilación inactivas R290N+A292T y G291N o del medio acondicionado de un simulacro de transfección se le añadió 0,025 ng de rFVIIa. Cuando se sometió a ensayo en el ensayo COASET FVII los 0,025 ng del FVIIa correspondían a una señal de DO_{405} = 0,35 (primera carrera) y DO_{405} = 0,26 (segunda carrera).
Los resultados obtenidos se compilan en la tabla a continuación:
9
Como se observa de los datos anteriores los conjugados de glicosilación G291N y R290N+A292T inhiben la función del rFVIIa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Purificación del FVII y activación posterior
La purificación del Factor VII DE tipo silvestre y de sus conjugados se realizó a 4ºC. El sobrenadante de las células que expresan el conjugado (o del FVII de tipo silvestre) se esterilizó por filtración (0,22 \mum) y se diluyó 2 veces en agua milliQ fría. Se añadió EDTA hasta 5 mM, el pH se ajustó a 8,6 y la conductividad estaba por debajo de 10 mS/cm. La muestra se aplicó sobre una resina Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrada a 4ºC en Tris 10 mM a pH 8,6. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con Tris 10 mM (pH 8,6), NaCl 150 mM, hasta que la absorción a 280 nm alcanzó niveles basales. A continuación la columna se equilibró en Tris 10 mM (pH 8,6), NaCl 100 mM. El conjugado unido (o el FVII de tipo silvestre) se eluyó con Tris 10 mM (pH 8,6), NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM. Las fracciones enriquecidas en el conjugado (o el FVII de tipo silvestre) se reunieron y se concentraron por diálisis o usando unidades de concentración Vivaspin (Vivascience).
La auto-activación del conjugado (o del FVII de tipo silvestre) se obtuvo por concentración y la incubación de la proteína eluida en Tris 10 mM (pH 7,8-8,6), NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM.
Alternativamente, el conjugado (o el FVII de tipo silvestre) se activó a 37ºC mediante el Factor Xa acoplado a una columna de sefarosa activada con CNBr en Tris 10 mM (pH 7,4-8,0) NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM.
El conjugado (o el FVII de tipo silvestre) se sometió a intercambio de tampón con una disolución que contiene CaCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM, manitol al 3%, Tween80 al 0,05%, se tamponó a pH 5,6 y se esterilizó por filtración antes de almacenar a -80ºC.
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Ejemplo 9 PEGegilación N-terminal del FVII
El factor VII se conjugó con metoxipolietilenglicol (mPEG) con un peso molecular de 5 kDa aproximadamente usando M-PEG-CHO (M-ALD-5000, obtenida de Shearwater) en un tampón que contiene citrato sódico 10 mM, CaCl_{2} 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. M-PEG-CHO estaba presente en un exceso molar de 50-100 veces, y la concentración de la proteína era de 0,2-0,5 mg/ml. La reacción se llevó a cabo en lotes de 300-1500 \mul a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación, y se añadió NaBH_{3}CN 500-1000 veces en exceso y se prosiguió con la incubación durante toda la noche a temperatura ambiente.
El FVII PEGilado se sometió a intercambio de tampón con el tampón A (Tris 10 mM a pH 7,6) y se aplicó a 4ºC sobre una columna mono Q (Pharmacia) equilibrada en tampón A. La proteína unida se eluyó en un gradiente del 0-100% de B (Tris 10 mM (pH 7,6), NaCl 500 mM) con 40 volúmenes de columna.
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Ejemplo 10 Estudios farmacocinéticos en ratas
Tanto el FVII de tipo silvestre como los conjugados de la invención se formulan en un tampón de glicilo-glicina de 1,3 mg/ml a pH 5,5 que contiene 1,5 mg/ml de CaCl_{2}, 30 mg/ml de manitol, 0,1 mg/ml de polisorbato 80 y 3 mg/ml de NaCl. Para la determinación de la semi-vida in vivo se administra cada una de las preparaciones a ratas Sprague-Dawley en forma de inyección intravenosa en bolo. Las inyecciones se administran lentamente durante 10 segundos aproximadamente para reducir el riesgo potencial de fallo cardiaco debido a la elevada concentración de Ca^{2+}. Se extraen muestras de sangre de cada una de las nueve ratas anestesiadas a intervalos adecuados, por ejemplo, 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos y 1 hora después de la inyección. Las muestras de sangre se recogen en tubos de 1 ml que contienen 50 \mul de una disolución de citrato-fosfato-dextrosa con adenina (Sigma #C4431) para prevenir la coagulación. Inmediatamente después de la recolección, las muestras se almacenan a 0ºC aproximadamente hasta la centrifugación y posterior recolección de los sobrenadantes plasmáticos citrados para ensayo. Las muestras se someten a ensayo mediante el ensayo de coagulación de una etapa como se ha descrito en la sección Medición de la sensibilidad reducida a la degradación proteolítica y a continuación se calculan las semi-vidas.
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<110> Maxygen ApS
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<120> Moléculas similares al Factor VII o VIIa
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<130> 0212W0100
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<140>
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<141>
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<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 406
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221>.MOD_RES
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<222> (6)..(35)
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<223> Xaa = ácido \gamma-carboxiglutámico o ácido glutámico
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<400> 1
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10
11
12 
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<210> 2
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<211> 1338
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (115)..(1335)
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<400> 2
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13
14
15 
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<210> 3
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<211> 406
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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16
17 
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<210> 4
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<211> 1357
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Casete de expresión para la expresión del FVII en células de mamífero
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<400> 4
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18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr174
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr175
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t 
\hfill
31 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr216
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
cttaaggatc ccgccaccat ggtcagccag 
\hfill
30 
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<210> 8
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr229
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggagtccccg gttttgttgg actgctgc 
\hfill
28 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr221
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
acttaagctt ttatcaaggg a 
\hfill
21 
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<210> 10
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr228
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcagcagtcc aacaaaaccg gggactcc 
\hfill
28 
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<210> 11
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador CBProFpr226
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cattctagaa aaccggaccg ctagcaaacc 
\hfill
30

Claims (19)

1. Un conjugado polipeptídico que comprende al menos un resto azúcar unido covalentemente a un sitio de N-glicosilación introducido in vivo, en el que la secuencia de aminoácidos de la parte polipeptídica de dicho conjugado difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y en la que se ha introducido un sitio de N-glicosilación in vivo mediante la sustitución V253N.
2. El conjugado polipeptídico de la reivindicación 1, en el que se han introducido dos o más sitios de N-glicosilación in vivo.
3. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y en la que se ha introducido un sitio de N-glicosilación in vivo mediante la sustitución V253N.
4. Un vector de expresión que alberga la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 3 o un vector de expresión según la reivindicación 4.
6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, en la que dicha célula hospedadora es una célula \gamma-carboxilante capaz de la glicosilación in vivo.
7. Un procedimiento para producir un conjugado polipeptídico según la reivindicación 1 ó 2, que comprende el cultivo de una célula hospedadora como se ha definido en la reivindicación 5 ó 6 en condiciones que da lugar a la expresión del polipéptido, y la recuperación del polipéptido, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora eucariota capaz de la glicosilación in vivo.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora es una célula de mamífero.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la célula hospedadora es una célula CHO, una célula BHK o una célula HEK.
10. Una composición que comprende un conjugado polipeptídico como se ha definido en la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. Un conjugado polipeptídico como se ha definido en la reivindicación 1 ó 2 para su uso como medicamento.
12. Uso de un conjugado polipeptídico como se ha definido en la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF en un mamífero.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que la enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF se selecciona del grupo constituido por enfermedades en las que es deseable una formación incrementada del coágulo.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que la enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF es hemofilia.
15. Uso según la reivindicación 12, en el que la enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF es traumatismo.
16. El conjugado polipeptídico de la reivindicación 1 ó 2, para su uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad relacionado con el FVIIa/TF en un mamífero.
17. El conjugado polipeptídico de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de enfermedades en las que es deseable una formación incrementada del coágulo.
18. El conjugado polipeptídico de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de hemofilia.
19. El conjugado polipeptídico de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de traumatismo.
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