ES2330658T3 - Polipeptido inmunogeno compuesto por peptidos cripticos optimizados derivados de antigenos tumorales, y sus usos. - Google Patents
Polipeptido inmunogeno compuesto por peptidos cripticos optimizados derivados de antigenos tumorales, y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia YLQVNSLQTVX 1X 2X 3YLEYRQVPVX 1X 2X 3 YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1), en el que los epítopos TERT988Y (SEC ID N.º: 8), MAGE-A248V9 (SEC ID N.º: 9), y HER-2/neu402Y (SEC ID N.º: 10) están separados mediante espaciadores X1X2X3, en los que X1, X2 y X3 son cualquier aminoácido o ninguno.
Description
Polipéptido inmunógeno compuesto por péptidos
crípticos optimizados derivados de antígenos tumorales, y sus
usos.
La presente invención está relacionada con el
campo de las vacunas contra el cáncer. De forma más particular, la
invención se refiere a un polipéptido optimizado para usar en una
vacuna contra el cáncer, que comprende tres péptidos tumorales
crípticos con capacidad inmunógena mejorada.
La reciente identificación de antígenos
asociados a tumores que son atacados por los linfocitos T
citotóxicos (CTL) antitumorales ha abierto el camino para
estrategias de vacunas contra el cáncer dirigidas a estimular el
repertorio de CTL específicos de tumor.
Las vacunas antitumorales experimentales tienen
muchas formas, que incluyen péptidos libres, células dendríticas
cargadas con péptidos o lisados tumorales y ADN. Aunque las vacunas
con base peptídica son muy atractivas comparadas con otras formas
en cuanto a la viabilidad, se encontró que, en muchos estudios, los
péptidos tumorales dominantes solo provocaban respuestas
inmunológicas y clínicas débiles, con una gran variabilidad entre
pacientes (Rosenberg et al., 2004). Varios factores podrían
explicar estos resultados relativamente decepcionantes.
Primeramente, la mayoría de los antígenos tumorales son proteínas
autólogas no mutadas que también son expresadas por los tejidos
normales, incluido el timo. Esto suscita problemas de tolerancia por
parte del repertorio de CTL específicos de tumores (Restifo, 2001;
Van Pel et al., 1995), que emplea péptidos dominantes en
lugar de crípticos (Cibotti et al., 1992; Nanda y Sercarz,
1995; Restifo, 2001). De hecho, recientemente se demostró que los
péptidos crípticos inducían inmunidad antitumoral más eficientemente
que los péptidos dominantes (Gross et al., 2004).
Segundo, las estrategias basadas en epítopos
únicos inducen una respuesta de CTL con HLA restringidos solo
contra un antígeno que, debido a la inestabilidad genética de los
tumores, puede no estar expresado en todas las células tumorales
(Brasseur et al., 1995; Lehmann et al., 1995). Las
estrategias que provocan respuestas de CTL contra antígenos
múltiples tendrían varias ventajas potenciales. En particular, la
expresión de al menos un antígeno diana debería ser suficiente para
desencadenar citotoxicidad, y es improbable que las células
tumorales pierdan todos los antígenos diana de forma simultánea,
especialmente cuando los antígenos en cuestión son esenciales para
la supervivencia celular y el crecimiento del tumor. Esta estrategia
puede provocar respuestas inmunitarias potentes (Oukka et
al., 1996).
Finalmente, la inmunoterapia contra el cáncer de
amplio espectro debería dirigirse contra antígenos tumorales
universales, como por ejemplo TERT, HER-2/neu,
MUC-1 y MAGE-A, que están
hiperexpresados en una amplia variedad de tumores (Minev et
al., 2000; Ofuji et al., 1998; Ogata et al., 1992;
Reese y Slamon, 1997; Slamon et al., 1987; Van den Eynde y
van der Bruggen, 1997; Vonderheide et al., 1999). La mayoría
de estos antígenos están implicados en la supervivencia de las
células tumorales y en la capacidad tumorogénica y su regulación por
disminución para evadir la respuesta inmunitaria por lo tanto
podría tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral.
Para dar respuesta al menos a parte de las
cuestiones mencionadas anteriormente, los inventores han combinado
tres péptidos crípticos optimizados derivados de antígenos tumorales
universales (TERT_{988Y}, HER-2/neu_{402Y} y
MAGE-A_{248V9}) en varios polipéptidos de 28
aminoácido, y han evaluado la capacidad de los polipéptidos
obtenidos de inducir una respuesta inmunitaria contra los tres
péptidos de forma simultánea, tanto in vivo en ratones
transgénicos con HLA-A*0201 (HHD) como in
vitro en donantes humanos sanos. Previamente se había
demostrado que cada uno de los tres péptidos provocaba una respuesta
antitumoral in vivo e in vitro (Gross et al.,
2004; Scardino et al., 2002). De forma interesante, los CTL
provocados por MAGE-A_{248V9} se dirigían contra
todos los antígenos MAGE-A (-A1, -A2, - A3, -A4,
-A6, -A10, -A12) (Graff-Dubois et al.,
2002).
Como describe más adelante, los inventores
demostraron que a) un polipéptido formado por TERT_{988Y,}
HER-2/neu_{402Y} y
MAGE-A_{248V9} provoca una respuesta de CTL
poliespecíficos, al contrario que la simple mezcla de los tres
péptidos; b) la capacidad del polipéptido de inducir una respuesta
de CTL poliespecíficos depende de su organización interna: de las
seis variantes que corresponden a todas las disposiciones posibles
de los tres péptidos, solo una produjo una respuesta de CTL
triespecíficos en casi todos los experimentos con ratones y células
humanas.
Un primer aspecto de la invención es por lo
tanto un polipéptido que comprende la secuencia
YLQVNSLQTVX_{1}X_{2}
X_{3}YLEYRQVPVX_{1}X_{2}X_{3}YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1). En esta secuencia, los epítopos TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9} y HER-2/neu_{402Y} están separados mediante espaciadores X_{1}X_{2}X_{3}, en los que X_{1}, X_{2} y X_{3} son cualquier aminoácido o ninguno. El polipéptido, por lo tanto, tiene una longitud de al menos 28 aminoácidos; su longitud puede aumentarse mediante la adición de espaciadores entre los epítopos, y/o por la adición de señales, en sus extremos N y/o C, que favorezcan su procesamiento. En particular, el polipéptido de acuerdo con la invención además puede comprender una secuencia de señalización de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N. Se han descrito varias secuencias de señalización de translocación al retículo endoplasmático en la bibliografía científica y pueden usarse en el contexto de la invención. Por ejemplo, puede añadirse la secuencia de señalización de la cadena kappa de Ig (Ishioka et al., 1999), y la secuencia de señalización de la proteína E3/19-kD (Anderson et al., 1991) en el extremo N de los péptidos de acuerdo con la invención. De forma alternativa o además, el polipéptido de acuerdo con la invención puede com-
prender además ubicuitina en su extremo C, dado que la ubicuitinación de las proteínas provoca una mayor proteólisis.
X_{3}YLEYRQVPVX_{1}X_{2}X_{3}YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1). En esta secuencia, los epítopos TERT_{988Y}, MAGE-A_{248V9} y HER-2/neu_{402Y} están separados mediante espaciadores X_{1}X_{2}X_{3}, en los que X_{1}, X_{2} y X_{3} son cualquier aminoácido o ninguno. El polipéptido, por lo tanto, tiene una longitud de al menos 28 aminoácidos; su longitud puede aumentarse mediante la adición de espaciadores entre los epítopos, y/o por la adición de señales, en sus extremos N y/o C, que favorezcan su procesamiento. En particular, el polipéptido de acuerdo con la invención además puede comprender una secuencia de señalización de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N. Se han descrito varias secuencias de señalización de translocación al retículo endoplasmático en la bibliografía científica y pueden usarse en el contexto de la invención. Por ejemplo, puede añadirse la secuencia de señalización de la cadena kappa de Ig (Ishioka et al., 1999), y la secuencia de señalización de la proteína E3/19-kD (Anderson et al., 1991) en el extremo N de los péptidos de acuerdo con la invención. De forma alternativa o además, el polipéptido de acuerdo con la invención puede com-
prender además ubicuitina en su extremo C, dado que la ubicuitinación de las proteínas provoca una mayor proteólisis.
En una realización preferida del polipéptido de
acuerdo con la invención, X_{1} = X_{2} = X_{3} = ninguno.
Esto quiere decir que los tres epítopos están unidos directamente
entre sí. En ausencia de ubicuitina y de señal de translocación al
RE, el polipéptido es por lo tanto el polipéptido
Poli-6 que se ilustra en los ejemplos más adelante,
cuya secuencia es YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL (SEC ID N.º: 2). De
acuerdo con otra realización, los espaciadores entre los epítopos
son AAY, lo que quiere decir que X_{1}=X_{2}=A y X_{3}=Y.
En los polipéptidos de acuerdo con la invención,
los aminoácidos pueden ser o bien aminoácidos L o D. Un polipéptido
de acuerdo con la invención preferiblemente muestra una o ambas de
las siguientes propiedades, que indican la buena capacidad
inmunógena:
- induce una respuesta triespecífica de
linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y},
MAGE-A_{248V9}, y
HER-2/neu_{402Y}, en una mayoría de ratones HHD
vacunados con dicho polipéptido;
- induce una respuesta triespecífica de
linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y},
MAGE-A_{248V9}, y
HER-2/neu_{402Y} en un ensayo in vitro con
PBMC humanos de donantes sanos con HLA-A*0201; esta
respuesta triespecífica preferiblemente se obtiene con PBMC de una
mayoría, más preferiblemente al menos 70%, de donantes sanos con
HLA-A*0201.
Estas propiedades pueden ser analizadas
fácilmente por el experto en la técnica, usando los protocolos y
ensayos que se describen en la parte experimental más adelante.
Otro objetivo de la presente invención es una
molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se
describe anteriormente. En una realización preferida, la molécula de
ácido nucleico es un vector de expresión. Por "vector de
expresión" se quiere decir una molécula que, cuando se introduce
en una célula de mamífero, permite expresar dicho polipéptido
codificado. Con ese objetivo, el experto en la técnica puede elegir
un promotor de la transcripción apropiado (por ejemplo, el promotor
del CMV), una secuencia codificante con codones optimizados para la
expresión en células humanas, una secuencia de terminación de la
traducción apropiada, opcionalmente una secuencia de consenso de
Kozak, etc. La molécula de ácido nucleico es preferiblemente una
molécula de ADN.
Un tercer aspecto de la invención es un una
célula dendrítica aislada cargada con un polipéptido como se ha
descrito anteriormente, o transducida con una molécula de ácido
nucleico que codifica un polipéptido así. En el presente contexto
"aislada" quiere decir que dicha célula dendrítica está fuera
del cuerpo del paciente. La célula preferiblemente se carga o se
transduce ex vivo. Por ejemplo, la célula dendrítica puede
cargarse con el polipéptido mediante la técnica que describen
Vonderheide et al. (Vonderheide et al., 2004), o
transducirse con un vector de expresión usando el protocolo que
describen Firat et al. (Firat et al., 2002).
La invención también se refiere a un complejo
que comprende un vector de transporte de péptidos y un polipéptido
como se describe anteriormente. Los ejemplos de vectores de
transporte de péptidos que pueden usarse de acuerdo con la
invención son péptidos que penetran en las células, toxinas
bacterianas como por ejemplo la adenilato ciclasa de B.
pertussis (Fayolle et al., 1999), la toxina de la
difteria (Fayolle et al., 1999), la toxina del ántrax
(Doling et al., 1999), la subunidad B de la toxina Shiga
(Haicheur et al., 2000) y otros vectores como por ejemplo el
PLA2 del veneno de abeja (Babon et al., 2005), liposomas,
virosomas (Bungener et al., 2002) y similares.
Otra clase de complejo de acuerdo con la
invención comprende un vector de transporte de genes y una molécula
de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente. Hasta la fecha
se ha descrito una enorme variedad de vectores de transporte de
genes entre los que puede elegir el experto en la técnica
dependiendo de la forma de administración que se contemple (ex
vivo, intratumoral, sistémica, ...), el tipo de células diana,
etc. Los ejemplos no limitantes de vectores de transporte de genes
que pueden usarse de acuerdo con la invención son vectores no
víricos como por ejemplo liposomas, péptidos que penetran en las
células, nanopartículas (como partículas de oro para la
administración con una pistola de genes), bacterias (Vassaux et
al., 2005) y vectores víricos como por ejemplo MVA (Meseda
et al., 2005), adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus,
lentivirus y similares, que se han descrito abundantemente en la
bibliografía científica.
La invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un polipéptido y/o una
molécula de ácido nucleico y/o un complejo y/o células dendríticas
genomanipuladas como se describe anteriormente. En particular, los
polipéptidos, las moléculas de ácido nucleico, los complejos y
células dendríticas de acuerdo con la invención pueden usarse para
la preparación de una composición inmunógena para la inmunoterapia
contra el cáncer. Estas composiciones son particularmente útiles
para la inmunoterapia de tumores que expresan al menos un antígeno
que se selecciona a partir del grupo formado por la familia
MAGE-A, la familia HER y TERT, especialmente para
tratar individuos con HLA-A*0201.
La vacunación o los procedimientos de
tratamiento contra el cáncer, que comprenden una etapa de
administrar un polipéptido y/o una molécula de ácido nucleico y/o
un complejo de acuerdo con la invención, o bien in vivo a un
paciente que lo necesite, o ex vivo a células provenientes de
dicho paciente, también son parte de la invención, así como la
vacunación o procedimientos de tratamiento que comprenden una etapa
de administrar células dendríticas genomanipuladas como se describe
anteriormente a un individuo.
La invención se ilustra además mediante la
siguiente figura y ejemplos.
Figura 1: Reconocimiento de péptidos nativos
cognados mediante CTL murinos inducidos por péptidos crípticos
optimizados.
Se derivaron líneas de CTL de esplenocitos de
ratones HHD inmunizados contra péptidos crípticos optimizados, como
se describe en Materiales y Métodos. Las líneas de CTL se analizaron
para determinar la citotoxicidad contra dianas de RMAS/HHD cargadas
con un péptido irrelevante (HIVgag76) o con el péptido nativo
cognado, a una proporción entre linfocitos y células diana de
10/1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones HHD transgénicos para
HLA-A*0201 que han sido descritos en otras fuentes
(Pascolo et al., 1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Células RMAS/HHD que han sido descritos en otras
fuentes (Pascolo et al., 1997). Las células T2 tumorales que
expresan HLA-A*0201 carecen de TAP1/2. Todas las
células se cultivaron en medio RPMI 1640 o DMEM suplementado con 10%
de suero de ternero fetal (FCS).
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos fueron sintetizados por Epytop
(Nîmes, Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo que se usó para medir la afinidad
relativa (RA) se describe en detalle en otros documentos (Tourdot
et al., 2000). En resumen, se incubaron células T2 con
diversas concentraciones de péptido (0,1-100 \muM)
durante 16 h y después se marcaron con mAb BB7,2 para cuantificar
la expresión de HLA-A*0201. A cada concentración de
péptido, se calculó el marcaje específico de
HLA-A*0201 en términos de porcentaje del marcado
obtenido con el péptido de referencia HIVpol_{589} (IVGAETFYV)
que se usó a 100 \muM. La afinidad relativa se calculó en
términos de la concentración de péptido de prueba dividida entre la
concentración del péptido de referencia que indujo el 20% de la
expresión de HLA-A*0201. Para medir la estabilidad
del complejo de péptido y HLA-A*0201, se incubaron
células T2 toda la noche con cada péptido a 100 \muM y 37ºC.
Después las células se trataron con Brefeldin A durante 1 h, se
lavaron, se incubaron a 37ºC durante 0, 2, 4 y 6 horas, y se
marcaron con mAb BB7.2. La CD_{50} se definió como el tiempo
necesario para una pérdida del 50% de HLA-A*0201,
como se ha descrito anteriormente (Tourdot et al., 2000).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectó a ratones HHD por vía subcutánea con
100 \mug de péptidos nonámeros/decámeros, y con 240 \mug de
polipéptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) más
150 \mug del epítopo de linfocito T cooperador HBVcore_{128}
con I-A^{b} restringido. Once días después, se
estimularon esplenocitos (5x10^{7} células en 10 ml) de los
ratones inmunizados in vitro con péptido (10 \muM) en RPMI
1640 + 10% de FCS durante cinco días. Se establecieron las líneas
de CTL mediante reestimulación semanal in vitro con
esplenocitos radiados en presencia de concentraciones decrecientes
de péptido (1 a 0,1 \muM) y 50 U/ml de IL-2
(Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron células péptido murinas como dianas,
como se ha descrito en otros documentos (Tourdot et al.,
1997). En resumen, se pulsaron 2,5x10^{3} dianas marcadas con
^{51}Cr con péptidos a 37ºC durante 60 min. Después se añadieron
células efectoras en 100 \mul de medio y se incubaron a 37ºC
durante 4 horas. Después de incubar, se recogieron 100 \mul de
sobrenadante y la radioactividad se midió en un contador \gamma.
El porcentaje de lisis específica se determinó como: Lisis =
(Liberación experimental - Liberación espontánea) / (Liberación
máxima - Liberación espontánea) x 100.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el marcado de los tetrámeros, se tiñeron
células de los nódulos linfáticos (LN) inguinales y paraaórticos de
ratones inmunizados con 15 \mug/ml de tetrámeros
HLA-A2/TERT_{988Y},
HLA-A2/MAGE-A_{248V9} y
HLA-A2/HER-2/neu_{402Y} acoplados
a PE (Proimmune, Oxford, Reino Unido) en presencia de un anticuerpo
contra el receptor Fc (clon 2.4 G2) en 20 \mul de PBS, 2% de FCS
durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez
en PBS, 2% de FCS y después se tiñeron con anticuerpos contra
CD44-FITC (clon 1M.178), contra
TCR\beta-cicromo (clon H57) y contra
CD8\alpha-APC (clon 53.6.7) (BD Biosciences, Le
Pont de Claix, Francia) en 50 \mul de PBS, 2% de FCS durante 30
min a 4ºC. Después las células se lavaron una vez en PBS, 2% de FCS
y se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo
FACSCalibur® (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE. UU.).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron PBMC mediante leucocitaféresis de
voluntarios sanos con HLA-A*0201. Las células
dendríticas (DC) se produjeron a partir de células adherentes
(2x10^{6} células/ml) se cultivaron durante siete días con 500
UI/ml de GM-CSF (Leucomax®, Schering- Plough,
Kenilworth, NJ) y 500 UI/ml de IL-4 (R&D
Systems, Minneapolis, MN) en medio completo (RPMI 1640 suplementado
con 10% de suero AB humano
termoinactivado,L-glutamina 2 \muM y
antibióticos). El día 7, las DC se pulsaron con péptidos o
polipéptidos 10 \muM durante 2 h; los agentes de maduración Poly
I:C (Sigma, Oakville, Canadá) a 100 ng/ml, y mAb contra CD40 (clon
G28-5, ATCC, Manassas, VA) a 2 \mug/ml se
añadieron al cultivo y los DC se incubaron además a 37ºC toda la
noche durante hasta 48 horas. Después se radiaron las DC maduras
(3500 rad). Los linfocitos CD8+ se purificaron mediante selección
positiva con MicroBeads CD8 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos CD8^{+}
(2x10^{5}) + los linfocitos CD8^{-} (6x10^{4}) se estimularon
con 2x10^{4} DC pulsadas con péptido en medio de cultivo completo
suplementado con 1000 UI/ml de IL-6 y 5 UI/ml de
IL-12 (R&D Systems, Minneapolis, MN) en placas
de fondo redondo de 96 pocillos. A partir del día 7, los cultivos
se volvieron a estimular semanalmente con DC cargadas con péptido en
presencia de 20 UI/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron
Corp., Emeryville, CA) y 10 ng/ml de IL-7 (R&D
Systems, Minneapolis, MN). Después de la tercera restimulación, los
linfocitos CD8 se analizaron en un ensayo de liberación de
IFN-\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron linfocitos T (10^{5}) con
2x10^{5} células T2 cargadas con péptido estimulante en presencia
de 20 \mug/ml de Brefeldin-A (Sigma, Oakville,
Canadá). Seis horas después se lavaron, se tiñeron con anticuerpo
contra CD8 conjugado con r-ficoeritrina (Caltag
Laboratories, Burlingame, CA) en PBS durante 25 min a 4ºC, se
lavaron de nuevo y se fijaron con 4% de PFA. Después las células se
permeabilizaron con PBS, 0,5% de BSA, 0,2% de saponina (Sigma,
Oakville, Canadá), y se marcaron con un mAb contra IFN\gamma
conjugado con aloficocianina (PharMingen, Mississauga, Canadá)
durante 25 min a 4ºC antes de analizar con un citómetro de flujo
FACSCalibur^{TM} (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron tres péptidos para incluirlos
en el polipéptido. HER-2/neu_{402Y} y
TERT_{988Y} son las variantes optimizadas de los affinity
péptidos crípticos con baja afinidad por
HLA-A*0201HER-2/neu_{402} y
TERT_{988}, que se derivan ellos mismos de los antígenos tumorales
ampliamente expresados HER-2/neu y TERT (Scardino
et al., 2002). Difieren de los péptidos nativos en la
posición 1, donde el resto nativo está sustituido por un Y. Esta
sustitución potencia la afinidad de los péptidos crípticos
restringidos a HLA-A*0201 (Tourdot et al.,
2000). MAGE-A_{248V9} es la variante optimizada de
el MAGE-A_{248D9/G9} con baja afinidad por
HLA-A*0201 que comparten todas las moléculas
MAGE-A. Difiere de los péptidos nativos en la
posición 9, donde los aminoácidos D/G son sustituidos por el resto
de ancla primaria V. Esta sustitución también potencia la afinidad
de HLA-A*0201 (Graff-Dubois et
al., 2002).
Los tres péptidos mostraban una elevada afinidad
de unión por HLA-A*0201 (RA<5) y formaban
complejos estables de HLA/péptido (CD50 > 2 h)
(Graff-Dubois et al., 2002; Scardino et
al., 2002) (Tabla 1). Como se demostró anteriormente, los tres
péptidos eran inmunógenos en ratones ratones HHD transgénicos para
HLA-A*0201 (Graff-Dubois et
al., 2002; Scardino et al., 2002). Y más importante, las
líneas de CTL murinos reconocían específicamente y destruían las
dianas RMAS/HHD cargadas con el péptido nativo apropiado (Figura
1).
La forma más simple de estimular una respuesta
de CTL poliespecíficos in vivo sería inyectar una mezcla de
los péptidos relevantes. Por lo tanto, los inventores examinaron si
los ratones HHD vacunados con una mezcla equimolar de péptidos
HER-2/neu_{402Y}, TERT_{988Y} y
MAGE-A_{248V9} desarrollaban una respuesta
poliespecífica in vivo. La respuesta inmunitaria se evaluó
midiendo la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de los
péptidos en los nódulos linfáticos que drenaban el sitio de la
inyección siete días después de la vacunación, usando tetrámeros
específicos. Antes de usar, se validó cada tetrámero con líneas de
CTL específicas de péptido como se había descrito anteriormente
(Miconnet et al., 2002). Se registró una respuesta positiva
cuando el porcentaje de linfocitos CD8 positivos para el tetrámero
era superior al porcentaje medio + 3 desviaciones típicas de
linfocitos CD8 positivos para el tetrámero en seis ratones sin
exposición previa (0,16% para MAGE-A_{248V9},
0,13% para HER-2/neu_{402Y} y 0,16% para
TERT_{988Y}). Se vacunó a ocho ratones con la mezcla de péptidos
en dos experimentos independientes (Tabla 2). Ninguno de los ocho
ratones respondió de forma simultánea a los tres péptidos. Tres
ratones respondieron a un péptido y cinco respondieron a dos
péptidos. Las respuestas contra MAGE-A_{248V9}
fueron más frecuentes (6/8 ratones) que las respuestas a
HER-2/neu_{402Y} (4/8 ratones) o TERT_{988Y}
(3/8 ratones).
\vskip1.000000\baselineskip
La incapacidad de la mezcla de péptidos de
estimular una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8 se
confirmó in vitro con células humanas. Se estimularon PBMC
de tres donantes con HLA-A*0201 in vitro con
una mezcla de MAGE-A_{248V9},
HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} y, después de
cuatro ciclos de reestimulación, se analizaron para determinar su
capacidad de reconocer y de ser activados por células estimuladoras
cargadas con cada péptido. La activación de los PBMC se evaluó
midiendo el porcentaje de linfocitos CD8 que producía IFN\gamma
mediante de marcado intracelular. Se registró una respuesta positiva
cuando el porcentaje de PBMC activados fue al menos dos veces la
obtenida con un péptido irrelevante. Ninguno de los tres donantes
desarrolló una respuesta específica de linfocitos T CD8 contra los
tres péptidos (Tabla 3). El donante n.º D5725 respondió a
MAGE-A_{248V9}/HER-2/neu_{402Y},
el donante n.º D7241 respondió a HER-2/neu_{402Y},
y el donante n.º D7225 respondió a
MAGE-A_{248V9}/TERT_{988Y}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demostraron que la vacunación
una simple mezcla de péptidos inmunógenos no generó una respuesta
poliespecífica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores después examinaron si la
vacunación con polipéptidos compuestos por
MAGE-A_{248V9},
HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} provocaba una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+. Primero se optimizó el polipéptido tomando en cuenta el procesamiento de cada péptido en su posición del extremo C y la generación de péptidos unidos con afinidad elevada por HLA-A*0201. El procesamiento en la posición del extremo C se evaluó usando dos modelos predictivos online de escisión con proteasomas (Netchop: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/, PAProc: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) (Kesmir et al., 2002; Kuttler et al., 2000; Nussbaum et al., 2001). Se consideró arbitrariamente que un péptido estaba procesado si ambos modelos predecían su escisión. La afinidad de los nuevos péptidos unidos se evaluó usando el modelo predictivo su Bimas (Parker et al., 1994). Seis variantes de polipéptidos, denominadas Poli-1 a Poli-6, englobaba todas las posibles disposiciones de los péptidos (Tabla 4). Ninguna de las seis variantes estaba asociada a la escisión de los tres péptidos en los modelos predictivos (Tabla 5). Además, Poli-1, Poli-3, Poli-4 y Poli-5 generaron péptidos unidos con puntuaciones predictivas elevadas de unión a HLA-A*0201 (Tabla 4). Uno de estos péptidos (YLYLQVNSL; Poli-1 y -3) correspondía a un péptido autólogo derivado de la región de la cadena pesada variable de inmunoglobulina humana.
HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} provocaba una respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+. Primero se optimizó el polipéptido tomando en cuenta el procesamiento de cada péptido en su posición del extremo C y la generación de péptidos unidos con afinidad elevada por HLA-A*0201. El procesamiento en la posición del extremo C se evaluó usando dos modelos predictivos online de escisión con proteasomas (Netchop: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/, PAProc: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) (Kesmir et al., 2002; Kuttler et al., 2000; Nussbaum et al., 2001). Se consideró arbitrariamente que un péptido estaba procesado si ambos modelos predecían su escisión. La afinidad de los nuevos péptidos unidos se evaluó usando el modelo predictivo su Bimas (Parker et al., 1994). Seis variantes de polipéptidos, denominadas Poli-1 a Poli-6, englobaba todas las posibles disposiciones de los péptidos (Tabla 4). Ninguna de las seis variantes estaba asociada a la escisión de los tres péptidos en los modelos predictivos (Tabla 5). Además, Poli-1, Poli-3, Poli-4 y Poli-5 generaron péptidos unidos con puntuaciones predictivas elevadas de unión a HLA-A*0201 (Tabla 4). Uno de estos péptidos (YLYLQVNSL; Poli-1 y -3) correspondía a un péptido autólogo derivado de la región de la cadena pesada variable de inmunoglobulina humana.
Dado que esta estrategia predictiva no consiguió
identificar la variante de polipéptido con la mayor eficacia
teórica, las variantes se analizaron experimentalmente para
determinar su capacidad de generar una respuesta triespecífica de
linfocitos T CD8 in vivo (ratones HHD) e in vitro
(donante sano con HLA-A*0201).
Se vacunó a los ratones HHD con cada
polipéptido, y se identificaron los linfocitos T CD8 específicos
para los péptidos individuales drenando los nódulos linfáticos
usando tetrámeros específicos. Las seis variantes de polipéptidos
fueron inmunógenas en los ratones HHD (es decir, generaron una
respuesta contra al menos un péptido) pero la frecuencia de los
ratones que respondía difería entre variantes. Las variantes más
inmunógenas fueron Poli-1, Poli-3 y
Poli-6, con 100%, 87% y 83% de ratones que
respondían, respectivamente (Tabla 6). Poli-2,
Poli-4 y Poli-5 indujeron una
respuesta respectivamente en 57%, 62% y 62% de los ratones
vacunados. La frecuencia de respuestas potentes (% de linfocitos CD8
positivos para el tetrámero de al menos el doble del corte; indicado
con ++) fue mayor con Poli-6 (41% de todas las
respuestas), Poli-3 (30% de todas las respuestas) y
Poli-1 (25% de todas las respuestas). Las respuestas
se dirigían contra MAGE-A_{248V9} en 74% de los
ratones que respondían, HER-2/neu_{402Y} en 71% y
TERT_{988Y} en 55%. El análisis de las respuestas inmunitarias en
ratones individuales mostró que Poli-6 indujo una
respuesta triespecífica en 67% de los ratones vacunados, seguido de
Poli-4 (37,5%), Poli-1 (28,5%),
Poli-5 (25%) y Poli-3 (12,5%).
Poli-2 no indujo una respuesta triespecífica en
ningún ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 6: Respuesta de linfocitos T
CD8 contra MAGE-A_{248V9},
HER-2/neu_{402Y} y TERT_{988Y} en ratones
individuales inmunizado con los diferentes polipéptidos. La
respuesta inmunitaria se evaluó midiendo el % de los linfocitos T
CD8 positivos para el tetrámero de los nódulos linfáticos de drenaje
en los ratones vacunados. "-": porcentaje de linfocitos T CD8
positivos para el tetrámero inferior al corte, como se define en
Materiales y Métodos (0,16% para
MAGE-A_{248V9}, 0,13 para
HER-2/neu_{402Y} y 0,16% para TERT_{988Y}).
"+": porcentaje una a dos veces superior al corte. "++":
porcentaje más de dos veces el corte. Las líneas sombreadas
corresponden a los ratones que respondieron a los tres
péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados se confirmaron con células
humanas in vitro. Cada polipéptido (excepto
Poli-2, que era muy poco inmunógeno en los ratones
HHD) se analizó con células de dos a cinco donantes sanos. Las
respuestas inmunitarias in vitro se evaluaron midiendo el
porcentaje de linfocitos CD8 que producían IFN\gamma \beta
después de la activación específica con péptidos. Los cinco
polipéptidos estimularon los linfocitos T para que respondieran a
al menos un péptido en 80% a 100% de los donantes. Sin embargo, sólo
Poli-6 y Poli-1 indujeron
respuestas triespecíficas en los CTL. Poli-6 indujo
respuestas contra los tres péptidos en 80% de donantes, comparado
con solo el 25% de donantes con Poli-1 (Tabla 7).
Poli-6 también provocó las respuestas más potentes
(contra MAGE-A_{248V9} en los donantes n.º D7017 y
n.º D7225; y contra HER-2/neu_{402Y} en el donante
n.º D7744).
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 7: Linfocitos T CD8
específicos de péptido inducidos por la estimulación con polipéptido
de PBMC de donante humano sano. Se generaron linfocitos T CD8
específicos de péptido mediante la estimulación in vitro de
PBMC de donantes sanos con los diferentes polipéptidos. Se evaluó la
especificidad de los linfocitos CD8 inducidos midiendo el % de
linfocitos CD8 que producía IFN\gamma tras la estimulación con
células T2 cargadas con péptido como se ha descrito en Materiales y
Métodos. "-": % de células positivas para IFN\gamma menos de
2 veces superior al control negativo (péptido irrelevante).
"+": % de células positivas para IFN\gamma 2 veces superior
al control negativo. "++": % de células positivas para
IFN\gamma 2 a 10 veces superior al control negativo. "+++": %
de células positivas para IFN\gamma m\alphas diez veces el
control negativo. Las líneas sombreadas corresponden a las células
de donante que respondían a los tres
péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Juntos estos resultados mostraron que
Poli-6 indujo unas respuestas triespecíficas de
linfocitos T CD8 frecuentes y potentes tanto in vivo (ratones
HHD) como in vitro (PBMC humanos).
\vskip1.000000\baselineskip
Este estudio de polipéptidos compuestos por tres
péptidos crípticos optimizados restringidos a
HLA-A*0201 derivados de los antígenos tumorales
universales hTERT, HER-2/neu y
MAGE-A identificó un polipéptido, denominado
Poli-6 (SEC ID N.º: 2), que indujo una respuesta de
CTL contra los tres péptidos componentes tanto en ratones HHD
transgénicos que expresaban en HLA-A*0201 como en
células de donante humano sano.
Existe un amplio consenso sobre la influencia de
la organización de los polipéptidos (estructuración del péptido,
adición de espaciadores), que de forma ideal debería permitir la
escisión apropiada de todos los péptidos componentes y evitar la
creación de nuevos péptidos unidos con gran afinidad por la molécula
de HLA relevante. Varios estudios han demostrado que la presencia
de espaciadores entre los péptidos aumenta la eficacia de la vacuna
al promover la escisión de los péptidos individuales (Livingston
et al., 2002; Velders et al., 2001; Wang et
al., 2004). Es más, Ishioka et al. encontraron que la
posición de un péptido dentro de un polipéptido puede afectar a su
capacidad inmunógena. Esto subraya la importancia de la
configuración global del poliepítopo (Ishioka et al., 1999).
Los presentes resultados apoyan estos hallazgos, ya que uno de las
seis estructuras polipeptídicas que se analizaron era muy
inmunógena, mientras que otra era mínimamente eficaz. Esta es la
primera demostración directa de que la organización del polipéptido
debe optimizarse para obtener una capacidad inmunógena máxima.
Estos resultados también muestran que esta organización óptima no
puede preverse usando los actuales modelos predictivos de escisión
de proteasomas. De hecho, no se predijo que ninguno de los seis
polipéptidos candidatos fuera escindido de una forma más eficiente
que los otros. Además, Poli-2, que no pudo provocar
una respuesta poliespecífica, no generó péptidos unidos que se
predijera que tenían una afinidad elevada por
HLA-A*0201 en el sistema de modelo de Bimas.
Los inventores también encontraron que la
vacunación con una mezcla de los tres péptidos era mucho menos
eficaz que la vacunación con polipéptidos para provocar una
respuesta poliespecífica. De forma interesante, las células de
donante humano D7225 respondió a los tres péptidos después de la
estimulación con Poli-6 ex vivo, pero solo a
HER-2/neu_{402Y} después de la estimulación con la
mezcla de péptidos. El uso de péptidos exógenos tiene el
inconveniente de que el número de complejos de péptido y MHC I decae
con la misma cinética que la concentración de péptido exógeno (Wang
et al., 2004). La corta semivida de estos complejos
provocaría una notable pérdida en la eficacia de la sensibilización
(Gett et al., 2003). Por el contrario, la presentación
cruzada de péptidos largos mediante APC podría asegurar una fuente
endógena de péptidos con cinética más lenta y más mantenida. Se ha
demostrado que esta estrategia
de péptidos largos es más inmunógena que el uso de los péptidos cortos correspondientes (Zwaveling et al., 2002).
de péptidos largos es más inmunógena que el uso de los péptidos cortos correspondientes (Zwaveling et al., 2002).
Como se ha demostrado anteriormente, el
polipéptido Poli-6 de la SEC ID N.º: 2, que está
compuesto por tres péptidos tumorales crípticos optimizados
derivados de antígenos tumorales universales
(HER-2/neu_{402Y}, TERT_{988Y} y
MAGE-1A_{248V9}), induce una respuesta
poliespecífica en los ratones HHD que expresan
HLA-A*0201y en células humanas ex vivo. Este
polipéptido tiene potencial de vacunación antitumoral de amplio
espectro para los pacientes de cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> VAXON BIOTECH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDO INMUNÓGENO COMPUESTO POR
PÉPTIDOS CRÍPTICOS OPTIMIZADOS DERIVADOS DE ANTÍGENOS TUMORALES
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipY SUS USOS
\hfill
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<130> VMA/bv1788-2
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<160> 14
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 34
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Poli-6 con
espaciadores
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
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<222> (11)..(13)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
natural
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<220>
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<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23) .. (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
natural
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 28
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Poli-6
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<400> 2
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Poli-1
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 28
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Poli-2
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<400> 4
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Poli-3
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<400> 5
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<210> 6
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Poli-4
\newpage
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Poli-5
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<400> 7
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<210> 8
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<213> Artificial
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<220>
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<223> TERT988Y
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<400> 8
\hskip1cm
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<210> 9
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MAGE-A248V9
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<210> 10
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HER-2/neu402Y
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HER-2/neu402Y
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> epítopo de unión
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<400> 11
\hskip1cm
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<210> 12
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<211> 10
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<213> Artificial
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<223> epítopo de unión
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<400> 12
\hskip1cm
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<210> 13
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> epítopo de unión
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<400> 13
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<211> 9
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<213> Artificial
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<223> epítopo de unión
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
Claims (17)
1. Un polipéptido caracterizado porque
comprende la secuencia
YLQVNSLQTVX_{1}X_{2}X_{3}YLEYRQVPVX_{1}X_{2}X_{3}
YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1), en el que los epítopos TERT_{988Y} (SEC ID N.º: 8), MAGE-A_{248V9} (SEC ID N.º: 9), y HER-2/neu_{402Y} (SEC ID N.º: 10) están separados mediante espaciadores X_{1}X_{2}X_{3}, en los que X_{1}, X_{2} y X_{3} son cualquier aminoácido o ninguno.
YLEEITGYL (SEC ID N.º: 1), en el que los epítopos TERT_{988Y} (SEC ID N.º: 8), MAGE-A_{248V9} (SEC ID N.º: 9), y HER-2/neu_{402Y} (SEC ID N.º: 10) están separados mediante espaciadores X_{1}X_{2}X_{3}, en los que X_{1}, X_{2} y X_{3} son cualquier aminoácido o ninguno.
2. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende una secuencia de señalización
de translocación al retículo endoplasmático en su extremo N.
3. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende
ubicuitina en su extremo C.
4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que X_{1} = X_{2} = X_{3} =
ninguno.
5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que X_{1} = X_{2} = A y
X_{3} = Y.
6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque induce una
respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y},
MAGE-A_{248V9}, y
HER-2/neu_{402Y} en la mayoría de los ratones HHD
vacunados con dicho polipéptido.
7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque induce una
respuesta triespecífica de linfocitos T CD8+ contra TERT_{988Y},
MAGE-A_{248V9}, y
HER-2/neu_{402Y} en un ensayo in vitro con
PBMC humanos de donantes sanos con HLAA* 0201.
8. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicha respuesta triespecífica de
linfocitos T CD8+ se obtiene con PBMC de la mayoría, preferiblemente
al menos 70% de los donantes sanos con
HLA-A*0201.
9. Una molécula de ácido nucleico que codifica
un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
10. La molécula de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 9, que es un vector de expresión.
11. Una célula dendrítica aislada cargada con
un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, o transducida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 9 o la reivindicación 10.
12. Un complejo que comprende un vector de
transporte de péptidos y un polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8.
13. Un complejo que comprende un vector de
transporte de genes y una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 8 o la reivindicación 9.
14. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, y/o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 9 o la reivindicación 10, y/o una célula dendrítica
de acuerdo con la reivindicación 11, y/o un complejo de acuerdo con
la reivindicación 12 o la reivindicación 13.
15. Uso de un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y/o una molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10,
y/o una célula dendrítica de acuerdo con la reivindicación 11, y/o
un complejo de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación
13, para la preparación de una composición inmunógena para la
inmunoterapia contra el cáncer.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15,
en el que dicha composición está destinada para la inmunoterapia de
tumores que expresan al menos un antígeno que se selecciona a partir
del grupo formado por la familia MAGE-A, la familia
HER y TERT.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15
o la reivindicación 16, en el que dicha composición está destinada a
tratar individuos con HLA-A*0201.
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