ES2338687T3 - Procedimientos para purificar proteinas altamente anionicas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona, que comprende las etapas de: (a) purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones; (b) cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y (c) lavar la columna, donde el paso de carga (b) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.

Description

Procedimientos para purificar proteínas altamente aniónicas.

Antecedentes de la invención

La purificación de proteínas se ve a menudo obstaculizada por una escasa retirada del ADN debido a las interacciones entre las proteínas y el ADN. Las interacciones entre las proteínas y el ADN son más problemáticas en la purificación de proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo proteínas sulfatadas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para aislar y purificar proteínas diana altamente aniónicas y proteínas diana que comprenden campos de inmunoglobulinas, por ejemplo, proteínas sulfatadas. Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa. Las proteínas sulfatadas son proteínas en las cuales la carga negativa neta se debe a al menos cerca de un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína sulfatada se refiere a la sustitución de al menos un grupo de hidroxilo (-OH) con -SO_{4}H en o entre el aminoácido o aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. En una realización preferida, la proteína sulfatada tiene al menos cerca de un (1) grupo sulfato. Los procedimientos de esta invención abarcan igualmente las proteínas sulfatadas que contienen al menos cerca de dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más grupos sulfato, por ejemplo, seis grupos sulfato en las tirosinas de N-terminales tal como se indica en PSGL-1 (Ligando-1 de las Glucoproteínas de la Selectina-P).

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para purificar proteínas diana altamente aniónicas que comprende los pasos de la cromatografía de intercambio de iones en condiciones apropiadas para la purificación de proteínas diana. Por ejemplo, este procedimiento permite (1) poner en contacto la muestra con un substrato que pueda fijar reversiblemente moléculas cargadas, con lo que las proteínas diana se fijan al substrato, (2) lavar el substrato con una primera solución de lavado en condiciones apropiadas, con lo que una serie de impurezas proteínicas y no proteínicas en la muestra bien no se fijan o bien se lavan del substrato mientras las proteínas diana altamente aniónicas continúan fijadas, (3) eluir la muestra con una primera solución de elución donde la primera solución de elución comprende una solución salina a una concentración altamente molar, y (4) recoger la muestra eluída que contiene proteínas diana aniónicas purificadas.

En una realización, el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 4,0 a 6,0. En otra realización, el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 6,5.

En una realización preferida, la proteína diana altamente aniónica es una proteína sulfatada y las impurezas incluyen una forma sulfatada de la proteína diana.

En otro aspecto, se purifica adicionalmente la muestra eluída, procedente de la purificación mediante cromatografía de intercambio de iones, que contiene las proteínas diana purificadas. Esta purificación adicional comprende el paso de la cromatografía de quelato metálico en condiciones apropiadas para la purificación de proteínas diana altamente aniónicas. Dicha purificación adicional permite los pasos de (1) pasar la muestra eluída que contiene las proteínas diana a través de una columna de cromatografía de quelato metálico, con lo que la muestra eluída es capturada en la columna, (2) lavar la columna con una segunda solución de lavado bajo condiciones apropiadas, con lo que se disocian los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra, (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas.

En condiciones cromatográficas de quelación del hierro, por ejemplo, la segunda solución de lavado comprende una concentración de sal de aproximadamente 2M, y la segunda solución de elución comprende una concentración de sal de aproximadamente 200 mM a 1M. Como variante, en condiciones de cromatografía de quelato de hierro, la segunda solución de lavado comprende MES a aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 2M, e imidazol a aproximadamente 5 mM, y la segunda solución de elución comprende una solución de MES de aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 1M e imidazol a aproximadamente 35 mM.

En otro aspecto, las proteínas diana tienen al menos cerca de una (1) sulfatación o sulfataciones. La presente invención también abarca las proteínas diana aniónicas que tienen al menos cerca de dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones, por ejemplo proteínas PSGL-1. Las proteínas aniónicas capaces de ser purificadas según la presente invención pueden ser proteínas naturales o bien recombinantes.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la purificación de proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas (por ejemplo un campo de immunoglobulinas Fc), tal como una proteína de fusión PSGL-1. Este procedimiento comprende los pasos de (1) poner en contacto la muestra con un substrato que puede fijar la parte Fc de la proteína diana que comprende un campo de inmunoglobulinas, con lo que las moléculas diana se fijan al substrato, (2) lavar el substrato con una primera solución de lavado en condiciones apropiadas para lavar los contaminantes contenidos en la muestra, (3) eluir la muestra con una primera solución de elución, donde el pH de la primera solución de elución es bajo, por ejemplo cerca de 4,0, y (4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas.

En otra realización, se purifica adicionalmente la muestra eluída procedente del substrato de fijación del Fc, que contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas. Por ejemplo, la purificación adicional comprende los pasos de (1) poner en contacto la muestra eluída que contiene las proteínas diana aniónicas purificadas que comprenden un campo de immunoglobulinas con un substrato que puede fijar reversiblemente moléculas cargadas con lo que una serie de impurezas proteínicas y no proteínicas en la muestra o bien no se fijan o bien se lavan del substrato mientras que las proteínas diana continúan fijadas al substrato, (2) lavar el substrato con una segunda solución de lavado donde el pH de la segunda solución de lavado es bajo, por ejemplo de aproximadamente 4,0, (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas.

En un aspecto, las proteínas diana que comprenden un campo de immunoglobulinas tienen al menos una (1) sulfatación o sulfataciones. La presente invención también abarca a las immunoglobulinas que comprenden proteínas con al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones, por ejemplo proteínas PSGL-Ig.

En una realización preferida, los procedimientos de purificación de la invención proporcionan proteínas diana purificadas altamente aniónicas y proteínas purificadas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas (por ejemplo PSGL-Ig) con una pureza mínima del 99,9% aproximadamente de proteínas contaminadas.

En otra realización, los procedimientos de purificación de la invención retiran al menos un 95% o 2,5 log_{10} aproximadamente de valor de retirada (LRV) del ADN contaminante de las proteínas diana altamente aniónicas y de las proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1-3 ilustran los procedimientos de purificación descritos en la presente, por ejemplo los procesos I-III, tal como se describen en los Ejemplos.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos procedimientos para purificar proteínas diana altamente aniónicas y proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas, por ejemplo, proteínas sulfatadas (tal como la PSGL-1). Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa. Las proteínas sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la carga negativa se debe a al menos una, o más preferentemente, cinco (5) o más sulfataciones, por ejemplo al menos aproximadamente seis (6) sulfataciones. Las sulfataciones en una proteína diana se refieren a la sustitución de al menos un grupo de hidroxilo (-OH) con SO_{4}H en o entre el aminoácido o aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. Las sulfataciones pueden ocurrir, por ejemplo, en las tirosinas N-terminales incorporadas en la PSGL-1.

En una realización preferida, la proteína sulfatada es PSGL-1, por ejemplo, PSGL-1 que comprende el aminoácido expuesto en la Patente de los EE.UU. número 5.827.817, cuyos contenidos se incorporan a la presente mediante referencia, o una parte activa del mismo. La secuencia completa de aminoácidos de la proteína PSGL-1 (es decir el péptido maduro más la secuencia inicial), se caracteriza por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Patente de los EE.UU. número 5.827.817 desde el aminoácido 1 al aminoácido 402, indicada aquí como SEQ ID NO:1. El análisis de la hidrofobicidad y la comparación con modelos conocidos de escisión predicen una secuencia de señal de 10 a 22 aminoácidos, es decir los aminoácidos 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 del PSGL-1. La PSGL-1 contiene un lugar de escisión (-Arg-Asp-Arg-Arg-) de la PACE (Enzima de Conversión de Aminoácidos Básicos Apareados) en los residuos de aminoácidos 38-41. La proteína madura de la PSGL-1 se caracteriza por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:1 desde el aminoácido 42 hasta el aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína ligando de la selectina-P se caracteriza por los aminoácidos 21 a 310 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Patente de los EE.UU. número 5.827.817. Otra forma soluble de la proteína madura PSGL-1 se caracteriza por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Patente de los EE.UU. número 5.827.817 del aminoácido 42 al aminoácido 310. La forma soluble de la proteína ligando de la selectina-P se caracteriza también por ser soluble en una solución acuosa a temperatura ambiente.

Las proteínas de fusión de la PSGL-1 (por ejemplo PSGL-Ig) pueden obtenerse de acuerdo con las enseñanzas de la Patente de los EE.UU. número 5.827.817.

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La PSGL-1 es una glucoproteína que puede contener uno o más de los siguientes carbohidratos terminales:

1

en donde R representa el resto de la cadena de carbohidratos, que va acoplada de manera covalente directamente a la proteína ligando de la selectina-P o a una mitad lípidica que va fijada de manera covalente a la proteína ligando de la selectina-P. La PSGL-1 podría además ser sulfatada o modificada de otro modo después de la traslación. Como se expresa en las células COS y CHO, la proteína ligando de la selectina-P de longitud total es una proteína homodimérica que tiene un peso molecular aparente de 220 kD tal como se observa por medio de la electroforesis no reductora del gel de SDS-poliacrilamida.

La estructura de la PSGL-1 de longitud total incluye un campo extracelular (del aminoácido 21 al 310 aproximadamente), un campo de transmembrana (del aminoácido 311 al 332 aproximadamente), y un campo citoplásmico intracelular (del aminoácido 333 al 402 aproximadamente). El campo extracelular contiene tres lugares de tripéptidos de consenso (Ans-X-Ser/Thr) de glucosilación fijada a N potencial que comienza en los residuos de Asn 65, 111 y 292. El campo extracelular contiene también tres posibles lugares de sulfatación de la tirosina en los residuos 46, 48 y 51. La región comprendida por los residuos 55-267 contiene un alto porcentaje de prolina, serina y treonina, incluido un subcampo de quince repeticiones decaméricas de la secuencia de consenso de diez aminoácidos Ala-Thr/Met-Glu-Ala-Gln-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr, en donde X puede ser Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Las regiones de este tipo son características de proteínas altamente glucosiladas O.

Pueden realizarse supresiones sustanciales de la secuencia PSGL-1 conservando a su vez la actividad de la proteína ligando de la selectina-P. Por ejemplo, la PSGL-1 que comprende la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 189, la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 118, o la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 89 de la SEQ ID NO:1 conservan cada una de ellas la actividad de fijación de proteína de la selectina-P y la capacidad de fijar la selectina-E. Las proteínas PSGL-1 en las que uno o más lugares de glucosilación vinculados a N (en los aminoácidos 65, 111 y 292) se han cambiado por otros aminoácidos o han sido eliminados, conservan también la actividad de fijación de la proteína de la selectina-P y la capacidad para fijar la selectina-E. Las proteínas ligando de la selectina-P comprendidas del aminoácido 42 al aminoácido 60 (que incluye una región altamente aniónica de la proteína del aminoácido 45 al aminoácido 58) también conservan la actividad de proteína ligando de la selectina-P; no obstante, las proteínas ligando de la selectina-P limitadas a dicha secuencia no se fijan en la selectina-E. Una proteína ligando de la selectina-P conserva preferentemente al menos uno (más preferentemente al menos dos y más preferentemente los tres) de los residuos de tirosina encontrados en los aminoácidos 46, 48 y 51, cuya sulfatación puede contribuir a la actividad de la proteína ligando de la selectina-P.

La presente invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos siguientes que no deberán interpretarse como limitativos en modo alguno. Todas las referencias a la secuencia de aminoácidos de la PSGL-1 se basan en la secuencia de aminoácidos de la PSGL que aparece en la Patente de los EE.UU número 5.827.817 y que se expone aquí como SEQ ID NO:1.

Ejemplos

Procedimientos: Los procedimientos generales para la purificación de proteínas se encuentran en Janson, J.C. y L. Ryden (eds.) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications (Purificación de Proteínas: Principios, Procedimientos de Alta Resolución y Aplicaciones). VCH Publishers, Inc. Nueva York (1989), Patente de los EE.UU, número 5.429.746, titulada Antibody Purification (Purificación de Anticuerpos) y la Patente de los EE.UU. número 5.115.101 titulada Renoval of Protein from Antibody Preparations (Retirada de las Proteínas de las Preparaciones de Anticuerpos).

Ejemplo 1 Purificación de la proteína de fusión PSGL-Ig recombinante - Proceso I

(No incluida en la invención)

El presente ejemplo describe la purificación de una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante la cromatografía de columna (Figura 1).

Una proteína ligando de la selectina-P soluble se expresó en las células CHO y se recolectaron los medios condicionados para la purificación de la proteína. Se preparó una columna A Q Sepharose^{TM} Fast Flow (Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm, según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna para la PSGL en los medios condicionado es aproximadamente 1 mg PSGL/ml de resina.

Se efectuó la cromatografía de intercambio de aniones del modo siguiente. Los medios microfiltrados acondicionados con CHO se cargaron en la columna a un pH de aproximadamente 7, y a una conductividad por debajo de 20 mS/cm. La columna se lavó con histidina 20 mM, NaCl 400 mM, con un pH de 6,5 para retirar la rPSGL-Ig hiposulfatada, por ejemplo, con 4 sulfataciones o menos. Los pasos de carga y lavado se efectuaron a 3,5 cm/minuto. La columna se eluyó a un pH de 6,5 con NaCl 1M, histidina 20 mM, con un pH de 6,5, a <1,1 cm/minuto. El pH de este paso podría estar entre 4 y 8, pero es preferentemente 6,5. El pico eluído contiene PSGL-Ig, ADN e histonas, así como otros contaminantes. La columna Q fija el ADN, y las histonas se fijan al ADN. La elución de PSGL (provocada por la elevación de la concentración de sal) coincide con la elución del ADN. La pureza del PSGL-Ig es >80%. En este paso se retira únicamente un 50% del ADN.

En estas condiciones, se purifican preferentemente las moléculas rPSGL-Ig hipersulfatadas, por ejemplo con cinco o seis sulfataciones. La rPSGL-Ig activa tiene idealmente cinco o seis sulfataciones en las tirosinas N-terminales.

El eluente de la columna de intercambio de aniones se purificó posteriormente utilizándose una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) del modo siguiente:

Se preparó una columna Phenyl Toyopearl 650C (Rohm and Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna de HIC es aproximadamente 3,5 mg PSGL/mL de resina. La columna se equilibró en sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM, a un pH de 7,4 a \leq 1,3 cm/minuto. El eluente de la columna de Sefarosa Q se ajustó a sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM, a un pH de 7,4, añadiendo sulfato amónico 3M, Tris 50 mM, a un pH de 7,4 y se cargó en la HIC. Como variante, la carga pudo realizarse en NaCl 4M en lugar de sulfato amónico 1,2M. La columna se lavó con sulfato amónico 1,2M. Tris 20 mM, con un pH de 7,4. Tanto los pasos de carga como de lavado se realizaron a una velocidad de aproximadamente 1,3 cm/minuto. La columna HIC se eluyó con sulfato amónico 0,48M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4 a 0,65 cm/minuto. En estas condiciones, la columna de HIC retira principalmente las histonas H2A y H2B que no fijan el ADN tan firmemente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2 aparecen en la fracción de lavado, y el pico contiene histonas H3 y H4, y algunas histonas H2. Además, una gran variedad del ADN permanece en las histonas y se eluye en el pico. El producto tiene una pureza del >95% de proteínas contaminadas, y se ha retirado el 85% del ADN mediante este paso.

El eluente de la columna HIC se purificó posteriormente utilizándose una columna de cromatografía de quelato metálico (IMAC) del modo siguiente.

Se preparó una columna IMAC Copper (II) en Fractogel Chelate (M) (E. Merck) según las instrucciones del fabricante. La columna IMAC tenía una profundidad de lecho de 6,4-7,2 cm, y una capacidad de aproximadamente 6,6 mg PSGL/ml de resina.

La columna se equilibró con fosfato de potasio (KPO4) 50 mM, NaCl 2,0M, imidazol 2 mM, con un pH de 7 para 5 cv a \leq5 cm/minuto. El eluente de la columna de HIC se ajustó a imidazol 2 mM, 50 mM KPO_{4}, con un pH de 7, NaCl 200 mM y se cargó en la columna de IMAC. La columna se lavó en primer lugar con tampón de equilibración, y después se lavó con MES 40 mM, NaCl 1M, imidazol 5 mM, con un pH de 6,6 a \leq5 cm/minuto. Esta baja concentración de sal no rompe el complejo histona/ADN en la columna IMAC. La columna se eluyó con MES 40 mM, NaCl 1M, imidazol 35 mM, con un pH de 6,6. La columna de IMAC retira principalmente las histonas H3 y H4. Las histonas H3 y H4 y algunas H2 se encuentran en la tira, aunque algunas histonas H3 y H2 se encuentran en el pico de la IMAC. El producto resultante tiene una pureza de >99,9% de proteínas contaminantes, y este paso retira el 95% del ADN. En total, existe una eliminación de aproximadamente un 2,5 LRV del ADN de todo este proceso.

Este proceso permitió que el ADN se transportara a través de toda la secuencia del proceso, dado que el ADN se fijó directamente a la columna Q. En el paso Q, el ADN también se fijó a las histonas (por ejemplo H2A, H2B, H3 y H4) que son proteínas fijadoras del ADN que aparecen naturalmente, las cuales están presentes en nuestra carga a la columna Q. En consecuencia, en la columna Q había un sándwich, en el cual el ADN se fijó a la columna Q y las histonas se fijaron al ADN. En los pasos posteriores se invirtió el sándwich, dado que el ADN no se fija a la columna de HIC o de IMAC directamente. En lugar de ello, las histonas se fijaron a la columna de HIC o de IMAC, y el ADN se fijó a las histonas. Cuando las histonas se eluyen desde la HIC o la IMAC, transportan con ellas la contaminación de ADN. En la purificación de proteínas puede encontrarse a menudo una escasa retirada del ADN debido a las interacciones ADN/proteína, especialmente en el caso de proteínas diana altamente aniónicas, y especialmente cuando estas proteínas aniónicas se eluyen desde una columna de intercambio de aniones.

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Ejemplo 2 Purificación de proteínas de fusión PSGL-Ig recombinantes - Proceso II

Este ejemplo describe la purificación de una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante cromatografía de columna, incluido el paso de disociar los complejos de histona/ADN contaminantes, con sal o un alcohol, aumentando así la pureza de las proteínas PSGL-Ig (Figura 2).

Se efectuó un paso de cromatografía de intercambio de aniones en la Sefarosa Q tal como se describe en el Ejemplo 1.

El eluente procedente de la columna de intercambio de aniones se purificó posteriormente utilizándose una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) del modo siguiente. Se preparó una columna Phenyl Toyopearl 650C (Rohm and Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm, según las instrucciones del fabricante, y se equilibró en sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4. El pH se este paso podría estar entre 6-8, pero es preferentemente un pH de 7,4.

Se ajustó el pico Q a sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4, añadiéndose sulfato amónico 3M, Tris 50 mM, con un pH de 7,4, y se cargó en la columna. Como variante, la carga pudo realizarse en NaCl 4M en lugar de sulfato amónico 1,2M. La columna se lavó con Sulfato Amónico 1,2M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4, seguido por el lavado con NaCl 4M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4. El lavado con NaCl 4M retira el 90% (o retirada de 1 Log_{10} o 1 LRV) del ADN de la columna. Como variante, podría efectuarse el lavado con isopropanol al 5% y Sulfato Amónico 1,2M. Esto retira el 99,9% del ADN de la columna ("retirada de 3 log_{10}", o 3 LRV). Como variante, podría efectuarse el lavado con etanol al 5% y Sulfato Amónico 1,2 M. Esto retira el 99,9% del ADN de la columna ("retirada de 3 log_{10}", o 3 LRV). Como variante, podría efectuarse el lavado con etanol al 5% y NaCl 4M. Esto retira el 99,9% del ADN de la columna ("retirada de 3 log_{10}", o 3 LRV). Como variante, podría efectuarse el lavado con isopropanol al 5% y NaCl 4M. Esto retira el 99,9% del ADN de la columna ("retirada de 3 log_{10}", o 3 LRV). Los pasos de carga y lavado se efectuaron a una velocidad de aproximadamente 1,3 cm/minuto. La columna se eluyó a continuación con Sulfato Amónico 0,48M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4, a una velocidad de 0,65 cm/minuto.

Como anteriormente, esta HIC con estas condiciones retira principalmente las histonas H2A y H2B, que no fijan el ADN tan firmemente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2 aparecen en el lavado. El pico contiene H3 y H4, con algunas histonas H2. Sin embargo, hemos observado que mediante el lavado con concentraciones más elevadas de sal, puede romperse la interacción entre el ADN y las histonas. Así pues, efectuándose el lavado con, por ejemplo, NaCl 4M, en lugar de Sulfato Amónico 1,2M, el ADN se desprende de la histona, y pasa al líquido de lavado. En estas condiciones, una amplia variedad del ADN aparece en el lavado, y las histonas siguen eluyéndose en el pico. Este paso de la HIC podría realizarse como variante después del paso de la IMAC (véase a continuación). Esto podría tener como resultado la retirada de un 999,% más del ADN (3 LRV).

El eluente de la columna de HIC se purificó posteriormente utilizándose una columna de cromatografía de quelato metálico (IMAC) del modo siguiente.

Se preparó una columna IMAC Copper (II) en Fractogel Chelate (M) (E. Merck) según las instrucciones del fabricante. La columna IMAC tenía una profundidad de lecho de 6,4-7,2 cm, y una capacidad de aproximadamente 6,6 mg PSGL/ml de resina. El pH de esta columna puede estar entre 4,8 y 8, pero es preferentemente un pH de 6,6.

La columna se equilibró con fosfato de potasio (KPO4) 50 mM, NaCl 2,0M, imidazol 2 mM, con un pH de 7 para 5 cv a \leq5 cm/minuto. Como variante, la columna puede equilibrarse a NaCl 200 mM en lugar de NaCl 2M. El eluente de la columna de la HIC se ajustó a imidazol 2 mM, KPO4 50 mM, con un pH de 7, NaCl 200 mM y se cargó en la columna de IMAC. Como variante, la columna puede efectuarse a NaCl 200 mM en lugar de NaCl 2M.

La columna se lavó en primer lugar con un tampón de equilibración, y después se lavó con MES 40 mM, NaCl 2M, imidazol 5 mM, con un pH de 6,6 a \leq5 cm/minuto. La comuna se eluyó con MES 40 mM, NaCl 1M, imidazol 35 mM, con un pH de 6,6. La columna de IMAC retira principalmente las histonas H3 y H4. Estas histonas, y algunas histonas H2, están en la tira. En el pico de la IMAC se encuentran también algunas histonas H3 y H2.

Este paso retira un 90% más de ADN que el paso I del proceso del Ejemplo 1 (1 LRV) utilizando la carga o el lavado con elevado contenido de sal. La novedad de este paso es efectuar la carga con NaCl 2M o el lavado con NaCl 2M para retirar el ADN del complejo histonas/ADN. Las histonas se pegan a la columna de la IMAC, y el ADN se pega a las histonas. Dado que el ADN se fija mejor al complejo H3/H4 que al complejo H3/H2 o simplemente al complejo H2, sería beneficioso retirar el complejo H3/H4 tan pronto como sea posible en el proceso. Así pues, al efectuar la HIC después de la IMAC se ha demostrado que puede obtenerse más eliminación de ADN (99,9% más de eliminación, o 3 LRV). En consecuencia, la colocación de la IMAC lo antes posible en el proceso podría tener como resultado claramente una reducción adicional del ADN. Sin embargo, la IMAC como primer paso requeriría una ultrafiltración/diafiltración para retirar de la carga los aminoácidos de peso molecular bajo y otros grupos que contienen aminas.

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Ejemplo 3 Purificación de proteínas de fusión PSGL-Ig recombinantes - Proceso III

(No incluida en la invención)

Este ejemplo describe un procedimiento alternativo para la purificación de una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante la cromatografía de columna. En contraste con el esquema de purificación descrito en el Ejemplo 1, este proceso utiliza un paso de afinidad como el primer paso de purificación (Figura 3). El paso de purificación de afinidad utiliza la Proteína A que fija la parte Fc de la quimera rPSGL-Ig. La rPSGL-Ig se eluye de la columna de Proteína A a un pH bajo, en este caso un pH de 3,7. El paso de la Proteína A da una mejor eliminación si la columna se lava con NaCl 1M después de la carga. Esta concentración de sal es mayor que la que se utiliza habitualmente (normalmente cerca de NaCl 150 mM) y, en consecuencia, es novedosa. La eliminación del ADN desde este paso va de un valor de retirada (LRV) de 4 log_{10} a un LRV de 6, con la adición de este paso de sal. Esto representa un aumento de 100 veces en la retirada del ADN.

El paso de la Proteína A parece no fijar las histonas, y proporciona una buena eliminación del ADN. Así, las histonas no están visiblemente presentes en los pasos siguientes al paso de la Proteína A. Sin embargo, dado que la Proteína A se lixivia de la columna de la Proteína A, se efectúan los pasos posteriores para retirar la Proteína A. El procedimiento más novedoso para retirar la Proteína A lixiviada es el de cargar el eluado de Proteína A directamente sobre la columna Q, a un pH neutro o incluso bajo, o el de lavar la columna Q a un pH bajo. Las columnas Q no se procesan normalmente a un pH bajo, especialmente a un pH de 4. Así pues, la captura de la rPSGL-Ig directamente del eluado de Proteína A o el lavado de la columna Q a un pH bajo, o una combinación de los mismos, es una novedad. Dado que la rPSGL-Ig y la Proteína A tienen un pH bajo, una amplia variedad de la rPSGL-Ig no se fija a la Proteína A lixiviada. Como resultado de ello, la Proteína A no se fija a la columna Q, sino que se encuentra en el flujo que pasa por Q. Esto es también una novedad. De ese modo, la columna Q se utiliza para retirar la Proteína A.

Se preparó una columna Fast Flow (Amersham Pharmacia) de la Proteína A con una profundidad de lecho de 6-10 cm, según las instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna es aproximadamente 1 mg/ml a 6 mg/mL. La columna se equilibró con Tris 20 mM, NaCl 200 mM, con un pH de 7,4, a aproximadamente 30-300 cm/hora, preferentemente 150 cm/hora. La columna se lavó con histidina 20 mM, NaCl 200 mM, con un pH de 7 a 8, preferentemente un pH de 7,4, y se eluyó con citrato 200 mM, con un pH de 3 a 4, preferentemente un pH de 3,7, a 50-300 cm/hora. La pureza es >95% para las proteínas y mediante este paso se ha retirado >99% del ADN.

El eluente de la columna de Proteína A se purificó adicionalmente con una columna Q Sepharose^{TM} Fast Flow (Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm. La capacidad de la columna de Sefarosa Q para la PSGL, a un pH de 3,6 a 4,0, preferentemente un pH de 3,7, después del paso de la Proteína A, es aproximadamente \geq6 mg PSGL/mL de resina.

El pico de Proteína A se carga directamente en la columna de Sefarosa Q sin ajustar el pH, o bien se neutraliza el pico antes de ser cargado en la columna de Sefarosa Q. En cualquiera de ambos casos, la columna se lava con NaCl 200 mM y citrato 20 mM a un pH de 3,5 a 4, preferentemente un pH de 3,7, para retirar los restos de Proteína A. Ambos procedimientos retiran la Proteína A lixiviada, la rPSGL-Ig hiposulfatada, la rPSGL-Ig recortada N-terminalmente, y la prorPSGL-Ig (una especie precursora de la rPSGL-Ig que no tiene escisión enzimática del término N. Después del lavado a un pH de 3,5 a 4, la columna podría lavarse con histidina 20 mM, NaCl 400 mM, a un pH de 6,5, a fin de retirar la rPSGL-Ig hiposulfatada. Las moléculas rPSGL-Ig hiposulfatadas tienen 4 o menos sulfataciones, mientras que la rPSGL-Ig activa tiene idealmente 5 o 6 sulfataciones en las tirosinas N-terminales. Los pasos de carga y lavado de la columna se efectúan a una velocidad de 3,5 cm/minuto. La columna se eluyó a un pH de 6,5 con NaCl 1M, histidina 20 mM, a un pH de 6,5. Como variante, podría efectuarse la elución a un pH de 3,5 a 4,0, preferentemente 3,7, en NaCl 500 mM, citrato 20 mM a <1,1 cm/minuto. Las proteínas representan el <2% del pico.

Referencias citadas en la memoria descriptiva

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es para comodidad del lector solamente. No forma parte del documento de la patente europea. Aun cuando se tuvo gran cuidado en cumplir las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la memoria descriptiva

\bullet US 5827817 A [0017][0018][0022]

\bullet US 5115101 A [0023]

\bullet US 5429746 A [0023]

\bullet US 60193351 B [0049]

<110> Genetics Institute, Inc,

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<120> PROCEDIMIENTOS PARA PURIFICAR PROTEÍNAS ALTAMENTE ANIÓNICAS

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<130> GFN-002PC

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<140>

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<141>

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<150> US 60/193.351

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<151> 2000-03-27

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<160> 1

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<171> Patentin Ver, 2.0

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<210> 1

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<211> 402

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

2

3

4

Claims (4)

1. Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona, que comprende las etapas de:

(a)

purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones;

(b)

cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y

(c)

lavar la columna,

donde el paso de carga (b) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.

2. Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona, que comprende las etapas de:

(a)

purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones;

(b)

cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y

(c)

lavar la columna,

donde el paso de carga (c) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2 donde la proteína es hipersulfatada.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 donde la proteína es PSGL-1.