ES2344793T3

ES2344793T3 - Antagonistas anti-cmet humanizados.

Info

Publication number: ES2344793T3
Application number: ES05804027T
Authority: ES
Inventors: Mark S. Dennis; Karen Billeci; Judy Young; Zhong Zheng
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2010-09-07
Anticipated expiration: 2025-08-04
Also published as: IL214325A; EP1773885A2; MX2007001470A; IL245462A0; ME01803B; SI1773885T1; AU2005267720B2; HK1177938A1; CN102942631A; ZA200701656B; RU2398777C2; JP5068651B2; HK1100779A1; CN104804095A; CA2575402A1; IL180588A0; US20120082663A1; KR101397851B1; US20060134104A1; US7476724B2

Abstract

Forma humanizada de un anticuerpo anti-c-met murino que comprende: (a) por lo menos una secuencia HVR seleccionada del grupo que consiste en: (i)HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A17, donde A1-A17 es KSSQSLLYTSSQKNYLA, (ii)HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es WASTRES, (iii)HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQYYAYPWT, (iv)HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde D1-D10 es GYTFTSYWLH, y (v)HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde E1-E18 es GMIDPSNSOTRFNPNFKD; y (b) una variante HVR-H3 que comprende la secuencia TYRSYVTPLDY, SYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, SYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY o TYSSYVTALDY donde la afinidad monovalente de dicho anticuerpo a c-met humana es mayor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de cadena ligera mostrada en la SEC ID NO: 9 y una secuencia variable de cadena pesada mostrada en la SEC ID NO: 10 y donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular dependiente de c-met mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostrada en las SEC ID NO:9 y 10 respectivamente.

Description

Antagonistas anti-c-met humanizados.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular y la regulación de los factores de crecimiento. Más específicamente, la presente invención se refiere a moduladores del mecanismo de señalización HGF/c-met y usos de dichos moduladores.

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Antecedentes

HGF es un factor pleiotrófico derivado del mesénquima con actividades mitogénica, motogénica y morfogénica en un conjunto de tipos de células diferentes. Los efectos del HGF están mediados por una tirosina quinasa específica, c-met, y a expresión aberrante de HGF y c-met se observa frecuentemente en un conjunto de tumores. Véase, por ejemplo, Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867. La regulación del mecanismo de señalización HGF/c-Met está implicada en la progresión de tumores y metástasis. Véase, por ejemplo, Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300).

El HGF se une al dominio extracelular del receptor tirosina quinasa (RTK) de Met y regula diversos procesos biológicos, tal como la dispersión, proliferación y supervivencia celular. La señalización HGF-Met es esencial para el desarrollo embrionario normal especialmente en la migración de células progenitoras musculares y el desarrollo del hígado y el sistema nervioso (Bladt et al., 1995; Hamanoue et al., 1996; Maina et al., 1996; Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). Los fenotipos del desarrollo de ratones exentos de Met y HGF son muy similares, lo que sugiere que HGF es el ligando afín para el receptor de Met (Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). HGF-Met juega también un papel en la regeneración del hígado, angiogénesis y curación de heridas (Bussolino et al., 1992; Matsumoto y Nakamura, 1993; Nusrat et al., 1994). El receptor de Met precursor experimenta una separación proteolítica en una subunidad \alpha extracelular y una subunidad \beta que comprende la membrana unidos por enlaces disulfuro (Tempest et al., 1988). La subunidad \beta contiene el dominio quinasa del citoplasma y alberga un sitio de interacción para múltiples sustratos en el extremo C-terminal donde proteínas adaptadoras se unen e inician la señalización (Bardelli et al., 1997; Nguyen et al., 1997; Pelicci et al., 1995; Ponzetto et al., 1994; Weidner et al., 1996). Tras la unión a HFG, la activación de Met conduce a la fosforilación de tirosina y la señalización cascada abajo a través de la activación de PI3-quinasa y ras/MAPK mediada por Gab1 y Grb2/Sos, respectivamente, lo cual conduce a la motilidad y proliferación celular (Furge et al., 2000; Hartmann et al., 1994; Ponzetto et al., 1996; Royal and Park, 1995).

Se observó que Met era transformante en una línea celular de osteosarcoma tratada con carcinógeno (Cooper et al., 1984; Park et al., 1986). Se ha observado la sobreexpresión o amplificación génica de Met en un conjunto de cánceres humanos. Por ejemplo, la proteína Met se sobreexpresa por lo menos 5 veces en cánceres colorrectales y se describe que se amplifica génicamente en la metástasis de hígado (Di Renzo et al., 1995; Liu et al., 1992). También se describe que la proteína Met se sobreexpresa en el carcinoma de célula escamosa oral, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales, carcinoma de mama, y carcinoma de pulmón (Jin et al., 1997; Morello et al., 2001; Natali et al., 1996; Olivero et al., 1996; Suzuki et al., 1994). Además, se ha observado la sobreexpresión de ARNm en carcinoma hepatocelular, carcinoma gástrico, y carcinoma colorrectal (Boix et al., 1994; Kuniyasu et al., 1993; Liu et al., 1992).

Se han encontrado un conjunto de mutaciones en el dominio quinasa de Met en carcinoma papilar renal que conduce a la activación constitutiva del receptor (Olivero et al., 1999; Schmidt et al., 1997; Schmidt et al., 1999). Estas mutaciones activantes confieren una fosforilación de tirosina de Met constitutiva y dan lugar a la activación de MAPK, la formación de focos y la tumorigénesis (Jeffers et al., 1997). Además, estas mutaciones aumentan la motilidad y la invasión celular (Giordano et al., 2000; Lorenzato et al., 2002). La activación de Met dependiente de HGF en células transformadas media en e aumento de la motilidad. La dispersión y la migración que finalmente conducen al crecimiento del tumor invasivo y la metástasis. (Jeffers et al., 1996; Meiners et al., 1998).

Se ha observado que Met interacciona con otras proteínas que impulsan al activación, transformación e invasión del receptor. En células neoplásicas, se describe que Met interacciona con la integrina \alpha6\beta4, un receptor para componentes de la matriz extracelular (ECM), tales como lamininas, para inducir el crecimiento invasivo dependiente de HGF (Trusolino et al., 2001). Además, se ha observado que el dominio extracelular de Met interacciona con un miembro de la familia de las semaforinas, plexina B1, y aumenta el crecimiento invasivo (Giordano et al., 2002). Además, también se describe que CD44v6, que se ha implicado en la tumorigénesis y metástasis, forma un complejo con Met y HGF y da lugar a la activación del receptor de Met (Orian-Rousseau et al., 2002).

Met es un miembro de a subfamilia de RTKs que incluyen Ron y Sea (Maulik et al., 2002). La predicción de la estructura del dominio extracelular de Met sugiere una homología compartida con las semaforinas y plexinas. El extremo N-terminal de Met contiene un dominio Sema de aproximadamente 500 aminoácidos que se conserva en todas las semaforinas y plexinas. Las semaforinas y plexinas pertenecen a una gran familia de proteínas secretadas y unidas a membrana descritas por primera vez por su papel en el desarrollo neuronal (Van Vactor and Lorenz, 1999). Sin embargo, más recientemente se ha correlacionado la sobreexpresión de semaforinas con la invasión tumoral y la metástasis. Un dominio PSI rico en cisteína (también referido como dominio de la Secuencia Relacionada con Met) hallado en plexinas, semaforinas e integrinas se encuentra adyacente al dominio Sema seguido de cuatro repeticiones IPT que son regiones de tipo inmunoglobulina halladas en plexinas y factores de transcripción. Un estudio reciente sugiere que el dominio Sema de Met es suficiente para la unión de HGF y heparina (Gherardi et al., 2003). Además, Kong-Beltran et al. (Cancer Cell (2004), 6:61-73) han descrito que el dominio Sema de Met es necesario para la dimerización y activación del receptor.

Se han descrito numerosas moléculas dirigidas al mecanismo HGF/c-met. Estas moléculas incluyen anticuerpos, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,686,292. También se ha observado que una parte del dominio extracelular de c-met es capaz de producir efectos antagonísticos contra el mecanismo HGF/c-met. En vista del importante papel que este mecanismo juega en la etiología de diversas condiciones patológicas, sin embargo, está claro que aún existe la necesidad de agentes que tienen características clínicas que son óptimas para el desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descrita aquí cumple esta necesidad y proporciona otras ventajas.

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Descripción de la invención

La invención está basada en parte en la identificación de un conjunto de antagonistas del mecanismo biológico HGF/c-met, que es un proceso biológico/celular que se presenta como una diana terapéutica importante y ventajosa. La presente invención proporciona composiciones y usos médicos tal como se define en las reivindicaciones en base a la interferencia con la activación de HFG/c-met, incluyendo, pero sin limitación, la interferencia con la unión de HGF a la parte extracelular de c-met y la multimerización del receptor. Los antagonistas de la invención, tal como se describen aquí, proporcionan importantes dianas terapéuticas y de diagnóstico para su uso en el reconocimiento de condiciones patológicas asociadas con una señalización anormal o no deseada del mecanismo HGF/c-met. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos y usos médicos tal como se definen en las reivindicaciones, y se refiere a kits y artículos de fabricación, relacionados con la modulación del mecanismo HGF-c-met, incluyendo la modulación de la unión del ligando de c-met, la dimerización de c-met, la activación y otras actividades biológicas/fisiológicas asociadas con la señalización de HGF/c-met.

En un aspecto, la presente invención proporciona agentes terapéuticos anti-HGF/c-met adecuados para el uso terapéutico y capaces de realizar grados diversos de interrupción del mecanismo de señalización HGF/c-met. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado anti-c-met en el que la afinidad monovalente del anticuerpo a c-met humano (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como un fragmento Fab a c-met humano) es mayor, por ejemplo, por lo menos 3, 5, 7, 10 ó 13 veces que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino (por ejemplo, afinidad del anticuerpo murino como fragmento Fab a c-met humano), que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de domino variable de cadena ligera y cadena pesada representada en la figura 7 (SEC ID NO: 9 y 10), tal como se define en las reivindicaciones. Tal como se establece en la técnica, la afinidad de unión de un ligando a su receptor se puede determinar utilizando cualquiera de un conjunto de ensayos y se expresa en términos de una serie de valores cuantitativos. Por consiguiente, en una realización, la afinidad de unión se expresa como valores K_{d} y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). En general y preferiblemente, la afinidad de unión se mide in vitro, tanto en forma libre de células como asociada a las mismas. Tal como se describe aquí con mayor detalle, la diferencia en el número de veces en la afinidad de unión se puede cuantificar en términos de la proporción del valor de afinidad de unión monovalente de un anticuerpo humanizado (por ejemplo, en forma de Fab) y el valor de la afinidad de unión monovalente de un anticuerpo de referencia/comparación (por ejemplo, en forma Fab) (por ejemplo, anticuerpo murino que tiene secuencias de región hipervariable dadora), donde los valores de la afinidad de unión se determinan en condiciones de reacción similares. De este modo, en una realización, la diferencia en número de veces de la afinidad de unión se determina como la proporción de los valores de Kd del anticuerpo humanizado en forma Fab y dicho anticuerpo Fab de referencia/comparación. Por ejemplo, en una realización, si un anticuerpo de la invención (C) tiene una afinidad que es "3 veces superior" que la afinidad de un anticuerpo de referencia (R), entonces si el valor de Kd para C es 1x, el valor de Kd de R sería 3x, y la proporción de Kd de C con respecto a Kd de R sería de 1:3. Cualquier de los ensayos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos aquí, se pueden utilizar para obtener mediciones de la afinidad de unión, incluyendo, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.

En un aspecto, un antagonista de HGF/c-met de la invención comprende un anticuerpo anti-c-met, que comprende:

(a) por lo menos uno, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de región hipervariable (HVR) seleccionadas del grupo que consiste en:

(i): HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A17, donde A1-A17 es KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO: 1)

(ii): HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es WASTRES (SEQ ID NO: 2)

(iii): HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 3)

(iv): HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde D1-D10 es GYTFTSYWLH (SEQ ID NO: 4)

(v): HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde E1-E18 es GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 5) y

(vi): una variante HVR-H3 que comprende la secuencia, tal como se define en la reivindicación 1.

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En una realización, la HVR-L1 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEC ID No. 1. En una realización, la HVR-L3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEC ID NO: 3. El anticuerpo de la invención que comprende estas secuencias (en combinación tal como se describe aquí) está humanizado.

Las HVR variantes en un anticuerpo de la presente invención pueden presentar modificaciones de uno o más residuos en la HVR. En una realización, una variante HVR-L2 comprende una secuencia tal como se define en la reivindicación 1 ó 3. En una realización, una variante HVR-H2 comprende una secuencia tal como se define en la reivindicación 1 ó 4. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo con HVR-H3 variante comprende además HVR-L1. HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 y HVR-H2, donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEC ID NOs: 1, 2, 3, 4 y 5. En algunas realizaciones, estos anticuerpos comprenden además una secuencia del armazón ("framework") consenso de cadena pesada del subgrupo III humano. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia del armazón consenso comprende la sustitución en las posiciones 71, 73 y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una realización de estos anticuerpos, estos anticuerpos comprenden además una secuencia del armazón consenso de cadena ligera \kappaI humana.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende una variante HVR-L2, en el que B6 es V. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo con variante HVR-L2 comprende además HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 variantes, donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEC ID NOs: 1, 3, 4 y 5 y tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, estos anticuerpos comprenden además una secuencia del armazón consenso de cadena pesada del subgrupo III humano. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia del armazón consenso comprende la sustitución en las posiciones 71, 73 y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una realización de estos anticuerpos, estos anticuerpos comprenden además una secuencia del armazón consenso de cadena ligera \kappaI humana.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende una variante HVR-R2 en la que E14 es T, E15 es K y E17 es E. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo con HVR-H2 variante comprende además HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 y HVRH3 variantes, donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEC ID NOs:1, 2, 3, 4 y tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, estos anticuerpos comprenden además una secuencia del armazón ("framework") consenso de cadena pesada del subgrupo III humano. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia del armazón consenso comprende la sustitución en las posiciones 71, 73 y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una realización de estos anticuerpos, estos anticuerpos comprenden además una secuencia del armazón consenso de cadena ligera \kappaI humana.

Un anticuerpo puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias HVR representadas en las figuras 2, 3 y/o 4 (SEC ID NOs: 56-163).

Un agente terapéutico para su uso en un sujeto huésped produce preferiblemente una respuesta inmunogénica pequeña o nula contra el agente en dicho sujeto. Por ejemplo, se describe aquí un anticuerpo humanizado que produce y/o se espera que produzca una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) a un nivel sustancialmente reducido en comparación con un anticuerpo que comprende la secuencia de SEC ID No. 9 y 10 en un sujeto huésped. En otro ejemplo, se describe un anticuerpo humanizado que produce o se espera que produzca una respuesta nula o mínima al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA). En un ejemplo, un anticuerpo produce una respuesta al anticuerpo anti-ratón que está a un nivel clínicamente aceptable o inferior.

Un anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender una o más secuencias de la región no hipervariable (por ejemplo, armazón) consenso humana y/o humana en su dominio variable de cadena pesada y/o ligera. En algunas realizaciones, están presentes una o más modificaciones adicionales en las secuencias de la región no hipervariable consenso humana y/o humana. En una realización, el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia del armazón consenso humano, que en una realización es la secuencia del armazón consenso del subgrupo III. En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende una secuencia del armazón consenso del subgrupo III variante modificada en por lo menos una posición de aminoácido. Por ejemplo, en una realización, una secuencia del armazón consenso del subgrupo III puede comprender una sustitución en una o más posiciones 71, 73 y/o 78. En una realización, dicha sustitución es R71A, N73T y/o N78A en cualquier combinación de las mismas.

Tal como se conoce en la técnica, y tal como se describe con más detalle aquí a continuación, la posición del aminoácido/límite que define la región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y las diversas definiciones conocidas en la técnica (descritas a continuación). Algunas posiciones en un dominio variable se pueden ver como posiciones hipervariables híbridas en que estas posiciones se puede estimar que están en una región hipervariable bajo un conjunto de criterios, mientras que se estima que está fuera de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios diferentes. También se pueden observar una o más de estas posiciones en regiones hipervariables extendidas (tal como se define posteriormente), La presente invención proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables híbridas. Estas posiciones hipervariables híbridas pueden incluir una o más de las posiciones 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 y 102 en un dominio variable de cadena pesada. Estas posiciones hipervariables híbridas pueden incluir una o más de las posiciones 24-29, 35-36, 46-49, 56 y 97 en un dominio variable de cadena ligera. Un anticuerpo puede comprender una secuencia del armazón consenso de subgrupo humano variante modificada en una o más posiciones hipervariables híbridas. Un anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia del armazón consenso del subgrupo III humana variante modificada en una o más de las posiciones 27-28, 30, 33-35, 49, 57-65, 94 y 102. En un ejemplo, el anticuerpo comprende una sustitución F27Y. El anticuerpo puede comprende una sustitución T28N, P, L, S, A o I una sustitución S30I, T o Y, una sustitución S30I, T o Y, una sustitución A33W, una sustitución M34L o M34V, una sustitución S35H, una sustitución T57I, una sustitución Y58R, una sustitución Y59F, una sustitución A60N, una sustitución D61P, T o Q, una sustitución S62N, D, K, T o V, una sustitución V63F o V63L, una sustitución K64E, H, N, D o Q, una sustitución K64E, H, N, D o Q, una sustitución G65D, Y, E o H, una sustitución R94T o R94S, o una sustitución Y102Q, S, H o F. En un ejemplo, un anticuerpo que comprende dicha modificación R94T o R94S comprende además una o más modificaciones en la posición 96 y/o 100. En un ejemplo, dichas modificaciones comprenden una sustitución G96R y/o S100T (es decir, en HVR-H3). Un anticuerpo puede comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia del armazón consenso del subgrupo I kappa humano variante modificada en una o más de las posiciones 24, 25, 29 y 56. En un ejemplo, el anticuerpo comprende una sustitución R24K. El anticuerpo puede comprender una sustitución A25S, una sustitución I29Q o una sustitución S56R, I, M o G.

Un anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia del armazón consenso del subgrupo II humana variante modificada en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todas las posiciones 27-28, 30, 33-35, 49, 57-65, 94 y 102. En un ejemplo, la modificación se selecciona del grupo que consiste en F27Y, T28(N, P, L, S, A o I). S30(I, T o Y), A33W, M34(L,V), S35H, T57I, Y58R, Y59F, A60N, D61(P, T, Q), S62(N, D, K, T,V), V63(F,L), K64 (E, H, N, D, Q), G65(D, Y, E, H), R94(T,S) y Y102(Q, S, H, F). En un ejemplo, un anticuerpo que comprende dicha modificación R94T o R94S comprende además una o más modificaciones en la posición 96 y/o 100. En un ejemplo, dichas modificaciones comprenden una sustitución G96R y/o S 100T (es decir, en HVR-H3).

Un anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia del armazón consenso del subgrupo I kappa humana variante modificada en las posiciones 1, 2, 3 o todas las posiciones 24, 25, 29 y 56. En un ejemplo, la modificación se selecciona del grupo que consiste en R24K, A25S, I29Q y S56(R, I, M, G).

Un anticuerpo de la presente invención puede comprende cualquier secuencia del armazón de cadena ligera consenso humana o humana adecuada, siempre que el anticuerpo muestre las características biológicas deseadas (por ejemplo, una afinidad de unión deseada). En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende por lo menos una parte (o toda) la secuencia del armazón de cadena ligera \kappa humana. En una realización, un anticuerpo de la presente
invención comprende por lo menos una parte (o toda) de la secuencia del armazón consenso del subgrupo I \kappa humana.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia del armazón representada en la SEC ID NO: 13 y/o 16 (Figura 1), siempre que la posición 94 en la cadena pesada no sea R (y sea, preferiblemente, pero no necesariamente S o T).

En un aspecto, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo anti-c-met humanizado que inhibe la unión del factor de crecimiento de hepatocitos humano a su receptor mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo anti-c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada representada en la figura 7 (SEC ID NO: 9 y 10). Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo de la presente invención inhibe la unión de HGF con un valor IC50 que es inferior a aproximadamente la mitad de la del anticuerpo quimérico. En una realización, el valor IC50 de un anticuerpo de la presente invención es aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3 ó 0,4 el del anticuerpo quimérico. La comparación de las capacidades para inhibir la unión de HGF a su receptor se puede realizar según diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en los siguientes ejemplos. En una realización, los valores IC50 se determinan a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo desde aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1000 nM.

En un aspecto, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo anti-c-met humanizado que inhibe la activación del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) humano mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo anti-c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada representada en la figura 7 (SEC ID No. 9 y 10). Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo de la presente invención inhibe la activación del receptor con un valor IC50 que es inferior a aproximadamente la mitad del del anticuerpo quimérico. En una realización, el valor IC50 de un anticuerpo de la presente invención es aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3 ó 0,4 el del anticuerpo quimérico. La comparación de las capacidades para inhibir la activación del receptor de HGF se puede realizar según diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en los siguientes ejemplos. En una realización, los valores IC50 se determinan a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM.

En un aspecto, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo anti-c-met humanizado que inhibe la proliferación celular dependiente de c-met mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo anti-c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada representada en la figura 7 (SEC ID NO: 9 y 10), con un valor IC50 que es inferior a aproximadamente la mitad del del anticuerpo quimérico. En una realización, el valor IC50 de un anticuerpo de la presente invención es aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3 ó 0,4 el del anticuerpo quimérico. La comparación de las capacidades para inhibir la proliferación celular se puede realizar según diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en los siguientes ejemplos. En una realización, los valores IC50 se determinan a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo desde aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 100 nM.

En una realización, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico son monovalentes. En una realización, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico comprenden una región Fab única unida a una región Fc. En una realización, el anticuerpo quimérico de referencia comprende secuencias de dominios variables representadas en la figura 7 (SEC ID NO: 9 y 10) unidas a una región Fc humana. En una realización, la región Fc humana es la de una IG (por ejemplo, IgG1, 2, 3 ó 4).

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC representada en la figura 13. En una realización, el dominio variable comprende la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC representada en la figura 13. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia de CH1 y/o Fc representada en la figura 13. En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC y la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC representada en la figura 13. En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, HVR2-HC and HVR3-HC, y la secuencia de CH1 y/o Fc representada en la figura 13. En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC y la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC representada en la figura 13, y la secuencia CH1 y/o Fc1 representada en la figura 13. En una realización, la región Fc del anticuerpo de la presente invención comprende un complejo entre un polipéptido que comprende la secuencia Fc en la figura 13 y un polipéptido que comprende la secuencia Fc en la figura 14.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de HVR1-LC, HVR2-LC y HVR3-LC representada en la figura 13. En una realización, el dominio variable comprende la secuencia FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y FR4-LC representada en la figura 13. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia de CL1 representada en la figura 13.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende dominios variables de cadena ligera y cadena pesada tal como se describe en los dos párrafos anteriores. En una realización, el anticuerpo es monovalente y comprende una región Fc. En una realización, la región Fc comprende por lo menos una protuberancia (saliente) y por lo menos una cavidad (hueco), donde la presencia de la protuberancia y la cavidad aumenta la formación de un complejo entre un polipéptido Fc que comprende la protuberancia y un polipéptido Fc que comprende la cavidad, por ejemplo, tal como se describe en WO 2005/063816. En una realización, la región Fc de un anticuerpo de la presente invención comprende un primer y segundo polipéptido Fc, donde el primer y segundo polipéptido comprenden una o más mutaciones con respecto a la Fc humana de tipo salvaje. En una realización, una mutación en la cavidad es T366S, L368A y/o Y407V. En una realización, una mutación en la protuberancia es T366W. En una realización, el primer polipéptido comprende la secuencia Fc representada en la figura 13 y el segundo polipéptido comprende la secuencia Fc representada en la figura 14.

Los antagonistas de la presente invención se pueden utilizar para modular uno o más aspectos de los efectos asociados a HGF/c-met, incluyendo, pero sin limitación, la activación de c-met, la señalización molecular cascada abajo (por ejemplo, la fosforilación de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), la migración celular, la supervivencia celular, la morfogénesis celular y la angiogénesis. Estos efectos se pueden modular mediante cualquier mecanismo biológicamente relevante, incluyendo, la alteración de la unión del ligando (por ejemplo, HGF) a c-met, fosforilación de c-met y/o multimerización de c-met. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista de c-met que inhibe la unión de HGF a c-met. En una realización, un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención altera la multimerización (por ejemplo, dimerización) de c-met. En una realización, un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención altera la función de dimerización del dominio Sema de c-met. En un ejemplo, un anticuerpo antagonista de c-met interfiere con la capacidad del dominio Sema de c.met de realizar una dimerización de c-met. La interferencia puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista de c-met se puede unir a una secuencia en el dominio Sema de c-met, y de este modo, inhibe la interacción de dominio unido con un pareja de unión (tal como otra molécula c-met). En otro ejemplo, un anticuerpo antagonista de c-met se puede unir a una secuencia que no está en el dominio Sema de c-met, pero en el que dicha unión da lugar a una alteración de la capacidad del dominio de Sema de c-met para interaccionar con su pareja de unión (tal como otra molécula c-met). En una realización, un anticuerpo antagonista de la invención que se une a c-met (por ejemplo, el dominio extracelular), de manera que se altera la dimerización de c-met. En una realización, un anticuerpo antagonista de la invención se une a c-met, de manera que se altera la capacidad del dominio Sema de c-met para realizar la dimerización. Por ejemplo, en una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tras la unión a una molécula c-met inhibe la dimerización de dicha molécula. En una realización, un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención se une específicamente a una secuencia en el dominio Sema de c-met.

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En una realización, un anticuerpo antagonista de la presente invención altera la dimerización de c-met que comprende la homodimerización. En una realización, un anticuerpo antagonista de la presente invención altera la dimerización de c-met que comprende la heterodimerización (es decir, la dimerización de c-met con una molécula que no es c-met).

En algunos casos, puede ser ventajoso tener un anticuerpo antagonista de c-met que no interfiere con la unión de un ligando (tal como HGF) a c-met. Por consiguiente, aquí se describe un anticuerpo que no se une a un sitio de unión a HGF en c-met. Un anticuerpo puede no inhibir sustancialmente la unión de HGF a c-met, o puede no competir sustancialmente con HGF por la unión a c-met. En un ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo antagonista de la presente invención conjuntamente con uno o más antagonistas, donde los antagonistas se dirigen a procesos y/o funciones diferentes en el eje HGF/c-met. De este modo, en una realización, un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención se une a un epítopo en c-met diferente de un epítopo unido por otro antagonista de c-met (tal como el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection Número de Acceso ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13)). En otra realización, un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención es distinta de (es decir, no es) un fragmento Fab del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection Número de Acceso ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13).

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista de c-met que altera tanto la multimerización de c-met como la unión de ligando. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista de la presente invención que inhibe la multimerización de c-met (por ejemplo, dimerización) también puede comprender la capacidad de competir con HGF por la unión a c-met.

En una realización de un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención, la unión del antagonista a c-met inhibe la activación de c-met mediante HGF. En otra realización de un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención, la unión del antagonista a c-met en una célula inhibe la proliferación, supervivencia, dispersión, morfogénesis y/o motilidad de la célula.

Un anticuerpo antagonista de c-met puede unirse específicamente a por lo menos una parte del dominio Sema de c-met o una variante del mismo. En un ejemplo, un anticuerpo antagonista se une específicamente a por lo menos una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en LDAQT (SEC ID NO: 15) (por ejemplo, residuos 269-273 de c-met), LTEKRKKRS (SEC ID NO: 16) (por ejemplo, residuos 300-308 de c-met), KPDSAEPM (SEC ID NO: 17) (por ejemplo, residuos 350-357 de c-met) y NVRCLQHF (SEC ID NO: 18) (por ejemplo, residuos 381-388 de c-met). En un ejemplo, un anticuerpo antagonista se une específicamente a un epítopo conformacional formado por parte o toda de por lo menos una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en LDAQT (por ejemplo, residuos 269-273 de c-met), LTEKRKKRS (por ejemplo, residuos 300-308 de c-met), KPDSAEPM (por ejemplo, residuos 350-357 de c-met) y NVRCLQHF (por ejemplo, residuos 381-388 de c-met). En un ejemplo, un anticuerpo antagonista se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o similar con la secuencia LDAQT, LTEKRKKRS, KPDSAEPM y/o NVRCLQHF.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención se une específicamente a un receptor de HGF de una primera especie animal, y no se une específicamente a un receptor de HGF de una segunda especie animal. En una realización, la primera especie animal es humana y/o primate (por ejemplo, mono cynomolgus) y la segunda especie animal es murina (por ejemplo, ratón) y/o canina. En una realización, la primera especie animal es humana. En una realización, la primera especie animal es un primate, por ejemplo, mono cynomolgus. En una realización, la segunda especie animal es murina, por ejemplo ratón. En una realización, la segunda especie animal es canina.

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos antagonistas de la presente invención y un portador. En una realización, el portador es farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la presente invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la presente invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante, tal como un vector de expresión. Se puede utilizar cualquiera de un conjunto de células huésped. En una realización, una célula huésped es una célula procariota, por ejemplo, E. coli. En una realización, una célula huésped es una célula eucariota, por ejemplo una célula de mamíferos, tales como célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

También se describen aquí métodos para producir un antagonista de la presente invención. Por ejemplo, se describe un método de producción de un anticuerpo antagonista de c-met (el cual, tal como se define aquí, incluye de longitud completa y fragmentos del mismo), que comprende expresar en una célula huésped adecuada un vector recombinante de la presente invención que codifica dicho anticuerpo (o fragmento del mismo), y recuperar dicho anticuerpo.

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También se describe aquí un artículo de fabricación que comprende un recipiente; y una composición contenida en el recipiente, donde la composición comprende uno o más anticuerpos antagonistas de c-met de la presente invención. En un ejemplo, la composición comprende un ácido nucleico de la presente invención. En un ejemplo, una composición que comprende un anticuerpo antagonista comprende además un portador que, en algunas realizaciones, es farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, un artículo de fabricación de la presente invención comprende además instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el anticuerpo antagonista) a un sujeto.

También se describen aquí un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos antagonistas c-met de la presente invención; y un segundo recipiente que comprende un tampón. En un ejemplo, el tampón es farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, una composición que comprende un anticuerpo antagonista comprende además un portador que en algunos casos es farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, un kit comprende además instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el anticuerpo antagonista) a un sujeto.

En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo antagonista de c-met de la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico de la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un vector de expresión de la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de una célula huésped de la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmune (tal como autoinmune) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

La presente invención proporciona usos médicos y composiciones útiles para modular los estados patológicos asociados con la desregulación del eje de señalización HGF/c-met. El mecanismo de señalización HGF/-cmet está implicado en múltiples funciones biológicas y fisiológicas, incluyendo, por ejemplo, la proliferación celular y la angiogénesis. De este modo, la presente invención proporciona el uso médico de un anticuerpo de la presente invención en un método que comprende administrar dicho anticuerpo,

por ejemplo, un método sobre la inhibición de la proliferación celular activada por c-met, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula o tejido con una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, a través de lo cual se inhibe la proliferación celular asociada con la activación de c-met,

un método de tratamiento de una condición patológica asociada con la desregulación de la activación de c-met en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, a través de lo cual se trata dicha condición,

un método de inhibición del crecimiento de una célula que expresa c-met o un factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo de la presente invención, causando así la inhibición del crecimiento de dicha célula. En una realización, la célula se pone en contacto mediante HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino),

un método de tratamiento terapéutico de un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende una célula que expresa c-met o un factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, tratando así de manera eficaz dicho mamífero, donde en un ejemplo, la célula se pone en contacto mediante HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino),

un método de tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular asociado con un aumento de la expresión o actividad de c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, tratando o previniendo así de manera eficaz dicho trastorno proliferativo celular, donde dicho trastorno proliferativo puede ser cáncer,

un método para inhibir el crecimiento de una célula, donde el crecimiento de dicha célula es por lo menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, inhibiendo así el crecimiento de dicha célula, donde en un ejemplo, la célula se pone en contacto mediante HGF expresada por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino), o

un método de tratamiento terapéutico de un tumor en un mamífero, donde el crecimiento de dicho tumor es por lo menos en parte dependiente de un efector potenciador del crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención, tratando así de manera eficaz dicho tumor, donde en un ejemplo, la célula se pone en contacto mediante HGF expresada por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino.

Dichos métodos se pueden utilizar para afectar a cualquier estado patológico adecuado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con la desregulación del mecanismo de señalización HGF/c-met. En un ejemplo, una célula que es reconocida en un método es una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede ser una seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de carcinoma papilar (por ejemplo, de la glándula tiroidal), una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula del sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una célula de melanoma y una célula de leucemia. En un ejemplo, una célula que es reconocida en un método es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En un ejemplo, una célula que es reconocida en un método es una célula displásica. En otro ejemplo, una célula que es reconocida en un método es una célula metastásica.

Dichos métodos pueden comprender además etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en un ejemplo, un método comprende además una etapa en la que una célula y/o tejido diana (por ejemplo, una célula cancerosa) se expone a un tratamiento por radiación o un agente quimioterapéutico.

Tal como se describe aquí, la activación de c-met es un proceso biológico importante, la desregulación del cual conduce a numerosas condiciones fisiológicas. Por consiguiente, en un ejemplo de métodos descritos aquí, una célula que es reconocida (por ejemplo, una célula cancerosa) es aquella en que aumenta la activación de c-met en comparación con una célula normal del mismo tejido origen. En un ejemplo, el método provoca la muerte de la célula reconocida. Por ejemplo, el contacto con un antagonista de la presente invención puede dar lugar a la incapacidad de la célula de señalizar a través del mecanismo de c-met, lo cual da lugar a la muerte de la célula.

La desregulación de la activación de c-met (y de este modo, la señalización) puede ser resultado de un conjunto de cambios celulares, incluyendo, por ejemplo, la sobreexpresión de HGF (ligando afín de c-met) y/o el propio c-met. Por consiguiente, en algunos ejemplos, el método comprende reconocer una célula donde c-met o el factor de crecimiento de hepatocitos, o ambos, son expresados de manera más abundante por dicha célula (por ejemplo, una célula cancerosa) en comparación con una célula normal del mismo tejido origen. Una célula que expresa c-met puede ser regulada por HGF de diversas fuentes, es decir, de una manera autocrina o paracrina. Por ejemplo, una célula reconocida se pone en contacto/es unida por el factor de crecimiento de hepatocitos expresado en una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino). Dicha célula diferente puede ser del mismo tejido origen o de uno diferente. En un ejemplo, una célula reconocida se pone en contacto/es unida por el factor de crecimiento de hepatocitos expresado por la propia célula reconocida (por ejemplo, a través de un efecto/bucle autocrino). La activación y/o la señalización de c-met también puede tener lugar de forma independiente del ligando. Por tanto, en un ejemplo, la activación de c-met en una célula reconocida tiene lugar de forma independiente del ligando.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la alineación de secuencias de las cadenas variables ligera y pesada para las siguientes: secuencia consenso del subgrupo I de cadena ligera humana, secuencia consenso del subgrupo III de cadena pesada humana, anticuerpo anti-c-met 5D5 murino y anticuerpo "humanizado" en injerto en 5D5.

La figura 2 representa diversas secuencias HVR de anticuerpos madurados por afinidad seleccionados de bibliotecas con HVR individuales obtenidos al azar.

La figura 3 representa secuencias de HVR-H3 de anticuerpos madurados por afinidad seleccionados de un conjunto de bibliotecas que comprenden una combinación de 6 bibliotecas que comprende las seis HVR, donde cada biblioteca se coloca aleatoriamente en una única HVR.

La figura 4 representa los resultados del análisis Biacore de anticuerpos anti-c-met seleccionados.

Las figuras 5A,B y 6A,B representan secuencias armazón consenso humanas aceptoras de ejemplo para uso en la práctica de la presente invención con los identificadores de secuencia siguientes:

Armazones consenso de cadena pesada variable (VH) (fig. 5A. B)

Armazón consenso del subgrupo I de VH humano menos CDRs de Kabat (SEC ID NO: 19)

Armazón consenso del subgrupo I de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NO: 20-22)

Armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos CDRs de Kabat (SEC ID NO: 23)

Armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NO: 24-26)

Armazón consenso del subgrupo III de VH humano menos CDRs de Kabat (SEC ID NO: 27)

Armazón consenso del subgrupo III de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NO: 28-30)

Armazón aceptor de VH humano menos CDRs de Kabat (SEC ID NO: 31)

Armazón aceptor de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NO: 32-33)

Armazón aceptor 2 de VH humano menos CDRs de Kabat (SEC ID NO: 34)

Armazón aceptor 2 de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NO: 35-37)

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Armazones consenso de cadena ligera variable (VL) (figuras 6A,B)

Armazón consenso del subgrupo I kappa de VL humano (SEC ID NO: 38)

Armazón consenso del subgrupo II kappa de VL humano (SEC ID NO: 39)

Armazón consenso del subgrupo III kappa de VL humano (SEC ID NO: 40)

Armazón consenso del subgrupo IV kappa de VL humano (SEC ID NO: 41)

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La figura 7 representa secuencias de dominio variable de cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de un dador (anticuerpo murino 5D5).

La figura 8 representa los datos gráficos para el bloqueo de la unión de HGF a su receptor por un anticuerpo de la presente invención.

La figura 9 representa los datos gráficos para la inhibición de la activación del receptor de HGF por un anticuerpo de la presente invención.

La figura 10 representa los datos gráficos para la inhibición de la proliferación celular por un anticuerpo de la presente invención. "rchOA5D5 HGF" se refiere a un anticuerpo 5D5 de un brazo quimérico más HGF; "rhuOA5D5v2 HGF" se refiere a OA5D5.v2 más HGF; "rhuOA5D5v1 HGF" se refiere a OA5D5.v1 más HGF". "rchOA5D5 Control" se refiere a un anticuerpo 5D5 de un brazo quimérico sin HGF; "rhuOA5D5v2 Control" se refiere a OASD5.v2 sin HGF; "rhuOA5D5v1 Control" se refiere a OA5D5.v1 sin HGF".

Las figuras 11A, B representan los datos para la inhibición de la fosforilación del receptor en presencia de un anticuerpo de la presente invención.

La figura 11A representa la fosforilación del receptor de células H358. La figura 11B representa la fosforilación del receptor de células H358 transfectadas con HGF.

La figura 12 representa datos gráficos que muestran la eficacia in vivo de un anticuerpo de la presente invención. "TI" se refiere a la incidencia del tumor. TI=8/10 se refiere a 8 ratones que tienen tumores de un grupo de 10 ratones. TI=2/8 se refiere a 2 ratones que tienen tumores de un grupo de 8 ratones.

La figura 13 representa secuencias de aminoácidos del armazón ("Framework") (FR), región hipervariable (HVR), primer dominio constante (CL o CH1) y región Fc (Fc) de una realización de un anticuerpo de la presente invención (5D5.v2). La secuencia de Fc representada comprende mutaciones por "agujero" (cavidad) T366S, L368A y Y407V, tal como se describe en WO 2005/063816.

La figura 14 representa la secuencia de un polipéptido Fc que comprende una mutación por "saliente" (protuberancia) T366W, tal como se describe en WO 2005/063816. En una realización, un polipéptido Fc que comprende esta secuencia forma un complejo con un polipéptido Fc que comprende la secuencia de Fc de la figura 13 para generar una región Fc de un anticuerpo de la presente invención.

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Modos para llevar a cabo la invención

La presente invención proporciona usos médicos y composiciones y se describen aquí kits y artículos de fabricación para identificar y7o utilizar inhibidores del mecanismo de señalización HG-GF/c-met.

Los detalles de estos métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación se proporcionan en la presente invención.

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Técnicas generales

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, e inmunología, que se encuentra en el sector. Dichas técnicas se explican en detalle en la literatura, tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).

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Definiciones

Una "modificación" de residuo/posición de aminoácido, tal como se utiliza aquí, se refiere a un cambio de una secuencia primaria de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos inicial, donde el cambio resulta de una alteración en la secuencia que implica dichos residuos/posiciones de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones típicas incluyen la sustitución del residuo (o en dicha posición) por otro aminoácido (por ejemplo, una sustitución conservativa o no conservativa), la inserción de uno o más aminoácidos (generalmente menos de 5 ó 3) adyacentes a dicho residuo/posición y la deleción de dicho residuo/posición. Una "sustitución de aminoácido", o variación de la misma, se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada (inicial) por un residuo de aminoácido diferente. En general y preferiblemente, la modificación da lugar a la alteración en por lo menos una actividad físicobioquímica del polipéptido variante en comparación con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos inicial (o "tipo salvaje"). Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, la actividad físicobioquímica que se altera puede ser la afinidad de unión, la capacidad de unión y/o el efecto de unión en una molécula diana.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, se purificará el anticuerpo (1) en más de un 95% en peso de anticuerpo, determinado por el método de Lowry, y más preferiblemente en más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

El término "residuo de dominio variable que se enumera como en Kabat" o "posición de aminoácido que se enumera como en Kabat", y variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondiente a un recorte o una inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de un único aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de residuos Kabat se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia enumerada Kabat "estándar".

La frase "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo/la misma", tal como se utiliza aquí, indica un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la presente invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación), de manera que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene una significancia biológica y/o estadística escasa o nula en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es preferiblemente inferior a aproximadamente el 50%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 40%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 30%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 20%, preferiblemente aproximadamente inferior a aproximadamente el 10% en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparación.

"Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza aquí, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de la pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad de puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos aquí. Los anticuerpos de baja afinidad se unen en general a antígenos lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que anticuerpos de afinidad elevada se unen en general a antígenos más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. En la técnica se conocen diversos métodos de medición de la afinidad de unión y cualquiera se puede utilizar para los objetivos de la presente invención A continuación se describen realizaciones ilustrativas específicas.

En una realización, "Kd" o "el valor Kd" según la presente invención se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con una versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de Fabs por el antígeno mediante el equilibrio de Fab con una concentración mínima de antígeno marcado (^{125}I) en presencia de una serie de titulaciones de antígeno no marcado, a continuación se captura el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) se recubren toda la noche con 5 \mug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de [^{125}I]-antígeno se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistentes con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés se incuba a continuación durante toda la noche; aunque sin embargo la incubación puede continuar durante un periodo de tiempo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Cuando se han secado las placas, se añaden 150 \mul/pocillo de centelleador (MicroScint-20; Packard), y se recuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que produce menos o igual a un 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva. Según otra realización, Kd o el valor de Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcore^{TM}-2000 o un BIAcore^{TM}-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a \sim10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del suministrador. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 \mug/ml (\sim0,2 \muM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 \mul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25ºC a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 \mul/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software version 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad "on" supera 10^{6} M^{-1}S^{-1} mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad "on" se puede determinar utilizando una técnica de "quenching" fluorescente que mide el incremento o descenso en la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25ºC de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una cuveta de agitación.

Una "velocidad on" o "velocidad de asociación" o "kon" según la presente invención también se puede determinar con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial descrita anteriormente utilizando un BIAcore^{TM}-2000 o un BIAcore^{TM}-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a \sim10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del suministrador. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 \mug/ml (\sim0,2 \muM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 \mul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25ºC a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 \mul/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software version 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calculó como la proporción koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. sin embargo, si la velocidad "on" supera 10^{6} M^{-1}S^{-1} mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad "on" se puede determinar utilizando una técnica de "quenching" fluorescente que mide el incremento o descenso en la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25ºC de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una cuveta de agitación. "Kd" o "el valor Kd" según la presente invención se mide en una realización mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab del anticuerpo y la molécula de antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de Fabs por el antígeno mediante el equilibrio de Fab con una concentración mínima de antígeno marcado (^{125}I) en presencia de una serie de titulaciones de antígeno no marcado, a continuación se captura el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) se recubren toda la noche con 5 \mug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de [^{125}I]-antígeno se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (consistentes con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés se incuba a continuación durante toda la noche; aunque sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo de tiempo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Cuando se han secado las placas, se añaden 150 \mul/pocillo de centelleador (MicroScint-20; Packard), y se recuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que producen menos o igual a un 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva. Según otra realización, Kd o el valor de Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcore^{TM}-2000 o un BIAcore^{TM}-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a \sim10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del suministrador. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 \mug/ml (\sim0,2 \muM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 \mul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25ºC a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 \mul/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software version 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad "on" supera 10^{6} M^{-1}S^{-1} mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad "on" se puede determinar utilizando una técnica de "quenching" fluorescente que mide el incremento o descenso en la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25ºC de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una cuveta de agitación.

En una realización, una "velocidad on" o "velocidad de asociación" o "kon" según la presente invención también se determina con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial descrita anteriormente utilizando un BIAcore^{TM}-2000 o un BIAcore^{TM}-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a \sim10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del suministrador. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 \mug/ml (\sim0,2 \muM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 \mul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25ºC a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 \mul/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software version 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calculó como la proporción koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad "on" supera 10^{6} M^{-1}S^{-1} mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad "on" se puede determinar utilizando una técnica de "quenching" fluorescente que mide el incremento o descenso en la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25ºC de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una cuveta de agitación.

La frase "sustancialmente reducido/a" o "sustancialmente diferente", tal como se utiliza aquí, indica un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la presente invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación), de manera que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores es de significancia estadística en el contexto de la característica biológica medida mediante dichos valores (por ejemplo, valores de Kd, respuesta HAMA). La diferencia ente dichos dos valores es preferiblemente superior a aproximadamente un 10%, preferiblemente superior a aproximadamente un 20%, preferiblemente superior a aproximadamente un 30%, preferiblemente superior a aproximadamente un 40%, preferiblemente superior a aproximadamente un 50% en función del valor del anticuerpo de referencia/comparación.

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a la secuencia de un péptido o polipéptido se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia específica de péptido o polipéptido, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de identidad de la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de aminoácidos se obtienen utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla A siguiente. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla A siguiente se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la figura 8. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:

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100 veces la fracción X/Y

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donde X es el número de residuos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B a A.

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A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores en % de la identidad de las secuencias de aminoácidos utilizadas en la presente invención se obtienen tal como se ha descrito en el párrafo anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA A

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El término "vector", tal como se utiliza aquí, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular al que se pueden unir segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden unir segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se refieren aquí como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más utilizada habitualmente.

"Polinucleótidos" o "ácido nucleico", se utilizan indistintamente aquí, para referirse a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante reacción sintética. Un polinucleótidos puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación en la estructura de nucleótidos se puede realizar antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir mediante componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse además después de la síntesis, tal como mediante la conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caps", sustitución de uno o más nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótidos, tales como, por ejemplo, aquellas con uniones no cargadas (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen grupos colgando, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, pli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos. Además, se puede sustituir cualquier grupo hidroxilo presente normalmente en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar uniones adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos de bloqueo orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son conocidas generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como metil ribósido. Se pueden sustituir uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de unión alternativa. Estos grupos de unión alternativa incluyen, pero sin limitación, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR.sub.2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH.sub.2 ("formacetal"), en que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C.) que opcionalmente contienen una unión éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todas las uniones en un polinucleótido necesitan ser idénticas. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos referidos aquí, incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido", tal como se utiliza aquí, se refiere en general a polipéptidos cortos generalmente sintéticos y generalmente de una cadena que generalmente, pero no necesariamente, tienen una longitud inferior a aproximadamente 200 nucleótidos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anterior para polinucleótidos es igualmente y totalmente aplicable a oligonucleótidos.

El término "factor de crecimiento de hepatocitos" o "HGF", tal como se utiliza aquí, se refiere, a menos que se especifique o se indique en el contexto lo contrario, a cualquier polipéptido HGF nativo o variante (ya sea nativo o sintético) que es capaz de activar el mecanismo de señalización HGF/c-met bajo condiciones que permiten que dicho proceso tenga lugar. El término "HGF de tipo salvaje" se refiere en general a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína HGF natural. El término "secuencia de HGF de tipo salvaje" se refiere en general a una secuencia de aminoácidos hallada en un HGF natural.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre que muestren la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (tal como se describe con más detalle aquí). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad.

Los "Fragmentos de anticuerpos" comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, donde la parte mantiene preferiblemente por lo menos una, preferiblemente la mayoría o todas, las funciones asociadas normalmente con la parte cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, de este modo, mantiene la capacidad de unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fc, mantiene por lo menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, la modulación de la vida media del anticuerpo, la función ADCC y la unión a complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión a antígeno unido a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. En una realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo con un brazo tal como se describe en WO2005/063816. En una realización, el anticuerpo con un brazo comprende mutaciones en Fc que constituyen "salientes" y "huecos" tal como se describe en WO2005/063816. Por ejemplo, una mutación en hueco puede ser una o más de T366A, L368A y/o Y407V en un polipéptido Fc, y una mutación en cavidad puede ser T366W.

El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico único. Además, a diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen habitualmente anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena o cadenas es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón ("framework") (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente la acción del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "antígeno" es un antígeno predeterminado al que se puede unir selectivamente un anticuerpo. El antígeno diana puede ser un polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto natural o sintético. Preferiblemente, el antígeno diana es un polipéptido. Un "armazón humano aceptor" para los objetivos de la presente invención es un armazón que comprende la secuencia de aminoácidos de un armazón VL o VH derivado de un armazón de inmunoglobulina humana, o de un armazón consenso humano. Un armazón humano aceptor "derivado de" un armazón de inmunoglobulina humana o armazón consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios preexistentes en la secuencia de aminoácidos. Cuando están presente cambios preexistentes de aminoácidos, preferiblemente están presentes no más de 5 y preferiblemente 4 o menos, o 3 o menos, cambios de aminoácidos preexistentes. Cuando están presente cambios preexistentes de aminoácidos en HV, preferiblemente estos cambios son sólo en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en estas posiciones pueden ser en 71A, 73T y/o 78A. En una realización, el armazón aceptor humano de VL es idéntico en la secuencia a una secuencia del armazón de la inmunoglobulina de VL humana o la secuencia de armazón consenso humano.

Un "armazón consenso humano" es un armazón que representa el residuo de aminoácido más habitual en una selección de secuencias armazón VL o VH de inmunoglobulinas humanas. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulinas humanas es a partir de un subgrupo de secuencias de dominios variables. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al. En una realización, para VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al. En una realización, para VH, el subgrupo es subgrupo III como en Kabat et al.

Un "armazón consenso del subgrupo III de VH" comprende la secuencia consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III de pesada variable de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos del armazón consenso del subgrupo III de VH comprende por lo menos una parte o toda de cada una se las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEC ID NO: 42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEC ID NO: 43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEC ID NO: 44)-H3-WGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 45).

Un "armazón consenso del subgrupo I de VL" comprende la secuencia consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I kappa de ligera variable de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos del armazón consenso del subgrupo I de VH comprende por lo menos una parte o toda de cada una se las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEC ID NO: 46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEC ID NO: 47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEC ID NO: 48)-L3-FGQGTKVEIK (SEC ID NO: 49).

Un "armazón humano no modificado" es un armazón humano que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el armazón humano aceptor,, por ejemplo, que carece de sustituciones de aminoácidos humanos a no humanos en el armazón humano aceptor.

Una "región hipervariable alterada" para los objetivos de la presente invención es una región hipervariable que comprende una o más (por ejemplo, una a aproximadamente 16) sustituciones de aminoácidos en la misma.

Una "región hipervariable no modificada" para los objetivos de la presente invención es una región hipervariable que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo no humano del que deriva, es decir, uno que carece de una o más sustituciones en la misma.

El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se utiliza aquí, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en la VH (H1, H2, H3), y tres en la VL (L1, L2, L3). Se utiliza un conjunto de delineaciones de la región hipervariable y se comprenden en la presente invención. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más utilizadas habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la localización de los bucles estructurales (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizadas por el software de modelaje del anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en el análisis de estructuras de cristales complejos disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación.

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Las regiones hipervariables pueden comprende "regiones hipervariables extendidas" tal como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (L1), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH. Los residuos del dominio variable se enumeran según Kabat et al., supra para cada una de estas definiciones.

Residuos de "Armazón" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen aquí.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos tal como se describe aquí. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que da lugar a una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee estas alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante el desplazamiento de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de residuos de CDR y/o armazón es descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancialmente o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", tal como se utiliza aquí, es un anticuerpo que mimetiza por lo menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la presente invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen el mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en la presente invención incluyen tumores malignos y benignos; tumores no leucémicos y linfoides; trastorno neuronal, glial, astrocital, hipotalámico y otros trastornos glandulares, de macrófagos epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, inmunológicos y otros trastornos relacionados con la angiogénesis.

Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con cierto grado de proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer.

"Tumor", tal como se utiliza aquí, se refiere al crecimiento y proliferación de todas las células neoplásicas, tanto malignas como benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular" y "tumor" no se excluyen mutuamente tal como se refieren aquí.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento/proliferación celular no regulada. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer Gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hematoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

La desregulación de la angiogénesis puede conducir a muchos trastornos que se pueden tratar mediante composiciones y métodos de la presente invención. Estos trastornos incluyen condiciones tanto neoplásicas como no neoplásicas. Las neoplásicas incluyen, pero sin limitación, las descritas anteriormente. Entre los trastornos no neoplásicos se incluyen, pero sin limitación, la hipertrofia no deseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (RA), psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, retinopatías diabéticas y otras retinopatías proliferativas incluyendo retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización por injerto corneal, rechazo de injerto corneal, neovascularización retinal/coroidal, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), transplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación de pulmón, lesión pulmonar aguda/ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primario, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado con ictus agudo/lesión cerrada en la cabeza/trauma), inflamación sinovial, formación de pannus en RA, miositis osificante, formación hipertrópica de huesos, osteoartritis (OA), ascitis refractaria, enfermedad de ovarios poliquísticos, endometriosis, tercer espacio de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome de compartimento, quemaduras, enfermedad del intestino), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica, tal como IBD (enfermedad Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de intestino inflamatorio, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido no deseado o aberrante (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento de cabello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasias retrolental, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada a pericarditis) y efusión pleural.

Tal como se utiliza aquí, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar la evolución natural del individuo o la célula en tratamiento, y se puede realizar por profilaxis o durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o reaparición de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de la metástasis, disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o cura parcial del estado patológico y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, se utilizan los anticuerpos de la presente invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la presente invención, agonista o antagonista puede variar según factores, tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para obtener una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula, agonista o antagonista son sobrevaluados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Habitualmente, pero no necesariamente, dado que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente activa será inferior a la cantidad terapéuticamente activa.

El término "agente citotóxico" tal como se utiliza aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina, u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos, y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos descritos a continuación. A continuación, se describen otros agentes citotóxicos. Un agente tumoricida causa la destrucción de células tumorales.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen los agentes alquilantes tales como la tiotepa y la ciclofosfamida CYTOXAN®; los alquilsulfonatos tales como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas tales como la benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; las etileniminas y metilamelaminas, incluyendo la altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; las acetogeninas (especialmente la bullatacina y la bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabiol (dronabinol, MARINOL®); beta-lacona; lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan(HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); la briostatina; la calistatina; el CDC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofílico; teniposide; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la criptoficina 8); la dolastatina; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); la eleuterobina; la pancratistatina; una sarcodictiina; la espongistatina; las mostazas nitrogenadas tales como el clorambucilo, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el hidrocloruro del óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida, la mostaza de uracilo; las nitrosureas tales como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina, y la ranimustina; los antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, la caliqueamicina, especialmente la caliqueamicina gammaII y la caliqueamicina omegaII (véase, por ejemplo, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); la dinemicina, inlcuyendo la dinemicina A; una esperamicina; así como el cromóforo de la neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamicina®) (incluyendo la morfolino-doxorubicina, la cianomorfolino-doxorubicina, la 2-pirrolino-doxorubicina y la desoxidoxorubicina), la epirubicina, la esorubicina, la idarubicina, la marcelomicina, las mitomicinas tales como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina, las olivomicinas, la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina, la tubercidina, el ubenimex, la zinostatina, la zorubicina; los anti-metabolitos tales como el metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); los análogos del ácido fólico tales como la denopterina, el metotrexato, la pteropterina, el trimetrexato; los análogos de purina tales como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina, la tioguanina; los análogos de pirimidina tales como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina, la floxuridina; los andrógenos tales como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, la mepitiostana, la testolactona; los anti-adrenales tales como la aminoglutetimida, el mitotano, el trilostano; los rellenadores de ácido fólico tales como el ácido frolínico; la aceglatona; el glicósido de aldofosfamida; el ácido aminolevulínico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucilo; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elfomitina; el acetato de eliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinano; la lonidainina; los maitansinoides tales como la maitansina y las ansamitocinas; la mitoguazona; la mitoxantrona; el mopidanmol; la nitraerina; la pentostatina; el fenameto; la pirarubicina; la losoxantrona; la 2-etilhidrazida; la procarbazina; el complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); la razoxana; la rizoxina; el sizofirano; el espirogermanio; el ácido tenuazónico; la triaziquona; la 2,2',2''-triclorotrietilamina; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, la verracurina A, la roridina A y la anguidina); el uretano; la vindesina (ELDISINA®, FILDESINA®); la dacarbazina; la manomustina; el mitobronitol; el mitolactol; el pipobromano; la gacitosina; el arabinósido ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulación en nanopartículas de paclitaxel diseñado en albúmina, libre de Cremóforos ABRAXANE^{TM} (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y el doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); el cloranbucilo; la gemcitabina (Gemzar®); la 6-tioguanina; la mercaptopurina; el metotrexato; los análogos de platino tales como el cisplatino y carboplatino; la vinblastina (VELBAN®); el platino; el etopósido (VP-16); la ifosfamida; la mitoxantrona; la vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovovina; la vinorelbina (Navelbine®); la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina; el ibandronato; el inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; la difluorometilornitina (DMFO); los retinoides tales como el ácido retinoico; la capecitabina (XELODA®); y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviación para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviación para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN^{TM}) combinado con 5-FU y leucovovina.

También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden inducir el crecimiento del cáncer y, a menudo, en forma de tratamiento sistémico o de todo el cuerpo. Pueden ser hormonas en sí. Entre los ejemplos se incluyen antiestrógenos y modulares de receptores de estrógeno selectivos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX® tamoxifeno), EVTSTA® raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; anti-progesteronas; subreguladores del receptor de estrógeno (ERDs); agentes que actúan para suprimir o desaactivar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de hormona leutinizante (LHRH), tales como LUPRON® y acetato de leuprolide ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®. Además, dicha definición de agentes quimioterapéuticos incluye bifosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC ®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA ®, tiludronato SKELID®, o risedronato ACTONEL®; así como troxacitabina (un análogo del 1,3-dioxolano nucleósido citosina); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en mecanismos de señalización implicados en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas, tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas con terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAPID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina quinasa dual de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016); y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula cuyo crecimiento depende de la activación de HGF/c-met in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser aquel que reduce significativamente el porcentaje de células dependientes de HGF/c-met en la fase S. Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto diferente de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Algunos bloqueadores clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Los agentes que interrumpen G1 también afectan a la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloroetamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerosos derivados del tejo. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos mediante la prevención de la despolimerizaciuón, lo que da lugar a la inhibición de la mitosis en células.

"Doxorrubicina" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorrubicina es (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenodiona.

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Generación de anticuerpos variantes que muestran una reducción o ausencia de respuesta HAMA

La reducción o eliminación de una respuesta de HAMA es un aspecto significativo de desarrollo clínico de agentes terapéuticos adecuados. Véase, por ejemplo, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41: 572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Tal como se describe aquí, la presente invención proporciona anticuerpos que están humanizados, de manera que la respuesta a HAMA se reduce o elimina. Las variantes de estos anticuerpos se pueden obtener además utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación.

Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo tal como se describe aquí puede actuar como secuencia de partida (parental) para la diversificación de las secuencia o secuencias del armazón y/o hipervariable. A la secuencia de armazón seleccionada a la que se une la secuencia hipervariable de partida se hace referencia aquí como un armazón humano aceptor. Aunque los armazones humanos aceptores pueden ser, o derivan de, una inmunoglobulina humana (las regiones VL y/o VH de la misma), preferiblemente los armazones humanos aceptores son de, o derivan de, un armazón consenso humano como tal, los armazones han demostrado tener una inmunogenicidad mínima o nula en pacientes humanos.

Cuando el aceptor deriva de una inmunoglobulina humana, se puede seleccionar opcionalmente una secuencia de armazón humana que se selecciona en base a su homología con la secuencia del armazón dadora mediante la alineación de la secuencia del armazón dadora con varias secuencias de armazón humanas en un conjunto de secuencias de armazón humanas y la selección de la secuencia de armazón más homóloga.

En una realización, los armazones consenso humanos de la presente invención son de, o derivan de, las secuencias de armazón consenso del subgrupo III de VH y/o el subgrupo I kappa de VL.

De este modo, el armazón humano aceptor de VH puede comprender una, dos, tres o todas las secuencias de armazón siguientes:

FR1 que comprende EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEC ID NO: 42),

FR2 que comprende WVRQAPGKGLEWV (SEC ID NO: 43),

FR3 que comprende RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEC ID NO: 50), donde X1 es A o R, X2 es T o N, y X3 es A o L,

FR4 que comprende WGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 45).

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Entre los ejemplos de armazones consenso de VH se incluyen:

Armazón consenso del subgrupo I de VH humano menos CDR Kabat (SEC ID NO: 19);

armazón consenso del subgrupo I de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NOs: 20-22);

armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos CDR Kabat (SEC ID NO: 23);

armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos regiones hipervariables menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NOs: 24-26);

armazón consenso del subgrupo III de VH humano menos CDR Kabat (SEC ID NO: 27);

armazón consenso del subgrupo III de VH humano menos regiones hipervariables menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NOs: 28-30);

armazón aceptor de VH humano menos CDR Kabat (SEC ID No. 31),

armazón aceptor de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC Id Nos. 32-33);

armazón del aceptor 2 de VH humano menos CDR Kabat (SEC ID NO: 34); o

armazón del aceptor 2 de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEC ID NOs: 35-37).

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En una realización, el armazón humano aceptor de VH comprende una, dos, tres o todas de las secuencias de armazón siguientes:

FR1 que comprende EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEC ID NO: 42),

FR2 que comprende WVRQAPGKGLEWV (SEC ID NO: 43),

FR3 que comprende RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEC ID NO: 51),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEC ID NO: 52),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEC ID NO: 53),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEC ID NO: 54), o

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEC ID NO: 55)

FR4 que comprende WGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 45).

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El armazón humano aceptor de VL puede comprender una, dos, tres o todas de las secuencias de armazón siguientes:

FR1 que comprende DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEC ID NO: 46),

FR2 que comprende WYQQKPGKAPKLLIY (SEC ID NO: 47),

FR3 que comprende GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEC ID NO: 48),

FR4 que comprende FGQGTKVEIK (SEC ID NO: 49).

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Entre los ejemplos de armazones consenso de VL se incluyen:

Armazón consenso del subgrupo I kappa de VL humano (SEC ID No. 38);

Armazón consenso del subgrupo II kappa de VL humano (SEC ID No. 39);

Armazón consenso del subgrupo III kappa de VL humano (SEC ID No. 40); o

Armazón consenso del subgrupo IV kappa de VL humano (SEC ID No. 41);

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Aunque el aceptor puede ser idéntico en la secuencia a la secuencia de armazón humana seleccionada, tanto si es de una inmunoglobulina humana o un armazón consenso humano, la presente invención contempla que la secuencia aceptora pueda comprender sustituciones de aminoácido existentes en relación con la secuencia de inmunoglobulina humana o la secuencia del armazón consenso humano. Estas sustituciones preexistentes son preferiblemente mínimas; normalmente cuatro, tres, dos o una diferencia de aminoácidos sólo en relación con la secuencia de inmunoglobulina humana o la secuencia del armazón consenso.

Los residuos de la región hipervariable del anticuerpo no humano se incorporan en los armazones humanos aceptores de VL y/o VH. Por ejemplo, se pueden incorporar residuos correspondientes a los residuos CDR Kabat, los residuos de bucle hipervariable Chothia, los residuos Abms, y/o residuos de contacto. Opcionalmente, se incorporan los siguientes residuos de la región hipervariable extendida: 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3).

Aunque aquí se describe la "incorporación" de residuos de la región hipervariable, se entenderá que esto se puede conseguir de varias maneras, por ejemplo, se pueden generar ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos deseada mediante la mutación de ácidos nucleicos que codifican la secuencia del dominio variable de ratón, de manera que los residuos del armazón de la misma se cambian a residuos del armazón humano aceptor, o mediante la mutación de ácidos nucleicos que codifican la secuencia del dominio variable humano, de manera que los residuos del dominio hipervariable se cambian a residuos no humanos, o mediante la síntesis de ácido nucleico que codifica la secuencia deseada, etc.

En los ejemplos de la presente invención, se generaron variantes injertadas en la región hipervariable mediante mutagénesis Kunkel de ácido nucleico que codifica las secuencias aceptoras humanas utilizando un oligonucleótido separado para cada región hipervariable. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Se pueden introducir cambios apropiados en el armazón y/o la región hipervariable utilizando técnicas de rutina para corregir y reestablecer las interacciones región hipervariable-antígeno correctas.

La expresión en fagémidos (también referido aquí como expresión en fagos en algunos contextos) se puede utilizar como un método conveniente y rápido para generar y cribar muchos anticuerpos variantes potenciales diferentes en una biblioteca generada mediante obtención aleatoria de secuencias. Sin embargo, existen otros métodos para el experto en la materia para fabricar y cribar anticuerpos alterados.

La tecnología de expresión en fagémidos ha proporcionado una herramienta potente para generar y seleccionar proteínas nuevas que se unen a ligando, tales como antígeno. Utilizando las técnicas de expresión en fagémidos se permite la generación de bibliotecas grandes de variantes de proteínas que se pueden clasificar rápidamente para aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con una afinidad elevada.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos variantes se fusionan en general a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de envoltura viral, tal como la proteína del gen III o la proteína del gen VIII. Se han desarrollado sistemas de expresión en fagémicos monovalentes donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o polipéptido se fusiona a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una parte de la proteína del gen IIII. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). En un sistema de expresión en fagémidos monovalentes, la fusión génica se expresa a niveles bajos y también se expresan las proteínas del gen III de tipo salvaje, de manera que se mantiene la infectividad de las partículas. Los métodos de generación de bibliotecas de péptidos y el cribado de estas bibliotecas se han descrito en muchas patentes (por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,723,286, Patente de Estados Unidos. 5,432, 018, Patente de Estados Unidos. 5,580,717, Patente de Estados Unidos No. 5,427,908 y Patente de Estados Unidos No. 5,498,530).

Las bibliotecas de anticuerpos o polipéptidos de unión a antígeno se han preparado de una serie de manera que incluyen la alteración de un único gen mediante la inserción de secuencias de ADN aleatorias o mediante la clonación de una familia de genes relacionados. Los métodos para expresar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno utilizando la expresión en fagémicos se han descrito en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717, y 5,658,727. La biblioteca se criba a continuación por la expresión de anticuerpos o proteínas de unión a antígeno con las características deseadas.

Los métodos de sustitución de un aminoácido de elección en un ácido nucleico de molde están bien establecidos en la técnica, algunos de los cuales se describen aquí. Por ejemplo, los residuos de la región hipervariable se pueden sustituir utilizando el método Kunkel. Véase, por ejemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).

La secuencia de oligonucleótidos incluye uno o más de los grupos de codones designados para los residuos de región hipervariable a alterar. El grupo de codones es un grupo de secuencias de tres nucleótidos diferentes utilizado para codificar aminoácidos variantes deseados. Los grupos de codones se pueden representar utilizando símbolos para designar nucleótidos concretos o mezclas equimolares de nucleótidos tal como se muestra a continuación según el código IUB.

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Códigos IUB

G: Guanina

A: Adenina

T: Timina

C: Citosina

R: (A o G)

Y: (C o T)

M: (A o C)

K: (G o T)

S: (C o G)

W: (A o T)

H: (A o C o T)

B: (C o G o T)

V: (A o C o G)

D: (A o G o T)H

N: (A o C G o T)

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Por ejemplo, en el codón DVK, D puede ser los nucleótidos A o G o T; V puede ser A o G o C; y K puede ser G o T. Este grupo de codones puede presentar 18 codones diferentes y puede codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, y Cys.

Los grupos de oligonucleótidos o sondas se pueden sintetizar utilizando métodos estándar. Se puede sintetizar un conjunto de oligonucleótidos, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida, que contiene secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos proporcionadas por el grupo de codones y que codificarán el grupo deseado de aminoácidos. La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleótidos seleccionados en ciertas posiciones es conocida en la técnica. Dichos grupos de nucleótidos que tienen grupos de codones se pueden sintetizar utilizando sintetizados de ácidos nucleicos comerciales (disponibles en, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA), o se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por lo tanto, un grupo de oligonucleótidos sintetizados que tienen un grupo de codones particulares incluirá habitualmente una pluralidad de oligonucleótidos con secuencias diferentes, las diferencias establecidas por el grupo de codones en la secuencia general. Los oligonucleótidos, tal como se utilizan en la presente invención, presentan secuencias que permiten la hibridación a un molde de ácido nucleico de dominio variable y también pueden incluir sitios para enzimas de restricción para fines de clonación.

En un método, las secuencias de ácido nucleico que codifican los aminoácidos variantes se pueden crear mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido. Esta técnica es bien conocida en el sector tal como se describe en Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Brevemente, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican aminoácidos variantes se crean mediante hibridación de un conjunto de oligonucleótidos que codifican los grupos de codones deseados a una ADN molde, donde el molde es la forma en cadena sencilla del plásmido que contiene una secuencia del ácido nucleico molde de la región variable. Después de la hibridación, se utiliza ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria entera del molde que incorporará de este modo el cebador de oligonucleótidos y contendrá los grupos de codones proporcionados por el grupo de oligonucleótidos.

En general, se utilizan oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios al molde en cualquier cara del nucleótidos o nucleótidos que codifican para la mutación o mutaciones. Esto asegura que el olgonucleótido se hibridará correctamente a la molécula del ADN molde de cadena única. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas en el sector, tales como las descritas por Crea et al., Pro. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765
(1978).

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El molde de ADN es generado por aquellos vectores que derivan de los vectores del bacteriófago M13 (los vectores M13mp18 y M13mp19 disponibles comercialmente son adecuados), o aquellos vectores que contienen un origen de replicación del fago de cadena única tal como se describe por Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). De este modo, el ADN a mutar se puede insertar en uno de estos vectores con el fin de generar un molde de cadena única. La producción del molde de cadena única se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., anterior.

Para alterar la secuencia de ADN nativo, el oligonucleótido se hibrida al molde de cadena única en condiciones de hibridación adecuadas. A continuación, se añade una enzima polimerizante de ADN, normalmente ADN polimerasa de T7 o el fragmento Klenow de ADN polimerasa I, para sintetizar la hebra complementaria del molde utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. De este modo, se forma una molécula de cadena doble heteróloga, de modo que una cadena de ADN codifica la forma mutada del gen 1 y la otra cadena (el modelo original) codifica la secuencia nativa inalterada del gen 1. Esta molécula de cadena doble heteróloga se transforma a continuación en una célula huésped adecuada, normalmente una procariota, tal como E. coli JM101. Después del crecimiento de las células, se emplacan sobre placas de agarosa y se criban utilizando el cebador de oligonucleótidos radiomarcado con fosfato-32 para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado.

El método descrito inmediatamente antes se puede modificar, de manera que se crea una molécula de cadena doble homóloga, en la que ambas cadenas del plásmido contienen la mutación o mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: El oligonucleótido de cadena única se hibrida al molde de cadena única tal como se describe anteriormente. Se combina una mezcla de tres desoxiribonucleótidos, desoxiriboadenosina (dATP), desoxiriboguanosina (dGTP), y desoxiribotimidina (dTT), con una tiodesoxiribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que se puede obtener de Amersham). Esta mezcla añade al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica al molde a excepción de las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión con endonucleasas de restricción. Después de cortar la hebra del molde de la doble cadena heteróloga con una enzima de restricción apropiada, la hebra del molde se puede digerir con la ExoIII nucleasa u otra nucleasa apropiada después de la región que contiene el sitio o sitios a mutageneizar. A continuación, se detiene la reacción para dejar una molécula que sólo tiene parcialmente una única cadena. A continuación, se forma una doble cadena homóloga de ADN utilizando ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxiribonucleótidos trifosfato, ATP y ADN ligasa. Esta molécula de doble cadena homóloga se pueden entonces transferir a una célula huésped adecuada.

Tal como se ha indicado previamente, la secuencia del grupo de oligonucleótidos es suficientemente larga para hibridarse al ácido nucleico molde y puede contener, pero no necesariamente, sitios de restricción. El molde de ADN se puede generar mediante estos vectores que derivan de vectores del bacteriófago M13 o vectores que contienen un origen de replicación de fago de cadena única tal como se describe por Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). De este modo, el ADN a mutar debe insertarse en uno de estos vectores con el fin de generar un molde de cadena única. La producción del molde de cadena única se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.

Según otro método, se pude generar una biblioteca disponiendo de grupos de oligonucleótidos en dirección 5' y 3', cada grupo teniendo una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las secuencias diferentes establecidas por los grupos de codones en la secuencia de los oligonucleótidos. Los grupos de oligonucleótidos en dirección 5' y 3', junto con una secuencia del ácido nucleico de molde del dominio variable, se pueden utilizar en una reacción en cadena de la polimerasa para generar una "biblioteca" de productos PCR. A los productos de PCR se les puede hacer referencia como "cassettes de ácidos nucleicos", ya que se pueden fusionar con otras secuencias de ácido nucleico relacionadas o no relacionadas, por ejemplo, proteínas de envoltura viral y dominios de dimerización, utilizando técnicas de biología molecular establecidas.

La secuencia de los cebadores de PCR incluye uno o más de los grupos de codones designados para las posiciones accesibles al disolvente y altamente diversas en la región hipervariable. Tal como se ha descrito anteriormente, un grupo de codones es un grupo de secuencias de tres nucleótidos diferentes utilizadas para codificar los aminoácidos variantes deseados.

Se pueden aislar selectores de anticuerpos que cumplen con los criterios deseados, seleccionados a través de las etapas de cribado/selección apropiadas y clonarse utilizando técnicas recombinantes estándar.

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Vectores, células huésped y métodos recombinantes

Para la producción recombinante de un anticuerpo de la presente invención, el ácido nucleico que lo codifica se aísla e inserta en un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Existen muchos vectores disponibles. La elección del vector depende en parte de la célula huésped a utilizar. En general, las células huésped preferidas son de origen procariota o eucariota (generalmente mamíferos).

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Generación de anticuerpos utilizando células huésped procariotas Construcción de vectores

Las secuencias de polinucleótidos que codifican los componentes polipeptídicos del anticuerpo de la presente invención se pueden obtener utilizando técnicas de recombinación estándar. Las secuencias de polinucleótidos deseadas se pueden aislar y secuenciar de células productoras de anticuerpos, tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando un sintetizador de nucleótidos o técnicas PCR. Una vez obtenidos, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en huéspedes procariotas. Existen muchos vectores disponibles y conocidos en la técnica que se pueden utilizar para el objetivo de la presente invención. La selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos a insertar en el vector y de la célula huésped particular a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótidos heterólogo, o ambos) y de su compatibilidad con la célula huésped particular en la que reside. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero sin limitación: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), una secuencia señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, los vectores de plásmidos que contienen replicón y secuencias de control que derivan de especies compatibles con la célula huésped se utilizan en relación con estos huéspedes. El vector transporta normalmente un sitio de replicación, así como secuencias de marcaje que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, de este modo, proporciona medios para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados, o u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o ser modificados para contener, promotores que se pueden utilizar por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados de pBR322 utilizados para la expresión de anticuerpos concretos se describen en detalle en Carter et al., U.S. Patent
No. 5,648,237.

Además, los vectores de fagos que contienen replicón y secuencias de control que son compatibles con el microorganismo huésped se pueden utilizar como vectores transformantes en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, se puede utilizar un bacteriófago como \lambdaGEM.TM.-11 en la fabricación de un vector recombinante que se puede utilizar para transformar células huéspedes susceptibles, tales como E. coli LE392.

El vector de expresión de la presente invención puede comprender dos o más parejas promotor-cistrón, que codifican cada uno de los componentes polipeptídicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida localizada en dirección 5' con respecto al cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas se clasifican normalmente en dos clases, inducible y constitutivo. El promotor inducible es un promotor que inicia mayores niveles de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a los cambios en la condición del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.

Se conoce una gran cantidad de promotores reconocidos por una serie de células huésped potenciales. El promotor seleccionado se puede unir operativamente a ADN de cistrón que codifica la cadena ligera o pesada mediante la extracción del promotor del ADN de origen a través de la digestión con enzima de restricción y la inserción de la secuencia del promotor aislada en el vector de la presente invención. Se pueden utilizar tanto la secuencia del promotor nativo como de promotores heterólogos para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, ya que permiten en general una mayor transcripción y rendimientos más elevados del gen diana expresado en comparación con el promotor de polipéptido diana nativo.

Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, sistemas de promotores de la \beta-galactamasa y lactosa, un sistema de promotores de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac o el promotor trc. Sin embargo, también son adecuados otros promotores que son funcionales en las bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos). Se ha publicado sus secuencias de nucleótidos, permitiendo así a un técnico unirlas a cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada diana (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

En un aspecto de la presente invención, cada cistrón en el vector recombinante comprende un componente de la secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de la membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN polipeptídico diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el objetivo de la presente invención debería ser aquella que es reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en secuencias líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina II (STII) estable al calor, LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realización de la presente invención, las secuencias señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal STII o variantes de la misma.

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En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la presente invención puede tener lugar en el citoplasma de la célula huésped, y, por tanto, no requiere la presencia de secuencias señal de secreción en cada cistrón. En este aspecto, se expresan las cadenas ligera y pesada de las inmunoglobulinas, se pliegan y se ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales en el citoplasma. Ciertas cepas huésped (por ejemplo, las cepas trx-B de E. coli) proporcionan condiciones del citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiendo así el pliegue y ensamblaje correctos de subunidades de proteínas expresadas. Proba y Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

La presente invención proporciona un sistema de expresión en el que la proporción cuantitativa de los componentes del polipéptido expresado se puede modular con el fin de maximizar el rendimiento de los anticuerpos secretados y correctamente ensamblados de la invención. Dicha modulación se lleva a cabo como mínimo en parte mediante la modulación simultánea de fuerzas traduccionales para los componentes del polipéptido.

Una técnica para modular la fuerza traduccional se describe en Simmons et al., Patente de Estados Unidos. No. 5,840,523. Utiliza variantes de la región de inicio de la traducción (TIR) en un cistrón. Para una TIR determinada, se puede crear una serie de variantes de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos con un intervalo de fuerzas traduccionales, proporcionando así un medio conveniente por el cual ajustar este factor al nivel de expresión deseado de la cadena específica. Las variantes de TIR se pueden generar mediante técnicas de mutagénesis convencionales que dan lugar a cambios de codones que pueden alterar la secuencia de aminoácidos, aunque se prefieren cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos. Las alteraciones en la TIR pueden incluir, por ejemplo, alteraciones en el número o espaciado de las secuencias Shine-Dalgarno, junto con alteraciones en la secuencia señal. Un método para generar secuencias señal mutantes es la generación de un "banco de codones" en el inicio de una secuencia codificante que no cambia la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (es decir, los cambios son silenciosos). Esto se puede conseguir mediante el cambio de la tercera posición de nucleótidos de cada codón; adicionalmente, algunos aminoácidos, tales como leucina, serina y arginina, tienen múltiples primeras y segundas posiciones que pueden añadir complejidad en la fabricación del banco. Este método de mutagénesis se describe en detalle en Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.

Preferiblemente, se genera un conjunto de vectores con un intervalo de fuerzas TIR para cada cistrón en el mismo. Este conjunto limitado proporciona una comparación de los niveles de expresión de cada cadena, así como el rendimiento de los productos de anticuerpo deseados bajo varias combinaciones de fuerza de TIR. Las fuerzas de TIR se pueden determinar mediante la cuantificación del nivel de expresión de un gen informador tal como se describe en detalle en Simmons et al. Patente de Estados Unidos No. 5, 840,523. En base a la comparación de la fuerza traduccional, las TIR individuales deseadas se seleccionan para combinarse en las construcciones de vectores de expresión de la presente invención.

Entre las células huésped procariotas adecuadas para expresar anticuerpos de la presente invención se incluyen Archaebacteria y Eubacteria, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilli (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacteria, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. En una realización, se utilizan células Gram-negativas. En una realización, se utilizan células E. coli como huéspedes para la invención. Ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pág. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27,325) y derivados de la misma, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac Iq lacL8 \DeltaompT\Delta(nmpc-fepE) degP41 kan^{R} (Patente de Estados Unidos No. 5,639,635). También están disponibles otras cepas y derivados de la misma, tales como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli_{\lambda} 1776 (ATCC 31,537) y E. coli RV308 (ATCC 31,608). Estos ejemplos so más ilustrativos que limitantes.

Los métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente que tienen genotipos definidos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). En general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, como huésped se pueden utilizar de forma adecuada las especies E. coli, Serratia, o Salmonella cuando se utilizan plásmidos conocidos, tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para suministrar el replicón. Habitualmente la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas y se pueden incorporar de manera deseable inhibidores de proteasas adicionales en el cultivo celular.

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Producción de anticuerpos

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medio nutriente convencional según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transformación significa introducir ADN en el huésped procariota, de manera que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o mediante integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro de calcio se utiliza en general para células bacterianas que contienen barreras de paredes celulares sustanciales. Otro método para la transformación utiliza polietilenglicol/DMSO. Otra técnica utiliza es la electroporación.

Las células procariotas utilizadas para producir los polipéptidos de la presente invención se desarrollan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Entre los ejemplos de medios adecuados se incluyen caldo de luria (LB) más suplementos de nutrientes necesarios. En algunas realizaciones, el medio también contiene un agente de selección, elegido en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina al medio para el crecimiento de células que expresan el gen de resistencia a ampicilina.

También se pueden incluir en las concentraciones apropiadas cualquier suplemento necesario además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico introducidos solos o como una mezcla con otro suplemento medio, tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las células huésped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varía de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 39ºC, más preferiblemente de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 37ºC, incluso más preferiblemente a aproximadamente 30ºC. El pH del medio puede ser cualquier pH que varía desde aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli, el pH es preferiblemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y más preferiblemente aproximadamente 7,0.

Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión de la presente invención, se induce la expresión de proteínas bajo condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la presente invención, los promotores PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos. Por consiguiente, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato para la inducción. Preferiblemente, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Se puede utilizar un conjunto de otros inductores, según la construcción de vector utilizada, tal como se conoce en la técnica.

En una realización, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en el periplasma y se recuperan del periplasma de las células huésped. La recuperación de proteínas implica habitualmente la ruptura del microorganismo, generalmente mediante medios, tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez se han roto las células, se pueden eliminar la debris celular o las células completas mediante centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía por afinidad de resina. Alternativamente, las proteínas se pueden transportar en el medio de cultivo y aislarse en el mismo. Las células se pueden extraer del cultivo y el sobrenadante de cultivo se filtra y concentra para una purificación posterior de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se pueden aislar posteriormente e identificarse utilizando métodos conocidos habitualmente, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.

En un aspecto de la presente invención, la producción de anticuerpos se realiza en grandes cantidades mediante un proceso de fermentación. Existen varios procedimientos de fermentación a gran escala de alimentación por lotes para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente aproximadamente 1.000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan impulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbono/energía preferida). La fermentación a escala pequeña se refiere en general a la fermentación en un fermentador que no tiene más de 100 litros de capacidad volumétrica, y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas se inicia habitualmente después de que las células hayan crecido bajo condiciones adecuadas hasta una densidad deseada, por ejemplo, DO550 de aproximadamente 180-220, en cuya fase las células se encuentran en una fase estacionaria inicial. Se pueden utilizar un conjunto de inductores, según la construcción de vector utilizada, tal como se conoce en la técnica y se ha descrito anteriormente. Las células se pueden desarrollar durante periodos de tiempo más cortos antes de la inducción. Las células se inducen habitualmente durante aproximadamente 12-50 horas, aunque se pueden utilizar una inducción de tiempo más larga o más corta.

Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la presente invención, se pueden modificar varias condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje correcto y el pliegue de los polipéptidos anticuerpo secretados, se pueden utilizar vectores adicionales que sobreexpresan proteínas chaperonas, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis,trans-isomerasa con actividad de chaperona) para co-transformar las células huésped procariotas. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan el correcto pliegue y la solubilidad de proteínas heterólogas producidas en células huésped bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos No. 6,083,715; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos No. 6,027,888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son proteolíticamente sensibles), se pueden utilizar ciertas cepas huésped deficientes en enzimas proteolíticas para la presente invención. Por ejemplo, las cepas de células huésped se pueden modificar para realizar una mutación o mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas, tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas de E. coli deficientes en proteasa están disponibles y se describen en, por ejemplo, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos No. 5,264,365; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos No. 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

En una realización, las cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas se utilizan como células huésped en el sistema de expresión de la presente invención.

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Purificación de anticuerpos

En una realización, la proteína anticuerpo producida se purifica adicionalmente para obtener preparaciones que sin sustancialmente homogéneas para ensayos y usos posteriores. Se pueden utilizar métodos de purificación de proteínas estándar conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, "chromatofocusing", SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, se utiliza la proteína A inmovilizada en una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad de los productos anticuerpos de longitud completa de la presente invención. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureas que se une con una gran afinidad a la región Fc de los anticuerpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida a la que se inmoviliza la proteína A es preferiblemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferiblemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento por prevenir la adherencia no específica de contaminantes.

Como primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo celular tal como se ha descrito anteriormente, se aplica a la proteína A inmovilizada en la fase sólida para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la proteína A. A continuación, la fase sólida se lava para eliminar contaminantes no unidos específicamente a la fase sólida. Finalmente el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida mediante elución.

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Generación de anticuerpos utilizando células huésped eucariotas

Entre los componentes del vector se incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

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(i) Componente secuencia señal

Un vector para usar en una célula huésped eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específica en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduros de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es la que es reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula huésped. En la expresión de células de mamíferos, se disponen las secuencias señal de mamíferos, así como las secuencias líderes secretoras víricas, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex.

El ADN para dicha región de precursor está ligada en el marco de lectura a ADN que codifica el anticuerpo.

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(ii) Origen de replicación

Generalmente, no es necesario un componente origen de replicación para vectores de expresión de mamíferos. Por ejemplo, el origen SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor temprano.

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(iii) Componente de gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, cuando sea pertinente, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman de forma satisfactoria con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y sobreviven de esta manera al régimen de selección. Algunos ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identificaron por primera vez mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza la DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, se pueden seleccionar células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable, tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH), mediante el crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase la Patente de Estados Unidos No. 4.965.199.

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(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico del polipéptido anticuerpo. Prácticamente, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en dirección 5' desde el sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión eucariotas.

La transcripción de polipéptidos anticuerpos de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviario, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus del Simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. En la Patente de Estados Unidos No. 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamíferos que utiliza el virus de papiloma bovino como vector. En la Patente de Estados Unidos No. 4.601.978 se describe una modificación de este sistema. Véase también Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) en la expresión de ADNc de \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus de herpes simplex. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus de sarcoma de rous se puede utilizar como promotor.

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(v) Componente elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido anticuerpo de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa frecuentemente mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente, se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de células eucariotas. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv. Nature 297:17-18 (1982) en elementos de potenciación para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en la posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del polipéptido anticuerpo, pero se localiza preferiblemente en un sitio 5' del promotor.

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(vi) Componente de la terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas también contendrán habitualmente las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5', y alguna vez desde 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase WO 94/11026 y el vector de expresión descrito en la misma.

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(vii) Selección y transformación de células huésped

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células eucariotas superiores, descritas en la presente invención, incluyendo células huésped de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Entre los ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos útiles están la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo y se cultivan en un medio con nutrientes habituales modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

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(viii) Cultivo de células huésped

Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo de la presente invención se puede cultivar en una serie de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195 o la Patente de Estados Unidos Re. 30.985, se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), soluciones tampón (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente en concentraciones finales a nivel micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede también incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán obvias para un técnico habitual.

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(ix) Purificación de anticuerpo

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, la debris particulada, ya sea células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpos preparada a partir de células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo ésta última la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isótopo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas humanas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 (Lindmark et al., J. Immunol Meth 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isótopos de ratón y para \gamma3 humanas (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero se disponen de otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permite mayores velocidades de flujo y tiempos de procesado más cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J.T. Baker Philipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-Sefarosa^{TM}, cromatografía en una resina de intercambio de anión o catión (tal como una columna de ácido poliaspártico), "chromatofocusing", SDS-PAGE y precipitación con sulfato amónico también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

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Tras cualquier etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se pueden someter a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente a concentraciones de sales bajas (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).

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Ensayos de actividad

Los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica.

Las inmunoglobulinas purificadas se pueden caracterizar adicionalmente mediante una serie de ensayos que incluyen, pero sin limitación, secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida a presión elevada (HPLC), exclusión por tamaño no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.

En ciertas realizaciones de la presente invención, las inmunoglobulinas producidas aquí se analizan por su actividad biológica. En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas de la presente invención se analizan por su actividad de unión a antígeno. Los ensayos de unión a antígeno que son conocidos en la técnica y que se pueden utilizar aquí incluyen sin limitación cualquier ensayo de unión directa o competitiva utilizando técnicas, tales como transferencias western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoadsorbente unido a enzima), inmunoensayos de "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, e inmunoensayos de proteína A. A continuación en los ejemplos, se proporciona un ensayo de unión a antígeno ilustrativo.

En una realización, la presente invención contempla un anticuerpo alterado que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que lo hace un candidato deseado para muchas aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es muy importante, aunque ciertas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. En ciertas realizaciones, las actividades de Fc de la inmunoglobulina producida se miden para asegurar que se mantienen sólo las propiedades deseadas. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo se pueden realizar para confirmar la reducción/agotamiento de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) se pueden realizar para asegurar que el anticuerpo carece de la unión FcyR (por tanto, que probablemente carece de actividad ADCC), pero mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan sólo Fc\gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad CDC. Para evaluar la activación de complemento, se puede realizar una activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). La unión a FcRn y las determinaciones de purificación/vida media in vivo también se pueden realizar utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección de Ejemplos.

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Anticuerpos humanizados

La presente invención comprende anticuerpos humanizados. Se conocen en la técnica varios métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "importados", que habitualmente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. A continuación, la secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta como armazón ("framework") humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza un armazón particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo armazón se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).

Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que muestran y visualizan probables estructuras de conformaciones tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir del receptor y secuencias importadas, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseado, tal como una mayor afinidad para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.

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Variantes de anticuerpos

En un aspecto, la presente invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende modificaciones en la interfase de los polipéptidos Fc que comprende la región Fc, donde las modificaciones facilitan y/o inducen a la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fc y una cavidad en un segundo polipéptido Fc, donde la protuberancia es posicionable en la cavidad para inducir la formación de complejos entre el primer y segundo polipéptido Fc. Los métodos de generación de anticuerpos con estas modificaciones son conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,731,168.

En algunas realizaciones, se contempla la modificación o modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos aquí. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/O inserciones y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución consigue llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo sujeto en el momento en que se produce la secuencia.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son posiciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por rastreo de alanina", tal como se describe por Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas posiciones de aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación mediante la introducción de variantes adicionales u otras en los sitios de sustitución o para los mismos. De este modo, mientras que el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar la acción de una mutación en un sitio determinado, se realiza la mutagénesis de rastreo de alanina o aleatorio en el codón o región diana y se criban las variantes las inmunoglobulinas expresadas por la actividad deseada.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi terminales que varían de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencias de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N o C terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en el suero.

Otro tipo de variante es una variante por sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo sustituida por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en la FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 2 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones", en la Tabla 2 o tal como se describe posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, y cribar los productos.

TABLA 2

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Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hélice o lámina, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar según las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pág. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):

(1): no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2): polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3): ácidos: Asp (D), Glu (E)

(4): básicos: Lys (K), Arg (R), His (H).

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Alternativamente, los residuos naturales se pueden dividir en grupos en base a las propiedades comunes de la cena lateral:

(1): hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrofílico neutro: cys, ser, thr; Asn, Gln;

(3): ácido: asp, glu;

(4): básico: his, lys, arg;

(5): residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6): aromáticos: trp, tyr, phe.

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Las sustituciones no conservativas comprenderán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservativos).

Un tipo de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Los anticuerpos generados de esta manera se expresan a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetados en cada partícula. A continuación, las variantes expresadas en el fago se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en la presente invención. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede aplicar la mutagénesis por rastreo de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura del cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos próximos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente invención. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente invención y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes para un desarrollo posterior.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en las secuencias de aminoácidos naturales) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida de sitio), la mutagénesis de PCR y la mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser deseable para introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fc de los polipéptidos inmunoglobulina de la presente invención, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que incluyen la de una cisteína bisagra.

Según esta descripción y los conocimientos de la técnica, se contempla que en algunas realizaciones, un anticuerpo utilizado en los métodos de la presente invención puede comprender una o más alteraciones en comparación con el anticuerpo homólogo de tipo salvaje, por ejemplo, en la región Fc. Estos anticuerpos, sin embargo, mantendrían sustancialmente las mismas características requeridas para la utilidad terapéutica en comparación con su homólogo de tipo salvaje. Por ejemplo, se cree que se pueden realizar ciertas alteraciones en la región Fc que daría lugar a una unión C1q alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC), por ejemplo, tal como se describe en WO99/51642. Véase también Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Patente de Estados Unidos No. 5,648,260; Patente de Estados Unidos No. 5,624,821; y WO94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

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Inmunoconjugados

La presente invención también se refiere a inmunoconjugados o conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para la liberación local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; Patente de Estados Unidos No 4,975,278), teóricamente permite la liberación dirigida de fragmentos de fármacos a los tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes fármacos no conjugados puede dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad en células normales, así como en las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). De este modo se busca la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Se ha descrito que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato, y vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas, tales como toxina de difteria, toxinas de plantas, tales como ricina, toxinas de molécula pequeña, tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden realizar sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado anticuerpo-radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgG1 murino dirigido contra el antígeno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y radioisótopos ^{111}In o ^{90}Y unidos por un enlazador-quelante de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN presenta actividad contra el Linfoma no de Hodgkin (NHL) de células B, la administración da lugar a citopenias severas y prolongadas en la mayoría de pacientes. MYLOTARG^{TM} (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuestos de anticuerpo CD33 hu unido a caliqueamicina, se aprobó en el 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patente de Estados Unidos No 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo C242 hu unido a través de un enlazador disulfuro SPP al fragmento de fármaco de maitansinoide, DM1, está avanzando en las pruebas en la Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo monoclonal para el antígeno de membrana específico antipróstata (PSMA) unido a un fragmento de fármaco de maitansinoide, DM1, se encuentra en desarrollo para el potencial tratamiento de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos a Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específico a Cd30 en tumores hematológicos) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) y se encuentran bajo desarrollo terapéutico.

Anteriormente se han descrito agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos inmunoconjugados. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un conjunto de radionucleidos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitella et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026.

También se contemplan en la presente invención conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteceno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tiene actividad de toxina.

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Maitansina y maitansinoides

En una realización, se conjuga un anticuerpo de la presente invención (longitud completa o fragmentos) a una o más moléculas maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto Maytenus serrata del África del este (Patente de Estados Unidos No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol (Patente de Estados Unidos No. (4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348;
4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.

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Conjugados maitansinoide-anticuerpo

En un intento por mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado a anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado como DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorectal humano. Se observó que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células del cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumores in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que se conjugó un maitansinoide a través de un enlace disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado Ta.1-maitansinoide se ensayó in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 10^{5} antígenos de la superficie de HER-2 por célula. El fármaco conjugado consiguió un grado de citotoxicidad similar al del fármaco maitansinoide libre, que se podía incrementar mediante el incremento del número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una citotoxicidad sistémica baja en ratones.

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Conjugados (inmunoconjugados) de anticuerpo-maitansinoide

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante la unión química de un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo han mostrado una eficacia en el aumento de la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo aumentara la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y se pueden sintetizar mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se describen maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 y en las otras publicaciones de patente y no patente referidas anteriormente aquí. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de maitansinol.

Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la técnica para fabricar conjugados anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 B1, y Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a esterasa, tal como se describe en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter.

Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden fabricar utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como, dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como, bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]), y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede estar formado por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede tener lugar en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.

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Caliqueamicina

Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, véase las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; y 5,877,296 (todas de la American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación, \gamma_{1}^{1}, \alpha_{2}^{1}, \alpha_{3}^{1}, N-acetil-\gamma_{1}^{1}, PSAG, y \theta_{1}^{1} (Hinman et al, CancerRes 53: 3336-3342 (1993); Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos mencionadas anteriormente de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral al que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos aumenta ampliamente sus efectos citotóxicos.

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Otros agentes citotóxicos

Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente invención incluyen BCNU, estrepzoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (patente de Estados Unidos 5,877,296).

Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desorribonucleasa; ADNasa).

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Existe un conjunto de isótopos radioactivos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32}, Pb^{212} e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el conjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios centellográficos, por ejemplo tc^{99m} o I^{123}, o un marcador de spin para la obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los radiomarcadores u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado de varias maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar mediante la síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores, tales como, tc^{99m} o I^{123}, Re^{186}, Re^{188} e In^{111} se pueden unir mediante un residuo de cisteína en el péptido. El ytrio-90 se puede unir mediante un residuo de lisina. El método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. "Monoclonal antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden fabricar utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador separable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 ; Patente de Estados Unidos No. 5,208,020).

Los compuestos de la presente invención contemplan expresamente, pero sin limitación, ADC preparado con reactivos interenlazadores: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) que está disponible comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Véase las páginas 467-495, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

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Preparación de conjugados anticuerpo-fármaco

En los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la presente invención, se conjuga un anticuerpo (Ab) a uno o más fragmentos de fármacos (D), por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 fragmentos de fármacos por anticuerpo, a través de un enlazador (L). EL ADC de fórmula I se puede preparar mediante varias rutas, utilizando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por un experto en la materia, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente para formar Ab-L, a través de un enlace covalente, seguido de una reacción con un fragmento de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de un fragmento de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido de la reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo.

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Ab-(L-D)_{p} I

Entre los grupos nucleofílicos en los anticuerpos se incluyen, pero sin limitación: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) hidroxilo o grupos amina de azúcares a donde el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en los fragmentos de enlazador y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS. Ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de acilo; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos presentan disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, puntes de cisteína. Los anticuerpos se pueden volver reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína formará por tanto, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleofílicos adicionales se pueden introducir en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dado lugar a la conversión de una amina en tiol.

Los conjugados anticuerpo-fármaco de la presente invención también se pueden producir mediante la modificación del anticuerpo para introducir grupos electrofílicos, los cuales pueden reaccionar con los sustituyentes nucleofílicos en el reactivo enlazador o fármaco. Los azúcares anticuerpos glicosilados se pueden oxidar, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o fragmentos de fármacos. Los grupos resultantes de base de Schiff iminas pueden formar una unión estable, o se pueden reducir, por ejemplo, mediante reactivos de borohidruro para formar uniones amina estables. En una realización, la reacción de la parte de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato sódico puede producir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realización, las proteínas que contienen los residuos serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con met-peryodato sódico dando lugar a la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Dicho aldehído puede reaccionar con un nucleófilo de fragmento de fármaco o enlazador.

Así mismo, los grupos nucleofílicos en un fragmento de fármaco incluye, pero sin limitación: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en grupos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de acilo; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida.

Alternativamente, se puede fabricar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y un agente citotóxico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado ya estén adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el premarcaje de un tumor, en la que se administra el conjugado anticuerpo-receptor al paciente, seguido de la extracción del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente purificador y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidita) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleido).

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Derivados de anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invención se puede modificar adicionalmente para contener grupos no proteináceos que son conocidos en la técnica y fácilmente disponibles. Preferiblemente, los grupos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Entre los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua se incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilen glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), polivinil alcohol, y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede presentar ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puedes ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo pueden variar, y si se unen más de un polímeros, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización se pueden determinar en base a las consideraciones que incluyen, pero sin limitación, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se utilizará bajo condiciones definidas, etc.

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Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente invención se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras formulaciones en seco. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabens, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concreta a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de forma adversa entre sí. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.

Los principios activos también pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización entre fases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles

Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros, tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico liberan las moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el organismo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos apropiados y el desarrollo de composiciones específicas de la matriz de polimérica.

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Usos

Un anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en, por ejemplo, métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar como antagonista para bloquear parcial o totalmente la actividad de antígeno específica in vitro, ex vivo y/o in vivo. Además, por lo menos algunos de los anticuerpos de la presente invención pueden neutralizar la actividad de antígeno de otra especie. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar para inhibir una actividad de antígeno específica, por ejemplo, en un cultivo celular, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene el antígeno, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen el antígeno con el que un anticuerpo de la presente invención reacciona de forma cruzada (por ejemplo, chimpancé, babuíno, marmoset, cynomolgus y rhesus, cerdo o ratón). En una realización, el anticuerpo de la presente invención se puede utilizar para inhibir actividades de antígeno mediante el contacto del anticuerpo con el antígeno, de manera que se inhibe la actividad de antígeno. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteica humana.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en un método para inhibir un antígeno en un sujeto que sufre de un trastorno en el que la actividad de antígeno es perjudicial, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la presente invención, de manera que se inhibe la actividad de antígeno en el sujeto. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteica humana y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el que se une un anticuerpo de la presente invención. El sujeto puede ser un mamífero en el que se ha introducido el antígeno (por ejemplo, mediante la administración del antígeno o mediante la expresión de un transgén de antígeno). Un anticuerpo de la presente invención se puede administrar a un sujeto humano para fines terapéuticos. Además, se puede administrar un cuerpo de la presente invención a un mamífero no humano que expresa un antígeno con el que la inmunoglobulina reacciona de forma cruzada (por ejemplo, un primate un cerdo o un ratón) para fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, ensayos de dosis y evolución con el tiempo de la administración). Entre los anticuerpos de bloqueo de la presente invención que son terapéuticamente útiles se incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, anticuerpos anti-HER2, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CD11, anti-interferón y anti-factor tisular. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar para trata, inhibir, retrasar la progresión, evitar/retrasar la reaparición, mejorar o evitar enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la expresión anormal y/o actividad de uno o más moléculas de antígeno, incluyendo, pero sin limitación, tumores malignos y benignos; tumores no de leucemia y tumores linfoides; trastornos neuronal, glial, astrocital, hipotalámico y otros trastornos glandulares, macrofágico, epitelial, estromal y blastocoélico; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

En un aspecto, un anticuerpo de bloqueo de la presente invención es específico para un antígeno ligando e inhibe la actividad de antígeno mediante el bloqueo o interferencia con la interacción ligando-receptor que implica al antígeno ligando, inhibiendo de este modo el correspondiente mecanismo de la señal y otros sucesos moleculares o celulares. La presente invención también caracteriza los anticuerpos específicos de receptores que no evitan necesariamente la unión a ligando, pero interfieren con la activación del receptor, inhibiendo de este modo cualquier respuesta que normalmente se iniciaría por la unión a ligando. La presente invención también comprende anticuerpos que preferiblemente o exclusivamente se unen a complejos ligando-receptor. Un anticuerpo de la presente invención puede actuar también como agonista de un receptor antígeno particular, potenciando, aumentando o activando de este modo todas las actividades o parte de ellas de la activación del receptor mediada por ligando.

En ciertas realizaciones, se administra al paciente un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado y/o antígeno al que se une es internalizado por la célula, dando lugar a un aumento de la eficacia terapéutica del inmunoconjugado en la citólisis de la célula diana a la que se une. En una realización, el agente citotóxico reconoce o interfiere con el ácido nucleico en la célula diana. Ejemplos de dichos agentes citotóxicos incluyen cualquier agente quimioterapéutico indicado en la presente invención (tal como un maitansinoide o una caliqueamicina), un isótopo radioactivo o una ribonucleasa o una ADN endonucleasa.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar solos o combinados con otras composiciones en terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención se puede coadministrar con otro anticuerpo, agente o agentes quimioterapéuticos (incluyendo cócteles de agentes quimioterapéuticos), otro agente o agentes citotóxicos, un agente o agentes anti-angiogénicos, citoquinas y/o un agente o agentes inhibidores del crecimiento. Cuando un anticuerpo de la presente invención inhibe el crecimiento tumoral, puede ser particularmente deseable combinarlo con uno o más agentes terapéuticos que también inhiben el crecimiento tumoral. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención se puede combinar con un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, AVASTIN) y/o anticuerpos anti-ErbB (por ejemplo, el anticuerpo anti-HER2 HERCEPTIN ®) en una pauta de tratamiento, por ejemplo, en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas aquí, incluyendo cáncer colorrectal, cáncer de mama metastático y cáncer de riñón. Alternativamente, o adicionalmente, el paciente puede recibir una terapia por radiación combinada (por ejemplo, radiación de rayos externos o terapia con un agente marcado radioactivamente, tal como un anticuerpo). Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente incluyen la administración combinada (donde dos o más agentes están incluidos en la misma formulación o formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la presente invención puede tener lugar antes y/o después de la administración de la terapia o terapias adjuntas.

El anticuerpo de la presente invención (y el agente terapéutico adjunto) se administran mediante cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para el tratamiento local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra de manera adecuada mediante infusión por pulsos, particularmente con dosis de crecientes de anticuerpo. La dosificación puede ser mediante cualquier ruta adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

La composición de anticuerpos de la presente invención se formulará, dosificará y administrará de un modo consistente con la buena práctica médica. Los factores para la consideración en este contexto incluyen el trastorno concreto a tratar, el mamífero específico a tratar, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, las pautas de administración, y otros factores conocidos para los médicos. El anticuerpo no necesita, pero se puede formular opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para evitar o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención presentes en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores descritos anteriormente. Éstos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las rutas de administración, tal como se utilizan aquí anteriormente, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis utilizadas aquí anteriormente.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la presente invención (cuando se utiliza solo o combinado con otros agentes, tales como agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administrar para fines preventivos o terapéuticos y la discreción del médico. El anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente de una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar desde aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que tenga lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis de ejemplo del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. De este modo, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de manera que el paciente recibe desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial más elevada, seguida de una o más dosis inferiores. Una pauta de dosificación de ejemplo comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

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Artículos de fabricación

Se describe un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición eficaz para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indican que la composición se utiliza para el tratamiento de la enfermedad de elección, tal como cáncer. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo de la presente invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un agente citotóxico adicional. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto que indica que la primera y segunda composiciones de anticuerpo se pueden utilizar para tratar una enfermedad particular, por ejemplo, el cáncer. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

A continuación, se indican ejemplos de los métodos y composiciones de la presente invención. Se entiende que se pueden realizar varias realizaciones, teniendo en cuenta la descripción general proporcionada anteriormente.

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Ejemplos Materiales y procedimientos

El número de residuos es según Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Se utilizan abreviaturas de aminoácidos de una sola letra. Se representan las degeneraciones de ADN utilizando el código TUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T,
V = A/C/G, B = C/G/T, H = A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = G/T).

Injertos directos en la región hipervariable en el armazón consenso humano aceptor - El fagémido utilizado para este trabajo es un vector de expresión Fab-g3 monovalente (pV0350-2B) que tiene 2 marcos de lectura abiertos bajo el control del promotor phoA, esencialmente tal y como se describe en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93. El primer marco de lectura abierto consiste en la secuencia señal stII fusionada a los dominios VL y CH1 de la cadena ligera aceptora y el segundo consiste en la secuencia señal stII fusionada a los dominios VL y CH1 de la cadena pesada aceptora seguidos de una proteína P3 de recubrimiento del fago menor truncado. Ver Lee et al., supra.

Se alinearon los dominios VL y VH de 5D5 murino (ver hibridoma 5D5.11.6, Depósito ATCC Nº HB-11895, fecha de depósito 23 de mayo, 1995) con los dominios kappa I de consenso humano (huKI) y VH de consenso del subgrupo III humano (huIII). Para fabricar el injerto HVR, se utilizó el armazón de VH aceptor, que difiere del dominio VH de consenso del subgrupo III humano en 3 posiciones: R71A, N73T, y L78A (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)). Se diseñaron regiones hipervariables del anticuerpo 5D5 murino (mu5D5) en el armazón consenso humano aceptor para generar un injerto HVR directo de 5D5 (injerto 5D5). En el dominio VL se injertaron las siguientes regiones al aceptor consenso humano: posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3). En el dominio VH, se injertaron las posiciones 26-35 (H1), 49-65 (H2) y 95-102 (H3) (Figura 1).

Se generaron variantes de injerto directo mediante mutagénesis de Kunkel utilizando un oligonucleótido separado para cada región hipervariable. Se valoraron los clones correctos mediante la secuenciación de ADN.

Aleatorización suave de las regiones hipervariables - Se introdujo diversidad de secuencia en cada región hipervariable utilizando una estrategia de aleatorización suave que mantiene una tendencia hacia la secuencia de la región hipervariable murina. Se llevó a cabo utilizando una estrategia de síntesis de oligonucleótido envenenada tal y como describe Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994). Para una posición determinada en una región hipervariable a mutar, se envenena el codón que codifica el aminoácido de tipo salvaje con una mezcla 70-10-10-10 de nucleótidos que dan lugar a un índice de mutación promedio del 50% en cada posición.

Se establecieron oligonucleótidos con una aleatorización suave después de las secuencias de región hipervariable murinas y comprendían las mismas regiones definidas por los injertos directos de región hipervariable. La posición del aminoácido en el principio de H2 (posición 49) en el dominio VH, se limitó en la diversidad de secuencia a A, G, S o T mediante la utilización del codón RGC.

Generación de bibliotecas de fagos - Se fosforilaron por separado los grupos de oligonucleótidos aleatorizados diseñados para cada región hipervariable en seis reacciones de 20 \mul que contenían 660 ng de oligonucleótido, Tris 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM, DTT 20 mM, y 5 U de polinucleótido quinasa durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se combinaron los seis grupos de oligonucleótidos fosforilados con 20 \mug de plantilla Kunkel en Tris 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM en un volumen final de 500 \mul dando lugar a una proporción de oligonucleótido con respecto a la plantilla de 3. Se hibridó la mezcla a 90ºC durante 4 min, 50ºC durante 5 min y a continuación se enfrió en hielo. Se eliminó el oligonucleótido en exceso no hibridado con un kit de purificación QIAQUICK PCR (Qiagen kit 28106) utilizando un protocolo modificado para evitar la desnaturalización excesiva del ADN hibridado. A los 500 \mul de mezcla de hibridación, se añadieron 150 \mul de PB, y se dividió la mezcla entre 2 columnas de sílice. Después de un lavado de cada columna con 750 \mul de PE y una centrifugación extra para secar las columnas, se eluyó cada columna con 110 \mul de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8. A continuación, se llenó la plantilla hibridada y purificada (220 \mul) mediante la adición de 1 \mul de ATP 100 mM, 10 \mul de dNTPs 25 mM (25 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 15 \mul de DTT 100 mM, 25 \mul de 10X tampón TM (Tris 0,5 M pH 7,5, MgCl_{2} 0,1 M), 2400 U de T4 ligasa, y 30 U de T7 polimerasa durante 3 h a temperatura ambiente.

Se analizó el producto rellenado en geles de agarosa/Tris-Acetato-EDTA (Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)). Normalmente fueron visibles tres bandas: la banda inferior es un producto correctamente rellenado y ligado, la banda central es un producto rellenado pero no ligado, y la banda superior es un producto de hebra desplazada. La banda superior es producida por una actividad secundaria intrínseca de T7 polimerasa y es difícil de evitar (Lechner et al., J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983)); no obstante, esta banda transforma con una eficacia 30 veces menor que la banda inferior y normalmente contribuye poco a la biblioteca. La banda central es debida a la ausencia de un 5' fosfato para la reacción de unión final; esta banda transforma de manera eficiente y produce principalmente secuencia de tipo salvaje.

A continuación, se purificó el producto rellenado y se electroporó en células SS320 y se propagó en presencia de fago auxiliar M13/KO7 tal y como describen Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000). Los tamaños de biblioteca variaban de 1-2 x 10^{9} clones independientes. Se secuenciaron clones aleatorios a partir de las bibliotecas iniciales para valorar la calidad de las bibliotecas.

Elección de fagos - Se generó el receptor de HGF humano y se utilizó como una fusión a Fc (HGFR-Fc) (Mark et al., J. Biol. Chem. (1992), 267:26166-26171). Se cubrió HGFR-Fc en placas de microtitulación MaxiSorp (Nunc) a 5 \mug/ml en PBS. Durante la primera ronda de selección se utilizaron 8 pocillos diana; se utilizó un pocillo único diana para las rondas sucesivas de selección. Se bloquearon los pocillos durante 1 hora utilizando Casein Blocker (Pierce). Se recogieron los fagos del sobrenadante del cultivo y se suspendió en PBS que contenía BSA al 1% y TWEEN 20 al 0,05% (PBSBT). Después de unirse a los pocillos durante 2 h, se extrajo el fago no unido mediante un lavado extenso con PBS que contenía TWEEN 20 al 0,05% (PBST). Se eluyeron los fagos de unión mediante la incubación de los pocillos con HCl 50 mM, KCl 0,5 M durante 30 min. Se amplificó el fago utilizando células Top10 y fago auxiliar M13/KO7 y creció durante toda la noche a 37ºC en 2YT, carbanecilina 50 \mug/ml. Se compararon los títulos de fago eluído de un pocillo cubierto diana con los títulos de fago recuperado de un pocillo cubierto no diana para valorar el enriquecimiento.

Por maduración por afinidad, se clasificaron bibliotecas de fago utilizando un procedimiento de clasificación en solución. Se biotiniló HGFR-Fc mezclando 500 \mul de HGFR-Fc 3,6 mg/ml en PBS, y 10 \mul de fosfaro de potasio 1 M, pH 8 con 20 \mul de Sulfo-NHS-LC-biotina 4 mM (Pierce). Se purificó el HGFR-Fc biotinilado (b-HGFR-Fc) utilizando una columna NAP5 (Amersham Biosciences) en PBS. Se cubrieron pocillos de microtitulación con 10 \mug/ml de neutravidina en PBS durante toda la noche a 4ºC y a continuación se bloqueó durante 1 hora utilizando Casein Blocker (Pierce). En la primera ronda de barrido, se mezclaron 200 \mul de fago suspendido en PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST) y BSA al 1% con b-HGFR-Fc 10 nM durante 1 hora. Se capturaron los fagos unidos a b-HGFR-Fc en pocillos cubiertos con neutravidina durante 10 minutos y se lavaron los fagos no unidos con PBST. Se eluyeron los fagos utilizando HCl 20 mM, KCl 500 mM durante 45 minutos, se neutralizaron y se propagaron en células azules XL1 (Stratagene) en presencia de fago auxiliar KO7 (New England Biolabs). Se realizaron rondas posteriores de clasificación de forma similar con las siguientes excepciones: en la ronda 2 la concentración final de b-HGFR-Fc fue 5,6 nM, en la ronda 3 la concentración final de b-HGFR-Fc fue 0,1 nM, en la ronda 4 la concentración final de b-HGFR-Fc fue 0,5 nM y se añadió HGFR-Fc no biotinilado 780 nM a la mezcla durante 1 hora antes de la captura en neutravidina.

ELISA de fagos - Se cubrieron las placas de microtitulación MaxiSorp con HGFR-Fc humano a 5 \mug/ml en PBS durante toda la noche y a continuación se bloquearon con Casein Blocker. Se incubaron los fagos de los sobrenadantes de cultivo con HGFR-Fc diluido en serie en PBST que contenía BSA al 1% en una placa de microtitulación de cultivo de tejido durante 1 hora después de lo cual se transfirieron 80 \mul de la mezcla a los pocillos recubiertos diana durante 15 minutos para capturar los fagos no unidos. Se lavó la placa con PBST y se añadió anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 en PBST que contenía BSA al 1%) durante 40 min. Se lavó la placa con PBST y se reveló mediante la adición de sustrato de Tetrametilbenzidina (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Se representó la absorbancia a 405 nm como una función de concentración de diana en solución para determinar una IC_{50}. Esto se utilizó como la afinidad estimada para el clon Fab expresado en la superficie del fago.

Producción de Fab y determinación de la afinidad - Para expresar la proteína Fab para mediciones de afinidad, se introdujo un codón de parada entre la cadena pesada y g3 en el vector de expresión del fago. Se transformaron clones en células de E. coli 34B8 y crecieron en medios AP5 a 30ºC (Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Se recogieron las células mediante centrifugación, se suspendieron en Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8 y se abrieron rompiéndolas utilizando un microfluidizador. Se purificó Fab con cromatografía de afinidad de Proteína G.

Las determinaciones por afinidad se realizaron mediante resonancia de plasmón de superficie utilizando BIAcore^{TM}-2000. Se inmovilizó HGFR-Fc (-1000 unidades de respuesta (RU)) en un chip CM5 y se inyectaron concentraciones variadas de Fab en (de 4 a 500 nM) en PBST. Después de cada inyección se regeneró el chip utilizando HCl 100 mM. Se corrigió la respuesta de unión mediante la resta del RU de una celda de flujo como blanco. Se utilizó un modelo 1:1 de Languir de ajuste simultáneo de k_{on} y k_{off} para análisis cinéticos.

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Ensayo electro-quimiluminiscente para el bloqueo de OA5D5 de la unión HGF/cMet

Se biotiniló la proteína cMet-Ig purificada producida en Genentech (South San Francisco, CA) mediante la incubación con NHS-X-Biotina en exceso molar de 20 veces en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5 utilizando biotina-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH). Se marcó HGF de 2 cadenas humano purificado producido en Genentech con BV-TAG (cat # 110034) a través de química de NHS-éster según las indicaciones del fabricante (BioVeris International, Gaithersburg, MD). Se incubaron juntos cMet-Ig-biotina (500 ng/mL), HGF-Ruthenium Tag (250 ng/mL), y títulos de anticuerpo OA5D5 que varían de 3333 a 0,21 nM de anticuerpo en un volumen de 100 ul de diluyente de ensayo: PBS + BSA al 0,5%/Tween 20 al 0,5%/Proclin al 0,033% (Supelco Inc. Bellefonte PA). Se incubaron las mezclas en placas selladas de 96 pocillos de fondo redondo de polipropileno (Coming) durante 2-4 horas a temperatura ambiente con agitación. Se añadieron partículas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads, BioVeris). Después de una incubación final de 45 min con agitación vigorosa, se leyeron las placas utilizando un instrumento BioVeris M-Series (BioVeris International, Gaithersburg, MD).

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KIRA (Fosforilación de Met dependiente de HGF)

Se mantuvieron células A549 (ATCC, Manassas, VA) en medio de cultivo (F12 de Ham/DMEM 50:50 [Gibco, Grand Island, NY] que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, Sigma, St. Louis, MO). Para preparar células para el ensayo, se separaron las células de cultivos confluentes utilizando Accutase (ICN, Aurora, OH) y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 50.000 células por pocillo. Después de incubar durante la noche a 37ºC, se extrajo el medio de crecimiento y se privó de suero a las células durante 30-60 min en medio que contenía FBS al 0,1%. Para determinar la capacidad de OA-5D5 de inhibir la fosforilación de cMet, se diluyó en serie la molécula de 200 a 0,19 nM en medio +FBS al 0,1% y se añadió en las placas de ensayo. Después de una incubación de 15 min a 37ºC, se añadió HGF (50 ng/ml). A continuación, se incubaron las placas durante 10 minutos adicionales a 37ºC, se extrajeron los medios y se añadió tampón de lisis celular (Cell Signaling Technologies, Cat #9803, Beverly, MA; complementado con un cóctel de inhibidor de proteasas adquirido en Calbiochem, Cat #539131, San Diego, CA). Se analizaron los lisatos por c-Met fosforilado mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia utilizando un instrumento BioVeris M-Series (BioVeris International, Gaithersburg, MD). Se marcó un mAb anti-fosfotirosina (clon 4G10, Upstate, Lake Placid, MY) con BV-TAG mediante química NHS-éster según las indicaciones del fabricante (BioVeris). Se biotinilaron anticuerpos contra el dominio extracelular de c-Met utilizando biotina-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH). Se diluyeron el 4G10 marcado con BV-TAG y el mAb anti-c-Met biotinilado en tampón de ensayo (PBS/Tween-20 al 0,5%/BSA al 0,5%) y se añadió como un cóctel a los lisatos celulares. Después de 1,5-2 horas de incubación a temperatura ambiente con agitación enérgica, se añadieron partículas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads, BioVeris). Después de una incubación final de 45 min, se leyeron las placas en el instrumento de BioVeris.

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Cultivo celular y ensayo de proliferación

BaF3 es una célula linfoide dependiente de IL-3 murina que normalmente no expresa cMet y no responde a HGF. No obstante, en BaF3-hMet derivada mediante transfección con un ADNc normal de longitud completa para c-Met humano (Schwall et al., J. Cell Biol. (1996), 133:709-718), HGF estimula la proliferación y la supervivencia en ausencia de IL-3. Se pasaron las células BaF3-hMet y BaF3-neo de forma rutinaria en RPMI 1640, suero bovino fetal al 5%, \beta-mercaptoetanol 4 \mul/L, penicilina 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 \mug/ml, L-glutamina 2 mM, y medio condicionado con WEHI al 5% como una fuente de IL-3. Para medir la proliferación dependiente de HGF se cuantificó la cantidad de células después de 3 días de tratamiento mediante la adición de 25 \mul de Alarma Blue (Trek Diagnostic Systems; Cleveland, OH) y midiendo la intensidad de fluorescencia 6 horas después. Los experimentos de control fueron la proliferación de estas células en ausencia de HGF. Se pasaron las células H358-PSF2 y HGF-PSF8 en RPMI 1640, suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 \mug/ml, L-glutamina 2 mM. El medio de ensayo fue RPMI 1640 plus al 0,1%, BSA al 0,5%, o FBS al 10% respectivamente. Se realizó el ensayo tal y como se describe anteriormente.

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Inmunoprecipitación y transferencia Western

Las células H358 son una línea celular derivada de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano (NSCLC). Las células H358-PSF2, H358-PSF8 son células H358 transfectadas estables de HGF humanas (Tsao et al., Neoplasia, Vol. 2, No. 3, 2000), y se cultivaron en RPMI 1640, suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 \mug/ml, L-glutamina 2 mM. Se realizó la detección de la fosforilación de la tirosina de cMet esencialmente tal y como se describe previamente (Zioncheck, J Bio Chem, 270(28): 16871-8, 1995). En resumen, se pusieron las células en placas de 60 mm durante toda la noche, y se cambió el medio a RPMI 1640 que contenía BSA al 0,5%, antes de añadir las combinaciones con o sin HGF 1 nM o anticuerpo OA5D5.v2 competidor. Después de 10 min a 37ºC, se extrajo el medio y se lisaron las células utilizando tampón de lisis (NaCl 150 mM, MgC1_{2} 1,5 mM, Triton X-100 al 1%, 1x de cóctel inhibidor de proteasa, 1X de cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma, St. Louis, MO)). Después de centrifugar, se incubó el sobrenadante del lisato con anticuerpo policlonal IgG anti-cMet (c-28; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) unido a proteína G-Sefarosa durante 1 hora a 4ºC. Se lavaron los inmunocomplejos y se hirvieron en 1x de tampón de muestra, antes de la separación mediante SDS-PAGE y electrotransferencia a nitrocelulosa. Se visualizaron las proteínas que contenían fosfotirosina utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10; Upstate Biotechnology, Waltham, MA) seguido de Fab anti-ratón de cabra conjugado con HRP (1:10.000; Jackson Labs, West Grove, PA), y en el caso de cMet total utilizando anticuerpo c-28 (1:400; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) seguido de Fc-HRP anti-conejo de cabra (1:10.000; Jackson Labs, West Grove, PA) con detección de quimioluminiscencia.

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Estudio de xenoinjerto de tumor

Fueron inoculados subcutáneamente ratones hembra atímicos con 5 millones de células de carcinoma pancreático KP4. Cuando los tumores alcanzaron los 150-200 mm^{3}, se asignaron los ratones a 2 grupos de 10. El grupo 1 fue inyectado IP con vehículo dos veces por semana. El grupo 2 fue inyectado IP con OA5D5.v2, 30 mg/kg, dos veces por semana. Se midió el tamaño del tumor dos veces por semana. Se sacrificaron los ratones cuando el volumen del tumor excedió dos veces el volumen tumoral inicial, o si el tumor se ulceró.

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Resultados y discusión

Humanización de 5D5 - El armazón aceptor humano utilizado para la humanización de 5D5 comprende el dominio VL kappa I humano de consenso y una variante del del dominio VH de consenso del subgrupo III humano. El dominio VH variante tiene 3 cambios con respecto al consenso humano: R71A, N73T y L78A. Se alinearon los dominios VH y VL de 5D5 murino con los dominios kappa I y del subgrupo III humanos; se identificó cada HVR y a continuación se injertó en el armazón aceptor humano para generar un injerto de 5D5 que podría expresarse como un Fab en fago. Cuando se evaluaron los fagos que expresan el injerto de 5D5 por unión a HFGR-Fc inmobilizado, no se observó unión.

Se generó una biblioteca en la que se aleatorizó suavemente cada una de las regiones HVR del injerto 5D5. Esta biblioteca se cribó contra HGFR-Fc inmovilizado durante 4 rondas de selección. Se eligieron los clones para el análisis de secuencia de ADN y se reveló que sólo se había seleccionado un único clon. Este clon tenía un único cambio en el dominio VH en la posición 94 (R94S) justo fuera de la región prevista de HVR-H3 marcada para mutagénesis. El análisis de este clon mediante ELISA de fagos indicó que tenía una afinidad similar con la afinidad monovalente de 5D5 murino. Cuando se expresa como un Fab y se evalúa mediante Biacore, se determinó que el Kd era de 9,8 nM en comparación con 8,3 nM para la afinidad monovalente de 5D5 murino. De este modo, esta sustitución inesperada restablece la afinidad de unión completa al injerto 5D5, y el injerto 5D5 más R94S (hu5D5.v1) representa un anticuerpo completamente humanizado. De un modo interesante, se descubrió un aminoácido homólogo, treonina, en esta posición en el anticuerpo murino. MacCallum et al. (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) han analizado estructuras de cristal complejas de anticuerpo y antígeno y han descubierto que las posiciones 93 y 94 de la cadena pesada son parte de la región de contacto, de modo que parece razonable incluir estas posiciones en la definición de región hipervariable de H3 (HVR-H3) cuando se humanizan anticuerpos.

Maduración por afinidad de hu5D5.v1 - Para incrementar la afinidad de hu5D5.v1, se generaron seis bibliotecas de expresión en fagos en la base de hu5D5.v1, cada una dirigida a una única HVR para su aleatorización suave. Para evitar la re-selección de hu5D5.v1 a partir de una potencial base elevada de una plantilla de tipo salvaje, se introdujeron codones de parada en la HVR para mutarse antes de la generación de cada biblioteca. Se utilizó un procedimiento de clasificación en solución para mejorar la eficiencia del proceso de selección de fagos basado en la afinidad. Mediante la manipulación de la concentración diana biotinilada, la reducción del tiempo de captura de fago a bases inferiores y la adición de diana no biotinilada para eliminar clones con velocidades "off" más rápidas, pueden seleccionarse de manera muy competente clones de alta afinidad. Lee et al., supra. De la primera ronda de selección, se observó enriquecimiento (captura de fago dependiente de diana) sugiriendo que una gran cantidad de clones estaban presentes en cada biblioteca con una afinidad razonablemente alta por HGFR-Fc. Se incrementó el rigor de la selección (ver Procedimientos anteriores) en rondas posteriores y en la ronda 3 se combinaron las 6 bibliotecas para generar un séptimo grupo de bibliotecas. Después de 4 rondas de selección, se analizaron clones de cada uno de los 7 grupos de bibliotecas. Todos los clones en las bibliotecas que reconocían HVR-L1 y HVR-L3 fueron idénticos a hu5D5.v1; no obstante, se observaron nuevas secuencias en bibliotecas que reconocían HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 (Figura 2). El grupo de bibliotecas que consistía en la combinación de las 6 bibliotecas estaba dominado por las secuencias de la biblioteca de HVR-H3 sugiriendo que esas secuencias proporcionaban el mayor incremento en afinidad por HGFR-Fc (Figura 3). Se cribaron clones seleccionados mediante ELISA de fagos y a continuación se expresaron como proteína Fab y se determinaron sus afinidades utilizando Biacore. Diversos clones de la biblioteca combinada con cambios en HVR-H3 habían incrementado sus afinidades en comparación con la afinidad monovalente de hu5D5.v1 o de 5D5 murino (Figura 4). Estos clones tenían S/T en la posición 94, R/S en la posición 96 y T/S en la posición 100 y P/S/A en la posición 100a. El mejor clon, el clon 78 (hu5D5.v2) presentaba 3 cambios a partir de hu5D5.v1 (94T, 96R y 100T) y un incremento de afinidad de 13 veces.

De este modo, partiendo del injerto de las 6 HVRs de 5D5 murino en la estructura ("scaffold") aceptor humano, la expansión de HVR3 para incluir la posición 94 (Treonina) y la adición de 2 cambios en HVR-H3 conduce a un anticuerpo 5D5 completamente humano con afinidad de unión por HGFR incrementada 13 veces. Además, se ha determinado que anticuerpos humanizados seleccionados descritos en la presente invención tienen una actividad biológica por lo menos comparable con la del anticuerpo 5D5 parental, por ejemplo en ensayos de fosforilación de receptor, etc. (datos no mostrados).

Caracterización de un anticuerpo de la invención - Se caracterizaron anticuerpos anti-Met "de un brazo" (también referida como un "un brazo" y "OA"). Se evaluaron dos anticuerpos de la invención. Específicamente, el anticuerpo "OA-5D5.v2" comprendía un único brazo Fab que comprendía secuencias de dominio variable tal y como se describe en la Figura 13, donde se fusionaba el brazo Fab con una región de Fc, y donde la región de Fc era un complejo entre un polipéptido Fc que comprendía la secuencia de Fc descrita en la Figura 13 y un polipéptido Fc que comprendía la secuencia de Fc descrita en la Figura 14. Los anticuerpos se caracterizaron de la siguiente manera:

(1) En un ensayo para evaluar la capacidad de OA-5D5.v2 para bloquear la unión de HGF a su receptor, OA-5D5.v2 fue capaz de bloquear la unión de HGF a su receptor por lo menos al igual que dos anticuerpos de comparación - concretamente un anticuerpo de un brazo quimérico (que comprendía un brazo Fab del anticuerpo parental 5D5 murino (dominios variables descritos en la Figura 7) fusionados con una región Fc humana), y otro anticuerpo de la invención (OA-5D5.v1). Cuando se evaluó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 3333 a 0,21 nM, bajo condiciones tal y como se describen en la sección anterior Materiales y Procedimientos, se descubrió que OA-5D5.v2 tenía un valor de IC50 que era inferior en aproximadamente la mitad con respecto al de un anticuerpo de comparación, tal como el anticuerpo de un brazo quimérico y OA-5D5.v1. De manera destacable, OA-5D5.v1 también bloqueaba con mejor IC50 que el anticuerpo quimérico de referencia. Ver Figura 8.

(2) En un ensayo para evaluar la capacidad de OA-5D5.v2 de inhibir la activación del receptor de HGF, OA-5D5.v2 fue capaz de inhibir la activación del receptor de quinasa por lo menos al igual que los dos anticuerpos de comparación tal y como se describe en (1) anteriormente. Cuando se evaluó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 200 a 0,19 nM, bajo condiciones tal y como se describen en la sección anterior Materiales y Procedimientos, se descubrió que OA-5D5.v2 tenía una IC50 con un valor que era inferior en aproximadamente la mitad con respecto al de un anticuerpo de comparación, tal como el anticuerpo de un brazo quimérico y OA-5D5.v1. Ver Figura 9.

(3) También se evaluó OA-5D5.v2 por unión cruzada de especies entre humano, primate (macaco cangrejero), canino y murino (ratón). Se descubrió que OA-5D5.v2 se unía específicamente al receptor de HGF humano y de primate (macaco cangrejero), pero no a canino o murino (ratón). (datos no mostrados).

(4) Se evaluó OA-5D5.v2 por su capacidad de inhibir la proliferación celular en presencia de HGF. Tal y como se muestra en la Figura 10, OA-5D5.v2 inhibía la proliferación celular por lo menos al igual que su anticuerpo quimérico homólogo y OA-5D5.v1 (tal y como se describe en (1) anteriormente). Cuando se evaluó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,01 a 100 nM, bajo condiciones tal y como se describen en la sección anterior Materiales y Procedimientos, se descubrió que OA-5D5.v2 tenía un valor de IC50 que era inferior en aproximadamente la mitad con respecto al de un anticuerpo de comparación, tal como el anticuerpo de un brazo quimérico y OA-5D5.v1. Ver Figura 10. Se confirmó la unión específica de OA-5D5.v2 a las células transfectadas con Met mediante análisis FACs. (datos no mostrados).

(5) Se evaluó OA-5D5.v2 por su capacidad de inhibir la fosforilación de tirosina del receptor en presencia de HGF. Tal y como se muestra en las Figuras 11A y B, OA-5D5.v2 inhibía la fosforilación de tirosina del receptor cuando se evaluó a concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 10 a 1000 nM. Ver Fig. 11A y B.

(6) Se evaluaron OA-5D5.v2 por la eficacia in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor basado en una línea celular tumoral pancreática (KP4). Los resultados de este estudio de eficacia mostraron que el anticuerpo OA-5D5.v2 era capaz de inhibir y causar regresión de tumores in vivo. Tal y como se muestra en la Figura 12, hubo una pérdida completa de tumor en la mayoría de los animales tratados con el anticuerpo.

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Lista parcial de referencias

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Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

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Claims

1. Forma humanizada de un anticuerpo anti-c-met murino que comprende:

(a) por lo menos una secuencia HVR seleccionada del grupo que consiste en:

(i): HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A17, donde A1-A17 es KSSQSLLYTSSQKNYLA,

(ii): HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es WASTRES,

(iii): HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQYYAYPWT,

(iv): HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde D1-D10 es GYTFTSYWLH, y

(v): HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde E1-E18 es GMIDPSNSOTRFNPNFKD; y

(b) una variante HVR-H3 que comprende la secuencia TYRSYVTPLDY, SYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, SYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY o TYSSYVTALDY

donde la afinidad monovalente de dicho anticuerpo a c-met humana es mayor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de cadena ligera mostrada en la SEC ID NO: 9 y una secuencia variable de cadena pesada mostrada en la SEC ID NO: 10 y donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular dependiente de c-met mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostrada en las SEC ID NO:9 y 10 respectivamente.

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2. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde por lo menos una parte de la secuencia del armazón es una secuencia del armazón consenso humana.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una variante HVR-L2 que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 72.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una variante HVR-H2 que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 98.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende una HVR-L1 que tiene la secuencia de SEC ID NO: 1.

6. Anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende una HVR-L3 que tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

7. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la variante HVR-H3 comprende la secuencia TYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY o TYSSYVTALDY.

8. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la afinidad monovalente del anticuerpo con respecto a c-met humana es por lo menos 3 veces superior a la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostradas en las SEC ID NO: 9 y 10 en la figura 7.

9. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 1, donde el anticuerpo murino se produce mediante la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de acceso de la American Type Culture Collection ATCC con la designación HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6).

10. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la afinidad de unión se expresa como un valor Kd.

11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1,8 ó 9, donde la afinidad de unión se mide mediante Biacore o radioinmunoensayo.

12. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende la secuencia del armazón consenso del subgrupo 1 \kappa humana.

13. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende la secuencia del armazón consenso del subgrupo III de cadena pesada humana.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, donde la secuencia armazón comprende una sustitución en la posición 71, 73 y/o 78.

15. Anticuerpo según la reivindicación 14, donde dicha sustitución es R71A, N73T y/o N78A.

16. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo humanizado inhibe la unión del factor de crecimiento de hepatocitos humano a su receptor mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo quimérico anti-c-met que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostradas en las SEC ID NO: 9 y 10, respectivamente.

17. Anticuerpo según la reivindicación 16, donde el anticuerpo inhibe la unión con un valor IC50 que es inferior que la mitad del del anticuerpo quimérico.

18. Anticuerpo según la reivindicación 17, donde la IC50 se determina a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo desde aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1000 nM.

19. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo humanizado inhibe la activación del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) humano mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo anti-c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostradas en las SEC ID NO: 9 y 10, respectivamente.

20. Anticuerpo según la reivindicación 19, donde el anticuerpo inhibe la activación del receptor con un valor de IC50 que es inferior a la mitad del del anticuerpo quimérico.

21. Anticuerpo según la reivindicación 20, donde la IC50 se determina a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM.

22. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo humanizado inhibe la proliferación celular con un valor de IC50 que es inferior a la mitad del del anticuerpo quimérico.

23. Anticuerpo según la reivindicación 22, donde la IC50 se determina a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 100 nM.

24. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico son monovalentes.

25. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico comprenden una región Fab única unida a una región Fc.

26. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC mostradas como SEC ID NO: 191-193, respectivamente.

27. Anticuerpo según la reivindicación 26, donde el dominio variable comprende las secuencias FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC mostradas como SEC ID NO: 187-190, respectivamente.

28. Anticuerpo según la reivindicación 26 ó 27, donde el anticuerpo comprende un CH1 y/o Fc mostrados como SEC ID NO: 194 y 195, respectivamente.

29. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias HVR1-LC, HVR2-LC y HVR3-LC mostradas como SEC ID NO: 183-185, respectivamente.

30. Anticuerpo según la reivindicación 29, donde el dominio variable comprende las secuencias FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y FR4-LC mostradas como SEC ID NO: 179-182, respectivamente.

31. Anticuerpo según la reivindicación 29 ó 30, donde el anticuerpo comprende la secuencia de CL1 mostrada como SEC ID NO: 186.

32. Anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 y un dominio variable de cadena ligera según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31.

33. Anticuerpo según la reivindicación 32, que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC mostradas como SEC ID NO: 191-193, respectivamente, las secuencias FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC mostradas como SEC ID NO: 187-190, respectivamente, y un CH1 y Fc mostrados como SEC ID NO: 194 y 195, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias HVR1-LC, HVR2-LC y HVR3-LC mostradas como SEC ID NO: 183-185, respectivamente, las secuencias FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y FR4-LC mostradas como SEC ID NO: 179-182, respectivamente, y la secuencia de CL1 mostrada como SEC ID NO: 186.

34. Anticuerpo según la reivindicación 32 ó 33, donde el anticuerpo es monovalente y comprende una región Fc.

35. Anticuerpo según la reivindicación 34, donde la región Fc comprende un primer y un segundo polipéptido, donde el primer y segundo polipéptido comprenden cada uno una o más mutaciones con respecto a Fc humana de tipo salvaje.

36. Anticuerpo según la reivindicación 35, donde el primer polipéptido comprende la secuencia Fc mostrada como SEC ID NO: 195 y el segundo polipéptido comprende la secuencia mostrada como SEC ID NO: 196.

37. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de tratamiento.

38. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de tratamiento del cáncer.

39. Anticuerpo según la reivindicación 38, donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o cáncer pancreático.

40. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno proliferativo.

41. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

42. Uso según la reivindicación 41, donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o cáncer pancreático.

43. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo.

44. Ácido nucleico que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

45. Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 44.

46. Composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

47. Composición según la reivindicación 46, donde la composición comprende un portador.