RS51326B

RS51326B - Humanizovani anti-cmet antagonisti

Info

Publication number: RS51326B
Application number: RSP-2010/0306A
Authority: RS
Inventors: Mark S. Dennis; Karen Billeci; Zhong Zheng; Judy Young
Original assignee: Genentech Inc.
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2010-12-31
Also published as: IL214325A; EP1773885A2; MX2007001470A; IL245462A0; ME01803B; SI1773885T1; AU2005267720B2; HK1177938A1; CN102942631A; ZA200701656B; RU2398777C2; JP5068651B2; HK1100779A1; CN104804095A; ES2344793T3; CA2575402A1; IL180588A0; US20120082663A1; KR101397851B1; US20060134104A1

Abstract

Humanizovana forma anti-c-met antitela glodara sadrži:(a) najmanje jednu HVR sekvencu odabranu iz grupe koju čine:(i) HVR-L1 sadrži sekvencu A1-A17, gde A1-A17 predstavlja KSSQSLLYTSSQKNYLA,(ii) HVR-L2 sadrži sekvencu B1-B7, gde B1-B7 predstavlja WASTRES,(iii) HVR-L3 sadrži sekvencu C1-C9, gde C1-C9 predstavlja QQYYAYPWT,(iv) HVR-40H1 sadrži sekvencu D1-D10, gde D1-D10 predstavlja GYTFTSYWLH, and(v) HVR-H2 sadrži sekvencu E1-E18, gde E1-E18 predstavlja GMIDPSNSOTRFNPNFKD; i(b) varianta HVR-H3 sadrži sekvencu TYRSYVTPLDY, SYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, SYSSY-VTPLDY, TYSSYVTSLDY ili TYSSYVTALDYgde je monovalentni afinitet pomenutog antitela za humani c-met veći nego monovalentni afinitet antitela glodara koje sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca prikazanu kao SEQ ID NO:9 i varijabilnu sekvencu teškog lanca prikazanu kao SEQ ID NO:10 i ovde pomenuto antitelo inhibira c-met-zavisnu ćelijsku proliferaciju bolje od referentnog antitela koje sadrži himerično anti-c-met antitelo koje sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca i teškog lanca prikazanu kao SEQ IP NO:509 i 10 kako sledi.Prijava sadrži još 46 zavisnih patentnih zahteva.

Description

PREDMET PRONALASKA

[0001]Predočeni pronalaztak se generalno odnosi na oblasti molekularne biologije i regulaciju faktora rasta. Preciznije, pronalazak se odnosi na modulatore HGF/c-met signalnog puta, i uportebu pomenutih modulatora.

OSNOVA

[0002]HGF je pleiotrofički factor, mezenhim-derivat sa mitogenim, motogenim i morfogenim dejstvom na izvestan broj različitih tipova čelija. HGF efekti se ostvaruju posredstvom specifične tirozin kinaze, c-met, i često se uočava ekspresija aberantnog HGF i c-met kod različitih tumora. Vidi, e.g., Maulik et al, Cvtokine & Grovvth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867. Regulacija HGF/c-Met signalnog puta, vezana je za progresiju tumora i metastaze. Vidi, e.g., Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300).

[0003]HGF se vezuje za ekstracelularni domen Met receptora tirozin kinaze (RTK) i reguliše raznovrsne biološke procese kao što je raspoređivanje čelija, proliferacija, i opstanak. HGF-Met signalizacija je esencijalna za normalan embrionalni razvoj naročito za migraciju prekursora mišićnih ćelija i razvoj jetre i nervnog sistema (Bladt et al., 1995; Hamanoue et al., 1996; Maina et al., 1996; Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). Razvojni fenotipi Met i HGF nokaut miševa su veoma slični i upućuju na to da je HGF srodan Ugandu za Met receptor (Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). HGF-Met takođe igra ulogu u regeneraciji jetre, angiogenezi, i zarastanju rane (Bussolinoetal., 1992; Matsumotoand Nakamura, 1993; Nusratetal., 1994). Prekursor Met receptora podleže proteolitičkom cepanju na ekstracelularnu a subjedinicu i ključnu B subjedinicu vezanu disulfidnim vezama za membranu (Tempest et al., 1988). p subjedinica sadrži domen citoplazmatične kinaze i prima multi-supstrat vezujući domen C-25terminalnog dela gde se vezuju adapter proteini i iniciraju signalizaciju (Bardelli et al., 1997; Nguven et al., 1997; Pelicci et al., 1995; Ponzetto et al., 1994; Weidner et al., 1996). Posle vezivanja HGF, aktivacija Met dovodi do fosforilacije tirozina i provođenja signala kroz Gabl i Grb2/Sos posredstvom PI3-kinaze i odgovarajuće aktivacije Ras/MAPK, što rukovodi ćelijskim motilitetom i proliferacijom (Furge et al., 2000; Hartmann et al., 1994; Ponzetto et al., 1996; Royal and Park, 1995).

[0004]Pokazalo se de se Met transformiše u karcinogen-30tretiranu osteosarkom ćelijsku liniju (Cooper et al., 1984; Park etal., 1986). Prekomerna ekspresija Met-a ili genska-amplifikacija je uočena kod raznovrsnih humanih karcinoma. Na primer, prekomerna ekspresija Met proteina je namanje 5-ostruka kod kolorektalnih karcinoma i registrovana je genska-amplifikacija kod metastaza u jetri (DiRenzoetal., 1995; Liu etal., 1992). Registrovana je takođe, prekomerna ekspresija Met proteina kod karcinoma oralnih skvuamoznih ćelija, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma bubrežnih ćelija, karcinoma dojke, i karcinoma pluća (Jin et al., 1997; Morello et al., 2001; Natali et al, 1996; Olivero et al., 1996; Suzuki et al., 1994). Pored toga, prekomedna ekspresija mRNA je uočena kod hepatocelularnog karcinoma, karcinoma želuđca, i kolorektalnog karcinoma (Boix et al., 1994; Kunivasu et al., 1993; Liu etal., 1992).

[0005]Izvestan broj mutacija u kinaza domenu Met-a nađen je kod papilarnog karcinoma bubrega što dovodi do konstitutivne aktivacije receptora (Olivero et al., 1999; Schmidt et al., 1997; Schmidt et al., 1999). Ove aktivizirajuće mutacije dovode do konstitutivne fosforilacije Met tirozina i rezultiraju aktivacijom MAPK, formiranjem fokusa, i tumor-genezom (Jeffers et al, 1997). Pored toga, ove mutacije utiču na ćelijski motilitet i invazivnost (Giordano et al., 2000; Lorenzato et al., 2002). Aktivacija HGF-dela Met-a u transformisanim ćelijama uslovljava povećan motilitet, rasprostranjenost, i migraciju što eventualno vodi ka invazivnom rastu tumora i metastazama (Jeffers et al., 1996; Meiners et al, 1998).

[0006]Pokazalo se da Met stupa u interakciju sa drugim proteinima što dovodi do aktivacije receptora, transformacije, i invazije. U neoplastičnim ćelijama, uočeno je da Met stupa u interakciju sa 45a6S4 celinom, receptorom za komponente ekstracelularnog matriksa (ECM) kao što su laminini, čime se podstiče HGF-zavisni invazivni rast (Trusolino et al., 2001). Pored toga, pokazalo se da ekstracelularni domen Met-a stupa u interakciju sa članom semaforin familije, pleksinom BI, i da podstiče invazivni rast (Giordano et al., 2002). Pored toga, pokazalo se takođe da CD44v6, koji je uključen u tumorgenezu i metastaziranje, formira kompleks sa Met i HGF i rezultira aktivacijom Met receptora (Orian-Rousseau et al., 2002).

[0007]Met je pripadnik subfamilije RTKs koja obuhvata Ron i Sea (Maulik et al., 2002). Pretpostavke o strukturi ekstracelularnog domena Met-a predlažu homologiju u kojoj učešće imaju semaforini i pleksini. N-terminus Met-a sadrži Sema domen od oko 500 amino kiselina koji je prisutan kod svih semaforina i pleksina. Semaforini i pleksini pripadaju velikoj familiji sekretovanih i proteina vezanih za membranu kojima je prvo opisana uloga u nervnom razvoju (Van Vactorand Lorenz, 1999). Svakako, u skorije vreme je prekomerna ekspresija semaforina povezana sa invazijom tumora i metastazama. PSI domen bogat Cistein-55 (takođe se odnosi i na domen Sekvence vezane za Met) nađen u pleksinima, semaforinima, i integrantima nalazi se u susedstvu Sema domena praćen sa ćetiri ponavljanja IPT regiona nalik imunoglobulinima nađenim u pleksinima i transkripcionim faktorima. Novije ispitivanje pretpostavlja da je dovoljan Met Sema domen za vezivanje HGF i heparina (Gherarđi et al., 2003). Pored toga, Kong-Beltran et al. (Cancer 2 Cell (2004), 6:61-73) konstatovali su da je Sema domen Met-a neophodan za đimerizaciju i aktivaciju receptora.

[0008] Otkriveni su brojni molekuli označeni na HGF/c-met putu. Ovi molekuli uključuju antitela kao što su ona opisana u U. S. Pat. No. 5,686,292. Pokazalo se takođe da deo ekstracelularnog domena c-met ima sposobnost antagonističkog dejstva protiv HGF/c-met puta. U svetlu važne uloge koju ovaj put zauzima u etiologiji raznovrsnih patoloških stanja, svakako, jasno je da i dalje postoji potreba za agensima koji poseduju kliničke atribute optimalne za unapređenje u terapijske agense. Ovde opisani pronalazak zadovoljava ovu potrebu i donosi druge benefite.

SADRŽAT PRONALASKA

[0009] Pronalazak se đelom zasniva na identifikaciji različitih antagonista HGF/c-met biološkog puta, koji je biološko/celularni proces koji predstavlja važan i napredan terapeutski cilj. Pronalazak obezbeđuje preparate i medicinske primene definisane u patentnim zahtevima zasnovanim na utkaju na HGF/c-met aktivaciju, uključujući ali ne ograničavajući se na uticaj na vezivanje HGF za ekstracelularni c-met deo i multimerizaciju receptora. Antagonisti iz ovog pronalaska, kao što je ovde opisano, obezbeđuju važne terapeutske i dijagnostičke agense za primenu u targetiranju patoloških stanja vezanih za abnormalnu ili neželjenu signalizaciju HGF/c-met puta. U skladu sa tim, pronalazak obezbeđuje metode i medicinsku primenu kao što je definisano u patentnim zahtevima, i odnosi se na kitove i proizvodene artikle, koji su u vezi sa modulacijom HGF/c-met puta, uključujući modulaciju vezivanja c-met liganda, c-met đimerizaciju, aktivaciju, i druge biološko/fiziološke procese vezane za HGF/c-met signalizaciju.

[0010] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-HGF/c-met terapeutske agense prikladne za terapeutsku primenu i sposobne da deluju u različitom stepenu na blokadu HGF/c-met signalnog puta. Posebno, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-c-met humanizirano antitelo sa većim monovalentnim afinitetom antitela za humani c-met (npr., afiniet antitela kao Fab fragmenta za humani c-met), na primer najmanje 3, 5, 7, 10 ili 13-ostruko veći, nego Što je ispoljeni monovalenrni afinitet antitela glodara (npr., afinitet antitela glodara kao Fab fragmenta za humani c-met), koje se sastoji od ili se u osnovi sastoji od lakog lanca i teškog lanca sa sekvencom variabilnog domena kao što je definisano na SI. 7 (SEQID NO: 9 i 10), kako je definisano u patentnim zahtevima. Kao što je čvrsto-ustanovljeno u ovoj oblasti, afinitet liganda za vezivanje za odgovarajući receptor može se odrediti primenom bilo kog od raznovrsnih testova, i može se izraziti preko različitih kvantitativnih vrednosti. U skladu sa tim, u jednom aspektu, afinitet za vezivanje je izražen kao Kd vrednost i odražava karakterističan afinitet za vezivanje (npr., sa minimiziranim neželjenim efektima). Generalno i poželjno, afinitet za vezivanje se meriin vitro,kako u okruženju bez ćelija tako i u ćelijskom okruženju. Kao što je ovde detaljnije opisano, višestruka razlika u afinitetu za vezivanje može se kvantifikovati kao odnos vrednosti afiniteta za monovalentno vezivanje humanizovanog antitela (npr., u Fab formi) i vrednosti afiniteta za monovalentno vezivanje referentno/komparatorsko antitelo (npr., u Fab formi) (npr., antitela glodara koja imaju region hipervarijabilnih sekvenci donora), gde su vrednosti afiniteta za vezivanje određene pod istim analitičkim uslovima. Tako, prema jednom aspektu, višestruka razlika u afinitetu za vezivanje se određuje kao odnos Kd vrednosti humanizovanog antitela u Fab formi i pomenutog referentno/35komparatorskog Fab antitela. Na primer, prema jednom aspektu, ako antitelo iz ovog pronalaska

(C) ima afinitet koji je "3-puta veći" nego afinitet referentnog antitela (R), onda ako Kd vrednost za C iznosi lx, Kđ vrednost za R će biti 3x, i odnos Kd za C prema Kd za R će biti 1:3. Bilo koji od brojnih testova poznatih u

ovoj oblasti, uključujući ove opisane ovde, mogu se upotrebiti za merenja afiniteta za vezivanje, uključujući, na primer, Biacore, radioimunoesej (RIA) i ELISA.

[0011] Prema jednom aspektu, HGF/c-40met antagonist iz ovog pronalaska podrazumeva anti-c-met antitelo obuhvatajući:

(a) najmanje jednu, dve, tri, četiri ili pet sekvenci hipervarijablnih regiona (HVR) odabranih iz grupe koju čine:

(i) HVR-L1 obuhvatajući sekvence A1-A17, gde A1-A17 predstavlja KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:l)

(ii) HVR-L2 obuhvatajući sekvence B1-45B7, gde B1-B7 predstavlja is VVASTRES (SEQ ID NO:2)

(iii) HVR-L3 obuhvatajući sekvence C1-C9, gde C1-C9 predstavlja is QQYYAYPWT (SEQ ID NO:3)

(iv) HVR-H1 obuhvatajući sekvence Dl-DIO, gde D1-D10 predstavlja is GYTFTSYWLH (SEQ ID NO:4)

(v) HVR-H2 obuhvatajući sekvence E1-E18, gde E1-E18 predstavlja GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:5) i

(vi) varijantu HVR-H3 koja obuhvata sekvencu, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

[0012] Prema jednom aspektu, HVR-L1 antitela iz ovog pronalaska obuhvata sekvencu SEQ ID NO:l. Prema jednom aspektu, HVR-L3 antitela iz ovog pronalaska obuhvata sekvencu SEQ ID NO:3. Antititelo iz ovog pronalaska koje obuhvata ove sekvence (u kombinaciji kako je ovde opisano) je humanizovano.

[0013] Varijanta HVRs u antitelu iz ovog pronalaska može imati modifikacije jednog ili više ostataka u okviru HVR. Prema jednom aspektu, HVR-L2 varijanta obuhvata sekvence kao što je definissano u patentnom zahtevu 1 ili 3. Prema jednom aspektu, HVR-H2 varijanta obuhvata sekvence kao što je definisano u patentnim zahtevima 1 ili 4. Prema nekim aspektima, pomenuta varijanta HVR-H3 antitela dalje obuhvata HVR-L1. HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 i HVR-H2 gde svako podrazumeva, po redosledu, sekvence predstavljene u SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4 i 5. Prema nekim aspektima, ova antitela dalje obuhvataju humanu podgroupu III teškoglanac okosnicu konsenzus sekvence. Prema jednom aspektu kod ovih antitela, okosnica konsenzus sekvence obuhvata supstituciju na poziciji 71, 73 i/ili 78. Prema nekim aspektima kod ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Prema jednom aspektu, ova antitela dalje obuhvataju humanikI laki lanac kao okosnicu konsenzus sekvence.

[0014] Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska obuhvata varijantu HVR-L2 gde B6 predstavlja V. U nekim aspektima, pomenuta varijanta HVR-L2 antitela dalje obuhvata HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i varijantu HVR-H3, gde svaki obuhvata, po redu, sekvencu prikazanu u SEQ ID NOs:l, 3, 4, 5 i kako je definisano u patentnim zahtevima. Prema nekim aspektima, ova antitela dalje obuhvataju humanu podgrupu III teškog lanca okosnicu konsenzus sekvence. Prema jednom aspektu ovih antitela, okosnica konsenzus sekvence obuhvata supstitucju na poziciji 71, 73 i/ili 78. Prema nekim aspektima kod ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Prema jednom aspektu, ova antitela dalje obuhvataju humanikI laki lanac okosnicu konsenzus sekvence.

[0015] Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska obuhvata varijantu HVR-H2 gde E14 predstavlja T, E15 je K i E17 je E. Prema nekim aspektima, pomenuta varijanta HVR-H2 antitela dalje obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, i varijantu HVR-H3 gde svaka obuhvata, po redu, sekvence prikazane u SEQ ID NOs:l,2, 3,4 i kako je definisano u patentnim zahtevima. Prema nekim aspektima, ova antitela dalje obuhvataju humanu podgrupu III teškog lanca okosnice konsenzus sekvence. Prema jednom aspektu ovih antitela, okosnica konsenzus sekvence obuhvata supstituciju na poziciji 71, 73 i/ili 78. Prema nekim aspektima ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Prema jednom aspektu, ova antitela dalje obuhvataju humaniklaki lanac okosnicu konsenzus sekvence.

[0016] Antitelo može obuhvatati jednu, dve, tri, četiri, pet ili sve HVR sekvence opisane na Fig. 2, 3 i/ili 4(SEQIDNOs:56-163).

[0017] Terapeutski agens za primenu na mnoštvu subjekata poželjno malo podstiče ne immunogeni odgovor protiv agensa u pomenutom subjektu. Na primer, ovde je opisano humanizovano antitelo koje podstiče i/ili se očekuje da kod mnoštva subjekata podstiče odgovor humanog anti-mišjeg antitela (HAMA) na značajno redukovanom nivou u poređenju sa antitelom koje sadrži sekvencu SEQ ID NO: 9 & 10. U drugom primeru, za humanizovano antitelo je navedeno da podstiče i/ili se očekuje da podstiče minimalni ili nikakav odgovor humanog anti-mišjeg antitela (HAMA), U jednom primeru, antitelo podstiče odgovor anti-mišjeg antitela koji je na ili ispod klinički-prihvatljivog nivoa.

[0018] Humanizovano antitelo iz ovog pronalaska u svom teškom i/ili lakom lancu varijabilnog domena može obuhvatati jednan ili više human i/ili human konsenzus ne-hipervariablni region (npr., okosnicu) sekvenci. Prema nekim aspektima, postoji jedna ili više dodatnih modifikacija u okviru humanog i/ili humanog konsenzus non-30hipervarijablnog regiona sekvenci. Sa još jednog aspekta, varijablni domen teškog lanca antitela iz ovog pronalaska obuhvata okosnicu humane konsenzus sekvence, koja je prema jednom aspektu subgrupa III okosnice konsenzus sekvence. Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska obuhvata varijantu subgrupe III okosnice konsenzus sekvence modifikovane u najmanje jednoj poziciji amino kiseline. Na primer, prema jednom aspektu, varijanta subgrupa III okosnice konsenzus sekvence može obuhvatati supstituciju na jednoj ili više pozicija 71, 73 i/ili 78. Prema jednom aspektu, pomenuta supstitucija je R71 A, N73T i/ili N78A, u bilo kojoj međusobnoj kombinaciji.

[0019] Kao što je poznato u ovoj oblasti, i kako je ovde i na dalje detaljnije opisano, pozicija amino kiseline /granično obeležavajuća za hipervarijablni region antitela može varirati, zavisno od konteksta i raznovrsnih definicija poznatih upućenima u ovu oblast (kao što je dole opisano). Neke pozicije u okviru varijablnog domena mogu se posmatrati kao hibridne hipervarijablne pozicije zato što ove pozicije prema jednom setu kriterijuma mogu predstavljati deo hipervarijablnog regiona dok prema drugom setu kriterijuma mogu biti izvan hipervarijablnog regiona. Jedna ili više ovih pozicija može se naći takođe i u ekstenziji hipervarijablnih regiona (kao što je dole dalje definisano). Pronalazak obezbeđuje antitela koja obuhvataju modifikacije na ovim hibridnim hipervarijablnim pozicijama. Ove hibridne hipervarijablne pozicije mogu uključivati jednu ili više pozicija 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 i 102 u varijablnom domenu teškog lanca. Ove hibridne hipervarijablne pozicije mogu uključivati jednu ili više pozicija 24-29, 35-36, 46-49, 56 and 97 u varijablnom domenu lakog lanca. Antitelo može obuhvatati varijantu humane subgrupe okosnice konsenzus sekvence modifikovane na jednoj ili više hibridnih hipervarijablnih pozicija. Antitelo može obuhvatati varijabilni domen teškog lanca uključujući varijantu humane subgrupe III okosnice konsenzus sekvence modifikovane na jednoj ili više pozicija 27-28, 30, 33-35,49, 57-65, 94 i 102. U jednom primeru, antitelo obuhvata F27Y supstituciju. Antitelo može imati T28N, P, L, S, A ili I supstituciju, S30I, T ili Y supstituciju, S30I, T ili Y supstituciju, A33W supstituciju, M34L ili M34V supstituciju, S35H supstituciju, T57I supstituciju, Y58R supstituciju, Y59F supstituciju, A60N supstituciju, D61P, T ili Q supstituciju, S62N, D, K, T ili V supstituciju, V63F ili V63L supstituciju, K64E, H, N, D ili Q supstituciju, K64E, H, N, D ili Q supstituciju, G65D, Y, E ili H supstituciju, R94T ili R94S supstituciju, ili Y102Q, S, H ili F supstituciju. U jednom primeru, antitelo sadrži pomenutu R94T ili R94S modifikaciju koja dalje obuhvata jednu ili modifikacija pozicije 96 i/ili 100. U jednom primeru, pomenute modifikacije obuhvataju G96R i/ili S100T supstituciju (npr., u HVR-55H3). Antitelo može sadržavati varijabilni domen lakog lanca koji ima varijantu humane kappa subgrupe I okosnice konsenzus sekvence modifikovane na jednoj ili više pozicija 24, 25, 29 i 56. U jednom primeru, antitelo obuhvata R24K supstituciju. Antitelo može sadržavati A25S supstituciju, I29Q supstituciju, ili S56R, I, M ili G supstituciju.

[0020]Antitelo može sadržavati varijabilni domen teškog lanca koji sadrži varijantu humane subgroup III okvirne konsenzus sekvence modifikovane na 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17 ili svim pozicijama 27-28, 30, 33-35, 49, 57-65, 94 i 102. U jednom primeru, modifikacija je odabrana iz grupe koju čine F27Y, T28(N, P, L, S, A ili I). S30(I, T ili Y), A33W, M34(L,V), S35H, T57I, Y58R, Y59F, A60N, D61(P, T, Q), S62(N, D, K, T,V), V63(F,L), K64 (E, H, N, D, Q), G65(D, Y, E, H), R94(T,S) i Y102(Q, S, H, F). U jednom primeru, antitelo sadrži pomenuti R94T ili R94S modifikacija dalje sadržava jednu ili više modifikacija na poziciji 96 i/ili 100. U jednom primeru, pomenute modifikacije sadrže G96R i/ili S100T substituciju (npr., u HVR-H3).

[0021]Antitelo može sadržavati varijabilni domen lakog lanca koji sadržava variantu humane kappa subgroupe I okvirne konsenzus sekvence modifikovane na poziciji 1, 2, 3 ili svim pozicijama 24, 25, 29 i 56. U jednom primeru, modifikacija je odabrana iz grupe koja sadrži R24K, A25S, I29Q i S56(R, I, M, G).

[0022]Antitelo iz ovog pronalaska može sadržavati bilo koje prikladne humane ili humane okvirne konsenzus sekvence lakog lanca, koje omogućavaju da antitelo ispoljava poželjne biološke karakteristike (npr., poželjni afinitet za vezivanje). Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži najmanje neke (ili sve) od okvirnih sekvenci humanogklakog lanca. Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži najmanje neke (ili sve) humane k subgroupe 1 okvirne konsenzus sekvence.

[0023]Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca koji sadrži okvirne sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 13 i/ili 16 (FIGURE 1), pod uslovom da pozicija 94 u teškom lancu nije R (i poželjno je ali nije neophodno da bude S ili T).

[0024]Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska je humanizovano anti-c-met antitelo koje inhibira vezivanje faktora rasta humanog hepatocita za njegov receptor bolje od referentnog antitela koje uključuje himerično anti-20c-met antitelo koje sadrži varijabilne sekvence lakog lanca i teškog lanca kao što je predstavljeno na SI. 7 (SEQ ID NO: 9 i 10). Na primer, prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska inhibira vezivanje HGF sa vrednosti IC50 koja je manja od oko polovine one koju ima himerično antitelo. Prema jednom aspektu, vrednost IC50 za antitelo iz ovog pronalaska je oko 0.1, 0.2, 0.3 ili 0.4 u odnosu na vrednost za himerično antitelo. Komparacija inhibitorne sposobnosti vezivanja HGF za njegov receptor može se izvesti u skladu sa različitim metodama poznatim upućenima u ovu oblast, uključujući i kako je opisano u donjim Primerima. Prema jednom aspektu, vrednosti IC50 su određene preko koncentracije antitela u opsegu od oko 0.01 nM do oko 1000 nM.

[0025] Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska je humanizovano anti-c-met antitelo koje inhibira aktivaciju receptora faktora rasta humanog hepatocita (HGF) bolje nego referentno antitelo koje uključuje himerično anti-c-met antitelo koje sadrži varijabilne sekvence lakog lanca i teškog lanca kao što je prikazano na SI. 7 (SEQ ID NO: 9 i 10). Na primer prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska inhibira aktivaciju receptora sa vrednosti IC50 koja je manja od oko polovine vrednosti za himerično antitelo. Prema jednom aspektu, vrednost IC50 za antitelo iz ovog pronalaska je oko 0.1, 0.2, 0.3 ili 0.4 od vrednosti za himerično antitelo. Komparacija sposobnosti inhibicije aktivacije HGF receptora može se izvesti u skladu sa različitim metodama poznatim upućenima u ovu oblast, uključujući i kako je opisano u donjim Primerima. Prema jednom aspektu, vrednosti IC50 su određene preko koncentracije antitela u opsegu od oko 0.1 nM do oko 100 nM.

[0026]Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska je humanizovano anti-35c-met antitelo koje inhibira c-met-zavisnu ćelijsku proliferaciju bolje nego referentno antitelo koje sadrži himerično anti-c-met antitelo uključujući varijabilne sekvence lakog lanca i teškog lanca kao što je prikazano na SI: 7 (SEQ ID NO: 9 and 10), sa vrednosti IC50 koja je manja od oko polovine za himerično antitelo. Prema jednom aspektu, vrednost IC50 za antitelo iz ovog pronalaska je oko 0.1, 0.2, 0.3 ili 0.4 od vrednosti za himerično antitelo. Komparacija sposobnosti inhibicije ćelijske proliferacije može se izvesti u skladu sa različitim metodama poznatim upućenima u ovu oblast, uključujući i kako je opisano u donjim Primerima. Prema jednom aspektu, vrednosti IC50 su određene preko opsega koncentracija antitela od oko 0.01 nM do oko 100 nM.

[0027]Prema jednom aspektu, oba, humanizovano antitelo i himerično antitelo su monovalentni. Prema jednom aspektu, oba, humanizovano antitelo i himerično antitelo sadrže jedan Fab region vezan za Fc region. Prema jednom aspektu, referentno himerično antitelo sadrži varijabilni domen sekvence predstavljen na SI. 7 (SEQ ID NO: 9 i 10) vezan za human Fc region. Prema jednom aspektu, smatra se da je IgG humani Fc region (npr., IgGl, 2, 3 ili 4).

[0028]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata HVR1-HC, HVR2-HC i HVR3-HC sekvence prikazane na Slici 13.Prema jednom aspektu, varijabilni domen obuhvata FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC i FR4-HC sekvence prikazane na Slici 13. Prema jednom aspektu, antitelo obuhvata CH1 i/ili Fc sekvence prikazane na Slici 13. Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata HVR1-50HC, HVR2-HC i HVR3-HC sekvence, i FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC i FR4-HC sekvence predstavljene na Slici 13. Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata HVR1-HC, HVR2-HC i HVR3-HC sekvence, i CH1 i/ili Fc sekvence predstavljene na Slici 13. Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata HVR1-HC, HVR2-HC i HVR3-HC sekvence, i FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC i FR4-HC sekvence predstavljene na Slici 13, i CH1 i/ili Fc sekvence predstavljene na Slici 13. Prema jednom aspektu, Fc region antitela iz ovog pronalaska sadrži kompleks između polipeptida Fc sekvence na Slici 13 i polipeptida Fc sekvence na Slici 14.

[0029]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata HVR1-LC, HVR2-LC i HVR3-LC sekvence prikazane na Slici 13. Prema jednom aspektu, varijabilni domen sadrži FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC i FR4-LC sekvence prikazane na Slici 13. Prema jednom aspektu, antitelo sadrži CL1 sekvencu prikazanu na Slici 13.

[0030]Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska sadrži varijabilne domene lakog i teškog lanca kao što je opisano u naredna dva paragrafa. Prema jednom aspektu, antitelo je monovalentno i sadrži Fc region. Prema jednom aspektu, Fc region sadrži najmanje jedno ispupčenje (kvrga) i najmanje jedno udubljenje (jama), gde prisustvo ispupčenja i uđubljenja podpomaže formiranje kompleksa između Fc polipeptida koji sadrži ispupčenje i Fc polipeptida koji ima udubljenje, kao što je na primer opisano u VVO 2005/063816. Prema jednom aspektu, Fc region antitela iz ovog pronalaska sadrži prvi i drugi Fc polipeptid, gde svaki, prvi i drugi polipeptid sadrži jednu ili više mutacija uvažavajući širok izbor humanog tipa Fc. Prema jednom aspektu, mutacija uđubljenja je T366S, L368A i/ili Y407V. Prema jednom aspektu, mutacija ispupčenja je T366VV. Prema jednom aspektu, prvi polipeptid sadrži Fc sekvencu prikazanu na Sici 13 i drugi polipeptid sadrži Fc sekvencu prikazanu na Slici 14.

[0031]Antagonisti iz ovog pronalaska mogu se upotrebiti za modulaciju jednog ili više aspekta HGF/c-met-udruženih efekta, uključujući ali ne ograničavajući se na c-met aktivaciju, nizvodnu molekularnu signalizaciju (npr., fofsforilacija mitogen aktivisanom protein kinazom (MAPK)), ćelijsku proliferaciju, ćelijsku migraciju, ćelijsko preživljavanje, ćelijsku morfogenezu i angiogenezu. Ovi efekti mogu biti modulisani biološki relevantnim mehanizmom, uključujući raskidanje veze liganda (npr., HGF) za c-met, c-met fosforilacije i/ili c-met multimerizacije. U skladu sa tim, prema jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antagonist c-met antitela koji inhibira vezivanje HGF za c-met. Prema jednom aspektu, antagonist c-met antitela iz ovog pronalaska raskida c-met multimerizaciju (npr., dimerizacija). Prema jednom aspektu, antagonist c-20met antitela iz ovog pronalaska raskida dimerizacionu funkciju c-met Sema domena. U jednom primeru, antagonist c-met antitela deluju na sposobnost c-met Sema domena da bi uticala na c-met đimerizaciju. Interferencija može biti direktna ili indirektna. Na primer, antagonist c-met antitela može se vezati na sekvencu u okviru c-met Sema domena, i zato inhibira interakciju pomenutog vezujućeg domena sa partnerom za vezivenje (kao što je drugi c-met molekul). U drugom primeru antagonist c-met antitela može se vezati za sekvencu koja nije u okviru c-met Sema domena, ali gde pomenuto vezivanje rezultira narušavanjem sposobnosti c-met Sema domena da stupi u interakciju sa partnerom za vezivanje (kao što je drugi c-met molekul). Prema jednom aspektu, antagonist antitelo iz ovog pronalaska se vezuje za c-met (npr., ekstracelularni domen) tako da raskida c-met đimerizaciju. Prema jednom aspektu, antagonist antitelo iz ovog pronalaska se vezuje za c-met tako da ugrožava sposobnost uticaja c-met Sema domena na c-met đimerizaciju. Na primer, prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antagonist antitelo koje nakon vezivanja za c-met molekul inhibira đimerizaciju pomenutog molekula. Prema jednom aspektu, c-30met antagonist antitelo iz ovog pronalaska specifično se vezuje za sekvencu u c-met Sema domenu.

[0032]Prema jednom aspektu, antagonist antitelo iz ovog pronalaska raskida c-met đimerizaciju uključujući homodimer-izaciju. Prema jednom aspektu, antagonist antitelo iz ovog pronalaska raskida c-met đimerizaciju uključujući heterodimer-izaciju (npr., c-met dimerizacija sa non-c-met molekulom).

[0033]U nekim instancama, može biti povoljno imati c-35met antagonist antitelo koje ne interferira sa vezivanjem liganda (kao što je HGF) za c-met. U skladu sa tim, ovde je opisano antitelo koje se ne vezuje za mesto vezivanja HGF za c-met. Antitelo ne mora u određenoj meri inhibirati vezivanje HGF za c-met, ili ne mora u određenoj meri đa se takmiči sa HGF za vezivanje za c-met. U jednom primeru, antagonist antitelo iz ovog pronalaska može se koristiti za konjunkcju sa jednim ili više drugih antagonista, gde su antagonisti usmereni preme različitim procesima i/ili funkcijama unutar HGF/c-met aksisa. Tako, prema jednom aspektu, c-40met antagonist antitelo iz ovog pronalaska se vezuje za epitop c-met-a udaljen od epitopa veze drugog c-met antagonista (kao što je Fab fragment monoklonskog antitela koje je proizvela hibridoma ćelijska linija deponovana kao American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-11894 (hvbriđoma 1A3.3.13)). Prema drugom aspektu, c-met antagonist antitelo iz ovog pronalaska je različito od (npr., nije) Fab fragmenta monoklonalnog antitela koje je proizvela hibridoma ćelijska linija deponovana kao American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-4511894 (hybridoma 1A3.3.13).

[0034]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje c-met antagonist antitelo koje raskida kako c-met multimerizaciju tako i vezivanje liganda. Na primer, antagonist antitelo iz ovog pronalaska koje inhibira c-met multimerizaciju (npr., đimerizaciju) može dalje podrazumevati sposobnost kompeticije sa HGF za vezivanju sa c-met.

[0035]Prema jednom aspektu, c-met antagonist antitelo iz ovog pronalaska, vezivanjem antagonista za c-met inhibira c-met aktivaciju sa HGF. Prema drugom aspektu, c-50met antagonist antitelo iz ovog pronalaska, vezivanjem antagonista za c-met u ćeliji inhibira proliferaciju, preživljavanje, rasipanje, morfogenezu i/ili motilitet ćelije.

[0036]c-met antagonist antitelo može specifično vezati najmanje porciju c-met Sema domena ili njegove varijante. U jednom primeru, antagonist antitelo specifično vezuje najmanje jednu od sekvenci odabranih iz grupe koju čine LDAOT (SEQ ID NO:15) (npr., 269-273 rezidue c-met-a), LTEKRKKRS (SEQ ID NO:16) (npr., 300-308rezidue c-met-a), KPDSAEPM (SEQ ID NO:5517) (npr., 350-357 rezidue c-met-a) i NVRCLQHF (SEQ ID NO:18) (npr., 381-388 rezidue c-met-a). U jednom primeru, antagonist antitelo specifično vezuje konformacioni epitop delimično formiran ili najmanje jednu celu sekvencu odabranu iz grupe koju čine LDAOT (e.g., 269-273 rezidue c-met-a), LTEKRKKRS (npr., 300-308 rezidue c-met-a), KPDSAEPM (npr., rezidue 350-357 c-met-a) i NVRCLQHF (npr.,381-388 rezidue c-met-a). U jednom primeru, antagonist antitelo specifično vezuje amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% identiteta sekvence ili je podudarna sa sekvencom LDAQT, LTEKRKKRS, KPDSAEPM i/ili NVRCLO.HF.

[0037]Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska specifično se vezuje za HGF receptor jednih životinjskih vrsta, i specifično se ne vezuje za HGF receptor druge životinjske vrste. Prema jednom aspektu, jedna životinjska vrsta je ljudska i/ili primat (npr., cynomolgus majmun), i druga životinjska vrsta je glođar (npr., miš) i/ili pas. Prema jednom aspektu, jedna šivotinjska vrsta je ljudska. Prema jednom aspektu, jedna životinjska vrsta je primat, na primer cynomolgus majmun. Prema jednom aspektu, druga životinjska vrsta su glodari, na primer miš. Prema jednom aspektu, druga životinjska vrsta je pas.

[0038]Prema jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje preparate koji sadrže jedno ili više antagonist antitela iz ovog pronalaska i nosač. Prema jednom aspektu, nosač je farmaceutski prihvatljiv.

[0039]Prema jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje prepoznaju c-met antagonist antitela iz ovog pronalaska.

[0040]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje prenosioce koji sadrže nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.

[0041]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćelije domaćine koje sadrže nukleinske kiseline ili prenosioce iz ovog pronalaska. Prenosilac može biti bilo kog tipa, na primer rekombinovani prenosilac kao što je ekspresioni vektor. Može se upotrebiti bilo koja vrsta ćelija domaćin. Prema jednom aspektu, ćelija domaćin je prokariotska čelija, na primer, £.coli.Prema jednom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, na primer ćelija sisara kao što je ćelija ovarijuma kineskog zamorca-Chinese Hamster Ovary (CHO).

[0042]Ovde su takođe opisane metode izrade antagonista iz ovog pronalaska. Na primer, metoda izrade c-met antagonist antitela (koje, kao što je ovde definisano obuhvata punu dužinu i njegove fragmente), pomenuta metoda obuhvata ekspresiju rekombinantnog vektora na pogodnoj ćeliji domaćinu iz ovog pronalaska koji prepoznaje pomenuto antitelo (ili njegove fragmente), i opisan je rikaveri pomenutog antitela.

[0043]Ovde je takođe opisan proizveden artikal koji obuhvata kontejner; i preparat koji kontejner sadrži, gde preparat obuhvata jedno ili više c-met antagonist antitela iz ovog pronalaska. U jednom primeru, preparat obuhvata nukleinsku kiselinu iz pronalaska. U jednom primeru, preparat koji obuhvata antagonist antitelo dalje podrazumeva i nosač, koji je u nekim aspektima farmaceutski prihvatljiv. U jednom primeru, proizveden artikal iz pronalaska dalje podrazumeva uputstva za primenu preparata (npr., antagonist antitela) na subjektu.

[0044]Ovde je takođe opisan kit koji obuhvata jedan kontejner koji podrazumeva preparat koji sadrži jedno ili više c-met antagonist antitela iz pronalaska; i drugi kontejner koji sadrži pufer. U jednom primeru, pufer je farmaceutski prihvatljiv. U jednom primeru, preparat sadrži antagonist antitelo dalje podrazumevajuči i nosač, koji je u nekim slučajevima farmaceutski prihvatljiv. U jednom primeru, kit dalje podrazumeva uputstva za primenu preparata (npr., antagonist antitela) na subjektu.

[0045]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu c-met antagonist antitela iz ovog pronalaaska u preparatima medikamenata za terapeutski i/ili profilaktički tretman bolesti, kao što je rak, tumor, poremećaj ćelijske proliferacije, imunološki (kao što je autoimuni) poremećaj i/ ili poremećaj vezan za angiogenezis-35.

[0046]Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu nukleinske kiseline iz pronalaska u pripremi medikamenta za terapeutski i/ili profilaktički tretmean bolesti, kao što je rak, tumor, poremećaj ćelijske proliferacije, Imunološki (kao što je autoimuni) poremećaj i/ili poremećaj vezan za angiogenezu.

[0047]Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na primenu ekspresionog vektora iz pronalaska u pripremi medikamenta za terapeutski i/ili profilaktički tretman bolesti, kao što je rak, tumor, poremećaj ćelijske proliferacije, imuni (kao što je autoimuni) poremećaj i/ili poremećaj vezan za angiogenezu.

[0048]Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na korišćenje ćelije domaćina u izradi medikamenta za terapeutski i/ili profilaktički tretman bolesti, kao što je rak, tumor, poremećaj ćelijske proliferacije, imuni (kao što je autoimuni) poremećaj i/ili poremećaj vezan za angiogenezu.

[0049] Pronalazak obezbeđuje medicinsku upotrebu i preparate korisne za modulaciju bolesnih stanja vezanih za disregulaciju HGF/c-met signalnog aksisa. HGF/c-met signalni put je involviran u multiple biološke i fiziološke funkcije, uključujući, npr., ćelijsku proliferaciju i angiogenezu. Tako, prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje medicinsku upotrebu antitela iz pronalaska metodom koja podrazumeva primenu pomenutog antitela, na primer, metoda za inhibiranje c-met aktivisane ćelijske proliferacije, pomenuta metoda podrazumeva kontakt ćelije ili tkiva sa efektivnom količinom antitela iz pronalaska, gde se inhibira ćelijska proliferacija vezana za c-met aktivaciju, metoda tretiranja patoloških stanja vezanih za disregulaciju c-met aktivaciju kod subjekta, pomenuta metoda podrazumeva davanje subjektu efektivne količine antitela iz pronalaska, gde su pomenuta stanja tretirana, metoda inhibicije čelijskog rasta sa ekspresijom c-55met ili faktora rasta hepatocita, ili oba, pomenuta metoda podrazumeva kontaktiranje pomenute ćelije sa antitelom iz pronalaska prouzrokujući tako inhibiciju rasta pomenute ćelije. Prema jednom aspektu, ćelija je kontaktirana sa HGF ekspresijom različitih ćelija (npr., preko parakrinog efekta), metodom terapeutskog tretmana sisara koji imaju kancerozni tumor obuhvatajući ćeliju sa ekspresijom c-met ili faktor rasta hepatocita, ili oba, pomenuta metoda podrazumeva davanje pomenutim sisarima efektivne količine antitela iz ovog pronalaska, tako efektivno treatiranje pomenutih sisara, gde u jednom primeru, ćelija stupa u kontakt sa HGF ekspresijom druge ćelije (npr., preko parakrinog efekta), metod tretiranja ili prevencije poremećaja ćelijske proliferacije udružene sa povećanom ekspresijom ili aktivnosti c-met ili prirasta hepatocita, ili oba, pomenuta metoda podrazumeva davanje subjektu u slučaju potrebe za takvim treatmanom efektivne količine antitela iz ovog pronalaska, tako efektivno tretiranje ili prevenciju pomenutog poremećaja ćelijske proliferacije, gde pomenuti poremećaj proliferacije može biti rak, metoda za inhibiciju rasta ćelije, gde je prirast pomenute ćelije najmanje delom zavistan od podsticanja efekta c-met na prirast ili factor rasta hepatocita, ili oba, pomenuta metoda podrazumeva dovođenje u kontakt pomenute ćelije sa efektivnom količinom antitela iz ovog pronalaska, inhibirajući tako rast pomenutih ćelija, gde u jednom primeru, ćelija je dovedena u kontakt sa HGF expresijom druge ćelije (npr., preko parakrinog efekta), ili metoda terapeutskog tretiranja tumora kod sisara, gde je rast pomenutog tumora najmanje delom zavistan od podsticajnog efekta c-met na prirast ili factor rasta hepatocita, ili oba, pomenuta metoda podrazumeva dovođenje u kontakt pomenute ćelije sa efektivnom količinom antitela iz ovog pronalaska, tako efektivno treatiranje pomenutog tumora, gde je u jednom primeru, ćelija dovedena u kontakt sa HGF ekspresijom druge ćelije (npr., preko parakrinog efekta).

[0050]Takve metode mogu se koristiti za utkaj na bilo koje prikladno patološko stanje, na primer, ćelije i/ili tkiva koje je udruženo sa disregulacijom HGF/c-met signalnog puta. U jednom primeru, ciljna ćelija u metodi je ćelija raka. Na primer, ćelija raka može biti jedna odabrana iz grupe koju čine čelija karcinoma dojke, ćelija kolorektalnog karcinoma, ćelija karcinoma pluća, čelija papilarnog karcinoma (npr., tiroidne žlezde), čelija karcinoma kolona, ćelija karcinoma pankreasa, ćelija karcinoma ovarijuma, ćelija karcinoma cerviksa, ćelija karcinoma centralnog nervnog sistema, ćelija osteo sarkoma, ćelija karcinoma bubrega, ćelija hepatocelularnog karcinoma, ćelija karcinoma mokraćne bešike, ćelija karcinoma želuca, ćelija skvuamoznog karcinoma glave i vrata, ćelija melanoma i ćelija leukemije. U jednom primeru, ciljna ćelija metode je hiperproliferativna i/ili hiperplastična ćelija. U jednom primeru, ciljna ćelija metode je displastična ćelija. U još jednom primeru, ciljna ćelija metode je metastatska ćelija.

[0051]Takve metode mogu dalje podrazumevati dodatne korake u treatmanu. Na primer, u jednom primeru, metoda dalje podrazumeva korak u kome je ciljna ćelija i/ili tkivo (npr., kancerozna čelija) treatirano radijacijom ili hemoterapeutskim agensom.

[0052]Kao što je ovde opisano, c-met aktivacija je važan biološki proces Čija disregulacija vođi ka brojnim patološkim stanjima. U skladu sa tim, u jednom ovde opisanom primeru metode, ciljna ćelija (npr., kancerozna ćelija) je jedna kod koje je aktivacija c-30met veća u poređenju sa normalnom ćelijom tkiva istog porekla. U jednom primeru, metoda dovodi do smrti ciljne ćelije. Na primer, kontakt sa antagonistom iz ovog pronalaska može rezultirati nesposobnošću ćelije da primi signal c-met putem što dovodi do smrti ćelije.

[0053]Disregulacija c-met aktivacije (i tako signalizacije) može rezultirati izvesnim brojem ćelijskih promena, uključujući, na primer, prekomernu ekspresiju HGF (Iigand blizak c-met-u) i/ili samog c-met. U skladu sa tim, u nekim primerima, metoda podrazumeva targetiranje ćelije kod koje je c-35met ekspresija ili ekspresija faktora rasta hepatocita, ili oba, više izražena kod pomenute ćelije (npr., kancerozna ćelija) u poređenju sa normalnom ćelijom tkiva istog porekla. Ćelijska ekspresija c-met može biti regulisana pomoću HGF iz različitih izvora, npr. na autokrini ili parakrini način. Na primer, ciljna ćelija je u kontaktu/vezi sa ekspresijom faktora rasta hepatocita u različitoj ćeliji (npr., via parakrini efekat). Pomenuta različita ćelija može biti iz tkiva istog ili različitog porekla. U jednom primeru, ciljna ćelija je u kontaktu/vezi sa sopstvenom expresijom HGF ciljne ćelije (npr., via autokrini efekat/401oop). C-met aktivacija i/ili signalizacija može se takođe pojaviti nezavisno od liganda. Odavde, u jednom primeru, c-met aktivacija u ciljnoj ćeliji javlja se nezavisno od liganda.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0054]SL, 1 prikazuje raspored sekvenci varijablnog lakog i teškog lanaca za sledeče: laki lanac humane subgroupe I konsenzus sekvence, teški lanac humane subgroupe III konsenzus sekvence, 5D5 anti-c-met antitela glodara i 5D5-kalemljeno "humanizovano" antitelo.

SL. 2 prikazuje raznovrsne HVR sekvence odabranih afinitet-50maturisanih antitela iz banaka sa inđiviđualno-randomiziranom HVR.

SL. 3 prikazuje HVR-H3 sekvence odabranih afinitet-maturisanih antitela iz pula banke koji podrazumeva kombinaciju od 6 banaka koje sadrže svih šest HVRa gde je svaka banka ranđomizirana u pojedinačne

HVR.

SL. 4 prikazuje rezultate Biacore analize sa odabranim anti-c-met antitelima.

SL. 5A,B & 6A,B prikazuju primer akceptora okvirih humanih konsenzus sekvenci za primenu u prakticiranju instant pronalaska sa identifikacijom sekvence kako sledi:

Variabilni teški ( VH) konsenzus okviri ( SL. 5A. B)

humana VH subgrupa I konsenzus okvira minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:19)

humana VH subgrupa I konsenzus okvira minus prošireni hipervarijablni regioni (SEQ ID NOs:20-22)

humana VH subgrupa II konsenzus kvira minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:23)

humana VH subgrupa II konsenzus okvira minus prošireni hipervarijablni regioni (SEQ ID NOs:24-26) humana VH subgrupa III konsenzus kvira minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:27)

humana VH subgrupa III konsenzus okvira minus prošireni hipervarijabni regioni (SEQ ID NOs:28-30) human VH akceptor okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID N0:31)

human VH akceptor okvir minus prošireni hipervarijablni regioni (SEQ ID NOs:32-33)

human VH akceptor 2 okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:34)

human VH akceptor 2 okvir minus prošireni hipervarijablni regioni (SEQ ID NOs:35-37)

Variiabni laki ( VU konsenzus okvir ( SL. 6A , B )

humana VL kapa subgrupa I konsenzus okvir (SEQ ID NO:38)

humana VL kapa subgrupa II konsenzus okvir (SEQ ID NO:39)

humana VL kapa subgrupa III konsenzus okvir (SEQ ID NO:40)

humana VL kapa subgrupa IV konsenzus okvir (SEQ ID NO:41)

SL. 7 prikazuje donorski (antitelo glodara 5D5) laki lanac (LC) i sekvence varijabilnog domena teškog lanca (HC).

SL. 8 prikazuje grafičke podatke za blokiranje vezivanja HGF za njegovo receptorsko antitelo iz ovog pronalaska.

SL. 9 prikazuje grafičke podatke za inhibiciju aktivacije HGF receptora antitelom iz ovog pronalaska. SL. 10 prikazuje grafičke podatke za inhibiciju ćelijske proliferacije antitelom iz ovog pronalaska. "rchOA5D5 HGF" se odnosi na himerično jedno-ruko 5D5 antitelo plus HGF; "rhuOA5D5v2 HGF" se odnosi na OA5D5.v2 plus HGF; "rhuOA5D5vl HGF" se odnosi na OA5D5. vi plus HGF". "rchOA5D5 Control" se odnosi na himerično jedno-ruko 5D5 antitelo bez HGF; "rhuOA5D5v2 Control" se odnosi na OASD5.v2 bez HGF; "rhuOA5D5vl Control" se odnosi na OA5D5.vl bez HGF".

SL. 11 A, B prikazuje podatke za inhibiciju fosforilacije receptora u prisustvu antitela iz ovog pronalaska. SL. 11A prikazuje fosforilaciju receptora H358 ćelija. SL. 11B prikazuje fosforilaciju receptora H358 ćelija transficiranih sa HGF.

SL. 12 prikazuje grafičke podatke koji pokazujuin vivoefikasnost antitela iz ovog pronalaska. "TI" se odnosi na incidencu tumora.

TI=8/10 se odnosi na 8 miševa koji imaju tumore iz grupe od 10 miševa. TI=2/8 se odnosi na 2 miša koji imaju tumore iz grupe od 8 miševa.

SL. 13 prikazuje amino kiselinske sekuence okvira (FR), hipervarijablni region (HVR), prvi konstantni domen (CL ili CH1) i Fc region (Fc) prema jednom aspektu antitela iz ovog pronalaska (5D5.v2). Prikazane Fc sekvuence podrazumevaju mutacije "hole" (uđubljenja) T366S, L368A i Y407V, kao što je opisano u WO 2005/063816.

SL. 14 prikazuje sekvence Fc polipeptida koji podrazumeva mutaciju "knob" (ispupčenja) T366W, kao što je opisano u WO 2005/063816. Prema jednom aspektu, Fc polipeptid podrazumeva da ova sekvenca formira kompleks sa Fc polipeptidom koji podrazumeva Fc sekvence sa SL. 13 da bi se generisao Fc

region antitela iz ovog pronalaska.

NAČINI ZA IZRADU PATENTA

[0055]Pronalazak obezbeđuje medicinsku upotrebu i preparate, i ovde su opisani kitovi i proizvedeni artikli, za identifikaciju i/ili upotrebu inhibitora HG-GF/c-met signalnog puta.

[0056]Ovde su dati detalji koji se odnose na metode, preparate, kitove i proizvedene artikle.

Generalne Tehnike

[0057]Primena predočenog pronalaska će uključiti, osim ako je drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije (uključujući recombinantne tehnike), mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije, i imunologije, koje su poznate upućenima u ovu oblast. Takve tehnike su potpuno objašnjene u literaturi, kao što je, "Molecular Cloning: A Laboratorv Manual", drugo izdanje (Sambrooketal, 1989); "Oligonucleodde Svnthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshnev, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.50); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, i periodčne dopune); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).

Definicije

[0058]"Modifikacija" amino kiselinskog ostatka/pozicije, kako se ovde koristi, odnosi se na izmenu primarne amino kiselinske sekvence u poređenju sa polaznom amino kiselinskom sekvencom, gde je promena rezultat alteracije sekvence koja uključuje bočni amino kiselinski ostatak/poziciju. Na primer, tipične modifikacije uključuju supstituciju ostatka (ili na pomenutoj poziciji) drugom amino kiselinom (npr., konzervativna ili non-konzervativna supstitucija), insertovanje jedne ili više (uopšteno manje od 5 ili 3) amino kiselina u susedstvu pomenutog ostatka/pozicije, i uklanjanje pomenutog ostatka/pozicije. " Supstitucija Amino kiseline ", ili njihova varijacija, se odnosi na zamenu postojećeg amino kiselinskog ostatka u predeterminisanoj (polaznoj) amino kiselinskoj sekvuenci različitim amino kiselinskim ostatkom. Generalno i poželjno, modifikacija rezultira alteracijom variante polipeptida u najmanje jednoj fizičkobiohemijskoj aktivnosti u poređenju sa polipeptidom koji sadrži polaznu (ili "sirovi tip") amino kiselinske sekvence. Na primer, u slučaju antitela, alteracija fizičkobiohemijske aktivnosti može se ogledati u afinitetu za vezivanje, sposobnosti za vezivanje i/ili efektu vezivanja za ciljne molekule.

[0059]"Izolovano" antitelo je jedno koje je bilo identifikovano i izolovano i/ ili izdvojeno iz komponente u njegovom prirodnom okruženju. Kontaminantne komponente iz njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi interferirali sa dijagnostičkim ili terapeutskim primenama antitela, i može uključivati enzime, hormone, i druge proteinske ili nonproteinske rastvorke. Prema aspektima koji imaju prednost, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95 težinskih% antitela kako je određeno Lowry metodom, i najpoželjnije više od 99 težinskih %, (2) do stepena dovoljnog da bi se dobilo najmanje 15 N-terminalnih ostataka ili unutrašnjih amino kiselinskih sekvenci primenom rotacionog sekventora, ili (3) do homogenizacije pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili nonredukcinim uslovima korišćenjem Coomassie plavog ili, poželjno, srebrne boje. Izolovano antitelo uključuje antiteloin situsa rekombinantnim ćelijama ako je odsutna najmanje jedna komponenta iz prirodnog okruženja antitela. Obično, svakako, izolovano antitelo će biti đobijeno najmanje jednim postupkom prečišćavanja.

[0060] Termin "ostatak varijablnog domena obeležen kao u Kabat" ili "pozicija amino kiselina obeležena kao u Kabat", i njihove varijacije, odnosi se na sistem obeležavanja primenjen na varijablne domene teškog lanca ili varijablne domene lakog lanca kompilacije antitela kod Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Primenom ovog sistema obeležavanja, aktuelna linearna amino kiselinska sekvenca može sadržavati manje ili više amino kiselina u saglasnosti sa skraćenjem, ili umetanjem, FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati jednu insertovanu amino kiselinu (ostatak 52a u skladu sa Kabat) posle ostatka 52 iz H2 i insertovane ostatke (npr. ostaci 82a, 82b, i 82c, itd. u skladu sa Kabat) iza FR ostatka 82 teškog lanca. Kabat obeležavanje ostataka može biti determinisano za da to antitelo svrstavanjem u regione po homologiji sekvence antitela sa sekvencom obeleženom kao "standard" Kabat.

[0061]Fraza "suštinski podudarno", ili "suštinski isto", kako je ovde upotrebljena, označava dovoljno visok stepen podudarnosti između dve numeričke vrednosti (generalno jedna vezana za antitelo iz ovog pronalaska i druga vezana za referentno/uporedno antitelo) tako da bi upućeni u ovu oblast smatrali razliku između dve vrednosti malom ili bez biološkog i/ili statističkog značaja u kontekstu bioloških karakteristika merenih pomenutim vrednostima (npr., Kd vrednost). Razlika između dve pomenute vrednosti poželjno je manja od oko 50%, poželjno manja od oko 40%, poželjno manja od oko 30%, poželjno manja od oko 20%, poželjno manja ođ oko 10% kao funkcija vrednosti za referentno/35komparatorsko antitelo.

[0062]'Afinetet za vezivanje" generalno se odnosi na ukupnu snagu zbira nonkovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta za vezivanje jednog molekula (npr., antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr., antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako je ovde korišćeno, "afinitet za vezivanje" se odnosi na svojstven afinitet za vezivanje koji se odnosi na 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr., antitelo i antigen). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y može se uopšteno predstaviti disocijacionom konstantom (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim metodama poznati upućenima u ovu oblast, uključujući one koje su ovde opisane. Antitela sa Niskim-afinitetom generalno vezuju antigen sporo i imaju izraženu tendenciju disocijacije, dok antitela visokog-afiniteta generalno vezuju antigen brže i imaju tendenciju đa ostanu duže vezani. Raznovrsne metode merenja afiniteta za vezivanje su poznate upućenima u ovu oblast, od kojih bilo koja može biti upotrebljena za potrebe predočenog pronalaska. Specifični ilustrativni aspekti su opisani u onom što sledi.

[0063]Prema jednom aspektu, "Kd" ili "Kd vrednost" u skladu sa ovim pronalaskom, meri se pomoću radio-obeleženih antigen vezujućih testova (RIA) koji se izvode sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena kao što je sledeći test koji meri afinitet za vezivanje Fab-ova iz rastvora za antigen pomoću ekvilibrisanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<l25>I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, potom hvatanjem vezanog antigena na ploči obloženoj sa anti-Fab antitelom (Chen, et al, (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Za postavljanje uslova određivanja, mikrotitarske ploče (Dynex) su preko noči obložene sa 5 ug/ml hvatajućeg anti-50Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9.6), i postepeno blokirane sa 2% (w/v) goveđeg serumskog albumina u PBS za dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U non-ađsorbant ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijom razblaženja Fab od interesa (npr., sastojak sa viškom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab od interesa je potom inkubiran preko noći; svakako, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr., 65 sati) da bi se osiguralo postizanje ekvilibrijuma. Potom, su smese prenete u ploče za izdvajanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi (npr., tokom jednog sata). Rastvor je potom uklonjen i potom je ploča isprana osam puta sa 0.1% Tween-20 in PBS. Kada su se ploče osušile, dodat je scintilant, 150 ul/po uđubljenju (MicroScint-20; Packard), i ploče su merene na Topcount gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja izabrane su za primenu u analizama kompetitivnog vezivanja. U skladu sa drugim aspektom određena Kd ili Kd vrednost je merena primenom analize površinske plazmon rezonance koriščenjem BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa đelićima imobilisanog antigena CM5 na -TO jedinica odgovora (RU). Doslovno, delići karboksimetilisanog dekstran biosenzora (CM5, BIAcore Inc.) su aktivisani sa N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hiđrohloriđom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) u skladu sa uputstvom isporučioca. Antigen je razređen sa lOmM natrijum aeetatom, pH 4.8, u 5ug/ml (~0.2uM) pre injektovanja pri protoku od 5ul/ minute da bi se dostiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) sparenog proteina. Prateći injekciju antigena, IM etanolamin je injektovan da bi se blokirale neodreagovane grupe. Za merenja kinetike, dvostruka serijska razblaženja Fab (0.78 nM do 500 nM) su injektovana u PBS sa 0.05% Tween 20 (PBST) na 25°C pri približnom nivou protoka od oko 25ul/min. Stepeni asocijacije (kQn) i stepeni disocijacije (k„ff) su izračunati pomoću jednostavnog jedan-za-jedan Langmuir modela vezivanja (BIAcore Evaluation Softvvare version 3.2) sa simultanim uklapanjem asociacionog i disoci-acionog sensorgrama. Ekvilibrijum disocijacione konstante (Kd) je izračunat kao odnos kofi/k„n. Vidi, npr., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Ako on-stepen prevazilazi IO<6>M"<1>S-<1>po analizi površinskog plazmon rezonance, tada on-stepen može đa se odredi koriščenjem fluorescentne kvenčing tehnike koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C iz 20nM anti-antigen antitela (Fab form) u PBS, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kao što su izmerene u spektrometru, kao što je stop-protok opremljeni spektrofometar (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) koji ima crvenu kivetu sa mešalicom.

[0064] "on-stepen" ili "stepen asocijacije" ili "asociacioni stepen" ili "k„n" u skladu sa ovim pronalaskom takođe može biti određen istom gore opisanom tehnikom površinske plazmon rezonance primenom BIAcore20™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa komadićima imobilisanog antigena CM5 na -10 jedinica odgovora (RU). Doslovno, komadići karboksimetilovanog dekstran biosenzora (CM5, BIAcore Inc.) su aktivisani sa N-hil-etN'- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hiđrohloriđom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom ( NHS) u skladu sa uputstvima isporučioca. Antigen je razblažen sa lOmM natrijum aeetatom, pH4.8, u 5ug/ml (~0.2uM) pre injekcije pri stepenu protoka 5ul/minut da bi se doostiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) sparenog proteina. Sledi injekcija IM etanolamina da bi se blokirale neodreagovane grupe. Za merenja kinetike, serijska dvostruka razređenja Fab (0.78 nM đo 500 nM) su injektovana u PBS sa 0.05% Tvveen 20 (PBST) na 25°C pri stepenu protoka od približno 25ul/min. Stepeni asocijacije (kon) i stepeni disocijacije (koff) su izračunati koriščenjem jednostavnog jedan-za-jedan Langmuir model vezivanja (BIAcore Evaluation Softvvare version 3.2) pomoću simultanog uklapanja asocijacionog i disocijacionog sensorgrama. Ekvilibrijum disocijaciona konstanta (Kd) je izračunata kao odnos k3CU/lw Vidi, npr., Chen, Y., etal., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Svakako, ako on-stepen prevazilazi IO<6>M'<1>S"<1>prema gornjoj analizi površinske plazmonrezonance, potom je on-stepen poželjno određen primenom fluorescentne kvenčing tehnike koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C, 20nM anti-antigen antitela (Fab forma) u PBS, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kako je izmereno u spektrometru, kao što je stop-protok opremljeni spektrofotometar (Aviv Instruments) ili 8000-35serija SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) koji ima kivetu sa mešalicom. "Kd" ili "Kd vrednost" u skladu sa ovim pronalaskom, prema jednom aspektu, merena je testom sa vezivanjem za radioobeleženi antigen (RIA) izvedenom sa Fab verzijom antitela i antigen molekulom kako je opisano sledećom analizom koja meri afinitet za vezivanje rastvora Fabs za antigen pomoću ekvilibrisanja Fab sa minimalnom koncentracijom (<12S>I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, potom hvatanjem vezanog antigena na ploči obloženoj sa anti-Fab antitelom (Chen, etal., (1999) J. Mol Biol 293:40865-881). Za ustanovljavanje uslova određivanja, mikrotitarske ploče (Dynex) su preko noči obložene sa 5 ug/ml hvatajućeg anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9.6), i postepeno su blokirane sa 2% (w/v) albuminom goveđeg seruma u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U non-adsorbant ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigen je pomešan sa serijom razređenja Fab od značaja (konzistentno sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab od značaja je potom inkubiran preko noči; svakako, inkubacija se može nastaviti u dužem periodu (npr., 65 sati) da bi se osiguralo dostizanje ekvilibrijuma. Potom su, smese prenete u ploče za hvatanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Rastvor je potom uklonjen i ploča je osam puta isprana sa 0.1% Tween-20 u PBS. Kada su se ploče osušile, dodato je 150 ul/udubljenje scintilanta (MicroScint-20; Packard), i ploče su podvrgnute brojanju na Topcount gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za primenu u analizama kompetitivnog vezivanja. Prema drugom aspektu, određena Kd ili Kd vrednost je merena primenom analize površinske plazmon rezonance koriščenjem BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa komadićima imobilisanog antigena CM5 na~10 jedinica odgovora (RU). Doslovno, komadići karboksimetilovanog dekstran biosenzora (CM5, BIAcore Inc.) su aktivisani sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hiđrohloriđom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) u skladu sa uputstvima isporučioca. Antigen je razređen sa 10 mM natrijum aceteta, pH 4.8, u 5ug/ml (~0.2uM) pre injektovanja pri stepenu protoka od 5ul/minut da bi se dostiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) sparenog proteina. Posle injekcije antigena, injektiran je IM etanolamin da bi se blokirale neodreagovane grupe. Za merenja kinetike, injektirana su dvostruka serijska razreženja Fab (0.78 nM to 500 nM) u PBS sa 0.05% Tvveen 20 (PBST) na 25°C pri stepenu protoka od oko 25ul/min. Stepeni asocijacije (kon) i stepeni disocijacije (k„f() su izračunati primenom jednostavnog Langmuir modela vezivanja jedan-za-jeđan (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pomoću simultanog uklapanja asocijacionog i đisocijacionog sensorgrama. Ekvilibrijum đisocijacione konstante (Kd) je izračunat kao odnos koff/ko„. Vidi, npr., Chen, Y., etal, (1999) J. Mol Biol293: 865-881. Ako on-stepen prevazilazi IO<6>M1 S"<1>prema gornjoj analizi površinske plasmon rezonance, onda on-stepen može biti određen primenom fluorescentne kvenčing tehnike koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C, 20nM anti-antigen antitela (Fab forma) u PBS, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kako je izmereno u spektrometru, kao što je stop-protok opremljen spektrofometar (Aviv Instruments) ili 8000-serija SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoS-pectronic) sa crvenom kivetom koja ima mešalicu.

[0065]Prema jednom aspektu, "on-stepen" ili "stepen asocijacije" ili "asocijacioni stepen" ili "kon" u skladu sa ovim pronalaskom je određena istom gore opisanom tehnikom površinske plazmon rezonance upotrebom BIAcore™-2000 ili BI-Acore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscatavvav, NJ) na 25C sa komadićima imobilisanog antigena CM5 na~10 jedinica odgovora (RU). Doslovno, komadići karboksimetilovanog dekstran biosenzora (CM5, BIAcore Inc.) su aktivisani sa N-etil-N'- (3-dimetilaminopropiI)-karbodiimid hiđrohloriđom (EDC) i N-idroksisukcinimidom (NHS) u skladu sa uputstvima isporučioca. Antigen je razblažen sa lOmM natrijum aeetatom, pH 4.8, u 5ug/ml (~0.2uM) pre injektiranja pri stepenu protoka od 5ul/minut da bi se dostiglo 10 jedinica odgovora (RU) sparenog proteina. Posle injekcije IM etanolamina đa bi se blokirale neodreagovane grupe. Za merenje kinetike, dvostruka serijska razređenja Fab (0.78 nM do 500 nM) su injektirana u PBS sa 0.05% Tvveen 20 (PBST) na 25°C uz stepen protoka od oko 25ul/min. Stepeni asocijacije (kon) i stepeni disocijacije (k««) su izračunati primenom jednostavnog Langmuir modela vezivanja jedan-za-jedan (BIAcore Evaluation Softvvare version 3.2) pomoću simultanog uklapanja asocijacionog i đisocijacionog sensorgrama. Ekvilibrijum konstante disocijacije (Kd) je izračunat kao odnos k^/k^. Vidi, npr., Chen, Y., etal., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Svakako, ako on-stepen prevaziđe IO<6>M"' S'<1>prema gornjoj analizi površinskog plazmon odgovora, tada je poželjno da se on-stepen određuje primenom fluorescentne kvenčing tehnike koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C, 20nM anti-antigen antitela (Fab forma) u PBS, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kako je mereno speetrometrom, kao što je spektrofometar opremljen sa stop-25protokom (Aviv Instruments) ili 8000-serija SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa kivetom koja ima mešalicu.

[0066]Izraz "stvarno redukovan," ili "stvarno razkličit", kako je ovde upotrebljen, označava dovoljno visok stepen razlike između dve numeričke vrednosti (generalno jedna koja se odnosi na antitelo iz ovog pronalaska i druga koja se odnosi na referentno/30komparator antitelo) tako da će upućeni u ovu oblast razliku između dve veličine smatrati za statistički značajnu u kontekstu bioloških karakteristika merenih pomenutim vrednostima (npr., Kd vrednosti, HAMA odgovor). Razlika između pomenute dve vrednosti poželjno je veća od oko 10%, poželjno je veća od oko 20%, poželjno je veća od oko 30%, poželjno je veća od oko 40%, poželjno je veća od oko 50% kao funkcija vrednosti za referentno/komparatorsko antitelo.

[0067]"Procenat (%) podudarnosti amino kiselinske sekvence" u odnosu na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu je definisan kao procenat amino kiselinskih ostataka u odabranoj sekvenci koji je identičan sa amino kiselinskim ostatcima u specifičnom peptidu ili polipeptidnoj sekvenci, posle nizanja sekvenci i uvođenja gapova, ako je neophodno, da bi se dostigao maksimalan percenat podudarnosti sekvence, i ne smatrajući svaku konzervativnu substituciju za deo podudarnosti sekvence. Nizanje u svrhu određivanja procenta podudarnosti amino kiselinske sekvence može se postići na različite načine poznate upućenima u ovu oblast, na primer, primenom javnosti dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-402, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Upućeni u ovu oblast mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje niza, uključujući bilo kakav algoritam potreban za postizanje maksimalnog niza preko cele dužine sekvenci koje se porede. U ovde opisanu svrhu, svakako, vrednosti % podudarnosti amino kiselinske sekvence su generisane primenom kompjuterskog programa za komparaciju sekvence ALIGN-2, gde je kompletan izvorni kod za ALIGN-2 program dostupan u Tabeli A dole. Kompjuterski program ALIGN-452 za poređenje sekvenci je napravio Genentech, Inc. i izvorni kod prikazan dole u Tabeli A je popunjen korisničkom dokumentacijom u U.S. Copvright Office, VVashington D.C., 20559, gde je registrovan u U.S. Copvright Registration No. TXU510087. ALIGN-2 program je javno dostupan preko Genentech, Inc., South San Francisco, California ili se može preuzeti iz izvornog koda dostupnog na Slici 8 dole. The ALIGN-2 program bi trebalo da bude preuzet za primenu na UNIX operativnom sistemu, poželjno u digital UNIX V4.0D. Svi parametri za poređenje parametara sekvenci su postavljeni ALIGN-502 programom i ne variraju.

[0068]U situacijama gde je primenjen ALIGN-2 is za poređenje amino kiselinskih sekvenci, % podudarnosti amino kiselinske sekvence date amino kiselinske sekvence A prema, sa, ili nasuprot date amino kiselinske sekvence B (koja alternativno može biti izražena kao data amino kiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određen % podudarnosti amino kiselinske sekvence prema, sa, ili nasuprot datoj amino kiselinskoj sekvenci B) izračunat je kako sledi: 100 puta frakcija X/ Y gde je X broj amino kiselinskih ostataka za koje je utvrđeno da su identično podudarni sa programskim nizom sekvence ALIGN-2 u programskom nizu A i B, i gde je Y ukupan broj amino kiselinskih ostataka u B. Bilo bi poželjno da dužina amino kiselinske sekvence A nije jednaka dužini amino kiselinske sekvence B, % podudarnosti amino kiselinske sekvence A prema B neće biti jednak % podudarnosti amino kiselinske sekvence B prema A.

[0069]Ukoliko se specifično ne tvrdi drugačije, sve vrednosti % podudarnosti ovde korišćenih amino kiselinskih sekvenci, dobijene su kako je opisano u paragrafu koji odmah sledi primenom ALIGN-2 kompjuterskog programa.

[0070] Izraz "vektor", koji se koristi ovde, ima za cilj da se odnosi na nukleinske kiseline molekul sposoban za transport drugih nukleinskih kiselina koje su povezane. Jednog tipa vektora je "plazmid", koja se odnosi na kružnim dvostruki nasukan DNK petlje u koje mogu da dodatni segmenti DNK se ligated. Druga vrsta vektora je vektor Fag. Druga vrsta vektora je vektor virusa, pri čemu dodatni segmenti DNK može ligated u virusnog genoma. Određene vektora su sposobni autonomne replikacije u ćelije domaćina u kojima su uvedene (npr. bakterija vektore koji imaju bakterijske poreklo replikacije i episomal sisara vektori). Ostale vektora (na primer, ne episomal sisara vektora) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina na uvod u ćelije domaćina, i tako se kopiraju zajedno sa domaćinom genoma. Staviše, neke vektore su u stanju da usmeravaju ekspresije gena na koje operativno su povezane. Takvi su vektori u daljem tekstu kao "rekombinantne izraz vektore" (ili jednostavno "rekombinantne vektori). U principu, izraz vektora korisnosti u rekombinantne DNK tehnike su često u formi plazmida. U ovom specifikacija, "plazmid" i "vektor" može naizmenično koristiti kao plazmida je najčešće korišćen oblik vektora.

[0071] " Polinucleotide ", ili" nukleinskih kiselina, koji se koristi naizmenično ovog člana, odnose se na polimera nukleotida bilo koje dužine, te su DNK i RNK može da se nukleotida deokiribonucleotides, Nukleotidi, put nukleotida ili bazama, i. / Ili njihovih analoga, ili bilo podloge koje mogu biti uključene u polimer DNK ili RNK polimeraza, ili sintetičke reakcije, polinucleotide može da uključi put nukleotida, kao što su metil nukleotida i njihovih analoga Ako sadašnjosti, modifikacija na strukturu nukleotida može biti saopštene pre ili posle montaže, polimera redosled nukleotida. može biti prekinut od strane ne-nukleotida komponente polinucleotide može biti dalje put posle sinteze, kao što je konjugacija sa obeleživačem. Drugi tipovi modifikacija uključuju, na primer, "caps", substituciju jednog ili više prirodnih nukleotida sa analogom, internukleotidne modifikacije kao što su, na primer, one sa vezama bez šarže (npr., metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa vezama sa šaržom (npr., fosforotioati, fosforoditioati, itd.), one koje sadrže zavisne polovine, kao što su , na primer, proteini (npr., nukleaze, toksini, antitela, signal peptidi, ply-L-lizin, itd.), one sa interkalatorima (npr., akridin, psoralen, itd.), one koje sadrže helatore (npr., metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali, itd.), one koje sadrže alkilatore, one sa mođifikovanim vezama (npr., alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.), isto kao nemodifikovane forme polinukleotida(s). Dalje, bilo koja hidroksilna grupa ordinarno prisutna u šećerima može biti zamenjena, na primer, fosfonatne grupe, fosfatne grupe, zaštićene standardnim zaštitnim grupama, ili aktivisane da pripreme dodamo vezivanje za dodatne nukleotide, ili mogu biti konjugovani u čvrste ili polu-čvrste nosače. 5' i 3' terminalne OH mogu biti fosforilisane ili substituisane sa aminima ili organskom vrstom grupe za uparivanje sa 1-im do 20 atoma ugljenika. Drugi hidroksili takođe mogu biti derivatizovani u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi takođe mogu sadržavati analogne forme šećera riboze ili deoksiriboze koji su dobro poznati upućenima u ovu oblast, uključujući, na primer, 2'-0-metil-, 2'-0-aIil, 2'-fluoro- ili 2'-azido-ribozu, karbociklične analoge šećera, .alfa.-anomerne šećere, epimerne šećere kao što je arabinoza, ksiloza ili liksoza, piranoza šećeri, furanoza šećeri, sedoheptuloza, aciklični analozi i abazični nukleozid analozi kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiesterskih veza može biti zamenjeno alternativnim grupama za vezivanje. Ove alternativne grupe za vezivanje uključuju, ali se ne ograničavaju na, primere gde je fosfat zamenjen sa P(0)S ("tioat"), P(S)S ("ditioat"), "(0)NR.sub.2 ("amidat"), P(0)R, P(0)OR', CO ili CH.sub.2 ("formacetal"), u kojima svaki R ili R' je nezavisno H ili substituisan ili nesubstituisan alkil (1-20 C.) koji može sadržavati etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Nema potrebe da sve veze u polinukleotidu budu identične. Opis koji sledi je primenjiv na sve ovde pomenute polinukleotide, uključujući RNA i DNA.

[0072]"Oligonukleotid," kako je upotrebljeno ovde, generalno se odnosi na kratki, obično jednostruko uvijen, generalno sintetski polinukleotid koji je generalno, ali ne obavezno, manje od oko 200 nukleotida u dužinu. Termini "oligonukleotid" i "polinukleotid" nisu naročito ekskluzivni. Gornji opis za polinukleotide je jednako i u potpunosti prihvatljiv za oligonukleotide.

[0073]Termin "faktor rasta hepatocita" ili "HGF", kako je ovde upotrebljen, odnosi se na, osim ako nije posebno ili kontekstom indikovano drugačije, na bilo koji prirodni ili varijantu (bilo prirodna ili sintetska) HGF polipeptida koji je sposoban da aktivira HGF/c-met signalni put pod uslovima koji omogućavaju da se taj proces odigra. Termin "sirov tip HGF" generalno se odnosi na polipeptid koji podrazumeva amino kiselinsku sekvencu koja se pojavljuje u prirodnom HGF proteinu. Termin "sekvenca sirovog tipa HGF " generalno se odnosi na amino kiselinsku sekvencu koja se nalazi u prirodnom HGF.

[0074]Termin "antitelo" i "imunoglobulin" su korišćeni naizmenično u širokom smislu i uključuje monoklonalna antitela (npr., puna dužina ili intaktno monoklonalna antitela), poliklonalna antitela, multivalentna antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela sve dotle dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost) i mogu takođe uključivati određene fragmente antitela (kao što je ovđe detaljnije opisano). Antitelo može biti humano, humanizovano i/ili unapređenog affini teta.

[0075]"Fragmenti antitela" podrazumevaju samo deo intaktnog antitela, gde je poželjno da deo obuhvata najmanje jednu, poželjno najveći deo svih, funkcija normalno vezanih za taj deo kada postoje u intaktnom antitelu. Prema jednom aspektu, fragment antitela obuhvata antigen vezujuće mesto intaktnog antitela i tako zadržava sposobnost antitela za vezivanje. Prema drugom aspektu, fragment antitela, na primer jedan koji obuhvata Fc region, zadržava najmanje jednu od bioloških funkcija normalno vezanih za Fc region kada je prisutan u intaktnom antitelu, kao što je FcRn vezivanje, modulacija polu života antitela, ADCC funkcija i vezivanja komplementa. Prema jednom aspektu, fragment antitela je monovalentno antitelo kojein vivoima polu život približno isti kao intaktno antitelo. Na primer, takav fragment antitela može se odnositi na ruku za vezivanje antigena vezanu za Fc sekvencu sposobnu da obezbediin vivostabilnost fragmenta. Prema jednom aspektu, antitelo iz pronalaska je jedno-ručno antitelo kako je opisano WO2005/063816. Prema jednom aspektu, jedno-ručno antitelo podrazumeva Fc mutacije koje grade "ispupčenja" i "uđubljenja" kako je opisano u VVO2005/063816. Na primer, mutacija uđubljenja može biti jedna ili više T366A, L368A i/ili Y407V u Fc polipeptidu, i mutacija ispupčenja može biti T366VV.

[0076]Termin "monoklonalno antitelo" kako je ovde upotrebljen odnosi se na antitelo đobijena od populacije stvarno homogenih antitela, npr., individualna antitela koja pripadaju populaciji su identična osim u slučaju mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjoj meri. Monoklonalna antitela su visoko specična, usmerena protiv jednog antigena. Pored toga, nasuprot preparatima poliklonalnih antitela koja obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu.

[0077]Monoklonalna antitela ovde specifično uključuju "himerična" antitela kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili su homologa sa odgovarajućim sekvencama u antitelu izvedenim iz određenih vrsta koje pripadaju određenoj klasi antitela ili subklasi, dok je ostatak lanca(s) identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelu izvedenom iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi antitela ili subklasi, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok ispoljavaju željene biološke aktivnosti (U.S. Patent No. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

[0078]"Humanizovane" forme non-humanih (npr., glodara) antitela su himerična antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz non-humanog imunoglobulina. U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipientno antitelo) u kom su ostatci iz hipervarijablnog dela recipienta zamenjeni ostatcima iz hipervarijablnog regiona non-humanih vrsta (donor antitelo) kao što je miš, pacov, zec ili nonhumani primat koja imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim instancama, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim non-humanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu pođrazumevati ostatke kojih nema u u recipientnom antitelu ili u donor antitelu. Ove modifikacije su načinjene da bi se dodatno unapredile performanse antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će obuhvatiti zapravo sve od najmanje jednog, i obično dva, varijablna domena, kod kojih će sve ili zaista sve hipervarijablne petlje korespondirati onima iz non-humanog imunoglobulina i svi ili zapravo svi FR-ovi su oni iz sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo opcionalno će takođe obuhvatiti najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj iz humanog imunoglobulina. Za dalje detalje, vidi Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struci Biol. 2:593-596 (1992). Vidi takođe sledeće revijalne članke i reference citirane u: Vasvvani and Hamilton, Ann. Allergv, Asthma & Imunol. 1:105-115(1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

[0079]"Antigen" je predeterminisan antigen za koji se antitelo može selektivno vezati. Ciljni antigen može biti polipeptid, ugljeni hidrat, nukleinska kiselina, lipid, hapten ili druga prirodna ili sintetska jedinjenja. Poželjno, ciljni antigen je polipeptid. "Akceptor humanog okvira" ovde ima svrhu da okvir podrazumeva amino kiselinsku sekvencu VL ili VH okvir izveden iz okvira humanog imunoglobulina, ili iz humanog konsenzus okvira. Akceptor humanog okvira "izveden iz" okvira humanog imunoglobulina ili humanog konsenzus okvira može pođrazumevati njihove iste amino kiselinske sekvence, ili može sadržavati pre-egzistentne izmene amino kiselinske sekvence. Gde su prisutne pre-egzistentne izmene amino kiselina, poželjno je ne više od 5 i poželjno 4 ili manje, ili 3 ili manje, prisutnih pre-egzistentnih izmena amino kiseline. Gde su prisutne pre-egzistentne izmene amino kiselina u VH, poželjno su to izmene samo na tri, dve ili jednoj od pozicija 71H, 73H i 78H; na primer, amino kiselinski ostaci na ovim pozicijama mogu biti 71 A, 73T i/ili 78A. Prema jednom aspektu, VL akceptor humanog okvira po sekvenci je identičan sa okvirom sekvence VL humanog imunoglobulina ili okvirom humane konsenzus sekvence.

[0080]"Humani konsenzus okvir" je okvir koji predstavlja amino kiselinski ostatak koji se najčešće pojavljuje u odabranim okvirima VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina. Uopšteno, odabrane VL ili VH sekvence humanog imunoglobulina su iz subgrupe sekvenci varijablnog domena. Uopšteno, subgrupa sekvenci je subgrupa kao kod Kabatet al.Prema jednom aspektu, za VL, subgrupa je subgrupa kapa I kao kod Kabatet al.Prema jednom aspektu, za VH, subgrupa je subgrupa III kao kod Kabatet al.

[0081]"VH subgrupa III konsenzus okvir" podrazumeva konsenzus sekvence dobijene iz amino kiselinskih sekvenci u varijablnoj teškoj subgrupi III kod Kabat 35et al.Prema jednom aspektu, VH subgrupa III konsenzus okvir amino kiselinske sekvence podrazumeva najmanje deo ili celu svaku od sledećih sekvenci: EVQLVESG-GGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:42)-Hl-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:43)-H2-RFTISRDNSKNT-LYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:44)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45).

[0082]"VL subgrupa I konsenzus okvir" podrazumeva konsenzus sekvence dobijene iz amino kiselinskih sekvenci u varijabilnoj lakoj kapa subgrupi I kod Kabat40et al.Prema jednom aspektu, VH subgrupa I konsenzus okvir amino kiselinske sekvence podrazumeva najmanje deo ili celu svake od sledećih sekvenci: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY SEQ ID NO:47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:48)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID

NO: 49) .

[0083]"Sirov humani okvir" je humani okvir koji ima iste amino kiselinske sekvence kao akceptor humanog okvira,npr.izostanak substitucije(-a) humane sa non-humanom amino kiselinom u akceptoru humanog okvira.

[0084]"Izmenjen hipervarijablni region" za ovdašnje potrebe je hipervarijablni region koji u sebi sadrži jednu ili više( npr.jednu do oko 16) amino kiselinskih substitucija.

[0085]"Sirovi hipervarijablni region" za ovdašnje potrebe je hipervarijabilni region koji ima iste amino kiselinske sekvence kao non-humano antitelo iz koga je dobijen, npr. jedno u kome nedostaje jedna ili više amino kiselinskih substitucija.

[0086]Termin "hipervarijabilni region", "HVR", ili "HV", kako se ovde koristi odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturu definisanu kao petlje. Uopšteno, antitela podrazumevaju šest hipervarijabilnih regiona; tri u VH (Hl, H2, H3), i tr VL (LI, L2, L3). Brojni prikazi hipervarijabilnih regiona je u upotrebi i ovde su obuhvaćeni. Kabat Complementarity Determining Regions (CDRs) se zasnivaju na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al., Sekvencas of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Nasuprot tome Chothia se odnosi na lokaciju strukturalnih petlji (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabat CDRs i Chothia strukturalnih petlji, i koristi ih Oxford Molecular's AbM antibody modeling softvvare. "Kontakt" hipervarijabilni regioni se zasnivaju na analizi dostupnih kompleksa kristalnih struktura. Ostaci svakog od ovih hipervarijabilnih regiona su dole notirani.

[0087]Hipervarijabilni regioni mogu pođrazumevati "produženi hipervarijabilni regioni" kako sledi: 24-36 ili 24-34 (LI), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL i 26-35 (Hl), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena su obeležani u skladu sa Kabatet al., supraza svaku od ovih definicija.

[0088]"Okvir" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena za razliku od ostataka hipervarijabilnog regiona kako je ovde definisano.

[0089]"Humano antitelo" je ono koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja korespondira sa antitelomkoje je humani proizved i/ ili je napravljeno primenom bilo koje tehnike zar pravljenje humanih antitela kako je ovde opisano. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje podrazumeva non-human antigen-vezujuće ostatke.

[0090]Antitelo "izmenjenog afiniteta" je ono koje ima jednu ili više alteracija u svojim CDRs što rezultira unapređenjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa antitelom od koga potiče a koje nema ove alteracije. Poželjni afinitet izmenjenog antitela će imati nanomolarni ili čak pikomolarni afinitet za ciljni antigen. Afinitet izmenjenog antitela se produkuje procedurama poznatim upućenima u ovu oblast. Marks etal. Bio/Technology 10:779-783(1992) opisuje izmenu afiniteta pomoću mešanja VH i VL domena. Random mutageneza CDR i/ili okvira ostataka je opisana kod: Barbasetal. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813

(1994); Schieretal. Gene 169:147-155(1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al,, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); anđ Havvkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0091]"Blokiranje" antitela ili "antagonist" antitelo je ono koje inhibira ili redukuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. Poželjno je da blokirajuća antitela ili antagonist antitela uglagvnom ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena.

[0092]"Agonist antitelo", kako je ovde upotrebljeno, je antitelo koje oponaša najmanje jednu od funkcionalnih aktivnosti polipeptida od interesa.

[0093]"Poremećaj" je bilo koje stanje u kome bi bilo koristi od tretmana sa substancom/molekulom ili metodom iz ovog pronalaska. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući ona patološka stanja koja predođređuju sisare za poremećaje o kojima se ovde radi. Primeri poremećaja bez-ograničenja za tretman ovde obuhvataju maligne i benigne tumore; non-leukemijske llmfoidne malignitete; neuronalne, glialne, astrocitalne, hipotalamičke i druge glandularne, makrofagalne, epitelijalne, stromalne i blastocitne poremećaje; i inflamatorni, imunološki i drugi poremećaji vezani za angiogenezu.

[0094] Termini "poremećaj ćelijske proliferacije" i "proliferativni poremećaj" se odnose na poremećaje koji su udruženi sa nekim stepenom abnormalnosti ćelijske proliferacije. Prema jednom aspektu, poremećaj ćelijske proliferacije je karcinom.

[0095] "Tumor", kako je ovde upotrebljen, odnosi se na svki neoplastični ćelijski rast i proliferaciju, kako maligne tako benigne, i sva pre-kancerozne i kancerozne ćelije i tkiva. Termini "karcinom", "kancerozni", "poremećaj ćelijske proliferacije ", "proliferativni poremećaj" i "tumor" nisu uzajamno ekskluzivni prema ovdašnjim navodima.

[0096] Termini "karcinom" i "kancerozni" se odnose na ili opisuju fiziološka stanja kod sisara koja su tipično karakterisana neregulisanim ćelijskim rastom/proliferacijom. Primeri karcinoma uključuju ali se na ograničavaju na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju. Određenije, primeri takvih karcinoma uključuju karcinom skvamoznih čelija, mikro-celularni karcinom pluča, non-mikro celularni karcinom pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, karcinom peritoneuma, hepatocelularni karcinom, gastrointestinalni karcinom, karcinom pankreasa, glioblastom, cervikalni karcinom, ovarijalni karcinom, karcinom jetre, karcinom mokraćne bešike, hepatom, karcinom dojke, karcinom kolona, kolorektalni karcinom, karcinom enđometrijuma ili uterusa, karcinom pljuvačnih žlezda, karcinom bubrega, karcinom jetre, karcinom prostate, karcinom vulvae, karcinom tiroidee, karcinom jetre i razne vrste karcinoma glave i vrata.

[0097] Disregulacija angiogeneze može voditi u mnoge poremećaje koji mogu biti tretirani preparatima i metodama iz ovog pronalaska. Ovi poremećaji uključuju oba, non-neoplastična i neoplastična stanja. Neoplastična uključuju ali se ne ograničavaju nagore opisana. Non-neoplastični poremećaji uključuju ali se ne ograničavaju na neželjenu ili aberantnu hipertrofiju, artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijazu, psorijatične plakove, sarkoidozu, aterosklerozu, aterosklerotične plakove, dijabetičnu i druge proliferativne retinopatije uključujući prematuritarnu retinopatiju, retrolentalnu fibroplaziju, neovaskularni glaukom, degeneraciju makule vezanu za starost, dijabetični edem makule, neovaskularizacija kornee, kornealni neo-vaskularizacioni graft, odbacivanje kornealnog graf ta, retinalno/horoidalna neovaskularizacija, neovaskularizacija ugla (rubeosis), okularna neovaskularna bolest, vaskularna restenoza, arteriovenske malformacije (AVM), meningiom, hemangiom, an-giofibrom, tiroidna hiperplazija (uključujući Grave-ovu bolest), transplantacija kornee i drugih tkiva, hronična inflamacija, upala pluća, akutna povreda pluća/ARDS, sepsa, primarna pulmonarna hipertenzija, maligne pulmonarne efuzije, cerebralni edem (npr., udružen sa akutnim Slogom/zatvorena povreda/ trauma glave), sinovijalna inflamacija, pannus formacija u RA, miositisossificans, hipertropična koštana formacija, osteoartritis(OA), refraktorni ascites, policistična bolest ovarijuma, enđometrioza, bolesti trećeg prostora tečnosti (pankreatitis, kompresioni sindrom, opekotine, bolest creva), uterini fibroidi, prevremeni porođaj, hronična inflamacija kao što je IBD (Crohn-ova bolest i ulcerozni kolitis), odbacivanje bubrežnog transplantata, inflamatorna bolest creva, nefrotski sindrom, nepoželjno ili aberantno masivno bujanje tkiva (non-kancer), hemofilični zglobovi, hipertrofični ožiljci, inhibicija rasta kose, Osler-20Weber sindrom, retrolentalna fibroplazija piogenog granuloma, sklerodermija, trahoma, vaskularne adhezije, sinovitis, đermatitis, preeklampsija, ascites, perikarđijalni izliv (kao onaj koji je udružen sa perikarđitisom), i pleuralni izliv.

[0098] Kako je ovde upotrebljen, "tretman" se odnosi na kliničke intervencije u nameri da se utiče na prirodni razvoj individue ili ćelije koja se tretira, i može se izvesti bilo radi profilakse ili tokom razvoja kliničke patologije. Poželjni efekti tretmana uključuju prevenciju pojavu ili ponovnu pojavu bolesti, ublažavanje simptoma, umanjivanje bilo kakve direktne ili indirektne patološke konsekvence bolesti, prevenciju metastaza, umanjenje stepena progresije bolesti, amelioracija ili palijacija stanja bolesti, i remisija ili poboljšana prognoza. Prema nekim aspektima, antitela iz ovog pronalaska su upotrebljena da uspore razvoj bolesti ili poremećaja.

[0099] "Efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u dozama i za neophodne periode vremena, da bi se dostigao željeni terapeutski ili profilaktički rezultat.

[0100] "Terapeutski efektivna količina" supstance/molekula iz ovog pronalaska, agonista ili antagonista može varirati u skladu sa faktorima kao što su stadijum bolesti, starost, pol, i težina individue, i sposobnost supstance/molekula, agonista ili antagonista da podstakne željeni odgovor u individui. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj je bilo koji toksični ili nepoželjni efekat supstance/molekula, agonista ili antagonista nadvladan terapeutski povoljnim efektima. "Profilactički efektivna količina" se odnosi na efektivnu količinu, u neophodnim dozama i periodima vremena, đa bi se dostigao željeni profilaktički rezultat. Obično ali ne i neophodno, pošto se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ranog stadijuma bolesti, profilaktička efektivna količina će biti manja nego terapeutski efektivna količina.

[0101]Termin "citotoksični agens" kako je ovde upotrebljen odnosi se na supstancu koja inhibira ili ometa funkciju ćelija i/ili prouzrokuje destrukciju ćelija. Termin treba da uključuje radioaktivne izotope (npr., At40211,111<1>,I12<5>, Y<*>, Re<1*>, Re<188>, Sm153,Bi212, P<32>i radioaktivne izotope Lu), hemoterapeutske agense npr. metotreksat, adriamicin, vink alkaloide (vinkristin, vinblastin, etoposid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalacione agense, enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitički enzimi, antibiotici, i toksini kao što su mali molekuli toksina ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante, i raznovrsne antitumorske ili antikancerozne agense dole obuhvaćene. Drugi citotoksični agensi su dole opisani. Tumoricidni agens prouzrokuje destrukciju tumorskih ćelija.

[0102]A "Hemoterapeutski agens" je hemijsko jedinjenje korisno u tretmanu karcinoma. Primeri hemo-terapeutskih agensa uključuju alkilirajuće agense kao što je tiotepa i CYTOXAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonati kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što je benzodopa, karbokvion, meturedopa, i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenefosforamid, trieti-ilenetiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); đelta-9-tet-rahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicini; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući sintetske analoge topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); briostatin; calistatin; CDC-1065 (uključujući itsadozelezin, karzelezin i bize-lezin sintetski analozi); podofilotoksin; podofilinska kiselina; tenipozid; kriptoficin (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetske analoge, KVV-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; azarkodiktin; spongistatin; azotni muštardi kao što je hlorambucil, hlomafazin, holofosfamiđ, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, pređnimusdn, trofosfamid, uracil mustarđ; nitrouree kao askarmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomus-tin, nimustin, i ranimnustin; antibiotici kao što su enedin antibiotici (npr., kaliheamicin, naročito kaliheam-icin gamall i kaliheamicin omegall (vidi,npr.,Agnevv, Chem Intl. Ed. Engl, 33:183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i slični hromoproteinski enediin antiobiotski hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kactinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicin kao što je mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, strepto-zocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što je metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, carmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što je kalusteron, dromostanolon pro-pionat, epitiostanol, mepitiostan, testolacton; anti- adrenalni kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; folna kiselina replenishersuchasfrolinicaciđ; aceglaton; aldofosfamideglikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfomitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; maitansinoidi kao što je maitanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharid kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rhizoksin; sizofiran; spiro-germanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2',202"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); tiotepa; taksoidi,npr.,TAXOL® paclitakel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ Cremophor-free, albumin-nadograđena nanopartikularna formulacija paclitaksel-a (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), i TAXOTERE® doksetaksel (Rhčne-Poulenc Rorer, Antonv, France); hloranbucil; gemcitabin (GEMZAR®); 6-25tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinum analozi kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platinum; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vincristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leukovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; ami-nopterin; ibandronat; topoisomeraze inhibitor RFS 2000; đifluorometlilomitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina; kapecitabin (XELODA®); farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo koje gore pomenute; kao i kombinacije dve ili više gornjih kao što je CHOP, skraćenje za kombinovanu terapiju ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, i prednizolon, i FOLFOX, skraćenje za oblik treatmana sa oksaliplatinom (ELOXA-TIN™) kombinovanog sa 5-FU i leukovovinom.

[0103]U ovu definiciju su takođe uključeni anti-hormonalni agensi koji deluju kao regulatori, reduktori, blokatori, ili inhibitori efekata hormona koji mogu doprineti rastu karcinoma, i obično su u formi sistemskog, ili treatmana celog tela. Hormoni mogu biti i oni sami. Primeri uključuju antiestrogene i selektivne modulatore receptora estrogena (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®tamoksifen), EVTSTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i FARESTON® toremifen; anti-progesteroni; dovvn-regulatori receptora estrogena (ERDs); agensi koji funkcionišu tako da suprimiraju ili isključuju ovarie, na primer, agonisti leutinizirajući hormon-oslobađajućeg hormona (LHRH) kao što je LUPRON® i ELIGARD® leuprolid acetat, gos-erelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; drugi antiandrogeni kao što je flutamid, nilutamid i bikalutamid; i aromataze inhibitori koji inhibiraju aromataza enzime, koji regulišu produkciju estrogena u adrenalnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megesrrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, i ARIMIDEX® anastrozol. Pored toga, takva definicija hemoterapijskih agensa uključuje bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OS-TAC®), DIDROCAL® etidronat, NE-4558095, ZOMETA® zoledronska kiselina/zoledronat, FGSAMAX® alendronat, ARE-DIA® pamidronat, SKELID® tiludronat, ili ACTONEL® risedronat; isto kao troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozid citozin analog); antisens oligonucleotidi, naročito oni koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnom putu vezanom za izmenjenu ćelijsku proliferaciju, kao što je, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras, i receptor factora rasta epiderma (EGF-R); vakcine kao što je THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina, and VAPID® vakcina; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditosilat (ErbB-2 i EGFR inhibitor malog-molekula dual tirozinkinaze poznate takođe kao GW572016); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo koje gore navedene.

[0104]" Agens koji inhibira rast" kako je ovde upotrebljen odnosi se na jedinjenja ili preparate koji inhibiraju rast ćelije čiji je rast zavistan od HGF/c-met aktivacije kakoin vitrotako iin vivo.Tako, agens koji inhibira rast može biti onaj koji značajno redukuje procenat HGF/c-met-zavisnih ćelija u S fazi. Primeri agensa koji inhibiraju rast uključuju agense koji blokiraju ciklus ćelijske progresije (na mestu koje nije S faza), kao što su agensi koji indukuju Gl zatvaranje i zatvaranje M-faze. Klasični blokatori M-faze uključuju vinkas(vinkristin i vinblastin), taksane, i inhibitore topoizomeraze II kao što je doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopoziđ, i bleomicin. Ovi agensi koji zatvaraju Gl takođe zahvataju i zatvaranje u S-fazi, na primer, DNA alkilacioni agensi kao što je tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil, i ara-C. Dodatne informacije se mogu naći u The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, naslovljen "Cell cyđe regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" od Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), naročito str. 13. Taksani (paclitaksel i đocetaksel) su antikancerozni lekovi oba izdvojena tisinog drveta. Đocetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), izdvojen iz Evropske tise, je semisintetski analog paclitaksel-a (TAXOL®, BristoI-Myers Squibb). Paclitaksel i đocetaksel podpomažu grupisanje mikrotubula iz tubulin đimera i stabilišu mikrotubule prevencijom depolimerizacije, koja rezultira inhibicijom ćelijske mitoze.

[0105]"Doksorubicin" je antraciklinski antibiotik. Puno hemijsko ime doksorubicina je (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoksi-a-L-likso-heksapiranozil)oksi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,ll-trihidroksi-8-(hidroksiacetil)-l-metoksi-5,12-naftacenedion.

Generisanie varijante antitela koje ispoljava redukovani HAMA odgovor ili njegovo odsustvo

[0106]Redukcija ili eliminacija HAMA odgovora je značajan aspekt kliničkog razvoja prikladnog terapeutskog agensa. Vidi, npr., Khaxzaeli etal., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffersetal., Transplantation

(1986), 41: 572; Shavvleretal., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller etal, Blood (1983), 62:988; Hakimi etal., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann etal, Nature (1988), 332:323; Junghans et al„ Cancer Res. (1990), 50:1495. Kako je ovde opisano, pronalazak obezbeđuje antitela koja su humanizovana tako da je HAMA odgovor redukovan ili eliminisan. Varijante ovih antitela se dalje mogu dobiti primenom rutinskih metoda poznatih upućenima u ovu oblast, od kojih su neke dalje dole opisane.

[0107] Na primer, amino kiselinska sekvenca iz antitela kako je ovde opisano može služiti kao polazna

(roditeljska) sekvenca za razdvajanje okvira i/ili hipervarijabilne sekvence(s). Odabrana okvirna sekvenca za koju je vezana polazna hipervarijablna sekvenca odnosi se, kako je ovde navedeno, na akceptor humanog okvira. Dok akceptor humanih okvira može biti od, ili izveden od, humanog imunoglobulina (njihovi VL i/ ili VH regioni), poželjno akceptori humanih okvira su od, ili izvedeni od, sekvence humanog konsenzus okvira i takvi okviri ispoljavaju minimalnu, ili nemaju, imunogenost kod humanih pacijenata.

[0108]Gde je akceptor izveden iz humanog imunoglobulina, može se po mogućstvu odabrati sekvenca humanog okvira koja je odabrana na osnovu njene homologije sa donorskim okvirom sekvence slaganjem donorske okvirne sekvence sa različitim humanim okvirnim sekvencama u kolekciji humanih okvirnih sekvenci, i odabiranjem kao akceptora naj-homologije okvirne sekvence.

[0109]Prema jednom aspektu, ovde su humani konsenzus okviri od, ili izvedeni od, VH subgrupe III i/ili VL kapa subgrupe I konsenzus okvirnih sekvenci.

[0110]Tako, VH akceptor humanog okvira može pođrazumevati jednu, dve, tri ili sve od sledećih okvirnih sekvenci:

FR1 podrazumeva EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:42),

FR2 podrazumeva WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:43),

FR3 podrazumeva FR3 podrazumeva RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:50), gde XI predstavlja

A ili R, X2 je T ili N, i X3 je A ili L,

FR4 podrazumeva WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45).

[0111]Primeri za VH konsenzus okvire uključuju: humanu VH subgroupu I konsenzus okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:4519);

humanu VH subgroupu I konsenzus okvir minus produžen hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:20-22);

humanu VH subgroupu II konsenzus okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:23);

humanu VH subgroupu II konsenzus okvir minus produžen hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:24-26);

humanu VH subgroupu III konsenzus okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:27);

humanu VH subgroupu III konsenzus okvir minus produžen hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO5028-30);

humani VH akceptor okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:31);

humani VH akceptor okvir minus produžen hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:32-33);

humani VH akceptor 2 okvir minus Kabat CDRs (SEQ ID NO:34); ili

humani VH akceptor 2 okvir minus produžen hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:35-37).

[0112]Prema jednom aspektu, VH akceptor humanog okvira podrazumeva jednu, dve, tri ili sve od sledećih okvirnih sekvenci:

FR1 podrazumeva EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID

NO:42), FR2 podrazumeva WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:43),

FR3 podrazumeva RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:51),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:52),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:53),

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO:54), or

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO:55) FR4

podrazumeva WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45).

[0113]VL akceptor humanog okvira može pođrazumevati jednu, dve, tri ili sve sledeće okvirne sekvence:

FR1 podrazumeva DIQN4TQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:46),

FR2 podrazumeva WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:47),

FR3 podrazumeva GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:48),

FR4 podrazumeva FGOGTKVEIK (SEQ ID NO:49).

Primeri za VL konsenzus okvire uključuju:

humana VL kapa subgroupa I konsensus okvir (SEQ ID NO:38);

humana VL kapa subgroupa II konsenzus okvir (SEQ ID NO:39);

humana VL kapa subgroupa III konsenzus okvir (SEQ ID NO:40); ili

humana VL kapa subgroupa IV konsenzus okvir (SEQ ID NO:41)

[0114]Dok akceptor može biti identičan u sekvenci sa odabranom humanom okvir sekvencom, bilo da je iz humanog imunoglobulina ili humanog konsenzus okvira, predočeni pronalazak posmatra akceptor sekvencu tako đa može obuhvatati pre-egzistentne amino kiselinske supstitucije u odnosu na humanu imunoglobulinsku sekvencu ili humanu konsenzus okvirnu sekvencu. Ove pre-egzistentne supstitucije su poželjno minimalne; obično četiri, tri, dve ili samo jedna razlika u amino kiselini u odnosu na humanu imunoglobulinsku sekvencu

ili konsenzus okvirnu sekvencu.

[0115]Ostaci hipervarijablnog regiona non-humanog antitela su inkorporirani u VL i/ili VH akceptor humanog okvira. Na primer, ostaci mogu biti inkorporirani korespondirajući sa Kabat CDR ostacima, ostaci Chothia hipervarijabilne petlje, Abm ostaci, i/ili kontakt ostaci. Moguće je da ostaci produženog hipervarijabilnog regiona budu inkorporirani kako sledi: 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3), 26-35 (Hl), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102,94-102, ili 95-102 (H3).

[0116]Dok je ovde diskutovana "inkorporacija" ostataka hipervarijabilnog regiona, bilo bi poželjno kada bi se to postiglo na različite načine, na primeer, kodiranjem nukleinskom kiselinom željena amino kiselinska sekvenca može biti generisana mutacijom kodiranja sekvence nukleinske kiseline varijabilnog domena miša tako da su njegovi okvir ostaci izmenjeni u akceptor humanig okvir ostataka, ili mutiranjem kodiranja sekvence nukleinske kiseline humanog variabilnog domena tako da su ostaci hipervarijabilnog domena izmenjeni u non-humane ostatke, i kombinovanjem koda željene sekvence nukleinske kiseline, itd.

[0117]U ovdašnjim primerima, varijante kalemljenog hipervarijabilog regiona su generisane Kunkelmutagenezom koda nukleinske kiseline humanih akceptor sekvenci, koriščenjem separatnog oligonukleotida za svaki hipervarijabilni region. Kunkel et al., Methods Enzvmol. 154:367-382 (1987). Odgovarajuće izmene mogu biti ugrađene u okvir i/ili hipervarijabilni region, primenom routinskih tehnika, da bi se korigovale i ponovo ustanovile pravilne interakcije hipervarijabilni region-antigen.

[0118]Phage(mid) displav (ovde pomenuto takođe kao fage prikaz u nekim kontekstima) može se koristiti kao prikladna i brza metoda za generisanje i skrining mnogih različitih potencijalnih varijanti antitela u banci generisanoj randomizacijom sekvence. Svakako, upućenoj osobi dostupne su i druge metode za pravljenje i skrining izmenjenih antitela.

[0119]Phage(mid) displav tehnologija je obezbedila moćno oruđe za generisanje i selekciju novih proteina koji se vezuju za liganđ, kao što je antigen. Primenom tehnika phage(mid) displav omogućeno je generisanje velikog dijapazona varijanti proteina koji mogu biti brzo sortirani za one sekvence koje se vezuju za ciljni molekul sa velikim afinitetom. Varijante koda polipeptida nukleinskih kiselina su generalno ujedinjene u kod sekvence nukleinske kiseline virusnog membranskog proteina, kao što je protein gena III ili protein gena VIII. Razvijeni su monovalent phagemid displav sistemi kod kojih su sekvence nucleinske kiseline kodirani protein ili polipeptid ujedinjene sa sekvencom nucleinse kiseline kodirane kao protein dela gena III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lovvman and VVells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). U monovalent phagemid display sistemu, fuzija gena je ispoljena na niskom nivou i proteini sirovog tipa gena III su takođe ispoljeni tako da je infektivnost partikula očuvana. Metode generisanja banke peptida i skrining tih banaka je uključen u mnoge patente (npr. U.S. Patent No. 5,723,286, U.S. Patent No. 5,432,018, U.S. Patent No. 5,580,717, U.S. Patent No. 5,427,908 and U.S. Patent No. 5,498,530).[0120]Banke antitela ili antigen vezujućih polipeptida su stvorene na brojne načine uključujući alteraciju pojedinačnog gena random umetanjem DNA sekvenci ili kloniranjem familije srodnih gena. Metode za prikazivanje antitela ili antigen vezujućih fragmenata primenom phage(mid) display opisane su u U.S. Patent Nos. 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717, i 5,658,727. Banka je potom sortirana za ekspresiju antitela ili antigen vezujućih proteina sa željenim karakteristikama.

[0121]Metode supstitucije izabrane amino kiseline u strukturi nucleinske kiseline su dobro ustanovljene u ovoj oblasti, a neke od njih su ovde opisane. Na primer, ostaci hipervarijabilnog regiona mogu biti supstituisani primenom Kunkel metode. Vidi,npr.,Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).

[0122]Sekvence oligonukleotida uključuju jednan ili više setova dizajniranih kodova za izmenu ostataka hipervarijabilnog regiona.Set kodova je set različitih triplet sekvenci nukleotida upotrebljen za kodiranje željene varijante amino kiselina. Set kodova može biti prikazan koriščenjem simbola za obeležavanje određenih nukleotida ili ekvimolarnih smesa nukleotida kako je dole prikazano u skladu sa IUB kodom.

IUB KODOVI

G Guanin

A Adenin

T Timin

C Citozin

R (A ili G)

Y (C ili T)

M (A ili C)

K (G ili T)

S (C ili G)

W (A ili T)

H (A ili C ili T) B (C ili G ili T)

V(AiliCiliG)

D (A Ui G ili T)H

N(AiliCiliGiliT)

[0123] Na primer, u setu kodova DVK, D mogu biti nukleotidi A ili G ili T; V može biti A ili G ili C; i K može biti G ili T. Ovaj kod set može predstavljati 18 različitih kodona i može označavati amino kiseline Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, i Cys.

[0124] Oligonukleotid ili primarni setovi mogu biti sintetisani primenom standardnih metoda. Set oligonukleotida može biti sintetisan, na primer, sintezom u čvrstoj fazi, koja sadrži sekvence koje predstavljaju sve moguće kombinacije nukleotid tripleta obezbeđene kodon setom koji će označiti željenu grupu amino kiselina. Sinteza oligonukleotida sa odabranom "degeneracijom" nukleotida na određenim pozicijama dobro je poznata upućenima u ovu oblast. Takvi setovi nukleotida koji imaju određene kodon setove mogu biti sintetisani primenom komercijalne sinteze nukleinske kiseline (dostupne kod, na primer, Applied Biosvstems, Foster City, CA), ili se može dobiti komercijalno (na primer, od Life Technologies, Rockville, MD). Zato će, sintetisani set oligonukleotida koji ima određeni kođon set obično uključivah mnoge oligonukleotide sa različitim sekvencama, razlike uvedene kodon setom u okviru sekvence sa kraja na kraj. Oligonukleotidi, kako su upotrebljeni u skladu sa pronalaskom, imaju sekvence koje dopuštaju hibridizaciju modelu nukleinske kiseline varijabilnog domena i mogu takođe uključivati restrikciju enzimskog mesta u svrhe kloniranja.

[0125] Po jednoj metodi, sekvence nukleinske kiseline sa varijantom koda amino kiselina mogu biti kreirane pomoću oligonukleotid-posređujuće mutageneze. Ova tehnika je dobro poznata upućenima u ovu oblast kako je opisao Zolleretal. Nucleic Aciđs Res. 10:6487-6504 (1987). Doslovno, sekvence nukleinskih kiselina kodrane varijantom amino kiselina kreirane su hibriđizacijom oligonukleotidnog seta koji sadrži željene kodon setove za DNA model, gde je model jednostruko-previjena forma plazmida koji sadrži nukleinske kiseline varijabilnog regiona modela sekvence. Posle hibridizacije, DNA polimeraza se koristi za sinteze cele druge komplementarne trake modela koji će tako inkorporirati oligonukleotid, i sadržavaće kodon setove kako diktira oligonukleotid set.

[0126] Uopšteno, korišćeni su oligonukleotidi sa najmanje 25 nukleotida u dužini. Optimalni oligonukleotid će imati 12 do 15 nukleotida koji su u potpunosti komplementarni sa uzorkom na obe strane nukleotida koji se kodira za mutaciju(e). Ovo osigurava da će oligonukleotid biti hibriđiziran kako treba u odnosu na pojedinačni-50ostruko previjeni molekul DNA kao model. Oligonukleotidi su bez problema sintetisani primenom tehnika poznatih upućenima u ovu oblast kao što su opisali Crea et al., Pro. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).

[0127] DNA model je generisan pomoću onih vektora koji su izvedeni iz bakteriofage M13 vektora (prikladni su komercijalno dostupni M13mpl8 i M13mpl9 vektori), ili oni vektori koji sadrže replikacije jednom-previjene fage porekla kako je opisao Vieraetal., Meth. Enzvmol., 153:553 (1987). Tako, DNA koja treba da bude mutirana može bih insertovana u jedan od ovih vektora u svrhu generisanja jednom-previjenog modela. Produkcija jednom-previjenog modela je gore opisana u odeljcima 4.21-4.41 u Sambrooket al.,.

[0128] Da bi se izmenila nativna DNA sekvenca, oligonukleotid je hibridizovan u jednostruko previjen model pod prikladnim uslovima za hibridizaciju. DNA polimerizujući enzimi, obično T7 DNA polimeraza ili Klenovv fragment u DNA polimerazi I, je potom dodat da bi se sintetisala komplementarna traka u odnosu na model primenom oligonukleotida kao uzorka za sintezu. Tako je formiran heterodupleks molekul tako da jedan lanac DNA nosi kod mututirane forme gena 1, i drugi lanac (originalni model) ima kod negativa, nepromenjena sekvenca gena 1. Ovaj heterodupleks molekul je potom transformisan u prikladnu ćeliju domaćina, obično prokariote kao što je E.cohJM101. Po okončanju rasta ćelija, one su postavljene su na agaroza ploče i pregledane koriščenjem oligonukleotida radioobeleženog sa 32-Fos-fatom da bi se identifikovale bakterijske kolonije koje sadrže mutiranu DNA.

[0129] Metoda opisana odmah iznad može biti modifikovana tako da se homodupleks molekul kreira tako da oba lanca plazmida sadrže mutaciju(e). Modifikacije su kako sledi: jednostruki oligonukleotid je prekaljen u jedno-lančani model kako je gore opisano. Smesa od tri deoksiribonukleotida, deoksiriboadenozina (dATP), deoksiriboguanozina (dGTP), i deoksiribotimidina (dTT), je pomešana sa modifikovanim tiođeoksiribocitozinom zvanim đCTP-(aS) (koji se može nabaviti od Amersham). Ova smesa je đodata kompleksu mođel-oligonukleotiđ. Posle dodavanja DNA polimeraze ovoj smesi, generiše se lanac DNA identičan modelu osim mutairanih baza. Pored toga, ovaj novi lanac DNA će sadržavati dCTP-(aS) umesto dCTP, koji ima ulogu da je zaštiti od ograničene digestije endonukleaze. Pošto je model lanca iz dvostrukog-lanca heterodupleksa odvojen sa odgovarajućim restrikcionim enzimom, lanac model može biti svaren pomoću ExoIII nukleaze ili druge odgovarajuće nukleaze osim regiona koji sadrži mesto(a) koja treba da budu mutirana. Reakcija je potom zaustavljena da bi ostao molekul koji je samo delimično jedno-lančani. Kompletan dvo-lančani DNA homodupleks je potom formiran koriščenjem DNA polimeraze u prisustvu sva četiri deoksiribonukleotid trifosfata, ATP, i DNA ligaze. Ovaj homodupleks molekul može potom biti transformisan u prikladnu ćeliju domaćina.

[0130]Kao što je predhodno naznačeno sekvenca seta oligonukleotida je dovoljne dužine za hibridizaciju u model nukleinske kiseline i može takođe, ali ne obavezno, sadržavati mesta sa ograničenjem. DNA model može biti generisan onim vektorima koji su ili derivati vektora M13 bakteriofage ili vektora koji sadrži jedno-lančani fage poreklom od replikacije kako je opisana u Vieraetal. Meth. Enzvmol.., 153:3(1987). Tako, DNA koja treba da bude mutirana mora biti insertovana u jedan od ovih vektora da bi se generisao jedno-lančani model. Produkcija jedno-lančanog modela je opisana u poglavljima 4.21-4.41 u Sambrooket al., supra.

[0131]Prema drugoj metodi, banka može biti generisana obezbeđivanjem uzlaznih i silaznih setova oligonukleotida, gde svaki set ima mnoštvo oligonukleotida sa različitim sekvencama, a različite sekvence su ustanovljene setovima kodova obezbeđenih u okviru sekvence oligonukleotida. Uzlazni i silazni setovi oligonukleotida, zajedno sa variabilnim domenom modela sekvence nukleinske kiseline, mogu biti upotrebljeni u reakciji lanca polimeraze da bi se generisala "banka" PCR produkata. PCR produkti mogu se odnositi na " kasete nukleinske kiseline ", kako mogu biti fuzionisani sa drugim srodnim ili nesrodnim sekvencama nukleinske kiseline, na primer, virusni površinski proteini i dimerizacioni domeni, koriščenjem ustanovljenih tehnika molekularne biologije.

[0132]Sekvence PCR primera uključuju jedan ili više oblikonavih setova kodova za prihvatljivi rastvarač i veoma različite pozicije u hipervarijabilnom regionu. Kako je gore opisano, set kodova je set različitih tripleta sekvenci nukleotida korišćenih za kodiranje željene varijante amino kiselina.

[0133]Predstavnici antitela koji dostižu željene kriterijume, kako su odabrani pomoću odgovarajućih skrining/selekcionih postupaka mogu biti izolovani i klonirani primenom standardnih rekombinantnih tehnika.

Vektori, Ćelije domaćini i Rekombinantne Metode

[0134]Za rekombinantnu produkciju antitela iz ovog pronalaska, kodirane nukleinske kiseline su izolovane i insertovane u replikabilni vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNA) ili za ekspresju. Kodiranjem DNA lako se izoluje antitelo i sekvencioniše primenom konvencionalnih procedura( npr.,koriščenjem oligonukleotid proba koje su sposobne za specifično vezivanje za gene kodiranih teških i lakih lanaca antitela). Mnogi vektori su dostupni. Izbor vektora delimično zavisi od ćelija domaćina koje će se koristiti. Uopšteno, prednost imaju ćelije domaćini koje su ili prokariotskog ili eukariotskog porekla (generalno sisara).

Generisanje antitela primenom prokariotskih ćelija domaćina:Konstrukcija Vektora

[0135]Sekvence polinukleotida kodiranih polipeptiđnih komponenata antitela iz ovog pronalaska mogu se dobiti primenom standardnih rekombinantnih tehnika. Poželjne polinukleotidne sekvence mogu biti izolovane i odvojene od ćelija koje produkuju antitela kao što su hibridoma ćelije. Alternativno, polinukleotidi mogu biti sintetisani primenom nukleotid sintetizera ili PCR tehnike. Jednom dobijene, sekvence kodiranih polipeptida su insertovane u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i ekspresiju heterologa polinukleotida u prokariotskim domaćinima. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati upućenima u ovu oblast mogu biti upotrebljene u svrhu predočenog pronalaska. Selekcija odgovarajućeg vektora će zavisiti uglavnom od veličine nukleinskih kiselina koje treba insertovati u vektor i određenu ćeliju domaćina koju vektorom treba transformisati. Svaki vektor sadrži različite komponente, zavisno ođ njegove funkcije (amplifikacija ili ekspresija heterologih polinukleotida, ili oba) i njegove kompatibilnosti sa određenom ćelijom domaćinom u kojoj boravi. Vektor komponente generalno uključuju, ali se ne ograničavaju na: poreklo replikacije, selekciju markera gena, promotera, ribozom vezujuće mesto (RBS), signalnu sekvencu, heterologe inserte nukleinske kiseline i transkripciju terminalne sekvence.

[0136]Generalno, plazmid vektori koji sadrže replikacione i kontrolne sekvence koje su izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinom koriste se u vezi sa ovim domaćinima. Vektor obično nosi replikaciono mesto, kao što stvara sekvence koje su sposobne da obezbeđe fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Na primer, E.colije tipično izmenjena koriščenjem pBR322, plazmida izdvojenog iz E.colivrste. pBR322 sadrži gene koji kodiraju rezistenciju na ampicillin (Amp) i tetraciklin (Tet) i tako obezbeđuju laku proizvodnju transformisanih ćelija. pBR322, njegovi derivati, ili drugi mikrobiološki plazmidi ili bakteriofage takođe mogu sadržavati, ili biti modifikovani da sadrže, promotere koji mogu biti upotrebljeni od strane mikrobioloških organizama za ekspresiju endogenih proteina. Primeri za pBR322 derivate korišćene za ekspresiju određenih antitela su detaljno opisani u Čarter et al., U.S. Patent No. 5,648,237.

[0137]Pored toga, fage vektori koji sadrže replikacione i kontrolne sekvence koje su kompatibne sa mikro-organizmom domaćinom mogu biti upotrebleni kao transformacioni vektori u vezi sa ovim domaćinima. Na primer, bakteriofage kao što je AGEM.TM.-ll mogu se koristiti u pravljenu rekombinantnog vektora koji može biti upotrebljen da transformiše podložnu ćeliju domaćina kao što je £.coliLE392.

[0138]Ekspresioni vektor iz ovog pronalaska može pođrazumevati dva ili više promoter-cistron parova, kodirajući svaku od polipeptidnih komponenata. Promoter je neprevedena regulatorna sekvenca postavljena uzvodno (5') na cistron koji modulira njegovu ekspresiju. Prokariotski promoteri tipično spadaju u dve klase, induktivnu i konstitutivnu. Induktivni promoter je promoter koji inicijalizira povišene nivoe transkripcije cistrona pod njegovom kontrolom u odgovoru na promene u stanju kulture, npr. prisustvo ili odsustvo nutrienta ili promena temperature.

[0139]Velik broj promotera prepoznat od mnogih potencijalnih ćelija domaćina je dobro poznat. Odabrani promoter može biti operativno vezan za cistron DNA kodiranu sa lakim ili teškim lancem uklanjanjem promotera sa ključem DNA preko restrikcije enzimske digestije i insertovanja izolovane promoter sekvence u vektor iz ovog pronalaska. Oba, nativna promoter sekvenca i mnogi heterologi promoteri mogu se koristiti za direktnu amplifikaciju i/ili ekspresiju ciljnih gena. Prema nekim aspektima, heterologi promoteri se koriste, jer oni generalno dopuštaju veću transkripciju i veći prinos ekspresioniranog ciljnog gena u poređenju sa nativnim ciljnim polipeptidnim promoterom.

[0140]Promoteri prikladni za korišćenje sa prokariotskim domaćinom uključuju PhoA promoter, 30p-galaktamaza i laktoza promoter sisteme, triptofan (trp) promoter sistem i hibrid promotere kao što jetacilirrcpromoter. Svakako, drugi promoteri koji su funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi poznati bakterijski ili fage promoteri) su pogodan izvor. Njihove sekvence nukleotida su objavljene, omogućivši tako spretnom radniku da ih operabilno veže za cistrone kodirajući ciljne lake i teške lance (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) koriščenjem linkera ili adaptora da bi snabdeo bilo koju potrebnu restrikcionu poziciju.

[0141]Prema jednom aspektu ovog pronalaska, svaki cistron u rekombinantnom vektoru podrazumrva izbor komponente signalne sekvence koja diriguje translokaciju ekspresioniranih polipeptida kroz membranu. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora, ili može biti deo ciljnog polipeptida DNA koji je insertovan u vektor. Signalna sekvenca odabrana u svrhu ovog pronalaska trebalo bi da bude neka koja je prepoznata i procesuirana (npr. odvojena signal peptidazom) pomoću ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćine koje ne prepoznaju i procesuiraju signalne sekvence nativne u odnosu na heterologe polipeptide, signalna sekvenca je supstituisana sa prokariotskom signalnom sekvencom odabranom na primer, iz grupe koju čine alkalna fosfataza, penicillinaza, Ipp, ili termo-stabilni enterotoksin II (STII) lideri, LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. Prema jednom aspektu pronalaska, signalne sekvence korišćene u oba cistrona ekspresionog sistema su STII signalne sekvence ili njihove varijante.

[0142]Prema drugom aspektu, produkcija imunoglobulina u skladu sa ovim pronalaskom se može pojaviti u citoplazmi ćelije domaćina, i zato ne zahteva prisustvo sekrecionih signalnih sekvenci u svakom cistronu. U tom poglrdu, ekspresija imunoglobulin lakih i teških lanaca, izuvijani i ukomponovani da formiraju funkcionalne imunoglobuline u citoplazmi. Određene vrste domaćina (npr.,E. coli trxB-vrste) pružaju poželjne uslove u citoplazmi za formiranje disulfidne veze, omogućavajući tako odgovarajuće uvijanje i komponovanje ekspresionih proteinskih subjedinica. Proba and Pluckthun Gen, 159:203 (1995).

[0143]Predočeni pronalazak obezbeđuje ekspresioni sistem u kom kvantitativni odnos ekspresionih polipeptidnih komponenata može biti modulisan radi maksimiziranja prinosa sekretovanih i pravilno komponovanih antitela iz ovog pronalaska. Takva modulacija je kompletirana najmanje delimično simultanom modulacijom translacionih veza polipeptidnih komponenata.

[0144]Jedna tehnika za modulaciju translacionih veza je uključena u Simmons et al., U.S. Pat. No. 5,840,523. Ona koristi varijante translacionog inicijacionog regiona (TIR) u cistronu. Za dati TIR, serija varijanti amino kiselina ili sekvenci nukleinskh kiselina može biti kreirana nizom translacionog vezivanja, obezbeđujući tako prikladan način za podešavanje faktora željenog stepena ekspresije specifičnog lanca. TIR varijante mogu biti generisane konvencionalnim mutageneckim tehnikama koje rezultiraju u promenama koda koji može uticati na amino kiselinsku sekvencu, iako su poželjnije nečujne izmene u sekvenci nukleotida. Alteracije u TIR mogu uključiti, na primer, alteracije u broju ili razmaku Shine-Dalgarno sekvenci, zajedno sa alteracijama u signalnoj sekvenci. Jedna metoda za generisanje mutant signalnih sekvenci je generisanje "kodon banke" na početku kodirajuće sekvence koja ne menja amino kiselinsku sekvencu signalne sekvence (npr., izmene su nečujne. Ovo može biti upotpunjeno promenom treče nukleotid pozicije svakog kodona; pored toga, neke amino kiseline, kao što je leucin, serin, i arginin, imaju multiple prve i druge pozicije koje mogu dodati kompleksnost u pravljenju banke. Ova metoda mutageneze je detaljno opisana u Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzvmol. 4:151-158.

[0145]Poželjno, set vektora je generisan u opsegu TIR podešavanja za svaki tamošnji cistron. Ovaj ograničeni set omogućava poređenje ekspresionih nivoa svakog lanca kao i dobijenih od produkta željenog antitela pod raznim kombinacijama TIR vezivanja. TIR veze mogu biti određene pomoću kvantifikacije nivoa ekspresije reporter gena kako je detaljno opisano u Simmons et al. U.S. Pat. No. 5, 840,523. Zasnovano na snazi translacionog vezivanja, željeni individualni TIRs su odabrani tako da se kombinuju u konstrukcijama ekspresionog vektora iz ovog pronalaska.[0146]Prokariotske ćelije domaćina prikladne za ekspresiju antitela iz ovog pronalaska uključuju Archaebakterije i Eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi. Primer korisnih bakterija uključuje Escherichia (npr.,E. coli),Bacilli (npr., B. subtilis), Enterobakterije, Pseuđomonas vrste (npr., P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ili Paracoccus. Prema jednom aspektu, koriste se gram-negativne ćelije. Prema jednom aspektu,E. colićelije su korišćene kao domaćini za pronalazak. Primeri E.colivrsta uključuju soj W3110 (Bachmarvn, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (VVashington, D.C.: American Sođety for MicrobioIogy, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) i njegove derivate, uključujući soj 33D3 koji ima genotip W3110AfliuA ( AtonA) ptr3 lac la lacL8 AompTA( ntnpc- fepE) đegP41 kan<R>(U.S. Pat. No. 5,639,635). Drugi sojevi i njihovi derivati, kao što je E.coli294 (ATCC 31,446), E.coli B, E. colix1776 (ATCC 31,537) i E.coliRV308(ATCC 31,608) su takođe prikladni. Ovi primeri su ilustrativni pre nego ograničavajući. Metode za konstrukciju derivata bilo koje od gore pomenutih bakterija koje imaju đefinisane genotipove poznate su upućenima u ovu oblast i opisane u, na primer, Bass et al., Proteins, 8:25309-314 (1990), Generalno je neophodno da se odaberu odgovarajuće bakterije imajući u vidu replikabilnost replikona u ćelijama bakterija, Na primer, E.coli,Serratia, ili Salmonella vrste mogu biti upotrebljene kao domaćini kada su dobro poznati plazmidi kao što je pBR322, pBR325, pACYC177, ili pKN410 korišćeni za snabđevanje replikona. Tipično, ćelija donor treba da sekretuje minimalne količine proteolitičkih enzima, i dodatni inhibitori proteaze poželjno mogu biti inkorporirani u ćelijsku kulturu.

Produkcija Antitela

[0147]Ćelije domaćini transformisane gore opisanim ekspresionim vektorima i kultivisane u konvencionalnoj hranljivoj podlozi modifikovanoj kako odgovara za uključivanje promotera, selektirajućih transformanta, ili amplifikacijom gena koji kodiraju željene sekvence.

[0148]Transformacija znači uvođenje DNA u prokariotskog domaćina tako da je DNA sposobna za replikaciju, svake kao ekstrahromozomalni element ili kao hromozomalni integrant. Zavisno od toga koja čelija domaćin je upotrebljena, transformacija je izvedena primenom standardnih tehnika odgovarajućom za te ćelije. Kalcijum tretman se primenjuje sa kalcijum hloridom uopšteno za bakterijske ćelije koje sadrže čvrste barijere ćelijskog zida. Druga metoda za transformaciju upotrebljava polietilen glikol/DMSO. Jedna druga primenjena tehnika je elektroporacija.

[0149]Upotrebljene prokariotske ćelije za produkciju polipeptida iz ovog pronalaska su porasle u medijumu poznatom upućenima u ovu oblast i prikladnnom za kultivisanje odabranih ćelija domaćina. Primeri prikladnog medija uključuju luria broth (LB) plus neophodni nutritivni dodaci. U nekim aspektima, medijum takođe sadrži odabir agesa, izbor baziran na konstrukciji ekspresionog vektora, tako da selektivno dopušta rast prokariotskih ćelija koje sadrže ekspresioni vektor. Na primer, ampicillin se dodaje medijumu za rast ćelija sa ekspresijom ampicillin rezistentnog gena.

[0150]Bilo koji neophodni suplementi pored izvora ugljenika, azota, i neorganskog fosfata mogu takođe biti uključeni

u odgovarajućim koncentracijama uvedenim pojedinačno ili kao smesa sa drugim suplementima ili medijum kao što je kompleks azotnog porekla. Moguće je da medijumi za kulture mogu sadržavati jedan ili više redukujućih agensa odabranih iz grupe koju čine glutation, cistein, cistamin, tioglikolat, ditioeritritol i ditiotreitol.

[0151]Prokariotske ćelije domaćini su kultivisane na prikladnim temperaturama. ZaE. colirast, na primer, poželjna temperatura se kreće ođ oko 20°C đo oko 39°C, još poželjnije od oko 25°C do oko 37°C, još poželjnije na oko 30°C. pH medijuma može biti bilo koja pH u opsegu od oko 5 do oko 9, pretežno zavisno od organizma domaćina. Za £.coli,poželjni pH je od oko 6.8 do oko 7.4, i još poželjnije oko 7.0.

[0152]Ako je korišćen inducibilni promoter kao što je upotrebljen u ekspresionom vektoru iz pronalaska, ekspresija proteina je indukovana pod uslovima prikladnim za aktivaciju promotera. Prema jednom aspektu pronalaska, PhoA promoteri su upotrebljeni za kontrolu transkripcije polipeptida. Prema tome, transformisane ćelije domaćini su kultivisane u fosfat-limitirajućem medijumu za indukciju. Poželjno, fosfat-limitirajući medijum je C.R.A.P medijum (vidi, npr., Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Mnogi drugi induktori mogu biti upotrebljeni, u skladu sa konstruisanjem vektora kako je poznato upućenima u ovu oblast.

[0153]Prema jednom aspektu, polipeptidi u ekspresiji u predočenom pronalasku su sekretovani i obnovljeni iz periplazme ćelije domaćina. Izdvajanje proteina obično uključuje razaranje mikroorganizma, generalno pomoću osmotskog šoka, ultrazvuka ili liziranjem. Jednom kada su razorene, ostaci ćelija ili cele ćelije mogu biti uklonjene centrifugiranjem ili filtracijom. Proteini mogu biti dalje prečišćeni, na primer, afinitetom hromatografske kolone. Alternativno, proteini se mogu transportovani u medijum kulture i tamo izolovani. Ćelije mogu biti uklonjene iz kulture i supernatant kulture je filtriran i koncentrovan za dalje prečišćavanje proizvedenih proteina. Polipeptidi u ekspresiji mogu se dalje izolovati i identifikovati primenom uobičajenih poznatih metoda kao što je elektroforeza na poliakrilamid gelu (PAGE) i VVestern blot analiza.

[0154]U jednom aspektu ovog pronalaska, produkcija antitela je izvedena u velikoj količini fermentacionim procesom. Raznovrsne large-scale fed-batch fermentacione procedure su dostupne za produkciju rekombinantnih proteina. Large-scale fermentacije imaju kapacitet najmanje 1000 litara, poželjno kapacitet od 1,000 do 100,000 liters. Ovi fermentori koriste agitator impelere za distribuciju kiseonika i nutritienata, naročito glukoze (poželjan ugljenik/energija izvor). Small scale fermentacija se odnosi generalno na fermentaciju u fermentoru koji nije veći od oko približno 100 litara u zapreminskom kapacitetu, i može biti u opsegu od 1 litar do oko 100 litara.

[0155]U fermentacionom procesu, uvođenje expresije proteina obično je initicirano pošto su ćelije porasle pod prikladnim uslovima do željenog stepena gustine, npr., OD550 od oko 180-220, u kome su ćelije u ranoj fazi. Razne vrste induktora se mogu koristiti, u skladu sa konstrukcijom primenjenog vektora, kao što je poznato upućenima u ovu oblast i gare opisano. Ćelije nogu bih odgajane tokom kraćih perioda pre indukcije. Ćelije su obično indukovane tokom oko 12-50 sati, iako može biti primenjeno duže ili kraće vreme indukcije.

[0156]Radi unapređenja produkcionog prinosa i kvaliteta polipeptida iz ovog pronalaska, različiti fermentacioni uslovi mogu biti modifikovani. Na primer, radi unapređenja pravilnog komponovanja i uvijanja sekretiranih polipeptida antitela, dodatni vektori sa overekspresijom pratećih proteina, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i ili DsbG) or FkpA (a peptiđylprolyl cis,trans-isomerase with chaperone activity) mogu se upotrebiti kao ko-transformatori prokariotskih ćelija domaćina. Haperon proteini su pokazali sposobnost pravilnog uvijanja i rastvaranja heterologih proteina produkovanih u bacterijskim ćelijama domaćinima. Chenetal. (1999) J BioChem. 274:19601-19605; Georgiou etal., U.S. Patent No. 6,083,715; Georgiou et al., U.S. Patent No. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; RammandPluckthun (2000) J.Biol.Chem. 275:17106-17113; Arieetal. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

[0157]Za minimiziranje proteolize heterologih proteina u ekspresiji (naročito onih koji su senzitivni na proteolizu), u predočenom pronalasku može se koristiti određena vrsta domaćina sa deficitom proteolitičkih enzima, Na primer, ćelijska vrsta ćelija domaćina može biti modifikovana tako đa utiče na genetsku mutaciju(e) u genima koji kodiraju poznate bakterijske proteaze kao što su Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI i njihove kombinacije. Neke E.coliproteaze-deficijentne vrste su dostupne i opisane u, na primer, Joly et al. (1998),supra;Georgiou et al., U.S. Patent No. 5,264,365; Georgiou etal., U.S. Patent No. 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

[0158]Prema jednom aspektu,35E. colivrste deficijentne u proteolitičkim enzimima i transformisane plazmidima sa overekspresijom jednog ili više chaperone proteina korišćene su kao ćelije domaćini u expresionom sistemu ovog pronalaska.

Prečišćavanje Antitela

[0159]Prema jednom aspektu, ovde je proizveden protein antitelo dalje prečišćen da bi se dobili preparatikoji su stvarno homogeni za dalju analizu i primenu. Primenjene su standardne metode prečišćavanja proteina poznate upućenima u ovu oblast. Sleđeći primeri su prikazi prikladnih procedura za prečišćavanje: frakcionisanje na imunoafinitetnim ili jon-izmenjivačkim kolonama, etanolna precipitacija, HPLC sa reversnom fazom, hromatograijom na silika gelu ili na katjon-izmenjivačkoj koloni kao što je DEAE, hromatofokusiranjem, SDS-PAGE, amonijum sulfat precipitacijom, i gel filtracijom koriščenjem, na primer, Sephadex G-75.

[0160]Prema jednom aspektu, Protein A imobilisan na čvrstoj fazi koristi se za imunoafinitetno prečišćavanje produkata iz ovog pronalaska, antitelo u punoj dužini. Protein A je 41 kD protein čelijskog zida izStaphylococcus aureaskoji se vezuje visokim afinitetom za Fc region antitela. Lindmarket al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. Čvrsta faza za koju je Protein A imobiliziran poželjno je kolona koja sadrži staklenu ili silika površinu, još poželjnije kolona sa kontrolisanim porama u staklu ili kolona silicijumske kiseline. U nekim aplikacijama, kolona je bila obložena sa reagensom, kao što je glicerol, sa namerom da se prevenira nespecifična aderencija kontaminanata.

[0161]U prvom stepenu prečišćavanja, preparat izdvojen iz ćelijske kulture kako je gore opisano nanet je na Protein A imobilizovanu čvrstu fazu da bi se omogućilo specifično vezivanje antitela od interesa za Protein A. Čvrsta faza je potom isprana da bi se uklonili kontaminanti nespecifično vezani za čvrstu fazu. Finalno antitelo od interesa je ispiranjem odvojeno od čvrste faze.

Generisanje antitela koriščenjem eukariotske ćelije domaćina:

[0162]Vektor componente generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jednu ili više od sledećih: signalna sekvenca, izvor replikacije, jedan ili više marker gena, pojačavajući element, promoter, i transkripciona terminalna sekvenca.

( i) Komponenta signalne sekvence

[0163]Vektor koji se koristi u eukariotskoj ćeliji domaćinu može takođe sadržavati signalnu sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifičnu poziciju za vezivanje na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida od interesa. Heterologa signalna sekvenca odabrana kao poželjna je jedna koja je prepoznata i procesirana( npr.,vezana pomoću signalne peptidaze) u ćeliji domaćinu. Kod ekspresije na ćelijama sisara dostupni su, signalne sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, herpes simplex gD signal.

[0164]DNA za takav prekursor region je povezan u riding okvr za DNA kodirajući antitelo.

( ii) Izvor replikacije

[0165]Generalno, izvor replikacione komponente nije potreban za expresiju Vektora sisara. Na primer, tipično može biti upotrebljen SV40 izvor samo zato što sadrži rani promoter,

( iii) Komponenta selekcionog gena

[0166]Expresioni i kloniraiući vektori mogu sadržavati selekcioni gen, takođe nazvan selektabilni marker. Tipično selekcionirani geni kodiraju proteine koji (a) obezbeđuju rezistanciju na antitela ili druge toksine,npr.,ampicilin, neomicin, metotreksat, ili tetraciklin, (b) dopunjavaju auksotrofične deficiencijencije, gde je relevantno, ili (c) snabdevaju kritičnim nutritientima koji nisu dostupni iz kompleksnog medijuma.

[0167]Jedan primer selekcione šeme koristi lek radi zaustavljanja rasta ćelije domaćina. One ćelije koje su uspešno transformisane tako što heterologi gen produkuje protein koji obezbeđuje rezistenciju na lek i zato preživljava selekcioni region. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolna kiselina i higromicin.[0168]Drugi primer prikladnog selektabilnog markera za ćelije sisara su one koje omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinske kiseline antitela, kao što je DHFR, timidinekinaza, metalotionein-I i -II, poželjno metalotionein geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza,itd.

[0169]Na primer, ćelije transformisane pomoću DHFR selekcionog gena su prvo identifikovane kultivisanjem svih transformanta u mediumu za kultivisanje koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Odgovarajuća ćelija domaćin kada se koristi sirov-tipe DHFR je ćelijska linija ovarija Kineskog pacova (CHO) đeficijenrnog u aktivnosti DHFR (npr., ATCC CRL-9096).

[0170]Alternativno, ćelije domaćini (delimično sirov-tip domaćina koj sadrže endogeni DHFR) transformisane ili kotransformirane sa DNA sekvencama koje kodiraju sposobnost, sirovog-tipa DHFR protein, i može biti odabran drugi selektivni marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), ćelijskim rastom u medijumu koji sadrži selekcioni agens za selektujući marker kao što je aminoglikozidni antibiotik,40npr„kanamicin, neomicin, ili G418. Vidi U.S. Patent No. 4,965,199.

( iv) Promoter komponenta

[0171]Ekspresija i kloniranje vektora koji obično sadrži promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno se vezuje za nukleinsku kiselinu polipeptida antitela. Promoter sekvence su poznate kao eukarioti. Raznovrsnost aleukariotskih gena ima AT-bogati region lociran približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde je inicijalizovana transkripcija. Druga sekvenca nađena 70 do 80 baza uzvodno od starta transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za ađiciju poli A repa na 3' kraj koding sekvence. Sve ove sekvence su prikladno insertovane u eukariotske ekspresione vektore.

[0172] Transkripcija polipeptida antitela sa Vektora u mamalija ćelijama domaćinima je kontrolisana, na primer, preko promotera dobijenih od genoma virusa kao što je polioma virus, fowlpox virus, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papilloma virus, avian sarcoma virus, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i Simian Virus 40 (SV40), od heterologenih promotera sisara,55npr.,theactin promoter ili imunoglobulin promoter, od heat-shock promotera, obezbeđivanje takvih promotera je kompatibilno sa sistemima ćelija domaćina.

[0173]Rani i kasni promoteri SV40 virusa se konvencionalno dobijaju kao SV40 restrikcioni fragment koji takođe sadrži SV40 viralni izvor replikacije. Imedijatni rani promoter humanog citomegalovirusa je konvencionalno dobijena kao Hindlll E restrikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNA koji koristi goveđi papilloma virus kao vektor u ćelijama sisara kao domaćinima, opisan je u U.S. Patent No. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Patent No. 4,601,978. Vidi takođe Reyes et al, Nature 297:598-601

(1982) na ekspresiji cDNA humanog p-interferona u ćelijama miša pod kontrolom atimidinkinaze promotera iz herpes simplex virusa. Alternativno, Rous Sarcoma Virus dugo terminalno ponavljanje može biti upotrebljeno kao promoter.

( v) Pojačivački element komponenta

[0174]Transkripcija DNA kodiranog polipeptida antitela iz ovog pronalaska pomoću viših eukariota često je unapređena insertovanjem unapređujuće sekvence u vektor. Mnoge unapređujuče sekvence su sada poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, ct-fetoprotein, i insulin). Tipično, svakako, biće upotrebljen unapređivač iz eukariotske ćelije virusa. Primeri uključuju SV40 unapređivač na poslednjoj strani replikacionog izvora (bp 100-270), rani promoter unapređivača citomegalovirusa, polioma unapređivač na poslednjoj strani replikacionog izvora, i adenovirus unapređivači. Vidi takođe Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) za unapređivačke elemente za aktivaciju eukariotskih promotera. Unapređivač može biti umetnut u vektor na poziciju 5' ili 3' u polipeptid-kodirajuću sekvencu antitela, ali je poželjno da bude locirana na poziciji 5' promotera.

( vi) Transkripcione terrninacione komponente

[0175]Ekspresija vektora korišćenih u eukariotskim ćelijama domaćinima tipično će takođe sadržavati sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNA. Takve sekvence su uobičajeno dostupne sa 5' i, ponekad 3', neprevedenih regiona eukariotiske ili virusne DNAs ili cDNAs. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilatovani fragmenti u neprevedenoj porciji mRNA koja kodira antitelo. Jedna korisna transkripciono terminatorna komponenta je poliadenilacioni region goveđeg hormona rasta. Vidi VVO94/11026 i ovde uključenu ekspresiju vektora.

( vii) Selekcija i transformacija ćelija domaćina

[0176]Prikladne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNA u vektorima ovde obuhvataju ovde opisane ćelije viših eukariota, uključujući ćelije đomećine vertebrata. Propagiranje ćelija vertebrata u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinska procrdura. Primeri linija ćelija domaćina sisara su linija majmunskog bubrega CV1 transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionska bubrežna linija (293 ili 293 ćelija subkloniranih za rast u suspenziji kulture, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); bubrežne ćelije beba pacova (BHK, ATCC CCL 10); ovarijalne ćelije Kineskog pacova /- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); sertoli ćelije miša (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); bubrežne ćelije afričkog zelenog majmuna (VERO-3576, ATCC CRL-1587); ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HELA, ATCC CCL 2); pseće bubrežne ćelije (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre buffalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana hepatoma linija (Hep G2).

[0177]Ćelije domaćini su transformisane sa gore opisanom ekspresjom ili kloniranjem vektora za produkciju antitela i kultivisane u konvencionalnom hranljivom medijumu modifikovanom kako odgovara za uvođenje promotera, selekciju transformanata, ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence.

( viii) Kultivisanje ćelije domaćina

[0178]Ćelije domaćini upotrebljene za produkciju antitela iz ovog pronalaska mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medij kao što je Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Pored toga, može se koristiti kao medijum za kultivisanje ćelijea domaćina bilo koji medijum opisan u Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Patent Re. 30,985. Bilo koji od ovih medijuma može se obogatiti ako je neophodno hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin, ili epidermalni faktor rasta), soli (kao što je natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum, i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što je adenozine i timidin), antitelima (kao što je lek GENTAMYCIN™), oligoelementima (definisani kao neorganskim jedinjenjima obično prisutnim u finalnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvuivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi neophodni suplementi takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama što bi bilo poznato upućenima u ovu oblast. Uslovi kultivisanja, kao što su temperatura, pH, i slično, su oni koji su predhodno korišćeni sa ćelijama domaćinima odabranim za ekspresiju, i biće poznah prosečno upućenima u ovu oblast.

( ix) Prečišćavanje antitela

[0179]Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo može biti proizvedeno intracelularno, ili direktno sekretovano u medijum. Ako antitelo je proizvedeno intracelularno, kao prvi korak, odstranjuju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom, nepotrebni delovi, kako ćelija tako i liziranih fragmenata,. Gde je antitelo sekretovano u medijum, supernatanti od takvih ekspresionih sistema su generalno prvo koncentrovani koriščenjem komercijalno dostupnog filtera za koncentrisanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Inhibitor protease kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji predhodni postupak radi inhibicije proteolize i antibiotici mogu biti uključeni u prevenciju rasta slučajnih kontaminanata.

[0180]Sastav antitela dobijen iz ćelija može biti prečišćen koriščenjem, na primer, hidroksilapatit hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, i afinitivne hromatografije, s' tim što tehnika prečišćavanja afinitivnom hromatografijom ima prednost. Prikladnost proteina A kao afinitivnog liganda zavisi od vrste i izotipa nekog Fc domena imunoglobulina koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se baziraju na humanim yl, y2, ili y4 teškim lancima (Lindmarketal., J. Imunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za humani y3 (Guss et al, EMBO J. 5:15671575 (1986)). Matriks za koji je afiniti-Iigand vezan najčešće je agaroza, ali su dostupni i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi kao što je staklo ili poli(stirendiviniI)benzen sa kontrolisanim porama omogućavaju brži nivo protoka i kraća vremena procesuiranja nego što se može postići sa agarozom. Gde antitelo sadržava CH3 domen, za prečišćavanje je korisna Bakerbond ABX™smola ([. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što je asfrakcionacija na jon-izmenjivačkoj koloni, precipitacija u etanolu, HPLC sa reversnom fazom, hromatografija na silika gelu, hromatografija na heparin SEPHAROSE™, hromatografija na anjon ili katjon izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartanske kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i amonijum sulfat precipitacija su takođe dostupne zavisno od antitela koje treba izdvojiti.

[0181]Posle bilo kog postupka preliminarnog prečišćavanja, smesa koja sadrži antitelo i kontaminante od interesa može se podvrgnuti hromatografiji na niskom pH sa hidrofobnom interakcijom uz korišćenje elucionog pufera na pH između oko 2.5-4.5, poželjno izvedeno sa niskim koncentracijama soli( e. g.,od oko 0-0.25M soli).

Analiza Aktivnosti

[0182]Antitela predočenog pronalaska mogu biti okarakterisana po njihovim fizičko/hemijskim svojstvima i biološkim funkcijama različitim analizama poznatim u ovoj oblasti.

[0183]Prečišćeni imunoglobulini mogu biti dalje okarakterisani serijom asnaliza koje uključuju, ali se ne ograničavaju na njih, N-terminalno sekvencionisanje, analize amino kiseline, tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) neđenaturišuća, ekskluziona po veličini, masena spektrometrija, jon izmanjivačka hromatografija i papain digestija.

[0184]Prema određenim aspektima pronalaska, ovde proizvedeni imunoglobulini su analizirani na svoju biološku aktivnost. U nekim aspektima, imunoglobulini iz predočenog pronalaska su testirani na njihovu antigen vezujuću aktivnost. Analize vezivanja antigena koje su poznate u ovoj oblasti i mogu se upotrebiti, ovde obuhvataju, bez ograničenja, bilo koju analizu direktnog ili kompetitivnog vezivanja koristeći tehnike kao što su vvestern blots, radioimuno analize, ELISA (enzim vezana imnosorbent analiza), "sandvvich" imuno analize, imunoprecipitacione analize, fluorescentne imuno analize, i protein A imuno analize. Ilustrativna analiza vezivanja antigena je predočena dole u delu sa Primerima.

[0185] U jednom aspektu, predočeni pronalazak razmatra izmenjeno antitelo koje poseduje neke ali ne sve efektorske funkcije, koje ga čine poželjnim kandidatom za mnoge primene u kojima je važan poluživot antitelain vivoiako su sigurne efektorske funkcije (kao što je komplement i ADCC) neophodne ili štetne. U određenim aspektima, Fc aktivnosti proizvedenog imunoglobulina su merene da bi se potvrdilo da su zadržane samo željene osobine. In vitro i/ili in vivo analize citotoksičnosti se mogu izvesti radi potvrde redukcije/opadanja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, analize vezivanja za Fc receptor (FcR) se mogu izvesti radi potvrde da se antitelo ne vezuje za FcyR (prema tome verovatno nedostatak ADCC aktivnosti), ali zadržava sposobnost FcRn vezivanja. Primarne ćelije za medijaciju ADCC, NK ćelije, imaju ekspresiju samo FcyRIII, dok monociti imaju ekspresiju FcyRI, FcyRII i FcyRM. FcR ekspresija na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 3 na strani 464 u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Imunol 9:457-92 (1991). Primer in vitro analize za utvrđivanje ADCC aktivnosti molekula od interesa je opisan u US Patent No. 5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i Natural Killer (NK) ćelije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se utvrditiin vivo, npr.,u životinjskom modelu kao što je onaj predstavljen u Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Analize Clq vezivanja takođe mogu biti izvedene zbog potvrđivanja nesposobnosti antitela da se veže za Clq i tako mu nedostaje CDC aktivnost. Da bi se ustanovila aktivacija komplementa, može se izvesti analiza CDC,npr.kako je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Imunol. Methods 202:163 (1996). FcRn vezivanje i in vivo određivanja klirensa/polu života takođe se mogu izvesti metodama poznatim u ovoj oblasti, npr. one koje su opisane u odeljku sa Primerima.

Humanizovana Antitela

[0186]Predočeni pronalazak obuhvata humanizovana antitela. Različite metode za humanizaciju non-humanih antitela su poznate u ovoj oblasti. Na primer, humanizovano antitelo može imati jedan ili više ostataka amino kiseline ugrađen u njega iz izvora koji je non-human. Ovi non-human ostaci amino kiselina su obično nazvani "import" ostaci, koji su tipično uzeti iz "import" varijabilnog domena. Humanizacija se u osnovi može izvesti sledeći metodu VVinter and co-vvorkers (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), supstitucijom sekvenci hipervarijabilnog regiona sa korespondirajućim sekvencama humanog antitela. Prema tome, takva "humanizovana" antitela su himerična antitela (U.S. Patent No. 4,816,567) gde je u stvari manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano korespondentnom sekvencom iz non-humanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki ostaci hipervarijabilnih regiona i moguće neki FR ostaci supstituisani ostacima sa analogih pozicija u antitelima glodara.

[0187] Izbor humanih varijabilnih domena, oba, lakog i teškog, da bi bili upotrebljeni za pravljenje humanizovanih antitela je veoma važan za ređukovanje antigenosti. U skladu sa tako zvanom "best-fit" metodom, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara je sistematski ispitana na celu skupinu poznatih humanih sekvenci varijabilnog-domena. Humana sekvenca koja je najbliža onoj koja je od glodara, tada je uzeta za humani okvir humanizovanog antitela (Simsetal. (1993) J. Imunol. 151:2296; Chothiaetal. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Druga metoda koristi određeni okvir izveden iz konsenzus sekvence svih humanih antitela određene subgroupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir može biti upotrebljen za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Čarter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta etal. (1993) J. Imunol., 151:2623.

[0188]Dalje je značajno da antitela budu humanizovana uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i drugih poželjnih bioločkih osobina. Za dostizanje ovog cilja, u skladu sa jednom metodom, humanizovana antitela su dobijena procesom analize srodnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koriščenjem tro-dimenzionalnih modela srodnih i humanizovanih sekvenci. Tro-đimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni i poznati su upućenima u ovu oblast. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće tro-đimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Inspekcija ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju imunoglobulinske sekvence-kandidata, npr., analiza ostataka koji utiču na sposobnost imunoglobulina-kandidata da se veže za svoj antigen. Na ovaj način, mogu biti odabrani FR ostaci i kombinovani od primaoca i važnih sekvenci tako da se dostignu željene karakteristike antitela, kao što je povećan afinitet za ciljni antigen(e). Uopšteno, ostaci hipervarijabilnog regiona su direktno i najznačajnije uključeni u utkaj na vezivane antigena.

Varijante Antitela

[0189]Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje fragment antitela koji sadrži modifikacije u vezivanju Fc polipeptida koji sadrže Fc region, gde modifikacije olakšava i/ili unapređuje heterođimerizaciju. Ove modifikacije pođrazumevaju uvođenje ispupčenja u prvi Fc polipeptid i uđubljenja u drugi Fc polipeptid, gde se ispupčenje može smestiti u udubljenje tako da podpomažu kompleksiranje prvog i drugog Fc polipeptida. Metode generisanja antitela sa ovim modifikacijama su poznate u ovoj oblasti, npr., kako je opisano u U.S. Pat. No. 5,731,168.

[0190]U nekim aspektima, razmotrene su modifikacija(e) amino kiselinske sekvence ovde opisanih antitela. Na primer, može biti poželjno unapređenje afiniteta za vezivanje i/ili druge biološke osobine antitela. Varijante amino kiselinske sekvence antitela su dobijene uvođenjem odgovarajućih izmena nukleotida u nukleinske kiseline antitela, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje sa, i/ ili insertovanje u i/ili supstitucije, ostataka u amino kiselinske sekvence antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, insertovanja, i supstitucije je napravljena da bi se došlo do finalne konstrukcije, obezbeđujući da finalna konstrukcija poseduje željene karakteristike. Amino kiselinske alteracije mogu biti uvedene u amino kiselinske sekvence antitela subjekta u vreme kada se pravi sekvenca.

[0191]Koristan metod za identifikaciju određenih ostataka ili regiona antitela koji su najpoželjnije lokacije za mutagenezu zove se "alanine scanning mutagenesis" kao Što su opisali Cunningham and VVells (1989) Science, 244: 1081-1085. Ovde, ostatak ili grupa ciljnih ostataka su identifikovani( npr.,ostaci sa šaržom naelektrisanja kao što su arg, asp, his, lis, i glu) i zamenjeni sa neutralnim ili amino kiselinom sa negativnom šaržom (najpoželjnije alanin ili polialarvin) da bi uticale na interakciju amino kiselina u antigenu. One lokacije amino kiseline koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na substitucije, potom su refinisane daljim uvođenjem ili drugim varijantama na, ili za, mesta supstitucije. Tako, dok je mesto za uvođenje sekvence amino kiseline predodređena varijacija, priroda mutacijepersene zahteva da bude predeterminisana. Na primer, za analizu mutacije izvedene na datom mestu, ala sistematska ili random mutageneza je izvedena na ciljnom kodonu ili regionu i ekspresija imunoglobulina je ispitana na željenu aktivnost.

[0192]Umetnuti elementi u amino kiselinsku sekvencu uključuju amino- i/ili karboksilne-terminalne fuzije koje variraju u dužini od jednog ostatka do polipeptida koji sadrži sto ili više ostataka, isto kao intrasekvencijalna umetanja pjedinačnih ili multiplih amino kiselinskih ostataka. Primeri terminalnih inserta uključuju antitelo sa jednim N-terminalnim metionil ostatkom ili antitelo fuzionisano sa citotoksičnim polipeptidom. Druge varijante molekula insertovanog antitela uključuju fuziju N- ili C-terminusa antitela sa enzimom( npr.za ADEPT) ili polipeptid koji povećava polu-život antitela u serumu.

[0193]Deugi tip varijante je varijanta supstitucije amino kiseline. Ove varijante imaju najmanje jedan amino kiselinski ostatak u molekulu antitela zamenjen različitim ostacima. Mesta od najvećeg interesa za supstitutucione mutageneze uključuju hipervarijabilne regione, ali su takođe i FR alteracije uzete u obzir. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 2 pod naznakom "poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije rezultiraju promenom bioloških aktivnosti, tada može biti uvedeno više značajnih izmena, naznačenih kao "primerene supstitucije" u Tabeli 2, ili kako je dalje dole opisano u referenci za amino kiselinske klase, i proizvodi mogu biti ispitani.

[0194]Značajne modifikacije u biološkim odlikama antitela su kompletirane izborom supstitucija koje se značajno razlikuju u uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidnog kostura u oblasti supstitucije, na primer, kao ravna ili helikoidna konformacija, (b) naboja ili hidrofobnosti molekula na ciljnoi poziciji, ili (c) glavnine bočnog lanca. Amino kiseline mogu biti grupisane prema sličnosti osobina njihovih bočnih lanaca (u A. L. Lehninger, in Biochemistrv, drugo izdanje., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) non-polarni: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) bez šarže polarni: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) kiseli: Asp (D), Glu (E)

(4) bazni: Lys (K), Arg (R), His(H)

[0195]Alternativno, ostaci koji se javljaju u prirodi nogu biti podcijeni u grupe prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobni: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kiseli: Asp, Glu; (4) bazni: His, Lys, Arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.

[0196]Non-konzervativne supstitucije će konsekventno izmenjivati članove jedne od ovih klasa za drugu klasu. Tako supstituisani ostaci takođe mogu biti uvedeni u konzervativne supstirucione pozicije ili, poželjnije, u preostale (non-konzervisane) pozicije.

[0197]Jedan tip supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovano ili humano antitelo). Generalno, rezultujuća varijanta(e) odabrana za dalji razvoj imače unapređene biološke osobine u odnosu na roditeljsko antitelo iz koga je generisano. Prikladan način za generisanje takvih substitucionalnih varijanti uključuje usavršavanje afiniteta koriščenjem fage displeja. Doslovno, nekoliko mesta na hipervarijabilnom regionu (npr. mesta 6-7) su mutirana da generišu sve moguće amino kiselinske supstitucije na svakoj poziciji. Tako generisana antitela su prikazana od strane filamentoznih fage delova kao fuzije sa genom HI produktom M 13 upakovanim u svaku partikulu. Fage-prikazane varijante su potom ispitane na biološke aktivnosti (npr. afinitet za vezivanje) kako je ovde uključeno. Radi identifikacije kandidat pozicija za modifiksciju hipervarijabilnog regiona, alanin skenirajuća mutageneza može se izvesti za identifikaciju ostataka hipervarijabilnog regiona koji značajno utiču na vezivanje antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa ovde elaboriranim tehnikama. Jednom kada su takve varijante generisane, panel varianti je podvrgnut skriningu kako je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednoj ili više relevantnih analiza mogu biti odabrana za dalji razvoj.

[0198]Molekule nukleinske kiseline sa kodom varijanti amino kiselinskih sekvuenci antitela su dobijene raznovrsnim metodama poznatim u ovoj oblasti. Ove metode uključuju, ali se ne ograničavaju na, izolaciju iz prirodnih izvora (u slučaju da se varijante amino kiselinskih sekvenci pojavljuju u prirodi) ili dobijanjem pomoću oligonukleotid-posredovanom (ili pozicijom-dirigovanom) mutagenezom, PCR mutagenezom, i kasetnom mutagenezom ranije dobijenih verzija varijanti ili non-varijanti antitela.

[0199]Moglo bi biti poželjno da se uvede jedna ili više amino kiselinskih modifikacija u Fc region polipeptida imunoglobulina iz ovog pronalaska, generišući tako variantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može pođrazumevati sekvencu humanog Fc regiona (npr., humani IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koja obuhvata amino kiselinsku modifikaciju (npr. supstituciju) na jednoj ili više amino kiselinskih pozicija uključujući onu na prevojnom cisteinu.

[0200]U skladu sa ovim opisom i stavovima u ovoj oblasti, smatra se da u nekim aspektima, antitelo korišćeno u metodama iz ovog pronalaska može pođrazumevati jednu ili više alteracija u poređenju sa sirovim tipom srodnog antitela, npr. u Fc regionu. Ova antitela će ipak zadržati u osnovi iste karakteristike potrebne za terapijsku primenu u poređenju sa njima srodnim sirovim tipom. Na primer, misli se da mogu biti napravljene određene alteracije u Fc regionu koje će rezultirati unapređenim (npr., ili pojačanim ili oslabljenim) Clq vezivanja i/ili Complement Dependent Cytotoxicity (CDC-komplement zavisna citotoksičnost), npr., kako je opisano u W099/51642. Vidi takođe Duncan & VVinter Nature 322:738-40

(1988); US Patent No. 5,648,260; US Patent No. 5,624,821; i W094/29351 koji se odnose na druge primere varijanti Fc regiona.

Imunokonjugati

[0201]Pronalazak se takođe odnosi na imunokonjugate, ili antitelo-lek konjugate (ADC), podrazumevajući antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapeutski agens, lek, agens inhibitor rasta, toksin (npr., enzimski aktivni toksini bakterija, gljiva, biljaka, ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi (npr., radiokonjugati).

[0202]Upotreba antitelo-lek konjugata za lokalno raznošenje citotoksičnih ili citostatskih agensa, npr. lekova koji ubijaju ili inhibiraju tumorske ćelije u treatmanu kancera (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvazand Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; U.S. patent 4,975,278) teorijski dozvoljavaju ciljano dopremanje lekovite vrste do tumora, i tamo intracelularnu akumulaciju, gde sistemska primena ovih nekonjugovanih lekovitih agensa može rezultirati jednako u neprihvatljivim nivoima toksičnosti za normalne ćelije, kao i u tome što će biti uočeno da su tumorske ćelije eliminisane (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15,1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antitelo Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Revievv," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). Zato se traži maksimalna efikasnost uz minimalnu toksičnost. Oba, poliklonalna antitela i monoklonalna antitela su notirana kao korisna u ovim strategijama (Rovvland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Lekovi korišćeni u ovim metodama uključuju daunomicin, doksorubicin, metotreksat, i vindesin (Rovvland et al., (1986)supra).Toksini korišćeni u antitelo-toksin konjugatima uključuju bakterijske toksine kao što je difterija toksin, biljni toksini kao što je ricin, toksini malih molekula kao što je geldanamicin (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Manđler et al

(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Biokonjugat Chem. 13:786-791), maitansinoidi (EP 1391213; Liu et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), i kalihemicin (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Toksini mogu uticati na njihove citotoksićne i citostatske efekte mehanizmima koji uključuju tubulin vezivanje, DNA vezivanje, inhibiciju ortopoizomeraze. Neki citotoksični lekovi su skloni da budu inaktivni ili manje aktivni kada su konjugovani sa velikim antitelom ili ligandima proteinskog receptora.

[0203]ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) je antitelo-radioizotop konjugat koji se sastoji ođ IgGl kapa monoklonalnog antitela glodara usmerenog protiv CD20 antigena nađenog na površini normalnih i malignih B limfocita i<m>ln ili '?Y rađioizotop vezan sa tioureu veznim-helatorom (VViseman et al

(2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; VViseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; VVitzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Iako ZEVALIN ima dejstvo protiv B-ćelija non-Hočkin Limfoma (NHL), rezultati primene kod teških i dugotrajnih citopenija kod većine pacijenata. MVLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), antitelo-lek konjugat sačinjen od hu CD33 antitela vezanog za kalihamicin, u injekcijama, potvrdio se 2000. u tretmanu akutne mieloidne leukemije (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; US Patent Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), antitelo-lek konjugat sačinjen od huC242 antitela vezanog preko disulfidne veze SPP za lek maitansinoid deo, DM1, je unapređen u Fazu II trials za tretman kancera koji imaju ekspresiju CanAg, kao što su kanceri kolona, pankreasa, želuca, i drugi. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), antitelo-lek konjugat sačinjen od anti-prostate monoklonalnog antitela specifičnog membranskog antigena (PSMA) vezanog za lek maitansinoid deo, DM1, je u razvoju za potencijalnu primenu u treatmanu tumora prostate. Auristatin peptidi, auristatin E (AE) i monometilauristatin (MMAE), sintetski analozi dolastatina, konjugovani sa himeričnim monoklonalnim antitelima cBR96 (specifična za Levvis Y na karcinomima) i cACIO (specifična za CD30 na hematološkim malignitetima) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnologv 21(7):778-784) su u procesu ter-apijskog razvoja.

[0204]Hemoterapeutski agensi korisni za generisanje takvih imunokonjugata su gore opisani. Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji mogu biti upotrebljeni uključuju difterija A lanac, nevezujuće aktivne fragmente difterija toksina, eksotoksin A lanac (izPseudomonas aeruginosa),ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin,Aleurites fordiiproteini, diantin proteini,Phytolaca americanaproteini (PAPI, PAPU, i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, feno-micin, enomicin, i trikoteceni. Raznovrsni radionuklidi su dostupni za produkciju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<l>3<1>1,121In,<M>Y, i<186>Re. Konjugati antitela i citotoksičnih agensa su napravljeni koriščenjem različitih bifunkcionalnih agensa za protein-kouplovanje kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HC1), aktivni estri (kao što je disukcinimidil superat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) hex-anediamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizokianati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktiv fluor jedinjenja (kao što je l,5-40difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može se dobiti kako je opisano u Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ugljenik-14-obeIežen l-izotiocijanatobenzil-3-metilđietilen triarninpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Vidi VV094/11026.

[0205]Ovde su takođe razmotreni, konjugati antitela i jednog ili više toksina malih molekula, kao što je kalihemicin, maitansinoidi, trihotecen, i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju aktivnost toksina.

Maitansin i maitansinoidi

[0206]Prema jednom aspektu, antitelo (puna dužina ili fragmenti) iz ovog pronalaska je konjugovano sa jednim ili više maitansinoid molekula.

[0207] Maitansinoidi su mitotički inhibitori koji deluju preko inhibicije tubulin polimerizacije. Maitansin je prvi izolovan iz istočno Afričkog žbunaMaytenus senata(U.S. Patent No. 3,896,111). Potom, je otkriveno da određeni mikrobi takođe produkuju maitansinoide, kao što su maitansinol i C-3 maitansinol estri (U.S. Patent No. 4,151,042). Sintetski maitansinol i njegovi derivati i analozi su uključeni, na primer, u U.S. Patent Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533.

Maitansinoid- antitelo konjugati

[0208]U pokušaju da se unapredi njihov terapeutski indeks, maitansin i maitansinoidi su konjugovani antitelima sa specifičnim vezivanjem za antigene tumorske čelije. Imunokonjugati koji sadrže maitansinoide i njihova terapeutska primena su uključeni, na primer, u U.S. Patent Nos. 5,208,020, 5,416,064 i European Patent EP 0 425 235 BI. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) su opisali imunokonjugate obuhvatajući naznačeni maitansinoid DM1 vezan za monoklonsko antitelo C242 usmereno protiv humanog kolorektalnog kancera. Nađeno je đa je konjugat visoko citotoksičan prema kultivisanim ćelijama kancera kolona, i pokazao je antitumorsku aktivnost uin vivoanalizi rasta tumora. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) opisuju imunokonjugate u kojima je maitansinoid konjugovan, via disulfidni veznik, za antitelo A7 glodara vezujući se za antigen na ćelijskim linijama humanog kancera kolona, ili za drugo monoklonalno antitelo TA glodara.l koji vezujeHER-2/rteMonkogen. Citotoksičnost TA.l-maitansonoid konjugata je testiranain vitrona čelijskoj liniji SK-BR-3humanog kancera dojke, sa ekspresijom 3 x IO<5>HER-2 površinskog antigena po ćeliji. Konjugat leka je dostigao stepen citotoksičnosti isti kao što ima slobodni lek maitansinoid, koji bi mogao biti unapređen povećanjem broja maitansinoid molekula po molekulu antitela. A7-maitansinoid konjugat je pokazao nisku sistemsku citotoksičnost kod miša.

Antitelo- maitansinoid konjugati ( imunokonjugati)

[0209]Antitelo-maitansinoid konjugati su dobijeni hemijskim vezivanjem antitela za maitansinoid molekule bez značajnog smanjenja biološke aktivnosti kako antitela tako i maitansinoid molekule. Oko 3-4 maitansinoid molekula konjugovanih po molekulu antitela pokazalo je efikasnost u pojačanju citotoksičnosti za ciljne čelije bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela, iako bi se čak za jedan molekule toxin/antitelo očekivalo da unapredi citotoksičnost u odnosu na samo antitelo. Maitansinoidi su dobro poznati u ovoj oblasti i mogu biti sintetisani poznatim tehnikama ili izolovani iz prirodnih izvora. Odgovarajući maitansinoidi su uključeni, na primer, u U.S. Patent No. 5,208,020 i u druge patente i nonpatentne publikacije koje se odnose na ovde gore opisano. Prednost imaju maitansinoidi maitansinol i maitansinol analozi modifikovani u aromatičnom prstenu ili na drugim pozicijama molekule maitansinola, kao što su razni maitansinol estri.

[0210] Postoje mnoge vezujuće gTupe poznate u ovoj oblasti za pravljeneje antitelo-maitansinoid konjugata, uključujući, na primer, one uključene u U.S. Patent No. 5,208,020 or EP Patent 0 425 235 BI, i Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992). Vezujuće grupe uključuju disulfidne grupe, tioetarske grupe, grupe labilne prema kiselini, fotolabilne grupe, grupe labilne na peptidaze, ili grupe labilne na esteraze, kako je obuhvaćeno gore-navedenim patentima, a prednost imaju disulfidne i tioetarske grupe.

[0211]Konjugati antitela i maitansinoida mogu se napraviti koriščenjem raznovrsnih bifunkcionalnih proteinskih agensa za kouplovanje kao što je N-sukcinimidiI-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-l-karboksilat, iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HC1), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidoben-zoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilenediamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktiv fluorna jedinjenja (kao što je l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Naročitu prednost u obezbeđivanju disulfidne veze, kao agensi za kuplovanje, imaju N-sukcinimiđil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP) (Carlsson et al., Bio-chem. J. 173:723-737 [1978]) i N-40sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP).

[0212]Veznik može biti vezan za maitansinoid molekul na različitim pozicijama, zavisno od tipa veze. Na primer, estarsko vezivanje može se formirati reakcijom sa hidroksilnom grupom primenom konvencionalnih tehnika kuplovanja. Reakcija se može odvijati na C-3 poziciji koja ima hidroksilnu grupu, C-14 poziciji modifikovanoj sa hidroksimetil, C-15 poziciji modifikovanoj sa hidroksilnom grupom, i C-20 poziciji koja ima hidroksilnu grupu. Prema aspektu koji ima prednost, veza se formira na poziciji C-3 maitansinola ili maitansinol analoga.

Calichearnicin

[0213]Drugi imunokonjugati od interesa obuhvataju antitelo konjugovano sa jednom ili više molekula calicheamicina. Calichearnicin familija antibiotika ima sposobnost produkcije dvostruko-previjenih DNA prekida u sub-pikomolarnim koncentracijama. Za dobijanje konjugata sa calichearnicin familijom, vidi U.S. patente 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (svi za American Cvanamid Companv). Strukturni analozi calicheamicina koji se mogu upotrebiti uključuju, ali se ne ograničavaju na, YU, a2', a,', N-acetil-YlI, PSAG i 6\ (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i već pomenute U.S. patente za American Cvanamid). Drugi anti-tumorski lek za koji antitelo može biti konjugovano je QFA koji je antifolat. Oba, calichearnicin i QFA, imaju intracelularna mesta delovanja i ne prolaze slobodno kroz plazma membranu. Zato, celularno preuzimanje ovih agensa preko inkorporacije posredovane antitelom veoma utiče na njihove citotoksične efekte.

Drugi citotoksični agensi

[0214]Drugi antitumorski agensi koji mogu biti konjugovani sa antitelima iz ovog pronalaska obuhvataju BCNU, streptozoicin, vincristin i 5-fluorouracil, familija agensa kolektivno poznata kao LL-E33288 kompleks opisana u U.S. patentima 5,053,394, 5,770,710, kao i esperamicini (U.S. patent 5,877,296).

[0215]Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogun upotrebiti uključuju difterija A lanac, nevezujuče aktivne fragmente difterija toksina, eksotoksin A lanac (izPseudomonas aeruginosa),ricin A lanac, abrin A lanac, modeccin A lanac, alfa-sarcin,Aleurites fordiiproteini, dianthin proteini,Phytolaca americanaproteini (PAPI, PAPU, i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomicin, enomicin i tricothecene. Vidi, na primer, WO 93/21232 objavljeno 28,Oktobra, 1993.

[0216]Predočeni pronalazak dalje razmatra imunokonjugate stvorene između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnopšću (npr., ribonukleaza ili DNA endonukleaza kao što je đeoksiribonukleaza; DNaza).

[0217]Za selektivnu destrukciju tumora, antitelo može sadržavati visoko radioaktivni atom. Različiti radioaktivni izotopi su dostupni za produkciju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At<21>1,1131,1<125>,Y<Xl,Re<186>, Re188, Sm<155>, Bi<2>12,P32, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada je konjugat upotrebljen za detekciju, može sadržavati radioaktivni atom za scintigrafska ispitivanja, na primer te<99>"" ili I123 ili ocrtavajuće obeležavanje za nuklearno magnetno rezonantno (NMR) prikazivanje (takođe poznato kao magnetno rezonantno prikazivanje, mri), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.

[0218] Radio- ili drugi obeleživači mogu biti inkorporirani u konjugate na poznate načine. Na primer, peptid može biti biosintetisan ili može biti sintetisan hemijskom sintezom amino kiseline koriščenjem prikladnih prekursora amino kiselina uključujući, na primer, fluor-19 na mestu vodonika. Obeleživači kao što su te99"1 ili I<123>, Re<186>, Re188 i In<1>11 mogu biti vezani preko cisteinskog ostatka u peptidu. Itrijum-90 može biti vezan preko lizin ostatka. IODOGEN metoda (Frakeretal (1978) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 80: 49-57 se može upotrebiti za inkorporaciju joda-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphv" (ChatakCRC Press 1989) detaljno opisuje druge metode.

[0219]Konjugat antitela i citotoksičnog agensa može se napraviti koriščenjem raznih bifunkcionalnih proteinskih agensa za kuplovanje kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukđnimiđil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-l-karboksilat, iminotiolan(IT), bifunkcionalni derivah imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HC1), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je (p-azidoben-zoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilenediamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktiv fluorna jedinjenja (kao što je l,5-30difluoro-2,4-dinitrobenzene). Na primer, ricin imunotoksin se može dobiti kao što je opisano u Vitettaetal., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14-obeležena l-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Vidi VVO94/11026. Veza može biti "raskidivi veznik" koja omogućava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu se upotrebiti kiselinski-labilni veznik, peptidaze-osrtljivi veznik, fotolabilni veznik, dimetil veznik ili veznik koji sadrži disulfid (Charietal., Cancer Research 52:127-131 (1992); U.S. Patent No. 5,208,020).

[0220]Ovoaj pronalazak naročito se bavi jedinjenjima, ali se ne ograničavaju na, ADC dobijenim sa reagensima za ukršteno-vezivanje: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su uobičajeno dostupni (npr., od Pierce Biotechnologv, Inc., Rockforđ, IL., U.S. A). Vidi strane 467-495, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

Dobijanje konjugata antitelo lek

[0221]U konjugatima antitelo lek (ADC) iz ovog pronalaska, antitelo (Ab) je konjugovano sa jednimili više delova leka (D), npr. oko 1 do oko 20 delova leka po antitelu, preko veznika (L). ADC Formule I može se dobiti na nekoliko načina, primenom reakcija organske hernije, uslova, i reagensa poznatih upućenima u ovu oblast, uključujući: (1) reakciju nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim vezujućim reagensom, da bi se formirao Ab-L, preko kovalentne veze, praćeno reakcijom sa delom koji je lek D; i (2) reakcijom nukleopfilne grupe sa đela koji je lek sa bivalentnim vezujućim reagensom, da bi se formirao D-L, preko kovalentne veze, praćeno reakcijom sa nukleophilnom grupom antitela.

Ab-(L-D)p I

[0222]Nukleofilne grupe na antitelu uključuju, ali se ne ograničavaju na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) bočni lanac aminskih grupa, npr. lizin, (iii) bočni lanac tiolnih grupa, npr. cistein, i (iv) šećer hidroksilne ili amino grupe gde je antitelo glikozirano. Aminske, tiolske, i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju sa formom kovalentnih veza sa elektrofilnih grupa na vezujućim delovima i vezujućim reagensima uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati, i halidi kiselina; (ii) alkil i benzil halidi kao što su haloacetamiđi; (iii) aldehidi, ketoni, karbokslne, i maleimid grupe. Određena antitela imaju reduktibilne disulfide unutar lanca, npr. cisteinski mostovi. Antitela se mogu učiniti reaktivna za konjugaciju sa vezujućim reagensima treatmanom sa redukujućim agensom kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će zato formirati, teorijski, dva reaktivna tiol nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu biti uvedene u antitela preko reakcije lizina sa 2-iminotiolanom (Traut's reagens) rezultujući konverzijom amina u tiol.

[0223]Antitelo lek konjugati iz ovog pronalaska mogu se takođe proizvesti modifikacijom antitela sa uvođenjem elektrofilnih delova, koji mogu reagovati sa nukleofilnim supsituentima na vezujućem reagensu ili leku. Šećeri glikoziranih antitela mogu biti oksidisani, npr. sa perjodatnim oksidacionim reagensom, đa bi se formirala aldehidna ili ketonska grupa koja može reagovati sa aminskom grupom vezujućeg reagensa ili delovima leka. Rezultujući imini Šifove bazne grupe mogu formirati stabilne veze, ili mogu biti redukovane, npr. sa borohidridnim reagensom da bi se formirale stabilne aminske veze. Prema jednom aspektu, reakcija ugljenohidratnog dela glikoziranog antitela ili sa glaktoza oksidazom ili sa natrijum meta-perjodatom može dati karbonil grupe (aldehide i ketone) u proteinu koji može reagovati sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Bioconjugate Technigues). Prema drugom aspektu, protein koji sadrži N-terminalni serin ili treonin ostatak može regovati sa natrijum meta-perjodatom, rezultujući sa produkcijom aldehida na mestu prve amino kiseline (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Takvi aldehidi

mogu reagovati sa delom koji je lek ili vezujući nukleofil.

[0224]Tako, nukleofilne grupe na delu koji je lek uključuju, ali se ne ograničavaju na: amin, tiol, hidroksil, hidrazid, oksim, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat, i arilhidrazidne grupe sposobne da reaguju da bi formirale kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na vezujućim delovima i vezujućim reagensima uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati, i halidi kiselina; (ii) alkil i benzil halidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksilne, i malimidne grupe.

[0225]Alternativno, može se napraviti fuzija proteina obuhvatajući antitelo i citotoksični agens, npr., rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Dužina DNA može pođrazumevati respektivne regione koji sadrže dve porcije konjugata koje su ili jedna uz drugu ili su razdvojene regionom koji je vezujući peptiđ koji ne uništava željene osobine konjugata.

[0226]Prema još jednom aspektu, antitelo može biti konjugovano za "receptor" (kao streptavidin) za primenu u pre-targetiranju tumora gde se antitelo-receptor konjugat daje pacijentu, praćeno uklanjanjem nevezanog konjugata iz cirkulacije primenom agensa za čišćenje i potom se daje "ligand" (npr., avidin) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr., radionukleotidom).

Derivati Antitela

[0227]Antitela predočenog pronalaska mogu se dalje mođifikovati tako da sadrže dodatne nonproteinske delove koji su poznati u ovoj oblasti i lako su dostupni. Poželjno, prikladni delovi za derivatizaciju antitela su polimeri rastvorni u vodi. Ne-ograničavajući primeri polimera rastvornih u vodi obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-l,3-dioksolan, poli-l,3,6-trioksan, etilen/malein anhidrid kopolimer, poliaminokiseline (kako homopolimeri ili random kopolimeri), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid ko-polimere, polioksietilovane poliole (npr., glicerol), polivinil alkohol, i njihove smese. Polietilen glikol propionaldehiđ može imati prednost u proizvodnji zahvaljujući svojoj stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, može biti račvast ili neračvast. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, i ako je vezan više od jednog polimera, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Uopžteno, broj i/ili tip polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti baziranjem na uključenim razmatranjima, ali ne ograničavajući se na, određene osobine ili funkcije antitela koje treba unaprediti, ako će derivat antitela biti upotrebljen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

Farmaceutski Preparati

[0228]Therapeutski preparati koji sadrže antitelo iz ovog pronalaska su pripremljeni za čuvanje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa mogućim fiziološki prihvatljivim nosačima, podlogama ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku vodenih rastvora, liofilizata ili drugih osušenih preparata. Prihvatljivi nosači, podloge, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni, histidinski i druge organske kiseline; antioksidante uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecilđimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hloriđ; benzalkonijum hlorid, bervzetonijum hloride; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što je metil ili propil paraben; catehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptiđe male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrophilne polimere kao što je polivinilpirolidon; amino kiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, orlizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ordekstrin; helirajuće agense kao što je EDTA; šećere kao što je sukroza, manitol, trehaloza ili sorbitol; slobodne-jone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili ne-jonske surfaktante kao što su TVVEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0229]Ovde obuhvaćeni preparati mogu takođe sadržavati više od jedne aktivne komponente kako je neophodno za tretiranje određene indikacije, poželjno one sa komplementarnim dejstvom tako da nema nepovoljnog uticaja jedne na drugu. Takve molekule su prikladno sadržane u kombinaciij u količinama koje su efectivne za željenu svrhu.

[0230]Aktivni sastojci mogu se takođe pripremiti obloženi u mikrokapsulama, na primer, emulzionim tehnikama ili površinskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozne ili želatinske-mikrokapsule i poli-(metil-metakilat) mikrokapsule, tim redom, u medijumima za isporuku Jekova u koloidnom stanju (na primer, lipozomi, albumin mikro-kuglice, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u obliku makroemulzija. Takve tehnike su sadržane u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.

(1980).

[0231]Preparati koji će biti korišćeniin vivomoraju biti sterilni. Ovo se lako postiže filtriranjem kroz membrane za sterilnu filtraciju.

[0232]Mogu se napraviti preparati sa postepenim-otpuštanjem. Prikladni primeri preparata sa postepenim-otpuštanjem uključuju semipermeabilne matrikse od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže imunoglobulin iz ovog pronalaska, a matriksi su u formi oblikovanih predmeta, npr., filmova, ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa postepenim-otpuštanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktidi (U.S. Pat. No. 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i y etil-L-glutamata, ne-razgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečna kiselina-glikolna kiselina kao što je LUPRON DEPOT™ (injekcione mikrosfere koje se sastoje od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata), i poli-20D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina. Dok polimeri kao što je etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju otpuštanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidrogelovi otpuštaju proteine u kraćem vremenskom periodu. Kada su inkapsulirani imunoglobulini se zadržavaju u telu duže vreme, mogu se denaturisati ili se može pojaviti agregacija kao rezultat izloženosti vlazi na 37°C, što rezultira gubitkom bioloških dejstava i moguće su promene imunogenosti. Mogu se pronaći racionalne strategije za stabilizaciju zavisno od mehanizama koji su uključeni. Na primer, ako je utvrđeno da je agregacioni mehanizam formiranje intermolekularne S-S veze preko tio-disulfiđne razmene, stabilizacija se mmože postići modifikovanjem sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, koriščenjem odgovarajućih aditiva, i razvojem polimernih matriksa specifičnog sastava.

Primate

[0233]Antitelo iz predočenog pronalaska može se koristiti u, na primer,in vitro, ex vivoiin vivoterapeutskim metodama. Antitela iz ovog pronalaska mogu se upotrebiti kao antagonisti za parcijalnu ili potpunu blokadu aktivnosti specifičnog antigenain vitro, ex vivoi/iliin vivo.Pored toga, najmanje neka antitela iz ovog pronalaska mogu neutralisati aktivnost antigena iz druge vrste. Prema tome, antitela iz ovog pronalaska mogu se upotrebiti za inhibiciju specifične aktivnosti antigena, npr., u ćelijskoj kulturi koja sadrži antigen, kod humanih subjekata ili kod drugih subjekata sisara koji imaju antigen sa kojim antitelo iz ovog pronalaska unakrsno-reaguje (npr. šimpanze, babuni, marmoseti, cvnomolgus i rhesus, svinja ili miš). Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska se može upotrebiti za inhibiciju aktivnosti antigena preko kontakta antitela sa antigenom tako da se aktivnost antigena inhibira. Poželjno, antigen je humani proteinski molekul.

[0234]Prema jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska se može upotrebiti u metodi inhibicije antigena kod subjekta koji pati od poremećaja kod kog je aktivnost antigena škodljiva, podrazumevajuči davanje antitela iz ovog pronalaska subjektu tako da se inhibira aktivnost antigena kod subjekta. Poželjno, antigen je humani proteinski molekul i subjekt je humani subjekt. Alternativno, subjekt može biti sisar sa ekspresijom antigena sa kojim se vezuje antitelo iz ovog pronalaska. Tako dalje, subjekt može biti sisar kome je antigen unet (npr., davanjem antigena ili ekspresijom antigen transgena). Antitelo iz ovog pronalaska se može davati humanim subjektima u terapeutske svrhe. Pored toga, antitelo iz ovog pronalaska, može se davati non-humanim sisarima sa ekspresijom antigena sa kojim imunoglobulin unakrsno-reaguje (npr., primat, svinja ili miš) za veterinarsku primenu ili kao kod životinjskog modela za humanu bolest. S' obzirom na poslednji navod, takvi životinjski modeli mogu biti korisni za razvoj terapeutske efikasnosti antitela iz ovog pronalaska (npr., testiranje doza i vremenskog rasporeda davanja). Blokirajuče antitelo iz ovog pronalaska koje je terapeutski korisno uključuje, na primer, ali se ne ograničava na, anti-50HER2, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CDH, anti-interferon i anti-tkivni faktor antitela. Antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti u tretmanu, inhibiciji, odlaganju progresije ili, prevenciji/odlaganju pojave, napredovanja, ili za prevenciju bolesti, poremećaja ili stanja udruženih sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću jednog ili više molekula antigena, uključujući ali ne ograničavajući se na poremećaje u malignim i benignim tumorima; non-leukemiijskim limfoidnim malignitetiima; neuronskim, glijalnim, astroitnim, hipotalamičkim i drugim glandularnim, makrofagalnim, epitelijalnim, i poremećajima vezivnog tkiva i ćelija blasta; i inflamatornim, angiogenim i imunologim poremećajima.

[0235]Prema jednom aspektu, blokirajuče antitelo iz ovog pronalaska je specifično za ligand antigen, i inhibira aktivnost antigena blokiranjem ili uplitanjem u ligand-receptor interakciju utičući na ligand antigen, i zato inhibira odgovarajući signalni put i druge molekulske ili ćelijske procese. Pronalazak takođe prikazuje receptor-specifična antitela koja obavezno ne sprečavaju vezivanje liganda ali interferiraju sa aktivacijom receptora, inhibitirajući tako bilo koji od odgovora koji bi normalno bili izazvani vezivanjem liganda. Pronalazak takođe obuhvata antitela koja se ili poželjnije ili isključivo vezuju za liganđ-receptor komplekse. Antitelo iz ovog pronalaska može takođe igrati ulogu agonista određenog antigen receptora, tako potentiacirajuči, pojačavajući ili aktivirajući onda sve ili deo aktivnosti ligand-posredovane activacije receptora.

[0236] U određenim aspektima, imunokonjugat koji podrazumeva antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom daje se pacijentima. U nekim aspektima, imunokonjugat i/ili antigen za koji je vezan je/su ugrađen u ćeliju, rezultirajuči povećanom terapeutskom efikasnosti imunokonjugata u ubijanju ciljne ćelije za koju se vezuje. U jednom aspektu, citotoksički agens targetira ili interferira sa nukleinskom kiselinom u ciljnoj ćeliji. Primeri takvih citotoksičnih agensa uključuju svaki ovde navedeni hemoterapeutski agens (kao što je maitansinoid ili calichearnicin), radioaktivni izotop, ili ribonukleaza ili DNA endonukleaza.

[0237]Antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti u terapiji ili sama ili u kombinaciji sa drugim preparatima. Na primer, antitelo iz ovog pronalaska može se davati zajedno sa drugim antitelom, hemoterapeutskim agensom(ima) (uključujući koktele hemotherapeutskih agensa), drugim citotoksičnim agensom(ima), anti-angiogenog(ih) agensa, citokina, i/ili agensa inhibitora rasta. Tamo gde antitelo iz ovog pronalaska inhibira rast tumora, može biti delimično poželjno da se kombinuju sa jednim ili više drugih terapeutskih agensa koji takođe inhibiraju rast tumora. Na primer, antitelo iz ovog pronalaska može biti kombinovano sa anti-VEGF antitelom (npr., AVASTIN) i/ili anti-ErbB antitelom (npr. HER-CEPTIN® anti-HER2 antitelo) u šemi tretmmana, npr. u treatiranju bio koje ovde opisane bolesti, uključujući kolorektalni kancer, metastatski kancer dojke i kancer bubrega. Alternativno, ili dodatno, pacijent može primati kombinovane radiacione terapije (npr. zračenje spoljnim zrakom ili terapija sa radioaktivno obeležanim agensom, kao što je antitelo). Takve gore pomenute kombinovane terapije uključuju kombinovanu primenu (gde su dva ili više agensa uključeni u iste ili odvojene preparate), i odvojenom primenom, u kom slučaju se davanje antitela iz ovog pronalaska može pojaviti pre, i/ili posle, davanja pomoćne terapije ili terapija.

[0238]Antitelo iz ovog pronalaska (i pomoćni terapeutski agens) se daje na bilo koji prikladan način, uključujući parenteralni, subkutani, intraperitonealni, intrapulmonarni, i intranazalni, i, ako je potrebno za lokalni tretman, intralezionalna primena. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, ili subkutanu primenu. Pored toga, antitelo se na prikladan način primenjuje pulsnom infuzijom, naročito sa opadajućim dozama antitela. Doziranje se može izvoditi prikladnim putem, npr. injekcijama, kao što su intravenske ili subkutane injekcije, delimično zavisno od toga da li je primena povremena ili hronična.

[0239]Preparat antitela iz ovog pronalaska će biti formulisan, doziran, i primenjen na način usklađen sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određene poremećaje koji su tretirani, ođerđene sisare koji su tretirani, kliničke uslove za pojedinog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, metod primene, raspored davanja, i druge faktore poznate medicinskim praktikantima. Antitelo me mora biti, ali može biti formulisano sa jednim ili više agensa koji su već u upotrebi za prevenciju ili tretman poremećaja koji su u pitanju. Delotvorna količina tih drugih agensa zavisi od količine antitela iz ovog pronalaska prisutne u preparatu, vrste poremećaja ili treatmana, i drugih gore diskutovanih faktora. Ovi su generalno korišćeni u istim dozama i putevima primene kako su ovde ranije upotrebljeni ili od oko 1 do 99% tu i tamo primenjenih doza.

[0240]Za prevenciju ili tretman bolesti, odgovarajuća doza antitela iz ovog pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim agensima kao što su hemoterapeutski agensi) zavisiće od vrste bolesti koja se tretira, tipa antitela, težine i uzroka bolesti, bez obzira na to da li je antitelo primenjeno u preventivne ili terapeutske svrhe, predhodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i razboritosti nadzornog lekara. Antitelo se prikladno primenjuje kod pacijenta jednokratno ili u serijama tretmana zavisno od tipa i težine bolesti, oko 1 ug/kg do 15 mg/kg( npr.O.lmg/kg-lOmg/kg) antitela je početna kandidat doza za davanje pacijentu, bilo kao, na primer, putem jednog ili više odvojenih davanja, ili putem kontinirane infuzije. Jedna tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 ug/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore pomenutih faktora. Pri ponovljenim davanjima tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, tretman je produžen do pojave željene supresije simptoma bolesti. Jedan primer doziranja antitela bio bi opseg od oko 0.05mg/kg do oko lOmg/kg. Tako, se pacijentu može davati jedna ili više doza od oko 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg ili lOmg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze mogu se primenjivati intermitentno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent dobija od oko dve do oko dvadeset, npr. oko šest doza antitela). Može se davati početna udarna doza punjenja, praćena jednom ili više nižih doza. Primer režima doziranja podrazumeva davanje početne doze punjenja od oko 4 mg/kg, praćeno nedeljnom dozom za održavanje od oko 2 mg/kg antitela. Svakako, mogu biti korisni i drugi režimi doziranja. Progres ove

terapije se lako prati konvencionnim tehnikama i analizama.

Predmeti Proizvodnje

[0241] Opisani su predmeti proizvodnje koji sadrže materijale korisne u tretmanu, prevenciji i/ ili dijagnostici gore opisanih poremećaja. Predmet proizvodnje podrazumeva kontejner i etiketu ili uputstvo na ili zajedno sa kontejnerom. Prikladni kontejneri uključuju, na primer, bočice, fiole, špriceve, itd. Kontejneri mogu biti načinjeni od različitih materijala kao što je staklo ili plastika. Kontejner sadrži preparat sam po sebi ili je kombinovan sa drugim preparatima efektivnim u tretiranju, prevenciji i/ili dijagnostici stanja i može imati sterilna ulazna vratanca (na primer kontejner može biti vreća za intravenski rastvor ili fiola koja ima zatvarač kroz koji može da prođe hipođermalna injekciona igla). Najmanje jedan aktivni agens u preparatu je antitelo iz ovog pronalaska. Etiketa ili uputstvo ukazuje na to da se preparat koristi za tretiranje odabranog stanja, kao što je kancer. Pored toga, predmet proizvodnje može pođrazumevati (a) prvi kontejner sa u njemu sadržanim preparatom, gde preparat podrazumeva antitelo iz ovog pronalaska; i (b) drugi kontejner sa u njemu sadržanim preparatom, gde preparat podrazumeva dodatne citotoksične agense. Predmet proizvodnje može dodatno pođrazumevati uputstvo koje naznačava da se prvi i drugi preparati antitela mogu upotrebiti za tretman određenog stanja, npr. kancer. Alternativno, ili dodatno, predmet proizvodnje može dodatno pođrazumevati drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski-prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska vođa za injekcije (BVVFI), fosfat-puferovani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. On dodatno može uključivati druge materijale poželjne sa komercijalne i tačke gledišta korisnika, uključujući druge pufere, diluente, filtere, igle, i špriceve.

[0242] Slede primeri metoda i preparata iz ovog pronalaska. Razume se da razni drugi aspekti, za koje je gore dat generalni opis, mogu biti primenjeni.

PRIMERI

Materijali i Metode

[0243] Brojevi ostataka su u skladu sa Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Korišćene su pojedinačne kasnije izmene amino kiselina. DNA degeneracije su predstavljene koriščenjem TUB koda (N = A/C/G/T, D

= A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = G/T).

[0244]Direktni hipervarijabilni region graftova na akceptorskom humanom konsenzus okviru- Fage središte korišćeno u ovom radu je monovalentni Fab-g3 ispoljeni vektor (pV0350-2B) koji ima 2 otvorena čitljiva rama pod kontrolom phoA promotera, u osnovi kako je opisano u Lee et al., ]. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93. Prvi otvoreni čitljivi okvir se sastoji od stil signalne sekvence fuzionisane sa VL i CH1 domenima akceptorskog lakog lanca i drugi se sastoji od stil signalne sekvence fuzionisane sa VH i CH1 domenima akceptorskog teškog lanca praćeno skraćenim minor fage površinskim proteinom P3. Vidi Lee et al.,

35supra.

[0245] VL i VH domeni iz 5D5 glodara (vidi hvbridoma 5D5.11.6, ATCC Deposit No. HB-11895, deposit date May 23, 1995) su poravnati sa humanim konsenzus kapa I (huKI) i humanom subgroupom III konsenzus VH (huIII) domenima. Za pravljenje HVR kalema upotrebljen je akceptor VH okvira, koji se razlikuje od humane subgroupe III konsenzus VH domena u 3 pozicije: R71A, N73T, i L78A (Čarter etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)). Hipervarijabilni regioni iz 5D5 antitela glodara (mu5D5) su preoblikovani u akceptor humanog konsenzus okvira da bi se generisao direktni HVR-kalem od 5D5 (5D5 kalem). U VL domenu sledeči regioni su kalemljeni na humani konsenzus akceptor: pozicije 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3). U VH domenu kalemljene su pozicije 26-35 (Hl), 49-65 (H2) i 95-102 (H3) (Slika 1).

[0246] Varijante direktni-kalem su generisane Kunkel mutagenezom koriščenjem posebnog oligonukleotida za svaki hipervarijabilni region. Korektni klonovi su dirigovani DNA sekvencioniranjem.

[0247]Blaga randomizacija hipervarijabilnih regiona- Različitost sekvenci je uvedena u svaki hipervarijabilni region primenom blage randomizacione strategije koja održava inklinaciju prema sekvenci hipervarijabilnog regiona glodara. Ovo je izvedeno primenom strategije sinteze zatrovanih oligonukleotida kako je opisano u Gallop etal., J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994). Za datu poziciju u hipervarijabilnom regionu koju treba mutirati, kodon koji kodira sirov-tip amino kiseline je zatrovan sa 70-10-10-10 smesom nukleotida rezultirajući stepemom mutacije oko 50 procenata na svakoj poziciji.

[0248] Blago randomizirani oligonukleotidi su kopirani posle sekvenci hipervarijabilnog regiona glodara i sadrže iste regione definisane direktnim kalemima hipervarijabilnog regiona. Pozicija amino kiseline na početku H2 (pozicija 49) u VH domenu, je sekvenca čija raznovrsnost je ograničena na A, G, S ili T uz upotrebu kodona RGC.

[0249]Generisanje Fage banaka- Pulovi ranđomiziranih oligonukleotida dizajnirani za svaki hipervarijabilni region su fosforilisani posebno u šest 20 pl reakcija sa sadržajem od 660 ng oligonukleotida, 50 mM Tris pH 7.5,10 mM MgClz, 1 mM ATP, 20 mM DTT, i 5 U polinukleotid kinaze tokom 1 h na 37°C. Šest fosforilisanih pulova oligonukleotida je potom pomešano sa 20 pg Kunkel modelom u 50 mM Tris pH 7.5,10 mM MgCl2 u finalnoj zapremini od 500 pl dajući odnos 3 oligonukleotida prema modelu. Smesa je grejana na 90 °C tokom 4 min, 50°C tokom 5 min i potom ohlađena na ledu. Višak, negrejanih oligonukleotida je uklonjen sa QIAQUICK PCR kitom za prečišćavanje (Qiagen kit 28106) koriščenjem modifikovanog protokola da bi se sprečila povećana denaturacija grejane DNA. U 500 pl grejane smese, dođato jel50 pl PB, i smesa je podeljena između 2 silika kolone. Posle ispiranja svake kolone sa 750 pl PE i dodatnog uvrtanja da bi se kolone osušile, svaka kolona je isprana sa 1100 pl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8. Grejani i očišćeni model (220 pl) je potom napunjen dodavanjem 1 ul lOOmM ATP, 10 p 25mM dNTPs (25mM svakog od dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 15 pl lOOmM DTT, 25 pl 10X TM pufera (0.5 M Tris pH 7.5, 0.1 M MgCl2), 2400 U T4 ligaze, i 30 U T7 polimeraze tokom 3 h na sobnoj temperaturi.

[0250] Napunjen proizvod je analiziran na Tris-Acetat-EDTA/agaroza gelovima (Siđhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)). Tri trake su obično bile vidljive: donja traka je korektno napunjen i vezan proizvod, srednja traka je napunjen ali nevezan proizvod, i gornja traka je zarobljen izmešten proizvod. Gornja traka je proizvod neželjene sporedne aktivnosti T7 polimeraze i teško je izbeći je (Lechner et al., J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983)); svakako, ova traka transformiše 30-ostruko manje efikasno u odnosu na donju traku i obično malo doprinosi banci. Srednja traka je posledica odsustva 5' fosfata za finalnu reakciju vezivanja; ova traka transformiše efikasno i daje sekvencu uglavnom sirovog tipa.

[0251] Napunjen proizvod je potom očišćen i elektroporiran u SS320 ćelije i razmnožen u prisustvu M13/K07 pomoćne fage kako su opisali Siđhu et al, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000). Veličina banke se kretala od 1 - 2 x IO<9>nezavisnih klonova. Random klonovi iz inicijalnih banaka su sekvencionirani da bi se unapredio kvalitet banke.

[0252]Izbor Fage- Humani HGF receptor je generisan i upotrebljen kao Fc fuzija (HGFR-Fc) (Mark et al., J. Biol. Chem. (1992), 267:26166-26171). HGFR-Fc je obložen na MaxiSorp mikrotitarskim pločama(Nunc) na 5 pg/ml u PBS. U prvoj rundi odabira upotrebljeno je 8 ciljnih pozicija; pojedinačna ciljna pozicija je upotrebljena za sukcesivne runde selekcije. Pozicije su bile blokirane tokom 1 h koriščenjem Casein Blocker (Pierce). Fage su sakupljene iz supernatanta kulture i suspendovane u PBS koji sadrži 1 % BSA i 0.05 % TVVEEN 20 (PBSBT). Posle vezivanja za pozicije tokom 2 h, nevezane fage su uklonjene ekstenzivnim pranjem sa PBS koji sadrži 0.05 % TVVEEN 20 (PBST). Vezane fage su isprane inkubiranjem pozicija sa 50 mM HC1, 0.5 M KC1 tokom 30 min. Fage su pojačane koriščenjem ToplO ćelija i M13/K07 pomoćnih faga i rasle su preko noći na 37°C u 2YT, 50 pg/ml arbanecilina. Titri fage isprane iz ciljne obložene pozicije su upoređeni sa titrima faga oporavljenih iz non-ciljnih obloženih pozicija radi poboljšanja obogaćenja.

[0253] Za maturaciju afiniteta, fage banke su sortirane koriščenjem metode sortiranja rastvorom. HFGR-Fc je biotinisan mešanjem 500 pl 3.6 mg/ml HGFR-Fc u PBS, i lOpl 1 M kalijum fosfata, pH 8 sa 20 pl 4 mM sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce). Biotinisan HGFR-Fc (b-HGFR-Fc) je prečišćen koriščenjem NAP5 kolone (Amersham Biosciences) u PBS. Mikroticarske pozicije na ploči su obložene sa 10 pg/ml neutraviđina u PBS preko noći na 4°C i potom blokirane tokom 1 h koriščenjem Casein Blocker (Pierce). U prvoj rundi ispiranja, pomešano je 200 pl fage suspendovanih u PBS koji sadrži 0.05% Tvveen 20 (PBST) i 1 % BSA sa 10 nM b-HGFR-Fc tokom 1 hr. Fage vezane za b-HGFR-Fc su zarobljene na neutravidin obloženim pozicijama tokom 10 min i nevezane fage su sprane sa PBST. Fage su isprane koriščenjem 20 mM HC1, 500 mM KC1 for 45 m, neutralisane, i razmnožene u XL1 blue cells (Stratagene) u prisustvu K07 pomoćne fage (Nevv England Biolabs). Sledeće runde sortiranja su izvedene na isti način sa sledećim izuzecima: u rundi 2 finalna b-HGFR-Fc koncentracija je bila 5.6 nM, u rundi 3 finalna b-HGFR-Fc koncentracija je bila 0.1 nM, u rundi 4 finalna b-HGFR-Fc koncentracija je bila 0.5 nM i 780 nM nebiotinisan HGFR-Fc je dodat smesi 1 h pre hvatanja na neutravidin.

[0254]Fage ELISA- MaxiSorp mikrotitarske ploče su obložene humanim HGFR-Fc na 5 pg/ml u PBS preko noći i potom je blokiran sa Casein Blocker. Fage iz supernatanta kultura su inkubirane sa serijskim razblaženjima HGFR-Fc u PBST koji sadrži 1 % BSA u kulturi tkiva u mikrotitarskoj ploči tokom 1 h posle čega je 80 pl smese preneto u target obložene pozicije tokom 15 min da bi se nevezane fage vezale. Ploča je oprana sa PBST i dodat je HRP konjugovani anti-M13 (Amersham Pharmacia Biotech) za 40 min (1:455000 in PBST containing 1 % BSA). Ploča je oprana sa PBST i razvijena dodavanjem Tetrametilbenziđin supstrata (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaith-ersburg, MD). Absorbanca na 405 nm je ucrtana kao funkcija koncentracije targeta u rastvoru da bi se odredio IC50. Ovo je upotrebljeno za ustanovljavanje afiniteta za Fab

klon ispoljen na površini fage.

[0255]Fab Produkcija i Određivanje Afiniteta -Za ekspresiju Fab proteina za merenje afiniteta, stop kodon je unet između teškog lanca i g3 u istaknutom vektoru fage. Klonovi su transformisani u E. coli 34B8 ćelije i uzgajani u AP5 medijumu na 30 C (Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, suspendovane u 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8 i razaranjem su otvorene korišćenjem mikrofluidizera. Fab je prečišćen sa Protein G afinitivnom hromatografijom.

[0256] Određivanja afiniteta su izvedena površinskom plazmon rezonancom korišćenjem BIAcore™-2000. HGFR-Fc je imobilisan (-1000 jedinica odgovora (response units - RU)) na CM5 čipu i injektirane su različite koncentracije Fab (4 do 500 nM) u PBST. Posle svakog injektiranja čip je regenerisan korišćenjem 100 mM HC1. Vezujući odgovor je korigovan oduzimanjem RU ođ slepe probe ćelijskog protoka. A 1:1 Languir model simultanog fitinga k<,„ i koff je upotrebljen za kinetičke analize.

[0257] Prečišćen cMet-Ig protein proizveden kod Genentech (South San Francisco, CA) je biotiniziran inkubiranjem sa 20-to molarnim viškom NHS-X-Biotina u 0.1 M NaHC03, pH 8.5 korišćenjem biotin-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH). Prečišćen humani 2-Ianac HGF proizveden kod Genentech je obeležen sa BV-TAG (cat# 110034) via NHS-estar hernije u skladu sa uputstvima proizvođača (BioVeris International, Gaithersburg, MD). cMet-Ig-biotin (500 ng/mL), HGF-Ruthenium Tag (250 ng/mL), i titracije OA5D5 antitela u osegu od 3333-0.21 nM antitela su incubirane zajedno u zapremini od 100 ul điluenta za analizu: PBS + 0.5% BSA / 0.5% Tvveen 20 /0.033% Proclin (Supelco Inc. Bellefonte PA). Smese su inkubirane u zatvorenim polipropilenskim pločama sa 96 pozicija sa zaobljenim dnom (Corning) tokom 2-4 sata na sobnoj temperaturi uz mešanje. Dodati su streptavidin magnetski mešači (Dvnabeads, BioVeris). Posle finalne 45 minutne inkubacije uz intenzivno mućkamje, ploče su pročitane upotrebom BioVeris M-Series instrumenta (BioVeris International, Gaithersburg, MD).

KIRA ( HGF- zavisna - Met Fosforilacija)

[0258] A549 ćelije (ATCC, Manassas, VA) su držane u medijumu za rast (Ham's F12/DMEM 50:50 [Gibco, Grand Island, NY] koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Sigma, St. Louis, MO). Da bi se ćelije pripremile za analizu, čelije iz slivenih kultura su razdvojene korišćenjem Accutase (ICN, Aurora, OH) i postavljene u ploče sa 96 pozicija gustinom od 50,000 čelija po poziciji. Posle incubacije preko noći na 37°C, uklonjen je medijum za rast i čelije su ostavljene bez seruma 30-60 min u medijumu koji sadrži 0.1% FBS. Da bi se odredila sposobnost OA-5D5 da inhibira cMet fosforilaciju, molekul je serijski razblažen od 200 do 0.19 nM u medijumu +0.1% FBS i dodat u ploče za analizu. Posle 15 minutne inkubacije na 37°C, dodat je HGF (50 ng/ml). Ploče su potom inkubirane tokom dodatnih 10 minuta na 37°C, medijum je uklonjen i dodat pufer za lizirnje ćelija (Cell Signaling Technologies, Cat # 9803, Beverlv, MA; obogaćen koktel inhibitorom proteaze nabavljenim od Calbiochem, Cat #539131, San Diego, CA). Lizati su analizirani na fosforilisan c-Met via analiza elektrohemiluminiscencijom upotrebom BioVeris M-Series instrumenta (BioVeris International, Gaithersburg, MD). Anti-fosfotirozin mAb (klon 4G10, Upstate, Lake Placid, MY) je obeležen sa BV-TAG via NHS-estar hernije u skladu sa uputstvima proizvođača (BioVeris). Antitela protiv c-Met ekstracelularnog domena je biotinisan korišćenjem biotin-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH). BV-TAG-obeleženi 4G10 i biotinisani anti-c-Met mAb su razblaženi u puferu za analizu (PBS / 0.5% Tween-20 / 0.5% BSA) i dodati lizatima ćelija kao koktel. Posle 1.5-2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi uz snažno mućkanje, dodati su streptavidin magnetski mešači (Dvnabeads, BioVeris). Posle finalne 45 minutne inkubacije, ploče su pročitane na BioVeris instrument.

Ćelijska Kultura i analiza proliferacije

[0259] BaF3 je IL-3 odeljak limfoidne ćelije glodara koja normalno ne ispoljava cMet i ne odgovara na HGF. Svakako, u BaF3-hMet izvedenim transfekcijom sa normalnim, puna-dužina cDNA za humani c-Met (SchvvalI et al., J.Cell Biol. (1996), 133:709-718), proliferacija HGF stimulatora i preživljavanje u odsustvu IL-3. BaF3-hMetanđ BaF3-neo ćelije su rutinski sprovedene u RPMI1640,5% fetalnog goveđeg seruma, 4 pl/L B-merkaptoetanola, 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml streptomicin sulfata, 2 mM L-40 glutamina, i 5% VVEHI-kondicioniranog medijuma kao izvora IL-3. Za merenje HGF-zavisne proliferacije broj ćelija posle 3 dana od tretmana je kvantifikovan dodavanjem 25 pl Alarma Blue (Trek Diagnostic Svstems; Cleveland, OH) i merenjem intenziteta fluorescencije 6 sati kasnije. Kontrolni eksperimenti su proliferacija ovih ćelija u odsustvu HGF. H358-PSF2 i HGF-PSF8 ćelije su sprovedene u RPMI 1640, 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml streptomicin sulfata, 2 mM L-glutamina. Medijum za analizu je bio RPMI 1640 plus 0.1%, 0.5% BSA, ili 10% FBS navedenim redom. Analiza je izvedena kako je gore opisano.

Imunoprecipitacija i Western Blot

[0260] H358 ćelije su ćelijska linija izvedena iz humanih ne-malih ćelija karcinoma pluća (NSCLC). H358-[0260]HPSF2, H358-PSF8 ćelije su humane HGF stabilne transficirane H358 ćelije (Tsao et al., Neoplasia, Vol.502, No.3, 2000), i kultivisane su u RPMI 1640, 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/ml penicillina, 100 pg/ml streptomicin sulfata, 2 mM L-glutamina. Detekcija cMet tirozin fosforilacije je u osnovi izvedena kako je gore opisano (Zioncheck, J Bio Chem, 270(28): 16871-8,1995). Doslovno, ćelije su postavljene u 60-mm ploče preko noći, i medijum je promenjen u RPMI 1640 koji sadrži 0.5% BSA, pre dodavanja kombinacija sa ili bez lnM HGF ili kompetitorskog OA5D5.v2 antitela. Posle 10 min na 37 °C, medijum je uklonjen i ćelije su lizirane korišćenjem lizirajućeg pufera (150 mM NaCl, 1.5 mM MgC12,1% Tri ton X-100, lx proteaza koktel inhibitor, IX fosfataze koktel inhibitor (Sigma, St. Louis, MO)). Posle stvaranja filamenata, supernatant iz lizata je inkubiran sa anti-cMet IgG poliklonalnim antitelom (c-28; Santa Cruz Biotechnologv, Santa Cruz, CA) vezanim za protein G-Sefaroze tokom 1-og sata na 4°C. Imuni kompleksi su oprani i prokuvani lx u puferu za uzorak, pre separacije pomoću SDS-PAGE i elektrofokusiranja na nitrocelulozi. Fosfotirozin-sadržavajući proteini su vizualizovani koriščenjem anti-fosfotirozin antitela (4G10; Upstate Biotechnologv, VValtham, MA) praćeno sa HRP-konjugovanim kozjim anti-mišjim Fab (1:10,000; Jackson Labs, VVest Grove, PA), i u slučaju totalnog cMet korišćenjem c-28 antitela (1:400; Santa Cruz Biotechnologv, Santa Cruz, CA) praćeno kozjim anti-zečjim Fc-HRP (1:10,000; Jackson Labs, VVest Grove, PA) sa hemiluminescentnom detekcijom.

Ksenograftsko ispitivanje tumoa

[0261] Atimični ženski miševi su postepeno inokulisani sa 5 milliona KP4 čelija pankreasnog karcinoma. Kada su tumori dostigli 150-200 mm<3>, miševi su podeljeni u 2 grupe po 10. Grupi 1 je injektiran IP sa rastvaračem dvaput nedeljno. Grupi 2 je injektiran IP sa OA5D5.v2, 30 mg/kg, dvaput nedeljno. Veličina tumora je merena dvaput nedeljno. Miševi su žrtvovani kada je zapremina tumora dvostruko prevazišla početnu zapreminu tumora, ili ako se pojavila ulceracija tumora.

Rezultati i Diskusija

[0262]Humanizacija 5D5- Humani akceptor okvir upotrebljen za humanizaciju 5D5 podrazumeva konsenzus humani kapa I VL domen i varijantu humane subgrupe III konsenzus VH domena. Varijanta VH domena ima 3 izmene iz humanog konsenzusa: R71A, N73T i L78A. VL i VH domeni 5D5 glodara su unapređeni sa humanim kapa I i subgrupom III domena; svaki HVR je identifikovan i potom kalemljen u humani akceptor okvir da bi generisao 5D5 kalem koji bi mogao biti prikazan kao Fab na fagama. Kada su fage koje prikazuju 5D5 kalem testirane na vezivanje za imobilisan HGFR-Fc, nije uočeno vezivanje.

[0263] Banka je generisana tako da je svaki od HVR regiona 5D5 kalema soft ranđomiziran. Ova banka je u 4 runde selekcije isprana od imobilisanog HGFR-Fc. Klonovi su uzeti za analizu DNA sekvence i odabrani su pojedinačni otkriveni klonovi. Ovaj klon je imao pojedinačnu izmenu u VH domenu na poziciji 94 (R94S) neposredno van ciljanog regiona HVR-H3 namenjenog za mutagenezu. Analize ovog klona sa fage ELISA ukazale su da je imao isti afinitet kao što je monovalentni afinitet 5D5 glodara. Kada je ispoljen kao Fab i testiran sa Biacore, određeno je da je Kd 9.8 nM u poređenju sa 8.3 nM za monovalentni afinitet 5D5 glodara. Tako ova neočekivana supstitucija obnavlja pun afinitet vezivanja za 5D5 kalem, i 5D5 kalem plus R94S (hu5D5.vl) predstavlja potpuno humanizovano antitelo. Interesantno, homologa amino kiselina, treonin, je nađena na ovoj poziciji u antitelu glodara. MacCallum et al. (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745

(1996)) su analizirali kristalne strukture antitelo i antigen kompleksa i našli da su pozicije 93 i 94 teškog lanca ulazna vrata kontaktnog regiona zbog čega izgleda razumno da se ove pozicije uključe u definiciju hipervarijabilnog regiona H3 (HVR-H3) prilikom humanizacije antitela.

[0264]Unapređenje Afiniteta hu5D5. vl-Za unapređenje afiniteta hu5D5.vl, generisani su prikazi šest banaka fage u osnovi hu5D5.vl, a svaka cilja pojedinačni HVR za soft randomizaciju. Za izbegavanje re-selekcije hu5D5.vl iz uzorka potencijalno visoke vrednosti sirovog-tipa, uvedeni su stop kodoni u HVR da bi mutirali pre generisanja svake banke. Metoda sortiranja rastvorom je upotrebljena da poboljša efikasnost procesa selekcije faga baziranog na afinitetu. Manipulacija biotininiziranom ciljnom koncentracijom, redukujući vreme zarobljavanja fage do nižih vrednosti i dodavanje nebiotiniziranog cilja radi eliminacije klonova sa bržim pacovskim, mogu se potpuno kompetentno odabrati klonovi visokog afiniteta. Lee etal.,supra.Iz prve runde selekcije, uočeno obogaćenje (zarobljavanje ciljno zavisnih faga) je nagovestilo prisustvo velikog broja klonova u svakoj banci sa razumno visokim afinitetom za HGFR-Fc. Rigorozna selekcija (vidi gore Metode) je unapređena uzastopnim rundama i kod 3 runde svih 6 banaka je kombinovano da bi se generisalo sedmi pul banaka. Posle 4 runde selekcije, analizirani su klonivi iz svakog od 7 pulova banaka. Svi klonovi u bankama koji su usmeseni na HVR-L1 i HVR-L3 bili su identični sa hu5D5.vl; svakako, nove sekvence su uočene u bankama usmerenim prema HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 (Slika 2). Pul banaka koji se sastoji od kombinacije svih 6 banaka je pod dominacijom sekvenci iz HVR-45H3 banke nagoveštavajući da su ove sekvence obezbedile najveće unapređenje afiniteta za HGFR-Fc (Slika 3). Odabrani klonovi su pregledani pomoću fage ELISA i potom ispoljeni kao Fab protein i njihov afinitet je određen korišćenjem Biacore. Nekoliko klonova iz kombinovane banke sa izmenama u HVR-H3 imalo je unapređene afinitete u poređenju sa hu5D5.vl ili monovalentnim afinitetom 5D5 glodara (Slika 4). Ovi klonivi su imali bilo koju od S/T na poziciji 94, R/S na poziciji 96 i T/S na poziciji 100 i P/S/A na poziciji 100a. Najbolji klon, klon 78 (hu5D5.v2) je imao 3 izmene od hu5D5.vl (94T, 96R i 100T) i 13-tostruko unapređenje afiniteta.

[0265]Tako polazeći ođ kalema od 6 glodarskih 5D5 HVRs u pomoćnom humanom akceptorskom okviru, ekspanzija HVR-H3 đa bi obuhvatio poziciju 94 (Treonin) i adiciju 2-e izmene na HVR-H3, vodi đo potpuno humanog 5D5 antitela sa 13-ostruko unapređenim afinitetom vezivanja za HGFR. Pored toga, za ovde opisana odabrana humanizovana antitela ustanovljeno je da imaju najmanje komparablnu biološku aktivnost kao roditeljsko 5D5 antitelo, na primer u analizi fosforilacije receptora, itd. (podaci nisu prikazani).

[0266]Karakterizacija antitela iz ovog pronalaska-Okarakterisana su "jedno-ruka" (takođe označena kao "jedna-ruka" i "OA") anti-Met antitela. Testirana su dva antitela iz ovog pronalaska. Specifično, "OA-5D5.v2" antitelo predstavlja jednu Fab ruku koja obuhvata sekvence varijabilnog domena kako je opisano na Slici 13, gde je Fab fuzionisan u Fc region, i gde je Fc region bio kompleks između jednog Fc polipeptida koji obuhvata sekvencu opisanu na Slici 13 i jednog Fc polipeptida koji obuhvata Fc sekvencu prikazanu na Slici 14. Antitela su okarakterisana kako sledi: (1) U analizi za testiranje sposobnosti OA-5D5.v2 da blokira vezivanje HGF za njegov receptor, OA-5D5.v2 je sposoban da blokira vezivanje HGF za svoj receptor najmanje isto tako dobro kao dva komparatorska antitela - naime himerično jedno-ruko antitelo (koje je obuhvatalo Fab ruku iz roditeljskog 5D5 antitela glodara (varijabilni domeni prikazani na Slici 7) fuzionisano sa humanim Fc regionom), i drugo antitelo iz ovog pronalaska (OA- 5D5.vl). Kada je testirano kroz opseg koncentracija antitela od oko 3333 do 0.21 nM, pod uslovima navedenim u gornjem odeljku Materijali i Metode, za OA-5D5.v2 je ustanovljeno da ima IC50 vrednost koja je manja od oko polovine u odnosu na komparatorsko antitelo kao što je himerično jedno-ruko antitelo i OA-5D5.vl. Primetno, OA-5D5.vl je takođe blokirao sa boljim IC50 nego referentno himerično antitelo. Vidi Sliku 8. (2) U analizi za testiranje sposobnosti OA-5D5.v2 da inhibira aktivaciju HGF receptora, OA-5D5.v2 je bilo sposobno da inhibira activaciju receptora kinaze najmanje tako dobro kao dva komparatorska antitela kako je opisano u (1) gore. Kada je testirano preko opsega koncentracija antitela od oko 200 do 0.19 nM, pod uslovima kako su opisani u gornjem odeljku,Materijali i Metode, za OA-5D5.v2 je ustanovljeno da ima vrednost IC50 koja je bila manja od oko polovine one koju je imalo comparatorsko antitelo kao što je himerično jedno-ruko antitelo i OA-5D5.vl. Vidi SI. 9. (3) OA-5D5.v2 je takođe testirano na ukrštene-vrste vezivanje između humanih, primata (cvnomolgus majmun), kozjih i glodara (miš). Za OA-5D5.v2 je nađeno da se specifično vezuje za humani i HGF receptor primta (cvnomolguls majmuna), ali ne za kozji ili glodara (miša), (podaci nisu prikazani). (4) OA-5D5.v2 je testirano na sposobnost inhibicije ćelijske proliferacije u prisustvu HGF. Kako je prikazano na Slici 10, OA-5D5.v2 je inhibiralo ćelijsku proliferaciju najmanje tako dobro kao njegovo himerično antitelo duplikat i OA-5D5.vl (kako je opisano u (1) gore). Kada je testirano kroz opseg koncentracija antitela od oko 0.01 do 100 nM, pod uslovima kako su opiani u gornjem odeljku Materijali i Metode, za OA-5D5.v2 je ustanovljeno da ima IC50 vrednost koja je bila manja od oko polovine od one koju je imalo komparatorsko antitelo kao što je himerično jedno-ruko antitelo i OA-5D5.vl. Vidi SI. 10. Specifično vezivanje OA-5D5.v2 za Met-transfekcirane ćelije je potvrđeno FACs analizom (podaci nisu prikazani). (5) OA-5D5.v2 je testirano na sposobnost inhibiranja fosforilacije tirozinskog receptora u prisustvu HGF. Kako je prikazano na Slikama HA i B, OA-5D5.v2 je inhibiralo fosforilaciju tirozinskog receptora kada je testirano sa koncentracijama antitela od oko 10 do 1000 nM. Vidi SI. HA i B.

(6) OA-5D5.v2 je testirano nain vivoefikasnost korišćenjem tumor ksenograft modela zasnovanog na

pankreasnoj tumorskoj ćelijskoj liniji (KP4). Rezultati ove studije efikasnosti pokazali su da je OA-5D5.v2 antitelo bilo sposobno za inhibiciju i prouzrokovanje regresije tumora in vivo. Kako je prikazano na SI. 12, tumor je potpuno nestao kod većine životinja tretiranih antitelom.

DELIMIĆNA LISTA REFERENCI

[0267]Angeloni, D., Danilkovitch-40Miagkova, A., Miagkov, A., Leonard, E. J., and Lerman, M. I. (2003). The soluble sema domain of the Ron receptor inhibits MSP-induceđ receptor activation. J Biol Chem.

Antipenko, A., Himanen, J. P., van Leyen, K., Narđi-Dei, V., Lesniak,}., Barton, W. A., Rajashankar, K. R., Lu, M., Hoemme, C, Puschel, A. W., and Nikolov, D. B. (2003). Structure of the semaphorin-3A receptor binding module. Neuron 39, 589-598.

Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D„ Stella, M. C, and Comoglio, P. M. (1997). Gabl coupling to the HGF/Met receptor multifunctional docking site requires binding of Grb2 and correlates vvith the transforming potential. Onco-gene 15,3103-3111.

Bertotti, A., and Comoglio, P. M. (2003). Tyrosine kinase signal specificity: lessons from the HGF receptor. Trends Biochem Sci 28, 527-533.

Bladt, F., Riethmacher, D., Isenmann, S., Aguzzi, A., and Birchmeier, C. (1995). Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature 376, 768-771.

Blechman, J. M., Lev, S., Barg, J., Eisenstein, M., Vaks, B., Vogel, Z„ Givol, D„ and Yarden, Y. (1995). The fourth immunoglobulin domain of the stem cell factor receptor couples ligand binding to signal transduction. Cell 80,103-113. Boix, L., Rosa, J. L., Ventura, F., Castells, A., Bruix,)., Rodes, J., and Bartrons, R. (1994). c-met mRNA overex-pression in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 19,88-91.

Bottaro, D. P., Rubin, J. S., Faletto, D. L., Chan, A. M., Kmiecik, T. E., Vande VVoude, G. F., and Aaronson, S. A. (1991). Identification of the hepatocyte grovvth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251,802-804.

Bussolino, F., Di Renzo, M. F., Ziche, M., Bocchietto, E., Olivero, M., Naldini, L., Gaudino, G., Tamagnone, L., Coffer, A., and Comoglio, P. M. (1992). Hepatocyte grovvth factor is a potent angiogenic factor vvhich stimulates endothelial cell motility and grovvth. J Cell Biol 119, 629-641.

Coltella, N., Manara, M. C, Cerisano, V., Trusolino, L., Di Renzo, M. F., Scotlandi, K., and Ferracini, R.

(2003). Role of the MET/HGF receptor in proliferation and invasive behavior of osteosarcoma. Faseb J17, 1162-1164.

Cooper, C. S., Park, M., Blair, D. G., Tainsky, M. A., Huebner, K., Croce, C. M., and Vande VVoude, G. F.

(1984). Molecular cloning of a nevv transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature 311, 29-33.

Di Renzo, M. F., Olivero, M., Giacomini, A., Porte, H., Chastre, E., Mirossay, L., Nordlinger, B., Breth, S., Bottardi, S., Giordano, S., and et al. (1995). Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer. Clin Cancer Res 1,147-154.

Ferguson, K. M., Berger, M. B., Mendrola, J. M., Cho, H. S., Leahy, D. J„ and Lemmon, M. A. (2003). EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization. Mol Cell 11, 507-517.

Furge, K. A., Zhang, Y. W., and Vande VVoude, G. F. (2000). Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins. Oncogene 19,5582-5589.

Garrett, T. P., McKern, N. M., Lou, M., Elleman, T. C, Adams, T. E„ Lovrecz, G. O., Zhu, H. J„ VValker, F., Frenkel, M. }., Hoyne, P. A., et al. (2002). Crystal structure of a truncated epidermal grovvth factor receptor extracellular domain bound to transforming grovvth factor alpha. Cell 110, 763-773.

Gherardi, E., Youles, M. E., Miguel, R. N., Blundell, T. L., lamele, L., Gough, J., Bandyopadhyay, A., Hartmann, G., and Butler, P. J. (2003). Functional map and domain structure of MET, the product of the c-met protooncogene and receptor for hepatocvte grovvth factor/scatter factor. Proc Natl Acad Sci USA.

Giancotti, F. G., and Ruoslahti, E. (1999). Integrin signaling. Science 285,1028-1032.

Giordano, S., Corso, S., Conrotto, P., Artigiani, S., Gilestro, G., Barberis, D., Tamagnone, L., and Comoglio, P. M. (2002). The semaphorin 4D receptor controls invasive grovvth by coupling vvith Met. Nat Cell Biol 4, 720-724.

Giordano, S., Di Renzo, M. F., Narsimhan, R. P., Cooper, C. S., Rosa, C, and Comoglio, P. M. (1989). Biosynthesis of the protein encoded by the c-met proto-oncogene. Oncogene 4,1383-1388.

Giordano, S., Maffe, A., VVilliams, T. A., Artigiani, S., Gual, P., Bardelli, A., Basilico, C, Michieli, P., and Comoglio, P. M. (2000). Different point mutations in the met oncogene elicit distinct biological properties. FasebJ 14,399-406.

Hamanoue, M., Takemoto, N., Matsumoto, K., Nakamura, T., Nakajima, K., and Kohsaka, S. (1996). Neurotrophic effect of hepatocyte grovvth factor on central nervous system neurons in vitro. J Neurosci Res 43,554-564.

Hartmarrn, G., VVeidner, K. M., Schvvarz, H., and Birchmeier, W. (1994). The motility signal of scatterfactor/50hepatocyte grovvth factor mediated through the receptor tyrosine kinase met requires intracellular action of Ras. J Biol Chem 269,21936-21939.

Jeffers, M., Rong, S., and Vande VVoude, G. F. (1996). Enhanced tumorigenicity and invasion-metastasis by hepatocyte grovvth factor/scatter factor-55met signalling in human cells concomitant vvith induction of the urokinase prote-olysis netvvork. Mol Cell Biol 16,1115-1125.

Jeffers, M., Schmidt, L., Nakaigavva, N., VVebb, C. P., VVeirich, G., Kishida, T., Zbar, B., and Vande VVoude, G. F. (1997). Activating mutations for the met tvrosine kinase receptor in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 94,11445-11450.

Jin, L., Fuchs, A., Schnitt, S. ]., Yao, Y., Joseph, A., Lamszus, K., Park, M., Goldberg, I. D., and Rosen, E. M.

(1997). Expression of scatter factor and c-met receptor in benign and malignant breast tissue. Cancer 79, 749-760.

Kuniyasu, H., Yasui, W., Yokozaki, H., Kitadai, Y., and Tahara, E. (1993). Aberrant expression of c-met mRNA in human gastric carcinomas. Int J Cancer 55, 72-75,

Lev, S., Yarden, Y., and Givol, D. (1992). A recombinant ectodomain of the receptor for the stem cell factor (SCF) retains ligand-induced receptor dimerization and antagonizes SCF-stimulated cellular responses. J Biol Chem 267,10866-10873.

Liu, G, Park, M., and Tsao, M. S. (1992). Overexpression of c-met proto-oncogene but not epidermal grovvth factor receptor or c-erbB-2 in primary human colorectal carcinomas. Oncogene 7,181-185.

Lokker, N. A., Mark, M. R., Luis, E. A., Bennett, G. L., Robbins, K. A., Baker, J. B., and Godovvski, P. J.

(1992). Structure-function analysis of hepatocyte grovvth factor: identification of variants that lack mitogenic activity yet retain high affinity receptor binding. Embo J 11,2503-2510.

Lorenzato, A., Olivero, M., Patane, S., Rosso, E., Oliaro, A„ Comoglio, P. M., and Di Renzo, M. F. (2002). Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility and invasion. Cancer Res 62, 7025-7030.

Love, C. A., Harlos, K„ Mavaddat, N., Daviš, S. J., Stuart, D. I., Jones, E. Y., and Esnouf, R. M. (2003). The ligand-binding face of the semaphorins revealed by the high-resolution crystal structure of SEMA4D. Nat

Struct Biol 10, 843-848.

Maina, F., Casagranda, F., Audero, E., Simeone, A., Comoglio, P. M., Klein, R., and Ponzetto, C. (1996). Uncoupling of Grb2 from the Met receptor in vivo reveals complex roles in muscle development. Cell 87, 531-542.

Matsumoto, K., and Nakamura, T. (1993). Roles of HGF as a pleiotropic factor in organ regeneration. Exs65,225-249.

Maulik, G., Shrikhande, A., Kijima, T., Ma, P. C, Morrison, P. T., and Salgia, R. (2002). Role of the hepatocvte growth factor receptor, c-35Met, in oncogenesis and potential for therapeutic inhibition. Cvtokine Grovvth Factor Rev 73, 41-59.

Meiners, S., Brinkmann, V., Naundorf, H., and Birchmeier, W. (1998). Role of morphogenetic factors in metastasis of mammarv carcinoma cells. Oncogene 16, 9-20.

Morello, S., Olivero, M., Aimetti, M., Bernardi, M., Berrone, S., Di Renzo, M. F., and Giordano, S. (2001). MET receptor is overexpressed but not mutated in oral squamous cell carcinomas. J Cell Phvsiol 189, 285-290.

Naka, D„ Ishii, T., Yoshiyama, Y., Miyazawa, K., Hara, H., Hishida, T., and Kidamura, N. (1992). Activation of hepatocyte grovvth factor by proteolytic conversion of a single chain form to a heterodimer. J Biol Chem 267,20114-20119.

Naldini, L., VVeiđner, K. M., Vigna, E., Gaudino, G., Bardelli, A., Ponzetto, C, Narsimhan, R. P., Hartmann, G., Zarnegar, R., Michalopoulos, G.K., and etal. (1991). Scatterfactorand hepatocyte grovvth factorare mdistinguishable ligandsforthe MET receptor. Embo J10, 2867-2878.

Natali, P. G., Prat, M., Nicotra, M. R., Bigotti, A., Olivero, M., Comoglio, P. M., and Di Renzo, M. F. (1996). Over-expression of the met/HGF receptor in renal cell carcinomas. Int I Cancer 69, 212-217.

Nguyen, L., Holgado-55Madruga, M„ Maroun, C, Fixman, E. D., Kamikura, D., Fournier, T., Charest, A., Tremblav, M. L., Wong, A. }., and Park, M. (1997). Association of the multisubstrate docking protein Gabl vvith the hepatocyte grovvth factor receptor requires a functional Grb2 binding site involving tyrosine 1356. J Biol Chem 272,20811-20819.

Nusrat, A., Parkos, C. A., Bacarra, A. E., Godovvski, P. J., Delp-Archer, C, Rosen, E. M., and Mađara, J. L.

(1994). Hepatocvte grovvth factor/scatter factor effects on epithelia. Regulation of intercellular junctions in transformed and nontransformed cell lines, basolateral polarization of c-met receptor in transformed and natural intestinal epithelia, and induction of rapid vvound repair in a transformed model epithelium. J Clin Invest 93, 2056-2065.

Ogiso, H., Ishitani, R., Nureki, O., Fukai, S., Yamanaka, M., Kim, J. H., Saito, K., Sakamoto, A., Inoue, M., Shirouzu, M., and Yokoyama, S. (2002). Crystal structure of the complex of human epidermal grovvth factor and receptor extracellular domains. Cell 110, 775- 787.

Olivero, M., Rizzo, M., Madeddu, R., Casadio, C, Pennacchietti, S., Nicotra, M. R., Prat, M„ Maggi, G., Arena, N., Natali, P. G., et al. (1996). Overexpression and activation of hepatocyte grovvth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer 74,1862-1868.

Olivero, M., Valente, G., Bardelli, A., Longati, P., Ferrero, N., Cracco, C, Terrone, C, Rocca-Rossetti, S., Comoglio, P. M., and Di Renzo, M. F. (1999). Novel mutation in the ATP-binđing site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer 82, 640-643.

Orian-Rousseau, V., Chen, L., Sleeman, ]. P., Herrlich, P., and Ponta, H. (2002). CD44 is required for two

consecutive steps in HGF/c-Met signaling. Genes Dev 16, 3074-3086.

Park, M., Dean, M., Cooper, C. S., Schmidt, M., O'Brien, S.}., Blair, D. G., and Vande VVoude, G. F. (1986). Mechanism of met oncogene activation. Cell 45, 895-904.

Peek, M., Moran, P., Mendoza, N., VVickramasinghe, D., and Kirchhofer, D. (2002). Unusual proteolvtic activation of pro-25hepatocyte grovvth factor by plasma kallikrein and coagulation factor XIa. J Biol Chem 277,47804-47809.

Pelicci, G., Giordano, S., Zhen, Z., Salcini, A. E., Lanfrancone, L., Bardelli, A., Panayotou, G., VVaterfield, M. D., Ponzetto, C, Pelicci, P. G., and et al. (1995). The motogenic and mitogenic responses to HGF are amplified by the Shc adaptor protein. Oncogene 10,1631-1638.

Plotnikov, A. N., Schlessinger, }., Hubbard, S. R., and Mohammadi, M. (1999). Structural basis for FGF receptor dimerization and activation. Cell 98, 641-650.

Ponzetto, C, Bardelli, A., Zhen, Z., Maina, F., dalla Zonca, P., Giordano, S., Graziani, A„ Panayotou, G., and Comoglio, P. M. (1994). A multifunctional docking site mediates signaling and transformation by the hepatocvte grovvth factor/scatter factor receptor family. Cell 77, 261-271.

Ponzetto, C, Zhen, Z., Audero, E., Maina, F., Bardelli, A., Basile, M. L., Giordano, S., Narsimhan, R., and Comoglio, P. (1996). Specific uncoupling of GRB2 from the Met receptor. Differential effects on transformation and morility. J Biol Chem 271,14119-14123.

Robertson, S. C, Tynan, J. A., and Donoghue, D. J. (2000). RTK mutations and human syndromeswhen good receptors turn bad. Trends Genet 16,265-271.

Royal, I., and Park, M. (1995). Hepatocyte grovvth factor-45induced scatter of Madin-Darby canine kidney cells requires phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem 270, 27780-27787.

Schmidt, C, Bladt, F., Goedecke, S., Brinkmaim, V., Zschiesche, W., Sharpe, M., Gherardi, E., and Birchmeier, C. (1995). Scatter factor/hepatocyte grovvth factor is essential for liver development. Nature 373, 699-702.

Schmidt, L., Duh, F. M., Chen, F., Kishida, T., Glenn, G., Choyke, P., Scherer, S. W., Zhuang, Z., Lubensky, I., Dean, M., et al. (1997). Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nat Genet 16, 68-73.

Schmidt, L., Junker, K., Nakaigavva, N., Kinjerski, T., VVeirich, G., Miller, M., Lubensky, I., Neumann, H. P., Brauch, H., Decker, ]., etal. (1999). Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene 18,2343-2350

Suzuki, K, Hayashi, N., Yamada, Y., Yoshihara, H., Miyamoto, Y„ Ito, Y., Ito, T., Katayama, K., Sasaki, Y., Ito, A., and et al. (1994). Expression of the c-met protooncogene in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 20,1231-1236.

Tamagnone, L., Artigiani, S., Chen, H., He, Z., Ming, G. I., Song, H., Chedotal, A., VVinberg, M. L., Goodman, C. S., Poo, M., et al. (1999). Plexins are a large family of receptors fortransmembrane, secreted, and GPI-anchored semaphorins in vertebrates. Cell 99, 71-80.

Tempest, P. R., Stratton, M. R., and Cooper, C. S. (1988). Structure of the met protein and variation of met protein kinase activity among human tumour cell lines. Br J Cancer 58, 3-7.

Trusolino, L., Bertotti, A., and Comoglio, P. M. (2001). A signaling adapter function for alpha6beta4 integrin in the control of HGF-dependent invasive grovvth. Cell 107, 643-654.

Uehara, Y., Minovva, O., Mori, C, Shiota, K., Kuno, J., Noda, T., and Kitamura, N. (1995). Placental defect and embrvonic lethalitv in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature 373, 702-705.

Van Vactor, D. V., and Lorenz, L. J. (1999). Neural development: The semantics of axon guidance. Curr Biol 9, R201-204.

VVeidner, K. M., Di Cesare, S., Sachs, M., Brinkmann, V., Behrens, J., and Birchmeier, W. (1996). Interaction between Gabl and the c-Met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphogenesis. Nature 384,173-176.

VViesmann, C, Fuh, G., Christinger, H. W., Eigenbrot, C, VVells, J. A., and de Vos, A. M. (1997). Crystal structure at 1.7 A resolution of VEGF in complex vvith domain 2 of the Flt-1 receptor. Cell 91, 695-704.

VVmrai¥vC,UltscHMrLBass,S. H,arddeVos,AM(l Qys?stnxtrBcfr)erveg[aw<h?torincomplex vvith the ligand-binding domain oftheTrkA receptor. Nature 401,184-188.

Claims

1. Humanizovana forma anti-c-met antitela glodara sadrži: (a) najmanje jednu HVR sekvencu odabranu iz grupe koju čine: (i) HVR-L1 sadrži sekvencu A1-A17, gde A1-A17 predstavlja KSSQSLLYTSSQKNYLA, (ii) HVR-L2 sadrži sekvencu B1-B7, gde B1-B7 predstavlja VVASTRES, (iii) HVR-L3 sadrži sekvencu C1-C9, gde C1-C9 predstavlja QQYYAYPWT, (iv) HVR-40H1 sadrži sekvencu D1-D10, gde D1-D10 predstavlja GYTFTSYWLH, and (v) HVR-H2 sadrži sekvencu E1-E18, gde E1-E18 predstavlja GMIDPSNSOTRFNPNFKD; i (b) varianta HVR-H3 sadrži sekvencu TYRSYVTPLDY, SYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, SYSSY-VTPLDY, TYSSYVTSLDY ili TYSSYVTALDY gde je monovalentni afinitet pomenutog antitela za humani c-met veći nego monovalentni afinitet antitela glodara koje sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca prikazanu kao SEQ ID NO:9 i varijabilnu sekvencu teškog lanca prikazanu kao SEQ ID NO: 10 i ovde pomenuto antitelo inhibira c-met-zavisnu ćelijsku proliferaciju bolje od referentnog antitela koje sadrži himerično anti-c-met antitelo koje sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca i teškog lanca prikazanu kao SEQ ID NO.509 i 10 kako sledi,

2. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde je najmanje deo okvir sekvence humana konsenzus okvir sekvenca. Antitelo iz patentnog zahteva 1, sadrži varijantu HVR-55L

3 koja sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 72.

4. Antitelo iz patentnog zahteva 1, sadrži varijantu HVR-H2 koja sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO:98.

5. Antitelo iz patentnog zahteva 1 sadrži HVR-L1 koji ima sekvencu od SEQ ID NO:l.

6. Antitelo iz patentnog zahteva 1 sadrži HVR-L3 koji ima sekvencu od SEQ ID NO:3.

7. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde varijanta HVR-H3 sadrži sekvencu TYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY ili TYSSYVTALDY.

8. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde je monovalentni afinitet antitela za humani c-met najmanje 3-ostruko veći od monovalentnog afiniteta antitela glodara sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca i teškog lanca prikazanog kao SEQ ID NO: 9 i 10 na SI. 7.

9. Humanizovano antitelo iz patentnog zahteva 1, gde je antitelo glodara produkovano pomoću hibridoma ćelijske linije čuvane kao American Type Culture Collection Accession Number ATCC sa oznakom HB-11895 (hybridoma 5D5.11.6).

10. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde je afinitet za vezivanje izražen kao Kd vrednost.

11. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1, 8 ili 9, gde je afinitet za vezivanje meren pomoću Biacore ili radioimunoeseja.

12. Antitelo iz patentnog zahteva 1 sadrži humanuksubgTupu 1 konsenzus okvir sekvence.

13. Antitelo iz patentnog zahteva 1 sadrži teški lanac humane subgrupe III konsenzus okvir sekvence.

14. Antitelo iz patentnog zahteva 13 gde okvir sekvenca sadrži supstituciju na poziciji 71, 73 i/ili 78.

15. Antitelo iz patentnog zahteva 14 gde je pomenuta supstitucija R71A, N73T i/ili N78A.

16. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde humanizovano antitelo inhibira vezivanje humanog faktora rasta hepatocita za njegov receptor bolje nego referentno antitelo koje podrazumeva himerično anti-c-met antitelo koje sadrži variabilnu sekvencu lakog lanca i teškog lanca prikazanu kao SEQ ID NO: 9 i 10 kako sledi.

17. Antitelo iz patentnog zahteva 16, gde antitelo inhibira vezivanje sa vrednosti IC50 koja je manja od polovine one koju ima himerično antitelo.

18. Antitelo iz patentnog zahteva 17, gde je IC50 određen preko opsega koncentracija antitela od oko 0.01 nM do oko 1000 nM.

19. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde humanizovano antitelo inhibira aktivaciju receptora humanog faktora rasta hepatocita (HGF) bolje nego referentno antitelo koje podrazumeva himerično anti-c-met antitelo koje sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca i teškog lanca prikazanu kao SEQ ID NO: 9 i 10 kako sledi.

20. Antitelo iz patentnog zahteva 19, gde antitelo inhibira aktivaciju receptora sa vrednosti IC50 koja je manja od polovine one koju ima himerično antitelo.

21. Antitelo iz patentnog zahteva 20, gde je IC50 određen preko opsega koncentracija antitela od oko 0.1 nM do oko 100 nM.

22. Antitelo iz patentnog zahteva 1, gde humanizovano antitelo inhibira proliferaciju ćelija sa vrednosti IC50 koja je manja od polovine one koju ima himerično antitelo.

23. Antitelo iz patentnog zahteva 22, gde je IC50 određen preko opsega koncentracija antitela od oko 0.01 nM đo oko 100 nM.

24. Antitelo iz bilo kog predhodnog patentnog zahteva, gde su oba, humanizovano antitelo i himerično antitelo monovalentna.

25. Antitelo iz predhodnih patentnih zahteva, gde oba, humanizovano antitelo i himerično antitelo sadrže pojedinačni Fab region vezan za Fc region.

26. Antitelo iz patentnog zahteva 1 sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži HVR1-HC, HVR2-HC i HVR3-HC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 191-193 kako sledi.

27. Antitelo iz patentnog zahteva 26, gde varijabilni domen sadrži FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC i R4-HC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 187-190 kako sledi.

28. Antitelo iz patentnog zahteva 26 ili 27, gde antitelo sadrži CH1 i/ili Fc prikazan kao SEQ ID NO: 194 i 195 kako sledi.

29. Antitelo iz patentnog zahteva 1 sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži HVR1-LC, HVR2-LC i HVR3-LC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 183-185 kako sledi.

30. Antitelo iz patentnog zahteva 29, gde varijabilni domen sadrži FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC i FR4-LC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 179-182 kako sledi.

31. Antitelo iz patentnog zahteva 29 ili 30, gde antitelo sadrži CL1 sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 186.

32. Antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca iz bilo kog od patentnih zahteva 26 do 28 i varijabilni domen lakog lanca iz bilo kog od patentnih zahteva 29 do 31.

33. Antitelo iz patentnog zahteva 32 sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži HVR1-HC, HVR2-HC i HVR3-HC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 191-193 kako sledi, FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC i FR4-HC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 187-190 kako sledi, i CH1 i Fc prikazan kao SEQ ID NO: 194 i 195 kako sledi, i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži HVR1-LC, HVR2-LC i HVR3-LC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 183-185 kako sledi, FR1-25LC, FR2-LC, FR3-LC i FR4-LC sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 179-182 kako sledi, i CL1 sekvenca prikazana kao SEQ ID NO: 186.

34. Antitelo iz patentnog zahteva 32 ili 33, gde je antitelo monovalentno i sadrži Fc region.

35. Antitelo iz patentnog zahteva 34, gde Fc region sadrži prvi i drugi polipeptid, gde svaki prvi i drugi polipeptid sadrži jednu ili više mutacija u odnosu na nekultivisani tip humanog Fc.

36. Antitelo iz patentnog zahteva 35, gde prvi polipeptid sadrži Fc sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 195 i drugi polipeptid sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 196.

37. Antitelo iz bilo kog predhodnog patentnog zahteva za korišćenje u metodi tretmana.

38. Antitelo iz bilo kog predhodnog patentnog zahteva za korišćenje u metodi tretmana karcinoma.

39. Antitelo iz patentnog zahteva 38, gde karcinom predstavlja karcinom pluća, karcinom mozga, karcinom bubrega, karcinom želuca, kolorektalni karcinom i/ili karcinom pankreasa.

40. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 36 za korišćenje u metodi tretmana proliferativnih poremećaja.

41 Korišćenje antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 36 u preparatima medikamenata za tretman karcinoma.

42. Korišćenje iz patentnog zahteva 41, gde karcinom predstavlja karcinom pluća, karcinom mozga, karcinom bubrega, karcinom želuca, kolorektalni karcinom i/ili karcinom pankreasa.

43. Korišćenje antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 36 u preparatima medikamenata za tretman proliferativnih poremećaja.

44. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-36.

45. Ćelija domaćin sadrži nuklensku kiselinu iz patentnog zahteva 44.

46. Preparat koji sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-36.

47. Preparat iz patentnog zahteva 46, gde preparat sadrži nosač.