ES2347015T3

ES2347015T3 - 3,5-di(aril o heteroaril)isoxazoles y 1,2,4-oxadiazoles como agonistas del receptor s1p1, agentes inmunosupresores y anti-inflamatorios.

Info

Publication number: ES2347015T3
Application number: ES07703028T
Authority: ES
Inventors: Rainer Albert; Frederic Zecri
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2010-10-22
Anticipated expiration: 2027-01-25
Also published as: CN101374821A; EP2233473A1; PL1981858T3; US20090137636A1; EP1981858B1; JP2009524611A; WO2007085451A3; WO2007085451A2; CA2637081A1; KR20080091161A; ATE471313T1; PT1981858E; DE602007007186D1; RU2008134534A; EP1981858A2; US7799812B2; GB0601744D0; PL1981858T4; BRPI0707285A2; AU2007209533A1

Abstract

Un compuesto de fórmula I **(Ver fórmula)** en donde X es -N= o =CH-; R1 es bifenililo, 4-fenoxi-fenilo o 4-(fenil-C1-4alcoxi)-fenilo, en donde en cada caso al menos uno de los grupos fenilo está monosustituido con un halo-C1-4alquilo; R2 es C1-4alquilo sustituido opcionalmente con halógeno, OH, NH2, C1-4alcoxi o C1-4alquilcarboniloxi; amino; OH; C1-4alcoxi; NH-OH; carboxi; sulfamoílo; carbamoílo; o HN-CO-C1-4alquilo; o R2 es R3-R4-COOH o R3-R4-CONH2 en donde R3 es SO2-NH, SO2-N(C1-4alquilo), CO-NH, CON(C1-4alquilo), CH2-O, NH-CO, o N(C1-4alquilo)CO; y R4 es C1-6alquileno interrumpido opcionalmente por O, S o C=CH2 o fenileno o C3-6cicloalquileno; y el anillo A puede ser fenilo o piridilo, estando cada uno sustituido además opcionalmente con halógeno, C1-4alquilo, haloC1-4alquilo, C1-4alcoxi, haloC1-4-alcoxi o nitrilo; o R2 es hidrógeno con la condición de que el anillo A es 3-piridilo; o una sal del mismo.

Description

3,5-di(aril o heteroaril)isoxazoles y 1,2,4-oxadiazoles como agonistas del receptor S1P1, agentes inmunosupresores y anti-inflamatorios.

La presente invención se refiere a compuestos policíclicos, procesos para su producción, su uso como productos farmacéuticos y a composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos.

Más particularmente, la presente invención proporciona en un primer aspecto un compuesto de fórmula I

1

en donde

X es -N= o =CH-;

R_{1} es bifenililo, 4-fenoxi-fenilo o 4-(fenil-C_{1-4}alcoxi)-fenilo, en donde en cada caso al menos uno de los grupos fenilo está monosustituido con un halo-C_{1-4}alquilo;

R_{2} es C_{1-4}alquilo sustituido opcionalmente con halógeno, OH, NH_{2}, C_{1-4}alcoxi o C_{1-4}alquilcarboniloxi; amino; OH; C_{1-4}alcoxi; NH-OH; carboxi; sulfamoílo; carbamoílo; o HN-CO-C_{1-4}alquilo; o

R_{2} es R_{3}-R_{4}-COOH o R_{3}-R_{4}-CONH_{2} en donde R_{3} es SO_{2}-NH, SO_{2}-N(C_{1-4}alquilo), CO-NH, CON(C_{1-4}alquilo), CH_{2}-O, NH-CO, o N(C_{1-4}alquilo)CO; y R_{4} es C_{1-6}alquileno interrumpido opcionalmente por O, S o C=CH_{2} o fenileno o C_{3-6}cicloalquileno; y

el anillo A puede ser fenilo o piridilo, estando cada uno sustituido además opcionalmente con halógeno, C_{1-4}alquilo, haloC_{1-4}alquilo, C_{1-4}alcoxi, haloC_{1-4}-alcoxi o nitrilo; o

R_{2} es hidrógeno con la condición de que el anillo A es 3-piridilo;

o una sal del mismo.

El halógeno puede ser flúor, cloro o bromo, preferiblemente flúor o cloro; alquilo o alcoxi como grupo o presente en un grupo puede ser lineal o ramificado. C_{1-6}alquileno puede ser lineal o ramificado.

HaloC_{1-8}alquilo o haloC_{1-8}alcoxi como grupo o resto presente en un grupo puede ser C_{1-8}alquilo o C_{1-8}alcoxi sustituido con 1 a 5 halógenos, v.g. CF_{3} o CF_{3}-CH_{2}-O-. C_{1-8}alquil-haloC_{1-8}alcoxi puede ser haloC_{1-8}alcoxi sustituido ulteriormente con C_{1-4}alquilo, v.g. en posición 1. Lo mismo puede aplicarse a los otros grupos.

Cuando R_{4} es fenileno o C_{3-6}cicloalquileno, el mismo puede ser 1,4-fenileno o C_{3-6}cicloalquileno, v.g. ciclohexileno.

El anillo A puede estar ulteriormente sustituido, v.g. con halógeno, C_{1-4}alquilo, haloC_{1-4}alquilo, C_{1-4}alcoxi,
haloC_{1-4}alcoxi o nitrilo, preferiblemente con halógeno, C_{1-4}alquilo, haloC_{1-4}alquilo, C_{1-4}alcoxi, o haloC_{1-4}alcoxi, más preferiblemente con halógeno, C_{1-4}alquilo, haloC_{1-4}alquilo, o C_{1-4}alcoxi, y especialmente con halógeno, C_{1-4}alquilo o C_{1-4}alcoxi. Cuando el anillo A es piridilo, el mismo es preferiblemente 3-piridilo.

Los significados siguientes se prefieren de modo independiente, colectivamente o en cualquier combinación o sub-combinación:

i): R_{1} es bifenililo, 4-fenoxi-fenilo o 4-(fenil-C_{1-4}alcoxi)-fenilo en donde al menos uno de los grupos fenilo lleva un haloC_{1-4}alquilo, v.g. CF_{3};

iv): R_{2} es sulfamoílo;

v): R_{2} es R_{3}-R_{4}-COOH; o R_{3}-R_{4}-CONH_{2}; más preferiblemente R_{3}-R_{4}-CONH_{2};

vi): R_{3} es SO_{2}-NH; SO_{2}-N(C_{1-4}alquilo); NH-CO; o N(C_{1-4}alquilo)CO;

vii): R_{4} es C_{1-6}alquileno, interrumpido opcionalmente por O;

viii): R_{2} es NH_{2};

ix): el anillo A es fenilo insustituido (es decir sin ningún sustituyente adicional además de R_{2});

x): el anillo A es piridilo sustituido o insustituido (es decir, no contiene sustituyente adicional alguno aparte de R_{2}).

Los compuestos de fórmula I pueden existir en forma libre o en forma de sal, v.g. sales de adición con v.g. ácidos orgánicos o inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido acético, o sales que pueden obtenerse cuando R_{2} es o comprende COOH, con una base, v.g. sales alcalinas tales como sales de sodio o potasio, o sales de amonio sustituidas o insustituidas.

Se apreciará que los compuestos de fórmula I pueden existir en la forma de isómeros ópticos, racematos, o diastereoisómeros. Por ejemplo, R_{4} puede comprender un átomo de carbono asimétrico cuando R_{4} es alquileno ramificado. Debe entenderse que la presente invención abarca todos los enantiómeros y confórmeros y sus mezclas. Consideraciones similares son aplicables en relación con los materiales de partida que exhiben átomos de carbono asimétricos como se ha mencionado arriba.

La presente invención incluye también un proceso para la producción de un compuesto de fórmula I, proceso que comprende

a): para la producción de un compuesto de fórmula I en donde X es -N= y R_{2} es como se ha definido arriba, hacer reaccionar un compuesto de fórmula II

2

\quad: en donde el anillo A y R_{2} son como se define arriba, o un derivado funcional de los mismos, v.g. un éster, cloruro de acilo o anhídrido activado

\quad: con un compuesto de fórmula III

3

\quad: en donde R_{1} es como se define arriba o un derivado funcional del mismo; o

b): para la producción de un compuesto de fórmula I en donde X es CH y R_{2} es NH_{2}, hacer reaccionar un compuesto de fórmula VI

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\quad: en donde R_{1} es como se define arriba, con un compuesto de fórmula VII

5

\quad: en donde el anillo A es como se define arriba y R'_{2} es NH_{2}; o

c): convertir un compuesto de fórmula I en otro compuesto de fórmula I, y recuperar el compuesto resultante de fórmula I en forma libre o en forma de una sal, y, en caso requerido, convertir el compuesto de fórmula I obtenido en forma libre en la forma de sal deseada o viceversa.

Los pasos de proceso a) a c) pueden realizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, o como se describe más adelante en los ejemplos.

Ejemplos de conversión de un compuesto de fórmula I en otro compuesto de fórmula pueden incluir, v.g.

i): para la producción de un compuesto de fórmula I en donde R_{1} es bifenililo, 4-fenoxi-fenilo o 4-(fenil-C_{1-4}alcoxi)-fenilo en donde al menos uno de los grupos fenilo está monosustituido, convertir un compuesto de fórmula I en donde R_{1} es distinto de bifenililo, 4-fenoxi-fenilo o 4-fenil-C_{1-4}alcoxi)-fenilo en donde al menos uno de los grupos fenilo está monosustituido, en un compuesto de fórmula I en donde R_{1} es bifenililo, 4-fenoxi-fenilo o 4-(fenil-C_{1-4}alcoxi)-fenilo en donde al menos uno de los grupos fenilo está monosustituido.

ii): Para la producción de un compuesto de fórmula I en donde R_{2} es R_{3}-R_{4}-COOH, hidrolizar un compuesto de fórmula I en donde el COOH presente en R_{2} se encuentra en forma de un éster fisiológicamente hidrolizable, v.g. un éster metílico.

iii): Para la producción de un compuesto de fórmula I en donde X es -N= y R_{2} es R_{3}-R_{4}-COOH en donde R_{3} es NH-CO o N(C_{1-4}alquilo)CO y R_{4} es como se define arriba, hacer reaccionar un compuesto de fórmula I

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\quad: en donde R_{1}, X, R'_{2} y el anillo A son como se define arriba,

\quad: con un agente de acilación.

iv): Para la producción de un compuesto de fórmula I en donde R_{2} es R_{3}-R_{4}-CONH_{2}, hacer reaccionar un compuesto de fórmula I en donde R_{2} es R_{3}-R_{4}-COOH con un agente de amidación.

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El compuesto de fórmula III utilizado como material de partida en el paso de proceso a) puede obtenerse por reacción de un compuesto de fórmula VIII

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en donde R_{1} es como se define arriba, con hidroxilamina.

El compuesto de fórmula VI utilizado como material de partida en el paso de proceso b) puede producirse por reacción de un compuesto de fórmula IX

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en donde R_{1} es como se define arriba, con hidroxilamina.

Un compuesto de fórmula I en donde X es -N= y R_{2} es NH_{2} puede producirse también por reacción de un compuesto de fórmula III con un compuesto de fórmula II'

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en donde el anillo A es como se define arriba, o un derivado funcional del mismo, v.g. un éster, cloruro de acilo o anhídrido activado. El grupo nitro presente en el compuesto resultante puede reducirse luego, v.g. por hidrogenación catalítica.

En la medida en que la producción de los materiales de partida no se describe particularmente, los compuestos son o bien conocidos, o se pueden preparar análogamente por métodos conocidos en la técnica o como se describe más adelante en esta memoria.

Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la invención.

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Ejemplo 1 4-[3-(2-Trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]-fenilamina

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a) 2-Trifluorometil-bifenil-4-carbaldehído-oxima

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Paso a) A una solución de 4-ciano-2-trifluoroanilina (1 eq.) en benceno se añade en atmósfera inerte nitrito de n-pentilo (1 eq.) a 50ºC. Después de una hora de reflujo se añade un segundo equivalente de nitrito de n-pentilo. Después de 2 horas más de reflujo, la mezcla de reacción se enfría a la temperatura ambiente y se concentra a presión reducida. El residuo oscuro se purifica en gel de sílice utilizando c-hexano \rightarrow c-hexano/acetato de etilo 9/1 como fase móvil (aceite anaranjado claro).

Paso b) El compuesto del paso a) (1 eq.) se disuelve en ácido fórmico (75%) y se añade níquel Raney (4 eq.). Después de 3 horas a 80ºC, la mezcla de reacción se filtra a través de Hyflo Super Cel® y el catalizador/Hyflo se lava 2 veces con etanol (con precaución \rightarrow inflamable). La solución resultante se concentra (rendimiento 61%; mezcla de éster y ácido) y se utiliza para el paso c) sin purificación ulterior alguna.

Paso c) El compuesto del paso b) e hidrocloruro de hidroxilamina (1,25 eq.) se disuelven en etanol y se añade K_{2}CO_{3} (1,1 eq.). Después de 18 horas a la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentra y, después de adición de agua, se extrae con acetato de etilo. La purificación se realiza, después de secado sobre Na_{2}SO_{4}, sobre gel de sílice utilizando c-hexano/acetato de etilo 9/1 como fase móvil, obteniéndose 2-trifluorometil-bifenil-4-carbaldehído-oxima. ESI-MS (ESI^{+}): 266 (M+1H)^{+}

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b) 4-[3-(2-Trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]fenilamina

A una solución de 2-trifluorometil-bifenil-4-carbaldehído-oxima (1 eq.) en CH_{2}Cl_{2} se añade una solución acuosa al 10% de NaOCl a 0ºC. Después de ello se añade una solución de 4-etinilanilina (1,1 eq.) y a continuación se agita la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluye con CH_{2}Cl_{2} y se extrae 3 veces con agua. Las capas orgánicas reunidas se secan sobre Na_{2}SO_{4}, se filtran y se concentran. La purificación se realiza, después de secado sobre Na_{2}SO_{4}, sobre gel de sílice utilizando c-hexano/acetato de etilo 9/1 \rightarrow 7/3 como fase móvil.

ESI-MS (ESI^{+}): 381 (M+1H)^{+}.

Ejemplo 2 Ácido N-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]-fenil}-succinámico

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El compuesto (1 eq.) del Ejemplo 1 se disuelve en CH_{2}Cl_{2} y se añaden 4-metilmorfolina (2 eq.) y anhídrido succínico (2 eq.). Después de 16 horas a la temperatura ambiente, se obtiene el compuesto del título puro después de filtración (sólido blanco).

ESI-MS (ESI^{+}): 481 (M+1H)^{+}.

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Ejemplo 3 N-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]-fenil}-succinamida

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El compuesto del Ejemplo 2 se disuelve en DMF y se añaden subsiguientemente hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC.HCl; 1,5 eq.), hidroxibenzotriazol (HOBt; 1,3 eq.), NH_{4}OH al 25% en agua (1,2 eq.) y diisopropiletilamina (1,5 eq.). Después de 16 horas a la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentra y se purifica sobre gel de sílice (CH_{2}Cl_{2}/metanol 95/5 \rightarrow CH_{2}Cl_{2}/metanol/ácido acético_{50%} 90/10/0,125 como fase móvil) dando como resultado el compuesto del título puro.

ESI-MS (ESI^{+}): 480 (M\cdot+1H)^{+}.

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Ejemplo 4 Ácido 3-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-benceno-sulfonilamino}-propiónico

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a) N-Hidroxi-2-trifluorometil-bifenil-4-carboxamidina

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Paso a) A una solución de 4-ciano-2-trifluoroanilina (1 eq.) en benceno se añade en atmósfera inerte nitrito de n-pentilo (1 eq.) a 50ºC. Después de una hora de calentamiento a reflujo se añade un segundo equivalente de nitrito de n-pentilo. Después de 2 horas más de reflujo, la mezcla de reacción se enfría a la temperatura ambiente y se concentra a presión reducida. El residuo oscuro se purifica en gel de sílice utilizando c-hexano \rightarrow c-hexano/acetato de etilo 9/1 como fase móvil (aceite anaranjado pálido).

Paso b) El compuesto del paso a) se disuelve en THF y se añade hidroxilamina (50% en agua; 10 eq.) a -10ºC. Después de 16 horas a la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluye con agua y se extrae con acetato de etilo. Después de secado de la fase orgánica con Na_{2}SO_{4}, se realiza la purificación sobre gel de sílice con c-hexano/acetato de etilo 75/25 como fase móvil.

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b) Ácido 4-(2-metoxicarbonil-etilsulfamoil)-benzoico

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El producto se obtiene por reacción de ácido 4-clorosulfonil-benzoico (1 eq.) con H-\betaAla-OMe x HCl en CH_{2}Cl_{2} utilizando diisopropiletilamina (2 eq.) como base. Después de 30 minutos a la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se extrae con agua y la capa orgánica se seca sobre Na_{2}SO_{4}. La eliminación del disolvente proporciona el compuesto del título.

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c) Éster metílico del ácido 3-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-bencenosulfonilamino}-propiónico

Se disuelve ácido 4-(2-metoxicarbonil-etilsulfamoil)-benzoico (1 eq.) en DMF y se añaden EDC.HCl (1,3 eq.) y HOBt (1,1 eq.). Después de 30 minutos a la temperatura ambiente se añade N-hidroxi-2-trifluorometil-bifenil-4-carboxamidina (1 eq.) y la mezcla de reacción de mantiene a 90ºC durante 16 horas. Después de eliminación del disolvente, se disuelve el residuo en acetato de etilo y se extrae con solución saturada de NaHCO_{3}. Se obtiene el compuesto del título después de secado de la fase orgánica sobre Na_{2}SO_{4} en gel de sílice utilizando c-hexano/acetato de etilo/CH_{2}Cl_{2} 8/2/1 como fase móvil.

ESI-MS (ESI^{-}): 530 (M-1H)^{-}

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d) Ácido 3-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-benceno-sulfonilamino}-propiónico

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Se disuelve LiOH (2 eq.) en metanol/agua (1/1) y se añade el éster (1 eq.). Después de 4 horas a 50ºC se elimina el metanol a presión reducida, se ajusta el pH a \sim3 con HCl 1N y la mezcla de reacción se extrae tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas reunidas se secan sobre Na_{2}SO_{4}, se filtran, se concentran y se obtiene el compuesto del título como un polvo blanco después de eliminación del disolvente.

ESI-MS (ESI^{-}): 516 (M+1H)^{-}.

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Ejemplo 5 4-[3-(2-Trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-fenilamina

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a) 5-(4-Nitro-fenil)-3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol

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Se obtiene el producto como un polvo blanco utilizando ácido 4-nitrobenzoico en lugar de ácido 4-(2-metoxicarbonil-etilsulfamoil)-benzoico en el procedimiento del Ejemplo 1 - paso c).

ESI-MS (ESI^{+}): 412 (M+1H)^{+}

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b) El compuesto del paso a) se disuelve en metanol/acetato de etilo 1/1 y se hidrogena a la temperatura ambiente a presión normal durante 16 horas con Pd/C_{10%} como catalizador. Después de filtración a través de Hyflo Super Cel® la mezcla de reacción se concentra y se purifica sobre gel de sílice (CH_{2}Cl_{2} \rightarrow CH_{2}Cl_{2}/metanol 95/5 como fase móvil) obteniéndose el compuesto del título.

ESI-MS (ESI^{+}): 382 (M+1H)^{+}.

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Ejemplo 6 2,6-Dimetoxi-3-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-piridina

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Se disuelve ácido 2,6-dimetoxi-nicotínico (1 eq.) en dioxano y se añaden EDC.HCl (1,3 eq.) y HOBt (1,1 eq.). Después de 30 minutos a la temperatura ambiente, se añade N-hidroxi-2-trifluorometil-bifenil-4-carboxamidina (1 eq.) y la mezcla de reacción se mantiene a 90º Celsius durante 16 horas. Después de eliminación del disolvente, el residuo se disuelve en acetato de etilo y se extrae con solución saturada de NaHCO_{3}. Se obtiene el compuesto del título después del secado de la fase orgánica sobre Na_{2}SO_{4} en gel de sílice utilizando c-hexano/acetato de etilo \rightarrow c-hexano/acetato de etilo 100 \rightarrow 70/30 como fase móvil.

ESI-MS (ESI^{-}): 426 (M-1H)^{-}

Siguiendo el procedimiento descrito en los ejemplos que anteceden y utilizando los materiales de partida apropiados, se obtienen los compuestos de fórmula I

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en donde X, R_{1}, R_{2} y el anillo A son como se define en la Tabla 1 siguiente.

TABLA 1

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Los compuestos de fórmula I en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, exhiben propiedades farmacológicas valiosas, v.g. como agonistas del receptor S1P1, v.g. como se indica en tests in vitro e in vivo, y por consiguiente están indicados para terapia.

A.In vitro

Los compuestos de fórmula I tienen afinidad de fijación a receptores S1P humanos individuales como se determina en los ensayos siguientes:

A.In vitro: Ensayo de activación de GPCR que mide la fijación de GTP [\gamma-^{35}S] a membranas preparadas a partir de células CHO que expresan receptores humanos EDG

Ensayo de fijación de S1P_{1} (EDG-1)GTP[\gamma-^{35}S]: Se preparan membranas homogeneizadas a partir de clones de células CHO que expresan establemente un marcador humano EDG-1 N-terminal c-myc. Las células se dejan crecer en suspensión en dos frascos rodantes de 850 cm^{2} durante 3 ó 4 días antes de la cosecha. Las células se centrifugan, se lavan una sola vez con PBS fría, y se suspenden de nuevo en \leq20 ml de Tampón A (HEPES 20 mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, cóctel exento de EDTA completo de inhibidores de proteasas [1 tableta/25 ml]). La suspensión de células se homogeneíza en hielo, utilizando un homogeneizador Polytron a 30.000 rpm en 3 intervalos de 15 segundos cada uno. El homogeneizado se centrifuga primeramente a 2000 rpm en una centrífuga de sobremesa de baja velocidad durante 10 minutos. El sobrenadante, después de pasar a través de un filtro de células, se centrifuga luego nuevamente a 50.000 x g durante 25 minutos a 4ºC. El sedimento se resuspende en tampón B (15% glicerol, HEPES 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, cóctel completo exento de EDTA de inhibidores de proteasas [1 tableta/10 ml]). La concentración de proteínas de la preparación se determina utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas BCA (Pierce) utilizando BSA como estándar. Las membranas se dividen en partes alícuotas y se mantiene congeladas a -80ºC.

Se preparan soluciones de los compuestos de test comprendidas entre 10 mM y 0,01 mM en DMSO. Se diluye S1P en solución de BSA al 4% como controles positivos. La cantidad deseada de preparación de membranas se diluye con tampón de ensayo enfriado en hielo (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, 0,1% de BSA exenta de ácidos grasos, GDP 5 \muM) y se agita bien enérgicamente. Se distribuyen 2 \mul o menos del compuesto en cada pocillo de una placa de ensayos de poliestireno de 96 pocillos con fondo redondo, seguido por adición de 100 \mul de membranas diluidas (3-10 \mug/pocillo) y se mantienen en hielo hasta la adición de GTP\gammaS caliente. Se diluye [^{35}S]-GTP\gammaS en relación 1:1000 (v/v) con tampón de ensayo frío y se añaden a cada pocillo 100 \mul. La reacción se lleva a cabo a la temperatura ambiente durante 90 minutos antes de cosechar las membranas sobre una placa de filtración Perkin-Elmer Unifilter® GF/B-96 utilizando un Cosechador Packard Filtermate. Después de varios lavados con tampón de lavado (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM), y un lavado con etanol de 95%, se seca el filtro en un horno a 37ºC durante 30 minutos. Se añade MicroScint-20 y la placa se sella para recuento de centelleo con TopCount. Se obtienen los valores CE_{50} por ajuste de las curvas de fijación GTP [\gamma-^{35}S] (datos brutos) con la herramienta de ajuste de curvas dosis-respuesta de GraphPad Prism. Se utilizan 6 ó 12 concentraciones diferentes para generar una curva concentración-respuesta (utilizando tres puntos de datos para cada concentración).

Se realizan ensayos de fijación de S1P-3, -4, -5 y -6 GTP [\gamma-^{35}S] de manera comparable al ensayo de fijación de S1P1 GTP[\gamma-^{35}S] utilizando membranas de células CHO que expresan de manera estable receptores c-terminales marcados con c-myc o sin marcar. Para cada preparación de membrana, se realizan primeramente experimentos de titulación con control de S1P para determinar la cantidad óptima de membranas a añadir por cada pocillo de ensayo.

Los compuestos de fórmula I se testan de acuerdo con el ensayo anterior y se observa que exhiben selectividad para el receptor S1P1. Por ejemplo, los Compuestos de los Ejemplos 4 y 13 tienen un valor CE_{50} < 1 \muM en el ensayo anterior y son v.g. al menos 20 veces selectivos para S1P1 comparado con S1P3, y v.g. al menos 20 veces selectivos para S1P1 comparado con S1P5.

B.In vitro: Ensayo FLIPR de flujo de calcio

Los compuestos de la invención se testan respecto a actividad agonista sobre S1P1, S1P3, S1P5 y S1P6 con un ensayo FLIPR de flujo de calcio. Resumidamente, células CHO que expresan un receptor S1P se mantienen en medio F-12K (ATCC), que contiene 5% de FBS, con 500 \mug/ml de G418. Antes del ensayo, las células se extienden en placas 384 negras con fondo claro a una densidad de 10.000 células/pocillo/25 \mul en el medio de F-12K que contiene 1% de FBS. El segundo día, las células se lavan tres veces (25 \mul cada vez) con tampón de lavado. Se añaden a cada pocillo aproximadamente 25 \mul de tinte y se incuban durante 1 hora a 37ºC y 5% de CO_{2}. Las células se lavan luego 4 veces con tampón de lavado (25 \mul cada vez). Se ensaya el flujo de calcio después de adición de 25 \mul de solución SEW2871 (publicado por Rosen et al., utilizado como referencia) a cada pocillo de células. Se realiza el mismo ensayo con células que expresan cada uno de los diferentes receptores S1P. La titulación en el ensayo FLIPR de flujo de calcio se registra a lo largo de un intervalo de 3 minutos, y se cuantifica como respuesta porcentual de altura máxima de pico con relación a la activación de S1P-1. Los compuestos de la invención son activos en este ensayo a una concentración comprendida entre 10^{-12} y 3 x 10^{-5} nM.

C.In vivo: Ensayos de cribado para medida del empobrecimiento en linfocitos de la sangre

Medida de linfocitos circulantes: Los compuestos a testar se disuelven en DMSO/PEG200 y se diluyen ulteriormente con agua desionizada. Se administra a ratas (variedad Lewis, hembras, de 6-12 semanas) 1 mg/kg del compuesto a testar en 4 ml/kg vehículo (máximo 2% DMSO/máximo 2% PEG200/agua) por aplicación oral. Se incluyen DMSO/PEG 200/agua y FTY720 (0,3 mg/kg) como controles negativo y positivo, respectivamente.

Se recoge sangre de la vena sublingual 2, 6, 24 y 48 horas después de la administración con anestesia breve de isoflurano. Se someten muestras de sangre entera a análisis hematológico. Se determinan los recuentos de linfocitos periféricos utilizando un analizador automático. Las subpoblaciones de linfocitos de sangre periférica se tiñen por anticuerpos específicos conjugados con fluorocromo y se analizan utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (Facscalibur). Se utilizan dos ratas para evaluar la actividad de empobrecimiento de linfocitos de cada compuesto cribado. El resultado es el valor DE_{50}, que se define como la dosis eficaz requerida para exhibir 50% de empobrecimiento de linfocitos en la sangre. Los compuestos de fórmula I se testan de acuerdo con el ensayo anterior y tienen una DE_{50} menor que 10 mg/kg.

Los compuestos de fórmula I son, por consiguiente, útiles en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o trastornos mediados por interacciones de los linfocitos, v.g. en trasplantes, tales como rechazo agudo o crónico de alo- o xenoinjertos de células, tejidos u órganos o función de injerto retardada, enfermedad de rechazo inverso, enfermedades autoinmunes, v.g., artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes tipo I o II y los trastornos asociados con ella, vasculitis, anemia perniciosa, síndrome de Sjoegren, uveítis, psoriasis, oftalmopatía de Graves, alopecia areata y otras, enfermedades alérgicas, v.g. asma alérgica, dermatitis atópica, rinitis/conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica de contacto, enfermedades inflamatorias opcionalmente con reacciones aberrantes subyacentes, v.g. enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, asma intrínseca, lesión inflamatoria pulmonar, lesión inflamatoria hepática, lesión inflamatoria glomerular, ateroesclerosis, osteoartritis, dermatitis irritante de contacto y otras dermatitis eccematosas, dermatitis seborreica, manifestaciones cutáneas de trastornos mediados inmunológicamente, enfermedad inflamatoria oftálmica, queratoconjuntivitis, miocarditis o hepatitis, lesión isquemia/reperfusión, v.g. infarto de miocardio, derrame cerebral, isquemia intestinal, insuficiencia renal o choque hemorrágico, choque traumático, cáncer, v.g. cáncer de mama, linfomas de células T o leucemias de células T, enfermedades infecciosas, v.g. choque tóxico (v.g. inducido por superantígenos), choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria de los adultos o infecciones virales, v.g. SIDA, hepatitis viral, infección crónica bacteriana, o demencia senil. Ejemplos de trasplantes de células, tejidos u órganos sólidos incluyen v.g. islotes pancreáticos, células madre, médula ósea, tejido corneal, tejido neuronal, corazón, pulmón, corazón-pulmón combinados, riñón, hígado, intestino, páncreas, tráquea o esófago. Para los usos anteriores, la dosis requerida variará por supuesto dependiendo del modo de administración, la afección particular a tratar y el efecto deseado.

En general, se ha indicado que se obtienen resultados satisfactorios sistémicamente a dosis diarias de aproximadamente 0,03 a 5,0 mg/kg de peso corporal. Una dosis diaria indicada en los mamíferos de mayor tamaño, v.g. los humanos, está comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg, administrada convenientemente, por ejemplo, en dosis divididas de hasta 4 veces al día o en forma retardada. Formas adecuadas de dosis unitaria para administración oral comprenden desde aprox. 0,1 a 50 mg del ingrediente activo.

Los compuestos de fórmula I pueden administrarse por cualquier ruta conveniente, en particular por vía enteral, v.g. por vía oral, v.g. en forma de tabletas o cápsulas, o por vía parenteral, v.g. en forma de soluciones o suspensiones inyectables, tópicamente, v.g. en forma de lociones, geles, ungüentos o cremas, o en una forma nasal o de supositorio. Composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula I en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable en asociación con al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable pueden fabricarse de manera convencional por mezcla con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos de fórmula I pueden administrarse en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, v.g. como se ha indicado arriba. Dichas sales se pueden preparar de manera convencional y exhiben el mismo orden de actividad que los compuestos libres.

De acuerdo con lo que antecede, la presente invención proporciona adicionalmente:

1.1: Un método para prevención o tratamiento de trastornos o enfermedades mediados por linfocitos, v.g. tal como se ha indicado arriba, en un individuo que precisa dicho tratamiento, método que comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

1.2: Un método para prevención o tratamiento del rechazo agudo o crónico de trasplantes o enfermedades inflamatorias o autoinmunes mediadas por células T, v.g. como se ha indicado arriba, en un individuo que precisa dicho tratamiento, método que comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2.: Un compuesto de fórmula I, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable para uso como producto farmacéutico, v.g. en cualquiera de los métodos indicados anteriormente bajo 1.1 ó 1.2.

3.: Una composición farmacéutica, v.g. para uso en cualquiera de los métodos como en los puntos 1.1 ó 1.2 anteriores, que comprende un compuesto de fórmula I en forma libre o forma de sal farmacéuticamente aceptable en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

4.: Un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en la preparación de una composición farmacéutica para uso en cualquiera de los métodos como en los puntos 1.1 ó 1.2 anteriores.

Los compuestos de fórmula I pueden administrarse como el único ingrediente activo o en asociación con, v.g. como adyuvantes para otros fármacos, v.g. agentes inmunosupresores o inmunomoduladores u otros agentes anti-inflamatorios, v.g. para el tratamiento o la prevención del rechazo agudo o crónico de alo- o xenoinjertos o trastornos inflamatorios o autoinmunes, o un agente quimioterapéutico, v.g. un agente anti-proliferativo de células malignas. Por ejemplo, los compuestos de fórmula I pueden utilizarse en combinación con un inhibidor de calcineurina, v.g. ciclosporina A o FK506; un inhibidor de mTOR, v.g. rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573, AP23464, AP23675, AP23841, TAFA-93, biolimus-7 o biolimus-9; una ascomicina que tiene propiedades inmunosupresoras, v.g. ABT-281, ASM981, etc.; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida; mizorribina; ácido micofenólico o sal del mismo; micofenolato-mofetil; 15-desoxiespergualina o un homólogo, análogo o derivado inmunosupresor del mismo; un inhibidor de PKC, v.g. como se describe en WO 02/38561 o WO 03/82859, v.g. el compuesto del Ejemplo 56 ó 70; un inhibidor de la quinasa JAK3, v.g. N-bencil-3,4-dihidroxi-bencilideno-cianoacetamida-\alpha-ciano-(3,4-dihidroxi)-]N-bencilcinamamida (Tyrphostin AG490), prodigiosina 25-C (PNU156804), [4-(4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina] (WHI-P131), [4-(3'-bromo-4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina] (WHI-P154), [4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina] (WHI-P97), KRX-211, 3-{(3R,4R)-4-metil-3-[metil-(7H-pirrol[2,3-d]pirimidin-4-il)-amino]-piperidin-1-il}-3-oxo-propionitrilo, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, v.g. monocitrato (denominado también CP-690.550), o un compuesto como se describe en WO 04/052359 o WO 05/066156; anticuerpos inmunosupresores monoclonales, v.g. anticuerpos monoclonales para receptores de leucocitos, v.g. MHC-CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, v.g. una molécula recombinante de fijación que tiene al menos una porción del dominio extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma, v.g. una porción al menos extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma unido a una secuencia de proteína distinta de CTLA4, v.g. CTLA41g (por ejemplo designado ATCC 68629) o un mutante de la misma, v.g. LEA29Y; inhibidores de moléculas de adhesión, v.g. antagonistas de LFA-1, antagonistas de ICAM-1 o -3, antagonistas de VCAM-4 o antagonistas VLA-4; o un agente quimioterapéutico, v.g. paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, doxorrubicina o 5-fluorouracilo; o un agente anti-infeccioso.

En el caso en que los compuestos de fórmula II se administran en asociación con otra terapia inmunosupresora/inmunomoduladora, quimioterapéutica anti-inflamatoria o anti-infecciosa, las dosis del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio, quimioterapéutico o antiinfeccioso co-administrado variarán por supuesto dependiendo del tipo de co-fármaco empleado, v.g. si se trata de un esteroide o de un inhibidor de calcineurina, del fármaco específico empleado, de la afección que se esté tratando, etcétera. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona en otro aspecto adicional:

5.: Un método como se define arriba que comprende laco-administración, v.g. concomitantemente o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente eficaz y no tóxica de un compuesto de fórmula I y al menos una segunda sustancia fármaco, v.g. un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio o quimioterapéutico, v.g. como se ha indicado arriba.

6.: Una combinación farmacéutica, v.g. un kit, que comprende a) un primer agente que es un compuesto de fórmula I como se describe en esta memoria, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y b) al menos un co-agente, v.g. un inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio, quimioterapéutico o agente anti-infeccioso. El kit puede comprender instrucciones para su administración.

Debe entenderse que los términos "co-administración" o "administración combinada" o análogos que se utilizan en esta memoria, abarcan la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un paciente individual, y tienen por objeto incluir regímenes de tratamiento en los cuales los agentes no se administran necesariamente por la misma ruta de administración o al mismo tiempo.

El término "combinación farmacéutica" como se utiliza en esta memoria, significa un producto que es resultado de la mezcla o combinación de más de un ingrediente activo e incluye combinaciones tanto fijas como no fijas de los ingredientes activos. El término "combinación fija" significa que los ingredientes activos, v.g. un compuesto de fórmula I y un co-agente, se administran ambos a un paciente simultáneamente en la forma de una entidad o dosificación singular. El término "combinación no fija" significa que los ingredientes activos, v.g. compuesto de fórmula I y un co-agente, se administran ambos a un paciente como entidades separadas sea simultánea, concurrente o secuencialmente sin ningún límite específico de tiempo, en donde cada administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Esto último es aplicable también a una terapia de cóctel, v.g. la administración de tres o más ingredientes activos.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por la Solicitante se da únicamente para comodidad del lector. La misma no forma parte del documento de patente europea. Aun cuando se ha puesto gran cuidado en la recopilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y la EPO no asume responsabilidad alguna a este respecto.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 0238561 A: \bullet WO 04052359 A

\bullet WO 0382859 A: \bullet WO 05066156 A

Claims

1. Un compuesto de fórmula I

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23

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en donde

X es -N= o =CH-;

R_{2} es hidrógeno con la condición de que el anillo A es 3-piridilo;

o una sal del mismo.

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2. Un compuesto de la fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado del grupo constituido por

4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]-fenilamina;

ácido N-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]-fenil}-succinámico;

N-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-isoxazol-5-il]-fenil}-succinamida;

ácido 3-{4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-benceno-sulfonilamino}propiónico;

4-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-fenilamina;

2,6-dimetoxi-3-[3-(2-trifluorometil-bifenil-4-il)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-piridina;

y un compuesto de la fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de los compuestos de la tabla siguiente:

24

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3. Proceso para la preparación de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, proceso que comprende

(i): para la producción de un compuesto de fórmula I en donde X es -N= y R_{2} es como se ha definido arriba, hacer reaccionar un compuesto de fórmula II

25

\quad: con un compuesto de fórmula III

26

(ii): para la producción de un compuesto de fórmula I en donde X es CH y R_{2} es NH_{2}, hacer reaccionar un compuesto de fórmula VI

27

28

\quad: en donde el anillo A es como se define arriba y R'_{2} es NH_{2}; o

(iii): convertir un compuesto de fórmula I en otro compuesto de fórmula I,

\quad: y recuperar el compuesto resultante de fórmula I en forma libre o en forma de una sal, y, en caso requerido, convertir el compuesto de fórmula I obtenido en forma libre en la forma de sal deseada o viceversa.

4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en forma libre o forma de sal farmacéuticamente aceptable en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

5. Una combinación farmacéutica, v.g. un kit, que comprende a) un primer agente que es un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y b) al menos un co-agente, v.g., un agente inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio, quimioterapéutico o anti-infeccioso.

6. Uso de una composición o compuesto farmacéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o trastornos mediados por interacciones de linfocitos, v.g. en enfermedades de trasplante y/o enfermedades autoinmunes.