ES2355819T3 - Composiciones inmunoestimuladoras y métodos para estimular una respuesta inmune. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunoestimuladora que comprende: una porción de modificador de la respuesta inmunitaria emparejada con una porción antigénica, de forma que se limita la difusión independiente de la porción de modificador de la respuesta inmunitaria con respecto a la porción antigénica, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria es un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** en la que:R1 es un grupo conector; R2 se selecciona del grupo que consiste en: -hidrógeno; -alquilo; -alquenilo; -arilo; -arilo sustituido; -heteroarilo; -heteroarilo sustituido; -alquil-O-alquilo; -alquil-S-alquilo; -alquil-O-arilo; -alquil-S-arilo; -alquil-O-alquenilo; -alquil-S-alquenilo; y -alquilo o alquenilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: -OH; -halógeno; -N(R5)2; -CO-N(R5)2; -CS-N(R5)2; -SO2-N(R5)2; -NR5-CO-alquilo C1-10; -NR5-CS-alquilo C1-10; -NR5-SO2-alquilo C1-10; -CO-alquilo C1-10; -CO-O-alquilo C1-10; -N3; -arilo; -arilo sustituido; -heteroarilo; -heteroarilo sustituido; -heterociclilo; -heterociclilo sustituido; -CO-arilo; -CO-(arilo sustituido); -CO-heteroarilo; y -CO-(heteroarilo sustituido); R3 y R4 son cada uno independientemente: -hidrógeno; -halógeno; -alquilo; -alquenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; y -N(R5)2; o cuando se consideran en conjunto, R3 y R4 forman un grupo arilo o heteroarilo fusionado que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: -halógeno; -alquilo; -alquenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; y -N(R5)2; o cuando se consideran en conjunto, R3 y R4 forman un anillo saturado de 5 a 7 miembros fusionado que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, y que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: -halógeno; -alquilo; -alquenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; y -N(R5)2; y cada R5 es independientemente hidrógeno o alquilo C1-10.

Description

Composiciones inmunoestimuladoras y métodos para estimular una respuesta inmune.

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/403.846, presentada el 15 de agosto de 2002.

Los modificadores de la respuesta inmunitaria ("IRMs") incluyen compuestos que poseen una actividad inmunomoduladora potente que incluye, pero sin limitación, la actividad antiviral y antitumoral. Ciertos IRMs modulan la producción y la secreción de citocinas. Por ejemplo, ciertos compuestos IRM inducen la producción y la secreción de citocinas tales como, p.ej., interferones de tipo I, TNF-\alpha, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, MIP-1, y/o MCP-1. Como un ejemplo adicional, ciertos compuestos IRM pueden inhibir la producción y la secreción de ciertas citocinas TH-2, tales como IL-4 e IL-5. Además, se cree que ciertos compuestos IRM inhiben IL-1 y TNF (pat. de EE.UU. nº
6.518.265).

Ciertos IRMs son moléculas orgánicas pequeñas (p.ej., con un peso molecular menor de alrededor de 1000 Daltons, en ciertos casos menor de alrededor de 500 Daltons, a diferencia de las proteínas o péptidos biológicos grandes) tales como los descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nºs 4.689.338; 4.929.624; 4.988.815; 5.037.986; 5.175.296; 5.238.944; 5.266.575; 5.268.376; 5.346.905; 5.352.784; 5.367.076; 5.389.640; 5.395.937; 5.446.153; 5.482.936;
5.693.811; 5.741.908; 5.756.747; 5.939.090; 6.039.969; 6.083.505; 6.110.929; 6.194.425; 6.245.776; 6.331.539;
6.376.669; 6.451.810; 6.525.064; 6.545.016; 6.545.017; 6.558.951; y 6.573.273; la patente europea 0 394 026; la publicación de patente nº 2002/0055517; y las publicaciones de patentes internacionales nºs WO 01/74343; WO 02/46188; WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; WO 02/46749; WO
02/102377; WO 03/020889; WO 03/043572 y WO 03/045391.

Los ejemplos adicionales de IRMs de moléculas pequeñas incluyen ciertos derivados de purina (tales como los descritos en las patentes de EE.UU. nºs 6.376.501, y 6.028.076), ciertos derivados de amida de imidazoquinolina (tales como los descritos en la patente de EE.UU. nº 6.069.149), ciertos derivados de bencimidazol (tales como los descritos en la patente de EE.UU. nº 6.387.938), y ciertos derivados de una 4-aminopirimidina fusionada a un anillo heterocíclico de cinco miembros que contiene nitrógeno (tales como los derivados de adenina descritos en las patentes de EE.UU. nºs 6.376.501; 6.028.076 y 6.329.381; y en el documento WO 02/08595).

Otros IRMs incluyen moléculas biológicas grandes tales como las secuencias oligonucleotídicas. Ciertas secuencias oligonucleotídicas de IRM contienen dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nºs 6.194.388; 6.207.646; 6.239.116; 6.339.068; y 6.406.705. Ciertos oligonucleótidos que contienen CpG pueden incluir motivos estructurales inmunomoduladores sintéticos tales como los descritos, por ejemplo, en las pat. de EE.UU. nºs 6.426.334 y 6.476.000. Otras secuencias nucleotídicas de IRM carecen de CpG y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente Internacional nº WO 00/75304.

Ciertos IRMs pueden funcionar como agonistas de receptores similares a Toll (TLR). Ciertos IRMs de moléculas pequeñas pueden actuar a través de uno o más de los TLRs 2, 4, 6, 7, y 8. CpG puede actuar a través de TLR
9.

Mediante la estimulación de ciertos aspectos del sistema inmunitario, así como mediante la inhibición de otros aspectos (véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. nºs 6.039.969 y 6.200.592), se pueden usar los IRMs para tratar muchas enfermedades. Por ejemplo, el IRM de molécula pequeña imiquimod es útil para el tratamiento de las verrugas perianales y genitales externas provocadas por el papilomavirus humano [véase, p.ej., Tomai et al, Antiviral Research 28(3): 253-64 (1995)]. Los ejemplos de otras enfermedades que se pueden tratar mediante el uso de IRMs incluyen, pero sin limitación, carcinoma de células basales, eccema, trombocitemia esencial, hepatitis B, esclerosis múltiple, enfermedades neoplásicas, psoriasis, artritis reumatoide, herpes simple tipo I, y herpes simple tipo
II.

Los compuestos IRM pueden modular también la inmunidad humoral estimulando la producción de anticuerpos por las células B. Además, se ha demostrado que diversos IRMs son útiles como adyuvantes en vacunas (véanse, p.ej., las pat. de EE.UU. nºs 6.083.505 y 6.406.705).

El documento WO 00/40228 describe ciertos compuestos de IRM para el tratamiento de afecciones en y por debajo de las superficies mucosas.

Se ha descubierto que los IRMs, en especial los IRMs de moléculas pequeñas y los agonistas de TLR 2, 4, 6, 7, y 8, son sorprendentemente eficaces en la estimulación de una respuesta inmunitaria cuando se emparejan químicamente o físicamente con un antígeno para formar una composición inmunoestimuladora. El efecto inmunoestimulador de una composición particular puede ser mayor que el efecto inmunoestimulador del mismo antígeno y el mismo IRM o un IRM comparable al de la composición, pero administrados en una forma sin empare-
jar.

La presente invención proporciona una composición inmunoestimuladora que incluye una porción de modificador de la respuesta inmunitaria (IRM) emparejada con una porción antigénica, de forma que se limita la difusión independiente de la porción de modificador de la respuesta inmunitaria con respecto a la porción antigénica, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria es un compuesto de fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

R_{1} es un grupo conector;

R_{2} se selecciona del grupo que consiste en:

-hidrógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-alquil-O-alquilo;

-alquil-S-alquilo;

-alquil-O-arilo;

-alquil-S-arilo;

-alquil-O-alquenilo;

-alquil-S-alquenilo; y

-alquilo o alquenilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-OH;

-halógeno;

-N(R_{5})_{2};

-CO-N(R_{5})_{2};

-CS-N(R_{5})_{2};

-SO_{2}-N(R_{5})_{2};

-NR_{5}-CO-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-CS-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-SO_{2}-alquilo C_{1-10};

-CO-alquilo C_{1-10};

-CO-O-alquilo C_{1-10};

-N_{3};

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-heterociclilo;

-heterociclilo sustituido;

-CO-arilo;

-CO-(arilo sustituido);

-CO-heteroarilo; y

-CO-(heteroarilo sustituido);

R_{3} y R_{4} son cada uno independientemente:

-hidrógeno;

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un grupo arilo o heteroarilo fusionado que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un anillo saturado de 5 a 7 miembros fusionado que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, y que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2}; y

cada R_{5} es independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-10}.

En ciertas realizaciones, la porción de IRM puede ser, o puede derivar de, un agonista del receptor 2 similar a Toll, receptor 4 similar a Toll, receptor 6 similar a Toll, receptor 7 similar a Toll, o receptor 8 similar a Toll. En otras realizaciones, la porción de IRM puede incluir, o puede derivar de, una amina de imidazoquinolina; una amina de tetrahidroimidazoquinolina; una amina de imidazopiridina; una amina de imidazopiridina sustituida con aril-éter; una amina de imidazoquinolina con puente 1,2; una amina de cicloalquilimidazopiridina fusionada en 6,7; una amina de imidazonaftiridina; una amina de tetrahidroimidazonaftiridina; una amina de oxazoloquinolina; una amina de tiazoloquinolina; una amina de oxazolopiridina; una amina de tiazolopiridina; una amina de oxazolonaftiridina; o una amina de tiazolonaftiridina. Aún en otras realizaciones, la porción de IRM puede incluir, o puede derivar de, un resto orgánico que tiene un peso molecular menor de alrededor de 1000 Daltons. La porción antigénica puede incluir una secuencia de aminoácidos, una secuencia de nucleótidos, un lipopolisacárido, un prión, una bacteria, un virus, o un hongo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un conjugado inmunoestimulador de fórmula:

2

en la que:

R_{1} es un grupo conector;

R_{2} se selecciona del grupo que consiste en:

-hidrógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-alquil-O-alquilo;

-alquil-S-alquilo;

-alquil-O-arilo;

-alquil-S-arilo;

-alquil-O-alquenilo;

-alquil-S-alquenilo; y

-alquilo o alquenilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-OH;

-halógeno;

-N(R_{5})_{2};

-CO-N(R_{5})_{2};

-CS-N(R_{5})_{2};

-SO_{2}-N(R_{5})_{2};

-NR_{5}-CO-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-CS-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-SO_{2}-alquilo C_{1-10};

-CO-alquilo C_{1-10};

-CO-O-alquilo C_{1-10};

-N_{3};

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-heterociclilo;

-heterociclilo sustituido;

-CO-arilo;

-CO-(arilo sustituido);

-CO-heteroarilo; y

-CO-(heteroarilo sustituido);

R_{3} y R_{4} son cada uno independientemente:

-hidrógeno;

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un grupo arilo o heteroarilo fusionado que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un anillo saturado de 5 a 7 miembros fusionado que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, y que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

cada R_{5} es independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-10}; y

n es 1 a 10; o

una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la estimulación de las células T de un paciente. El método incluye proporcionar una composición inmunoestimuladora según la reivindicación 1; permitir que la composición inmunoestimuladora se una a las células presentadoras de antígenos, por lo que se activan las células presentadoras de antígenos; y permitir que las células presentadoras de antígenos activadas estimulen las células T del paciente. Las células T del paciente se pueden estimular in vivo o in vitro.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la estimulación de las células productoras de anticuerpos in vitro. El método incluye proporcionar una composición inmunoestimuladora según la reivindicación 1; y permitir que la composición inmunoestimuladora se una a las células productoras de anticuerpos.

Otras diversas características y ventajas de la presente invención deberían ser fácilmente evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada, ejemplos, reivindicaciones y dibujos adjuntos. En varios lugares a lo largo de la memoria descriptiva, se proporciona orientación por medio de listas de ejemplos. En cada caso, la lista enumerada sirve solamente como un grupo representativo, y no se debería interpretar como una lista exclusiva.

La Figura 1 muestra el porcentaje de células T CD8^{+} activadas específicas de ovalbúmina generadas por ratones inmunizados con ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 2 muestra el porcentaje de células T CD8^{+} activadas específicas de ovalbúmina generadas por ratones inmunizados de forma subcutánea con un conjugado IRM-ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 3 muestra el porcentaje de células T CD8^{+} activadas específicas de ovalbúmina generadas por ratones inmunizados de forma intraperitoneal con un conjugado IRM-ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 4 muestra la producción de interferón-\gamma inducida por ratones inmunizados con ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 5 muestra la producción de interferón-\gamma inducida por ratones inmunizados de forma subcutánea con un conjugado IRM-ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 6 muestra la producción de interferón-\gamma inducida por ratones inmunizados de forma intraperitoneal con un conjugado IRM-ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 7 muestra el incremento de la respuesta inmunitaria específica del antígeno después de proporcionar una inmunización secundaria con un conjugado IRM-ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 6.

La Figura 8 muestra la reducción del tamaño tumoral después de la inmunización con un conjugado específico del tumor IRM-antígeno, como se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 9 muestra la expansión de células T CD8^{+} activadas específicas de antígeno tumoral en el bazo tras la inmunización con un conjugado IRM-antígeno tumoral, como se describe en el Ejemplo 8.

La Figura 10 muestra la expansión de células T CD8^{+} activadas específicas de antígeno tumoral en el tumor tras la inmunización con un conjugado IRM-antígeno tumoral, como se describe en el Ejemplo 8.

La Figura 11 muestra el porcentaje de células presentadoras de antígenos que están presentando K^{b}/SIINFEKL tras la inmunización con ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 12 muestra el porcentaje de células presentadoras de antígenos que están presentando K^{b}/SIINFEKL tras la inmunización con ovalbúmina más IRM sin conjugar, como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 13 muestra el porcentaje de células presentadoras de antígenos que están presentando K^{b}/SIINFEKL tras la inmunización con conjugado IRM-ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 14 muestra las tasas de supervivencia de ratones inmunizados con ovalbúmina o un conjugado IRM-ovalbúmina tras la exposición a células tumorales que expresan ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 15 muestra la expansión de células T CD8^{+} específicas del antígeno tras la inmunización con ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 16 muestra la expansión de células T CD8^{+} específicas del antígeno en un sujeto tras la inmunización con una suspensión coloidal de IRM y ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 17 muestra la expansión de células T CD8^{+} específicas del antígeno en un segundo sujeto tras la inmunización con una suspensión coloidal de IRM y ovalbúmina, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 18 muestra la expansión de células T CD8^{+} específicas del antígeno como resultado de la inmunización con conjugados IRM-antígeno mediante el uso de dos IRMs diferentes.

La Figura 19 muestra la expansión en proporción de células T CD8^{+} sobre la inmunización con ovalbúmina sola de ratones inmunizados con diversas con diversas composiciones inmunoestimuladoras.

La presente invención proporciona composiciones inmunoestimuladoras (CIEs), métodos para producir las composiciones inmunoestimuladoras, métodos para provocar una respuesta inmunitaria mediante el uso de las composiciones inmunoestimuladoras, y métodos para aumentar la actividad inmunoestimuladora de un IRM emparejando el IRM con otro componente inmunoestimulador (p.ej., un antígeno). Las CIEs se pueden diseñar para provocar una respuesta inmunitaria mediada por células, una respuesta inmunitaria humoral, o ambas.

Tal como se indicó anteriormente, se pueden usar muchos IRMs como adyuvantes de vacunas para incrementar la respuesta inmunitaria generada contra uno o más antígenos también presentados en la vacuna. Sorprendentemente, ciertas CIEs según la presente invención pueden proporcionar una respuesta inmunitaria aún mayor que una vacuna que contiene el mismo IRM o un IRM comparable y el mismo antígeno, pero en una forma sin emparejar. En un caso, una CIE proporcionó una respuesta inmunitaria alrededor de cinco veces mayor que la respuesta inmunitaria generada por una vacuna que incluyó el mismo antígeno y un IRM comparable.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "emparejado" y las variaciones del mismo se refieren a componentes asociados en una cierta forma química o física de manera que los componentes no son dispersables libremente entre sí. Por ejemplo, dos componentes pueden estar unidos de forma covalente entre sí de manera que los dos componentes son incapaces de dispersarse o difundirse por separado. El emparejamiento se puede llevar a cabo también, por ejemplo, mediante unión por afinidad no covalente, unión iónica, afinidad hidrófila o hidrófoba, o atrapamiento físico. El emparejamiento se distingue específicamente de una mezcla simple de antígeno y adyuvante en una vacuna convencional. En una mezcla simple, los componentes pueden tener libertad para dispersarse independientemente dentro del medio de la vacuna. Tal como se usa en la presente memoria, "emparejado", y las variaciones del mismo, da a entender que los componentes emparejados mantienen una asociación química o física tras la
inmunización.

La porción de modificador de la respuesta inmunitaria puede ser, o puede derivar de, cualquier IRM adecuado. Los IRMs adecuados incluyen moléculas orgánicas pequeñas, es decir, moléculas que tienen un peso molecular menor de alrededor de 1000 Daltons, aunque en ciertas realizaciones el IRM puede tener un peso molecular menor de alrededor de 700 Daltons, y en ciertos casos el IRM puede tener un peso molecular de alrededor de 500 Daltons a alrededor de 700 Daltons. Los IRMs adecuados también incluyen los agonistas de uno o más de los TLRs 2, 4, 6, 7, 8 y 9. En ciertas realizaciones, los IRMs adecuados incluyen, pero sin limitación, los compuestos de IRM de moléculas pequeñas descritos anteriormente y los derivados de los mismos. Los IRMs de moléculas pequeñas adecuados, que tienen una 2-aminopiridina fusionada a un anillo heterocíclico de cinco miembros que contiene nitrógeno, incluyen, pero sin limitación, aminas de imidazoquinolina que incluyen, pero sin limitación, las aminas de imidazoquinolina sustituidas con amida, aminas de imidazoquinolina sustituidas con sulfonamida, aminas de imidazoquinolina sustituidas con urea, aminas de imidazoquinolina sustituidas con aril-éter, aminas de imidazoquinolina sustituidas con éter heterocíclico, aminas de imidazoquinolina sustituidas con amido-éter, aminas de imidazoquinolina sustituidas con sulfonamido-éter, éteres de imidazoquinolina sustituidos con urea, y aminas de imidazoquinolina sustituidas con tioéter; aminas de tetrahidroimidazoquinolina que incluyen, pero sin limitación, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con amida, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con sulfonamida, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con urea, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con aril-éter, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con éter heterocíclico, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con amido-éter, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con sulfonamido-éter, éteres de tetrahidroimidazoquinolina sustituidos con urea, y aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con tioéter; aminas de imidazopiridina que incluyen, pero sin limitación, aminas de imidazopiridina sustituidas con amida, aminas de imidazopiridina sustituidas con sulfonamida, aminas de imidazopiridina sustituidas con urea; aminas de imidazopiridina sustituidas con aril-éter, aminas de imidazopiridina sustituidas con éter heterocíclico, aminas de imidazopiridina sustituidas con amido-éter, aminas de imidazopiridina sustituidas con sulfonamido-éter, éteres de imidazopiridina sustituidos con urea, y aminas de imidazopiridina sustituidas con tio-éter; aminas de imidazoquinolina con puente en 1,2; aminas de cicloalquilimidazopiridina fusionadas en 6,7; aminas de imidazonaftiridina; aminas de tetrahidroimidazonaftiridina; aminas de oxazoloquinolina; aminas de tiazoloquinolina; aminas de oxazolopiridina; aminas de tiazolopiridina; aminas de oxazolonaftiridina; y aminas de tiazolonaftiridina.

Los IRMs de moléculas pequeñas adecuados adicionales incluyen ciertos derivados de purina, ciertos derivados de amida de imidazoquinolina, ciertos derivados de bencimidazol, y ciertos derivados de una 4-aminopirimidina fusionada a un anillo heterocíclico de cinco miembros que contiene nitrógeno (p.ej., derivados de adenina) descritos anteriormente.

Otros IRMs adecuados incluyen los CpGs y otras secuencias de nucleótidos IRM que carecen de CpG descritas anteriormente.

La porción antigénica puede incluir cualquier material que genere una respuesta inmunitaria mediada por células, una respuesta inmunitaria humoral, o ambas. Los materiales antigénicos adecuados incluyen, pero sin limitación, péptidos; polipéptidos; lípidos; glicolípidos; polisacáridos; carbohidratos; polinucleótidos; priones; bacterias, virus u hongos vivos o inactivados; e inmunógenos, toxinas o toxoides bacterianos, virales, fúngicos, protozoarios, derivados de tumores o derivados de organismos.

Las enfermedades para las que se pueden usar las composiciones inmunoestimuladoras de la presente invención como tratamiento incluyen, pero sin limitación:

(a) enfermedades virales, tales como verrugas genitales, verrugas comunes, verrugas plantares, hepatitis B, hepatitis C, virus herpes simple tipo I y tipo II, molluscum contagiosum, viruela, VIH, CMV, VZV, rinovirus, adenovirus, coronavirus, gripe, para-gripe;

(b) enfermedades bacterianas, tales como tuberculosis, y mycobacterium avium, lepra;

(c) otras enfermedades infecciosas, tales como enfermedades fúngicas, chlamydia, candida, aspergillus, meningitis criptocócica, pneumocystis carnii, cryptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis, infección por trypanosoma, leishmaniasis;

(d) enfermedades neoplásicas, tales como neoplasias intraepiteliales, displasia cervical, queratosis actínica, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pilosas, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinoma de células renales, leucemia mielógena, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de células T cutáneas, y otros cánceres;

(e) enfermedades mediadas por TH-2, atópicas, y autoinmunitarias, tales como dermatitis atópica o eccema, eosinofilia, asma, alergia, rinitis alérgica, lupus eritematoso sistémico, trombocitemia esencial, esclerosis múltiple, síndrome de Ommen, lupus discoide, alopecia areata, inhibición de la formación de queloides y otros tipos de cicatrización, y aumento de la cicatrización de heridas, que incluyen las heridas crónicas; y

(f) como adyuvante de vacunas para el uso junto con cualquier material que genere una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células, tal como inmunógenos virales y bacterianos vivos e inmunógenos, toxoides o toxinas virales, derivados de tumores, protozoarios, derivados de organismos, fúngicos y bacterianos inactivados, polisacáridos, proteínas, glicoproteínas, péptidos, vacunas celulares, vacunas de ADN, proteínas recombinantes, glicoproteínas, y péptidos, para el uso con relación a, p.ej., BCG, cólera, peste, fiebre tifoidea, hepatitis A, B, y C, gripe A y B, paragripe, polio, rabia, sarampión, paperas, rubeola, fiebre amarilla, tétano, difteria, haemophilus influenzae b, tuberculosis, vacunas meningocócicas y pneumocócicas, adenovirus, VIH, varicela, citomegalovirus, dengue, leucemia felina, peste aviar, HSV-1 y HSV-2, peste porcina, encefalitis japonesa, virus sincitial respiratorio, rotavirus, papilomavirus, y fiebre amarilla.

Las composiciones inmunoestimuladoras de la invención incluyen una cantidad eficaz de actividad biológica tanto de la porción de modificador de la respuesta inmunitaria como de la porción antigénica. Una cantidad eficaz de actividad biológica de la porción de modificador de la respuesta inmunitaria ("actividad IRM") incluye uno o más de lo siguiente: un incremento de la producción de citocinas por las células T, la activación de las células T específicas de un antígeno, y la activación de las células dendríticas. Una cantidad eficaz de actividad biológica de la porción antigénica ("actividad antigénica") incluye uno o más de lo siguiente: generación de anticuerpos específicos hacia el antígeno por las células B y generación de células presentadoras de antígenos que presentan el antígeno. Las composiciones inmunoestimuladoras de la presente invención se pueden combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable, uno o más excipientes, o cierta combinación de lo anterior para formar una composición farmacéutica.

Aunque la cantidad exacta de compuesto activo usada en una composición farmacéutica de la invención variará según factores conocidos para los expertos en la técnica, tales como la naturaleza física y química de la composición inmunoestimuladora, la naturaleza del vehículo, la naturaleza del sistema inmunitario del sujeto (p.ej., deprimido, comprometido, estimulado), y el régimen de dosificación deseado, se prevé que las composiciones farmacéuticas de la invención contendrán una porción de modificador de la respuesta inmunitaria suficiente para proporcionar una dosis de alrededor de 100 ng/kg a alrededor de 50 mg/kg, preferiblemente alrededor de 10 \mug/kg a alrededor de 5 mg/kg, de IRM al sujeto.

Se puede usar una diversidad de formas farmacéuticas, tales como comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones parenterales, jarabes, cremas, pomadas, formulaciones en aerosol, parches transdérmicos o parches transmucosos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en forma del agente terapéutico simple en un régimen de tratamiento, o la composición farmacéutica se puede administrar en combinación con otra composición farmacéutica o con otros agentes activos, que incluyen modificadores de la respuesta inmunitaria adicionales, antivirales, antibióticos, anticuerpos, proteínas, péptidos, oligonucleótidos, etc.

En ciertas realizaciones, la porción de modificador de la respuesta inmunitaria inmunoestimuladora puede estar acoplada covalentemente a la porción antigénica para formar un conjugado inmunoestimulador. Tal como se usa en la presente memoria, "acoplado covalentemente" se refiere al acoplamiento directo e indirecto de dos componentes exclusivamente por medio de enlaces covalentes. El acoplamiento covalente directo puede implicar la unión covalente directa entre un átomo de la porción de modificador de la respuesta inmunitaria y un átomo de la porción antigénica. De forma alternativa, el acoplamiento covalente se puede dar por medio de un grupo conector unido de forma covalente a la porción IRM, a la porción antigénica, o a ambas, que facilita el acoplamiento covalente de la porción IRM y la porción antigénica. El acoplamiento covalente indirecto puede incluir un tercer componente tal como, por ejemplo, un soporte sólido al cual se unen covalentemente por separado la porción de modificador de la respuesta inmunitaria y la porción antigénica. Además, "acoplado covalentemente" y "unido covalentemente" se usan de forma intercambiable.

Un conjugado inmunoestimulador puede incluir un resto modificador de la respuesta inmunitaria como la porción IRM y un resto que contiene antígeno como la porción antigénica. Cuando se sintetiza un conjugado inmunoestimulador, se puede seleccionar el resto modificador de la respuesta inmunitaria, el grupo conector, y el resto que contiene antígeno, de forma que el conjugado inmunoestimulador resultante posea una cantidad eficaz de actividad IRM y una cantidad eficaz de actividad antigénica.

El grupo conector puede ser cualquier grupo conector orgánico adecuado que permita que el resto que contiene antígeno se acople covalentemente al resto modificador de la respuesta inmunitaria a la vez que se conserva una cantidad eficaz de actividad IRM y de actividad antigénica. En ciertas realizaciones, el grupo conector se puede seleccionar para crear un espacio suficiente entre el núcleo activo del resto modificador de la respuesta inmunitaria y el resto que contiene antígeno, de forma que el resto que contiene antígeno no interfiera con la interacción biológicamente eficaz entre el núcleo activo y las células T que da como resultado la actividad IRM, tal como la producción de citocinas.

El grupo conector incluye un grupo reactivo capaz de reaccionar con el antígeno para formar un enlace covalente. Los grupos reactivos adecuados incluyen los discutidos en Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, Capítulo 2, "The Chemistry of Reactive Functional Groups", 137-166. Por ejemplo, el grupo conector puede reaccionar con una amina primaria (p.ej., un éster de N-hidroxisuccinimidilo o un éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo); puede reaccionar con un grupo sulfhidrilo (p.ej., una maleimida o un yodoacetilo), o puede ser un grupo fotorreactivo (p.ej. una azida de fenilo, que incluye 4-azidofenilo, 2-hidroxi-4-azidofenilo, 2-nitro-4-azidofenilo, y 2-nitro-3-azidofenilo).

Un grupo químicamente activo accesible para el acoplamiento covalente al grupo conector incluye los grupos que se pueden usar directamente para el acoplamiento covalente al grupo conector, o los grupos que se pueden modificar para que estén disponibles para el acoplamiento covalente al grupo conector. Por ejemplo, los grupos químicamente activos adecuados incluyen, pero sin limitación, las aminas primarias y los grupos sulfhidrilo. Debido a que ciertos restos que contienen antígeno, p.ej., proteínas y otros péptidos, pueden incluir una diversidad de grupos químicamente activos, ciertas CIEs según la presente invención pueden incluir una diversidad de restos IRM conjugados a un resto que contiene antígeno particular.

Métodos de Producción de Conjugados Inmunoestimuladores

Los conjugados inmunoestimuladores según la presente invención se pueden preparar en general haciendo reaccionar un modificador de la respuesta inmunitaria con un interconector, y después haciendo reaccionar el intermedio resultante con un antígeno. Se conocen muchos interconectores adecuados para la preparación de bioconjugados, y muchos están disponibles comercialmente. Véase, por ejemplo, Hermanson, G. (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press.

Los conjugados inmunoestimuladores según la presente invención se pueden preparar también, por ejemplo, según el método mostrado en el Esquema de Reacción I, en el que el resto que contiene antígeno se une al resto IRM por medio de R_{1}. En la etapa (1) del Esquema de Reacción I, se hace reaccionar un compuesto de Fórmula III con un interconector heterobifuncional de Fórmula IV para proporcionar un compuesto de Fórmula II. R_{A} y R_{B} contienen cada uno un grupo funcional que se selecciona para que reaccione con el otro. Por ejemplo, si R_{A} contiene una amina primaria, se puede seleccionar un interconector heterobifuncional en el que R_{B} contiene un grupo funcional reactivo con aminas tal como un éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo. R_{A} y R_{B} se pueden seleccionar de forma que reaccionen para proporcionar el grupo conector deseado en el conjugado.

Se conocen los métodos para la preparación de los compuestos de Fórmula III en los que R_{A} contiene un grupo funcional. Véanse, por ejemplo, las pat. de EE.UU. nºs 4.689.338; 4.929.624; 5.268.376; 5.389.640; 5.352.784; 5.494.916; 4.988.815; 5.367.076; 5.175.296; 5.395.937; 5.741.908; 5.693.811; 6.069.149; 6.194.425; y 6.331.539 y las publicaciones internacionales WO 00/76505; WO 00/76518; WO 02/46188, WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; y WO 02/46194.

Se conocen muchos interconectores heterobifuncionales, y muchos están disponibles comercialmente. Véase, por ejemplo, Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, Capítulo 5, "Heterobifunctional Cross-Linkers", 229-285. La reacción se puede llevar a cabo en general combinando una disolución del compuesto de Fórmula III en un disolvente adecuado tal como N,N-dimetilformamida con una disolución del interconector heterobifuncional de Fórmula IV en un disolvente adecuado tal como N,N-dimetilformamida. La reacción se puede llevar a cabo a temperatura ambiente. El producto de Fórmula II se puede aislar después mediante el uso de técnicas convencionales.

En la etapa (2) del Esquema de Reacción I, se hace reaccionar un compuesto de Fórmula II que contiene el grupo reactivo Z_{A} con el antígeno para proporcionar el conjugado inmunoestimulador de Fórmula I. La reacción se puede llevar a cabo en general combinando una disolución del compuesto de Fórmula II en un disolvente adecuado tal como sulfóxido de dimetilo con una disolución del antígeno en un tampón adecuado tal como PBS. La reacción se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o a una temperatura reducida (\sim4ºC). Si Z_{A} es un grupo fotorreactivo tal como una azida de fenilo, la mezcla de reacción se expondrá a luz UV de onda larga durante un período de tiempo adecuado para lograr la interconexión (p.ej., 10 - 20 minutos). El número medio de restos modificadores de la respuesta inmunitaria por resto de antígeno se puede controlar ajustando la cantidad de compuesto de Fórmula II usada en la reacción. El conjugado de respuesta inmunitaria de Fórmula I se puede aislar y purificar mediante el uso de técnicas convencionales.

Esquema de Reacción I

3

De forma alternativa, se puede sintetizar un compuesto de Fórmula II sin usar un interconector heterobifuncional. Mientras el compuesto de Fórmula II contenga el grupo reactivo Z_{A}, se puede hacer reaccionar con el antígeno mediante el uso del método de la etapa (2) anterior para proporcionar un conjugado inmunoestimulador.

Tal como se usa en la presente memoria, los términos "alquilo", "alquenilo" y el prefijo "alc-" incluyen grupos de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos, es decir, cicloalquilo y cicloalquenilo. A menos que se especifique de otra manera, estos grupos contienen de 1 a 20 átomos de carbono, y los grupos alquenilo contienen de 2 a 20 átomos de carbono. Los grupos preferidos tienen un total de hasta 10 átomos de carbono. Los grupos cíclicos pueden ser monocíclicos o policíclicos, y preferiblemente tienen de 3 a 10 átomos de carbono en el anillo. Los grupos cíclicos ejemplares incluyen ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopropilmetilo, y adamantilo.

El término "haloalquilo" incluye los grupos que están sustituidos con uno o más átomos de halógeno, lo que incluye los grupos perfluorados. Esto también es cierto para los grupos que incluyen el prefijo "halo-". Los ejemplos de grupos haloalquilo adecuados son clorometilo y trifluorometilo.

El término "arilo", tal como se usa en la presente memoria, incluye anillos aromáticos carbocíclicos o sistemas de anillos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, bifenilo, fluorenilo e indenilo. El término "heteroarilo" incluye anillos aromáticos o sistemas de anillos que contienen al menos un heteroátomo en el anillo (p.ej., O, S, N). Los grupos heteroarilo adecuados incluyen furilo, tienilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, isoindolilo, triazolilo, pirrolilo, tetrazolilo, imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, carbazolilo, benzoxazolilo, pirimidinilo, bencimidazolilo, quinoxalinilo, benzotiazolilo, naftiridinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, purinilo y quinazolinilo.

"Heterociclilo" incluye anillos no aromáticos o sistemas de anillos que contienen al menos un heteroátomo en el anillo (p.ej., O, S, N), e incluye todos los derivados completamente saturados y parcialmente insaturados de los grupos heteroarilo anteriormente mencionados. Los grupos heterocíclicos ejemplares incluyen pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, e imidazolidinilo.

Los grupos arilo, heteroarilo, y heterociclilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, metilendioxi, etilendioxi, alquiltio, haloalquilo, haloalcoxi, haloalquiltio, halógeno, nitro, hidroxi, mercapto, ciano, carboxi, formilo, arilo, ariloxi, ariltio, arilalcoxi, arilalquiltio, heteroarilo, heteroariloxi, heteroariltio, heteroarilalcoxi, heteroarilalquiltio, amino, alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, heterocicloalquilo, alquilcarbonilo, alquenilcarbonilo, alcoxicarbonilo, haloalquilcarbonilo, haloalcoxicarbonilo, alquiltiocarbonilo, arilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, ariltiocarbonilo, heteroariltiocarbonilo, alcanoiloxi, alcanoiltio, alcanoilamino, arilcarboniloxi, arilcarboniltio, alquilaminosulfonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, arildiazinilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, arilalquilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, alquenilcarbonilamino, arilcarbonilamino, arilalquilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, heteroarilalquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino, alquenilsulfonilamino, arilsulfonilamino, arilalquilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, heteroarilalquilsulfonilamino, alquilaminocarbonilamino, alquenilaminocarbonilamino, arilaminocarbonilamino, arilalquilaminocarbonilamino, heteroarilaminocarbonilamino, heteroarilalquilaminocarbonilamino y, en el caso de heterociclilo, oxo. Si otros grupos se describen como "sustituidos" u "opcionalmente sustituidos", esos grupos pueden estar sustituidos también con uno o más de los sustituyentes enumerados anteriormente.

Se prefieren en general ciertos sustituyentes. Por ejemplo, los grupos R_{2} preferidos incluyen hidrógeno, grupos alquilo que tienen 1 a 4 átomos de carbono (es decir, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, y ciclopropilmetilo), y grupos alcoxialquilo (p.ej., metoxietilo y etoximetilo). Preferiblemente, R_{3} y R_{4} son independientemente hidrógeno o metilo, o R_{3} y R_{4} se unen entre sí para formar un anillo de benceno, un anillo de piridina, un anillo saturado de 6 miembros o un anillo saturado de 6 miembros que contiene un átomo de nitrógeno. Uno o más de estos sustituyentes preferidos, si están presentes, pueden estar presentes en los compuestos de la invención en cualquier combinación.

En ciertas realizaciones, los conjugados inmunoestimuladores pueden incluir una estructura de soporte sólido a la cual están unidas tanto la porción antigénica como la porción IRM. En ciertas realizaciones, la porción IRM, la porción antigénica, o ambas pueden estar unidas covalentemente al soporte sólido mediante el uso de un grupo conector tal como los descritos anteriormente. El soporte sólido puede incluir, por ejemplo, esferas de agarosa o partículas de oro. El soporte sólido se puede usar después para co-administrar la porción IRM y la porción antigénica unidas a la población adecuada de células seleccionadas como objetivo. Los métodos para la unión de biomoléculas a soportes sólidos se conocen en la técnica. Los protocolos para la inmovilización de biomoléculas en soportes sólidos se conocen bien en la técnica, y hay reactivos adecuados de fuentes comerciales.

Las composiciones inmunoestimuladoras según la presente invención pueden contener asociaciones químicas distintas del acoplamiento covalente entre la porción IRM y la porción antigénica. Por ejemplo, una CIE puede incluir una interacción por afinidad entre la porción antigénica y la porción IRM. La afinidad avidina-biotina representa un ejemplo de una interacción no covalente que se puede utilizar para emparejar una porción antigénica con una porción IRM. Una molécula de biotina se puede unir químicamente a un antígeno por medio de varios grupos funcionales presentes en los aminoácidos, por ejemplo, en un antígeno proteico (p.ej., aminas primarias o grupos sulfhidrilo). Se puede conjugar una porción IRM a una molécula de avidina por medios químicos similares. La porción IRM y la porción antigénica se pueden emparejar después mediante la interacción por afinidad avidina-biotina. Un experto en la técnica conoce bien los métodos para biotinilar proteínas y enlazar grupos químicos a avidina. Las interacciones por afinidad alternativas que pueden ser útiles para producir CIEs incluyen, por ejemplo, las interacciones antígeno/anticuerpo, interacciones glicoproteína/lectina.

Las composiciones inmunoestimuladoras se pueden formar también mediante interacciones iónicas entre una porción IRM y una porción antigénica. Por ejemplo, una porción IRM, una porción antigénica, o ambas, se pueden modificar químicamente para que contengan componentes con cargas opuestas. La porción IRM y la porción antigénica con cargas opuestas se pueden incubar después entre sí para permitir la interacción iónica entre las dos entidades. La CIE resultante se puede administrar después a un sujeto o a una población de células, lo que da como resultado la co-administración del IRM y del antígeno a las células seleccionadas como objetivo.

Como en el caso de las CIEs con uniones covalentes, las CIEs en las que la porción IRM y la porción antigénica están emparejadas de forma no covalente pueden incluir un soporte sólido.

Métodos para Provocar Respuestas Inmunitarias Mediante el Uso de Conjugados Inmunoestimuladores

Las composiciones inmunoestimuladoras según la presente invención se pueden usar para provocar respuestas inmunitarias de células del sistema inmunitario in vitro o in vivo. Así, una CIE según la presente invención puede ser útil como componente de una vacuna o como factor inmunoestimulador usado en el cultivo celular in vitro de células T o de células B. De hecho, los IRMs pueden ser factores inmunoestimuladores más potentes cuando se administran como parte de una CIE según la presente invención en comparación con cuando se administran como un adyuvante de vacuna sin emparejar. Cuando se usan para provocar respuestas inmunitarias in vitro, las células inmunitarias activadas in vitro se pueden reintroducir en un paciente. De forma alternativa, se pueden recoger los factores secretados por las células inmunitarias activadas, p.ej., anticuerpos o citocinas, para el uso en investigación, diagnóstico, y/o
terapia.

A menos que se indique de otra manera, un hospedador se puede inmunizar de forma subcutánea o intraperitoneal. Tras un tiempo suficiente para permitir que el hospedador genere una respuesta inmunitaria hacia la CIE, se recogen las células inmunitarias apropiadas para el sitio de inmunización. Por ejemplo, se puede realizar la recolección de nódulos linfáticos de un hospedador que se había inmunizado de forma subcutánea. Se pueden recoger células de bazo de un hospedador inmunizado de forma peritoneal. Para algunos hospedadores, la recolección de las células puede incluir el sacrificio de los hospedadores. En otros casos, la recolección de las células puede incluir una biopsia o la extracción quirúrgica de un tejido apropiado.

En una realización, las CIEs se pueden usar para inducir la proliferación de células T específicas de antígenos. Se puede inmunizar un hospedador (p.ej., un ratón) con una CIE que incluye un antígeno particular. Tras una incubación suficiente en el hospedador, ciertas células T (p.ej., células T CD8^{+}) madurarán hasta células T específicas de antígeno en respuesta a la inmunización. Un porcentaje mayor de células T serán específicas del antígeno en los hospedadores inmunizados con las CIEs en comparación con los hospedadores inmunizados solamente con antígeno (Figs. 1-3). La CIE se puede emparejar acoplando covalentemente la porción IRM y la porción antigénica (Figs. 1-3) o, de forma alternativa, mediante un emparejamiento no covalente tal como, por ejemplo, una suspensión coloidal (Figs.
15-17).

Si el antígeno es una proteína (p.ej., ovalbúmina), puede ser innecesario que la CIE incluya la proteína completa. Por ejemplo, puede ser suficiente un péptido inmunodominante de la proteína para inducir el desarrollo de células T específicas hacia el antígeno proteico completo. Además, una inmunización de recuerdo, p.ej., 15 días después de la inmunización inicial, puede aumentar la inducción de las células T específicas del antígeno (Fig. 7).

La inmunización de un hospedador con CIEs se puede usar para provocar una respuesta específica de antígenos en linfocitos T citotóxicos CD8^{+} (CTLs). Tal respuesta se puede dirigir contra muchas afecciones que incluyen, pero sin limitación, tumores y poblaciones celulares infectadas por virus. Las CIEs también se pueden administrar de forma profiláctica para proporcionar a un hospedador inmunidad de CTL protectora dirigida contra futuros tumores o infecciones virales.

En otra realización, las CIEs se pueden usar para inducir la producción de citocinas por células T específicas de antígenos in vitro. Se puede recoger un tejido apropiado de un hospedador inmunizado y cultivarlo in vitro con antígeno, por lo que se induce la producción de una o más citocinas (p.ej., IFN-\gamma, véanse las Figs. 4-6). De nuevo, en los casos en los que el antígeno es una proteína, un péptido inmunodominante de la proteína antigénica puede ser suficiente para inducir en las células T específicas del antígeno en cultivo celular la producción y la secreción de las citocinas.

En otra realización, las CIEs se pueden usar para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Los hospedadores que tienen células tumorales que expresan un antígeno particular se pueden inmunizar con las CIEs que contienen el antígeno. En ciertas realizaciones, la inmunización inicial se puede reforzar con una segunda inmunización. Los tumores recogidos de hospedadores inmunizados con CIE que contenían el antígeno fueron menores en general que los tumores recogidos de hospedadores inmunizados solamente con el antígeno (Fig. 8). Además, el análisis de los tumores demostró que los tumores recogidos de hospedadores inmunizados con CIE contuvieron un porcentaje más elevado de células T específicas de antígeno que los tumores recogidos de hospedadores inmunizados solamente con el antígeno (Fig. 10).

Aún en otra realización, los CIEs se pueden usar para inducir a células presentadoras de antígenos (APCs, p.ej., células dendríticas) a que presenten péptidos del antígeno dentro de complejos del MHC de clase I en sus superficies celulares. Los hospedadores se pueden inmunizar de forma intravenosa para inducir este tipo de respuesta. La respuesta se puede verificar recogiendo y analizando células del bazo en busca de APCs que presentan complejos antígeno/MHC de clase I (Figs. 11-13).

En una realización alternativa, se pueden usar CIEs para desarrollar células T específicas de antígeno in vitro. Por ejemplo, se pueden recoger células de médula ósea de un paciente que tiene un tumor que expresa un antígeno particular. Las células recogidas se pueden cultivar in vitro con una CIE que contiene el antígeno expresado por el tumor. De nuevo, si el antígeno es una proteína, puede ser suficiente que la CIE incluya un péptido inmunodominante de la proteína. Las células T específicas de antígeno que se desarrollan in vitro en respuesta a la incubación con la CIE se pueden reintroducir en el paciente.

Aún en otra realización alternativa, se puede administrar una CIE a un sujeto que tiene un tumor para incrementar la probabilidad, la duración, o ambas, de la supervivencia. Una CIE que incluía una porción antigénica específica de un tumor administrada a un ratón expuesto a células de melanoma proporcionó una supervivencia incrementada en comparación con los ratones inmunizados solamente con el antígeno tumoral (Fig. 14).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se han seleccionado simplemente para ilustrar adicionalmente las características, ventajas y otros detalles de la invención. Se debe entender expresamente, sin embargo, que aunque los ejemplos sirven para este fin, los materiales y cantidades particulares usados, así como otras condiciones y detalles, no se deben interpretar de forma que se limite excesivamente el alcance de esta invención.

Preparación de Compuestos IRM

Compuesto IRM 1 (IRM1): N-[6-({2-[4-amino-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletil}
amino)-6-oxohexil]-4-azido-2-hidroxibenzamida

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4

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Parte A

Una disolución agitada de 4-cloro-3-nitroquinolina (17,3 g, 83,2 mmol) en 200 mL de CH_{2}Cl_{2} anhidro, bajo N_{2}, se trató con trietilamina (23,2 mL, 166,4 mmol) y 1,2-diamino-2-metilpropano (9,57 mL, 91,5 mmol). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se diluyó con 800 mL de CHCl_{3}, se lavó con H_{2}O (3 X 300 mL) y salmuera (300 mL). La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar 2-metil-N^{1}-(3-nitroquinolin-4-il)propano-1,2-diamina (21,0 g) en forma de un sólido amarillo intenso.

Parte B

Una disolución de 2-metil-N^{1}-(3-nitroquinolin-4-il)propano-1,2-diamina (2,60 g, 10,0 mmol) en 50 mL de tetrahidrofurano (THF), bajo N_{2}, se enfrió a 0ºC y se trató con 10 mL de una disolución de NaOH 1 N. Después se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (2,18 g, 10,0 mmol) a la disolución con agitación rápida. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se añadieron 400 mg adicionales de dicarbonato de di-terc-butilo y se continuó con la agitación durante 3 días. La reacción se trató después con acetato de etilo (200 mL) y se lavó con H_{2}O (2X) y salmuera. La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar un sólido amarillo que se trituró con un 10% de EtOAc/hexanos. El sólido se aisló mediante filtración y se secó a vacío durante la noche para proporcionar 1,1-dimetil-2-[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etilcarbamato de terc-butilo (2,80 g) en forma de un polvo amarillo.

Parte C

Una disolución de 1,1-dimetil-2-[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etilcarbamato de terc-butilo (3,50 g, 9,72 mmol), en 150 mL de tolueno se trató con 0,3 g de un 5% de Pt sobre carbono y se agitó bajo H_{2} (3 atm, 3 Kg/cm^{2}) durante 6 horas. La disolución se filtró después a través de una almohadilla de Celite y se concentró para proporcionar 3,04 g de 2-[(3-aminoquinolin-4-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo bruto en forma de una espuma anaranjada
clara.

Parte D

Una disolución de 2-[(3-aminoquinolin-4-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (3,04 g, 9,21 mmol) en 50 mL de CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC y se trató con trietilamina (1,41 mL, 10,13 mmol) y cloruro de etoxiacetilo (1,02 mL, 10,17 mmol). Después de 2 horas, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El jarabe resultante se resuspendió en 100 mL de EtOH y se trató con 4,5 mL de trietilamina. La disolución se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se concentró y se resuspendió en 100 mL de CH_{2}Cl_{2} y se lavó con H_{2}O (2X) y salmuera. La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El jarabe resultante se purificó mediante cromatografía en columna (SiO_{2}, 80% de EtOAc/hexanos) para proporcionar 2-[2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,57 g) en forma de una espuma de color melocotón.

Parte E

Una disolución de 2-[2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,57 g, 3,94 mmol) en 30 mL de CH_{2}Cl_{2} se trató con ácido 3-cloroperoxibenzoico (77%, 1,01 g, 4,57 mmol). Después de agitar durante 2 horas, la mezcla de reacción se trató con 30 mL adicionales de CH_{2}Cl_{2} y se lavó con una disolución de Na_{2}CO_{3} al 1% (2 X 30 mL), H_{2}O y salmuera. La porción orgánica se secó después sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar 2-[2-(2-(etoximetil)-5-oxido-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,58 g) en forma de una espuma marrón clara.

Parte F

Una disolución de 2-[2-(2-(etoximetil)-5-oxido-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,57 g, 3,79 mmol) en 20 mL de 1,2-dicloroetano se calentó a 70ºC y se trató con 2 mL de una disolución concentrada de NH_{4}OH. A la disolución con agitación rápida se le añadió cloruro de p-toluensulfonilo sólido (795 mg, 4,17 mmol). La mezcla de reacción se selló después en un recipiente a presión y se continuó con el calentamiento durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió después y se trató con 50 mL de CHCl_{3}. La mezcla de reacción se lavó después con H_{2}O, disolución de un 1% de Na_{2}CO_{3} (3X) y salmuera. La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar el producto en forma de un aceite marrón claro. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía en columna (SiO_{2}, 2-5% de MeOH/CHCl_{3}) para proporcionar 2-[4-amino-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,26 g) en forma de una espuma amarilla
clara.

Parte G

Se disolvió 2-[4-amino-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo
(1,26 g, 3,05 mmol) en 10 mL de EtOH y se trató con 10 mL de HCl 2 M en EtOH. Después de calentar a reflujo durante 2 horas, la mezcla de reacción se enfrió y se concentró a presión reducida. El sólido amarillo resultante se disolvió en 50 mL de H_{2}O y se extrajo con CHCl_{3} (20 mL). La capa orgánica se desechó y la porción acuosa se basificó (pH \sim 12) mediante la adición de una disolución concentrada de NH_{4}OH. Esta se extrajo después con CHCl_{3} (4 x 20 mL) y las porciones orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4} y se concentraron para proporcionar 1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (808 mg) en forma de un polvo marrón claro. p.f. 161,0-162,0ºC;

MS m/z 314 (M + H);

^{1}H RMN (300 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 8,30 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,59 (dd, J = 1,2, 8,3 Hz, 1H), 7,40 (ddd, J = 1,0, 7,2, 8,1 Hz, 1H), 7,21 (ddd, J = 1,2, 7,0, 8,2 Hz, 1H), 6,57 (s, 2H), 4,94 (s ancho, 2H), 4,61 (s ancho, 2H), 3,52 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 1,61 (s, 2H), 1,31 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,07 (s, 6H);

^{13}C RMN (75 MHz, d_{6}-DMSO) \delta 152,4, 151,1, 145,7, 134,3, 126,8, 126,7, 121,7, 120,8, 115,7, 65,6, 65,2, 55,8, 52,5, 29,2, 15,4.

Anál. Calc. para C_{17}H_{23}N_{5}O: %C, 65,15; %H, 7,40; %N, 22,35. Hallado: %C, 65,04; %H, 7,52; %N, 22,07.

Parte H

Bajo una atmósfera de nitrógeno, se añadió una disolución de (azidosalicilamido)hexanoato de N-hidroxisulfosuccinimidilo (100 mg, 0,204 mmol de Sulfo-LC-NHS-ASA de Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, IL, EE.UU.) en N,N-dimetilformamida DMF, (2-4 mL) a una disolución de 1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (63 mg, 0,201 mmol) en DMF (5 mL). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno en un recipiente envuelto en papel de aluminio. Después de 2 días, se añadieron 50 mg adicionales de (azidosalicilamido)hexanoato de N-hidroxisulfosuccinimidilo. Después de alrededor de una semana, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida a 55ºC. El residuo se repartió entre diclorometano que contenía una pequeña cantidad de metanol y agua. La capa orgánica se separó y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía por desorción súbita (2 X 15 cm de SiO_{2} eluyendo con un 6% de metanol en cloroformo) para proporcionar 53 mg de producto en forma de un vidrio incoloro. El vidrio se transfirió mediante el uso de diclorometano a un matraz cónico y después se concentró para proporcionar una espuma. La espuma se secó durante la noche a alto vacío para proporcionar 48 mg de un sólido cristalino blanco. El análisis mediante RMN indicó la presencia de diclorometano, así que el material se secó durante la noche a alto vacío y después en un horno de vacío a 50ºC durante 5 horas. El análisis mediante HPLC indicó una pureza de >93%.

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Compuesto IRM 2 (IRM2): N-{6-[(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etil)
amino]-6-oxohexil}-4-azido-2-hidroxibenzamida

5

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Parte A

Una disolución de 2-(2-aminoetoxi)etanol (29,0 g, 0,276 mol) en 180 mL de tetrahidrofurano (THF), bajo N_{2}, se enfrió a 0ºC y se trató con 140 mL de una disolución de NaOH 2 N. Una disolución de dicarbonato de di-terc-butilo (60,2 g, 0,276 mol) en 180 mL de THF se añadió después gota a gota a lo largo de 1 h a la disolución con agitación rápida. La mezcla de reacción se dejó calentar después hasta temperatura ambiente y se agitó otras 18 horas. Después se eliminó el THF a presión reducida y la suspensión espesa acuosa restante se llevó a pH 3 mediante la adición de 150 mL de una disolución de H_{2}SO_{4} 1 M. Esto se extrajo después con acetato de etilo (300 mL, 100 mL), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O (2X) y salmuera. La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar 2-(2-hidroxietoxi)etilcarbamato de terc-butilo en forma de un aceite incoloro (47,1 g).

Parte B

Una disolución con agitación rápida de 2-(2-hidroxietoxi)etilcarbamato de terc-butilo (47,1 g, 0,230 mol) en 1 L de CH_{2}Cl_{2} anhidro se enfrió a 0ºC bajo N_{2} y se trató con trietilamina (48,0 mL, 0,345 mol). Después se añadió cloruro de metanosulfonilo (19,6 mL, 0,253 mol) gota a gota a lo largo de 30 min. La mezcla de reacción se dejó calentar después a temperatura ambiente y se agitó otras 22 horas. La reacción se paró mediante la adición de 500 mL de una disolución saturada de NaHCO_{3}, y se separó la capa orgánica. La fase orgánica se lavó después con H_{2}O (3 X 500 mL) y salmuera. La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar metanosulfonato de 2-{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etoxi}etilo en forma de un aceite marrón (63,5 g).

Parte C

Una disolución agitada de metanosulfonato de 2-{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etoxi}etilo (63,5 g, 0,224 mol) en 400 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) se trató con NaN_{3} (16,1 g, 0,247 mol) y la mezcla de reacción se calentó a 90ºC bajo N_{2}. Después de 5 horas, la disolución se enfrió a temperatura ambiente y se trató con 500 mL de H_{2}O frío. La mezcla de reacción se extrajo después con Et_{2}O (3 X 300 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con H_{2}O (4 X 100 mL) y salmuera (2 X 100 mL). La porción orgánica se secó sobre MgSO_{4} y se concentró para proporcionar 52,0 g de 2-(2-azidoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo en forma de un aceite marrón claro.

Parte D

Una disolución de 2-(2-azidoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo (47,0 g, 0,204 mol) en MeOH se trató con 4 g de un 10% de Pd sobre carbono y se agitó bajo H_{2} (3 Kg/cm^{2}) durante 24 horas. La disolución se filtró después a través de una almohadilla de Celite y se concentró para proporcionar 35,3 g de 2-(2-aminoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo bruto en forma de un líquido incoloro que se usó sin purificación posterior.

Parte E

Una disolución agitada de 4-cloro-3-nitroquinolina (31,4 g, 0,151 mol) en 500 mL de CH_{2}Cl_{2} anhidro, bajo N_{2}, se trató con trietilamina (43 mL, 0,308 mol) y 2-(2-aminoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo (0,151 mol). Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se lavó con H_{2}O (2 X 300 mL) y salmuera (300 mL). La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar un sólido amarillo intenso. La recristalización a partir de acetato de etilo/hexanos proporcionó 43,6 g de 2-{2-[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo en forma de cristales de color amarillo intenso.

Parte F

Una disolución de 2-{2-[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo (7,52 g, 20,0 mmol) en tolueno se trató con 1,5 g de un 5% de Pt sobre carbono y se agitó bajo H_{2} (3 Kg/cm^{2}) durante 24 horas. La disolución se filtró después por medio de una almohadilla de Celite y se concentró para proporcionar 6,92 g de 2-{2-[(3-aminoquinolin-4-il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo bruto en forma de un jarabe amarillo.

Parte G

Una disolución de 2-{2-[(3-aminoquinolin-4-il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo (10,2 g, 29,5 mmol) en 250 mL de CH_{2}Cl_{2} anhidro se enfrió a 0ºC y se trató con trietilamina (4,18 mL, 30,0 mmol). Después se añadió cloruro de metoxipropionilo (3,30 mL, 30,3 mmol) gota a gota a lo largo de 5 min. La reacción se calentó después a temperatura ambiente y se continuó con la agitación durante 1 hora. La mezcla de reacción se concentró después a presión reducida para proporcionar un sólido anaranjado. Este se disolvió en 250 mL de EtOH y se añadieron 12,5 mL de trietilamina. La mezcla se calentó a reflujo y se agitó bajo N_{2} durante la noche. La reacción se concentró después hasta sequedad a presión reducida y se trató con 300 mL de Et_{2}O. La mezcla se filtró después y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar un sólido marrón. El sólido se disolvió en 200 mL de metanol caliente y se trató con carbón activado. La disolución caliente se filtró y se concentró para proporcionar 11,1 g de 2-{2-[2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo en forma de un jarabe amarillo.

Parte H

Una disolución de 2-{2-[2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etil-carbamato de terc-butilo
(10,22 g, 24,7 mmol) en 250 mL de CHCl_{3} se trató con ácido 3-cloroperbenzoico (77%, 9,12 g, 40,8 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de Na_{2}CO_{3} al 1% (2 X 75 mL) y salmuera. La capa orgánica se secó después sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar 10,6 g de 2-{2-[2-(2metoxietil)-5-oxido-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1- il]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo en forma de una espuma anaranjada que se usó sin purificación posterior.

Parte I

Una disolución de 2-{2-[2-(2-metoxietil)-5-oxido-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etilcarbamato de terc-
butilo (10,6 g, 24,6 mmol) en 100 mL de 1,2-dicloroetano se calentó a 60ºC y se trató con 10 mL de disolución concentrada de NH_{4}OH. A la disolución con agitación rápida se le añadió cloruro de p-toluensulfonilo sólido (7,05 g, 37,0 mmol) a lo largo de un período de 10 minutos. La mezcla de reacción se trató con 1 mL adicional de disolución concentrada de NH_{4}OH y después se selló en un recipiente a presión y se continuó con el calentamiento durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió después y se trató con 100 mL de CHCl_{3}. Después la mezcla de reacción se lavó con H_{2}O, disolución de Na_{2}CO_{3} al 1% (2X) y salmuera. La porción orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para proporcionar 10,6 g de 2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo en forma de una espuma marrón.

Parte J

Se trató 2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etil-carbamato de terc-butilo (10,6 g, 24,6 mmol) con 75 mL de HCl 2 M en etanol y la mezcla se calentó a reflujo con agitación. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se enfrió y se filtró para proporcionar un sólido gomoso. El sólido se lavó con etanol y Et_{2}O y se secó a vacío para proporcionar la sal de hidrocloruro en forma de un sólido marrón claro. La base libre se produjo disolviendo la sal de hidrocloruro en 50 mL de H_{2}O y tratando con una disolución de NaOH al 10%. La suspensión acuosa se concentró después hasta sequedad y el residuo se trató con CHCl_{3}. Las sales resultantes se eliminaron mediante filtración y el filtrado se concentró para proporcionar 3,82 g de 1-[2-(2-aminoetoxi)etil]-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina en forma de un polvo marrón claro.

MS 330 (M + H)^{+};

^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,10 (d, J = 8,1 Hz, 1 H); 7,66 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 7,40 (m, 1 H); 7,25 (m, 1 H); 6,88 (s ancho, 2 H); 4,78 (t, J = 5,4 Hz, 2 H); 3,89 (t, J = 4,8 Hz, 2 H); 3,84 (t, J = 6,9 Hz, 2 H); 3,54 (t, J = 5,4 Hz, 2 H); 3,31 (s, 3 H); 3,23 (t, J = 6,6 Hz, 2 H); 2,88 (t, J = 5,3 Hz, 2 H).

Parte K

Bajo una atmósfera de nitrógeno, se añadió una disolución de (azidosalicilamido)hexanoato de N-hidroxisulfosuccinimidilo (100 mg, 0,204 mmol de Sulfo-LC-NHS-ASA de Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, IL, EE.UU.) en DMF (2-4 mL) a una disolución de 1-[2-(2-aminoetoxi)etil]-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (66 mg, 0,201 mmol) en DMF (5 mL). Después de 3,5 horas el análisis mediante HPLC demostró que no había presente material de partida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y después se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía por desorción súbita (2 X 15 cm de SiO_{2} mediante elución con un 8% de metanol en cloroformo) para proporcionar 55 mg de producto en forma de un vidrio incoloro. El vidrio se transfirió mediante el uso de diclorometano a un matraz cónico, y después se concentró para proporcionar una espuma. La espuma se secó durante la noche a alto vacío y después en una estufa de vacío a 50ºC durante 5 horas para proporcionar 45 mg de producto en forma de un sólido blanco velloso. El análisis mediante HPLC indicó una pureza de
>95%.

Compuesto IRM 3 (IRM3): N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etil)hexadecanamida

6

Bajo una atmósfera de nitrógeno, una suspensión de 1-[2-(2-aminoetoxi)etil]-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (140,5 mg, 0,428 mmol) en una mezcla de diclorometano (3,5 mL) y trietilamina (150 \muL, 1,07 mmol) se enfrió a 0ºC. Se añadió lentamente cloruro de palmitoilo (130 \muL, 0,428 mmol). La mezcla de reacción se dejó agitar a 0ºC durante 2 horas, en cuyo momento el análisis mediante cromatografía en capa fina indicó que no quedaba material de partida. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (30 mL), se lavó con una disolución saturada de bicarbonato sódico (2 x 5 mL), se secó sobre sulfato de magnesio y después se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna (12 g de de gel de sílice eluido con un 2% de metanol en diclorometano) para proporcionar 183 mg de N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi}etil)hexadecanamida en forma de un polvo blanco.

Anál. Calc. para C_{33}H_{53}N_{5}O_{3}: %C, 69,80; %H, 9,41; %N, 12,33. Hallado: %C, 69,60; %H, 9,28; %N, 11,99.

Ejemplo 1

Interconexión de un Modificador de la Respuesta Inmunitaria a Ovalbúmina

Se suspendió el IRM1 en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 10 mg/ml. Se suspendió ovalbúmina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 10 mg/ml, y el pH se ajustó a >10,0 mediante la adición de NaOH. Se mezclaron 500 \mul de la disolución de ovalbúmina (5 mg de ovalbúmina) con 100 \mul de la disolución de IRM1 (1 mg de IRM1) en un único pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos. La placa se colocó sobre hielo y se colocó una fuente de luz UV de longitud de onda larga directamente sobre la placa tan cerca como fue posible del pocillo que contenía la mezcla de IRM1/ovalbúmina. La mezcla se irradió durante 15 minutos. El conjugado resultante se extrajo del pocillo y se resuspendió en PBS hasta una concentración final de 5 mg/ml de ovalbúmina, 0,5 mg/ml de IRM1, y se dializó con PBS para eliminar el IRM sin conjugar.

Ejemplo 2

Inmunizaciones

Se inmunizó a ratones C57BL/6 con el conjugado (1 mg de ovalbúmina y 200 \mug de IRM1, preparado como en el Ejemplo 1) en 200 \mul de PBS de forma subcutánea o intraperitoneal. Los ratones de control se inmunizaron con 1 mg ovalbúmina en 200 \mul de PBS. Para el análisis de las respuestas primarias, los ratones se sacrificaron 5-7 días tras la inmunización. Para el análisis de las respuestas secundarias, se administró a los ratones una dosis de refuerzo 7-15 días tras la inmunización inicial y se sacrificaron 5-7 días más tarde. A menos que se indique de otra manera, se recogieron nódulos linfáticos de los ratones inmunizados de forma subcutánea para su análisis, y se recogieron células de bazo de los ratones inmunizados de forma intraperitoneal para su análisis.

Ejemplo 3

Reactivos

Se obtuvieron anticuerpos marcados con fluorocromos específicos de CD8, CD11c, y CD44 de ratón de Pharmingen (San Diego, CA). El anticuerpo monoclonal 25D1.16 (Dr. Ron Germain, NIH) es específico del péptido de ovalbúmina dominante (SIINFEKL) unido a la molécula del MHC de clase I H-2K^{b}. Porgador et al., Immunity 6:715-26. La ovalbúmina se obtuvo de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Se produjeron tetrámeros de la molécula del MHC de clase I H-2K^{b} unida al péptido de ovalbúmina dominante SIINFEKL tal como se describió en Kedl et al., J Exp Med, 192:1105-13 (2000). La línea de células de melanoma que expresan ovalbúmina B16ova se produjo mediante la lipofección de la línea de células B16-F10 (ATCC nº CRL-6475) con un plásmido que codifica la ovalbúmina de longitud completa. Véase Kedl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:10811-6. Los reactivos de captura de citocinas y de detección fueron de Miltyeni Biotech (Auburn, CA).

Ejemplo 4

Los ratones experimentales se inmunizaron con el conjugado preparado como en el Ejemplo 1 de forma subcutánea o intraperitoneal como se describió en el Ejemplo 2. Los ratones de control se inmunizaron con ovalbúmina como se describió en el Ejemplo 2. Siete días más tarde, se extrajeron nódulos linfáticos o el bazo y las células se tiñeron con anticuerpos específicos de CD8, CD44, y tetrámeros H-2K^{b}/SIINFEKL y se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en las Figs. 1-3. Las células que se tiñen positivamente para los tres marcadores identifican las células T CD8^{+} activadas, específicas de ovalbúmina que se desarrollaron como resultado de la inmunización.

Cada una de las Figuras 1-3 incluye el porcentaje de todas las células T CD8^{+} examinadas que se identificaron como células T CD8^{+} activadas, específicas de ovalbúmina. En los ratones de control, el 0,07% de las células T CD8^{+} fueron células T CD8^{+} activadas, específicas de ovalbúmina. La inmunización subcutánea con el conjugado generó un 0,52% de células T CD8^{+} activadas, específicas de ovalbúmina. La inmunización intraperitoneal con el conjugado generó un 0,92% de células T CD8^{+} activadas, específicas de ovalbúmina.

La inmunización con el péptido de ovalbúmina dominante (SIINFEKL) conjugado a IRM1 (100 \mug de péptido interconectado a 200 \mug de IRM1) también indujo la activación de las células T CD8^{+} específicas de ovalbúmina.

Ejemplo 5

Los ratones de control se inmunizaron con ovalbúmina como se describió en el Ejemplo 2. Los ratones experimentales se inmunizaron con conjugado preparado como en el Ejemplo 1 de forma subcutánea o intraperitoneal como se describió en el Ejemplo 2. Las células inmunitarias apropiadas se recogieron siete días después de la inmunización y se incubaron in vitro durante cuatro horas con péptido SIINFEKL. Se identificaron las células T CD8^{+} productoras de interferón \gamma (IFN-\gamma) mediante un ensayo de captura y detección de IFN-\gamma acoplado a citometría de flujo. Las células T CD8^{+} que se generaron mediante la inmunización con el conjugado IRM1-ovalbúmina produjeron IFN-\gamma en respuesta a la estimulación antigénica subsiguiente (Figuras 4-6).

Ejemplo 6

Los ratones se inmunizaron con el conjugado preparado como en el Ejemplo 1 tal como se describió en el Ejemplo 2 y después se reforzaron con una cantidad igual de conjugado en el día 15. Las células de bazo y de nódulo linfático de los animales reforzados se analizaron siete días tras el refuerzo. El análisis demostró un porcentaje incrementado de células T CD8^{+} activadas específicas de ovalbúmina respecto de las de los ratones que habían recibido solamente la inmunización primaria (Figura 7).

Ejemplo 7

Se inyectó a los ratones de forma intradérmica la línea de células de melanoma que expresan ovalbúmina B16ova (1 x 10^{5} células). En el Día 7, se inyectó de forma subcutánea a los ratones 1 mg de ovalbúmina (control) o conjugado preparado como en el Ejemplo 1. En el Día 14, los ratones se reforzaron de forma subcutánea con ovalbúmina o conjugado como en el día 7. En el Día 20, se midió el tamaño de los tumores con calibres en dos dimensiones. La inmunización con el conjugado dio como resultado un tamaño tumoral reducido en comparación con el control (Figura 8).

Ejemplo 8

Se inyectó a los ratones de forma intradérmica la línea de células de melanoma que expresan ovalbúmina B16ova (1 x 10^{5} células). Siete y 14 días más tarde, se inyectó a los ratones de forma intraperitoneal 1 mg de ovalbúmina (control) o conjugado preparado como en el Ejemplo 1. Veinte días tras la exposición a la línea de células de melanoma, se extrajeron los bazos y los tumores y las células de cada fuente se tiñeron con anticuerpos específicos hacia CD8 y CD44 así como con tetrámeros H-2K^{b}/SIINFEKL. El análisis mediante citometría de flujo reveló una expansión significativa de células T CD8^{+} activadas específicas de ovalbúmina en el bazo (Figura 9) y dentro del tumor (Figura 10).

Ejemplo 9

Se inmunizó a ratones de forma intravenosa con ovalbúmina, ovalbúmina e IRM1 sin emparejar: 1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (IRM1 antes de la unión del grupo conector - el producto de la Parte G de la síntesis de IRM1), o con conjugado preparado como en el Ejemplo 1. Catorce horas más tarde se extrajeron los bazos, se trataron con colagenasa, y las células se tiñeron con anticuerpos específicos de CD8, CD11c, y el anticuerpo 25D1.16, que es específico del péptido de ovalbúmina SIINFEKL complejado con la molécula del MHC de clase I H-2K^{b}. El análisis mediante citometría de flujo indicó que la inmunización de los ratones con el conjugado IRM1-ovalbúmina (Figura 13) generó un porcentaje mayor de células dendríticas CD11c^{+}, CD8^{+} que estaban presentando K^{b}/SIINFEKL que la inmunización de los ratones con ovalbúmina sola (Fig. 11) o una mezcla de ovalbúmina e IRM1 sin emparejar (Figura 12).

Ejemplo 10

Se inmunizó a ratones en el Día 0 de forma subcutánea como se describió en el Ejemplo 2 con ovalbúmina (control) o con conjugado de IRM1 preparado como en el Ejemplo 1. Los ratones recibieron inmunizaciones de refuerzo en el Día 14. Los ratones se expusieron después de forma intradérmica a la línea de células de melanoma que expresan ovalbúmina B16ova (1 x 10^{5} células) en el Día 28 y se monitorizó el crecimiento tumoral. En el Día 75, el 80% de los ratones inmunizados con conjugado sobrevivieron y parecieron sanos, mientras todos los ratones inmunizados solamente con ovalbúmina murieron (Fig. 14).

Ejemplo 11

Se preparó una disolución de reserva de IRM3 disolviendo IRM3 en DMSO hasta una concentración de 10 mg/ml. Se disolvió ovalbúmina en PBS hasta una concentración de 50 mg/ml. Se añadieron 50 \mul de la disolución de reserva de IRM3 a 150 \mul de PBS y después se mezclaron mediante agitación en vórtex. Se añadieron 50 \mul de la ovalbúmina a la disolución de IRM3 y se mezclaron mediante agitación en vórtex. Se obtuvo como resultado una suspensión coloidal turbia de IRM3 y ovalbúmina.

Los ratones se inmunizaron en el Día 0 de forma subcutánea como se describió en el Ejemplo 2 con (a) ovalbúmina sola, o (b) 50 \mul de la suspensión coloidal de ovalbúmina e IRM3. En el Día 6, se extrajeron los nódulos linfáticos, se homogenizaron, y se tiñeron con el tetrámero H-2K^{b}/SIINFEKL para identificar las células T específicas de ovalbúmina. La Figura 15 muestra los datos de la citometría de flujo de un ratón de control inmunizado con ovalbúmina sola; las Figuras 16 y 17 muestran datos de dos ratones diferentes que se inmunizaron con la suspensión coloidal.

Ejemplo 12

Se preparó un conjugado de IRM2 y ovalbúmina como se describió en el Ejemplo 1, con la excepción de que se usó IRM2 en lugar de IRM1.

Se dividieron veinticuatro ratones en ocho grupos de tres. Se inmunizaron cuatro grupos de tres ratones de forma subcutánea como se describió en el Ejemplo 2 en el Día 0, y cada grupo recibió cantidades crecientes de conjugado IRM1-ovalbúmina. Los cuatro grupos restantes se inmunizaron de forma similar en el Día 0 con el conjugado IRM2-ovalbúmina. En el Día 6, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los nódulos linfáticos y se tiñeron con el tetrámero H-2K^{b}/SIINFEKL para identificar las células T específicas de ovalbúmina. Se calculó el porcentaje de células T específicas de ovalbúmina para cada ratón. La Figura 18 resume los resultados.

Ejemplo 13

Se transfirieron a ratones de forma adoptiva aproximadamente 2 x 10^{6} de células T transgénicas específicas de ovalbúmina OT1 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Los ratones se inmunizaron en el Día 0 de forma subcutánea como se describió en el Ejemplo 2 con (a) 100 \mug de ovalbúmina, (b) 100 \mug de ovalbúmina + 50 \mug de CpG (Ova + CpG), (c) 100 \mug de ovalbúmina + 50 \mug de IRM1 sin emparejar (Ova + IRM), o (d) 100 \mug de ovalbúmina conjugada con 50 \mug de IRM1 (Ova x IRM). En el Día 5, se extrajeron los nódulos linfáticos y las células se tiñeron con el tetrámero H-2K^{b}/SIINFEKL para identificar las células T específicas de ovalbúmina. La Figura 19 muestra la expansión en proporción de las células T específicas de ovalbúmina en los grupos Ova + CpG, Ova + IRM, y Ova x IRM respecto de los ratones inmunizados con ovalbúmina sola.

Serán evidentes para los expertos en la técnica diversas modificaciones y alteraciones de esta invención sin apartarse del alcance y el espíritu de la invención. Se proporcionan realizaciones y ejemplos ilustrativos como ejemplos solamente, y no pretenden limitar al alcance de la presente invención. El alcance de la invención está limitado solamente por las reivindicaciones expuestas a continuación.

Claims (10)

1. Una composición inmunoestimuladora que comprende:

una porción de modificador de la respuesta inmunitaria emparejada con una porción antigénica, de forma que se limita la difusión independiente de la porción de modificador de la respuesta inmunitaria con respecto a la porción antigénica, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria es un compuesto de fórmula:

7

en la que:

R_{1} es un grupo conector;

R_{2} se selecciona del grupo que consiste en:

-hidrógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-alquil-O-alquilo;

-alquil-S-alquilo;

-alquil-O-arilo;

-alquil-S-arilo;

-alquil-O-alquenilo;

-alquil-S-alquenilo; y

-alquilo o alquenilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-OH;

-halógeno;

-N(R_{5})_{2};

-CO-N(R_{5})_{2};

-CS-N(R_{5})_{2};

-SO_{2}-N(R_{5})_{2};

-NR_{5}-CO-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-CS-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-SO_{2}-alquilo C_{1-10};

-CO-alquilo C_{1-10};

-CO-O-alquilo C_{1-10};

-N_{3};

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-heterociclilo;

-heterociclilo sustituido;

-CO-arilo;

-CO-(arilo sustituido);

-CO-heteroarilo; y

-CO-(heteroarilo sustituido);

R_{3} y R_{4} son cada uno independientemente:

-hidrógeno;

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un grupo arilo o heteroarilo fusionado que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un anillo saturado de 5 a 7 miembros fusionado que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, y que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2}; y

cada R_{5} es independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-10}.

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2. La composición inmunoestimuladora de la reivindicación 1, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria es un agonista del receptor 2 similar a Toll, receptor 4 similar a Toll, receptor 6 similar a Toll, receptor 7 similar a Toll, o receptor 8 similar a Toll.

3. La composición inmunoestimuladora de la reivindicación 1, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria comprende una amina de imidazoquinolina; una amina de tetrahidroimidazoquinolina; una amina de imidazopiridina; una amina de imidazopiridina sustituida con aril-éter; una amina de imidazoquinolina con puente 1,2; una amina de cicloalquilimidazopiridina fusionada en 6,7; una amina de imidazonaftiridina; una amina de tetrahidroimidazonaftiridina; una amina de oxazoloquinolina; una amina de tiazoloquinolina; una amina de oxazolopiridina; una amina de tiazolopiridina; una amina de oxazolonaftiridina; o una amina de tiazolonaftiridina.

4. La composición inmunoestimuladora de la reivindicación 1, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria y la porción antigénica están acopladas covalentemente.

5. La composición inmunoestimuladora de la reivindicación 1, en la que la porción de modificador de la respuesta inmunitaria y la porción antigénica están emparejadas mediante una asociación física o química distinta del acoplamiento covalente.

6. La composición inmunoestimuladora de la reivindicación 1, en la que la composición comprende una suspensión coloidal.

7. La composición inmunoestimuladora de la reivindicación 1, en la que la porción antigénica comprende una secuencia de aminoácidos, una secuencia de nucleótidos, un lipopolisacárido, un prión, una bacteria, un virus, o un hongo.

8. Un conjugado inmunoestimulador de fórmula:

8

en la que:

R_{1} es un grupo conector;

R_{2} se selecciona del grupo que consiste en:

-hidrógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-alquil-O-alquilo;

-alquil-S-alquilo;

-alquil-O-arilo;

-alquil-S-arilo;

-alquil-O-alquenilo;

-alquil-S-alquenilo; y

-alquilo o alquenilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-OH;

-halógeno;

-N(R_{5})_{2};

-CO-N(R_{5})_{2};

-CS-N(R_{5})_{2};

-SO_{2}-N(R_{5})_{2};

-NR_{5}-CO-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-CS-alquilo C_{1-10};

-NR_{5}-SO_{2}-alquilo C_{1-10};

-CO-alquilo C_{1-10};

-CO-O-alquilo C_{1-10};

-N_{3};

-arilo;

-arilo sustituido;

-heteroarilo;

-heteroarilo sustituido;

-heterociclilo;

-heterociclilo sustituido;

-CO-arilo;

-CO-(arilo sustituido);

-CO-heteroarilo; y

-CO-(heteroarilo sustituido);

R_{3} y R_{4} son cada uno independientemente:

-hidrógeno;

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un grupo arilo o heteroarilo fusionado que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

o cuando se consideran en conjunto, R_{3} y R_{4} forman un anillo saturado de 5 a 7 miembros fusionado que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, y que está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-halógeno;

-alquilo;

-alquenilo;

-O-alquilo;

-S-alquilo; y

-N(R_{5})_{2};

cada R_{5} es independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-10}; y

n es 1 a 10; o

una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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9. Un método para la estimulación de células productoras de anticuerpos in vitro, y el método comprende:

a)

proporcionar una composición inmunoestimuladora según la reivindicación 1; y

b)

permitir que la composición inmunoestimuladora se una a las células productoras de anticuerpos.

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10. Una composición inmunoestimuladora según la reivindicación 1 para el uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un organismo hacia la porción antigénica.