ES2380893T3 - Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión en perlas - Google Patents

Abstract

Un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende: (a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas de emulsión acuosa en una fase oleosa termoestable; en el que un primer subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas y una o mas de las especies de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas; (b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde del primer subconjunto de gotitas, en el que una o mas perlas del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas; (c) romper las gotitas de emulsión acuosa para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos; (d) hibridar con el amplicón inmovilizado en las perlas un cebador que es complementario del extremo 3' del amplicón; y o bien: (e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana, y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y (f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, desde las perlas que no tienen amplicón unido; o bien (e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado desde las perlas que no tienen amplicón unido.

Description

Amplificaci6n de acidos nucleicos en emulsi6n en perlas

Campo de la invenci6n

La presente descripci6n se refiere a metodos para amplificar moldes de acidos nucleicos desde bajo numero de

5 copias hasta cantidades que permiten la secuenciaci6n sobre un soporte s6lido tal como una perla. La presente invenci6n se dirige a separaci6n cero de las perlas. Tambien se describe un metodo de enriquecimiento de soportes s6lidos que contienen acidos nucleicos amplificados.

Antecedentes de la invenci6n

La capacidad de amplificar una pluralidad de secuencias de acidos nucleicos tales como un banco gen6mico o un

10 banco de DNA, es critica, dada la ineficacia de los metodos actuales de secuenciaci6n.. Las tecnologias de secuenciaci6n actuales requieren millones de copias de acido nucleico por cada reacci6n de secuenciaci6n. Ademas, la secuenciaci6n de un genoma humano podria requerir, aproximadamente, decenas de millones de reacciones de secuenciaci6n diferentes. Si el material de partida es limitado, es necesaria la amplificaci6n del DNA inicial antes de realizar la secuenciaci6n gen6mica. El material de partida puede estar limitado, por ejemplo, si el

15 genoma que ha de ser secuenciado procede de indicios de un pat6geno o de un paciente prenatal. Las tecnicas actuales de amplificaci6n gen6mica in vitro implican protocolos de clonaci6n y de cultivo que han limitado la utilidad de la secuenciaci6n gen6mica. Otras tecnicas, tales como peR, si bien rapidas y dignas de confianza, son incapaces de amplificar un genoma de un modo representativo.

Aun cuando puede construirse con facilidad por ingenieria genetica una peR aleatoria con cebador para amplificar

20 una pluralidad de acidos nucleicos en una reacci6n, este metodo no es preferido debido a que el banco de DNA amplificado no es representativo del banco de partida. Es decir, en el ambiente de una peR aleatoria algunas secuencias de DNA son amplificadas preferentemente a expensas de otras secuencias, de modo que el producto amplificado no representa el material de partida.. Este problema de la peR puede ser obviado si cada miembro individual de un banco de DNA es amplificado en una reacci6n separada. No obstante, este enfoque puede no ser

25 practico si se requieren muchos miles de tubos de reacci6n separados para el procedimiento de amplificaci6n, dado que un banco gen6mico o un banco de DNA puede incluir mas de 100.000 fragmentos. La amplificaci6n individual de cada fragmento de estos bancos en reacciones separadas, no es practica.

Griffiths et al., EMBO Journal, 22:1, Enero 2003, paginas 24-35, se refieren a la evoluci6n dirigida de una

fosfotriesterasa, sumamente rapida, mediante compartimentaci6n in vitro.

30 El documento WO00/50712 describe un metodo 6ptico de clasificaci6n utilizado para aislar uno o mas elementos geneticos que codifican un producto genico que posee una actividad deseada.

El documento WO 02/10301 describe un metodo selectivo de amplificaci6n genica en el que se amplifica

selectivamente un acido nucleico que codifica un producto genico seleccionado que posee una actividad deseada.

Fry et al., Biotechniques, 13: 1, Enero, 1992, paginas 124-131, describen un metodo de hibridaci6n y purificaci6n

35 que emplea particulas paramagneticas, que se utiliza para la purificaci6n de DNA, especificamente para aplicaciones de secuenciaci6n.

Sumario de la invenci6n

Segun la presente invenci6n, se proporciona un metodo para enriquecer un amplic6n, que comprende:

(a) distribuir una soluci6n que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas

40 de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas acuosas de emulsi6n en una fase oleosa termoestable, en el que un primer subconjunto de las gotitas comprende una o mas de las perlas y una o mas de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprende una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

45 (b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde existentes dentro del primer subconjunto de gotitas, en el que una o mas perlas dentro del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplic6n inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas acuosas de emulsi6n para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) someter a hibridaci6n de acidos nucleicos al amplic6n inmovilizado en las perlas con un cebador que es 50 complementario del extremo 3' del amplic6n; y

o bien: (e)(i) formar un complejo de perla con amplic6n inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condici6n selectiva; y

(f)(i) aplicar la condici6n selectiva para aislar el complejo de perla con amplic6n inmovilizado y. perla de 5 enriquecimiento, de aquellas perlas que no tienen amplic6n unido;

o bien

(e)(ii) exponer las perlas con amplic6n inmovilizado a una o mas superficies de uni6n que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplic6n inmovilizado, y separar las perlas con amplic6n inmovilizado de las perlas que

10 no tienen amplic6n unido.

Se describe en esta memoria un metodo para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos (por ejemplo, cada una de las secuencias de un banco de DNA, transcriptoma o genoma) de un modo rapido y econ6mico en un unico tubo de reacci6n. Un uso del metodo es para llevar a cabo la amplificaci6n clonal simultanea (por ejemplo, por peR) de una pluralidad de muestras (tantas como varios cientos de miles) en un recipiente de reacci6n. Esta descripci6n

15 proporciona, ademas, medios para encapsular individualmente una pluralidad de muestras de DNA en una microcapsula de una emulsi6n (es decir, un microrreactor), llevando a cabo simultaneamente la amplificaci6n de la pluralidad de muestras de acido nucleico encapsuladas, y el desprendimiento desde las microcapsulas de dicha pluralidad de DNA amplificada, para efectuar las reacciones subsiguientes.

eopias unicas de las especies de moldes de acidos nucleicos pueden ser hibridadas con perlas de captura que

20 comprenden, por ejemplo, oligonucle6tidos de captura o grupos quimicos que se unen al molde de acido nucleico. Las perlas son suspendidas en una soluci6n de amplificaci6n completa (vease el Ejemplo 2 como ejemplo de una soluci6n de amplificaci6n) y emulsionadas para producir microrreactores (tipicamente de 100 a 200 micr6metros de diametro). Despues de esto, se usa amplificaci6n (por ejemplo, por peR) para aumentar clonalmente en los microrreactores el numero de copias de la especie inicial de molde, y estas copias se unen a las perlas de captura

25 de los microrreactores.

Alternativamente, pueden anadirse perlas de captura a una mezcla de reacci6n de amplificaci6n (por ejemplo, una soluci6n de amplificaci6n del Ejemplo 2) que comprende un molde de acido nucleico, y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. La amplificaci6n (por ejemplo, por peR) se utiliza para aumentar clonalmente en los microrreactores el numero de copias de la especie de molde inicial, y estas copias se unen a las perlas de captura

30 de los microrreactores.

Ventajosamente, los microrreactores permiten la amplificaci6n simultanea clonal y discreta de muchos moldes diferentes sin contaminaci6n cruzada de los productos amplificados o de los reactivos., o el dominio de un molde particular o de una serie de moldes (por ejemplo, predisposici6n de peR). La reacci6n de amplificaci6n, por ejemplo, puede ser llevada a cabo simultaneamente con al menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reacci6n.

35 preferiblemente, cada microrreactor comprende una o pocas especies de molde amplificado.

Los microrreactores pueden tener un tamano medio de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 250 μm. preferiblemente, los microrreactores tienen un diametro medio de aproximadamente 60 a aproximadamente 200 μm. Mas preferiblemente. los microrreactores tienen un diametro medio de aproximadamente 60 μm tal como una media de 40 μm a 80 μm de diametro. Los microrreactores pueden tener un diametro medio de 60 μm aproximadamente.

40 preferiblemente, los microrreactores tienen un volumen medio de aproximadamente 113 pl. Lo mas preferible, aproximadamente 3.000 microrreactores estan contenidos en un microlitro de una emulsi6n de una proporci6n 1:2 de agua a aceite.

La presente descripci6n proporciona tambien un metodo para producir una pluralidad de perlas que llevan molde de acido nucleico, en el que cada perla comprende hasta 1.000.000 de copias y mas de una unica secuencia de acido

45 nucleico. preferiblemente, cada perla puede comprender mas de 20 millones de copias de un unico acido nucleico.

La presente descripci6n proporciona, ademas, un banco de DNA obtenido mediante los metodos de la descripci6n. El banco puede ser obtenido utilizando como material de partida para la amplificaci6n, por ejemplo, un banco de DNA gen6mico, un banco de cDNA, o un banco de plasmidos. El banco puede derivarse desde cualquier poblaci6n de acidos nucleicos, por ejemplo, de origen biol6gico o sintetico.

50 La presente invenci6n proporciona un metodo de enriquecimiento de aquellas perlas que contienen el producto de amplificaci6n de DNA con exito (es decir, por separaci6n de las perlas que no tienen DNA unido).

Descripci6n breve de los dibujos

Figura 1: Representaci6n esquematica de la estructura de una perla de captura de DNA.

Figuras 2A-2B: Representaci6n esquematica de una realizaci6n de un procedimiento de amplificaci6n en emulsi6n en perlas.

Figura 3: Representaci6n esquematica de un procedimiento de enriquecimiento para retirar las perlas que no tienen DNA unido.

5 Figura 4: Representaci6n del patr6n de guia utilizado para alojar tubos sobre la placa de agitaci6n por debajo de la bomba de jeringuillas vertical. El patr6n de guia se modific6 para alojar tres conjuntos de mezclas de reacci6n de amplificaci6n en emulsi6n en perlas. La jeringuilla estaba cargada con la mezcla de peR y las perlas.

Figura 5: Representaci6n de la colocaci6n 6ptima de jeringuillas en la bomba de jeringuillas vertical y orientaci6n de los tubos de emulsi6n por debajo de las salidas de las jeringuillas.

10 Figura 6: Representaci6n de la colocaci6n 6ptima del bloque impulsor de la bomba de jeringuillas contra los embolos de las jeringuillas, y orientaci6n 6ptima del patr6n de guia sobre la placa de agitaci6n. Utilizando esta disposici6n, los contenidos de las jeringuillas fueron expulsados hacia el aceite de la emulsi6n agitado.

Figura 7: Representaci6n de perlas (veanse las flechas) suspendidas en microrreactores individuales segun los metodos de la invenci6n.

15 Figuras 8A-8e: Representaci6n esquematica que muestra las etapas iniciales de amplificaci6n en emulsi6n en perlas usado en conjunci6n con la secuenciaci6n de dobles extremos. La perla activada con NHS (Figura 8A) esta fijada con cebadores de captura (Figura 8B) y encapsulada en un microrreactor que comprende la perla de captura de DNA y el molde (Figura 8e).

Figura 9: Representaci6n esquematica que muestra las etapas de amplificaci6n y captura de la amplificaci6n en

20 emulsi6n en perlas utilizada en asociaci6n con la secuenciaci6n de dobles extremos. El molde es amplificado por peR de fase de soluci6n y los productos de la amplificaci6n estan unidos a la perla de captura de DNA.

Figura 10: Representaci6n esquematica que muestra las etapas finales del procedimiento de amplificaci6n en emulsi6n en perlas, utilizado en asociaci6n con la secuenciaci6n de dobles extremos. La emulsi6n se rompe (Figuras 10A -10B), la segunda cadena del producto de amplificaci6n es separada y se utiliza enriquecimiento para

25 maximizar el numero de perlas unidas con producto de amplificaci6n (Figura 10e), los cebadores de secuenciaci6n son sometidos a hibridaci6n de los acidos nucleicos (Figura 10D) y la primera cadena es secuenciada (Figura 10E), seguido de la segunda cadena.

Descripci6n detallada de la invenci6n

Breve visi6n de conjunto de la amplificaci6n en emulsi6n en perlas

30 Se discute a continuaci6n una breve visi6n de conjunto de una realizaci6n de la invenci6n. Sigue mas adelante una descripci6n mas detallada de cada una de las etapas individuales de esta realizaci6n. En esta realizaci6n la tecnica de amplificaci6n escogida es peR.

En un aspecto de la invenci6n, la amplificaci6n en emulsi6n en perlas se lleva a cabo uniendo el molde (por ejemplo, un molde de DNA) que ha de ser amplificado, a un soporte s6lido, preferiblemente en la forma de una perla 35 generalmente esferica. La perla esta ligada a un gran numero de una especie de un solo cebador (es decir, el cebador B de la Figura 2) que es complementario de una regi6n del DNA del molde, y las copias de amplificaci6n de este molde. Alternativamente, la perla esta ligada a grupos quimicos (por ejemplo, biotina) que pueden unirse a grupos quimicos (por ejemplo, estreptavidina) incluidos en el molde de DNA y copias de amplificaci6n de este molde. Las perlas se suspenden en una mezcla acuosa de reacci6n y luego son encapsuladas en una emulsi6n de agua en

40 aceite. En diferentes aspectos de la invenci6n, el DNA del molde se une a la perla antes de la emulsificaci6n, o el DNA de molde es incluido en soluci6n, en la mezcla de reacci6n de amplificaci6n. En una realizaci6n preferida, se lleva a cabo una etapa de amplificaci6n antes de la distribuci6n de los moldes de acido nucleico en una placa de gran numero de pocillos (por ejemplo, placa de picotitulaci6n).

En ciertas realizaciones, la emulsi6n esta compuesta de microgotitas de fase acuosa discretas, por ejemplo, de un

45 diametro medio de 60 a 200 μm, aproximadamente, incluidas en una fase oleosa termoestable. eada microgotita contiene, preferiblemente, soluci6n de reacci6n de amplificaci6n (es decir, los reactivos necesarios para la amplificaci6n de los acidos nucleicos). Un ejemplo de una soluci6n de reacci6n de amplificaci6n podria ser una mezcla para llevar a cabo una peR (polimerasa, sales, dNTps; vease el Ejemplo 2 como ejemplo de una realizaci6n) y un par de cebadores de peR (cebador A y cebador B). Vease la Figura 2A. En algunos casos el DNA

50 del molde es incluido en la mezcla de reacci6n. Un subconjunto de la poblaci6n de microgotitas incluye la perla con DNA y el molde. Este subconjunto de microgotitas constituye la base de la amplificaci6n. Las microcapsulas restantes no contienen DNA de molde y no participan en la amplificaci6n, En una realizaci6n, la tecnica de amplificaci6n es peR y los cebadores de peR estan presentes en una raz6n de 8:1 6 16:1 (es decir, 8 6 16 de un cebador respecto a 1 del segundo cebador) para efectuar una peR asimetrica. En otra realizaci6n, la raz6n de los

55 cebadores de la peR puede ser sustancialmente igual a la de una peR normal.

La reacci6n de amplificaci6n, tal como peR, puede ser llevada a cabo utilizando cualquier metodo adecuado-En la visi6n de conjunto que sigue, se discute como ilustraci6n un mecanismo de peR. Sin embargo, ha de entenderse que la invenci6n no se limita a este mecanismo. En el ejemplo, una regi6n de la molecula de DNA (regi6n B') es hibridada con un oligonucle6tido inmovilizado en una perla (cebador B). Durante la termociclaci6n (Figura 2B), se

5 rompe la uni6n entre el molde monocatenario y el cebador B inmovilizado en la perla, liberando el molde en la soluci6n microencapsulada circundante. La soluci6n de amplificaci6n, en este caso la soluci6n de peR, contiene la adici6n del cebador A y del cebador B en la fase de soluci6n (por ejemplo, en una proporci6n de 8:1 6 16:1). Los cebadores B de la fase de soluci6n se unen facilmente a la regi6n B' complementaria del molde ya que la cinetica de uni6n es mas rapida para los cebadores en fase de soluci6n que para los cebadores inmovilizados.

10 En la fase precoz de la peR, ambas cadenas A y B se amplifican igualmente bien (Figura 2e). En la fase intermedia de la peR (es decir, entre los ciclos 10 y 30) los cebadores B se agotan, deteniendo una amplificaci6n exponencial. La reacci6n entra entonces en amplificaci6n asimetrica y la poblaci6n de amplicones se hace dominada por las cadenas A (Figura 2D). En la fase tardia de la peR (Figura 2E) despues de 30 a 40 ciclos, la amplificaci6n asimetrica aumenta la concentraci6n de cadenas A en soluci6n. El exceso de cadenas A comienza a hibridarse con

15 los cebadores B inmovilizados en las perlas. polimerasas termoestables utilizan entonces la cadena A como molde para sintetizar una cadena B del amplic6n inmovilizada, unida a la perla.

En la fase final de la peR (Figura 2F) la ciclaci6n termica continuada fuerza una hibridaci6n adicional con los cebadores unidos a las perlas. La amplificaci6n en fase de soluci6n puede ser minima en esta etapa pero la concentraci6n de cadenas B inmovilizadas aumenta. Luego, la emulsi6n se rompe y el producto inmovilizado se 20 hace monocatenario por desnaturalizaci6n (por calor, pH, etc.) lo que separa la cadena A complementaria. Los cebadores A son hibridados con la regi6n A' de la cadena inmovilizada, y la cadena inmovilizada es cargada con enzimas de secuenciaci6n, y cualesquiera proteinas accesorias necesarias. Las perlas, son secuenciadas despues empleando tecnicas de pirofosfato reconocidas (descritas, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos. 6.274.320,

6.258.568 y 6.210.891).

25 Diseno de moldes

En una realizaci6n preferida, el molde de acido nucleico que ha de ser amplificado por amplificaci6n en emulsi6n en perlas es una poblaci6n de DNA tal como, por ejemplo, un banco de DNA gen6mico o un banco de cDNA. Se prefiere que todos los miembros de la poblaci6n de DNA tengan una secuencia comun de acido nucleico en el primer extremo y una secuencia comun de acido nucleico en un segundo extremo. Esto puede conseguirse, por 30 ejemplo, ligando una primera secuencia de DNA adaptador a un extremo y una segunda secuencia de DNA adaptador a un segundo extremo de cada uno de los miembros de la poblaci6n de DNA. Muchos bancos de DNA y de cDNA, debido a la naturaleza del vector de clonaci6n (por ejemplo, Bluescript, Stratagene, La Jolla, eA) se ajustan a esta descripci6n de tener una secuencia comun es un primer extremo y una segunda secuencia comun en un segundo extremo de cada miembro de DNA. El molde de acido nucleico puede tener cualquier tamano que

35 permita la amplificaci6n in vitro (que incluyen las tecnicas de amplificaci6n preferidas de peR y peR asimetrica). En una realizaci6n preferida, el molde tiene un tamano de 150 a 750 bp aproximadamente, por ejemplo, un tamano de 250 bp aproximadamente.

Uni6n de moldes de acido nucleico a perlas de captura

En un aspecto de la invenci6n, el molde de acido nucleico monocatenario que ha de ser amplificado se une a una

40 perla de captura. El molde puede ser capturado en la perla antes de la emulsificaci6n o despues de haber sido formada la emulsi6n. En un aspecto preferido, las copias de amplificaci6n del molde de acido nucleico se unen a una perla de captura. eomo ejemplos no limitativos, estas uniones pueden tener lugar con mediaci6n por grupos quimicos u oligonucle6tidos que se unen a la superficie de la perla. El acido nucleico (por ejemplo, el molde de acido nucleico, las copias de amplificaci6n, o los oligonucle6tidos) pueden fijarse al soporte s6lido (por ejemplo, una perla

45 de captura) de cualquier modo conocido en la tecnica.

Segun la presente invenci6n, el enlace covalente quimico de un acido nucleico a la perla puede conseguirse usando agentes estandar de copulaci6n. por ejemplo, puede usarse una carbodiimida hidrosoluble para ligar el 5'-fosfato de una secuencia de DNA con perlas de captura revestidas con una amina por medio de un enlace de fosfoamidato. Alternativamente, oligonucle6tidos especificos pueden copularse a la perla utilizando una tecnica quimica similar, y

50 despues puede utilizarse DNA ligasa para ligar el molde de DNA al oligonucle6tido situado sobre la perla. Otras tecnicas quimicas de ligamiento para unir el oligonucle6tido a las perlas, incluyen el uso de N-hidroxisuccinamida (NHS) y sus derivados.

En un metodo que sirve de ejemplo, un extremo de un engarce puede contener un grupo reactivo (tal como un grupo amida) que forma un enlace covalente con el soporte s6lido, mientras que el otro extremo del engarce contiene un

55 segundo grupo reactivo que puede unirse con el oligonucle6tido que ha de ser inmovilizado. En una realizaci6n preferida, el oligonucle6tido se une a la perla de captura de DNA mediante enlace covalente. Sin embargo, enlaces no covalentes tales como quelaci6n o complejos de antigeno-anticuerpo, pueden ser utilizados tambien para fijar el oligonucle6tido a la perla.

eomo ejemplos no limitativos, pueden emplearse oligonucle6tidos que se hibriden especificamente con secuencias unicas situadas en el extremo del fragmento de DNA, tal como el extremo de superposici6n procedente de un sitio de una enzima de restricci6n o los "extremos adhesivos" de vectores de clonaci6n. , pero tambien pueden usarse engarces de extremos romos. Estos metodos estan descritos con detalle en la patente de EE.UU. No. 5.674.743. Se

5 prefiere que las perlas continuen fijando el oligonucle6tido inmovilizado en todas las etapas de los metodos de la invenci6n.

En una realizaci6n de la invenci6n, cada perla de captura esta disenada para que tenga una pluralidad de oligonucle6tidos que reconocen, es decir, son complementarios de una parte del molde de acido nucleico, y de las copias de amplificaci6n de este molde. En los metodos descritos en esta memoria, se desea la amplificaci6n clonal

10 de la especie de molde, asi que se prefiere que solo una unica especie de acido nucleico se una a una cualquiera de las perlas de captura.

Las perlas utilizadas en esta invenci6n pueden tener cualquier tamano conveniente y fabricarse partiendo de muchos materiales conocidos. eomo ejemplos de tales materiales se incluyen: materiales inorganicos, polimeros naturales y polimeros sinteticos. eomo ejemplos especificos de estos materiales se incluyen celulosa, derivados de 15 celulosa, resinas acrilicas, vidrio, geles de silice, poliestireno, gelatina, polivinilpirrolidona, copolimeros de vinil-y acrilamida, poliestireno reticulado con divinilbenceno, o semejantes ( segun ha sido descrito por ejemplo, por Merrifield en Biochemistry 1964, 3, 1385-1390), poliacrilamidas, geles de latex, poliestireno, dextrano, caucho, silicona, plasticos, nitrocelulosa, esponjas naturales, geles de silice, vidrio de poro controlado, metales, dextranos reticulados (por ejemplo, Sephadex™) geles de agarosa (Sepharose™) y otros soportes de fase s6lida conocidos por

20 los expertos en la tecnica. En realizaciones preferidas, las perlas de captura son perlas de 2 a 100 μm de diametro, aproximadamente, 6 10 a 80 μm de diametro, y, lo mas preferible, de 20 a 40 μm de diametro. En una realizaci6n preferida, las perlas de captura son perlas de Sepharose.

Emulsificaci6n

para usar con la presente invenci6n, las perlas de captura con o sin molde de acido nucleico unido, estan

25 suspendidas en una emulsi6n de agua en aceite termoestable. Se contempla que una pluralidad de los microrreactores incluyan solamente un molde y una perla. puede haber muchas gotitas que no contienen un molde

o que no contienen una perla. Del mismo modo puede haber gotitas que contienen mas de una copia de un molde. La emulsi6n puede formarse segun cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Un metodo para crear una emulsi6n se describe mas adelante pero puede emplearse cualquier metodo utilizado para formar una emulsi6n.

30 Estos metodos son conocidos en la tecnica e incluyen metodos con adyuvantes, metodos a contracorriente, metodos de corrientes cruzadas, metodos de tambor giratorio, y metodos de membrana, Ademas, el tamano de las microcapsulas puede ajustarse variando el caudal y la velocidad de los componentes. por ejemplo, en adici6n gota a gota, el tamano de las gotas y el tiempo total de distribuci6n pueden variarse. preferiblemente, la emulsi6n contiene una densidad de aproximadamente 3.000 perlas encapsuladas por microlitro.

35 A varias emulsiones adecuadas para reacciones biol6gicas, aluden Griffiths y Tawfick, en EMBO, 22, paginas 2436 (2003); Ghadessy et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, paginas 4552-4557 (2001); patente de EE.UU. No.

6.489.103 y el documento WO 02/22869.

Hay que hacer notar que Griffiths et al. (patente de EE.UU. No. 6.489.103 y documento WO 99/02671) se refieren a un metodo de clasificaci6n in vitro de uno o mas elementos geneticos que codifican productos genicos que poseen

40 una actividad deseada. Este metodo implica compartimentalizar un gen, expresar el gen y clasificar el gen compartimentalizado basandose en el producto expresado. por contraste con la presente invenci6n, el metodo de Griffiths de clasificaci6n de microencapsulados no es adecuado para el analisis paralelo de muchas microcapsulas debido a que su producto de acido nucleico no esta fijado y no puede ser fijado. Dado que los acidos nucleicos de Griffiths no estan fijados, podrian mezclarse durante la desemulsificaci6n.

45 La emulsi6n se genera, preferiblemente, anadiendo perlas a una soluci6n de amplificaci6n. Tal como se emplea en esta memoria, la expresi6n "soluci6n de amplificaci6n" significa la mezcla suficiente de reactivos que es necesaria para realizar la amplificaci6n de DNA de molde. Un ejemplo de una soluci6n de amplificaci6n, una soluci6n de amplificaci6n de peR, se proporciona en los Ejemplos que figuran mas adelante. Ha de apreciarse que pueden llevarse a cabo diversas modificaciones de la soluci6n de amplificaci6n basandose en el tipo de amplificaci6n a

50 realizar y en si el DNA de molde esta unido a las perlas o se proporciona en soluci6n. En una realizaci6n, la mezcla de perlas y de la soluci6n de amplificaci6n se anade gota a gota a una mezcla en rotaci6n de un aceite biocompatible (por ejemplo, aceite mineral ligero, Sigma) y se deja emulsionar. En otra realizaci6n, las perlas y la soluci6n de amplificaci6n se anaden gota a gota a contracorriente con el aceite biocompatible. El aceite utilizado puede ser suplementado con uno o mas estabilizantes de emulsiones biocompatibles. Estos estabilizantes de

55 emulsiones pueden incluir Atlox 4912, Span 80 y otros estabilizantes de emulsiones reconocidos y de los que se dispone en el comercio. En aspectos preferidos la emulsi6n es termoestable lo que permite la ciclaci6n termica, por ejemplo, hasta por lo menos 94°e, por lo menos 95°e o, por lo menos, 96°e. preferiblemente, las gotitas formadas varian en tamano desde aproximadamente 5 micr6metros hasta aproximadamente 500 micr6metros, mas preferiblemente, desde aproximadamente 10 micr6metros hasta aproximadamente 350 micr6metros, aun mas

60 preferiblemente, desde aproximadamente 50 a 250 micr6metros y, lo mas preferible, desde aproximadamente 100 micr6metros hasta aproximadamente 200 micr6metros. Ventajosamente, la mezcla de fluidos a contracorriente permite regular la formaci6n de las gotitas y la uniformidad del tamano de la gotita. El solicitante ha observado que pueden estar presentes en la emulsi6n gotitas de agua mas pequenas que no contienen perlas.

Los microrreactores deben ser lo suficientemente grandes para encerrar reactivos de amplificaci6n suficientes para

5 el grado de amplificaci6n que se requiera, Sin embargo, debe ser lo suficientemente pequenos para que pueda amplificarse mediante un equipo convencional de laboratorio una poblaci6n de microrreactores cada uno de los cuales contiene un miembro de un bando de DNA, por ejemplo, un equipo de termociclaci6n de peR, tubos de ensayo, incubadores y equipaci6n semejante. Notablemente, el uso de microrreactores permite amplificar mezclas complejas de moldes (por ejemplo, muestras de DNA gen6mico o RNA de celulas totales) sin entremezclas de

10 secuencias o dominio de uno o mas moldes (por ejemplo, predominio de selecci6n de peR, veanse las publicaciones de Wagner et al., 1994; Suzuki y Giovannoni, 1996; ehandler et al., 1997; polz y eavanaugh, 1996)

eon las limitaciones anteriormente descritas, el tamano 6ptimo de un microrreactor puede tener, por termino medio, un diametro de 100 a 200 micr6metros. Los microrreactores de este tamano permitirian amplificar un banco de DNA que comprendiera aproximadamente 600.000 miembros, en una suspensi6n de microrreactores de un volumen 15 menor que 10 ml. por ejemplo, si peR es el metodo de amplificaci6n escogido, 10 ml de microrreactores podrian ajustarse en 96 tubos de un aparato de termociclaci6n regular con capacidad para 96 tubos. En una realizaci6n preferida la suspensi6n de 600.000 microrreactores podria tener un volumen menor que 1 ml. Una suspensi6n de volumen menor que 1 ml puede ser amplificada en aproximadamente 10 tubos de un aparato de termociclaci6n convencional de peR. En la realizaci6n mas preferida, la suspensi6n de 600.000 microrreactores podria tener un

20 volumen menor que 0,5 ml.

Otra realizaci6n de la invenci6n se dirige a un metodo para llevar a cabo la amplificaci6n de acidos nucleicos con un molde y una perla, pero sin uni6n del molde a la perla. En un aspecto, la perla puede comprender una molecula de engarce que puede unir el acido nucleico amplificado despues de la amplificaci6n. por ejemplo, el engarce puede ser un engarce que pueda ser activado. Tales engarces son bien conocidos e incluyen pares de uni6n sensibles a la

25 temperatura o sensibles a las sales, tales como estreptavidina/biotina y antigeno/anticuerpos. El acido nucleico de molde puede ser encapsulado con una perla y amplificado. Despues de la amplificaci6n, el acido nucleico amplificado puede ligarse a las perlas, por ejemplo, ajustando la temperatura o la concentraci6n salina.

Amplificaci6n

Despues de encapsular, el acido nucleico de molde puede ser amplificado, mientras esta unido o sin unir a perlas,

30 mediante cualquier metodo de amplificaci6n adecuado que incluye sistemas de amplificaci6n basados en transcripci6n (Kwoh D. et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989); Gingeras T.R. et al., documento WO 88/10315; Davey et al., publicaci6n de Ep No. 329.822; Miller, H.I. et al., documento WO 89/06700, "RAeE" (Frohman, M.A. en :peR protocols; A Guide to Methods and Applications, Academic press. NY (1990) y peR de un lado (Ohara, O. et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5673-5677 (1989)). Todavia otros metodos tales como

35 amplificaci6n de dioligonucle6tidos, amplificaci6n isotermica (Walker, G.T. et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:392396 (1992)). Amplificaci6n basada en las secuencias de acidos nucleicos (NASBA; vease, por ejemplo, la publicaci6n de Deiman, B. et al., en Mol. Biotechnol. 20(2): 163-79, 2002), amplificaci6n del genoma total (vease, por ejemplo, la publicaci6n de Hawkins, TL. et al., en eurr Opin Biotechnol. 13(1):65-7, 2002), amplificaci6n por desplazamiento de cadena (vease, por ejemplo, la publicaci6n de Andras, Se. en Mol. Biotechnol.19(1): 29-44,

40 2001), amplificaci6n en circulo rodante (revisado en la patente de EE.UU. No. 5.714.320), asi como otras tecnicas bien conocidas, pueden emplearse segun la presente invenci6n.

En una realizaci6n preferida la amplificaci6n de DNA se realiza por peR. La peR segun la presente invenci6n puede llevarse a cabo encapsulando el acido nucleico diana con una soluci6n de peR que comprende todos los reactivos necesarios para realizar la peR. Despues, puede llevarse a cabo la peR exponiendo la emulsi6n a cualquier 45 regimen adecuado de termociclaci6n conocido en la tecnica. En una realizaci6n preferida se efectuan 30 a 50 ciclos, de amplificaci6n, de preferencia, aproximadamente, 40 ciclos. Es deseable, pero no necesario, que despues del procedimiento operatorio de amplificaci6n haya uno o mas ciclos de hibridaci6n y extensi6n que sigan a los ciclos de amplificaci6n. En una realizaci6n preferida se efectuan 10 a 30 ciclos, de preferencia aproximadamente 25 ciclos, de hibridaci6n y extensi6n (por ejemplo, segun se describe en los ejemplos). Rutinariamente, el DNA de molde es 50 amplificado hasta que, tipicamente, al menos 10.000 a 50.000.000, de copias estan inmovilizadas sobre cada perla. Se reconoce que para aplicaciones de detecci6n de acidos nucleicos, se necesitan menos copias del molde. para aplicaciones de secuenciaci6n de acidos nucleicos se prefiere que al menos dos millones a cincuenta millones de copias, de preferencia aproximadamente diez millones a treinta millones de copias del DNA de molde, esten inmovilizadas en cada perla. Los expertos en la materia reconoceran que el tamano de la perla (y el sitio de captura

55 sobre ella) determina cuantos cebadores cautivos pueden estar unidos (y por tanto, cuantos moldes amplificados pueden ser capturados sobre cada perla).

Diseno de cebadores de peR

La selecci6n de cebadores de acido nucleico para amplificaci6n, tal como amplificaci6n por peR, se encuentra dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica. Estrategias para el diseno de cebadores pueden encontrarse

en la bibliografia cientifica, por ejemplo, en la publicaci6n de Rubin, E. y A.A. Levy, Nucleic Acids Res. 24(18), paginas 3538-45, 1996; y de Buck, G.A. et al., en Biotechniques, 27(3); paginas 528-36, 1999. En una realizaci6n preferida los cebadores pueden limitarse a una longitud de 20 bases (5 tetrameros) para sintesis eficaces de cebadores bipartitos de peR/secuenciaci6n. eada cebador puede incluir una "grapa" de Ge de dos bases sobre el 5 extremo 5', y una grapa de Ge, unica, sobre el extremo 3', y todos los cebadores pueden compartir una Tm similar (+/-2°e). En una realizaci6n preferida estructuras de forma de horquilla en el interior de los cebadores (vastagos internos de forma de horquilla ΔG> -1,9 kcal/mol) son fuertemente desestimadas en cualquiera de los cebadores disenados. En otra realizaci6n preferida se controla tambien la dimerizaci6n del cebador, para permitir un dimero aceptable de 3 bases como maximo. No obstante, se permite que ocurra solamente en las seis bases de 3' finales y

10 que la ΔG maxima permisible para un dimero de 3' sea -2,0 kcal/mol. preferiblemente, se aplica una penalizaci6n a los cebadores en los que los extremos 3' son demasiado similares a otros del grupo. Esto evita la hibridaci6n cruzada entre un cebador y el complemento inverso de otro cebador.

Si los cebadores han sido disenados segun los criterios descritos, la posibilidad de regiones favorables que ocurran dentro del genoma de interes, no tiene mayor importancia, a pesar de la tolerancia indicada de la peR a 15 desigualdades en poblaciones de muestras complejas (Rubin, E. y A.A. Levy, Nucleic Acids Res. 24(18); p. 3548-45, 1996). Aun cuando la probabilidad de encontrar una igualdad perfecta para un cebador de 20 bases es extremadamente baja (420) (vease la Tabla 1), la probabilidad de encontrar igualdades no consecutivas mas cortas aumenta significativamente con el tamano del genoma de interes. eomo resultado, la probabilidad de descubrir una igualaci6n perfecta para una secuencia de al menos 10 de 20 bases es 99,35% para un genoma de Adenovirus. La

20 probabilidad de encontrar una igualaci6n perfecta para una secuencia de 16 bases es 97% para las secuencias de la base de datos de NeBI (aproximadamente 100 veces mas informaci6n de secuencias que el genoma de Adenovirus). La probabilidad de descubrir una igualaci6n perfecta para una secuencia de 17 a 20 bases es 99% para el genoma humano (aproximadamente tres mil millones de bases)

Tabla 1: La probabilidad de igualaciones secuenciales perfectas para cebadores aumenta con la disminuci6n de los requisitos de longitud de igualaci6n y el aumento de tamano del genoma de interes

Longitud de igualaci6n

probabilidad de igualaci6n perfecta (1/(4Alongitud)) % de probabilidad de igualaci6n en Adeno ∼35 Kbases % de probabilidad de igualaci6n en la base de datos de bacterias de NeBI 488 M de bases % de probabilidad de igualaci6n en el genoma humano 3 mil millones de bases

20

9,1E-13 0,00% 0,04% 0,27%

19

7,3E-12 0,00% 0,65% 4,32%

18

4,4E-11 0,00% 5,76% 34,37%

17

2,3E-10 0,00% 35,69% 99,17%

16

1,2E-09 0,02% 97,52% >100%

15

5,6E-09 0,12% >100% >100%

14

2,6E-08 0,64% >100% >100%

13

1,2E-07 3,29% >100% >100%

12

5,4E-07 15,68% >100% >100%

11

2,4E-06 68,16% >100% >100%

10

1,0E-05 99,35% >100% >100%

9

4,6E-05 99,77% >100% >100%

8

2,0E-04 >100% >100% >100%

7

8,5E-04 >100% >100% >100%

6

3,7E-03 >100% >100% >100%

5

1,6E-02 >100% >100% >100%

4

6,4E-02 >100% >100% >100%

3

2,5E-01 >100% >100% >100%

2

7,1E-01 >100% >100% >100%

1

1,0E+00 >100% >100% >100%

Sin embargo, la hibridaci6n cruzada de cebadores con diversas regiones del genoma es menos problematica de lo que podria esperarse debido a la digesti6n aleatoria de DNA utilizada para formar los moldes de acido nucleico. Las regiones de hibridaci6n cruzada (eHRs) son claramente benignas. En primer lugar, es improbable que una eHR pudiera ser capaz de competir con exito con la igualaci6n perfecta entre los cebadores de peR en soluci6n y el 5 molde. Ademas, cualesquiera cebadores que incluyan desigualdades en sus extremos 3' estaran en una desventaja competitiva importante. Incluso si una eHR pudiera competir con el cebador de peR pretendido, esto daria lugar a un producto de peR truncado, sin un lugar situado aguas abajo para el cebador de secuenciaci6n. Si el producto truncado pudiera conducirse hacia la perla de captura e inmovilizarse en elle, podrian resultar una de dos situaciones. Si la eHR compitiera con el cebador en fase de soluci6n, el producto inmovilizado careceria de un sitio de uni6n del cebador de secuenciaci6n, y podria dar por resultado un pocillo vacio de la placa de picotitulaci6n (pTp). Si la eHR entrara en competencia con el cebador unido a la perla, el cebador de secuenciaci6n estaria presente todavia, y el unico efecto seria una inserci6n mas corta. Ninguno de los dos resultados comprometeria indebidamente la calidad de la secuencia. Dada la gran cantidad de material gen6mico que se usa en el procedimiento de preparaci6n de las muestras (habitualmente 25 μg, que contienen 5,29 x 1016 copias del genoma

15 de Adenovirus de 35 Kb), puede usarse puede usarse un muestreo especifico para proporcionar fragmentos que carecen de la eHR completa y que permiten la amplificaci6n estandar por peR de la regi6n en cuesti6n.

Rotura de la emulsi6n y recuperaci6n de las perlas

Despues de la amplificaci6n del molde de acido nucleico y de la uni6n de las copias de la amplificaci6n a la perla, la emulsi6n se "rompe" (a lo que se denomina tambien en la tecnica "desemulsificaci6n"). Existen muchos metodos de rotura de una emulsi6n (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5.989.892 y las referencias bibliograficas citadas en ella) y un experto en la tecnica seria capaz de seleccionar un metodo apropiado. En la presente invenci6n, un metodo preferido de rotura de la emulsi6n emplea aceite adicional para hacer que la emulsi6n se separe en dos fases. La fase oleosa se retira luego y se anade un disolvente organico adecuado (por ejemplo, hexanos). Despues de mezclar, se separa la fase de aceite/disolvente organico. Esta etapa puede repetirse varias

25 veces. Finalmente, se retiran las capas acuosas situadas por encima de las perlas. Luego se lavan las perlas con una mezcla de un disolvente organico y tamp6n de hibridaci6n (en los ejemplos se describe un tamp6n de hibridaci6n adecuado) y despues se lava de nuevo con tamp6n de hibridaci6n. Los disolventes organicos adecuados incluyen alcoholes tales como metanol, etanol y semejantes.

Las perlas unidas con productos de amplificaci6n pueden volver a suspenderse despues en el seno de una soluci6n acuosa para usarlas, por ejemplo, en una reacci6n de secuenciaci6n segun tecnologias conocidas. (Veanse las publicaciones de Sanger, F. et al., proc. Natl-Acad. Sci. USA, 75, 5463-5467 (1977); Maxam, A.M. y Gilbert, W. proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564 (1977); Ronaghi, M. et al., Science 281, 363, 365 (1998); Lysov, I. et al., Dokl. Akad. Nauk. SSSR 303, 1508-15511 (1988); Bains, W y Smith G.e. J. Theor. Biol. 135, 303-307 (1988); Dmanac, R. et al., Genomics 4, 114-128 (1989); Khrapko, K.R. et al., FEBS Lett. 256, 118-122 (1989); pevzner p.A.

35 J. Biomol. Struct. Dyn. 7, 63-73 (1989); Southern, E.M. et al., Genomics 13, 1008-1017 (1992)).

Si las perlas han de ser usadas en una reacci6n de secuenciaci6n a base de pirofosfato (descrita, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos. 6.274.320, 6.258.568 y 6.210.891, entonces es necesario retirar la segunda cadena del producto de la peR e hibridar un cebador de secuenciaci6n con el molde monocatenario que esta unido a la perla. La segunda cadena puede ser dispersada usando cualquiera de los diversos metodos conocidos comunmente, tales como adici6n de NaOH, aplicaci6n de compuestos de baja resistencia i6nica (por ejemplo, sales), degradaci6n enzimatica o desplazamiento de la segunda cadena, o tratamiento por calor. Despues de esta etapa de separaci6n de la cadena, las perlas son sometidas a peletizaci6n y se desecha el sobrenadante. Las perlas se vuelven a suspender en tamp6n de hibridaci6n y se anade un cebador de secuenciaci6n u otro cebador de no amplificaci6n. El cebador es hibridado con el producto de amplificaci6n monocatenario. Esto puede realizarse

45 usando un tamp6n de hibridaci6n de los acidos nucleicos apropiado y condiciones de temperatura adecuadas, por ejemplo, segun procedimientos operatorios estandar en la tecnica.

purificaci6n de las perlas

En este punto, el acido nucleico amplificado situado sobre las perlas puede ser secuenciado o bien directamente sobre la perla o bien en un recipiente de reacci6n diferente. El acido nucleico puede ser secuenciado directamente sobre las perlas haciendo pasar las perlas a un recipiente de reacci6n y sometiendo el acido nucleico a una reacci6n de secuenciaci6n (por ejemplo, secuenciaci6n con pirofosfato o secuenciaci6n de Sanger). Alternativamente, las perlas pueden ser aisladas y el acido nucleico puede ser retirado de las perlas y secuenciado. En cualquiera de los dos casos, las etapas de secuenciaci6n pueden ser llevadas a cabo sobre cada perla individual. Sin embargo, este metodo, aun cuando viable desde el punto de vista comercial y tecnicamente posible, puede no ser el mas eficaz

55 debido a que muchas de las perlas pueden ser perlas "negativas" ( es decir, perlas sin acido nucleico amplificado unido). En tales casos, puede emplearse el procedimiento opcional descrito seguidamente, para separar las perlas negativas antes de la distribuci6n en placas de gran numero de pocillos (por ejemplo, de picotitulaci6n)

Un alto porcentaje de las perlas pueden ser negativas si el objetivo es minimizar el numero de perlas que estan asociadas con dos o mas especies diferentes de moldes de acido nucleico. para una secuenciaci6n 6ptima con pirofosfatos, cada perla debe contener multiples copias de una unica especie de acido nucleico. Esto puede conseguirse maximizando el numero total de perlas combinadas con un fragmento unico de acido nucleico antes de la amplificaci6n. por ejemplo, puede utilizarse el modelo matematico que figura a continuaci6n

para el caso general de un numero N de DNAs distribuidos aleatoriamente, con un numero M de perlas, la poblaci6n relativa de perlas asociadas con cualquier numero de DNAs, depende de la raz6n N/M. La fracci6n de perlas asociadas con N DNAs, R(N), puede calcularse utilizando la distribuci6n de poisson:

R(N) = exp -(N/M) x (N/M)N/NI (x es el simbolo de multiplicaci6n)

La tabla 2 que figura a continuaci6n muestra algunos valores calculados para diversas N/M (la raz6n media de fragmento de DNA a perla) y N (el numero de fragmentos asociados con una perla).

Tabla 2

N/M

0,1 0,5 1 2

R(0)

0,9 0,61 0,37 0,13

R(1)

0,09 0,3 0,37 0,27

R(N>1)

0,005 0,09 0,26 0,59

10 En la tabla 2, la fila superior denota las diversas razones de N/M, R(0) denota la fracci6n de perlas sin DNA, R(1) denota la fracci6n de perlas con un DNA (antes de amplificar) y R(N>1) denota la fracci6n de DNA con mas de un DNA (antes de amplificar).

La Tabla 2 indica que la fracci6n maxima de perlas asociadas con un solo fragmento de DNA es 0.37 (37%) y esto tiene lugar en una raz6n de fragmento a perla de uno a uno. En esta mezcla aproximadamente el 63% de las perlas

15 no puede ser utilizada para la secuenciaci6n debido a que o no estan asociadas con DNA o estan asociadas con mas de una especie de DNA. Sin embargo, el control de la raz6n de fragmento a perla requiere calculos complejos y la variabilidad puede producir lotes de perlas con una fracci6n significativamente menor de perlas utilizables.

Esta ineficacia puede ser mejorada de modo importante si las perlas que contienen amplic6n (procedentes de la asociaci6n con al menos un fragmento) son separadas de las que no contienen amplic6n (procedentes de perlas sin 20 fragmentos asociados). Un amplic6n se define como cualesquiera moleculas de acido nucleico producidas mediante una tecnica de amplificaci6n de acidos nucleicos in vitro. para aumentar la eficacia , la uni6n puede llevarse a cabo empleando razones bajas de fragmento a perla (N/M < 1). Esto minimiza el numero de perlas asociadas con mas de un DNA. puede utilizarse una etapa de separaci6n para retirar la mayor parte o la totalidad de las perlas sin DNA, quedando una poblaci6n enriquecida de perlas con una o mas especies de DNA amplificado. Esta poblaci6n

25 enriquecida puede analizarse por cualquier metodo de secuenciaci6n tal como, por ejemplo, secuenciaci6n con pirofosfato. Debido a que la fracci6n de perlas con un amplic6n (N = 1) esta enriquecida, puede utilizarse mas eficazmente cualquier metodo de secuenciaci6n.

eomo ejemplo, con una raz6n media de fragmento a perla de 0,1, el 90% de las perlas no llevara amplic6n, el 9% de las perlas llevara un amplic6n, y el 0,55% de las perlas llevara mas de un amplic6n. El enriquecimiento descrito

30 en esta memoria mas adelante permite separar el 90% de las perlas con amplic6n cero, quedando una poblaci6n de perlas en la que la fracci6n disponible para la secuenciaci6n (N = 1) es:

1 -(0,005/0,09) = 94%

La diluci6n de la raz6n de fragmento a perla junto con la separaci6n de perlas que contienen amplic6n, puede proporcionar un enriquecimiento de 2,5 veces sobre el metodo sin enriquecer 6ptimo. por ejemplo, 94%/37% (vease 35 la Tabla 2 anterior. N/M = 1) = 2,5. Un beneficio adicional del procedimiento operatorio de enriquecimiento descrito en esta memoria mas adelante, es que la fracci6n ultima de perlas utiles para la secuenciaci6n es relativamente insensible a la variabilidad de N/M. por tanto, o bien son innecesarios calculos complejos para deducir la raz6n 6ptima de N/M, o bien pueden realizarse con niveles inferiores de precisi6n. por consiguiente, los metodos de la invenci6n pueden adaptarse facilmente para utilizar por personal menos entrenado o para automatizar. Un beneficio 40 adicional de estos metodos es que las perlas con amplic6n cero pueden reciclarse y volver a utilizarlas. Aun cuando el reciclamiento no es necesario, puede disminuir el coste o la masa total de reactivos, haciendo que el metodo de la invenci6n sea mas adecuado para algunos fines tales como, por ejemplo, muestreo portatil, muestreo rob6tico por control remoto, y semejantes. Ademas, los beneficios colectivos de los metodos descritos (por ejemplo, la adaptaci6n a personal menos entrenado, automatizaci6n y reciclamiento de reactivos) pueden reducir los costes de

45 los metodos. El procedimiento operatorio de enriquecimiento se describe con detalle a continuaci6n.

El procedimiento operatorio de enriquecimiento puede ser empleado para tratar perlas que han sido amplificadas por el metodo de emulsi6n en perlas descrito. La amplificaci6n esta disenada de modo que cada molecula de acido nucleico amplificada contenga la misma secuencia en su extremo 3'. La secuencia de nucle6tidos puede ser un 20-mero, pero puede ser cualquier secuencia desde 15 bases o mas, tal como 25 bases, 30 bases, 35 bases, 40 bases, o mas largas. Aun cuando son funcionales extremos mas largos de oligonucle6tidos, no son necesarios. Esta secuencia de 3' puede ser introducida en el extremo de un acido nucleico amplificado por un experto en la tecnica. por ejemplo, si se usa peR para amplificar un molde de DNA, la secuencia puede ser incluida como parte de un miembro del par de cebadores de la peR,

5 Una representaci6n esquematica del procedimiento de enriquecimiento se indica en la Figura 3. En este procedimiento, la perla con amplic6n unido se mezcla con cuatro perlas vacias creando una mezcla de fragmento y perla de amplificaci6n diluida. En la etapa 1 un cebador biotinilado complementario del extremo 3' del amplic6n es sometido a hibridaci6n de extremos complementarios con el amplic6n. En la etapa 2, DNA polimerasa y los cuatro desoxinucle6tido trifosfatos naturales (dNTps) se anaden a la mezcla de perlas y se extiende el cebador biotinilado.

10 Esta extensi6n es para intensificar la uni6n entre el cebador biotinilado y el DNA unido a la perla. Esta etapa puede omitirse si la uni6n de cebador biotinilado y DNA es fuerte (por ejemplo, en un medio ambiente de alta fuerza i6nica). En la etapa 3, perlas revestidas con estreptavidina capaces de ser atraidas por un campo magnetico (a cuyas perlas se alude en esta memoria como "perlas magneticas con estreptavidina" ) se introducen en las mezclas de perlas. perlas magneticas pueden obtenerse en el comercio, por ejemplo, de Dynal (M290). Los restos de captura de

15 estreptavidina ligan los grupos de biotina hibridados a los amplicones, uniendo las perlas con amplic6n unido con las perlas magneticas con estreptavidina.

En la etapa 5, un campo magnetico (representado por un iman) es situado cerca de la mezcla de reacci6n, lo que hace que los complejos de perlas magneticas con estreptavidina/ perlas con amplic6n unido, se situen a lo largo de un lado del tubo mas cercano al campo magnetico. Tambien es de esperar que las perlas magneticas sin perlas con 20 amplic6n unido fijadas, se situen a lo largo del mismo lado. Las perlas sin amplicones permanecen en soluci6n. La mezcla de perlas se lava y las perlas sin fijar por el iman (es, decir, las perlas vacias) son separadas y desechadas. En la etapa 6, la cadena de cebador biotinilado extendida se separa de la cadena de amplic6n por "fusi6n". Esta etapa. puede llevarse a cabo, por ejemplo, por calor o mediante un cambio de pH. El calor puede ser el correspondiente a 60°e en condiciones de baja concentraci6n salina (por ejemplo, en un medio ambiente de baja 25 fuerza i6nica tal como SSe 0,1X). El cambio de pH puede conseguirse mediante la adici6n de NaOH. Seguidamente, se lava la mezcla y se recoge el sobrenadante que contiene las perlas con amplic6n unido, mientras que las perlas magneticas son retenidas por el campo magnetico. Las perlas enriquecidas que resultan pueden ser utilizadas para la secuenciaci6n de DNA. Ha de apreciarse que el cebador sobre la perla de captura de DNA puede ser el mismo que el cebador de la etapa 2 anterior. En este caso, la hibridaci6n del amplic6n con cadenas

30 complementarias del cebador (con o sin extensi6n) es el origen de la afinidad de captura-diana.

El par biotina-estreptavidina podria reemplazarse por una diversidad de pares de captura-diana. por ejemplo, los pares de captura-diana pueden emplear ligamientos reversibles (por ejemplo, desdoblables) o ligamientos irreversibles. eomo ejemplos no limitativos de ligamientos reversibles se incluyen los ligamientos tiol-tiol, digoxigenina/antidigoxigenina, y los ligamientos que emplean VEeTREX®Avidin DLA (Vector Laboratories,

35 Burlingame, eA), eaptAvidin™, NeutrAvidin™ y D-destiobiotina (Molecular probes, Inc., Eugene, OR).

Segun se ha descrito antes, la etapa 2 del procedimiento de enriquecimiento es opcional. Si se omite la etapa 2, puede no ser necesario separar las perlas magneticas de las perlas con amplic6n unido. Las perlas con amplic6n unido, con las perlas magneticas fijadas pueden usarse directamente para la secuenciaci6n. por ejemplo, no es necesaria la separaci6n si la secuenciaci6n ha de ser llevada cabo en una placa de microtitulaci6n o de

40 picotitulaci6n, y el complejo de perla con amplic6n unido y perla magnetica puede ajustarse dentro del pocillo de la placa.

Aun cuando el uso de perlas de captura magneticas es conveniente, los restos de captura pueden abarcar otras superficies de uni6n. por ejemplo, puede unirse quimicamente estreptavidina a una superficie tal como la superficie interior de un tubo. En este caso, la mezcla de perlas amplificadas puede hacerse circular a traves del tubo. Las

45 perlas con amplic6n unido tenderan a ser retenidas hasta la "fusi6n" mientras que las perlas vacias fluiran a su traves. Esta disposici6n puede ser particularmente ventajosa para automatizar el procedimiento de preparaci6n de las perlas.

Aun cuando las realizaciones descritas anteriormente son especialmente utiles, pueden imaginarse otros metodos de separaci6n de las perlas. por ejemplo, las perlas de captura podrian ser marcadas con un resto fluorescente que 50 pudiera hacer fluorescente el complejo de perla de captura-diana. El complejo de perla de captura-diana puede ser separado mediante citometria de flujo o distribuci6n de celulas por fluorescencia. Utilizando perlas de captura grandes podria efectuarse la separaci6n por filtraci6n u otras tecnicas de separaci6n de particulas por tamano. Dado que tanto las perlas de captura como las dianas son capaces de formar complejos con muchas otras perlas, es posible aglutinar una masa reticulada de perlas de captura-diana. El tamano grande de la masa aglutinada haria

55 posible la separaci6n simplemente arrastrando por lavado las perlas vacias sin aglutinar. Estos metodos han sido descritos con mayor detalle, por ejemplo, por Bauer, J. en J. ehromatography B. 722 (1999) 55-69 y Brody et al., en Applied physics Lett. 74. 144-146, (1999).

En esta memoria se describe un metodo para amplificar uno o mas acidos nucleicos que comprende las etapas de: a) formar una emulsi6n de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos en la que al menos 60 uno de los microrreactores comprende un solo molde de acido nucleico, una unica perla capaz de unirse al acido

nucleico y soluci6n de reacci6n de amplificaci6n que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificaci6n de los acidos nucleicos; b) amplificar los acidos nucleicos de los microrreactores para formar copias amplificadas de los acidos nucleicos; y c) unir las copias amplificadas a las perlas de los microrreactores.

La soluci6n de reacci6n de amplificaci6n empleada en este metodo, puede ser una soluci6n para realizar una

5 reacci6n en cadena de la polimerasa, que comprende nucle6tido trifosfatos, una polimerasa termoestable, y cebadores de acidos nucleicos suspendidos en una soluci6n tamp6n compatible con las condiciones de la reacci6n en cadena de la polimerasa. La reacci6n en cadena de la polimerasa puede ser una reacci6n en cadena de la polimerasa, asimetrica o una reacci6n en cadena de la polimerasa, simetrica. eomo ejemplo, la amplificaci6n puede llevarse a cabo por amplificaci6n basada en la transcripci6n, amplificaci6n rapida de extremos de DNA, amplificaci6n

10 de flujo continuo, o amplificaci6n en circulo rodante..

para usar en este metodo, la mayoria de los microrreactores pueden incluir un unico acido nucleico. El metodo puede ser llevado a cabo con al menos 10.000 acidos nucleicos o al menos 50.000 acidos nucleicos. eada perla utilizada en el metodo puede usarse para capturar mas de 10.000 copias de amplificaci6n de un molde de acido nucleico. En varias realizaciones, la emulsi6n contiene adicionalmente estabilizantes de emulsiones. Los

15 estabilizantes de emulsiones pueden ser Atlox 4912, Span 80 o sus combinaciones o sus mezclas. La emulsi6n puede ser termoestable, por ejemplo hasta 95°e, y puede formarse mediante la adici6n gota a gota a un aceite de los moldes de acido nucleico, las perlas y la soluci6n de reacci6n de amplificaci6n. Los microrreactores pueden tener un tamano medio de 50 a 250 μm de diametro.

Tambien se describe en esta memoria un banco de DNA que comprende una pluralidad de moleculas de acido

20 nucleico, en la que cada molecula de acido nucleico ha sido inmovilizada por separado en una perla diferente, y en la que cada perla comprende mas de 1.000.000 de copias de amplificaci6n clonal de cada molecula de acido nucleico, en la que el banco esta contenido en un solo recipiente. eomo ejemplos, la molecula de acido nucleico puede ser DNA gen6mico, cDNA, DNA episomal, BAe DNA o YAe DNA. El DNA gen6mico puede ser DNA gen6mico de origen animal, vegetal, viral, bacteriano o fungico. preferiblemente, el DNA gen6mico es DNA

25 gen6mico humano o DNA humano. En ciertos aspectos, la perla, por ejemplo, una perla de Sepharose, tiene un diametro de 2 micr6metros a 100 micr6metros.

La descripci6n incluye tambien un metodo para amplificar un acido nucleico que comprende las etapas de: a) proporcionar un molde de acido nucleico que ha de ser amplificado; b) proporcionar una material s6lido de soporte que comprende una perla generalmente esferica, que tiene un diametro de aproximadamente 10 a

30 aproximadamente 80 μm, en el que la perla es capaz de unirse al molde de acido nucleico; c) mezclar el molde de acido nucleico y la perla en una soluci6n de reacci6n de amplificaci6n que contiene reactivos necesarios para realizar una reacci6n de amplificaci6n de acidos nucleicos en una emulsi6n de agua en aceite; d) amplificar el molde de acido nucleico para formar copias amplificadas del molde de acido nucleico; y e) unir las copias amplificadas a la perla.

35 eomo una opci6n, el metodo puede incluir una etapa de enriquecimiento para aislar las perlas con copias amplificadas del acido nucleico unidas, de las perlas sin acido nucleico unido. Esta etapa de enriquecimiento puede llevarse a cabo por electroforesis, distribuci6n de celulas, o purificaci6n por afinidad (por ejemplo, con perlas magneticas que fijan acidos nucleicos). preferiblemente, al menos 100.000 copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen a cada perla, al menos 1.000.000 de copias de cada molecula de acido nucleico diana se

40 unen a cada perla, o al menos 1 a 20.000.000 de copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen a cada perla. En varios aspectos, las perlas son perlas de Sepharose y las copias amplificadas estan unidas a las perlas por un par de uni6n tal como antigeno/anticuerpo, ligando/receptor, polihistidina/niquel o avidina/biotina. El metodo puede incluir tambien las etapas de: f) separar las perlas que llevan molde y las perlas magneticas; y g) retirar las perlas magneticas con un campo magnetico. Esta separaci6n puede conseguirse por incubaci6n a una temperatura

45 mayor que 45°e o incubando las perlas que llevan molde y las perlas magneticas en una soluci6n de un pH basico.

La descripci6n incluye, ademas, un kit para llevar a cabo la amplificaci6n de acidos nucleicos, de un molde de acido nucleico, que comprende: a) perlas de captura de un acido nucleico; b) un aceite de emulsi6n; c) uno o mas estabilizantes de emulsiones; y d) instrucciones para emplear el kit.

Adicionalmente, la descripci6n incluye un metodo para producir una poblaci6n clonal de acidos nucleicos, que

50 comprende: a) proporcionar una pluralidad de moldes de acido nucleico de una longitud de 50-800 bp y perlas capaces de unirse con los moldes de acido nucleico; b) mezclar los moldes de acido nucleico y las perlas en el seno de una soluci6n biol6gica de reacci6n que contiene reactivos necesarios para amplificar los moldes de acido nucleico; y c) formar una emulsi6n para crear una pluralidad de microrreactores que comprenden los moldes de acido nucleico, perlas y soluci6n biol6gica de reacci6n, en el que al menos uno de los microrreactores comprende un

55 unico molde de acido nucleico y una sola perla encapsulados en la soluci6n biol6gica de reacci6n, en el que los microrreactores estan contenidos en el mismo recipiente.

Segun este metodo, los acidos nucleicos pueden ser transcritos y traducidos para generar al menos 10.000 copias de un producto de expresi6n. El producto de expresi6n puede unirse a las perlas mediante un par de uni6n seleccionado entre el grupo que consiste en pares de uni6n de antigeno/anticuerpo, ligando/receptor, his6X/niquel

acido nitrilotriacetico, y marca FLAG/anticuerpo FLAG. En ciertos aspectos, el metodo produce una poblaci6n clonal de proteinas, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y anticuerpos construidos por ingenieria genetica. La emulsi6n puede comprender una pluralidad de microrreactores termoestables, en cuya emulsi6n los microrreactores tienen un diametro de 50 a 200 μm y comprenden una soluci6n biol6gica de reacci6n. La soluci6n 5 biol6gica de reacci6n puede comprender reactivos para llevar a cabo reacciones de amplificaci6n de reacci6n en cadena de la polimerasa o reacciones copuladas de transcripci6n y traducci6n. preferiblemente, una pluralidad de microrreactores comprenden un molde de acido nucleico, por ejemplo, uno o pocos moldes de acido nucleico y una

o pocas perlas que unen a los moldes de acido nucleico.

Ejemplos

10 peR en emulsi6n en perlas

Los procedimientos operatorios que siguen, que incluyen captura del DNA de molde, amplificaci6n del DNA, y recuperaci6n de las perlas unidas al molde amplificado, pueden llevarse a cabo en un solo tubo. La forma de la emulsi6n asegura la separaci6n fisica de las perlas en "microrreactores" de 100-200 μm dentro de este unico tubo, lo que permite la amplificaci6n clonal de diversos moldes. La inmovilizaci6n del producto de amplificaci6n se consigue

15 mediante extensi6n del molde a lo largo de los oligonucle6tidos unido a las perlas de captura de DNA. Tipicamente, el numero de copias del molde inmovilizado varia desde 10 a 30 millones de copias por perla. Las perlas de captura de DNA con multiples copias de una sola especie de molde de acido nucleico, estan listas para distribuir en placas de picotitulaci6n (pTps).

Los 300.00 pocillos de 75 picolitros grabados en la superficie de la pTp proporcionan una disposici6n unica para la

20 secuenciaci6n de moldes de DNA cortos, de un modo masivamente paralelo, eficiente y de coste eficaz. Sin embargo, esto requiere cantidades bastante grandes (millones de copias) de moldes clonales en cada pocillo de reacci6n. Los metodos descritos en esta memoria permiten al usuario amplificar clonalmente especies de moldes de DNA gen6mico monocatenario mediante procesos de peR realizados en tubos estandar o en placas de microtitulaci6n estandar. eopias unicas de la especie de molde pueden mezclarse con perlas de captura,

25 resuspenderse en soluci6n completa de amplificaci6n por peR, y emulsionarse en microrreactores (de 100 a 200 μm de diametro), despues de lo cual la amplificaci6n por peR genera una amplificaci6n de 107 veces de la especie inicial de molde. Este procedimiento operatorio es mucho mas sencillo y mas eficaz respecto al coste que los metodos anteriores,

Ejemplo 1: Uni6n de moldes de acidos nucleicos a perlas de captura

30 Este ejemplo describe la preparaci6n de una poblaci6n de perlas que poseen, preferiblemente, solamente un unico molde de acido nucleico unido a ellas. La amplificaci6n clonal con exito depende de la distribuci6n a cada perla de un numero regulado de especies de molde (0,5 a 1). La distribuci6n de especies en exceso puede dar por resultado la amplificaci6n por peR de una poblaci6n mixta de moldes, que evita la generaci6n de resultados secuenciales significativos, al tiempo que puede resultar una deficiencia de especies en algunos pocillos que contienen molde

35 para secuenciar. Este hecho puede reducir la extensi6n de cobertura gen6mica proporcionada por la fase de secuenciaci6n. eomo resultado, se prefiere que la concentraci6n del molde sea determinada con exactitud mediante cuantificaci6n replicada, y que el protocolo de uni6n sea seguido como se describe a continuaci6n

eontrol de calidad del molde

El exito del proceso de peR en emulsi6n, esta relacionado con la calidad de las especies de molde. eon

40 independencia del cuidado y del detalle prestados a la fase de amplificaci6n, los moldes de mala calidad pueden impedir una amplificaci6n con exito asi como la generaci6n de datos secuenciales de importancia. para evitar perdidas innecesarias de tiempo y de dinero, es importante comprobar la calidad del material de molde antes de iniciar la fase de peR en emulsi6n del procedimiento. preferiblemente, el banco de DNA debe pasar por dos etapas de control de la calidad antes de usarle en el proceso de peR en emulsi6n. Su concentraci6n y la distribuci6n de

45 productos que contiene, deben ser determinadas. Idealmente, el banco debe aparecer como una poblaci6n heterogenea de fragmentos con pocos dimeros adaptadores visibles, o sin ellos (por ejemplo, ∼ 90 bases). Asimismo, la amplificaci6n con cebadores de peR debe dar por resultado un producto que varia, por ejemplo, desde 300 a 500 bp. La ausencia de producto de amplificaci6n puede reflejar fallo en ligar apropiadamente los adaptadores al molde, al tiempo que la presencia de una sola banda de cualquier tamano puede reflejar contaminaci6n del molde

50 preparaci6n de la soluci6n de peR

La consideraci6n principal para esta fase es la de evitar la contaminaci6n de la mezcla para la peR con amplicones extranos. La contaminaci6n de las peR con un amplic6n residual es una de las consecuencias criticas que pueden ocasionar fallo de una operaci6n de secuenciaci6n. para reducir la posibilidad de contaminaci6n, deben seguirse tecnicas de laboratorio apropiadas, y la preparaci6n de la mezcla de reacci6n debe llevarse a cabo en una sala

55 limpia en una cabina de flujo laminar tratada con radiaci6n UV.

Mezcla de reacci6n de la peR para una mezcla de reacci6n de 200 μl para el proceso de peR (suficiente para amplificar 600.000 perlas), los siguientes reactivos fueron mezclados en un tubo de peR de 0,2 ml.

Tabla 3

Aprovisionamiento (stock)

Final Microlitros

Soluci6n tamp6n HIFI

10X 1X 20

Nucle6tidos tratados

10 mM 1 mM 20

Mg

50 mM 2 mM 8

BSA

10% 0,1% 2

Tween 80

1% 0,01% 2

ppasa

2 U 0,003 U 0,333333

eebador MMp1a

100 μM 0,625 μM 1,25

eebador MMp1b

10 μM 0,078 μM 1,56

Taq polimerasa

5 U 0,2 U 8

Agua

136,6

Total

200

El tubo se someti6 a agitaci6n con formaci6n de v6rtice y se mantuvo sobre hielo hasta que las pelas se hibridaron 5 con el molde.

perlas de captura de DNA

1. 600.000 perlas de captura de DNA fueron hechas pasar desde el tubo de aprovisionamiento hasta un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml. La cantidad exacta utilizada depende de la concentraci6n de perlas del reactivo formalizado.

10 2. Las perlas fueron sometidas a peletizaci6n en una minicentrifuga de sobremesa y se separ6 el sobrenadante.

3.

Las etapas 4-11 fueron realizadas en una sala limpia para peR.

4.

Las perlas fueron lavadas con 1 ml de Tamp6n de Hibridaci6n 1X.

5. Las perlas de captura fueron sometidas a peletizaci6n en la microcentrifuga. El tubo se hizo girar 180° y se 15 someti6 a centrifugaci6n de nuevo.

6.

easi 10 μl, aproximadamente, del sobrenadante fue retirado del tubo que contenia las perlas. Las perlas no fueron alteradas.

7.

Se anadi6 1 ml de Tamp6n de Hibridaci6n 1X y esta mezcla se incub6 durante 1 minuto. Las perlas fueron sometidas a peletizaci6n luego como en la etapa 5.

20 8. Se separ6 casi 100 μl, aproximadamente, del material del tubo.

9.

Las perlas y la soluci6n restantes fueron pasadas a un tubo de peR.

10.

El tubo de 1,5 ml se lav6 con 150 μl de Tamp6n de Hibridaci6n 1X con pipeta, aspirando y expulsando varias veces el liquido. Este se anadi6 al tubo de peR que contenia las perlas.

11. Las perlas fueron sometidas a peletizaci6n como en la etapa 5 y casi 10 μl, aproximadamente, del 25 sobrenadante fueron retirados, teniendo cuidado de no alterar el pelet de perlas.

12.

Se separ6 una parte alicuota de DNA monocatenario (sstDNA) de molde (sstDNA) cuantificado. La concentraci6n final era 200.000 moleculas de sstDNA/μl.

13.

Se anadi6 3 μl del sstDNA diluido al tubo de peR que contenia las perlas. Esto fue equivalente a 600.000 copias de sstDNA.

30 14-El tubo se agit6 suavemente con formaci6n de v6rtice para mezclar el contenido.

15. El sstDNA fue hibridado con las perlas de captura en un aparato de termociclaci6n de peR con el programa 80Anneal almacenado en la carpeta EpeR del aparato de termociclaci6n MU, empleando el siguiente protocolo.

5 minutos a 65°e

5 Disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 60°e Mantenimiento en 60°e durante 1 minuto Disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 50°e Mantenimiento en 50°e durante 1 minuto Disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 40°e

10 Mantenimiento en 40°e durante 1 minuto Disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 20°e, y Mantenimiento en 10°e hasta estar listos para la etapa siguiente.

En la mayor parte de los casos las perlas se usaron para la amplificaci6n inmediatamente despues de la uni6n del molde. Si las perlas no se utilizaron inmediatamente despues se mantuvieron en la soluci6n de molde a 4°e hasta 15 que se necesitaron. Despues de esto las perlas fueron tratadas del modo siguiente:

16.

eomo en la etapa 6, las perlas fueron retiradas del aparato de termociclaci6n, centrifugadas y se retir6 el tamp6n de hibridaci6n sin alterar las perlas.

17.

Las perlas fueron mantenidas en un cubito de hielo hasta la emulsificaci6n (Ejemplo 2).

18. Las perlas de captura incluian, por termino medio, 0,5 a 1 copia de sstDNA unido a cada perla, y estaban 20 listas para la emulsificaci6n.

Ejemplo 2. Emulsificaci6n Este ejemplo describe c6mo crear una emulsi6n termoestable de agua en aceite que contiene, aproximadamente,

3.000 microrreactores de peR por microlitro. Se describe a continuaci6n un protocolo para preparar la emulsi6n

1. Se anadi6 200 μl de soluci6n de peR a las 600.000 perlas (ambos componentes procedente del Ejemplo 1).

25 2. La soluci6n se aspir6 con pipeta y se expuls6 varias veces para volver a suspender las perlas.

3.

Se incub6 a temperatura ambiente durante 2 minutos la mezcla de perlas y soluci6n de peR para equilibrar las perlas con la soluci6n de peR.

4.

Se anadi6 400 μl a Aceite de Emulsi6n a un tubo de microcentrifuga de 2 ml irradiado con radiaci6n UV.

5.

Se anadi6 al tubo con el Aceite de emulsi6n una barra magnetica de agitaci6n de 6,35 mm "sin amplic6n"

30 para someter a agitaci6n magnetica. La barra de agitaci6n "sin amplic6n" se prepar6 del modo siguiente: Se us6 una barra de agitaci6n grande para sostener una barra de agitaci6n de 6,35 mm. La barra de agitaci6n fue, despues:

Lavada por goteo o pulverizaci6n sin DNA Enjuagada con agua picopura35 Secada con una arista Kimwipe, e Irradiada con radiaci6n UV durante 5 minutos.

6. Se retir6 la inserci6n magnetica de un soporte de tubos Mpe-S de Dynal. El tubo de Aceite de Emulsi6n se coloc6 en el soporte tubos. Se fij6 el tubo en el centro de una placa de agitaci6n fijada en 600 rpm.

7. El tubo fue sometido extensamente a agitaci6n con formaci6n de v6rtice para volver a suspender las perlas 40 Esto asegur6 que hubiera un agrupamiento minimo de las perlas.

8.

Usando una pipeta p-200 la mezcla de peR y perlas se anadi6 gota a gota al aceite en rotaci6n a una velocidad de aproximadamente una gota cada 2 segundos, dejando que cada gota bajara hasta el nivel de la

barra magnetica de agitaci6n y quedara emulsionada antes de anadir la gota siguiente. La soluci6n se transform6 en un liquido blanco lechoso, homogeneo, con una viscosidad similar a la de la mayonesa.

9.

Una vez anadida la totalidad de la mezcla de peR y perlas, el tubo de microcentrifugaci6n se golpe6 con suavidad algunas veces para mezclar el aceite que hubiera en la superficie de la emulsi6n lechosa.

5 10. Se continu6 agitando durante otros 5 minutos.

11.

Se repitieron las etapas 9 y 10.

12.

Se retir6 del material emulsionado la barra de agitaci6n sacandola fuera del tubo con una barra de agitaci6n de mayor tamano.

13.

Se separ6 10 μl de la emulsi6n y se coloc6 en un porta de microscopio. La emulsi6n se tap6 con un cubre y

10 se inspeccion6 con un aumento 50X (lentes de 10X del ocular y 5X del objetivo). Era de esperar una "buena" emulsi6n que incluyera principalmente aisladas en el seno de gotitas aisladas (microrreactores) de la soluci6n de peR en aceite.

14.-Se prepar6 una mezcla oleosa de emulsi6n adecuada con estabilizantes de emulsiones, del modo que sigue. Los componentes de la mezcla de emulsi6n se indican en la Tabla 4.

15 Tabla 4

Ingrediente

eantidad requerida Origen Numero de referencia

Aceite Mineral Ligero "Sigma"

94,5 g Sigma M-5904

Atlox 4912

1 g Uniqema NA

Span 80

4,5 g Uniqema NA

La mezcla oleosa de emulsi6n se obtuvo calentando previamente el Atlox 4912 a 60°e en un bano de agua. Despues, se anadi6 4,5 g de Span 80 a 94,5 g gramos de aceite mineral para formar una mezcla. Luego se anadi6 a la mezcla un gramo del Atlox 4912 precalentado. Las soluciones se colocaron en un recipiente cerrado y se mezclaron por sacudimiento e inversi6n. eualquier indicio de que el Atlox hubiera sedimentado o solidificado se

20 remedi6 calentando la mezcla a 50°e, seguido de sacudimiento adicional.

Ejemplo 3: Amplificaci6n

Este ejemplo describe la amplificaci6n del DNA de molde en la mezcla de perlas y emulsi6n. Segun este protocolo de la invenci6n, la fase de amplificaci6n de DNA del procedimiento tarda 3 a 4 horas. Una vez completada la amplificaci6n puede dejarse la emulsi6n en el aparato de termociclaci6n durante hasta 12 horas antes de comenzar

25 el procedimiento de aislamiento de las perlas. La termociclaci6n por peR se llev6 a cabo colocando 50 a 100 μl de la mezcla de reacci6n emulsionada en camaras individuales de reacci6n peR (es decir, tubos de peR). La peR se llev6 a cabo del modo siguiente:

1. Se hizo pasar la emulsi6n en cantidades de 50-100 μl a, aproximadamente, 10 tubos de peR separados o a

una placa de 96 pocillos, utilizando la punta de una sola pipeta. En esta etapa la emulsi6n de agua en aceite 30 era muy viscosa.

2.

Se hermetiz6 la placa o se cerraron los bordes de los tubos, y los recipientes fueron colocados en un aparato de termociclaci6n MJ con o sin adaptador de placas de 96 pocillos.

3.

El aparato de termociclaci6n de peR se program6 para que ejecutara el programa siguiente:

1 ciclo (4 minutos a 94°e) Iniciaci6n de fase caliente

35 40 ciclos (30 segundos a 94°e, 30 segundos a 58°e, 90 segundos a 68°e)

25 ciclos (30 segundos a 94°e, 6 minutos a 58°e), y

Almacenamiento a 14°e.

4. Una vez completada la peR se separ6 el material amplificado para proceder a la rotura de la emulsi6n y la recuperaci6n de las perlas.

40 Ejemplo 4: Rotura de la emulsi6n y recuperaci6n de las perlas

Este ejemplo describe c6mo romper la emulsi6n y recuperar las perlas con molde amplificado en ellas. preferiblemente, la emulsi6n despues del proceso de peR debe permanecer intacta. La fase inferior de la emulsi6n debe permanecer, por inspecci6n visual, como una suspensi6n blanca, lechosa. Si la soluci6n es clara, la emulsi6n puede haberse separado parcialmente en sus fases acuosa y oleosa, y es probable que muchas de las perlas tengan una mezcla de moldes. Si la emulsi6n se ha roto en uno o mas de los tubos, estas muestras no deben mezclarse con las otras. Si la emulsi6n se ha roto en todos los tubos no debe continuarse el procedimiento operatorio.

1. Todas las mezclas de las reacciones de peR procedentes de la muestra primitiva de 600 μl fueron combinadas en un unico tubo de microcentrifuga de 1,5 ml utilizando la punta de una sola pipeta. eomo se ha indicado antes, la emulsi6n era bastante viscosa. En algunos casos se repiti6 el pipeteo varias veces para cada tubo. Se hizo pasar al tubo de 1,5 ml tanto material como fue posible.

2-El material emulsionado restante se recuper6 desde cada tubo de peR anadiendo 50 μl de Aceite Mineral "Sigma" a cada una de las muestras. Usando la punta de una sola pipeta, cada tubo fue sometido a pipeteo aspirando y expulsando algunas veces para volver a suspender el material restante,

3.

Este material se anadi6 al tubo de 1,5 ml que contenia el grueso del material emulsionado.

4.

La muestra se agit6 con formaci6n de v6rtice durante 30 segundos.

5.

La muestra se centrifug6 durante 20 minutos en el tubo de microcentrifuga de sobremesa a 13,2K rpm, en la microcentrifuga Eppendorf

6.

La emulsi6n se separ6 en dos fases con una interfase blanca grande. Se separ6 tanto como fue posible de la fase superior oleosa, transparente, . El material turbio se dej6 en el tubo. Frecuentemente una capa blanca separaba las capas de aceite y de agua. Se observaron con frecuencia perlas aglomeradas en el fondo del tubo.

7.

La capa acuosa por encima de las perlas fue retirada y guardada para su analisis (analisis en gel, Agilent 2100, y Taqman). Si persistia una interfase de material blanco por encima de la capa acuosa se separ6 20 microlitros de la capa acuosa subyacente. Esto se llev6 a cabo penetrando el material de la interfase con la punta de una pipeta y retirando la soluci6n desde abajo.

8.

En la eabina de Humos del Laboratorio Quimico de Fabricaci6n and Superficie de la pTp, se anadi6 1 ml al resto de la emulsi6n

9.

la muestra se agit6 con formaci6n de v6rtice y se centrifug6 a total velocidad durante 1 minuto.

10.

En la eabina de Humos del Laboratorio Quimico de Fabricaci6n y Superficie de la pTp, se retir6 la fase superior de aceite/hexano y se deposit6 en el contenedor de residuos organicos.

11.

Se anadi6 1 ml de Tamp6n de Hibridaci6n 1X en el seno de etanol de 80%, a la fase acuosa, interfase y perlas restante.

12.

La muestra se agit6 con formaci6n de v6rtice durante 1 minuto o hasta que se disolvi6 la sustancia blanca.

13.

Se centrifug6 la muestra durante 1 minutos a alta velocidad. Se hizo girar 180° el tubo y se centrifug6 de nuevo durante 1 minuto. Se retir6 el sobrenadante sin alterar el pelet de perlas.

14.

Se lavaron las perlas con 1 ml de Tamp6n de Hibridaci6n 1X que contenia Tween 20 a 0,1%, y se repiti6 esta etapa.

Ejemplo 5: Separaci6n de una cadena e hibridaci6n del cebador

Si las perlas han de ser utilizadas en una reacci6n de secuenciaci6n basada en pirofosfato, es necesario separar la segunda cadena del producto de la peR e hibridar un cebador de secuenciaci6n con el molde monocatenario que esta unido a la perla. Este ejemplo describe un protocolo de realizaci6n de este procedimiento.

1.

Se lavaron las perlas con 1 ml de agua y se centrifug6 dos veces durante 1 minuto. Se hizo girar el tubo 180° entre cada centrifugaci6n. Despues de centrifugar se retir6 la fase acuosa.

2.

Se lavaron las perlas con 1 ml de EDTA 1 mM Se centrifug6 el tubo como en la etapa 1 y se retir6 la fase acuosa.

3.

Se anadi6 1 ml de NaOH 0,125 M y se incub6 la muestra durante 8 minutos.

4.

La muestra se agit6 brevemente con formaci6n de v6rtice y se coloc6 en una microcentrifuga

5.

Al cabo de 6 minutos las perlas fueron sometidas a peletizaci6n como en la etapa 1 y se retir6 tanta soluci6n como fue posible.

6.

Una vez completada la incubaci6n de 8 minutos con NaOH, se anadi6 1 ml de tamp6n de hibridaci6n 1X

7.

La muestra se agit6 brevemente con formaci6n de v6rtice y las perlas fueron sometidas a peletizaci6n como en la etapa 1. Se separ6 tanto sobrenadante como fue posible y se anadi6 otro 1 ml de tamp6n de hibridaci6n 1X.

5 8. La muestra se agit6 brevemente con formaci6n de v6ritce, se sometieron a peletizaci6n las perlas como en la etapa 1, y se retir6 800 μl del tamp6n de hibridaci6n 1X.

9.

Se hicieron pasar las perlas a un tubo de peR de 0,2 ml.

10.

Las perlas fueron hechas pasar y se retir6 tanto tamp6n de hibridaci6n como fue posible sin alterar las perlas.

10 11. Se anadi6 100 μl de tamp6n de hibridaci6n 1X.

12.

Se anadi6 4 μl de cebador de secuenciaci6n 100 μM-La muestra se agit6 con formaci6n de v6rtice justamente antes de hibridaci6n.

13.

Se realiz6 la hibridaci6n en un aparato de termociclaci6n MJ utilizando el programa "80Anneal".

14. Se lavaron las perlas tres veces con 200 μl de tamp6n de hibridaci6n 1X y se volvi6 a suspenderlas en 100 15 μl de tamp6n de hibridaci6n 1X.

15. Las perlas fueron sometidas a recuento en un hemacit6metro Hausser. Se recuperaron, tipicamente,

300.000 a 500.000 perlas (3.000-5.000 perlas/μl).

16. Las perlas fueron almacenadas de 4°e y pudieron usarse para la secuenciaci6n durante 1 semana.

Ejemplo 6: Etapa opcional de enriquecimiento

20 Las perlas pueden ser enriquecidas en perlas que contienen amplic6n utilizando los procedimientos operatorios que siguen. El enriquecimiento no es necesario pero podria utilizarse para hacer mas eficaces tecnicas de biologia molecular subsiguientes, tales como secuenciaci6n de DNA.

eincuenta microlitros de cebador de secuenciaci6n con biotina, 10 μM (500 pmoles en total) se anadi6 a las perlas de Sepharose que contenian amplicones, procedentes del Ejemplo 5. Las perlas fueron colocadas en un aparato de

25 termociclaci6n. El cebador fue hibridado con el DNA sobre las perlas mediante el programa de hibridaci6n del aparato de termociclaci6n del ejemplo 2.

Despues de hibridar, las perlas de Sepharose fueron lavadas tres veces con tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1%. Las perlas, que contenian ahora fragmentos de ssDNA hibridados con los cebadores de secuenciaci6n con biotina, fueron concentradas por centrifugaci6n y resuspendidas en 200 μl de tamp6n de uni6n de

30 BST. Se anadi6 a las perlas resuspendidas diez microlitros de BST-polimerasa de 50.000 unidades/ml y el recipiente que contenia las perlas se coloc6 en un aparato rotativo durante cinco minutos. Se anadi6 dos microlitros de mezcla 10 mM de dNTp (es decir, 2,5 μl de cada uno de dATp, dGTp, deTp y dTTp, 10 mM) y la mezcla se incub6 durante un periodo adicional de 10 minutos a temperatura ambiente, Las perlas fueron lavadas tres veces con tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tamp6n de hibridaci6n

35 eincuenta microlitros de perlas de estreptavidina Dynal (perlas de Dynal Biotech. Inc., Lake Success, NY; M270 6 MyOne™, a 10 mg/ml) se lavaron tres veces con tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1%. Despues, la mezcla de perlas Dynal se anadi6 a las perlas de Sepharose resuspendidas. La mezcla se agit6 con formaci6n de v6rtice y se coloc6 en un aparato rotativo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

40 Las perlas fueron recogidas en el fondo del tubo de ensayo por centrifugaci6n a 2300 G (500 rpm de la centrifuga Eppendorf 5415D). Las perlas fueron resuspendidas en el volumen original de tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1%. La mezcla, en un tubo de ensayo, se coloc6 en un separador magnetico (Dynal). Se lavaron tres veces las perlas con tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original del mismo tamp6n. Las perlas sin amplicones fueron retiradas mediante etapas de lavado, como se ha

45 descrito antes. Solamente quedaron retenidas las perlas de Sepharose que contenian los fragmentos de DNA apropiados.

Las perlas magneticas fueron separadas de las perlas de Sepharose por adici6n de 500 μl de NaOH 0,125 M. La mezcla se agit6 con formaci6n de v6rtice y las perlas magneticas fueron separadas mediante separaci6n magnetica. Las perlas de Sepharose que permanecian en soluci6n fueron transferidas a otro tubo y lavadas con 400 μl de Tris

50 Acetato 50 mM hasta que el pH se estabiliz6 en 7,6.

Ejemplo 7: Secuenciaci6n de acidos nucleicos usando peR en emulsi6n en perlas

Se llev6 a cabo el experimento que sigue para ensayar la eficacia de la peR en emulsi6n en perlas. para este protocolo, 600.000 perlas de Sepharose con un diametro medio de 25-35 μm (tal como fueron suministradas por el fabricante) fueron enlazadas covalentemente con cebadores de captura en una proporci6n de 30-50 millones de

5 copias por perla. Las perlas con cebadores de captura enlazados covalentemente, fueron mezcladas con 1,2 millones de copias de un banco de Adenovirus monocatenario. Las construcciones del banco incluian una secuencia que era complementaria del cebador de captura sobre las perlas.

El banco de adenovirus se hibrid6 con las perlas usando el procedimiento operatorio descrito en el Ejemplo 1. Despues, las perlas fueron resuspendidas en soluci6n de peR completa. La soluci6n de peR y las perlas fueron 10 emulsionadas en 2 volumenes de aceite de emulsificaci6n en rotaci6n utilizando el mismo procedimiento operatorio descrito en el Ejemplo 2. Las perlas emulsionadas (encapsuladas) fueron sometidas a amplificaci6n por peR como se ha descrito en el Ejemplo 3. La emulsi6n se rompi6 como se ha descrito en el Ejemplo 4. El DNA de las perlas fue hecho monocatenario, y el cebador de secuenciaci6n se hibrid6 utilizando el procedimiento operatorio del Ejemplo 5.

Seguidamente, 70.000 perlas fueron secuenciadas simultaneamente por secuenciaci6n con pirofosfato, utilizando

15 un secuenciador de pirofosfato de 454 Life Sciences (New Haven, eT) (vease la solicitud de patente en tramitaci6n junto con la presente, de Lohman et al., presentada al mismo tiempo que la titulada Metodos de Amplificaci6n y Secuenciaci6n de Acidos Nucleicos" documento USSN 60/476.592, presentada el 6 de Junio de 2003). Fueron secuenciados varios lotes de 70.000 perlas y los resultados obtenidos se exponen en la Tabla 5 que figura a continuaci6n

20 Tabla 5

Tolerancia del error de alineaci6n

Alineaciones eobertura Error de lectura inferido

Ninguna

Una sola Multiple Unica

0%

47916 1560 1110 54,98% 0,00%

5%

46026 3450 2357 83,16% 1,88%

10%

43474 6001 1 3742 95,64% 4,36%

La Tabla 5 expone los resultados obtenidos del analisis BLAST que compara las secuencias obtenidas desde el secuenciador de pirofosfato con la secuencia de Adenovirus. La primera columna muestra la tolerancia del error utilizado en el programa BLAST. La ultima columna muestra el error real determinado por comparaci6n directa con la secuencia conocida.

25 peR en emulsi6n en perlas para la secuenciaci6n de dos extremos

Ejemplo 8: eontrol de calidad de los moldes

Segun se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que el exito de la reacci6n peR en emulsi6n estaba relacionado con la calidad de la especie del molde monocatenario. por consiguiente, se determin6 la calidad del material de molde con dos controles de calidad separados, antes de iniciar el protocolo de peR en emulsi6n. En

30 primer lugar, una parte alicuota del molde monocatenario se ensay6 en el 2100 BioAnalyzer (Agilient). Un pico ehip de RNA se us6 para verificar que la muestra incluia una poblaci6n heterogenea de fragmentos que variaban de tamano desde aproximadamente 200 a 500 bases. En segundo lugar, el banco fue cuantificada utilizando el ensayo de fluorescencia RiboGreen en un fluor6metro de placa Bio-Tek FL600. Las muestras que se determin6 que tenian concentraciones de DNA menores que 5 ng/μl se consideraron demasiado diluidas para usar.

35 Ejemplo 9: Sintesis de perlas de captura de DNA

perlas empaquetadas procedentes de una columna de afinidad de Hp de Sepharose activada con ester de N-hidroxisuccinimida (NHS) de 1 ml (Amersham Biosciences, piscataway, NJ) fueron separadas desde la columna. Las perlas de tamano 30-25 μm fueron seleccionadas por paso seriado a traves de secciones de malla filtrante de 30 y 25 μm de tamano de poro (Sefar America, Depew, NY. EE.UU.) Las perlas que atravesaron el primer filtro pero 40 que eran retenidas por el segundo, fueron recogidas y activadas segun se describe en el prospecto del producto (Amersham pharmacia protocol no. 71700600Ap). Se obtuvieron dos cebadores de captura largos de HEG (hexaetilenglicol) marcados con amina, que correspondian al extremo 5' de la cadena sentido y antisentido del molde que habia que amplificar (5'-Amina-3 espaciadores HEG gcttacctgaccgacctctgcctatcccctgttgcgtgtc-3'; SEQ ID NO:1; y 5'-Amina-3 espaciadores HEG ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtc-3'; SEQ ID NO:2) (IDT Technologies, 45 eoralville, IA, EE.UU.) Los cebadores estaban disenados para la captura de ambas cadenas de los productos de amplificaci6n y permitir la secuenciaci6n de los dos extremos, es decir, la secuenciaci6n de la primera y la segunda cadenas de los productos de amplificaci6n. Los cebadores de captura se disolvieron en tamp6n de fosfato 20 mM, pH 8,0 para obtener una concentraci6n final 1 mM. Tres microlitros de cada cebador se unieron a las perlas

tamizadas de 30 -25 μm. Despues las perlas fueron mantenidas en una soluci6n tamp6n de almacenamiento (Tris 50 mM, Tween al 0,02% y azida de sodio al 0,02%, pH 8). Las perlas fueron cuantificadas con un hemacit6metro (Hausser Scientific, Horsham, pA, EE.UU.) y mantenidas a 4°e hasta que fueron necesarias.

Ejemplo 10: preparaci6n y formulaci6n de mezclas de reacci6n peR

5 eomo con cualquier tecnica de amplificaci6n molecular, la contaminaci6n de los reactivos con amplicones extranos o residuales procedentes de otros experimentos, podria interferir con una operaci6n de secuenciaci6n. para reducir la posibilidad de contaminaci6n, la mezcla de reacci6n peR se prepar6 en una cabina de flujo laminar tratada con radiaci6n UV, situada en una sala limpia para la peR. para cada reacci6n peR en emulsi6n en 600.000 perlas se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo de 1,5 ml: 225 μl de mezcla de reacci6n (Tamp6n platinum HiFi 1X

10 (Invitrogen)), dNTps 1 mM, MgSO4 2,5 mM (Invitrogen), BSA al 0,1%, Tween al 0,01%, 0,003 U/μl de ppi-asa termoestable (NEB), cebador directo (5'-gcttacctgaccgacctctg-3'; SEQ ID NO:3) 0,125 μM, y cebador inverso (5'-ccattccccagctcgtcttg-3'; SEQ ID NO:4) 0,125 μM, (IDT Technologies, eoralville, IA, EE.UU.) y 0,2 U/μl de Taq polimerasa de platinum Hi-Fi (Invitrogen). Se separ6 veinticinco microlitros de la mezcla de reacci6n y se mantuvo en un tubo de peR individual de 200 μl para usar como testigo negativo. Tanto la mezcla de reacci6n como los

15 testigos negativos fueron mantenidos sobre hielo hasta que se necesitaron.

Ejemplo 11: Uni6n de especies de moldes con perlas de captura de DNA

La amplificaci6n de DNA clonal realizada con exito para secuenciaci6n se refiere a la distribuci6n de un numero regulado de especie de molde a cada perla. para los experimentos descritos en esta memoria que siguen, se determin6 que la concentraci6n tipica del molde diana era 0,5 copias del molde por perla de captura. En esta 20 concentraci6n la distribuci6n de poisson dicta que el 61% de las perlas no tienen molde asociado, que el 30% tiene un especie de molde y que el 9% tiene dos o mas especies de molde. La distribuci6n de especies en exceso puede dar por resultado la uni6n y amplificaci6n subsiguiente de una poblaci6n mixta (2 6 mas especies) sobre una sola perla, lo que evita la generaci6n de resultados secuenciales significativos. Sin embargo, la distribuci6n de demasiado pocas especies puede dar por resultado menos pocillos que contengan molde (un especie por perla), reduciendo la

25 extensi6n de cobertura de la secuenciaci6n. por consiguiente, se consider6 que era importante la concentraci6n de moldes del banco monocatenario.

Moleculas de acido nucleico de molde fueron hibridadas con cebadores complementarios sobre las perlas de captura de DNA por el metodo que sigue, realizado en una cabina de flujo laminar tratada con radiaci6n UV. Seiscientas mil perlas de captura de DNA suspendidas en soluci6n tamp6n de almacenamiento de perlas (vease el 30 Ejemplo 9 anterior) fueron transferidas a un tubo de peR de 200 μl. Se someti6 a centrifugaci6n el tubo en una minicentrifuga de sobremesa durante 10 segundos, se hizo rotar 180° y se centrifug6 durante 10 segundos mas para asegurar la formaci6n uniforme de pelets.. Se separ6 el sobrenadante y las perlas se lavaron con 200 μl de tamp6n de hibridaci6n (Tris 20 mM, pH 7,5 y acetato magnesico 5 mM). Se agito el tubo con formaci6n de v6rtice durante 5 segundos para resuspender las perlas y las perlas se sometieron a peletizaci6n como antes. easi 10 μl,

35 aproximadamente, del sobrenadante por encima de las perlas fue separado y se anadi6 una porci6n adicional de 200 μl de tamp6n de hibridaci6n. Las perlas fueron sometidas de nuevo a agitaci6n con formaci6n de v6rtice durante 5 segundos, dejadas en reposo 1 minuto y despues sometidas a peletizaci6n como antes. Se desech6 casi 10 μl, aproximadamente, de sobrenadante.

Seguidamente, se anadi6 a las perlas 1,5 μl de un banco de moldes de 300.000 moleculas/μl. Se agit6 el tubo con

40 formaci6n de v6rtice durante 5 segundos para mezclar el contenido y los moldes fueron hibridados con las perlas segun un programa controlado de desnaturalizaci6n/hibridaci6n efectuado en un aparato de termociclaci6n MJ, El programa permitia la incubaci6n durante 5 minutos a 80°e, seguido de una disminuci6n de 0,1°e/ segundo a 70°e, incubaci6n durante 1 minuto a 70°e, disminuci6n de 0,1°e/segundo a 60°e, mantenimiento en 60°e durante 1 minuto, disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 50°e, mantenimiento en 50°e durante 1 minuto, disminuci6n de

45 0,1°e/segundo hasta 20°e, y mantenimiento en 20°e. Una vez completado el procedimiento de hibridaci6n, las perlas fueron retiradas del aparato de termociclaci6n y sometidas a centrifugaci6n como antes, y se decant6 cuidadosamente el tamp6n de hibridaci6n, Las perlas de captura incluian, por termino medio, 0,5 copia de DNA monocatenario de molde unido a cada perla, y se mantuvieron sobre hielo hasta que fueron necesarias.

Ejemplo 12: Emulsificaci6n

50 El procedimiento de emulsificaci6n crea una emulsi6n de agua en aceite termoestable que contiene 10.000 microrreactores de peR discretos, por microlitro. Esta emulsi6n sirve de matriz de amplificaci6n clonal, de una sola molecula, de las moleculas individuales del banco de DNA diana. La mezcla de reacci6n y las perlas de captura de DNA para una sola reacci6n fueron emulsionadas del modo que sigue. En una cabina de flujo laminar tratada con radiaci6n UV se anadi6 200μl de soluci6n de peR (procedente del Ejemplo 10) al tubo que contenia las 600.000

55 perlas de captura de DNA (procedentes del Ejemplo 11). Las perlas fueron resuspendidas mediante pipeteado repetido. Despues de esto, la mezcla de soluci6n de peR y perlas se incub6 a temperatura ambiente durante 2 minutos por lo menos, dejando que las perlas se equilibraran con la soluci6n de peR. Al mismo tiempo, 450 μl de Aceite de Emulsi6n (Span 80 al 4,5% (p/p), Atlox 4912 al 1% (p/p) (Uniqema, Delaware) en el seno de aceite mineral ligero (Sigma) se distribuy6 en partes alicuotas en un tubo de centrifuga de 2 ml de parte superior plana (Dot Scientific) que contenia una barra de agitaci6n magnetica de 6,35 mm, esteril, (Fischer). Este tubo se coloc6 despues en un soporte de plastico para tubos hecho a medida, que luego se centr6 sobre una placa calefactora con agitaci6n de temperatura uniforme, digital, de Fisher Scientific, fijada en 450 rpm.

5 La soluci6n de peR y perlas se agit6 con formaci6n de v6rtice durante 15 segundos para resuspender las perlas. La soluci6n fue extraida luego con una jeringuilla desechable de plastico de 1 ml (Benton-Dickinson) con una aguja de jeringuilla de seguridad de plastico fijada(Henry Schein). La jeringuilla se coloc6 en una bomba de jeringuillas (eolepalmer) modificada con una unida de base de aluminio que orientaba la bomba verticalmente en lugar de horizontalmente (por ejemplo, Figuras 4-6). El tubo con el aceite de emulsi6n se aline6 sobre la placa de agitaci6n

10 de modo que estuviera centrado por debajo de la aguja de jeringuilla de plastico y la barra de agitaci6n magnetica pudiera girar apropiadamente. La bomba de jeringuillas se fij6 para dispensar 0,6 ml a 5,5 ml/hora. La soluci6n de peR y perlas se anadi6 al aceite de emulsi6n gota a gota. Se tuvo cuidado para asegurar que las gotitas no se ponian en contacto con los lados del tubo a medida que caian en el aceite que estaba girando.

Una vez formada la emulsi6n, se tuvo gran cuidado para reducir al minimo la agitaci6n de la emulsi6n tanto durante

15 el procedimiento de emulsificaci6n como en las etapas siguientes de distribuci6n de partes alicuotas despues de la emulsificaci6n. Se encontr6 que la agitaci6n con formaci6n de v6rtice, un pipeteado rapido o un proceso de mezclado excesivo, podia hacer que la emulsi6n se rompiera, destruyendo los microrreactores discretos. Al formar la emulsi6n, las dos soluciones se transformaron en una mezcla blanca, lechosa, homogenea, con la viscosidad de una mayonesa. Los contenidos de la jeringuilla fueron vaciados en el aceite en rotaci6n. Despues, se retir6 el tubo de

20 emulsi6n de la pieza de soporte, y suavemente se le golpe6 con el dedo hasta que desapareci6 la capa de aceite residual de la parte superior de la emulsi6n. El tubo se volvi6 a colocar en la pieza de soporte y se agit6 con la barra magnetica durante un periodo adicional de un minuto. Se retir6 la barra de agitaci6n de la emulsi6n haciendo pasar un util magnetico de retirada a lo largo del exterior del tubo, y se desech6 la barra de agitaci6n.

Se tomaron veinte microlitros de la emulsi6n desde la parte media del tubo usando una pipeta p-100 y se coloc6

25 sobre un porta de microscopio. Las puntas de pipeta mayores se utilizaron para minimizar las fuerzas de cizalla. La emulsi6n se inspeccion6 a 50 aumentos para asegurar que comprendia, predominantemente, perlas aisladas en microrreactores de 30 a 150 micr6metros de diametro, de soluci6n de peR en aceite (Figura 7). Despues del examen visual, las emulsiones fueron amplificadas inmediatamente.

Ejemplo 13: Amplificaci6n

30 La emulsi6n se distribuy6 en partes alicuotas en 7-8 tubos de peR separados. eada tubo incluia, aproximadamente, 75 μl de la emulsi6n. Los tubos fueron cerrados hermeticamente y colocados en un aparato de termociclaci6n MJ junto con el testigo negativo de 25 μl anteriormente descrito. Se emplearon los tiempos de ciclo siguientes: 1 ciclo de incubaci6n durante 4 minutos a 94°e (Iniciaci6n de comienzo en caliente), 30 ciclos de incubaci6n durante 30 segundos a 94°e y 150 segundos a 68°e (Amplificaci6n), y 40 ciclos de incubaci6n durante 30 segundos a 94°e y

35 360 segundos a 68°e(Hibridaci6n y Extensi6n). Una vez completado el programa de peR, los tubos fueron separados y las emulsiones se rompieron inmediatamente o las mezclas de reacci6n fueron mantenidas a 10°e durante hasta 16 horas antes de iniciar el procedimiento de rotura.

Ejemplo 14: Rotura de la emulsi6n y recuperaci6n de las perlas

Despues de la amplificaci6n, las emulsiones fueron examinadas para determinar la rotura (separaci6n de las fases

40 oleosa y acuosa). Las emulsiones sin romper fueron combinadas en un tubo de microcentrifuga unico de 1,5 ml, al tiempo que la emulsi6n ocasional rota se desech6. Dado que las muestras de emulsi6n eran bastante viscosas permanecian en cada tubo de peR cantidades importantes. La emulsi6n que quedaba en los tubos se recuper6 anadiendo 75 μl de aceite mineral a cada tubo de peR y pipeteando la mezcla. Esta mezcla se anadi6 al tubo de 1,5 ml que contenia el grueso del material emulsionado. El tubo de 1,5 ml se agit6 con formaci6n de v6rtice durante 30

45 segundos. Despues de esto, el tubo se someti6 a centrifugaci6n durante 20 minutos en la microcentrifuga de sobremesa a 13,2K rpm (velocidad total).

Despues de centrifugar, la emulsi6n se separ6 en dos fases con una interfase blanca grande. Se desech6 la fase superior oleosa, clara, mientras que el material de la interfase, turbio, se dej6 en el tubo. En una cabina de humos, se anadi6 1 ml de hexanos a la fase inferior y la capa de interfase. La mezcla se agit6 con formaci6n de v6rtice 50 durante 1 minuto y se centrifug6 a total velocidad durante 1 minuto en una microcentrifuga de sobremesa. Se separ6 la fase superior de aceite/hexano y se desech6. Despues de esto, se anadi6 1 ml de tamp6n de hibridaci6n 1X/etanol de 80%, a la fase acuosa, interfase y perlas, restantes. Esta mezcla se agit6 con formaci6n de v6rtice durante 1 minuto o hasta que el material blanco de la interfase se habia disuelto. Entonces se centrifug6 la muestra durante 1 minuto en una microcentrifuga de sobremesa a total velocidad. El tubo se hizo rotar 180 grados y se

55 centrifug6 de nuevo durante un minuto mas. Luego se separ6 cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pelet de perlas.

El pelet de perlas blanco se lav6 dos veces con 1 ml de tamp6n de hibridaci6n que contenia Tween 20 al 0,1%. Se desech6 la soluci6n de lavado y las perlas fueron sometidas a peletizaci6n despues de cada lavado segun se ha descrito anteriormente. El pelet se lav6 con un 1 ml de agua picopura. Las perlas fueron sometidas a peletizaci6n con el metodo de centrifuga-rotaci6n-centrifuga utilizado anteriormente. la fase acuosa se separ6 cuidadosamente. Las perlas fueron lavadas luego con 1 ml de EDTA 1 mM como antes, excepto que las perlas se agitaron con formaci6n de v6rtice brevemente a media velocidad durante 2 segundos antes de formar los pelets y de la retirada

5 del sobrenadante.

El DNA amplificado, inmovilizado sobre las perlas de captura, fue tratado apara obtener DNA monocatenario. La segunda cadena fue separada por incubaci6n en una soluci6n Melt basica. Un ml de soluci6n Melt (NaOH 0,125 M, Nael 0,2 M) se anadi6 seguidamente a las perlas.. El pelet se volvi6 a suspender por agitaci6n con formaci6n de v6rtice a velocidad media durante 2 segundo y el tubo se coloc6 en un rodador de tubos Thermolyne LabQuake 10 durante 3 minutos. Despues, las perlas fueron sometidas a peletizaci6n como antes, y el sobrenadante se separ6 cuidadosamente y se desech6. La soluci6n Melt residual se neutraliz6 mediante la adici6n de 1 ml de tamp6n de hibridaci6n. Despues de esto, las perlas fueron agitadas con formaci6n de v6rtice, a velocidad media, durante 2 segundos. Las perlas fueron sometidas a peletizaci6n y el sobrenadante se separ6 como antes. Se repiti6 el lavado con tamp6n de hibridaci6n , excepto que solamente se separ6 despues de centrifugar 800 μl del tamp6n de

15 hibridaci6n. Las perlas y el resto del tamp6n de hibridaci6n se hicieron pasar a un tubo de peR de 0,2 ml. Las perlas fueron usadas inmediatamente o mantenidas a 4°e durante hasta 48 horas antes de continuar con el procedimiento de enriquecimiento.

Ejemplo 15: Enriquecimiento de las perlas

La masa de perlas incluia perlas con cadenas de DNA amplificadas, inmovilizadas, y perlas vacias o nulas. Segun

20 se ha mencionado anteriormente, se calcul6 que el 61% de las perlas carecia de DNA de molde durante el procedimiento de amplificaci6n. Se us6 enriquecimiento para aislar selectivamente las perlas con DNA de molde, haciendo maximo con ello la eficacia de la secuenciaci6n. El procedimiento de enriquecimiento se describe con detalle seguidamente.

Las perlas con una sola cadena procedente del Ejemplo 14 fueron sometidas a peletizaci6n con el metodo de

25 cenrifuga-rotaci6n-centrifuga y se separ6 tanto sobrenadante como fue posible sin alterar las perlas. Se anadi6 a las perlas quince microlitros de tamp6n de hibridaci6n, seguido por 2 μl de cebador de enriquecimiento de 40 bases, biotinilado, 100 μM (5'-biotina-tetra espaciadores de etilenglicol ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtctcag-3'; SEQ ID NO:5). El cebador era complementario de los sitios de amplificaci6n y secuenciaci6n combinados (cada uno de una longitud de 20 bases) sobre el extremo 3' del molde inmovilizado en la perla. La soluci6n se mezcl6 por

30 agitaci6n con formaci6n de v6rtice a velocidad media durante 2 segundos y los cebadores de enriquecimiento fueron hibridados con las cadenas de DNA inmovilizadas usando un programa regulado de desnaturalizaci6n/hibridaci6n en un aparato de termociclaci6n MJ. El programa consistia en los siguientes ciclos de tiempo y temperatura:: incubaci6n durante 30 segundos a 65°e, disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 58°e, incubaci6n durante 90 segundos a 58°e y mantenimiento a 10°e.

35 Mientras los cebadores se estaban hibridando, perlas de estreptavidina MyOne™ de Dynal fueron resuspendidas agitando suavemente por rotaci6n. A continuaci6n, 20 μl de las perlas MyOne™ fueron anadidos a un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml que contenia 1 ml de fluido de intensificaci6n (Nael 2 M, Tris-Hel 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La mezcla de perlas MyOne se agit6 durante 5 segundos con formaci6n de v6rtice y se coloc6 el tubo en un iman Mpe-S de Dynal. Las perlas paramagneticas se agruparon formando pelets en el lado del tubo de

40 microcentrifuga. Se separo cuidadosamente el sobrenadante y se desecho sin alterar las perlas MyOne™ Se separ6 el tubo del iman y se anadi6 100 μl de fluido de intensificaci6n. Se agit6 el tubo durante 5 segundos con formaci6n de v6rtice para volver a suspender las perlas, y se mantuvo sobre hielo hasta que se necesit6.

Una vez completado el programa de hibridaci6n se anadi6 100 μl de tamp6n de hibridaci6n al tubo de peR que contenia las perlas de captura de DNA y el cebador de enriquecimiento. Se agit6 el tubo durante 5 segundos con 45 formaci6n de v6rtice y el contenido se hizo pasar un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml de nueva aportaci6n. El tubo de peR en el que el cebador de enriquecimiento habia sido hibridado con las perlas de captura se lav6 una vez con 200 μl de tamp6n de hibridaci6n y la soluci6n de lavado se anadi6 al tubo de 1,5 ml. Las perlas fueron lavadas tres veces con 1 ml de tamp6n de hibridaci6n, agitadas durante 2 segundos con formaci6n de v6rtice y sometidas a peletizaci6n como anteriormente. El sobrenadante se separ6 cuidadosamente. Despues del tercer lavado, las perlas

50 fueron lavadas dos veces con 1 ml de fluido de intensificaci6n enfriado con hielo. Las perlas fueron agitadas con formaci6n de v6rtice, agrupadas en pelets, y el sobrenadante se separ6 como antes. Las perlas fueron resuspendidas en 150 μl de fluido de intensificaci6n enfriado con hielo y la soluci6n de perlas se anadi6 a las perlas MyOne™ lavadas.

La mezcla de perlas se agit6 durante 3 segundos con formaci6n de v6rtice y se incub6 a temperatura ambiente

55 durante 3 minutos en un rodador de tubos LabQuake. Las perlas MyOne™ revestidas con estreptavidina se unieron con los cebadores de enriquecimiento biotinilados hibridados con moldes inmovilizados situados sobre las perlas de captura de DNA. Despues las perlas fueron centrifugadas a 2.000 rpm durante 3 minutos, al cabo de cuyo tiempo las perlas fueron agitadas con formaci6n de v6rtice con impulsos de 2 segundos hasta que quedaron suspendidas de nuevo. Las perlas resuspendidas se colocaron sobre hielo durante 5 minutos. Despues de esto se anadi6 a las perlas 500 μl de fluido de intensificaci6n frio y el tubo se insert6 en un iman Mpe-S de Dynal. Las perlas fueron dejadas sin alterar durante 60 segundos para permitir la peletizaci6n contra el iman. Despues de esto, el sobrenadante con MyOne™ en exceso y perlas de captura sin DNA , se separ6 cuidadosamente y se desech6.

Se retir6 el tubo del iman Mpe-S y se anadi6 a las perlas 1 ml de fluido de intensificaci6n frio. Se volvi6 a suspender

5 las perlas golpeando suavemente el tubo con el dedo. Fue importante no formar v6ritce con las perlas en este momento ya que la mezcla con fuerza podia romper el enlace entre las perlas MyOne™ y las perlas de captura. Las perlas fueron devueltas al iman y se retir6 el sobrenadante. Se repiti6 el lavado tres veces mas para asegurar la separaci6n de todas las perlas de captura nulas. para separar los cebadores de enriquecimiento hibridados y las perlas MyOne™, las perlas de captura de DNA fueron resuspendidas en 400 μl de soluci6n de fusi6n, agitadas con

10 formaci6n de v6rtice durante 5 segundos y agrupadas formando pelets con el iman El sobrenadante con las perlas enriquecidas fue hecho pasar a un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml, separado. para la maxima recuperaci6n de las perlas enriquecidas, se anadi6 una segunda parte alicuota de 400 μl de soluci6n de fusi6n, al tubo que contenia las perlas MyOne™. Las perlas fueron agitadas con formaci6n de v6rtice y agrupadas formando pelets como antes. El sobrenadante procedente del segundo lavado se separ6 y se combin6 con el primer bolo de perlas enriquecidas. Se

15 desech6 el tubo de perlas MyOne™ agotado,

El tubo de microcentrifuga con perlas de captura de DNA enriquecidas, se coloc6 sobre el iman Mpe-S de Dynal para formar pelets con las perlas MyOne™ residuales. Las perlas enriquecidas existentes en el sobrenadante fueron transferidas a un segundo tubo de microcentrifuga de 1,5 ml y centrifugadas. Se separ6 el sobrenadante y las perlas fueron lavadas tres veces con 1 ml de tamp6n de hibridaci6n para neutralizar la soluci6n de fusi6n residual. 20 Despues del tercer lavado 800 μl del sobrenadante fueron separados y las perlas y la soluci6n restantes fueron hechas pasar a un tubo de peR de 0,2 ml. Las perlas enriquecidas fueron centrifugadas a 2.000 rpm durante 3 minutos y se desech6 el sobrenadante. A continuaci6n, se anadieron 20 μl de tamp6n de hibridaci6n y 3 μl de dos diferentes cebadores de secuenciaci6n 100 μM (5'-ccatctgttccctccctgtc-3'; SEQ ID NO:6; y 5'-cctatcccctgttgcgtgtc-3' fosfato; SEQ ID NO:7) fueron anadidos. El tubo se agit6 5 segundos con formaci6n de v6rtice y se coloc6 en un

25 aparato de termociclaci6n MJ para realizar el siguiente programa de hibridaci6n de 4 etapas: incubaci6n durante 5 minutos a 65°e, disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 50°e, incubaci6n durante 1 minuto a 50°e, disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 40°e, mantenimiento a 40°e durante 1 minuto, disminuci6n de 0,1°e/segundo hasta 15°e y mantenimiento en 15°e.

Una vez completado el programa de hibridaci6n, .as perlas fueron retiradas del aparato de termociclaci6n y

30 sometidas a peletizaci6n por centrifugaci6n durante 10 segundos. El tubo se hizo rotar 180° y se centrifug6 durante 10 segundos mas. Se decant6 el sobrenadante y se desech6, y se anadi6 al tubo 200 μl de tamp6n de hibridaci6n. Las perlas fueron resuspendidas con una segunda agitaci6n de 5 segundos con formaci6n de v6rtice, y agrupadas formando pelets como antes. Se separ6 el sobrenadante y se volvi6 a suspender las perlas en 100 μl de tamp6n de hibridaci6n. En este punto, las perlas fueron cuantificadas con un contador eoulter Multisizer 3 (Beckman eoulter).

35 Las perlas se mantuvieron a 4°e y fueron estables durante 1 semana por lo menos.

Realizaciones de la descripci6n

1. Un metodo para amplificar uno o mas acidos nucleicos, que comprende las etapas de

(a) formar una emulsi6n de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos en los que al menos uno de los microrreactores comprende un molde unico de acido nucleico, una sola perla capaz de uni6n

40 con acido nucleico, y soluci6n de reacci6n de amplificaci6n que contiene reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificaci6n de los acidos nucleicos.

(b)

amplificar los acido nucleicos de los microrreactores para formar copias amplificadas de dichos acidos nucleicos; y

(c)

unir las copias amplificadas con las perlas de los microrreactores.

45 2. El metodo de la realizaci6n 1, en el que la mayoria de los microrreactores incluyen un unico acido nucleico

3. El metodo de la realizaci6n 1, en el que dicha soluci6n de reacci6n de amplificaci6n es una soluci6n de reacci6n en cadena de la polimerasa que comprende nucle6tido trifosfatos, una polimerasa termoestable y cebadores de acidos nucleicos suspendidos en un tamp6n compatible con las condiciones de la reacci6n en cadena de la polimerasa.

50 4. El metodo de la realizaci6n 3, en el que dicha reacci6n en cadena de la polimerasa es una reacci6n en cadena de la polimerasa, asimetrica.

5.

El metodo de la realizaci6n 3, en el que dicha reacci6n en cadena de la polimerasa es una reacci6n en cadena de la polimerasa, simetrica.

6.

El metodo de la realizaci6n 1, en el que dicha emulsi6n contiene, adicionalmente, estabilizantes de emulsiones.

7.

El metodo de la realizaci6n 6, en el que dichos estabilizantes de emulsiones estan seleccionados entre el grupo que consiste en Atlox 4912, Span 80 y sus combinaciones y sus mezclas.

8.

El metodo de la realizaci6n 1, en el que dicha emulsi6n es termoestable.

9.

El metodo de la realizaci6n 8, en el que dicha emulsi6n es termoestable a 95°e.

5 10. El metodo de la realizaci6n 1, en el que la amplificaci6n se lleva a cabo mediante un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en amplificaci6n basada en la transcripci6n, amplificaci6n rapida de extremos de cDNA, amplificaci6n de flujo continuo, y amplificaci6n en circulo rodante

11. El metodo de la realizaci6n 1, en el que la emulsi6n se forma mediante la adici6n gota a gota a un aceite, de los moldes de acidos nucleicos, perlas, y soluci6n de reacci6n de amplificaci6n.

10 12. El metodo de la realizaci6n 1, realizado con al menos 10.000 acidos nucleicos.

13.

El metodo de la realizaci6n 1, realizado con al menos 50.000 acidos nucleicos.

14.

El metodo de la reivindicaci6n 1, en el que los microrreactores tienen un tamano medio de 50 a 250 μm de diametro.

15. El metodo de la realizaci6n 1, en el que despues de la etapa (c) cada perla captura mas que 10.000 copias de 15 amplificaci6n de un molde de acido nucleico.

16. Un banco de DNA que comprende una pluralidad de moleculas de acidos nucleicos, en el que cada molecula de acido nucleico es inmovilizada por separado en una perla diferente, y en la que cada perla comprende mas de

1.000.000 de copias de amplificaci6n clonal de cada molecula de acido nucleico, en el que el banco esta contenido en un unico recipiente.

20 17. El banco de la realizaci6n 16, en el que las moleculas de acidos nucleicos estan seleccionadas entre el grupo que consiste en DNA gen6mico, cDNA, DNA episomal, BAe DNA y YAe DNA.

18. El banco de la realizaci6n 17, en el que el DNA gen6mico esta seleccionado entre el grupo que consiste en DNA gen6mico animal, vegetal, viral, bacteriano y fungico.

19. El banco de la realizaci6n 18, en el que el DNA gen6mico es DNA gen6mico humano o cDNA humano. 25 20. El banco de la realizaci6n 16, en la que la perla tiene un diametro de 2 micr6metros a 100 micr6metros.

21.

El banco de la reivindicaci6n 16, en la que la perla es una perla de Sepharose.

22.

Un metodo para amplificar un acido nucleico, que comprende las etapas de

(a)

proporcionar un molde de acido nucleico que ha de ser amplificado:

(b)

proporcionar un material s6lido de soporte que comprende una perla generalmente esferica que tiene un

30 diametro de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 μm, en el que la perla es capaz de uni6n con el molde de acido nucleico;

(c) mezclar el molde de acido nucleico y la perla en el seno de una soluci6n de reacci6n de amplificaci6n que contiene reactivos necesarios para realizar una reacci6n de amplificaci6n de acidos nucleicos, en una emulsi6n de agua en aceite;

35 (d) amplificar el molde de acido nucleico para formar copias amplificadas de dicho molde de acido nucleico; y

(e) unir las copias amplificadas con la perla..

23. Un kit para realizar la amplificaci6n de acidos nucleicos, de un molde de acido nucleico, que comprende :

(a) perlas de captura de acido nucleicos:

(b) un aceite de emulsi6n; 40 (c) uno o mas estabilizantes de emulsiones;

(d) instrucciones para llevar a cabo el metodo de la realizaci6n 1 6 de la realizaci6n 22.

24. El metodo de la realizaci6n 1 6 de la realizaci6n 22, que comprende, ademas, la etapa de enriquecimiento de las perlas que unen copias amplificadas del acido nucleico, fuera de las perlas con las que no esta unido acido nucleico, cuya etapa de enriquecimiento esta seleccionada entre el grupo que consiste en purificaci6n por afinidad,

45 electroforesis y distribuci6n celular.

25.

El metodo de la realizaci6n 24, en el que la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo por purificaci6n por afinidad con perlas magneticas que fijan acido nucleico;

26.

El metodo de la realizaci6n 1 6 22, en el que al menos 100.000 copias cada molecula de acido nucleico diana se unen con cada perla;

5 27. El metodo de la realizaci6n 1 6 22, en el que al menos 1.000.000 de copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen con cada perla

28.

El metodo de la realizaci6n 1 6 22, en el que entre al menos 1a 20.000.000 de copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen con cada perla.

29.

El de la realizaci6n 1 6 22, en el que las perlas son perlas de Sepharose;

10 30. El metodo de la realizaci6n 1 6 22, en el que las copias amplificadas se unen con la perlas mediante un par de uni6n seleccionado entre el grupo que consiste en antigeno/anticuerpo, ligando/receptor y polihistidina/niquel

31.

El metodo de la realizaci6n 30, en el que el par de uni6n es avidina/biotina;

32.

El metodo de la realizaci6n 25, que comprende ademas las etapas de;

separar las perlas que llevan molde y las perlas magneticas; y 15 retirar las perlas magneticas con un campo magnetico.

33.

El metodo de la realizaci6n 32, en el que la separaci6n se consigue por incubaci6n a una temperatura mayor que 45°e o por incubaci6n de las perlas que llevan molde y las perlas magneticas en una soluci6n con un pH basico.

34.

Un metodo para producir una poblaci6n clonal de acidos nucleicos, que comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de moldes de acido nucleico desde 50 a 800 bp de longitud, y perlas capaces 20 de unirse con los moldes de acido nucleico;

(b)

mezclas los moldes de acido nucleico y las perlas en una soluci6n biol6gica de reacci6n que contiene reactivos necesarios para amplificar los moldes de acido nucleico:

(c)

formar una emulsi6n para crear una pluralidad de microrreactores que comprenden los moldes de acido nucleico,. perlas y soluci6n biol6gica de reacci6n, en el que al menos uno de los microrreactores comprende un

25 molde unico de acido nucleico y una sola perla encapsulados en la soluci6n biol6gica de reacci6n, en el que los microrreactores estan contenidos en el mismo recipiente.

35.

El metodo de la realizaci6n 34, que comprende, ademas, transcribir y traducir los acidos nucleicos para generar al menos 10.000 copias de un producto de expresi6n.

36.

El metodo de la realizaci6n 35, en el que dicho producto de expresi6n esta unido a dichas perlas por un par de

30 uni6n seleccionado entre el grupo que consiste en pares de uni6n de antigeno/anticuerpo, ligando/receptor, his6X/niquel-acido nitrilotriacetico, y FLAG tag/FLAG anticuerpo

37.

El metodo de la realizaci6n 35 en el que el metodo produce una poblaci6n clonal de proteinas

38.

El metodo de la realizaci6n 37, en el que las proteinas estan seleccionadas entre el grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y anticuerpos obtenidos por ingenieria.

35 39. Una emulsi6n que comprende una pluralidad de microrreactores termoestables, en la que los microrreactores tienen 50 a 200 μm de diametro y comprenden una soluci6n biol6gica de reacci6n

40. La emulsi6n de la realizaci6n 39, en la que la soluci6n biol6gica de reacci6n comprende reactivos para llevar a cabo amplificaci6n por reacci6n en cadena de la polimerasa.

41, La emulsi6n de la realizaci6n 39, en la que la soluci6n de reacci6n biol6gica comprende reactivos para llevara 40 cabo reacciones copuladas de transcripci6n y traducci6n.

42.

La emulsi6n de la realizaci6n 40 6 la realizaci6n 41, en la que la pluralidad de microrreactores comprenden un molde de acido nucleico.

43.

La emulsi6n de la realizaci6n 42, en la que la pluralidad de microrreactores comprenden uno o menos moldes de acido nucleico.

45 44. La emulsi6n de la realizaci6n 43, en la que la pluralidad de microrreactores comprende una o menos perlas que se unen con los moldes de acido nucleico.

Listado de secuencias

<110> Berka, Jan ehen, Yi-Ju Leamon, John H.

5 Lefkowitz, Steve Lohman, Kenton Makhijani, Vinod Sarkis, Gary J. Rothberg, Jonathan

10 Rothberg, Jonathan Weiner, Michael Srinivasan, Maithreyan

<120> Amplificaci6n de acidos nucleicos en emulsi6n en perlas

<130> 21465-508 UTIL

15 <150> US 60/443.471

<151> 2003-01-29

<150> US 60/465.071

<151> 2003-04-23

<150> US 60/476.592 20 <151> 2003-06-06

<150> US 60/476.504

<151> 2003-06-06

<150> US 60/476.592

<151> 2003-06-06

25 <150> US 60/476.602

<151> 2003-06-06

<150> US 60/497.985

<151> 2003-08-25

<160> 7

30 <170> patentln, versi6n 3,2

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

35 <220>

<223> oligonucle6tido

<400> 1 gcttacctga ccgacctctg cctatcccct gttgcgtgtc 40

<210> 2 40 <211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucle6tido

45 <400> 2 ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA 50 <213> Artificial

<220> <223> oligonucle6tido

<400> 3 gcttacctga ccgacctctg

20

5

<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial

10

<220> <223> oligonucle6tido

<400> 4 ccattcccca gctcgtcttg

20

15

<210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> oligonucle6tido

20

<400> 5 ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc tcag 44

<210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial

25

<220> <223> oligonucle6tido

<400> 6 ccatctgttc cctccctgtc

20

30

<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> oligonucle6tido

35

<400> 7 cctatcccct gttgcgtgtc 20

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para enriquecer un amplic6n, que comprende:

   (a) distribuir una soluci6n que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas de emulsi6n acuosa en una fase oleosa termoestable;

   5 en el que un primer subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas y una o mas de las especies de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

   (b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde del primer subconjunto de gotitas, en el 10 que una o mas perlas del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplic6n inmovilizado en ellas;

   (c)

   romper las gotitas de emulsi6n acuosa para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

   (d)

   hibridar con el amplic6n inmovilizado en las perlas un cebador que es complementario del extremo 3' del amplic6n; y o bien:

   (e)(i) formar un complejo de perla con amplic6n inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que

   15 la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana, y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condici6n selectiva; y

   (f)(i) aplicar la condici6n selectiva para aislar el complejo de perla con amplic6n inmovilizado y perla de enriquecimiento, desde las perlas que no tienen amplic6n unido; o bien

   (e)(ii) exponer las perlas con amplic6n inmovilizado a una o mas superficies de uni6n que comprenden

   20 restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplic6n inmovilizado, y separar las perlas con amplic6n inmovilizado desde las perlas que no tienen amplic6n unido.
2. 2. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que la soluci6n comprende una raz6n del numero de las moleculas de acido nucleico de molde al numero de las perlas, menor que 1

   25 3. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que la soluci6n comprende, ademas, una mezcla suficiente de reactivos necesarios para llevar a cabo una reacci6n de amplificaci6n de las especies de moleculas de acido nucleico de molde.

3. 4. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que la etapa de amplificaci6n emplea un procedimiento de amplificaci6n de reacci6n en cadena de la polimerasa.

   30 5. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que el cebador complementario del extremo 3' del amplic6n de la etapa

   (d) tiene, al menos, 15 bases.
4. 6. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que el metodo comprende las etapas (e)(i) y (f)(i) y en el que la condici6n selectiva comprende un campo magnetico que permite aislar una o mas de las perlas de enriquecimiento desde las perlas del segundo subconjunto.

   35 7. El metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende, ademas, determinar una composici6n de acido nucleico para la una o mas especies de moleculas de acido nucleico de molde.

   8, El metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende, ademas, reciclar y reutilizar las perlas del segundo subconjunto.
5. 9. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que el cebador complementario del extremo 3' del amplic6n de la etapa

   40 (d), es un cebador biotinilado que en la etapa (e)(i) o en la etapa (e)(ii) esta inmovilizado por un resto de estreptavidina formando un par de biotina-estreptavidina, de captura-diana.
6. 10. El metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende, ademas, extender el cebador hibridado con el extremo 3' del amplic6n de la etapa (d) por adici6n de DNA polimerasa y de los cuatro desoxinucle6tido trifosfatos (dNTps) naturales a la mezcla de perlas, en el que la extensi6n intensifica la uni6n entre el cebador y el amplic6n

   45 inmovilizado en la perla.
7. 11. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que la reivindicaci6n 1 comprende la etapa (c)(ii) y en el que el metodo comprende, ademas: verter las perlas del primer y segundo subconjuntos que existen en una soluci6n, sobre la una

   o mas superficies de uni6n, en el que las perlas del segundo subconjunto permanecen en la soluci6n 12. El metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que la reivindicaci6n 1 comprende las etapas (e)(i) y (f)(i) y en el que el metodo comprende, ademas: separar el cebador desde el amplic6n inmovilizado en la perla para separar las perlas de enriquecimiento desde las perlas con amplic6n inmovilizado.

   30

   31

   32

   33

   34

   35

   36

   37

   38