ES2389737T3 - Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5' - Google Patents

Abstract

Un nucleósido bicíclico que tiene la fórmula: **Fórmula**en la que:Bx es un resto de base heterocíclico;uno de entre T1 y T2 es H o un grupo protector hidroxilo y el otro de entre T1 y T2 es H, un grupo protectorhidroxilo o un grupo fósforo reactivo;Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquiniloC2-C6 sustituido o acilo sustituido;en la que cada grupo sustituido está mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionadosindependientemente de entre halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(>=O)NJ1J2,N(H)C(>=NH)NJ1J2 o N(H)C(>=X)N(H)J2 en la que X es O o S; ycada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, aminoalquilo C1-C6, aminoalquilo C1-C6 sustituido o ungrupo protector,en la que la expresión grupo fósforo reactivo se refiere a una fosforamidita, un H-fosfonato, un triéster de fosfatoo un auxiliar quiral que contiene fósforo.

Description

Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5’

Listado de secuencias

La presente solicitud se está presentando junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado CHEM0029WOSEQ.TXT, creado el 10 de mayo de 2007, que tiene un tamaño de 8 Kb.

Campo de la invenci6n

La presente invención proporciona nucleósidos bicíclicos modificados en 5’ y compuestos oligoméricos y composiciones preparadas a partir de los mismos. Más concretamente, la presente invención proporciona nucleósidos que tienen un puente 2’-O-CH2-4’ con un grupo adicional situado en la posición 5’ y oligómeros y composiciones preparadas a partir de los mismos. En una forma de realización preferente, el grupo 5’ está en una configuración concreta que proporciona el isómero (R) o (S). En determinadas formas de realización, las composiciones y los compuestos oligoméricos de la presente invención hibridan con una porción de un ARN diana que da como resultado la pérdida de la función normal del ARN diana.

Antecedentes de la invenci6n

La tecnología antisentido es un medio eficaz para reducir la expresión de uno o más productos génicos específicos y por lo tanto puede llegar a ser excepcionalmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. Los nucleósidos modificados químicamente se utilizan de manera rutinaria para su incorporación en secuencias antisentido para mejorar una o más propiedades, tales como por ejemplo la resistencia a las nucleasas. Uno de tales grupos de modificaciones químicas incluye nucleósidos bicíclicos en los que la porción furanosa del nucleósido incluye un puente que conecta dos átomos en el anillo de furanosa formando así un sistema de anillo bicíclico. Tales nucleósidos bicíclicos tienen diversos nombres, incluyendo BNA y LNA para ácidos nucleicos bicíclicos o ácidos nucleicos bloqueados, respectivamente.

Se han preparado y presentado diversos BNA en la literatura de patentes así como en la literatura científica, véanse por ejemplo: Singh y col., Chem. Commun., 1998,4, 455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Wengel y col., solicitud internacional PCT número PCT/DK98/00303 (publicada como WO 99/14226 el 25 de marzo de 1999), presentada el 14 de septiembre de 1998; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039, cuyos textos se incorporan en el presente documento por referencia, en su totalidad. Ejemplos de patentes expedidas en EE.UU. y solicitudes publicadas incluyen, por ejemplo: las patentes de los EE.UU. nº 6.770.748 6.268.490 y 6.794.499, y las solicitudes de los EE.UU. publicadas nº 20040219565, 20040014959, 20030207841, 20040192918, 20030224377, 20040143114, 20030087230 y 20030082807.

Se han preparado y presentado diversos nucleósidos modificados en 5’ en la literatura de patentes así como en la literatura científica, véanse por ejemplo: Mikhailov y col., Nucleosides and Nucleotides, 1991, 10, 393-343; Saha y col., J. Org. Chem., 1995, 60, 788-789; Beigleman y col., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 901-905; Wang, y col., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; y la solicitud internacional PCT WO94/22890 publicada el 13 de octubre de 1994.

Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad largamente sentida de agentes que regulen específicamente la expresión génica a través de mecanismos antisentido. En el presente documento se desvelan BNA modificados en 5’ y compuestos antisentido preparados a partir de los mismos útiles para modular las vías de expresión génica, que incluyen aquellas que dependen de mecanismos de acción tales como enzimas ARNasa H, ARNi y ARNbc, así como otros mecanismos antisentido basados en la degradación de la diana o la ocupación de la diana. Un experto en la materia, una vez provisto de la presente divulgación podrá, sin experimentación indebida, identificar, preparar y explotar compuestos antisentido para estos usos.

Breve sumario de la invenci6n

La presente invención proporciona nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula: en la que:

Bx es un resto de base heterocíclico; uno de entre T1 y T2 es H o un grupo protector hidroxilo y el otro de entre T1 y T2 es H, un grupo protector hidroxilo o un grupo fósforo reactivo según se define en la reivindicación 1;

5 Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (-C(=O)-); en la que cada grupo sustituido está mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de entre halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2,

10 N(H)C(=NH)NR1R2 o N(H)C(=X)N(H)J2 en la que X es O o S; y cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, aminoalquilo C1-C6, aminoalquilo C1-C6 sustituido

o un grupo protector.

En una forma de realización Z es alquilo C1-C6 sustituido. En otra forma de realización Z es metileno sustituido en el

15 que los grupos sustituyentes preferentes incluyen uno o más grupos seleccionados independientemente de entre F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 o (H)C(=O)N(H)J2. En una forma de realización cada J1 y J2 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.

En una forma de realización Z es metilo, etilo o metoximetilo. En otra forma de realización Z es metilo. En una forma de realización adicional Z es etilenilo. En otra forma de realización Z es acilo sustituido. En una forma de realización 20 adicional Z es C(=O)NJ1J2.

En una forma de realización, por lo menos uno de entre T1 y T2 es un grupo protector hidroxilo en el que una lista de grupos protectores hidroxilo preferentes incluye acetilo, t-butilo, t-butoximetilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, 1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 2-trimetilsililetilo, p-clorofenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, benzoilo, p-fenilbenzoilo, 2,6-diclorobencilo, difenilmetilo, p-nitrobencilo, trifenilmetilo (tritilo), 4,4’-dimetoxitritilo, trimetilsililo, trietilsililo,

25 t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, trifenilsililo, triisopropilsililo, benzoilformato, cloroacetilo, tricloroacetilo, trifluoroacetilo, pivaloílo, carbonato de 9-fluorenilmetilo, mesilato, tosilato, triflato, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, 9-fenilxantina-9-ilo (Pixylo) y 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX). Una lista de grupos protectores hidroxilo más preferentes incluye acetilo, bencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo y 4,4’-dimetoxitritilo.

En una forma de realización T2 es un grupo fósforo reactivo en el que una lista de grupos fósforo reactivos 30 preferentes incluye diisopropilcianoetoxi-fosforamidita y H-fosfonato.

En una forma de realización T2 es una diisopropilcianoetoxi-fosforamidita y T1 es 4,4’-dimetoxitritilo.

En una forma de realización, el grupo Z está en la configuración (R):

En una forma de realización, el grupo Z está en la configuración (S):

La presente invención también proporciona compuestos oligoméricos que comprenden por lo menos un monómero de la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclico; T3 es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo de unión de internucleósidos

5 fijado a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico; T4 es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo de unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico;

10 Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (-C(=O)-); en la que cada grupo sustituido está mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de entre halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2,

15 N(H)C(=NH)NR1R2 o N(H)C(=X)N(H)J2 en la que X es O o S; cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, aminoalquilo C1-C6, aminoalquilo C1-C6 sustituido

o un grupo protector; y en la que por lo menos uno de entre T3 y T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un

20 nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico

En una forma de realización Z es alquilo C1-C6 sustituido. En otra forma de realización Z es metileno sustituido en el que los grupos sustituyentes preferentes incluyen uno o más grupos seleccionados independientemente de entre F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O) NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 o N(H)C(=O)N(H)J2. En una forma de realización cada J1

25 y J2 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.

En una forma de realización Z es metilo, etilo o metoximetilo. En otra forma de realización Z es metilo. En una forma de realización adicional Z es etilenilo. En otra forma de realización Z es acilo sustituido. En una forma de realización adicional Z es C(=O)NJ1J2.

En una forma de realización T3 es H o un grupo protector hidroxilo. En otra forma de realización T3 es un grupo de

30 unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido o una subunidad monomérica. En una forma de realización adicional T3 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un oligonucleósido o un oligonucleótido. En otra forma de realización T3 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un compuesto oligomérico.

En una forma de realización T4 es H o un grupo protector hidroxilo. En otra forma de realización T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido o una subunidad monomérica. En una forma de

35 realización adicional T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un oligonucleósido o un oligonucleótido. En otra forma de realización T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un compuesto oligomérico.

En una forma de realización los compuestos oligoméricos se proporcionan con por lo menos un monómero en el que el grupo Z está en la configuración (R):

40 En una forma de realización los compuestos oligoméricos se proporcionan con por lo menos un monómero en el que el grupo Z está en la configuración (S):

En una forma de realización, por lo menos uno de entre T3 y T4 comprende un grupo de unión de internucleósidos seleccionado de entre fosfodiéster o fosforotioato. En otra forma de realización, cada grupo de unión de internucleósidos en el compuesto oligomérico es, independientemente, un fosfodiéster o un fosforotioato.

5 En una forma de realización los compuestos oligoméricos se proporcionan con por lo menos una región de por lo menos dos monómeros contiguos de nucleósidos bicíclicos sustituidos en 5’ de la invención. En otra forma de realización los compuestos oligoméricos se proporcionan con por lo menos dos regiones de por lo menos dos monómeros contiguos de nucleósidos bicíclicos sustituidos en 5’ de la invención. En una forma de realización adicional los compuestos oligoméricos se proporcionan con por lo menos dos regiones separadas de por lo menos

10 dos monómeros contiguos de nucleósidos bicíclicos modificados en 5’ de la invención que comprenden un compuesto oligomérico interrumpido.

En una forma de realización los compuestos oligoméricos se proporcionan con aproximadamente 8 a aproximadamente 40 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. En una forma de realización adicional el compuesto oligomérico comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 nucleósidos y/o

15 nucleósidos modificados o miméticos de longitud. En otra forma de realización más los compuestos oligoméricos comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente 16 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. En otra forma de realización los compuestos oligoméricos comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud.

También se proporcionan compuestos para uso en procedimientos de inhibición de la expresión génica que

20 comprenden poner en contacto una o más células, un tejido o un animal con un compuesto oligomérico de la invención.

Descripci6n detallada de la invenci6n

La presente invención proporciona nucleósidos bicíclicos modificados en 5’ y compuestos oligoméricos preparados a partir de los mismos. Más concretamente, la presente invención proporciona nucleósidos que tienen restos azúcar 25 ribofuranosilo bicíclicos modificados en 5’ (también denominados en el presente documento nucleósidos bicíclicos modificados en 5’ o BNA modificados en 5’) y oligómeros y composiciones preparadas a partir de los mismos. En una forma de realización preferente, el grupo que modifica la posición 5’ tiene una configuración concreta, proporcionando así la quiralidad (R) o (S). Los compuestos también se describen utilizando la nomenclatura IUPAC, por ejemplo, el ácido nucleico bicíclico sustituido en 5’-CH3 uracilo DMT fosforamidita tendría el nombre: 30 (1R,3R,4R,7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)-fosfinoxi]-1-[1-(S,R o ninguno para el racémico)-(4,4’-dimetoxitritil)oxi-etil]-3-(uracil-1-il)-2,5-dioxa-bicilo[2.2.1]heptano terminología (uracilo DMT fosforamidita por ejemplo) en la que la posición del etilo es (R), (S) o racémica y la base heterocíclica que se muestra como uracilo-1-il puede estar sustituida con cualquier base heterocíclica descrita en el presente documento. Los BNA modificados en 5’ de la presente invención resultan útiles para mejorar las propiedades deseadas de los

35 compuestos oligoméricos en los que se incorporan. Los oligómeros de la presente invención también pueden resultar útiles como cebadores y sondas en aplicaciones de diagnóstico.

En una forma de realización preferente, los nucleósidos bicíclicos modificados en 5’ de la presente invención tienen la estructura que se muestra a continuación:

40 En la que los asteriscos indican independientemente hidroxilo, hidroxilo protegido, enlace internucleósido que conecta el nucleósido bicíclico modificado en 5’ a un monómero u oligómero, un grupo fósforo reactivo, un conjugado unido opcionalmente u otro grupo analizado en el presente documento o útil en la tecnología antisentido.

La preparación de diversos BNA sustituidos en (5’-Z) se ve posibilitada en un aspecto por la sustitución de los reactivos de Grignard disponibles en el mercado (o sintetizados de manera alternativa) en los procedimientos 45 ilustrados en la sección de ejemplos. Por ejemplo véase el Ejemplo 1, Etapa C, donde se utiliza bromuro de metilmagnesio como reactivo de Grignard para proporcionar el análogo 5’-CH3-BNA. También pueden introducirse grupos sustituyentes utilizando reacciones de homologación de carbono funcionalmente similares conocidas para los expertos en la materia. La adición de nitrometano y la homologación a través de un epóxido se describe en Wang,

G.; Middleton, P. J. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 2739-2742 (véase también: Wang y col., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; y Saha y col., J. Org. Chem., 1995, 60, 788-789). Además, los reactivos de Grignard o de otro tipo adecuadamente funcionalizados pueden manipularse después de la adición para proporcionar análogos funcionalizados adicionales. Por ejemplo, el uso de reactivos de bromuro de alilmagnesio o vinilmagnesio introducirá un doble enlace, que podría funcionalizarse a muchos grupos diferentes, incluyendo funcionalidades tales como halometilo, metoximetilo, hidroximetilo apropiadamente protegido, aminometilo y otros diversos grupos funcionales.

En un aspecto de la presente invención, los nucleósidos bicíclicos modificados en 5’ de la presente invención resultan útiles para modificar de otro modo compuestos oligoméricos sin modificar en una o más posiciones. Tales compuestos oligoméricos modificados pueden describirse como que tienen un motivo concreto. Los motivos aplicables a la presente invención incluyen pero no se limitan a un motivo interrumpido, un motivo hemímero, un motivo blocámero, un motivo completamente modificado, un motivo modificado posicionalmente y un motivo alterno. Conjuntamente con estos motivos también puede utilizarse una amplia variedad de enlaces que incluyen, pero no se limitan a, enlaces fosfodiéster y fosforotioato utilizados de manera uniforme o en combinaciones. El posicionamiento de los nucleósidos bicíclicos modificados en 6 y el uso de estrategias de enlace pueden optimizarse fácilmente para la mejor actividad para una diana concreta.

Las patentes representativas de los EE.UU. que ilustran la preparación de motivos representativos incluyen, pero no se limitan a las nº 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922, algunas de las cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud. Los motivos también se desvelan en la solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 02 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005 y la PCT/US2005/019220, presentada el 02 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121372 el 22 de diciembre de 2005.

Las expresiones "compuesto estable" y "estructura estable" pretenden indicar un compuesto que es lo suficientemente robusto para superar el aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y la formulación en un agente terapéutico eficaz. En el presente documento sólo se contemplan los compuestos estables.

Los grupos sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en el presente documento están presentes en un grado recursivo. En este contexto, "sustituyente recursivo" significa que un sustituyente puede describir otro ejemplo de sí mismo. Dada la naturaleza recursiva de tales sustituyentes, en teoría, puede estar presente un gran número en cualquier reivindicación dada. Un experto habitual en la técnica de la química médica y de la química orgánica entiende que el número total de tales sustituyentes está razonablemente limitado por las propiedades deseadas del compuesto que se busca. Tales propiedades incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, propiedades físicas tales como el peso molecular, la solubilidad o el log P, propiedades de aplicación tales como la actividad contra la diana prevista, y propiedades prácticas tales como la facilidad de síntesis.

Los sustituyentes recursivos son un aspecto previsto de la invención. Un experto habitual en la técnica de la química médica y orgánica comprende la versatilidad de tales sustituyentes. En la medida en que los sustituyentes recursivos estén presentes en una reivindicación de la invención, el número total se determinará como se ha expuesto anteriormente.

El término "sustituyente" y la expresión "grupo sustituyente," tal como se utilizan en el presente documento, pretenden incluir grupos que por lo general se añaden a otros grupos o precursores para mejorar las propiedades deseadas o proporcionar los efectos deseados. Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o no protegidos y pueden añadirse a un sitio disponible o a muchos sitios disponibles en un precursor. Los grupos sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden estar fijados a un precursor directamente o a través de un grupo de unión tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo. Tales grupos incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxo sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-NRbbRcc)) imino (=NRbb), amido (-C(O)N-RbbRcc o -N(RBB)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)NRbbRcc o -N(RBB)C(O)ORaa), ureido (-N(RBB)C(O)NRbbRcc), tioureido (-N(RBB)C(S) NRbbRcc), guanidinilo (-N(RBB)C(=NRbb)NRbbRcc), amidinilo (-C(=NRbb) NRbbRcc o N-(Rbb)C(NRbb)Raa), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb), sulfonamidilo (-S(O)2NRbbRcc o N-(Rbb)-S(O)2Rbb ) y grupos conjugados. En los que cada Raa, Rbb y Rcc es H, un grupo funcional químico unido opcionalmente o un grupo sustituyente adicional con una lista preferente que incluye sin limitación H, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo.

Los grupos de unión o restos de unión bifuncionales tales como los conocidos en la técnica son aplicables a la presente invención. Los grupos de unión resultan útiles para la fijación de grupos funcionales químicos, grupos conjugados, grupos indicadores y otros grupos a los sitios selectivos en un precursor. En general, un resto de unión bifuncional comprende un resto hidrocarbilo que tiene dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales está seleccionado para unirse a una molécula precursora o compuesto de interés y el otro está seleccionado para unirse básicamente a cualquier grupo seleccionado tal como un grupo funcional químico o un grupo conjugado. En determinadas formas de realización, el engarce comprende una estructura de cadena o un oligómero de unidades que se repiten como etilenglicol o unidades de aminoácidos. Ejemplos de grupos funcionales que se utilizan de manera rutinaria en un resto de unión bifuncional incluyen, pero no se limitan a, electrófilos para reaccionar con grupos nucleófilos y nucleófilos para reaccionar con grupos electrófilos. En determinadas formas de realización, los restos de unión bifuncionales incluyen amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, insaturaciones (por ejemplo, enlaces dobles o triples), y similares. Determinados ejemplos no limitativos de restos de unión bifuncionales incluyen ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoic (ADO), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros grupos de unión incluyen, pero no se limitan a, alquilo C1-C10 sustituido, alquenilo C2-C10 sustituido o no sustituido, o alquinilo C2-C10 sustituido o no sustituido, en los que una lista no limitativa de grupos sustituyentes preferentes incluye hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.

El término "hidrocarbilo" incluye grupos que comprenden C, O y H. Se incluyen grupos lineales, ramificados y cíclicos con cualquier grado de saturación. Tales grupos hidrocarbilo pueden incluir uno o más heteroátomos seleccionados de entre N, O y S y pueden estar mono o poli sustituidos adicionalmente con uno o más grupos sustituyentes.

El término "alquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo lineal o ramificado saturado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen por lo general de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más generalmente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo más preferentes de 1 a 6 átomos de carbono. La expresión "alquilo inferior" tal como se utiliza en el presente documento incluye de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo tal como se utilizan en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyente adicionales.

El término "alquenilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene por lo menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen por lo general de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más generalmente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyente adicionales.

El término "alquinilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene por lo menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero no se limitan a, etinilo, 1-propinilo, 1 butinilo, y similares. Los grupos alquinilo incluyen por lo general de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más generalmente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 2 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyente adicionales.

El término "aminoalquilo" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical alquilo sustituido con un amino. Este término pretende incluir grupos alquilo C1-C12 que tienen un sustituyente amino en cualquier posición y en los que el grupo alquilo fija el grupo aminoalquilo a la molécula precursora. Las porciones alquilo o amino del grupo aminoalquilo pueden estar sustituidas adicionalmente con grupos sustituyentes.

El término "alifático", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en el que la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un enlace simple, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferentemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más generalmente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede estar interrumpida con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Tales grupos alifáticos, interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas, y poliiminas. Los grupos alifáticos tal como se utilizan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

El término "alicíclico" o "aliciclilo" se refiere a un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillo puede comprender uno o más anillos en los que por lo menos un anillo es alifático. Alicíclicos preferentes incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico tal como se utiliza en el presente documento puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

El término "alcoxi", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en el que el átomo de oxígeno se utiliza para fijar el grupo alcoxi de una molécula precursora. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Los términos "halo" y "halógeno", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a un átomo seleccionado de entre flúor, cloro, bromo y yodo.

Los términos "arilo" y "aromático", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a radicales de sistemas de anillo carbocíclicos mono o policíclicos que tienen uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Sistemas de anillo arilo preferentes tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Los términos "aralquilo" y "arilalquilo", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a un radical formado entre un grupo alquilo y un grupo arilo en el que el grupo alquilo se utiliza para fijar el grupo aralquilo a una molécula precursora. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales fijados al alquilo, al arilo, o a ambos grupos que forman el grupo radical.

La expresión "radical heterocíclico" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical de sistema de anillo mono o policíclico que incluye por lo menos un heteroátomo y que es insaturado, parcialmente saturado o completamente saturado, incluyendo así grupos heteroarilo. Heterocíclico pretende incluir también los sistemas de anillo fusionados en los que uno o más de los anillos fusionados contienen por lo menos un heteroátomo y los demás anillos pueden contener uno o más heteroátomos u, opcionalmente, no contener heteroátomos. Un grupo heterocíclico incluye por lo general por lo menos un átomo seleccionado de entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen, [1,3]dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y similares. Los grupos heterocíclicos tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Los términos "heteroarilo", y "heteroaromático," tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a un radical que comprende un anillo, sistema de anillo o sistema de anillo fusionado aromático mono o policíclico, en el que por lo menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. Heteroarilo también pretende incluir los sistemas de anillo fusionados, que incluyen los sistemas donde uno o más de los anillos fusionados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen por lo general un átomo en el anillo seleccionado de entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazoilo, quinoxalinilo, y similares. Los radicales heteroarilo pueden estar fijados a una molécula precursora directamente o a través de un resto de unión tal como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo tal como se utilizan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

El término "heteroarilalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo heteroarilo tal como se ha definido con anterioridad que tiene un radical alquilo que puede fijar el grupo heteroarilalquilo a una molécula precursora. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, piridinilmetilo, pirimidiniletilo, naftiridinilpropilo y similares. Los grupos heteroarilalquilo tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

La expresión "estructura mono o policíclica" tal como se utiliza en la presente invención incluye todos los sistemas de anillo que son sencillos o policíclicos que tienen anillos que están fusionados o unidos y pretende incluir los sistemas de anillo sencillos y mixtos seleccionados individualmente de entre alifático, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático, heteroarilalquilo. Tales estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que son uniformes o que tienen diferentes grados de saturación incluyendo completamente saturado, parcialmente saturado o completamente insaturado. Cada anillo puede comprender átomos en el anillo seleccionados de entre C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como anillos que comprenden sólo átomos de C en el anillo que pueden estar presentes en un motivo mixto tal como, por ejemplo, bencimidazol en el que un anillo tiene sólo átomos de carbono en el anillo y el anillo fusionado tiene dos átomos de nitrógeno. Las estructuras mono o policíclicas puede estar sustituidas adicionalmente con grupos sustituyentes tales como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =O fijados a uno de los anillos. En otro aspecto, las estructuras mono o policíclicas pueden estar fijadas a una molécula precursora directamente a través de un átomo en el anillo, a través de un grupo sustituyente o un resto de unión bifuncional.

El término "acilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X en la que X es por lo general alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo tal como se utilizan en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales. El término "oxo" se refiere al grupo (=O).

Los compuestos (por ejemplo, los nucleósidos bicíclicos modificados en 5’) descritos en el presente documento pueden prepararse mediante cualquiera de las técnicas aplicables de síntesis orgánica, como, por ejemplo, las ilustradas en los ejemplos que se presentan más adelante. Muchas de tales técnicas son bien conocidas en la técnica. Sin embargo, muchas de las técnicas conocidas se desarrollan en Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, Nueva York) Vol. 1, Ian T. Harrison and Shuyen Harrison (1971); Vol. 2, Ian T. Harrison y Shuyen Harrison (1974); Vol. 3, Louis S. Hegedus y Leroy Wade (1977); Vol. 4, Leroy G. Wade Jr., (1980); Vol. 5, Leroy G. Wade Jr. (1984); y Vol. 6, Michael B. Smith; así como March, J., Advanced Organic Chemistry, 3ª Edición, John Wiley & Sons, Nueva York (1985); Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry, en 9 volúmenes, Barry M. Trost, editor en jefe, Pergamon Press, Nueva York (1993); Advanced Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, 4ª Ed.; Carey y Sundberg; Kluwer Academic/Plenum Publishers: Nueva York (2001); Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, 2ª Edición, Marzo, McGraw Hill (1977); Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4ª Edición, Greene, T.W., y Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, Nueva York (2007); y Comprehensive Organic transformations, 2ª Edición, Larock, R.C., John Wiley & Sons, Nueva York (1999).

En un aspecto de la presente invención los compuestos oligoméricos son modificados por la fijación covalente de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto oligomérico fijado, que incluyen pero no se limitan a, farmacodinámica, farmacocinética, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y eliminación. Los grupos conjugados se utilizan de manera rutinaria en las técnicas químicas y están unidos directamente o a través de un grupo de unión o resto de unión opcional a un precursor tal como un compuesto oligomérico. Una lista preferente de grupos conjugados incluye, sin limitación, intercaladores, moléculas indicadoras, grupos de fármacos tales como ibuprofeno, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, restos de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.

La expresión "grupo protector", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto químico lábil que se sabe en la técnica que protege grupos reactivos que incluyen, sin limitación, grupos hidroxilo, amino y tiol, contra reacciones no deseadas durante los procedimientos sintéticos. Los grupos protectores se utilizan por lo general selectivamente y/u ortogonalmente para proteger los sitios durante las reacciones en otros sitios reactivos y a continuación pueden eliminarse para dejar el grupo no protegido tal cual o disponible para reacciones adicionales. Los grupos protectores como se conocen en la técnica se describen de forma general en el documento de Greene Protective Groups in Organic Synthesis, 4ª Edición, Greene, T.W., y Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, Nueva York (2007).

Los grupos pueden incorporarse selectivamente en los compuestos oligoméricos de la invención como precursores. Por ejemplo, puede colocarse un grupo amino en un compuesto de la invención como grupo azido que puede convertirse químicamente en el grupo amino en un punto deseado en la síntesis. Generalmente, los grupos están protegidos o presentes como el precursor que será inerte a las reacciones que modifican otras zonas de la molécula precursora para la conversión en sus grupos finales en un momento apropiado. Los grupos precursores o protectores representativos adicionales se analizan en Agrawal, y col., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; Nueva Jersey, 1994; Vol. 26 págs. 1-72.

Los ejemplos de grupos protectores hidroxilo incluyen, pero no se limitan a, t-butilo, t-butoximetilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, 1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 2-trimetilsililetilo, p-clorofenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, 2,6-diclorobencilo, difenilmetilo, p-nitrobencilo, bis(2-acetoxietoxi) metilo (ACE), 2-trimetilsililetilo, triisopropilsililo, [(triisopropilsililo)oximetilo (TOM), monometoxitritilo, dimetoxitritilo (DMT), trimetoxitritilo, 1 (2-fluorofenil) -4-metoxipiperidin-4-ilo (FPMP), 9-fenilxantina-9-ilo (Pixylo) y 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX), trifenilmetilo (tritilo), 4,4’-dimetoxitritilo, trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, trifenilsililo, benzoilformato, acetato, cloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, pivaloato, benzoato, p-fenilbenzoato, carbonato de 9-fluorenilmetilo, mesilato y tosilato. Donde los grupos protectores hidroxilo más preferentes incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2,6-diclorobencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, benzoilo, mesilato, tosilato, dimetoxitritilo (DMT), 9-fenilxantina-9-ilo (Pixylo) y 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX).

Los ejemplos de grupos protectores amino incluyen, pero no se limitan a, grupos protectores de carbamato, tales como 2-trimetilsililetoxicarbonilo (Teoc), 1-metil-1-(4-bifenilil)-etoxicarbonilo (Bpoc), t-butoxicarbonilo (BOC), aliloxicarbonilo (Alloc), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), y benciloxicarbonilo (Cbz); grupos protectores amida, tales como formilo, acetilo, trihaloacetilo, benzoilo, y nitrofenilacetilo; grupos protectores de sulfonamida, tales como 2-nitrobencenosulfonilo; y grupos protectores de imina e imida cíclica, tales como ftalimido y ditiasuccinoílo.

Los ejemplos de grupos protectores de tiol incluyen, pero no se limitan a, trifenilmetilo (tritilo), bencilo (Bn), y similares.

En determinadas formas de realización preferentes se preparan compuestos oligoméricos conectando nucleósidos con enlaces internucleósido que contienen fósforo opcionalmente protegido. Los grupos protectores representativos para los enlaces internucleósido que contienen fósforo tales como enlaces fosfodiéster y fosforotioato incluyen

�-cianoetilo, difenilsililetilo, o-cianobutenilo, ciano p-xililo (CPX), N-metil-N-trifluoroacetil etilo (META), acetoxi fenoxi etilo (APE) y grupos buteno-4-ilo. Véanse, por ejemplo las patentes de los EE.UU. nº 4.725.677 y Re. 34.069 (�-cianoetilo); Beaucage, S.L. e Iyer, RP, Tetrahedron, 49 nº 10, págs. 1925-1963 (1993); Beaucage, SL e Iyer, RP, Tetrahedron, 49 nº 46, págs. 10441-10488 (1993); Beaucage, SL e Iyer, RP, Tetrahedron, 48 nº 12, págs. 2223-2311 (1992).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión " protegido ortogonalmente" se refiere a grupos funcionales que están protegidos con diferentes clases de grupos protectores, en los que cada clase de grupo protector puede eliminarse en cualquier orden y en presencia de todas las demás clases (véase, Barany, G. y Merrifield, RB, J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 7363; idem, 1980,102, 3084). La protección ortogonal se utiliza ampliamente, por ejemplo, en la síntesis automatizada de oligonucleótidos. Se desbloquea un grupo funcional en presencia de uno o más de otros grupos funcionales protegidos, que no se ven influidos por el procedimiento de desbloqueo. Este grupo funcional desbloqueado se hace reaccionar de alguna manera, y en algún punto se elimina un grupo protector ortogonal adicional bajo un conjunto diferente de condiciones de reacción. Esto permite que la química selectiva llegue a un compuesto o compuesto oligomérico deseado.

La presente invención proporciona compuestos que tienen grupos fósforo reactivos útiles para formar enlaces internucleósido que incluyen, por ejemplo, enlaces internucleósido fosfodiéster y fosforotioato. Tales grupos fósforo reactivos son conocidos en la técnica y contienen átomos de fósforo en estado de valencia PIII o PV y se limitan a, fosforamidita, H-fosfonato, triésteres de fosfato y auxiliares quirales que contienen fósforo. Una síntesis en fase sólida sintética preferente utiliza fosforamiditas (química PIII) como fosfitos reactivos. Los compuestos fosfito intermedios se oxidan posteriormente al estado PV utilizando procedimientos conocidos para producir, en formas de realización preferentes, enlaces internucleósido fosfodiéster o fosforotioato. Fosfatos y fosfitos reactivos adicionales se desvelan en Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage y Iyer, Tetrahedron, 1992,48, 2223-2311).

Los ejemplos específicos de los compuestos oligoméricos útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen enlaces internucleósido de origen no natural, por ejemplo, modificados. Dos clases principales de enlaces internucleósido se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleósido modificados que tienen un átomo de fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil-fosfonatos incluyendo 3’-alquilenfosfonatos, 5’-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3’-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, esclenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos con enlaces 2’-5’ de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en los que uno o más enlaces internucleótido es un enlace 3’ a 3’, 5’ a 5’ o 2’ a 2’. Los oligonucleótidos que tienen polaridad invertida pueden comprender un enlace 3’ a 3’ sencillo en el enlace internucleótido más 3’, es decir, un residuo del nucleósido invertido sencillo que puede no tener base (la base nitrogenada se pierde o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas ácidas libres.

Las patentes de los EE.UU. representativas que ilustran la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriormente indicados incluyen, pero no se limitan a, los documentos: U.S. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050, algunos de los cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud.

Los enlaces internucleósido modificados que no tienen un átomo de fósforo incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se forman por enlaces internucleósido alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósido mixtos de heteroátomos y cicloalquilo o alquilo, o uno o más enlaces internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.

Las patentes de los EE.UU. representativas que ilustran la preparación de los oligonucleósidos anteriormente indicados incluyen, pero no se limitan a, los documentos: U.S. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 and 5.677.439, algunos de los cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud.

Los compuestos descritos en el presente documento contienen uno o más centros asimétricos y por lo tanto dan lugar a enantiómeros, diastereoisómeros, y otras formas estereoisómeras que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)-, a o �, o como (D)- o (L)-, tales como para los aminoácidos y otros. La presente invención pretende incluir todos estos isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras. Los isómeros ópticos pueden prepararse a partir de sus respectivos precursores ópticamente activos mediante los procedimientos descritos anteriormente, o resolviendo las mezclas racémicas. La resolución puede llevarse a cabo en presencia de un agente de resolución, mediante cromatografía o por cristalización repetida o por alguna combinación de estas técnicas que son conocidas para los expertos en la materia. Detalles adicionales acerca de las resoluciones pueden encontrarse en Jacques, y col., Enantiomers, Racemates, and Resolutions (John Wiley & Sons, 1981). Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos, otras insaturaciones, u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende que los compuestos incluyan los isómeros geométricos E y Z o los isómeros cis y trans. Asimismo, también pretenden incluirse todas las formas tautómeras. La configuración de cualquier doble enlace carbono-carbono que aparece en el presente documento está seleccionada sólo por razones de conveniencia y no pretende designar una configuración concreta, a menos que el texto así lo indique; de esta manera un doble enlace carbono-carbono o doble enlace carbono-heteroátomo representado arbitrariamente en el presente documento como trans puede ser cis, trans, o una mezcla de los dos en cualquier proporción.

En el contexto de la presente invención, la expresión "compuesto oligomérico" se refiere a un polímero que tiene por lo menos una región que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico. La expresión "compuesto oligomérico" incluye oligonucleótidos, análogos de oligonucleótidos y oligonucleósidos así como miméticos de nucleótidos y/o polímeros mixtos que comprenden componentes de ácido nucleico y de ácido no nucleico. Los compuestos oligoméricos se preparan de manera rutinaria linealmente pero pueden juntarse o prepararse de otra manera para que sean circulares y también pueden incluir la ramificación. Los compuestos oligoméricos pueden formar construcciones bicatenarias tales como, por ejemplo, dos hebras hibridadas para formar composiciones bicatenarias. Las composiciones bicatenarias pueden estar unidas o separadas y pueden incluir salientes en los extremos. En general, un compuesto oligomérico comprende una cadena principal de subunidades monoméricas unidas donde cada subunidad monomérica está directa o indirectamente fijada a un resto de base heterocíclica. Los compuestos oligoméricos también pueden incluir subunidades monoméricas que no están unidas a un resto de base heterocíclica proporcionando así sitios sin base. Los enlaces que juntan las subunidades monoméricas, los restos azúcar o sustitutos y los restos de base heterocíclica pueden modificarse independientemente. La unidad de azúcar de enlace, que puede incluir o no una base heterocíclica, puede estar sustituida con un mimético tal como los monómeros en los ácidos nucleicos peptídicos. La capacidad de modificar o sustituir porciones o monómeros enteros en cada posición de un compuesto oligomérico da lugar a un gran número de motivos posibles.

Como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son purinas y pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2’, 3’ ó 5’ del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente entre sí nucleósidos adyacentes para formar un compuesto polimérico lineal. Los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal pueden juntarse para formar una estructura circular por hibridación o por formación de un enlace covalente, sin embargo, generalmente se desean estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se atribuye comúnmente a los grupos fosfato la formación de los enlaces internucleósido del oligonucleótido. El enlace internucleósido normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3’ a 5’.

En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN). Este término incluye oligonucleótidos compuestos por nucleobases de origen natural, azúcares y enlaces internucleósido covalentes. La expresión "análogo de oligonucleótido" se refiere a oligonucleótidos que tienen una o más partes de origen no natural. Con frecuencia tales oligonucleótidos de origen no natural resultan más deseables que las formas de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad por la diana de ácido nucleico mejorada y una mayor estabilidad en presencia de nucleasas.

En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleósido" se refiere a una secuencia de nucleósidos que se juntan mediante enlaces internucleósido que no tienen átomos de fósforo. Los enlaces internucleósido de este tipo incluyen alquilo de cadena corta, cicloalquilo, alquil-heteroátomos mixtos, cicloalquil-heteroátomos mixtos, uno o más heteroatómos de cadena corta y uno o más heterocíclicos de cadena corta. Estos enlaces internucleósido incluyen, pero no se limitan a, siloxano, sulfuro, sulfóxido, sulfona, acetilo, formacetilo, tioformacetilo, metilformacetilo, tioformacetilo, alquenilo, sulfamato, metilenimino, metilenhidrazino, sulfonato, sulfonamida, amida y otros que tienen partes componentes N, O, S y CH2 mixtas.

Las patentes de los EE.UU. representativas que ilustran la preparación de los oligonucleósidos anteriormente indicados incluyen, pero no se limitan a, los documentos U.S.: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439, algunos de los cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud.

Los términos "nucleobase" o la expresión "resto de base heterocíclica" tal como se utiliza en el presente documento, pretende ser sinónimo de "base de ácido nucleico o mimético del mismo." En general, una base nitrogenada es cualquier subestructura que contiene uno o más átomos o grupos de átomos capaces de formar enlaces de hidrógeno con una base de un ácido nucleico. La expresión resto de base heterocíclica incluye, purinas, pirimidinas, bases heterocíclicas, bases modificadas, nucleobases modificadas y nucleobases de origen natural y de origen no natural.

Tal como se utiliza en el presente documento, nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, otras nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina y 2-aminoadenina. Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que se sustituye la base de purina o pirimidina con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen las desveladas en la patente de Estados Unidos nº 3.687.808, las desveladas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, las desveladas en Englisch y col., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y las desveladas en Sanghvi, YS, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, ST y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993.

Las nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño ampliado y bases fluoradas tal como se definen en el presente documento. Algunas de estas nucleobases son especialmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad dúplex del ácido nucleico en 0,6-1,2ºC (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y actualmente resultan preferibles las sustituciones de bases, incluso más concretamente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2’-O-metoxietilo.

Las patentes de los EE.UU. representativas que ilustran la preparación de algunas de las nucleobases modificadas anteriormente indicadas así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan al documento anteriormente indicado U.S. 3.687.808, así como los documentos U.S.: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; y 5.681.941, algunos de los cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud, y la patente de Estados Unidos 5.750.692, que es del mismo solicitante que la presente solicitud.

Además de tener por lo menos un nucleósido modificado BNA modificado en 5’, los compuestos oligoméricos de la presente invención también pueden contener uno o más nucleósidos adicionales que tienen restos azúcar modificados. El anillo de azúcar furanosilo puede estar modificado de una serie de maneras que incluyen la sustitución con un grupo sustituyente, la formación de puentes para formar un BNA y la sustitución del 4’-O con un heteroátomo tal como S o N(R). Determinadas patentes de los EE.UU. representativas que ilustran la preparación de tales azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a los documentos U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; 5.700.920. 6.600.032 y a la solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005, algunos de los cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud. Una lista representativa de azúcares modificados preferentes incluye, pero no se limita a, azúcares sustituidos que tienen un grupo sustituyente 2’-F, 2’-OCH2 o 2’-O(CH2)2-OCH3; azúcares modificados con 4’-tio y azúcares modificados bicíclicos.

Los compuestos oligoméricos de la presente invención también pueden contener uno o más nucleósidos que tienen restos azúcar modificados. El anillo de azúcar furanosilo puede estar modificado de una serie de maneras que incluyen la sustitución con un grupo sustituyente, la formación de puentes para formar un BNA y la sustitución del 4’-O con un heteroátomo tal como S o N(R). Determinadas patentes de los EE.UU. representativas que ilustran la preparación de tales azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a, los documentos U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; 5.700.920;

6.600.032 y la solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/12137 el 22 de diciembre de 2005 algunos de los cuales son del mismo solicitante que la presente solicitud. Una lista representativa de azúcares modificados incluye preferente, pero no se limita a, azúcares sustituidos que tienen un grupo sustituyente 2’-F, 2’-OCH2 o 2’-O(CH2)2-OCH3; azúcares modificados con 4’-tio y azúcares modificados bicíclicos.

Tal como se utiliza en el presente documento la expresión "mimético de nucleósido" pretende incluir aquellas estructuras utilizadas para sustituir el azúcar o el azúcar y la base, no el enlace, en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcares con morfolino o biciclo[3.1.0]hexilo, por ejemplo, unidades de azúcar distintas de furanosa con un enlace fosfodiéster. La expresión "sustituto de azúcar" se solapa con la expresión algo más amplia "mimético de nucleósido", pero pretende indicar sólo la sustitución de la unidad de azúcar (anillo de furanosa). La expresión "mimético de nucleótido" pretende incluir aquellas estructuras utilizadas para sustituir el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por enlaces -N(H)-C(=O)-O u otros enlaces no fosfodiéster.

Los compuestos oligoméricos de acuerdo con la presente invención comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. Un experto habitual en la técnica entenderá que la invención contiene compuestos oligoméricos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud, o cualquiera de sus intervalos.

En otra forma de realización, los compuestos oligoméricos de la invención tienen de 8 a 40 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. Un experto habitual en la técnica entenderá que esta incorpora compuestos oligoméricos de 8, 9,10,11, 12, 13, 4,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud, o cualquiera de sus intervalos.

En otra forma de realización, los compuestos oligoméricos de la invención tienen de 8 a 20 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. Un experto habitual en la técnica entenderá que esta incorpora compuestos oligoméricos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleósidos y/o nucleósidos modificados

o miméticos de longitud, o cualquiera de sus intervalos.

En otra forma de realización, los compuestos oligoméricos de la invención tienen de 10 a 16 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. Un experto habitual en la técnica entenderá que esta incorpora compuestos oligoméricos de 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud, o cualquiera de sus intervalos.

En otra forma de realización, los compuestos oligoméricos de la invención son de 10 a 14 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud. Un experto habitual en la técnica entenderá que esta incorpora compuestos oligoméricos de 10, 11, 12, 13 ó 14 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos de longitud, o cualquiera de sus intervalos.

La oligomerización de nucleósidos modificados y sin modificar y miméticos de los mismos, en un aspecto de la presente invención, se realiza de acuerdo con los procedimientos de la literatura para la síntesis de ADN (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press) y/o ARN (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217; Gait y col., Applications of Chemically synthesized RNA en RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36; Gallo y col., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713) según resulte apropiado. Procedimientos adicionales para síntesis en fase sólida pueden encontrarse en las patentes de los EE.UU. de Caruthers nº 4.415.732; 4.458.066; 4.500.707; 4.668.777; 4.973.679; y 5.132.418; y en las patentes de los EE.UU. de Koster U.S. nº 4.725.677 y Re. 34,069.

Los equipos disponibles en el mercado utilizados de manera rutinaria para la síntesis de compuestos oligoméricos y compuestos relacionados basada en medios de soporte son comercializados por varios proveedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). De manera alternativa o adicionalmente, puede emplearse cualquier otro medio para tal síntesis conocida en la técnica. Técnicas en fase sólida adecuadas, que incluyen las técnicas de síntesis automatizada, se describen en F. Eckstein (ed.), Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, Nueva York (1991).

La síntesis de ARN y análogos relacionados con respecto a la síntesis de ADN y análogos relacionados ha sido creciente al igual que los esfuerzos para aumentar el ARNi. Las estrategias de síntesis de ARN primario que actualmente se están utilizando comercialmente incluyen 5’-O-DMT-2’-O-t-butildimetilsililo (TBDMS), 5’-O-DMT-2’-O-[1(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-il] (FPMP), 2’-O-[(triisopropilsililo)oxi]metil(2’-O-CH2-O-Si (iPr)3 (TOM), y el 5’-O-sililéter-2’-ACE (5’-O-bis(trimetilsiloxi)ciclododeciloxisililéter (DOD)-2’-O-bis(2-acetoxietoxi)metil (ACE). Una lista actual de algunas de las principales empresas que ofrecen actualmente productos de ARN incluye Pierce Nucleic Acid Technologies, Dharmacon Research Inc., Ameri Biotechnologies Inc., e Integrated DNA Technologies, Inc. Una empresa, Princeton Separations, está comercializando un activador de la síntesis de ARN que se dice que reduce los tiempos de acoplamiento especialmente con las químicas de TOM y TBDMS. Un activador de este tipo también sería aplicable a la presente invención.

Los grupos primarios que se están utilizando para la síntesis de ARN comercial son:

TBDMS = 5’ O-DMT-2’-O-t-butildimetilsililo; TOM = 2’-O-[(triisopropilsililo)oxi]metilo; DOD/ACE = éter-2’-O-bis(2-acetoxietoxi)metílico de (5’-O-bis(trimetilsiloxi)ciclododeciloxisililo FPMP = 5’-O-DMT-2’-O-[1 (2 fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo].

Todas las estrategias de síntesis de ARN anteriormente mencionadas son aplicables a la presente invención. Las estrategias que sean un híbrido de las anteriores, por ejemplo utilizando un grupo protector de 5’ de una estrategia con un protector de 2’-O de otra estrategia son también aplicables a la presente invención.

En el contexto de la presente invención, "hibridación" se refiere al emparejamiento de hebras complementarias de compuestos oligoméricos. En la presente invención, un mecanismo de emparejamiento implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido, entre nucleósidos o bases de nucleótidos (nucleobases) complementarios de las hebras de los compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se emparejan a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede ocurrir en circunstancias variables.

Un compuesto oligomérico es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana causando una pérdida de actividad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de tratamiento terapéutico o ensayos in vivo, y en condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.

"Complementario", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso de dos nucleobases independientemente del lugar donde se encuentren situadas las dos. Por ejemplo, si una base nitrogenada en una determinada posición de un compuesto oligomérico es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una base nitrogenada en una determinada posición de un ácido nucleico diana, siendo el ácido nucleico diana un ADN, un ARN, o una molécula de oligonucleótido, entonces se considera que la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es una posición complementaria. El compuesto oligomérico y el ADN, ARN, o la molécula de oligonucleótido adicional son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula están ocupadas por nucleobases que pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí. De esta manera, "específicamente hibridable" y "complementario" son expresiones que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso a lo largo de un número suficiente de nucleobases de manera que se produzca la unión estable y específica entre el oligonucleótido y un ácido nucleico diana.

Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto oligomérico no necesita ser complementaria al 100% a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Además, un oligonucleótido puede hibridar a lo largo de uno o más segmentos de manera que los segmentos adyacentes o intermedios no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura en bucle o estructura en horquilla). Los compuestos oligoméricos de la presente invención pueden comprender por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente un 95%, o por lo menos aproximadamente el 99% de complementariedad de la secuencia con una región diana dentro de la secuencia del ácido nucleico diana a la que están dirigidos. Por ejemplo, un compuesto oligomérico en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto oligomérico son complementarias a una región diana, y por lo tanto hibridarían específicamente, representaría una complementariedad del 90 por ciento. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a las nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto oligomérico que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad global del 77,8% con el ácido nucleico diana y por lo tanto pertenece al ámbito de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto oligomérico con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse de manera rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamientos locales básicos) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).

En la presente invención se incluyen adicionalmente compuestos oligoméricos tales como compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencias guía externas (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con por lo menos una porción del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos oligoméricos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o en horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como bucles o protuberancias internas o terminales. Una vez introducidos en un sistema, los compuestos oligoméricos de la invención pueden obtener la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la modificación del ácido nucleico diana.

En un aspecto de la presente invención, se proporcionan oligómeros monocatenarios que hibridan con una diana de ácido nucleico y degradan la diana mediante el reclutamiento de una enzima endonucleasa. Un ejemplo no limitativo de tal enzima es la ARNasa H, una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos oligoméricos monocatenarios que son "de tipo ADN" obtienen ARNasa H. Por lo tanto, la activación de la ARNasa H da como resultado la escisión de la diana de ARN, mejorando de esa manera en gran medida la eficacia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. Se han postulado funciones similares para otras ribonucleasas tales como las de la familia de enzimas de la ARNasa III y la ribonucleasa L.

Aunque una forma de compuesto oligomérico es un oligonucleótido antisentido monocatenario, se ha demostrado que en muchas especies la introducción de estructuras bicatenarias, tales como moléculas de ARN bicatenario (ARNbc), induce una reducción mediada por antisentido potente y específica de la función de un gen o de sus productos génicos asociados. Este fenómeno se produce en las plantas y en los animales y se cree que tiene una conexión evolutiva con la defensa viral y el silenciamiento de transposones.

En determinadas formas de realización, pueden emplearse "segmentos diana adecuados" en un cribado de compuestos oligoméricos adicionales que modulan la expresión de una proteína seleccionada. "Moduladores" son aquellos compuestos oligoméricos que reducen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína y que comprenden por lo menos una porción de 8 nucleobases que es complementaria de un segmento diana adecuado. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana adecuado de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con uno o más moduladores candidatos, y seleccionar en busca de uno o más moduladores candidatos que reducen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína. Una vez que se demuestra que el modulador o los moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, reducir o aumentar) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido, a continuación puede emplearse el modulador en estudios adicionales de investigación de la función del péptido, o para su uso como un agente de búsqueda, diagnóstico o terapéutico de acuerdo con la presente invención.

Los segmentos diana adecuados de la presente invención también pueden combinarse con sus respectivos compuestos oligoméricos antisentido complementarios de la presente invención para formar oligonucleótidos bicatenarios (dúplex) estabilizados. Se ha mostrado en la técnica que tales restos de oligonucleótidos bicatenarios modulan la expresión dirigida y regulan la traducción, así como el procesamiento del ARN a través de un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden someterse a modificaciones químicas (Fire y col., Nature, 1998, 391, 806-811; Timmons y Fire, Nature 1998, 395, 854; Timmons y col., Gene, 2001, 263, 103-112; Tabara y col., Science, 1998, 282, 430-431; Montgomery y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl y col., Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197; Elbashir y col., Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashir y col., Genes Dev. 2001, 15, 188-200). Por ejemplo, se ha demostrado que tales restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de la hebra antisentido del dúplex a la diana, desencadenando así la degradación enzimática de la diana (Tijsterman y col., Science, 2002, 295, 694-697).

Los compuestos oligoméricos de la presente invención también pueden aplicarse en las áreas de descubrimiento de fármacos y validación de dianas. La presente invención comprende el uso de los compuestos oligoméricos y las dianas identificadas en el presente documento en los esfuerzos para el descubrimiento de fármacos para dilucidar las relaciones que existen entre las proteínas y un estado de enfermedad, un fenotipo, o una afección. Estos procedimientos incluyen la detección o modulación de un péptido diana que comprende poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con los compuestos oligoméricos de la presente invención, medir el nivel de ácido nucleico o proteína de la diana y/o un criterio de valoración fenotípico o químico relacionado en algún momento después del tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o una muestra tratada con un compuesto oligomérico adicional de la invención. Estos procedimientos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos para el proceso de validación de la diana o para determinar la validez de un producto génico concreto como diana para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, afección, o fenotipo concretos.

Se evalúa el efecto de las modificaciones de nucleósidos sobre la actividad del ARNi de acuerdo con la literatura existente (Elbashir y col., Nature (2001), 411, 494-498; Nishikura y col., Cell (2001), 107, 415-416; y Bass y col., Cell (2000), 101, 235-238.).

Los compuestos oligoméricos de la presente invención pueden utilizarse para el diagnóstico, la terapia, la profilaxis y como kits y reactivos de búsqueda. Además, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con una especificidad exquisita, son utilizados con frecuencia por los expertos habituales en la técnica para dilucidar la función de genes concretos o para distinguir entre las funciones de diversos miembros de una ruta biológica. Los compuestos oligoméricos de la presente invención, solos o en combinación con otros compuestos oligoméricos o agentes terapéuticos, pueden utilizarse como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para dilucidar patrones de expresión de una porción o del complemento completo de genes expresados en células y tejidos. Los compuestos oligoméricos también pueden utilizarse eficazmente como cebadores y sondas en condiciones que favorecen la amplificación o la detección de genes, respectivamente. Estos cebadores y sondas resultan útiles en los procedimientos que requieren la detección específica de proteínas que codifican moléculas de ácidos nucleicos y en la amplificación de las moléculas de ácidos nucleicos para su detección

o para su uso en estudios adicionales. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, especialmente los cebadores y sondas de la invención con un ácido nucleico, puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el radiomarcado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse kits que utilizan tales medios de detección para detectar el nivel de las proteínas seleccionadas en una muestra.

Como ejemplo no limitativo, los patrones de expresión en las células o tejidos tratados con uno o más compuestos oligoméricos se comparan con células o tejidos de referencia no tratados con compuestos oligoméricos y los patrones producidos se analizan en busca de niveles diferenciales de expresión génica por pertenecer, por ejemplo, a una asociación a enfermedades, una ruta de señalización, una localización celular, un nivel de expresión, un tamaño, una estructura o una función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse sobre células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos y/o compuestos oligoméricos que influyen en los patrones de expresión.

Los ejemplos de los procedimientos de análisis de expresión génica conocidos en la técnica incluyen las matrices o

5 micromatrices de ADN (Brazma y Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (análisis seriado de la expresión génica) (Madden, y col., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (amplificación con enzimas de restricción de ADNc digeridos) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análisis de la expresión génica total) (Sutcliffe, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), matrices de proteínas y proteómica (Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, y col.,

10 Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciación de secuencias etiquetadas por la expresión (EST) (Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, y col., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), toma de huellas de ARN sustractiva (SuRF) (Fuchs, y col., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson, y col., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonación sustractiva, presentación diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli, y col., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas FISH (hibridación

15 fluorescente in situ) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometría de masas (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).

Aunque la presente invención se ha descrito con especificidad de acuerdo con algunas de sus formas de realización, los siguientes ejemplos sirven sólo para ilustrar la invención y no pretenden limitar la misma.

Ejemplo 1

20 Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S) -7- [2-cianoetoxi (diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxietil]-3-(uracilo-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (19a)

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A) Preparaci6n del Compuesto 4

Se añadió una solución de cloruro de terc-butildimetilsililo (6,24 g, 40,7 mmoles) en diclorometano (10 ml) durante 10 minutos, a través de un embudo de adición, a una solución fría (0ºC) de Compuesto 2 (12 g, 38,8 mmoles, preparado de acuerdo con el procedimiento de Moffatt y col., J. Org. Chem. 1979, 44, 1301), trietilamina (11,44 ml, 81,5 mmoles) y 4-dimetilaminoetilpiridina (0,47 g, 3,9 mmoles) en CH2Cl2 (184 ml). Después de terminada la adición, se calentó gradualmente la reacción a temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas más. Se diluyó la reacción con CH2Cl2 y se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con 10% EtOAc/hexanos al 10% - EtOAc/hexanos al 20% - EtOAc/hexanos al 30%) dio el Compuesto 3 (11,53 g, 59%) y el Compuesto 4 (3,93 g, 22%) como sólidos blancos.

B) Preparaci6n del Compuesto 5

Se añadió dimetilsulfóxido (1,84 ml, 26,0 mmoles) a una solución fría (-78ºC) de cloruro de oxalilo (1,14 ml, 13,0 mmoles) en CH2Cl2 (70 ml). Se agitó la solución a -78ºC durante 30 minutos y se añadió una solución de Compuesto 4 (3,93 g, 9,3 mmoles) en CH2Cl2 (20 ml) a través de una cánula. Se continuó la agitación durante 45 minutos y se añadió a la reacción trietilamina (5,48 ml, 39,0 mmoles). Se agitó la reacción durante 40 minutos más después de lo cual se vertió en CH2Cl2 y la capa orgánica se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 5, que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

C) Preparaci6n del Compuesto 6a y del Compuesto 6b

Se agitó una suspensión de cloruro de cerio III (4,57 g, 18,6 mmoles) en THF (55 ml) a temperatura ambiente durante 90 minutos. La reacción se enfrió en un baño de hielo y se añadió bromuro de metilmagnesio (13,3 ml de una solución 1M en THF) durante 5 minutos y se continuó la agitación durante otros 90 minutos. Se añadió a la reacción una solución de Compuesto 5 bruto (anterior) en THF (15 ml). Después de agitar durante otros 90 minutos, se interrumpió la reacción con una solución de NH4Cl saturado y se vertió en EtOAc. La capa orgánica se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo secuencialmente con CHCl3; acetona/CHCl3 al 3%; y finalmente acetona/CHCl3 al 5%) dio el Compuesto 6a (2,25 g, 55% a partir del Compuesto 4) y el Compuesto 6b (1,84 g, 45% a partir del Compuesto 4).

6a 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,44-7,29 (m, 5H), 5,68 (d, 1H, J = 3,8), 4,76 (d, 1H, J = 12,0), 4,62 (d, 1H, J =12,0), 4,58 (m, 1H), 4,44 (d, 1H, J = 10,3), 4,08 (d, 1H, J = 5,3), 3,95 (m, 1H), 3,81 (d, 1H, J = 10,3), 2,84 (d, 1H, J = 7,5), 1,60 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 1,20 (d, 3H, J= 6,4), 0,88 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 6b 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,39-2,29 (m, 5H), 5,73 (d, 1H, J = 3,9), 4,76 (d, 1H, J = 11,7), 4,58 (m, 1H, parcialmente solapado), 4,56 (d, 1H, J = 11,7), 4,16 (d, 1H, J = 5,2), 4,14-4,04 (m, 3H), 2,43 (d, 1H, J = 3,8), 1,62 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 1,17 (d, 3H, J = 6,52), 0,88 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,05, (s, 3H),

D) Preparaci6n del Compuesto 7a

Se añadió cloruro de isobutirilo (0,67 ml, 6,3 mmoles) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 6a (2,29 g, 5,3 mmoles), trietilamina (1,06 ml, 7,6 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (77 mg, 0,6 mmoles) en CH2Cl2 (6 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 7a, que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

E) Preparaci6n del Compuesto Sa

Se añadió HF/piridina al 70% (1,25 ml) a una solución de Compuesto 7a bruto en THF (25 ml) en un tubo de polipropileno. Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se añadió a la reacción trietilamina (1,25 ml). Después de 10 minutos, se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se filtró. Se añadió trietilamina adicional (1,25 ml) a la solución de EtOAc y la reacción se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 8a, que se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

F) Preparaci6n del Compuesto 9a

Se añadió cloruro de metanosulfonilo (0,46 ml, 5,8 mmoles) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 8a bruto, trietilamina (1,1 ml, 7,8 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (60 mg, 0,5 mmoles) en CH2Cl2 (21 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se vertió la reacción en CHCl3 y la capa orgánica se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 9a, que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

G) Preparaci6n del Compuesto 10a

Se añadió H2SO4 concentrado (1 gota) a una solución de Compuesto 9a bruto en ácido acético glacial (9 ml) y anhídrido acético (1,3 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó con agua, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos al 40%) dio el Compuesto 10a (2,71 g, 99% a partir del Compuesto 6a) como un aceite incoloro.

H) Preparaci6n del Compuesto 11a

Se añadió N, O-bis(trimetilsilil)acetamida (3,9 ml, 15,7 mmoles) a una suspensión de Compuesto 10a (2,7 g, 5,2 mmoles) y uracilo (0,73 g, 6,5 mmoles) en MeCN (16 ml). Después de calentar a 40ºC durante 15 minutos para obtener una solución transparente, se añadió a la reacción triflato de trimetilsililo (1,23 ml, 6,8 mmoles). Después de someter a reflujo durante 2 horas, se enfrió la reacción a temperatura ambiente y se vertió en EtOAc. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 11a, que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

I) Preparaci6n del Compuesto 12a

Se añadió una solución de NaOH (2M, 11 ml) a una solución de Compuesto 11a bruto en 1,4-dioxano:H2O (1:1, 12 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se neutralizó la reacción con HCl acuoso al 5% (pH ~ 7) y se extrajo con una mezcla de piridina/EtOAc al 25%. La capa orgánica se lavó adicionalmente con salmuera al 50%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, MeOH/CHCl3 al 5%) dio el Compuesto 12a como un sólido blanco (1,56 g, 83% a partir del Compuesto 10a). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 8,48 (s, br, 1H), 7,71 (d, 1H, J = 8,2), 7,40-7,29 (m, 5H), 5,71 (d, 1H, J = 8,3), 5,67 (s, 1H), 4,67 (d, 2H, J =11,5), 4,54 (d, 1H, J = 11,5), 4,48 (s, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,03 (s, 1H, J = 7,8), 3,91 (s, 1H), 3,76 (d, 1H, J = 7,8), 1,32 (d, 3H, J = 6,6),

J) Preparaci6n del Compuesto 13a

Se añadió anhídrido isobutírico (0,86 ml, 5,2 mmoles) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 12a (1,56 g, 4,3 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (10 mg) en piridina (8,6 ml). Se agitó la reacción durante 16 horas durante las cuales se calentó gradualmente a temperatura ambiente. Se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, EtOAc/hexanos al 50%) dio el Compuesto 13a (1,68 g, 90%) como un sólido blanco.

K) Preparaci6n del Compuesto 14a

Se añadió cuidadosamente MeOH (20 ml) a una mezcla de Pd/C (10% p/p, 190 mg) y Compuesto 13a (1,68 g, 3,9 mmoles). La mezcla anterior se hidrogenó utilizando un globo de H2 durante 16 horas. El catalizador se eliminó por filtración a través de celita y se concentró para proporcionar una mezcla bruta de los Compuestos 13a y 14a. El procedimiento anterior se repitió hasta que no pudo detectarse Compuesto 13a (TLC) en la mezcla de reacción. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, MeOH/CHCl3 al 7%) dio el Compuesto 14a como un sólido blanco (1,35 g, 92%).

L) Preparaci6n del Compuesto 15a

Se añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (1,95 g, 13,0 mmoles) a una solución de Compuesto 14a (1,35 g, 4 mmoles) e imidazol (1,76 g, 25,9 mmoles) en DMF (8 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (MeOH/CHCl3 al 5%) dio el Compuesto 15a como un sólido blanco (1,63 g, 90%).

M) Preparaci6n del Compuesto 16a

Se añadió K2CO3 (0,99 g, 7,1 mmoles) a una solución de Compuesto 16a en MeOH (20 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, la reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (SiO2, MeOH/CHCl3 al 10%) para dar el Compuesto 16a como un sólido blanco (1,15 g, 75%).

N) Preparaci6n del Compuesto 17a

Se añadió cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (DMTCl) (2,53 g, 7,5 mmoles) a una solución de Compuesto 16a (1,15 g, 3,0 mmoles) y 2,6-lutidina (0,87 ml, 7,5 mmoles) en piridina (20 ml). Se calentó la reacción a 45ºC durante 24 horas después de lo cual se añadieron DMTCl (0,43 g, 1,3 mmoles) y 2,6-lutidina (0,15 ml, 1,27 g) adicionales. Después de calentar a 45ºC durante 24 horas más, se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, EtOAc/hexanos al 25% - EtOAc/hexanos al 50%) dio el Compuesto 17a como una espuma amarillenta (2,0 g, 97%). 17a 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 8,75 (s, br, 1H), 8,09 (d, 1H, J = 8,2), 7,49-7,19 (m, 9H), 6,82 (m, 4H), 5,68 (s, 1H), 5,66 (d, 1H, J = 8,2, parcialmente solapado), 4,33 (s, 1H), 4,24 (s, 1H), 3,86 (d, 1H, J = 7,6), 3,80 (s, 6H), 3,72 (m, 2H), 0,96 (d, 3H, J = 6,5), 0,77 (s, 9H), 0,03 (s, 3H), -0,10 (s, 3H),

N) Preparaci6n del Compuesto 1Sa

Se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (1,29 ml, 8,0 mmoles) a una solución de Compuesto 17a (1,09 g, 1,6 mmoles) y trietilamina (0,45 ml, 3,2 mmoles) en THF (8 ml) en un tubo de polipropileno. Después de agitar a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió la reacción en EtOAc y la fase orgánica se lavó secuencialmente con H2O, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con acetona/CHCl3 al 25% -acetona/CHCl3 al 40%) dio el Compuesto 18a (0,79 g, 86%) como una espuma blanca.

0) Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S) -7-[2-cianoetoxi(diisopropilaminofosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxietil]-3-(uracilo-1-il)-2,5-dioxa-biciclo [2.2.1] heptano, Compuesto 19a

Se añadió 2-cianoetil N,N'-tetraisopropilfosforamidita (0,43 ml, 2,0 mmoles) a una solución de Compuesto 18a (0,78 g, 1,4 mmoles), tetrazol (76,0 mg, 1,1 mmoles), N-metilimidazol (28 μl, 0,3 mmoles) en DMF (7 ml). Después de agitar durante 8 horas a temperatura ambiente, se vertió la reacción en EtOAc y la fase orgánica se lavó con salmuera al 90%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos al 60% - EtOAc/hexanos al 75%) dio el Compuesto 19a (0,91 g, 87%) como un sólido blanco. 19a 31P RMN (300 MHz, CDCl3) o: 149,1, 148,5.

Ejemplo 2

Preparaci6n de (1 R, 3R, 4R, 7S)-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(R)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-etil]3-(uracilo-1-il)-2,5-dioxa-biciclo [2.2.1]heptano, Compuesto 19b (Esquema 1)

A) Preparaci6n del Compuesto 7b

Se añadió cloruro de isobutirilo (0,55 ml, 5,2 mmoles) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 6b (1,90 g, 4,4 mmoles), trietilamina (0,88 ml, 6,3 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (53 mg, 0,4 mmoles) en CH2Cl2 (5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 7b que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

B) Preparaci6n del Compuesto Sb

Se añadió HF/piridina al 70% (2,0 ml) a una solución de Compuesto 7b bruto en THF (30 ml) en un tubo de polipropileno. Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se añadió a la reacción trietilamina (2,0 ml). Después de 10 minutos, se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se filtró. Se añadió trietilamina adicional (2,0 ml) a la solución de EtOAc y la reacción se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 8b, que se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

C) Preparaci6n del Compuesto 9b

Se añadió cloruro de metanosulfonilo (0,40 ml, 5,2 mmoles) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 8b bruto, trietilamina (0,88 ml, 6,3 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (53 mg, 0,4 mmoles) en CH2Cl2 (16 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se vertió la reacción en CHCl3 y la capa orgánica se lavó secuencialmente con HCl acuoso al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 9b, que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

D) Preparaci6n del Compuesto 10b

Se añadió H2SO4 concentrado (1 gota) a una solución de Compuesto 9b bruto en ácido acético glacial (9 ml) y anhídrido acético (1,3 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó con agua, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos al 40%) dio el Compuesto 10b (2,0 g, 90% a partir de 6b) como un aceite incoloro.

E) Preparaci6n del Compuesto 11b

Se añadió N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (2,73 ml, 11,0 mmoles) a una suspensión de Compuesto 10b (2,0 g, 3,9 mmoles) y uracilo (0,52 g, 4,6 mmoles) en CH3CN (11 ml). Después de calentar a 40ºC durante 15 minutos para obtener una solución transparente, se añadió a la reacción triflato de trimetilsililo (0,87 ml, 4,8 mmoles). Después de someter a reflujo durante 2 horas, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en EtOAc. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 11b bruto, que se utilizó sin purificación en la siguiente etapa.

F) Preparaci6n del Compuesto 12b

Se añadió una solución de NaOH (2M, 8,0 ml) a una solución de Compuesto 11b bruto en 1,4-dioxano:H2O (1:1, 8 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se neutralizó la reacción con HCl acuoso al 5% (pH ~ 7) y se extrajo con una mezcla de piridina/EtOAc al 25%. La capa orgánica se lavó adicionalmente con salmuera al 50%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, MeOH/CHCl3 al 5%) proporcionó el Compuesto 12b como un sólido blanco (1,30 g, 98% a partir del Compuesto 10b). 12b 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 8,90 (s, br, 1H), 7,52 (d, 1H, J = 8,2), 7,43-7,29 (m, 5H), 5,72 (d, 1H, J = 8,2), 5,64 (s, 1H), 4,68 (d, 1H, J = 11,5), 4,59 (s, 1H), 4,51 (d, 1H, J = 11,5), 4,31 (m, 1H, parcialmente solapado), 4,24 (d, 1H, J = 8,1), 3,96 (d, 1H, J = 8,1), 3,79 (s, 1H), 2,25 (d, 1H, J = 5,2), 1,34 (d, 3H, J = 6,6),

G) Preparaci6n del Compuesto 13b

Se añadió anhídrido isobutírico (0,60 ml, 3,6 mmoles) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 12b (1,08 g, 3,0 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (5 mg) en piridina (6 ml). Se agitó la reacción durante 16 horas durante las cuales se calentó gradualmente a temperatura ambiente. Se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 13b, que se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

H) Preparaci6n del Compuesto 14b

Se añadió cuidadosamente MeOH (20 ml) a una mezcla de Pd/C (10% p/p, 170 mg) y el Compuesto 13b. Se hidrogenó la mezcla anteriormente indicada utilizando un globo de H2 durante 16 horas. El catalizador se eliminó por filtración a través de celita y se concentró para proporcionar una mezcla bruta de los Compuestos 13b y 14b. El procedimiento anteriormente indicado se repitió hasta que no pudo detectarse el Compuesto 13b (TLC) en la mezcla de reacción. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, MeOH/CHCl3 al 7%) dio el Compuesto 14b como un sólido blanco (0,84 g, 83% a partir del Compuesto 12b).

I) Preparaci6n del Compuesto 15b

Se añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (1,49 g, 9,9 mmoles) a una solución de Compuesto 14b (0,84 g, 2,5 mmoles) e imidazol (1,35 g, 19,9 mmoles) en DMF (5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (MeOH/CHCl3 al 5%) dio el Compuesto 15b como un sólido blanco (0,92 g, 81%).

J) Preparaci6n del Compuesto 16b

Se añadió K2CO3 (0,70 g, 5,1 mmoles) a una solución de Compuesto 15b en MeOH (10 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, la reacción se concentró y se repartió entre salmuera al 90% y piridina/EtOAc al 25%. Se recogió la fase orgánica, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío para dar el Compuesto 16b bruto, que se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

K) Preparaci6n del Compuesto 17b

Se añadió cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (DMTCl) (1,87 g, 5,5 mmoles) a una solución de Compuesto 16b (0,71 g, 1,8 mmoles) y 2,6-lutidina (0,64 ml, 5,5 mmoles) en piridina (20 ml). Después de calentar a 45ºC durante 48 horas, se vertió la reacción en EtOAc y se extrajo con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, EtOAc/hexanos al 25% - EtOAc/hexanos al 50%) dio el Compuesto 17b como una espuma amarillenta (1,29 g, 93% a partir del Compuesto 15b). 17b 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 8,70 (s, br, 1H), 7,61 (d, 1H, J = 8,2), 7,49-7,16 (m, 9H), 6,82 (d, 4H, J = 8,9), 5,63 (s, 1H), 5,56 (d, 1H, J = 8,2), 4,25 (s, 1H), 3,97 (d, 1H, J = 8,1), 3,85 (s, 1H), 3,79 (s, 6H), 3,70 (d, 1H, J = 8,1), 3,58 (m, 1H), 1,12 (d, 3H, J = 6,6), 0,79 (s, 9H), 0,01 (s, 3H), -0,01 (3H)

L) Preparaci6n del Compuesto 1Sb

Se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (1,06 ml, 6,5 mmoles) a una solución de Compuesto 17b (0,89 g, 1,3 mmoles) y trietilamina (0,46 ml, 3,3 mmoles) en THF (6,5 ml) en un tubo de polipropileno. Después de agitar a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió la reacción en EtOAc y la fase orgánica se lavó secuencialmente con H2O, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con acetona/CHCl3 al 30% -acetona/CHCl3 al 45%) dio el Compuesto 18b (0,73 g, 98%) como una espuma blanca.

M) Pre paraci6n de (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1- [1 -(R)-(4,4'-dimetoxitritil) oxi-etil]-3-(uracilo-1-il)-2,5-dioxa-biciclo [2.2.1]heptano, Compuesto 19b

Se añadió 2-cianoetil N,N'-tetraisopropilfosforamidita (0,60 ml, 1,9 mmoles) a una solución de Compuesto 18b (0,73 g, 1,3 mmoles), tetrazol (71 mg, 1,0 mmoles), N-metilimidazol (26 μl, 0,3 mmoles) en DMF (6 ml). Después de agitar durante 8 horas a temperatura ambiente, se vertió la reacción en EtOAc y la fase orgánica se lavó con salmuera al 90%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con acetona/CHCl3 al 10% - acetona/CHCl3 al 15%) dio el Compuesto 19b (0,89 g, 91%) como un sólido blanco. 19b 31P RMN (300 MHz, CDCl3) o:149,4, 148,6.

Ejemplo 3

Preparaci6n d e (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxietil]-3-(4-N-benzoil-citosin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 24a

Se añadió, gota a gota, oxicloruro de fósforo (0,98 ml, 10,5 mmoles) a una suspensión fría (0ºC) de 1,2,4-triazol (3,10 g, 44,9 mmoles) en CH3CN (17 ml). Después de agitar durante 10 minutos, se añadió a la reacción trietilamina (7,4 ml, 51,8 mmoles) y se continuó la agitación durante 30 minutos. Se añadió a la reacción una solución de Compuesto 17a (0,91 g, 1,3 mmoles) en CH3CN (8 ml) y se continuó la agitación durante 4 horas a temperatura

10 ambiente. Se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó con H2O, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para dar el Compuesto 20a bruto, que se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

B) Preparaci6n del Compuesto 21a

Se añadió solución acuosa de amoníaco (4 ml) a una solución de Compuesto 20a en 1,4-dioxano (20 ml). Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la reacción se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con MeOH/CHCl3 al 5%) dio el Compuesto 21a (0,80 g, 89% a partir del Compuesto 17a) como un sólido blanco.

C) Preparaci6n del Compuesto 22a

Se añadió anhídrido benzoico (0,41 g, 1,8 mmoles) a una solución de Compuesto 21a (0,80 g, 1,2 mmoles) en N,N-dimetilformamida (3 ml). Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la reacción se concentró a alto vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos al 50%) dio el Compuesto 22a (0,81 g, 88%).

D) Preparaci6n del Compuesto 23a

Se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (1,00 ml, 6,1 mmoles) a una solución de Compuesto 22a (0,81 g, 1,1 mmoles) y trietilamina (0,35 ml, 2,5 mmoles) en THF (7 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó con H2O, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos al 90%) dio el Compuesto 23a (0,68 g, 99%).

E) Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxietil]-3-(4-N-benzoil-citosin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 24a

Se añadió 2-cianoetil N,N'-tetraisopropilfosforamidita (0,48 ml, 1,5 mmoles) a una solución de Compuesto 23a (0,68 g, 1,0 mmoles), tetrazol (56 mg, 0,81 mmoles), N-metilimidazol (20 μl, 0,3 mmoles) en DMF (5 ml). Después de agitar durante 8 horas a temperatura ambiente, se vertió la reacción en EtOAc y la fase orgánica se lavó con salmuera al 90%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc /hexanos al 60% - EtOAc/hexanos al 90%) dio el Compuesto 24a (0,73 g, 84%) como un sólido blanco. 24a 31P RMN (300 MHz, CDCl3) o: 149,4, 148,6.

Ejemplo 4

Preparaci6n d e (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(R)-(4,4'-dimetoxitritil)oxietil]-3-(4-N-benzoil-citosin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 24b (Esquema 2)

A) Preparaci6n del Compuesto 20b

Se añadió, gota a gota, oxicloruro de fósforo (1,3 ml, 14,0 mmoles) a una suspensión fría (0ºC) de 1,2,4-triazol (4,10 g, 59,5 mmoles) en CH3CN (30 ml). Después de agitar durante 10 minutos, se añadió a la reacción trietilamina (9,80 ml, 70,0 mmoles) y se continuó la agitación durante 30 minutos. Se añadió a la reacción una solución del Compuesto 17b (1,20 g, 1,8 mmoles) en CH3CN (10 ml) y se continuó la agitación durante 4 horas a temperatura ambiente. Se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó con H2O, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para dar el Compuesto 20b bruto, que se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

B) Preparaci6n del Compuesto 21b

Se añadió solución acuosa de amoníaco (5 ml) a una solución de triazolida 20b (anterior) en 1,4-dioxano (25 ml). Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, se concentró la reacción para proporcionar el Compuesto 21b que se secó a alto vacío durante 24 horas y se utilizó sin purificación adicional en la siguiente etapa.

C) Preparaci6n del Compuesto 22b

Se añadió anhídrido benzoico (0,59 g, 2,6 mmoles) a una solución de Compuesto 21b (0,80 g, 1,2 mmoles) en N,N-dimetilformamida (3 ml). Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la reacción se concentró a alto vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos al 50%) dio el Compuesto 22b (1,36 g, 87% a partir del Compuesto 17b).

D) Preparaci6n del Compuesto 23b

Se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (1,66 ml, 10,2 mmoles) a una solución de Compuesto 23b (1,35 g, 1,7 mmoles) y trietilamina (0,57 ml, 4,1 mmoles) en THF (12 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió la reacción en EtOAc y la capa orgánica se lavó con H2O, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con acetona en cloroformo del 20% al 40%) dio el Compuesto 23b (1,03 g, 90%).

E) Prep araci6n d e (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)-fosfinoxi]-1-[1-(R)-(4,4'-dimetoxitritil) oxi-etil]-3-(4-N-benzoil-citosin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 24b

Se añadió 2-cianoetil N,N'-tetraisopropilfosforamidita (0,73 ml, 2,3 mmoles) a una solución de Compuesto 23b (1,03 g, 1,53 mmoles), tetrazol (85 mg, 1,2 mmoles), N-metilimidazol (31 μl, 0,38 mmoles) en DMF (7,7 ml). Después

5 de agitar durante 8 horas a temperatura ambiente, se vertió la reacción en EtOAc y la fase orgánica se lavó con salmuera al 90%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc/hexanos del 60% al 90%) dio el Compuesto 24b (1,22 g, 91%) como un sólido blanco. 24b 31P RMN (300 MHz, CDCl3) o: 149,5, 148,8.

Ejemplo 5

10 Preparaci6n d e (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxietil]-3-(6-N-benzoiladenin-9-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 33a

El Compuesto 25a se prepara mediante la reacción de Vorbrüggen del Compuesto 10a utilizando 6-N-Bz-adenina, BSA y TMSOTf en dicloroetano a reflujo. La reacción posterior de 25a con hidróxido sódico en dioxano/agua, seguido de reprotección del grupo 4-amino con cloruro de benzoilo proporciona el compuesto nucleósido 26a. La fosforamidita, Compuesto 33a se prepara a partir del compuesto nucleósido 26a siguiendo las mismas etapas que

5 se ilustran para el Compuesto 19a a partir del Compuesto 11a.

Ejemplo 6

Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(R)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-etil] -3-(6-N-benzoiladenin-9-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 33b (Esquema 3)

El Compuesto 25b se prepara mediante la reacción de Vorbrüggen del Compuesto 10b utilizando 6-N-Bz-adenina,

10 BSA y TMSOTf en dicloroetano a reflujo. La reacción posterior de 25b con hidróxido sódico en dioxano/agua, seguido de reprotección del grupo 4-amino con cloruro de benzoilo proporciona el compuesto nucleósido 26b. La fosforamidita, Compuesto 33b se prepara a partir del compuesto nucleósido 26b siguiendo las mismas etapas que se ilustran para el Compuesto 19b a partir del Compuesto 11b.

Ejemplo 7

15 Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-etil] -3-(2-N-isobutirilguanin-9-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 42a

(Continua en pág siguiente)

El Compuesto 34a se prepara mediante la reacción de Vorbrüggen del Compuesto 10a utilizando 2-amino-6-cloropurina, BSA y TMSOTf en dicloroetano a reflujo. La reacción del nucleósido 34a con 3-hidroxipropionitrilo e hidruro sódico proporciona el nucleosido 35a ciclado. La fosforamidita, Compuesto 42a se prepara a partir del compesto nucleósido 35a siguiendo las mismas etapas que se ilustran para el Compuesto 19a a

5 partir del Compuesto 11a.

Ejemplo S

Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(R)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-etil] -3-(2-N-isobutirilguanin-9-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano, Compuesto 42b (Esquema 4)

El Compuesto 34b se prepara mediante la reacción de Vorbrüggen del Compuesto 10b utilizando

10 2-amino-6-cloropurina, BSA y TMSOTf en dicloroetano a reflujo. La reacción del nucleósido 34b con 3-hidroxipropionitrilo e hidruro sódico proporciona el nucleósido 35b ciclado. La fosforamidita, Compuesto 42b se prepara a partir del compuesto nucleósido 35b siguiendo las mismas etapas que se ilustran para el Compuesto 19b a partir del Compuesto11b.

Ejemplo 9

15 Preparaci6n del Compuesto 4S A) Preparaci6n del Compuesto 44

Se disolvieron 1,2,5,6-di-O-isopropiliden-a,-D-alofuranosa, Compuesto 43, disponible en el mercado, (135 g, 519,0 mmoles) y 2-(bromometil)-naftaleno (126 g, 570,0 mmoles) en DMF (500 ml) en un matraz de tres bocas (500 ml) y la reacción se enfrió en un baño de hielo. Se añadió a la reacción hidruro sódico (60% p/p, 29 g, 727,0 mmoles) cuidadosamente (porciones de 6 g cada 10 minutos) y se continuó la agitación durante otros 60 minutos después de terminada la adición. En este momento el análisis por TLC ya no mostró azúcar de partida 43. Se vertió la reacción cuidadosamente sobre hielo triturado (aproximadamente 500 g) y la suspensión resultante se agitó vigorosamente hasta derretirse todo el hielo. El sólido blanquecino resultante se recogió por filtración y se suspendió en agua. La suspensión se agitó vigorosamente con un agitador mecánico durante 30 minutos después de lo cual se recogió el sólido por filtración y se suspendió en hexanos. La suspensión se agitó vigorosamente durante 30 minutos después de lo cual se recogió el sólido por filtración y se secó al aire durante 4-6 horas y a continuación se secó a alto vacío sobre P2O5 durante 16 horas para proporcionar el Compuesto 44 (206,0 g, 99%) como un sólido blanquecino. 1H MRN (300 MHz, CDCl3) o: 7,85 (m, 4H), 7,48 (m, 3H), 5,74 (s, 1H), 4,92 (d, 1H, J = 11,7), 4,75 (d, 1H, J = 11,6), 4,58 (m, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,03-3,86 (m, 3H), 1,61 (s, 3H), 1,36 (s, 9H),

B) Preparaci6n del Compuesto 45

Se añadió Compuesto 44 (200,0 g, 0,5 moles) en pequeñas porciones a una solución de ácido acético (2,2 l) y agua (740 ml). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 16 horas después de lo cual, el análisis por TLC (EtOAc/hexanos al 30%) indicó el consumo completo de 44. A continuación la reacción se concentró a presión reducida hasta eliminar la mayor parte del ácido acético. La solución restante se vertió en una mezcla agitada de EtOAc (1 l) y agua (1 l). A continuación se añadió KOH sólido a la mezcla anteriormente indicada hasta que la capa acuosa fue fuertemente básica (pH > 12). A continuación, la capa orgánica se separó, se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico, salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar el Compuesto 45 como una espuma amarilla, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

C) Preparaci6n del Compuesto 46

Se añadió una solución de NaIO4 (107,0 g) en agua (3 l) durante 40 minutos a una solución agitada (agitador mecánico) de Compuesto 45 (bruto anterior) en dioxano (1,5 l) Después de 60 minutos la mezcla de reacción se vertió en EtOAc (1,5 l) y la capa orgánica se separó, se lavó con agua (1 l), salmuera (1 l), se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar el Compuesto 46 como un aceite amarillo, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

D) Preparaci6n del Compuesto 47

Se disolvió Compuesto 46 (bruto anterior) en una mezcla de THF (500) y agua (500 ml) y la reacción se enfrió en un baño de hielo. Se añadieron a la reacción NaOH 2N (600 ml) y formaldehído (250 ml de una solución acuosa al 37%) y se continuó la agitación a temperatura ambiente durante 3 días. A continuación se vertió la reacción en EtOAc (1 l) y se lavó con agua (1 l), salmuera (1 l) y se evaporó a presión reducida hasta quedar aproximadamente 200 ml de EtOAc (en el procedimiento se formó un precipitado blanco). Se añadieron al precipitado hexanos (300 ml) y se dejó reposar la mezcla durante 16 horas después de lo cual el sólido blanco se recogió por filtración, se lavó con hexanos y se secó a alto vacío sobre P2O5 para dar el Compuesto 47 como un sólido blanco (124 g, 66% a partir de 44). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,85 (m, 4H), 7,48 (m, 3H), 5,75 (d, 1H, J= 3,9), 4,96 (d, 1H J = 11,8), 4,75 (d, 1H, J= 11,8), 4,66 (m, 1H), 4,26 (d, 1H, J = 5,2), 3,95 (m, 2H), 3,79 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 2,39 (m, 1H, OH), 1,66 (s, 3H), 1,34 (s, 3H),

E) Preparaci6n de los Compuestos 4S y 49

Se añadió terc-Butildifenilclorosilano (305,0 mmoles, 84,0 ml) a una solución en agitación fría (0ºC) del Compuesto 47 (278,0 mmoles, 100,0 g) y trietilamina (305 mmoles, 43,0 ml) en diclorometano (600 ml). Después de terminada la adición, se calentó la reacción a temperatura ambiente y se continuó la agitación durante 16 horas. Se añadió a la reacción MeOH (50 ml) (para inactivar el exceso de TBDPSCI) y se continuó la agitación durante otras 2 horas a temperatura ambiente. A continuación se diluyó la reacción con cloroformo y la capa orgánica se lavó con HCl al 10%, NaKCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar un aceite espeso. Se añadieron al aceite hexanos (150 ml) y la mezcla se expuso a ultrasonidos hasta obtener como resultado una solución. A continuación se sembró la solución con una pequeña cantidad de 48 (aislado con anterioridad mediante cromatografía en columna). Después de reposar durante 16 horas más se añadieron hexanos a la suspensión espesa y se recogió el sólido por filtración. A continuación, el sólido se resuspendió en hexanos y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. El sólido se recogió por filtración para proporcionar 48 (80,5, 48 g%) después de secado a alto vacío durante 16 horas. Los filtrados se combinaron y se concentraron a presión reducida. El aceite resultante se volvió a disolver en una cantidad mínima de hexanos y se hizo pasar por un tapón de gel de sílice (eluyendo con EtOAc en hexanos al 20%). Las fracciones que contenían el producto 48 se combinaron, se concentraron y se cristalizaron como se ha descrito anteriormente para proporcionar una segunda cosecha de 48 (20 g, 12%) como un sólido blanco. La elución adicional del tapón de gel de sílice con EtOAc en hexanos al 50%

proporcionó el Compuesto 48 puro (40,0 g, 24%) como un aceite espeso. Además se aisló también de una mezcla de 48 y 49 (aproximadamente 15 g al 9%) como un aceite espeso. Diol 48; 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,83 (m, 4H), 7,56 (m, 7H), 7,30 (m, 6H), 5,80 (s, 1H), 4,97 (d, 1H, J= 11,4), 4,70 (m, 2H), 4,46 (m, 1H), 3,92-3,66 (m, 4H), 2,39 (m, 1H, OH), 1,67 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 0,92 (s, 9H), Diol 49; 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,9-7,3 (m, 17H), 5 5,71 (d, 1H, J = 3,9), 4,86 (d, 1H, J = 12,2), 4,74 (d, 1H, J= 12,2), 4,56 (m, 1H), 4,22 (d, 1H, J= 11,1), 4,18 (m, 1H), 4,07 (d, 1H, J= 11,1), 4,02 (dd, 1H, J = 4,2 12,0), 3,64 (dd, 1H, J = 9,4, 11,9), 1,89 (m, 1H), 1,25 (s, 6H), 1,05 (s, 9H),

F) Recuperar el Compuesto 47 a partir del Compuesto 49

Se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (70 ml de una solución 1M en THF) a una solución en agitación fría (0ºC) de diol 49 (62,7 mmoles, 37,5 g) en THF (250 ml) después de lo cual, se dejó calentar la reacción a temperatura 10 ambiente gradualmente. Después de agitar durante 72 horas más, la reacción se concentró al vacío y el residuo se vertió sobre hielo triturado. El matraz se aclaró con algo más de THF (3 veces) y se añadió a la suspensión anteriormente indicada. Se eliminó el sobrenadante por decantación y el sólido en la parte inferior se añadió a una mezcla en agitación de hexanos (200 ml) y agua (200 ml). Después de agitar durante 2 horas, el sólido floculento se recogió por filtración, se lavó con hexanos y agua adicional y se secó a alto vacío para proporcionar el Compuesto

15 47 (20 g, 89%) como un sólido blanco.

Ejemplo 10

Preparaci6n del Compuesto 60 A) Preparaci6n del Compuesto 51

Se añadió, gota a gota, cloruro de pivaloílo (25 mmoles, 3,0 ml) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 48 (16,7 mmoles, 10,0 g), diisopropiletilamina (25,0 mmoles, 4,4 ml) y dimetilaminometilpiridina (2,5 mmoles, 0,30 g) en diclorometano (35 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se diluyó la reacción con cloroformo y la capa orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar el Compuesto 51 bruto, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

B) Preparaci6n del Compuesto 52

Se añadió HF/piridina al 70% (4,2 ml) a una solución fría (0ºC) de 51 bruto (anterior). Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, se añadió a la reacción HF/piridina al 70% adicional (2,5 ml). Después de agitar otros 2 días a temperatura ambiente, se añadió cuidadosamente trietilamina (7,5 ml) a la reacción. Después de agitar durante 1 hora, se interrumpió la reacción cuidadosamente con NaHCO3 saturado hasta que el pH > 10. Se diluyó la reacción con EtOAc y La capa orgánica se lavó adicionalmente con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos del 25 al 40%) proporcionó el Compuesto 52 (7,01 g, 95% a partir del Compuesto 48) como un aceite.

C) Preparaci6n del Compuesto 53

Se añadió DMSO (3,30 ml, 46,7 mmoles) a una solución fría (-78ºC) de cloruro de oxalilo (23,3 mmoles, 2,0 ml) en diclorometano (120 ml). Después de agitar durante 30 minutos, se añadió a la reacción Compuesto 52 (15,6 mmoles, 6,91 g) en diclorometano (30 ml) a través de una cánula. Después de agitar durante 45 minutos a -78ºC, se añadió trietilamina (70,0 mmoles, 9,60 ml) y la reacción se dejó calentar hasta 0ºC. El análisis por TLC en este momento indicó que no había material de partida, Compuesto 52, por lo que se diluyó la reacción con cloroformo y la capa orgánica se lavó con HCl al 10%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar el Compuesto 53, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

D) Preparaci6n de los Compuestos 54 y 55

Se añadió lentamente bromuro de vinilmagnesio (1M en THF, 31,1 ml) a una solución fría (-78ºC) de Compuesto 53 en THF (120 ml). Después de agitar a -78ºC durante 2 horas, se interrumpió la reacción con NH4Cl saturado y se diluyó la reacción con EtOAc. La capa orgánica se lavó con HCl al 10%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar el Compuesto 54 y el Compuesto 55 como una mezcla, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

E) Preparaci6n de los Compuestos 56 y 57

Se añadió una solución de NaOH (4M, 12,5 ml) a una solución de Compuesto 54 y Compuesto 55 en dioxano/metanol (30 ml/10 ml). Después de agitar durante 4 horas a temperatura ambiente, se evaporaron los disolventes a presión reducida y se disolvió el residuo en EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos del 33 al 40%) proporcionó el Compuesto 57 (2,42 g, 40% a partir de 53) como un aceite. El aumento de la polaridad (EtOAc en hexanos al 60%) del eluyente proporcionó el Compuesto 56 (0,82 g, 14% a partir del Compuesto 53). 57 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,94-7,73 (m, 4H), 7,60-7,46 (m, 3H), 6,04-5,85 (m, 1H), 5,69 (d, 1H, J = 3,6), 5,36 (d, 1H, J = 17,3), 5,24 (d, 1H, J = 10,6), 4,97 (d, 1H, J = 11,7), 4,74 (d, 1H, J = 11,7), 4,59 (m, 1H), 4,33 (m, 2H), 4,19 (d, 1H, J = 11,9), 3,85 (d, 1H, J = 11,9), 1,65 (s, 3H), 1,34 (s, 3H).

F) Preparaci6n del Compuesto 5S

Se añadió cloruro de tosilo (9,3 mmoles, 1,77 g) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 57 (2,43 g, 6,29 mmoles) en piridina (12,6 ml). Después de agitar a 0ºC durante 8 horas, se interrumpió la reacción con agua y se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos del 15 al 25%) proporcionó el Compuesto 58 (2,58 g, 76%) como un sólido blanco. Se aisló también 57 sin reaccionar (0.0.39 g, 16%).

G) Preparaci6n del Compuesto 59

Se añadió cloruro de isobutirilo (6,9 mmoles, 0,73 ml) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 58 (4,6 mmoles, 2,48 g), diisopropiletilamina (6,9 mmoles, 0,88 ml) y dimetilaminometilpiridina (0,68 g, 83 mg) en diclorometano (9 ml). Después de 2 horas a 0ºC, se añadieron a la reacción cloruro de isobutirilo (6,9 mmoles, 0,73 ml) y diisopropiletilamina (6,9 mmoles, 0,88 ml) adicionales. Después de otras 2 horas a 0ºC, se añadieron a la reacción cloruro de isobutirilo (6,9 mmoles, 0,73 ml) y diisopropiletilamina (6,9 mmoles, 0,88 ml) adicionales y se agitó la reacción a 0ºC durante 16 horas. Se añadió agua cuidadosamente a la reacción para inactivar cualquier cloruro de ácido sin reaccionar y se continuó la agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se diluyó la reacción con cloroformo y la capa orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con de EtOAc en hexanos al 25%) proporcionó el Compuesto 59 (2,2 g, 83%) como un aceite. Se aisló también 58 sin reaccionar (0,31 g, 13%) después de la purificación.

H) Preparaci6n del Compuesto 60

Se añadió ácido sulfúrico concentrado (3-4 gotas) a una solución de Compuesto 59 (3,6 mmoles, 2,20 g) en ácido acético (11 ml) y anhídrido acético (3 ml). Después de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se eliminaron

5 los disolventes a alto vacío en un evaporador rotatorio (sin calor) y se disolvió el residuo en EtOAc. Se lavó cuidadosamente la capa orgánica con NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar el Compuesto 60, que se secó a alto vacío sobre P2O5 y se utilizó sin ninguna purificación adicional. 60 LCMS: M + 23 calculado 677,2; encontrado 677,1; tiempo de retención LC 2,05 min.

Ejemplo 11

10 Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-(3propenil)]-3-(uracilo-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (69) A) Preparaci6n del Compuesto 61

Se añadió N,O-bis-trimetilsililamida (18,0 mmoles, 4,4 ml) a una suspensión de Compuesto 60 (3,6 mmoles, bruto anterior) y uracilo (7,2 mmoles, 0,81 g) en acetonitrilo (18 ml) y se calentó suavemente la suspensión (utilizando una pistola de aire caliente) hasta obtener como resultado una solución. La reacción se enfrió en un baño de hielo y se añadió a la reacción TMSOTf (7,2 mmoles, 1,3 ml). Después de terminada la adición, se retiró el baño de hielo y se calentó la reacción a reflujo durante 2 horas después de lo cual se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se interrumpió cuidadosamente con solución saturada de NaHCO3. La capa orgánica se lavó adicionalmente con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentraron para proporcionar el Compuesto 61 bruto, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

B) Preparaci6n del Compuesto 62

Se añadió una solución de NaOH (2M, 7,2 ml) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 61 bruto (anterior) en dioxano (10 ml). Después de 2 horas a 0ºC, se añadió a la reacción una cantidad adicional de NaOH (2M, 10 ml). Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, se acidificó la reacción con HCl al 5% (pH 4-5), se diluyó con EtOAc y la capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. Se formó un precipitado blanco, que se lavó cuidadosamente con éter y se secó a alto vacío para proporcionar el compuesto nucleósido 62 (0,97 g, 64%). La purificación de los lavados con éter mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con acetona en cloroformo al 25%) proporcionó una cantidad adicional de Compuesto 62 parcialmente puro (0,10 g, 7%).

C) Preparaci6n del Compuesto 63

Se añadió anhídrido benzoico (2,8 mmoles, 0,64 g) a una solución de Compuesto 62 (2,0 mmoles, 0,85 g) en piridina (4 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 6 horas, se interrumpió la reacción con agua y se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos al 50%) proporcionó el Compuesto 63 (1,069 g, cuantitativo) como un sólido blanco.

D) Preparaci6n de 64 Compuesto

Se añadió DDQ (3,8 mmoles, 0,86 g) a una solución de Compuesto 64 (1,9 mmoles, 1,0 g) en diclorometano (19 ml) y agua (1 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, la reacción se concentró a presión reducida. Se disolvió el residuo en EtOAc y la capa orgánica se lavó con agua, bisulfito sódico al 10%, NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos al 75%) proporcionó el Compuesto 64 (0,74 g, cuantitativo).

E) Preparaci6n del Compuesto 65

Se añadió TBSCl (5,8 mmoles, 0,87 g) a una solución de Compuesto 64 (1,9 mmoles, 0,75 g) e imidazol (11,6 mmoles, 0,79 g) en DMF (5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, se diluyó la reacción con EtOAc y la capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, EtOAc en hexanos al 50%) proporcionó el Compuesto 65 (0,89 g, 94%) como una espuma blanca.

F) Preparaci6n del Compuesto 66

Se disolvió el Compuesto 65 (1,6 mmoles, 0,8 mmoles) en una solución de amoníaco en metanol (7M, 25 ml). Después de calentar en un recipiente sellado a 45ºC durante 4 días, el disolvente se eliminó a presión reducida. La purificación mediante cromatografía (SiO2, metanol en cloroformo del 2 al 4%) proporcionó el Compuesto 66 (0,65 g, cuantitativo) como un sólido blanco. 66 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 8,57 (s, br, 1H), 7,84 (d, 1H, J = 8,2), 6,10-5,96 (m, 1H), 5,74 (d, 1H, J = 8,2), 5,64 (s, 1H), 5,41-5,44 (m, 2H), 4,35 (m, 1H), 4,26 (s, 1H), 4,13 (s, 1H), 3,95 (d, 1H, J = 7,8), 3,66 (d, 1H, J = 7,8), 2,04 (d, 1H, J = 4,3), 0,90 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,10 (s, 3H).

G) Preparaci6n del Compuesto 67

Se calentó una solución de Compuesto 66 (0,25 mmoles, 0,1 g), DMTCl (0,63 mmoles, 0,21 g) y 2,6-lutidina (0,63 mmoles, 73 μl) en piridina (1,25 ml) a 45ºC durante 10 días. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó con bicarbonato sódico saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró a presión reducida. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos del 15 al 45%) proporcionó el Compuesto 67 (0,16 g, 93%) como un sólido blanco. 67 1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 8,92 (s, br, 1H), 8,26 (d, 1H, J = 8,2),7,53-7,24 (m, 9H), 6,97-6,78 (m, 4H), 6,08-5,88 (m, 1H), 5,73 (s, 1H), 5,68 (d, 1H, J= 8,2), 4,83 (s, 1H, J= 11,0), 4,58 (d, 1H, J= 17,3), 4,37 (s, 1H), 4,04 (d, 1H, J= 9,5), 3,84 (s, 6H, 3,78, m, 1H, parcialmente solapado), 3,55 (d, 1H, J = 7,9), 0,83 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,00 (s, 3H).

H) Preparaci6n del Compuesto 6S

Se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (1,3 mmoles, 0,21 ml) a una solución de Compuesto 67 (0,22 mmoles, 0,15 g) y trietilamina (0,54 mmoles, 75 μl) en THF (2 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 días, se diluyó la reacción con EtOAc y la capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. LCMS: M+23 calculado 607.2, encontrado 607.2; tiempo de retención LC 3,51 minutos.

I) Preparaci6n del Compuesto 69

El Compuesto fosforamidita 69 se prepara a partir del Compuesto 68 de acuerdo con el procedimiento descrito para la preparación de la fosforamidita 19a a partir del Compuesto 18a del Ejemplo 1.

Ejemplo 12

Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-(3propenil)]-3-(4-N-benzoil-citosin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (73)

10 La fosforamidita 73 se prepara a partir del Compuesto 67 utilizando los mismos procedimientos generales descritos en el Ejemplo 3 para la preparación de fosforamidita 24a a partir del Compuesto 17a.

Ejemplo 13

Ruta alternativa para la p reparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)(4,4'-dimetoxitritil)oxi-(3-propenil)]-3-(4-N-benzoil-citosin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (73)

El Compuesto 73 se prepara utilizando los mismos procedimientos generales descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 69 a partir del Compuesto 60 del Ejemplo 11. La reacción de Vorbrugen del Compuesto 60 con N-benzoil-citosina, BSA y TMSOTf en acetonitrilo a reflujo proporciona el compuesto nucleósido 74. El tratamiento de 74 con una solución acuosa de NaOH logra la ciclación al Compuesto 75. La protección del grupo

5 5’-hidroxilo y la amina exocíclica con BzCl en piridina proporciona el Compuesto 76. El tratamiento adicional del Compuesto 76 a Compuesto fosforamidita 71 es similar a los procedimientos descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 69 a partir del Compuesto 63.

Ejemplo 14

Preparaci6n de (1R, 3R, 4R, 7S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-(310 propenil)]-3-(6-N-benzoiladenin-9-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (SS)

El Compuesto 88 se prepara utilizando los mismos procedimientos generales descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 69 a partir del Compuesto 60 del Ejemplo 11. La reacción de Vorbrugen del Compuesto 60 con N-benzoil-adenina, BSA y TMSOTf en dicloroetano a reflujo proporciona el Compuesto nucleósido 80. El tratamiento de 80 con una solución acuosa de NaOH logra la ciclación al Compuesto 81. La protección del grupo

5 5’-hidroxilo y la amina exocíclica con BzCl en piridina proporciona el Compuesto 82. El tratamiento adicional del Compuesto 82 a Compuesto fosforamidita 88 es similar a los procedimientos descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 69 a partir del Compuesto 63.

Ejemplo 15

Preparaci6n (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-(310 propenil)]-3-(2-N-isobutirilguanin-9-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (97)

El Compuesto 97 se prepara utilizando los mismos procedimientos generales descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 69 a partir del Compuesto 60 del Ejemplo 11. La reacción de Vorbrugen del Compuesto 60 con 2-amino-6-cloropurina, BSA y TMSOTf en dicloroetano a reflujo proporciona el Compuesto nucleósido 89. El tratamiento del Compuesto 89 con 3-hidroxipropionitrilo e hidruro sódico logra la ciclación al Compuesto 90. La

5 protección transitoria del grupo 5’-hidroxilo como el trimetilsililéter va seguido de la protección del grupo amino exocíclico con cloruro de isobutirilo. La desprotección del trimetilsililéter durante las condiciones de tratamiento acuoso, seguido de la protección del grupo 5’-hidroxilo como el éster de benzoato (cloruro de benzoilo, piridina) proporciona el Compuesto 91. El tratamiento adicional del Compuesto 91 a Compuesto fosforamidita 97 es similar a los procedimientos descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 69 a partir del Compuesto 63.

10 Ejemplo 16

Preparaci6n (1 R, 3 R, 4 R, 7 S)-7-[2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi]-1-[1-(S)-(4,4'-dimetoxitritil)oxi-(3propenil)]-3-(base seleccionada, opcionalmente protegida)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano (110,113

A) Preparaci6n del Compuesto 9S

15 Se hidrogenó una mezcla de paladio sobre carbón activado (5 mg) y el Compuesto 66 (0,25 mmoles, 0,10 g) en MeOH (2 ml) utilizando un globo de hidrógeno. Después de 1 hora, se filtró la reacción a través de celita y se lavó el lecho del filtro con EtOAc. Los disolventes se evaporaron a presión reducida para proporcionar 98, que se secó adicionalmente a alto vacío y se utilizó sin ninguna purificación.

B) Preparaci6n del Compuesto 102

20 Se calentó una solución de Compuesto 98 (0,25 mmoles, 0,1 g), DMTCl (0,63 mmoles, 0,21 g) y 2,6-lutidina (0,63 mmoles, 73 μl) en piridina (1,25 ml) a 45ºC durante 7 días. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó con bicarbonato sódico saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró a presión reducida. La purificación mediante cromatografía en columna (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos del 15 al 45%) proporcionó el Compuesto 102 (0,10 g, 58%) como un sólido blanco. 102 (1H RMN (300

25 MHz, CDCl3) o: 9,1 (s, br, 1H), 8,26 (d, 1H, J= 8,2), 7,42-7,20 (m, 9H), 6,84-6,78 (m, 4H), 5,69 (s, 1H), 5,66 (d, 1H, solapado), 4,33 (s, 1H), 4,32 (s, 1H), 3,85 (d, 1H, J = 7,5), 3,8 (s, 6H), 3,75 (d, 1H, J= 7,5), 3,42 (d, 1H, J= 8,2), 1,65 (m, 1H), 1,47 (m, 1H), 0,79 (s, 9H), 0,25 (t, 3H, J = 7,5), 0,02 (s, 3H), -0,18 (s, 3H).

C) Preparaci6n del Compuesto 110

El Compuesto fosforamidita 110 se prepara a partir del Compuesto 102 utilizando el mismo procedimiento general descrito para la preparación del Compuesto fosforamidita 19a a partir del Compuesto 17a del Ejemplo 1. Los Compuestos fosforamidita 111-113 se prepararon a partir de los Compuestos nucleósidos 79, 85 y 94. La

5 hidrogenación del doble enlace utilizando paladio catalítico en carbono e hidrógeno proporciona los Compuestos 98-101, respectivamente. La protección del grupo 5’-hidroxilo como el dimetoxitritiléter seguido de la eliminación del grupo protector sililo y una reacción de fosfitilación (como se describe en el Ejemplo 1) proporciona los Compuestos fosforamidita 110-113.

Ejemplo 17

10 Preparaci6n de los Compuestos 116a, 116b, 116c y 116d

A) Preparaci6n del Compuesto 114a

Se añadió hidruro sódico (60%, 1,0 mmoles, 40 mg) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 66 (0,25 mmoles, 0,10

15 g) y cloruro de benciloximetilo (BomCl, 0,75 mmoles, 0,1 ml) en DMF (1 ml). Después de 1 hora, se interrumpió la reacción con agua y se diluyó con EtOAc. A continuación, la capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación del residuo mediante cromatografía (SiO2, EtOAc en hexanos al 30%) proporcionó el Compuesto 114a (0,15 g, 93%) como un sólido blanco.

B) Preparaci6n del Compuesto 115a

20 Se añadió una solución de tetróxido de osmio (2,5% en isopropanol, 0,12 ml) a una mezcla de Compuesto 114a (0,17 g, 0,11 g), peryodato sódico (0,70 mmoles, 0,15 g) y 2-6-lutidina (0,12 ml) en dioxano (2 ml) y agua (0,5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 36 horas, se diluyó la reacción con EtOAc y se lavó con agua, tiosulfato sódico al 10%, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró para proporcionar el Compuesto 115a bruto, que se utilizó sin ninguna purificación adicional.

C) Preparaci6n del Compuesto 116a

Se añadió borohidruro sódico (25 mg) a una solución de Compuesto 115a bruto (anterior) en MeOH (1 ml). Después

5 de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se diluyó la reacción con EtOAc y la capa orgánica se lavó con HCl al 10%, bicarbonato sódico saturado, salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación del residuo mediante cromatografía (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos al 50%) proporcionó el Compuesto 116a (73 mg, 65% a partir de 115a) como un aceite. 116a (1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,69 (d, 1H, J= 8,2), 7,49-7,24 (m, 10H), 5,77 (d, 1H, J = 8,2), 5,61 (s, 1H), 5,47 (m, 2H), 4,98 (d, 1H, J = 6,9), 4,84 (d, 1H, J = 6,9), 4,80 (d, 1H, J = 11,8),

10 4,69 (s, 2H), 4,66 (d, 1H, J= 11,8), 4,29 (s, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,96-3,79 (m, 3H), 3,67 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 0,87 (s, 9H), 0,07 (s, 3H), 0,04 (s, 3H).

D) Preparaci6n de los Compuestos 116b-d

La reacción de los Compuestos 79, 85 y 94 con cloruro de benciloximetilo e hidruro sódico proporciona los Compuestos nucleósidos 114b-d, respectivamente. La escisión del doble enlace con tetróxido de osmio proporciona

15 los Compuestos aldehídos 115b-d. Una reducción adicional del grupo funcional aldehído utilizando borohidruro sódico proporciona los Compuestos 116b-d, respectivamente.

Ejemplo 1S

Preparaci6n de los nucle6sidos 117a-d a 12Sa-d

(Continua en página siguiente)

A) Preparaci6n del Compuesto 127a (R = Me)

Se añadió hidruro sódico (60%, 0,23 mmoles, 9 mg) a una solución fría (0ºC) de Compuesto 116a (0,11 mmoles, 73 mg), yodometano (0,57 mmoles, 40 μl) en DMF (0,25 ml). Después de agitar a 0ºC durante 1 hora, se interrumpió la reacción con agua y se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó adicionalmente con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación mediante cromatografía (SiO2, eluyendo con EtOAc en hexanos del 20 al 40%) proporcionó el Compuesto127a (1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7,79 (d, 1H, J = 8,2), 7,45-7,28 (m, 10H), 5,74 (d, 1H, J = 8,2), 5,62 (s, 1H), 5,48 (m, 2H), 4,90 (m, 2H), 4,74 (d, 1H, J = 11,9), 4,69 (s, 1H), 4,60 (s, 1H, J = 11,9), 4,29 (s, 1H), 4,04 (s, 1H), 4,04 (m, 1H, solapado), 3,99 (d, 1H, J = 8,3), 3,84 (d, 1H, J= 8,2), 3,72-3,48 (m, 2H), 3,35 (s, 3H), 0,87 (s, 9H), 0,07 (s, 3H), 0,04 (s, 3H).

B) Preparaci6n de los Compuestos 117a-d a 123a-d

Los Compuestos 117a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d por tratamiento con un agente de fluoración tal como DAST utilizando diclorometano como disolvente. Los Compuestos 118a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d oxidando en primer lugar el grupo hidroxilo primario con periodinano de Dess-Martin o en condiciones Swem seguido de tratamiento del aldehído resultante con DAST. Los compuestos 119a-d se preparan a partir de los compuestos 116a-d oxidando en primer lugar el grupo hidroxilo primario con periodinano de Dess-Martin o en condiciones Swem seguido de aminación reductora del aldehído resultante con una amina primaria o secundaria, en presencia de ácido acético glacial y un agente reductor tal como cianoborohidruro sódico. Los Compuestos 120a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d convirtiendo el grupo hidroxilo en un derivado de tiocarbonato seguido de un procedimiento de desoxigenación radical utilizando nBu3SnH. Los Compuestos 121a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d convirtiendo del grupo hidroxilo en un grupo saliente (mesilato, tosilato, haluro) seguido de calentamiento con exceso de azida sódica. Los Compuestos 124a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d por oxidación del alcohol primario a un ácido carboxílico, seguido de reacción con una amina en presencia de HATU o cualquier otro reactivo de acoplamiento de péptidos. Los Compuestos 125a-b se preparan a partir de los Compuestos 116a-d activando el grupo hidroxilo con carbonildiimidazol seguido de reacción con una amina. Los Compuestos 126a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d oxidando el alcohol primario en condiciones Swem o de Dess-Martin seguido de reacción con un reactivo organometálico adecuado. Los Compuestos 127b-d (127a preparado en la sección A, R = CH3 anterior) se preparan a partir de los Compuestos 116b-d desprotegiendo el grupo hidroxilo con una base apropiada, seguido de inactivación del anión con un reactivo alquilante. Los Compuestos 128a-d se preparan a partir de los Compuestos 116a-d convirtiendo del grupo hidroxilo en un grupo saliente seguido de desplazamiento con un nucleófilo tiol. Los Compuestos 122a-d se preparan a partir de los Compuestos 121a-d por reducción del grupo azida seguido de reacción con un isocianato o un isotiocianato. Los compuestos 123a-d se preparan a partir de los Compuestos 121a-d por reducción del grupo azido y reacción con FmocNCS para proporcionar una tiourea activada. La reacción adicional de la tiourea activada por Fmoc con una amina en presencia de EDC proporciona la guanidina sustituida. La eliminación del grupo protector Fmoc libera los Compuestos 123a-d.

Ejemplo 19

Preparaci6n de las fosforamiditas 141-144 A) Preparaci6n del Compuesto 129 (Z = CH20Me)

Se hidrogenó una mezcla de paladio sobre carbón activado (3 mg) y Compuesto 127a (0,04 mmoles, 27 mg) en MeOH (1 ml) utilizando un globo de hidrógeno. Después de 24 horas, se filtró la reacción a través de celita y se lavó

5 el lecho del filtro con EtOAc. Se evaporan los disolventes a presión reducida y se volvió a disolver el residuo en MeOH (1 ml) y trietilamina (2 gotas). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, se eliminaron los disolventes a presión reducida para proporcionar 129, 129 (1H RMN (300 MHz, CDCl3) o: 7.89 (d, 1H, J= 8.2), 5.75 (d, 1H, J= 8.2), 5.63 (s, 1H), 4.22 (s, 1H), 4.17 (s, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.98 (d, 1H, J = 7.6), 3.71 (d, 1H, J= 7.6), 3.60 (t, 1H, J = 9.1), 3.44 (s, 3H), 3.42 (m, 1H, solapado), 0.88 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H).

10 B) Preparaci6n del Compuesto 141

El Compuesto 129 se convierte en Compuesto fosforamidita 141 utilizando los mismos procedimientos generales descritos para la preparación del Compuesto fosforamidita 19a a partir de 16a del Ejemplo 1.

C) Preparaci6n de los Compuestos 142-144

Los Compuestos 130-132 se preparan por hidrogenación del grupo protector benciloximetilo utilizando paladio

15 catalítico sobre carbón y gas hidrógeno. La protección del grupo 5’-hidroxilo como el dimetoxitritiléter seguido de la eliminación del grupo protector sililo y una reacción de fosfitilación (como se describe en el Ejemplo 1) proporciona los Compuestos fosforamidita 142-144.

Ejemplo 20

Sintesis de fosforamiditas de nucle6sidos

20 La preparación de fosforamiditas de nucleósidos se lleva a cabo siguiendo los procedimientos que se ilustran en el presente documento y en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, la patente de los EE.UU. nº 6.426.220 y la PCT publicada como WO 02/36743.

Ejemplo 21

Sintesis de oligonucle6tidos y oligonucle6sidos

Los compuestos oligoméricos utilizados de acuerdo con la presente invención pueden generarse convenientemente y de manera rutinaria a través de la técnica bien conocida de la síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis es comercializado por varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Además o de manera alternativa, puede emplearse cualquier otro medio para tal síntesis conocida en la técnica. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y los derivados alquilados.

Oligonucleótidos: los oligonucleótidos de fosfodiéster (P=O) no sustituidos y sustituidos pueden sintetizarse en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 394) utilizando la química de la fosforamidita convencional con oxidación por yodo.

Los fosforotioatos (P=S) se sintetizan de manera similar a los oligonucleótidos de fosfodiéster con las siguientes excepciones: la tiación se efectúa utilizando una solución al 10% p/v de 1,1-dioxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la oxidación de los enlaces fosfito. El tiempo de la etapa de reacción de tiación se aumenta a 180 segundos y está precedida por la etapa de protección terminal normal. Después de la escisión de la columna de CPG y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (12-16 horas), los oligonucleótidos se recuperan mediante precipitación > 3 volúmenes de etanol de una solución de NH4OAc 1M. Los oligonucleótidos fosfinados pueden prepararse como se describe en la patente de los EE.UU. nº 5.508.270.

Los oligonucleótidos de alquilfosfonato pueden prepararse como se describe en la patente de los EE.UU. nº 4.469.863.

Los oligonucleótidos de 3’-desoxi-3’metilenfosfonato pueden prepararse como se describe en las patentes de los EE.UU. nº 5.610.289 ó 5.625.050.

Los oligonucleótidos de fosforamidita pueden prepararse como se describe en la patente de los EE.UU. nº 5.256.775

o la patente de los EE.UU. nº 5.366.878.

Los oligonucleótidos de alquilfosfonotioato pueden prepararse como se describe en las solicitudes PCT publicadas PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como documentos WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).

Los oligonucleótidos de 3’-desoxi-3’-amino fosforamidato pueden prepararse como se describe en la patente de los EE.UU. nº 5.476.925.

Los oligonucleótidos de fosfotriéster pueden prepararse como se describe en la patente de los EE.UU. nº 5.023.243.

Los oligonucleótidos de boranofosfato pueden prepararse como se describe en las patente de los EE.UU. nº 5.130.302 y 5.177.198.

Oligonucleósidos: los oligonucleósidos unidos con metilenmetilimino, también identificados como oligonucleósidos unidos con MMI, oligonucleósidos unidos con metilendimetilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos unidos con MDH, y oligonucleósidos unidos con metilencarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos unidos con amida-3, y oligonucleósidos unidos con metilenaminocarbonilo, también identificados como oligonucleósidos unidos con amida-4, así como compuestos oligoméricos de cadena principal mixta que tienen, por ejemplo, enlaces P=O o P=S y MMI alternos pueden prepararse como se describe en las patente de los EE.UU. nº 5.378.825; 5.386.023; 5.489.677; 5.602.240 y 5.610.289.

Los oligonucleósidos unidos con formacetal y tioformacetal pueden prepararse como se describe en las patente de los EE.UU. nº 5.264.562 y 5.264.564.

Los oligonucleósidos unidos con óxido de etileno pueden prepararse como se describe en la patente de los EE.UU. nº 5.223.618.

Ejemplo 22

Aislamiento de oligonucle6tidos

Después de la escisión del soporte sólido de vidrio de poro controlado y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC durante 12-16 horas, los oligonucleótidos u oligonucleósidos se recuperan mediante precipitación en NH4OAc 1M > 3 volúmenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizan mediante espectroscopia de masas por electronebulización (determinación del peso molecular) y mediante electroforesis en gel capilar. Las cantidades relativas de enlaces fosforotioato y fosfodiéster obtenidos en la síntesis se determinan mediante la relación entre el peso molecular correcto y el producto -16 amu (+/32 +/-48). Para algunos estudios los oligonucleótidos se purifican mediante HPLC, como se describe en Chiang y col., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con el material purificado por HPLC son generalmente similares a los obtenidos con el material no purificado mediante HPLC.

Ejemplo 23

Sintesis de oligonucle6tidos - Formato de placa de 96 pocillos

Los oligonucleótidos pueden sintetizarse a través de la química de la fosforamidita en fase sólida P(III) en un sintetizador automático capaz de ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato de 96 pocillos. Los enlaces internucleótido fosfodiéster se proporcionan mediante oxidación con yodo acuoso. Se generan enlaces internucleótido fosforotioato mediante sulfuración utilizando 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (Reactivo de Beaucage) en acetonitrilo anhidro. Se adquieren beta-cianoetildiisopropil-fosforamiditas con la base protegida convencionales de proveedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Se sintetizan nucleósidos no convencionales mediante procedimientos convencionales o patentados. Se utilizan en forma de beta-cianoetildiisopropil-fosforamiditas con la base protegida.

Los oligonucleótidos se escinden del soporte y se desprotegen con NH4OH concentrado a una temperatura elevada (55-60ºC) durante 12-16 horas y a continuación se seca el producto liberado al vacío. A continuación, el producto seco se resuspende en agua estéril para proporcionar una placa maestra a partir de la cual se diluyen a continuación todas las muestras de placas analíticas y de ensayo utilizando pipeteadores robotizados.

Ejemplo 24

Analisis de oligonucle6tidos utilizando un formato de placa de 96 pocillos

Se evalúa la concentración de oligonucleótido en cada pocillo mediante dilución de las muestras y espectroscopia de absorción UV. La integridad completa de los productos individuales se evalúa mediante electroforesis capilar (CE) en un formato de 96 pocillos (Beckman P/ACET™ MDQ) o, para las muestras preparadas individualmente, en un aparato de CE comercial (p. ej., Beckman P/ACE™ 5000, ABI 270). Se confirma la composición de bases y de la cadena principal mediante análisis de masas de los compuestos oligoméricos utilizando electronebulización-espectroscopia de masas. Todas las placas de ensayo del análisis se diluyen a partir de la placa maestra utilizando pipeteadores robóticos de uno y múltiples canales. Se considera que las placas son aceptables si por lo menos el 85% de los compuestos oligoméricos de la placa tienen longitud completa por lo menos en un 85%.

Ejemplo 25

Cultivo celular y tratamiento de oligonucle6tidos

Puede someterse a ensayo el efecto de los compuestos oligoméricos sobre la expresión del ácido nucleico diana en cualquiera de una variedad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico diana esté presente a niveles apreciables. Esto puede determinarse de manera rutinaria utilizando, por ejemplo, una PCR o un análisis de transferencia Northern. Pueden obtenerse líneas celulares derivadas de múltiples tejidos y especies de la colección americana de cultivos tipo (ATCC, Manassas, VA).

Se proporciona el siguiente tipo celular con fines ilustrativos, pero pueden utilizarse otros tipos celulares utilizados de manera rutinaria, siempre que la diana se exprese en el tipo celular escogido. Esto puede determinarse fácilmente mediante procedimientos rutinarios en la técnica, por ejemplo análisis de transferencia Northern, ensayos de protección de ribonucleasas o RT-PCR.

Células b.END: Se obtuvo la línea de células endoteliales de cerebro de ratón b.END del Dr. Werner Risau del Instituto Max Plank (Bad Nauheim, Alemania). Las células b.END se cultivaron de manera rutinaria en DMEM, con alto contenido de glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) complementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Las células se hicieron pasar de manera rutinaria por tripsinación y dilución cuando alcanzaron una confluencia de aproximadamente el 90%. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA) a una densidad de aproximadamente 3.000 células/pocillo para usos que incluyen, pero no se limitan a, experimentos de transfección de compuestos oligoméricos.

Experimentos que implican tratamiento de células con compuestos oligoméricos:

Cuando las células alcanzan una confluencia apropiada, se tratan con compuestos oligoméricos utilizando un procedimiento de transfección como el descrito.

LIPOFECTINA™

Cuando las células alcanzan una confluencia del 65-75%, se tratan con oligonucleótido. El oligonucleótido se mezcla con LIPOFECTINA™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en medio con suero reducido Opti-MEM™-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido y una concentración de LIPOFECTINA™ de 2,5 ó 3 μg/ml por oligonucleótido 100 nM. Esta mezcla de transfección se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 0,5 horas. Para las células desarrolladas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavan una vez con 100 μl de OPTI-MEM™-1 y a continuación se tratan con 130 μl de la mezcla de transfección. Las células desarrolladas sobre placas de 24 pocillos u otras placas para el cultivo de tejidos convencionales se tratan de manera similar, utilizando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido. Se tratan las células y se obtienen datos por duplicado o triplicado. Después de aproximadamente 4-7 horas de tratamiento a 37ºC, el medio que contiene la mezcla de transfección se sustituye por medio de cultivo fresco. Las células se recogen 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido.

Otros reactivos de transfección adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, CYTOFECTINA™, LIPOFECTAMINA™, OLIGOFECTAMINA™, y FUGENE™. Otros procedimientos de transfección adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, electroporación.

Ejemplo 26

Analisis de inhibici6n con oligonucle6tido de una expresi6n diana

Puede analizarse la modulación antisentido de una expresión diana de una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden cuantificarse los niveles de ARNm diana, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva, o PCR en tiempo real. Actualmente se desea la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN pueden realizarse sobre el ARN celular total o ARNm poli(A)+. Un procedimiento de análisis de ARN de la presente invención es el uso de ARN celular total como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La (PCR) cuantitativa en tiempo real puede llevarse a cabo convenientemente utilizando el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM™ 7600, 7700, ó 7900, disponible en el mercado de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizarlo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los niveles de proteína de una diana pueden cuantificarse de una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse a través de procedimientos de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales convencionales bien conocidos en la técnica. Los procedimientos de preparación de antisueros policlonales se ilustran, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, págs. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se ilustra, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, págs. 11.4.111.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Los procedimientos de inmunoprecipitación son convencionales en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, págs. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. La transferencia de Western (inmunotransferencia) es convencional en la técnica y puede encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, págs. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) son convencionales en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, págs. 11.2.1-.11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.

Ejemplo 27

Disero de ensayos fenotipicos y estudios in vivo para el uso de inhibidores de la diana

Ensayos fenotipicos

Una vez que se han identificado los inhibidores de la diana mediante los procedimientos descritos en el presente documento, los compuestos oligoméricos se investigan adicionalmente en uno o más ensayos fenotípicos, teniendo cada uno criterios de valoración mesurables predictivos de la eficacia en el tratamiento de una enfermedad o afección concreta.

Los ensayos fenotípicos, kits y reactivos para su uso son bien conocidos para los expertos en la materia y se utilizan en el presente documento para investigar el papel y/o la asociación de una diana en la salud y la enfermedad. Los ensayos fenotípicos representativos, que pueden adquirirse de uno cualquiera de los numerosos proveedores comerciales, incluyen aquellos para determinar la proliferación, la citotoxicidad, la viabilidad celular o la supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR; Perkin Elmer, Boston, MA), análisis basados en proteínas que incluyen análisis enzimáticos (Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA), la regulación celular, la transducción de señales, la inflamación, los procedimientos oxidativos y la apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI ), la acumulación de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ensayos de angiogénesis, ensayos de formación de tubos, ensayos de citocinas y hormonas y ensayos metabólicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

En un ejemplo no limitativo, se tratan las células que se ha determinado que son apropiadas para un ensayo fenotípico concreto (es decir, células MCF-7 seleccionadas para estudios de cáncer de mama; adipocitos para estudios de obesidad) con inhibidores de la diana identificados a partir de estudios in vitro así como compuestos de referencia a concentraciones óptimas que se determinan mediante los procedimientos descritos anteriormente. Al final del período de tratamiento, se analizan las células tratadas y no tratadas mediante uno o más procedimientos específicos para el ensayo para determinar los resultados y criterios de valoración fenotípicos.

Los criterios de valoración fenotípicos incluyen cambios en la morfología celular a lo largo del tiempo o las dosis de tratamiento así como cambios en los niveles de los componentes celulares tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, sacáridos o metales. Las mediciones del estado celular que incluyen el pH, la fase del ciclo celular, la absorción o la excreción de indicadores biológicos por la célula, también son criterios de valoración de interés.

La medición de la expresión de uno o más de los genes de la célula después del tratamiento también se utiliza como indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de la diana. Los genes distintivos o aquellos genes que se sospecha que están asociados con una enfermedad, afección, o fenotipo específicos, se miden en las células tratadas y en las no tratadas.

Estudios in vivo

Los sujetos individuales de los estudios in vivo descritos en el presente documento son animales vertebrados de sangre caliente, que incluyen seres humanos.

Ejemplo 2S

Aislamiento de ARN

Aislamiento de ARNm poli(A)+

Se aísla ARNm poli(A)+ de acuerdo con Miura y col., (Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764). Otros procedimientos para el aislamiento de ARNm poli(A)+ son rutinarios en la técnica. En resumen, para las células desarrolladas en placas de 96 pocillos, se elimina el medio de crecimiento de las células y se lava cada pocillo con 200 μl de PBS frío. Se añaden a cada pocillo 60 μl de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5%, complejo de vanadil-ribonucleósido 20 mM), se agita suavemente la placa y a continuación se incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfieren 55 μl de lisado a placas de 96 pocillos recubiertas con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine CA). Las placas se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavan 3 veces con 200 μl de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M). Después del lavado final, la placa se transfiere a toallas de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado y a continuación se seca al aire durante 5 minutos. Se añaden 60 μl de tampón de elución (Tris-HCl 5 mM pH 7,6), se precalienta a 70ºC, se añade a cada pocillo, se incuba la placa sobre una placa caliente a 90ºC durante 5 minutos, y el producto eluido se transfiere a continuación a una placa de 96 pocillos nueva.

Las células desarrolladas sobre 100 mm u otras placas convencionales pueden tratarse de manera similar, utilizando volúmenes apropiados de todas las soluciones.

Aislamiento de ARN total

El ARN total se aísla utilizando un kit RNEASY 96™ y tampones adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. En resumen, para las células desarrolladas en placas de 96 pocillos, se elimina el medio de crecimiento de las células y se lava cada pocillo con 200 μl de PBS frío. Se añaden a cada pocillo 150 μl de Buffer RLT y se agita vigorosamente la placa durante 20 segundos. A continuación se añaden a cada pocillo 150 μl de etanol al 70% y los contenidos se mezclan pipeteando arriba y abajo tres veces. Las muestras se transfieren a continuación a la placa de pocillos RNEASY 96™ fijada a un colector QIAVAC® equipado con una bandeja de recogida de desechos y fijado a una fuente de vacío. El vacío se aplica durante 1 minuto. Se añaden 500 μl de Tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se incuban durante 15 minutos y se aplica de nuevo el vacío durante 1 minuto. Se añaden 500 1l más de Tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplica vacío durante 2 minutos. A continuación se añade 1 ml de Tampón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplica vacío durante un período de 90 segundos. A continuación se repite el lavado con el Tampón RPE y se aplica el vacío durante 3 minutos más. A continuación se retira la placa del colector QIAVAC™ y se secaron en toallas de papel. A continuación se vuelve a fijar la placa al colector QIAVAC™ equipado con un rejilla de tubos de recogida que contiene tubos de recogida de 1,2 ml. A continuación se eluye el ARN pipeteando 140 μl de agua libre de ARNasa en cada pocillo, incubando 1 minuto, y aplicando a continuación vacío durante 3 minutos.

El pipeteado repetitivo y las etapas de elución pueden automatizarse utilizando un QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). Básicamente, después de lisar las células en la placa de cultivo, la placa se transfiere a la pletina del robot donde se llevan a cabo las etapas de pipeteado, tratamiento con ADNasa y elución.

Ejemplo 29

Analisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm diana

La cuantificación de los niveles de ARNm diana se logró mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM™ 7600, 7700, ó 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este es un sistema de detección de fluorescencia, no basado en gel, de tubo cerrado que permite la cuantificación de alto rendimiento de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. En oposición a la PCR convencional en la que los productos de amplificación se cuantifican después de terminada la PCR, los productos de la PCR cuantitativa en tiempo real se cuantifican a medida que se acumulan. Esto se logra incluyendo en la reacción de PCR una sonda oligonucleotídica que hibrida específicamente entre los cebadores directo e inverso de la PCR, y contiene dos colorantes fluorescentes. Se fija un colorante indicador (p. ej., FAM o JOE, obtenidos de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) al extremo 5’ de la sonda, se fija un colorante interruptor (p. ej., TAMRA, obtenido de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) al extremo 3’ de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión del colorante indicador es interrumpida por la proximidad del colorante interruptor 3’. Durante la amplificación, la hibridación de la sonda a la secuencia diana crea un sustrato que puede ser escindido por la actividad exonucleasa 5’ de la polimerasa Taq. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación de la PCR, la escisión de la sonda por la polimerasa Taq libera el colorante indicador del resto de la sonda (y por consiguiente del resto interruptor) y se genera una señal de fluorescencia específica de la secuencia. Con cada ciclo, se escinden moléculas adicionales de colorante indicador de sus respectivas sondas, y se supervisa la intensidad de fluorescencia a intervalos regulares mediante óptica láser montada en el Sistema de Detección ABI PRISM™. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones seriadas de ARNm de muestras de referencia no tratadas genera una curva patrón que se utiliza para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento de las muestras de ensayo con oligonucleótidos antisentido.

Antes del análisis de PCR cuantitativo, se evalúan grupos de cebadores-sondas específicos para el gen diana se está midiendo para determinar su capacidad para ser "multiplexados" con una reacción de amplificación de GAPDH. En la multiplexación, se amplifican el gen diana y el gen patrón interno GAPDH al mismo tiempo en una única muestra. En este análisis, el ARNm aislado de las células no tratadas se someten a dilución seriada. Cada dilución se amplifica en presencia de grupos de cebadores-sondas específicos para GAPDH sólo, gen diana sólo ("monoplexación"), o ambos (multiplexación). Después de la amplificación por PCR, se generan curvas patrón de GAPDH y señal de ARNm diana como una función de la dilución a partir de las muestras monoplexadas y multiplexadas. Si tanto la pendiente como el coeficiente de correlación del GAPDH y las señales diana generadas a partir de las muestras multiplexadas están dentro del 10% de sus valores correspondientes generados a partir de las muestras monoplexadas, se considera que el grupo de cebadores-sonda específico para esa diana es multiplexable. También se conocen en la técnica otros procedimientos de PCR.

Los reactivos para la RT y la PCR se obtuvieron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). La RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo añadiendo 20 μl de cóctel para PCR (2,5x tampón de PCR menos MgCl2, MgCl2 6,6 mM, 375 μM de cada uno de dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada uno de los cebadores directo e inverso, 125 nM de sonda, 4 Unidades de inhibidor de ARNasa, 1,25 unidades de PLATINUM® Taq, 5 unidades de transcriptasa inversa MuLV, y 2,5x colorante ROX) a placas de 96 pocillos que contenían 30 μl de solución de ARN total (20-200 ng). La reacción de RT se llevó a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48ºC. Después de una incubación de 10 minutos a 95ºC para activar el PLATINUM® Taq, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguido de 60ºC durante 1,5 minutos (hibridación/extensión).

Las cantidades de diana génica obtenidas mediante RT-PCR en tiempo real, se normalizan utilizando el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantifica mediante RT-PCR en tiempo real, que se realiza simultáneamente con la diana, mediante multiplexación, o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Los procedimientos de cuantificación de ARN por medio de RIBOGREEN™ se ilustran en Jones, L.J., y col, (Analytical Biochemistry, 1998,265, 368-374).

En este ensayo, se pipetean 170 μl de reactivo de trabajo RIBOGREEN™ (reactivo RIBOGREEN™ diluido 1:350 en Tris-HCl 10mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) en una placa de 96 pocillos que contiene 30 1l de ARN celular, purificado. La placa se lee en un CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.

Ejemplo 30

Cebadores y sondas especificas de la diana

Pueden diseñarse sondas y cebadores para que hibriden con una secuencia diana, utilizando la información de las secuencias publicadas.

Por ejemplo, para PTEN humano, se diseñó el siguiente grupo de cebador-sonda utilizando la información de la secuencia publicada (número de acceso GENBANK™ U92436.1, SEC ID NO: 1).

Cebador directo: AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT (SEC ID NO: 2)

Cebador inverso: TGCACATATCATTACACCAGTTCGT (SEC ID NO: 3)

5 y la sonda de PCR:

FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA (SEC ID NO: 4),

En el que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante interruptor.

Ejemplo 31

Analisis de transferencia de Western de los niveles de proteina diana

10 Se lleva a cabo el análisis de transferencia de Western (análisis de inmunotransferencia) utilizando procedimientos convencionales. Las células se recogen 16-20 horas después del tratamiento con oligonucleótido, se lavan una vez con PBS, se suspenden en tampón de Laemmli (100 μl/pocillo), se hierven durante 5 minutos y se cargan en un gel de SDS-PAGE al 16%. Los geles se hacen correr durante 1,5 horas a 150 V, y se transfieren a una membrana para la transferencia de Western. Se utiliza el anticuerpo primario apropiado dirigido a una diana, con un anticuerpo

15 secundario radiomarcado o marcado fluorescentemente dirigido contra la especie de anticuerpo primario. Se visualizan las bandas utilizando un PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA).

Ejemplo 32

Estabilidad a la nucleasa de olig6meros modificados 5'-(S) y (R)-CH3-BNA tratados con SVPD

La estabilidad a la nucleasa de los oligómeros modificados 5’-CH3-BNA se determinó utilizando fosfodiesterasa de

20 veneno de serpiente (SVPD). Cada oligómero se preparó como una mezcla de 500 μl que contenía: 5 μl de oligómero 100 μM, 50 μl de fosfodiesterasa I @ 0,5 unidades/ml en tampón SVPD (Tris-HCL 50 mM, pH 7,5, MgCl2 8 mM) concentración final 0,05 unidades/ml, 445 μl de tampón SVP. Las muestras se incubaron a 37ºC en un baño de agua. Se tomaron alícuotas (100 μl) a los 0, 1, 2 y 4 días con enzima fresca añadida los días 1 y 2. Se añadió EDTA a las alícuotas inmediatamente después de la eliminación para interrumpir la actividad de la enzima. Las

25 muestras se analizaron en IP HPLC/MS.

SEC ID N0.IISIS N0 Composici6n (5' a 3') % de longitud completa el dia 4

05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS >80 05/392746 CRURTAGCACTGGCCRUR >80 05/392745 CIUITAGCACTGGCCIUI 40-50 05/392753 CeUeTAGCACTGGCCeUe 30-40

Todos los enlaces internucleósido son fosfodiéster, el subíndice S o R indica la configuración en el átomo de carbono 5’ para los nucleósidos 5’-CH3-BNA que tienen también un grupo puente 4’-CH2-O-2’. Un subíndice e indica nucleósidos 2’-O- MOE y el subíndice I indica nucleósidos modificados 4’-CH2-O-2’. Los compuestos que contienen BNA sustituido en 5-metilo (392746 y 392747) presentaron una notable mejora con respecto al compuesto que

30 contiene BNA no sustituido (392745).

SEC ID N0. IISIS N0 % composici6n a % composici6n a % composici6n a las 24 horas las 4S horas las 96 horas

05/392747 100% 86% 82% 05/392746 100% 90% 84% 05/392745 67% 56% 48% 05/392753 58% 46% 36%

Ejemplo 33

Estabilidad a la nucleasa de olig6meros modificados 5'-(S)-CH3 y 2'-0-M0E tratados con SVPD

Se determinó la estabilidad a la nucleasa de los oligómeros modificados 5’-CH3-BNA utilizando fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD). Cada oligómero se preparó como una mezcla de 90 μl que contenía 5 μl de oligómero 35 (2 μl de oligómero 5 μM y 3 μl de oligómero marcado con 32P en 5’), 75 μl de H2O, y 10 μl de 10X tampón (Tris-HCl 500 mM, NaCl 700 mM, y MgCl2 140 mM a pH 8,6). En el momento 0 minutos, se retiraron 9 μl de la muestra de oligómero preparada anteriormente y se añadieron a 10 μl de tampón de parada (urea 6,67 M, formamida al 16,67% y EDTA 83,3 mM) seguido de 1 μl de H2O y se calentaron a 100ºC durante 2,5 a 3 minutos. La cinética del ensayo comenzó por la adición de 9 μl de SVPD (0,5 unidades/ml). La concentración final de enzima fue 0,05 unidades/ml. 40 Cada alícuota de 10 μl de solución para la cinética del oligómero se añadió a 10 μl de tampón de parada y se desactivó por calor como se ha descrito anteriormente. Los instantes de tiempo de la cinética se tomaron a los 1, 3, 9, 27, 80, 240 y 1.290 minutos. Las muestras se analizaron mediante una ronda de PAGE acrilamida al 12% durante

2 horas a 45 vatios/gel.

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') Modificaci6n

06/395421 TTTTTTTTTTTeTe 2’-O-MOE 07/395423 TTTTTTTTTTUIUI 4’-CH2-O-2’ 07/395427 TTTTTTTTTTUSUS 5’-(S)-CH3 BNA 06/7157 TTTTTTTTTTTT (2’-H) sin modificar

Todos los enlaces internucleósido son fosfodiéster, el subíndice S indica la configuración en el átomo de carbono 5’ para los nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’, el subíndice e indica nucleósidos 2’-O-MOE y el subíndice I indica los 4’-CH2-O-2’ BNA. Todos los T sin subíndice son 2’-H. El compuesto que contiene BNA sustituido en 5-metilo (395427) presentaron una notable mejora con respecto al compuesto que contenía BNA no sustituido (395423) y el compuesto que contenía MOE (395421).

SEC ID N0. % c omposici6n % c omposici6n % c omposici6n % composici6n % composici6n a IISIS No. a los 3 min. a los 27 min. a los S0 min. a los 240 min. los 1.290 min.

06/395421 68,7 27,9 17,2 11,6 9,0 07/395423 32,6 4,7 2,5 2,2 2,2 07/395427 100,0 91,6 86,6 76,0 61,1 06/7157 5,2 1,2 2,0 1,7 0,9

Ejemplo 34

0lig6meros interrumpidos 5'-(S)-CH3-BNA y 5'-(R)-CH3-BNA 2-10-2 dirigidos a PTEN: estudio in vitro

De acuerdo con la presente invención, se sintetizaron compuestos oligoméricos y se sometieron a ensayo para

10 determinar su capacidad para reducir la expresión de PTEN a lo largo de un intervalo de dosificaciones. Las células b.END se trataron con los oligómeros modificados 5’-CH3-BNA a concentraciones de 0,3125, 0,0625, 1,25, 2,5, 5, 10 ó 20 nM utilizando los procedimientos descritos en el presente documento. Los niveles de expresión de PTEN se determinaron utilizando la PCR en tiempo real y se normalizaron para RIBOGREEN™ como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Más adelante se expone en forma de tabla el porcentaje de reducción de

15 ARNm de PTEN con relación a las células de referencia no tratadas (% UTC) a una concentración de fármaco de 20 nM. Las curvas dosis-respuesta resultantes se utilizaron para determinar la CE50 de 392747 como se muestra más adelante. Las Tm se evaluaron en tampón fosfato 100 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7, a 260 nm utilizando oligómeros modificados 5’-CH3-BNA 4 μM y ARN complementario 4 μM.

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') %UTC IC50 Tm °C

05/392746 CRURTAGCACTGGCCRUR 75 47,3

05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 28 8,6 57,0

Todos los enlaces internucleósido son fosforotioato y los subíndices R y S indican la configuración en el átomo de 20 carbono 5’ para nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’.

Ejemplo 35

0lig6meros interrumpidos 5'-(S)-CH3-BNA y 5'-(R)-CH3-BNA 2-10-2 dirigidos a PTEN: estudio in vivo

Se inyectaron oligómeros modificados 5’-CH3-BNA (5’-(S) ó 5’-(R)) dirigidos a PTEN a una dosis de 0,5 ó 2 1moles/kg a ratones Balb/c de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) dos veces por semana

25 durante 3 semanas. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la administración final. Se homogeneizaron los tejidos del hígado y se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando la PCR en tiempo real como se ha descrito en el presente documento para la comparación con los niveles de referencia no tratados (%UTC).

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') dosis (ImolesIkg) %UTC

solución salina 100 05/392746 CRURTAGCACTGGCCRUR 2,0 56 05/392746 CRURTAGCACTGGCCRUR 0,5 71 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 2,0 28 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 0,5 91

Todos los enlaces internucleósido son fosforotioato y los subíndices R y S indican la configuración en el átomo de 30 carbono 5’ para nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’.

Ejemplo 36

0lig6meros interrumpidos 5'-(S)-CH3-BNA 2-10-2 dirigidos a PTEN: estudio in vivo

Se inyectaron una vez oligómeros modificados 5’-(S)-CH3-BNA dirigidos a PTEN a una dosis de 1, 2, 4 u 8 μmoles/kg a ratones Balb/c de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Los ratones fueron

5 sacrificados 72 horas después de la administración. Se homogeneizaron los tejidos del hígado y se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando la PCR en tiempo real como se ha descrito en el presente documento para la comparación con los niveles de referencia no tratados (%UTC).

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') dosis (ImolesIkg) %UTC

solución salina 100 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 1 92 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 2 65 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 4 33 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 8 13

Todos los enlaces internucleósido son fosforotioato y el subíndice S indica la configuración en el átomo de carbono 5’ para nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’.

10 Ejemplo 37

0lig6meros interrumpidos 5'-(S)-CH3-BNA y 2'-0-M0E dirigidos a PTEN en un el estudio con dosis multiples, de tres semanas, in vivo.

Se inyectaron los oligómeros modificados 5’-(S)-CH3-BNA (2-10-2, 14-mer), 4’-CH2-O-2’-BNA (2-10-2, 14-mer) y 2’-O-MOE (5-10-5, 20-mer) dirigidos a PTEN a una dosis de 3,2, 1,0, 0,32 y 0,1 μmoles/kg (sólo se muestran más

15 adelante los datos de 3,2 y 1 μmoles/kg) a ratones Balb/c de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) dos veces por semana durante tres semanas. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última administración. Se homogeneizaron los tejidos de hígado y se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando la PCR en tiempo real como se ha descrito en el presente documento para la comparación con los niveles de referencia no tratados (%UTC). La química del plasma y los pesos del hígado se determinaron después del

20 sacrificio.

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') dosis (ImolesIkg) %UTC ALT

solución salina 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 3,2 15 17,5 05/392747 CSUSTAGCACTGGCCSUS 1 53 21,3 08/392063 MeCITITAGCACTGGCMeCITI 3,2 4,2 279,3 08/392063 MeCITITAGCACTGGCMeCITI 1 26 41,0 09/116847 MeCeTeGeMeCeTeAGMeCMeCTMeC 1 53 41,3

TGGATeTeTeGeAe

Todos los enlaces internucleósido son fosforotioato y el subíndice S indica la configuración en el átomo de carbono 5’ para nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’, el subíndice 1 indica un 4’-CH2-O-2’ BNA, el subíndice e indica un 2’-O-MOE y MeC indica un nucleosido 5’-metilcitosina.

Al culminar el estudio, los animales del grupo al que se había administrado una dosificación elevada mostraron un

25 aumento significativo en los pesos del hígado para los oligómeros que contenían 4’-CH2-O-2’ BNA (grupo de dosificación 392063, 3,2 μmoles/kg) (153% con respecto a la solución salina). Por el contrario, los pesos del hígado para los oligómeros que contenían 5’-(S)-CH3 BNA (grupo de dosificación 392749, 3,2 μmoles/kg) fueron un 121% con respecto a la solución salina. Los pesos del hígado para los oligómeros que contenían 2’-O-MOE (grupo de dosificación 116847, 1,0 μmoles/kg) fueron de 116% con respecto a la solución salina. Este ejemplo demuestra que

30 la modificación 5-(S)-CH3-BNA permite el diseño de oligómeros antisentido que muestran una mejora espectacular en los niveles de ALT con respecto a los compuestos modificados 4’-CH2-O-2’ BNA.

Ejemplo 3S

0lig6meros interrumpidos 5'-(S)-Me-BNA y 4'-CH2-0-2' BNA 2-10-2 dirigidos a PTEN: estudio in vivo

Se inyectaron una vez los oligómeros interrumpidos modificados 5’-(S)-CH3 (396569), 4’-CH2-O-2’ BNA 2-10-2

35 dirigidos a PTEN a una dosis de 2,5, 5, 10 y 20 μmoles/kg (sólo se muestran los datos de 5 y 10 μmoles/kg) a ratones Balb/c de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Los ratones fueron sacrificados 66 horas después de la administración. Se homogeneizaron los tejidos de hígado.

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') dosis (ImolesIkg) ALT

solución salina 41,3 10/396569 USCSATGGCTGCAGCSUS 10 111,0 10/396569 USCSATGGCTGCAGCSUS 5 54,0 11/392056 TIMeCIATGGCTGCAGMeCITI 10 925,0 11/392056 TIMeCIATGGCTGCAGMeCITI 5 373,0

Todos los enlaces internucleósido son fosforotioato y el subíndice S indica la configuración en el átomo de carbono 5’ para nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’, el subíndice 1 indica nucleósidos 4’-CH2-O-2’ y el subíndice MeC indica un nucleosido 5’-metilcitosina.

5 Para los oligonucleósidos anteriores, uno (Isis Nº 392056) no incluye un nucleósido que es quiral en el átomo de carbono 5’, en el que el 396569 lo hace. El 396569 incluye un monómero 5’(S)-Me y resulta claramente menos tóxico en el hígado en comparación con el 392056 que no tiene un sustituyente en la posición 5’.

Ejemplo 39

0lig6meros interrumpidos 5'-(S)-Me-BNA, 2'-0-M0E y 4'-CH2-0-2' BNA2-14-2 dirigidos a PTEN: estudio in 10 vivo

Se inyectaron una vez los oligómeros interrumpidos modificados 5’-CH3-BNA dirigidos a PTEN a una dosis de 2 ó 10 μmoles/kg a ratones Balb/c de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración. Se homogeneizaron los tejidos de hígado y se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando la PCR en tiempo real como se ha descrito en el presente documento para la

15 comparación con los niveles de referencia no tratados (%UTC).

SEC ID N0. IISIS N0. Composici6n (5' a 3') modificaci6n

12/394420 MeCeTeGCTAGCCTCTGGATTeTe 2’-O-MOE 12/394425 MeC1T1GCTAGCCTCTGGATT1T1 4’-CH2-O-2’ BNA 13/400521 CSUSGCTAGCCTCTGGATUSUS 5’-(S)-CH3

ISIS N0. dosis (ImolesIkg) %UTC ALT

solución salina 100% 38,5 394420 2 79% 30,3 394420 10 26% 49,3 394425 2 11% 41,2 394425 10 2,1% 2.453,2 400521 2 21,4% 36,7 400521 10 3,8% 152

Todos los enlaces internucleósido son fosforotioato, los subíndices R y S indican la configuración en el átomo de carbono 5’ para nucleósidos 5’-CH3-BNA que también tienen un grupo puente 4’-CH2-O-2’, el subíndice e indica nucleósidos 2’-O-MOE, el subíndice 1 indica nucleósidos 4’-CH2-O-2’ y MeC indica un nucleósido 5’-metilcitosina.

20 En el grupo al que se había administrado una dosificación elevada (10 micromoles/kg), el oligonucleótido 400521 que contenía la modificación 5’(S)-Me es básicamente igual de eficaz que el 394425. Sin embargo, los aumentos de la ALT para 400521 son modestos (152) en comparación con 394425 (2.453,2) lo que indica claramente que sustitución 5’ da como resultado un índice terapéutico mejorado en gran medida.

Claims (40)

1. REIVINDICACIoNES

   1. Un nucleósido bicíclico que tiene la fórmula:

   en la que:

   5 Bx es un resto de base heterocíclico; uno de entre T1 y T2 es H o un grupo protector hidroxilo y el otro de entre T1 y T2 es H, un grupo protector hidroxilo o un grupo fósforo reactivo; Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido;

   10 en la que cada grupo sustituido está mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de entre halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 o N(H)C(=X)N(H)J2 en la que X es O o S; y cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6

   15 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, aminoalquilo C1-C6, aminoalquilo C1-C6 sustituido o un grupo protector, en la que la expresión grupo fósforo reactivo se refiere a una fosforamidita, un H-fosfonato, un triéster de fosfato

   o un auxiliar quiral que contiene fósforo.
2. 2. El nucleósido bicíclico según la reivindicación 1 en el que Z es alquilo C1-C6 sustituido.

   20 3. El nucleósido bicíclico según la reivindicación 2 en el que Z es metilo sustituido.
3. 4. El nucleósido bicíclico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que cada uno de los grupos sustituyentes es, independientemente, F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 o N(H)C(=O)N(H)J2.
4. 5. El nucleósido bicíclico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que cada J, y J2 es, 25 independientemente, H o alquilo C1-C6.

5. 6.

   El nucleósido bicíclico según la reivindicación 1 en el que Z es metilo, etilo o metoximetilo.

6. 7.

   El nucleósido bicíclico según la reivindicación 1 en el que Z es metilo.

7. 8.

   El nucleósido bicíclico según la reivindicación 1 en el que Z es etenilo.

8. 9.

   El nucleósido bicíclico según la reivindicación 1 en el que Z es acilo sustituido.

   30 10. El nucleósido bicíclico según la reivindicación 9 en el que Z es C(=O)NJ1J2.

9. 11.

   El nucleósido bicíclico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que por lo menos uno de entre T1 y T2 es un grupo protector hidroxilo.

10. 12.

    El nucleósido bicíclico según la reivindicación 11 en el que cada uno de dichos grupos protectores hidroxilo se selecciona, independientemente, de entre acetilo, t-butilo, t-butoximetilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, 1-etoxietilo,

    35 1-(2-cloroetoxi)etilo, 2-trimetilsililetilo, p-clorofenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, benzoilo, p-fenilbenzoilo, 2,6-diclorobencilo, difenilmetilo, p-nitrobencilo, trifenilmetilo (tritilo), 4,4’-dimetoxitritilo, trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, trifenilsililo, triisopropilsililo, benzoilformato, cloroacetilo, tricloroacetilo, trifluoroacetilo, pivaloílo, carbonato de 9-fluorenilmetilo, mesilato, tosilato, triflato, tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, 9-fenilxantina-9-ilo (Pixylo) y 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX).

    40 13. El nucleósido bicíclico según la reivindicación 11 en el que T1 es acetilo, bencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo o 4,4’-dimetoxitritilo.

11. 14.

    El nucleósido bicíclico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que T2 es un grupo fósforo reactivo.

12. 15.

    El nucleósido bicíclico según la reivindicación 14 en el que el grupo fósforo reactivo es diisopropilcianoetoxi-fosforamidita o H-fosfonato.

13. 16.

    El nucleósido bicíclico según la reivindicación 15 en el que T2 es diisopropilcianoetoxi-fosforamidita y T1 es 4,4’-dimetoxitritilo.

14. 17.

    El nucleósido bicíclico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que tienen la configuración:

15. 18.

    El nucleósido bicíclico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que tienen la configuración:

16. 19.

    Un compuesto oligomérico que tiene por lo menos un monómero de la fórmula:

    en la que:

    10 Bx es un resto de base heterocíclico; T3 es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo de unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico; T4 es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo de unión de internucleósidos fijado a

    15 un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico; Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido; en la que cada grupo sustituido está mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados

    20 independientemente de entre halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 o N(H)C(=X)N(H)J2 en la que X es O o S; cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, aminoalquilo C1-C6, aminoalquilo C1-C6 sustituido o un

    25 grupo protector; y en la que por lo menos uno de entre T3 y T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico en la que la expresión "compuesto oligomérico" se refiere a un polímero que tiene por lo menos una región que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico, en la que el compuesto oligomérico comprende de 8 a

    30 80 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos.

17. 20.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 19 en el que cada Z es un alquilo C1-C6 sustituido.

18. 21.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 20 en el que cada Z es metilo sustituido.

19. 22.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 en el que cada uno de dichos grupos

    sustituyentes es, independientemente, F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 o 35 N(H)C(=O)N(H)J2.

20. 23.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 22 en el que cada uno de J1 y J2 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.

21. 24.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 19 en el que cada Z es metilo, etilo o metoximetilo.

22. 25.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 24 en el que cada Z es metilo.

23. 26.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 19 en el que cada Z es etenilo.

24. 27.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 19 en el que cada Z es acilo sustituido.

    5 28. El compuesto oligomérico según la reivindicación 27 en el que cada Z es C(=O)NJ1J2.

25. 29.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28 en el que un T3 es H o un grupo protector hidroxilo.

26. 30.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29 en el que un T4 es H o un grupo protector hidroxilo.

    10 31. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28 en el que por lo menos un T3 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido o una subunidad monomérica.
27. 32. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, ó 31 en el que por lo menos un T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un nucleósido, un nucleótido o una subunidad monomérica.
28. 33. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, 30 ó 32 en el que por lo menos un T3 15 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un oligonucleósido o un oligonucleótido.

29. 34.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, 31 ó 33 en el que por lo menos un T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un oligonucleósido o un oligonucleótido.

30. 35.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, 30, 32 ó 34 en el que por lo menos un T3 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un compuesto oligomérico.

    20 36. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, 31, 33 ó 35 en el que por lo menos un T4 es un grupo de unión de internucleósidos fijado a un compuesto oligomérico.
31. 37. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 36 en el que el grupo Z de por lo menos un monómero tiene la configuración:

    25 38. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 36 en el que el grupo Z de por lo menos un monómero tiene la configuración:
32. 39. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 38 en el que por lo menos uno de entre T3 y T4 comprende un grupo de unión de internucleósidos seleccionado de entre fosfodiéster o fosforotioato.

    30 40. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 39 en el que cada grupo de unión de internucleósidos es, independientemente, un fosfodiéster o un fosforotioato.
33. 41. El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 40 que comprenden por lo menos una región de por lo menos dos monómeros contiguos de dicha fórmula.

34. 42.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 41 que comprenden por lo menos dos 35 regiones de por lo menos dos monómeros contiguos de dicha fórmula.

35. 43.

    El compuesto oligomérico según la reivindicación 42 que comprende un compuesto oligomérico interrumpido.

36. 44.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 42 que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos en longitud.

37. 45.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 42 que comprende de aproximadamente 5 8 a aproximadamente 20 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos en longitud.

38. 46.

    El compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 42 que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 16 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos en longitud.

39. 47.

    El compuesto oligomérico según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 42 que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 nucleósidos y/o nucleósidos modificados o miméticos en longitud.

    10 48. Un compuesto oligomérico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 47 para su uso en un procedimiento in vivo para inhibir la expresión génica, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una o más células, un tejido o un animal con dicho compuesto.
40. 49. Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión génica que comprende poner en contacto una o más células o un tejido con un compuesto oligomérico según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 47.