ES2458636T3

ES2458636T3 - Humanización de anticuerpos

Info

Publication number: ES2458636T3
Application number: ES04816814.0T
Authority: ES
Inventors: William Dall-Acqua; Melissa Damschroder; Herren Wu
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2014-05-06
Anticipated expiration: 2024-08-18
Also published as: WO2005042743A3; EP2272566A3; JP2012110325A; JP4934426B2; JP5587280B2; AU2004286198A1; CA2536238C; AU2004286198C1; WO2005042743A8; US20050048617A1; EP1660186A2; EP1660186B1; AU2010227001B2; JP2007502622A; AU2010227001A1; AU2004286198B2; CA2536238A1; EP2272566A2; WO2005042743A2

Abstract

Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.

Description

Humanización de anticuerpos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de modificación por reingeniería o remodelación de anticuerpos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos, al tiempo que se mantiene la inmunoespecificidad de los anticuerpos para un antígeno. En particular, la presente invención proporciona métodos de producción de anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno sintetizando una biblioteca combinatoria que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo donador fusionado en marco con regiones de entramado de un sub-banco de regiones de entramado.

1. Antecedentes de la invención

15 Los anticuerpos desempeñan un papel fundamental en nuestras respuestas inmunitarias. Pueden inactivar virus y toxinas bacterianas y son esenciales en el reclutamiento del sistema del complemento y diversos tipos de glóbulos blancos para destruir microorganismos invasores y parásitos grandes. Los anticuerpos se sintetizan exclusivamente por linfocitos B y se producen en millones de formas, cada una con una secuencia de aminoácidos diferente y un sitio de unión diferente para un antígeno. Los anticuerpos, denominados colectivamente inmunoglobulinas (Ig), están entre los componentes de proteínas más abundantes en la sangre. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc.

Un anticuerpo típico es una molécula en forma de Y con dos cadenas pesadas (H) idénticas (que contienen cada

25 una aproximadamente 440 aminoácidos) y dos cadenas ligeras (L) idénticas (que contienen cada una aproximadamente 220 aminoácidos). Las cuatro cadenas se mantienen juntas mediante una combinación de enlaces no covalentes y covalentes (disulfuro). Las enzimas proteolíticas, tales como papaína y pepsina, pueden dividir una molécula de anticuerpo en diferentes fragmentos característicos. La papaína produce dos fragmentos Fab idénticos y separados, cada uno con un sitio de unión a antígeno, y un fragmento Fc. La pepsina produce un fragmento F(ab’)2. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc.

Tanto las cadenas L como H tienen una secuencia variable en sus extremos amino-terminales pero una secuencia constante en sus extremos carboxilo-terminales. Las cadenas L tienen una región constante de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud y una región variable del mismo tamaño. Las cadenas H también tienen una región

35 variable de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, pero la región constante de las cadenas H tiene aproximadamente 330 ó 440 aminoácidos de longitud, dependiendo de la clase de la cadena H. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc. en la pág. 1019.

Sólo parte de la región variable participa directamente en la unión del antígeno. Estudios han mostrado que la variabilidad en las regiones variables tanto de las cadenas L como H está limitada en su mayor parte a tres regiones hipervariables pequeñas (también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR) en cada cadena. Las partes restantes de la región variable, conocidas como regiones de entramado (FR), son relativamente constantes. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989, Garland Publishing, Inc. en las págs. 1019 1020.

45 Se han usado inmunoglobulinas naturales en ensayos, diagnósticos y, en una medida más limitada, terapia. Sin embargo, tales usos, especialmente en terapia, se han visto dificultados por la naturaleza policlonal de inmunoglobulinas naturales. La llegada de anticuerpos monoclonales de especificidad definida aumentó las oportunidades para uso terapéutico. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos monoclonales se producen tras la inmunización de un animal huésped roedor con la proteína diana y la posterior fusión de una célula del bazo de roedor que produce el anticuerpo de interés con una célula de mieloma de roedor. Por tanto, son esencialmente proteínas de roedor y como tales son naturalmente inmunogénicas en seres humanos, dando con frecuencia lugar a una respuesta inmunitaria no deseada denominada respuesta HAMA (anticuerpo humano anti-ratón).

55 Muchos grupos han ideado técnicas para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos. Tradicionalmente, se selecciona un molde humano mediante el grado de homología con el anticuerpo donador, es decir, se usa el anticuerpo humano más homólogo con el anticuerpo no humano en la región variable como molde para la humanización. El fundamento es que las secuencias de entramado sirven para mantener las CDR en su orientación espacial correcta para la interacción con un antígeno, y que a veces los residuos de entramado pueden incluso participar en la unión a antígeno. Por tanto, si las secuencias de entramado humanas seleccionadas son las más similares a las secuencias de las regiones de entramado donadoras, se maximizará la probabilidad de que se conserve la afinidad en el anticuerpo humanizado. Winter (documento EP n.º 0239400), por ejemplo, propuso generar un anticuerpo humanizado mediante mutagénesis dirigida al sitio usando oligonucleótidos largos con el fin de injertar tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de cada una de las regiones

65 variables de cadena pesada y ligera. Aunque se ha mostrado que este enfoque funciona, limita la posibilidad de seleccionar el mejor molde humano que soporta las CDR donadoras.

Aunque un anticuerpo humanizado es menos inmunogénico que su equivalente natural o quimérico en un ser humano, muchos grupos encuentran que un anticuerpo humanizado con CDR injertada puede demostrar una disminución significativa de la afinidad de unión (por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 3 32:323-327). Por

5 ejemplo, Reichmann y colaboradores encontraron que la transferencia de las regiones CDR sola no era suficiente para proporcionar una actividad de unión a antígeno satisfactoria en el producto con CDR injertada, y que también era necesario convertir un residuo de serina en la posición 27 de la secuencia humana en el correspondiente residuo de fenilalanina de rata. Estos resultados indicaron que pueden ser necesarios cambios en los residuos de la secuencia humana fuera de las regiones CDR para obtener una actividad de unión a antígeno eficaz. Aún así, la afinidad de unión todavía era significativamente inferior a la del anticuerpo monoclonal original.

Por ejemplo, Queen et al (patente estadounidense n.º 5.530.101) describieron la preparación de un anticuerpo humanizado que se une al receptor de interleucina-2, combinando las CDR de un anticuerpo monoclonal murino (mAb anti-Tac) con regiones de entramado y constantes de inmunoglobulina humana. Las regiones de entramado

15 humanas se eligieron para maximizar la homología con la secuencia de mAb anti-Tac. Además, se usó modelado por ordenador para identificar residuos de aminoácido de entramado que era probable que interaccionaran con las CDR o antígeno, y se usaron aminoácidos de ratón en estas posiciones en el anticuerpo humanizado. Se notificó que el anticuerpo anti-Tac humanizado obtenido tenía una afinidad por el receptor de interleucina-2 (p55) de 3 X 109 M-1, lo que todavía era de tan sólo aproximadamente un tercio de la del mAb murino.

Otros grupos identificaron posiciones adicionales dentro de la secuencia de entramado de las regiones variables (es decir, fuera de las CDR y bucles estructurales de las regiones variables) en las que las identidades de aminoácido de los residuos pueden contribuir a obtener productos con CDR injertada con afinidad de unión satisfactoria. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.054.297 y 5.929.212. Además, es imposible saber de

25 antemano lo eficaz que será una disposición de injerto de CDR particular para cualquier anticuerpo de interés dado.

Leung (publicación de solicitud de patente estadounidense n.º US 2003/0040606) describe un enfoque de parches de entramado, en el que la región variable de la inmunoglobulina se compartimentaliza en FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4, y se selecciona la secuencia de FR individual mediante la mejor homología entre el anticuerpo no humano y el molde de anticuerpo humano. Sin embargo, este enfoque requiere mucho trabajo y no pueden identificarse fácilmente las regiones de entramado óptimas.

Dado que están desarrollándose más anticuerpos terapéuticos y tienen resultados más prometedores, es importante poder reducir o eliminar la respuesta inmunitaria del organismo provocada por el anticuerpo administrado. Por tanto,

35 nuevos enfoques que permiten un diseño por ingeniería eficaz y rápido de anticuerpos para que sean de tipo humano y/o que permiten una reducción del trabajo para humanizar un anticuerpo proporcionan grandes beneficios y valor médico.

La mención o discusión de una referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que la misma es técnica anterior con respecto a la presente invención.

2. Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una

45 pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido

55 nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales. Según esta realización, el método puede comprender además introducir la biblioteca combinatoria de secuencias de ácido nucleico en una población de células.

En otra realización, la presente invención proporciona un método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas, produciéndose cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena ligera humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una 65 región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de 5 anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales. Según esta realización, el método puede comprender además introducir la biblioteca combinatoria de secuencias de ácido nucleico en una población 10 de células. En otra realización, la presente invención proporciona un método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende secuencia de ácido nucleico que comprende: (i) un primer conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de dicho primer conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de 15 cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 20 de cadena pesada humana, y (ii) un segundo conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas, produciéndose cada una de dicho segundo conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una 25 región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR de región variable de cadena pesada se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano, 30 las CDR de región variable de cadena ligera se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano, cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada humana es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales y cada secuencia de ácido nucleico

35 que codifica para una región de entramado de cadena ligera humana es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales. Según esta realización, el método puede comprender además introducir la biblioteca combinatoria de secuencias de ácido nucleico en una población de células.

40 Los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar células que comprenden, que contienen o diseñadas por ingeniería para expresar las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento.

La presente invención proporciona un método de producción de un anticuerpo humanizado que se une

45 inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una

50 región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a

55 dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (b) introducir las secuencias de polinucleótido en una población de células que contienen cada una una secuencia de polinucleótido que codifica para una región variable de cadena

60 ligera; y (c) expresar las secuencias de polinucleótido que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Pueden generarse sub-bancos de secuencias de región de entramado de cadena pesada antes de la etapa (a) del método anteriormente descrito. La región variable de cadena ligera puede ser una región variable de cadena ligera humanizada o humana. Según esta realización, el método puede comprender además una etapa (d) que comprende examinar para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente

65 al antígeno.

La presente invención proporciona un método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de 5 ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de

15 anticuerpos humanos funcionales; (b) introducir las secuencias de polinucleótido en una población de células que contienen cada una un polinucleótido que codifica para una región variable de cadena pesada; y (c) expresar las secuencias de polinucleótido que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Pueden generarse sub-bancos de secuencias de región de entramado de cadena ligera antes de la etapa (a) del método anteriormente descrito. La región variable de cadena pesada puede ser una región variable de cadena pesada humanizada o humana. Según esta realización, el método puede comprender además una etapa (d) que comprende examinar para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno.

En otra realización, la presente invención proporciona un método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de 25 primeras secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena 35 pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (b) sintetizar una pluralidad de segundas secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una 45 secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (c) introducir las secuencias de ácido nucleico generadas en las etapas (a) y (b) en una población de células; y (d) expresar las secuencias de nucleótidos que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Según esta realización, el método puede comprender además una etapa (e) que comprende examinar para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno. Pueden generarse sub-bancos de secuencias de región de entramado de

55 cadena ligera antes de la etapa (a) del método anteriormente descrito.

En métodos de la invención, el/los sub-banco(s) de regiones de entramado humanas comprende(n) regiones de entramado de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales en las que se han introducido una o más mutaciones. Los sub-bancos de regiones de entramado pueden usarse fácilmente para sintetizar una biblioteca combinatoria de anticuerpos que puede examinarse para determinar su inmunoespecificidad para un antígeno de interés, así como su inmunogenicidad en un organismo de interés.

La invención se basa, en parte, en la síntesis de sub-bancos de regiones de entramado para las regiones de

65 entramado de cadena pesada variable y la regiones de entramado de cadena ligera variable de anticuerpos y en la síntesis de bibliotecas combinatorias de anticuerpos que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una

región de cadena ligera variable produciéndose la(s) región/regiones de cadenas variables fusionando entre sí en marco regiones determinantes de complementariedad (CDR) derivadas de un anticuerpo donador y regiones de entramado derivadas de sub-bancos de regiones de entramado. La síntesis de sub-bancos de regiones de entramado permite la producción rápida, que requiere menos trabajo, de bibliotecas combinatorias de anticuerpos 5 (con o sin regiones constantes) que pueden examinarse fácilmente para determinar su inmunoespecificidad para un antígeno de interés, así como su inmunogenicidad en un organismo de interés. El enfoque de biblioteca descrito en el presente documento permite una identificación y selección eficiente de regiones de entramado aceptoras humanas. Además de la síntesis de sub-bancos de regiones de entramado, pueden generarse sub-bancos de CDR y fusionarse al azar en marco con regiones de entramado de sub-bancos de regiones de entramado para producir bibliotecas combinatorias de anticuerpos (con o sin regiones constantes) que pueden examinarse para determinar su inmunoespecificidad para un antígeno de interés, así como su inmunogenicidad en un organismo de interés. La metodología de biblioteca combinatoria de la invención se muestra a modo de ejemplo en el presente documento para la producción de anticuerpos humanizados para su uso en seres humanos. Sin embargo, la metodología de biblioteca combinatoria puede aplicarse fácilmente a la producción de anticuerpos para su uso en cualquier

15 organismo de interés.

En algunas realizaciones, una o más de las CDR derivadas de la(s) región/regiones variable(s) de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo donador contiene(n) una o más mutaciones con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica para la CDR correspondiente en el anticuerpo donador.

Pueden producirse anticuerpos humanizados mediante los métodos descritos en el presente documento; tales anticuerpos pueden formularse en una composición que comprende un anticuerpo humanizado producido mediante los métodos descritos en el presente documento y un portador, diluyente o excipiente, que puede ser una composición farmacéutica en una forma para su uso previsto.

25 Los anticuerpos humanizados generados tal como se describe en el presente documento comprenden una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada. Los anticuerpos generados tal como se describe en el presente documento pueden comprender además una(s) región/regiones constante(s).

Los anticuerpos humanizados generados según la invención pueden conjugarse o fusionarse con un resto (por ejemplo, un fármaco o agente terapéutico). Tales anticuerpos pueden formularse en composiciones, preferiblemente composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo generado y/o identificado según la presente invención y un portador, diluyente o excipiente. Las composiciones, preferiblemente composiciones farmacéuticas, pueden comprender un anticuerpo humanizado (o fragmento del mismo) conjugado o fusionado con un resto (por ejemplo,

35 un fármaco o agente terapéutico), y un portador, diluyente o excipiente. Un anticuerpo humanizado generado y/o identificado según la presente invención puede usarse solo o en combinación con otras terapias, para prevenir, tratar, gestionar o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo.

Las composiciones farmacéuticas pueden usarse para la prevención, la gestión, el tratamiento o la mejora de una enfermedad o uno o más síntomas de la misma. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas son estériles y están en forma adecuada para un método de administración particular para un sujeto con una enfermedad.

Los métodos de detección, diagnóstico y/o monitorización de la progresión de un trastorno pueden usar uno o más anticuerpos humanizados generados y/o identificados según los métodos de la invención.

2.1 Terminología

Tal como se usan en el presente documento, los términos “aceptor” y “anticuerpo aceptor” se refieren al anticuerpo o a la secuencia de ácido nucleico que proporciona o codifica para al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones de entramado. En algunas realizaciones, el término “aceptor” se refiere al anticuerpo o a la secuencia de ácido nucleico que proporciona o codifica para la(s) región/regiones constante(s). En una realización específica, el término “aceptor” se refiere a un anticuerpo humano o a una secuencia de ácido nucleico que proporciona o codifica para al menos el 80%, preferiblemente, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% de las secuencias de aminoácidos de una o

55 más de las regiones de entramado. Una región de entramado aceptora y/o región/regiones constante(s) aceptora(s) puede(n), por ejemplo, derivarse u obtenerse de un gen de anticuerpo de línea germinal, un gen de anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (por ejemplo, anticuerpos bien conocidos en la técnica, anticuerpos en desarrollo o anticuerpos disponibles comercialmente).

Tal como se usan en el presente documento, los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camélidos, anticuerpos quiméricos, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de un único dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab), Fv con enlaces disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas 65 de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por

ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

Un anticuerpo típico contiene dos cadenas pesadas emparejadas con dos cadenas ligeras. Una cadena pesada de longitud completa tiene aproximadamente 50 kD de tamaño (aproximadamente 446 aminoácidos de longitud) y se 5 codifica por un gen de región variable de cadena pesada (aproximadamente 116 aminoácidos) y un gen de región constante. Hay diferentes genes de región constante que codifican para la región constante de cadena pesada de diferentes isotipos tales como secuencias alfa, gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu. Una cadena ligera de longitud completa tiene aproximadamente 25 KD de tamaño (aproximadamente 214 aminoácidos de longitud) y se codifica por un gen de región variable de cadena ligera (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda. Las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada son responsables de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras típicas de un anticuerpo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “CDR” se refiere a la región determinante de complementariedad dentro de secuencias variables de anticuerpo. Hay tres CDR en cada una de las regiones 15 variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se designan como CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Los límites exactos de estas CDR se han definido de diferentes maneras según diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) y (1991)) no sólo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites de residuos precisos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) encontraron que determinadas sub-porciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de estructura principal peptídica casi idénticas, a pesar de tener una gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Estas sub-porciones se designaron como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 en las que “L” y “H” designan las regiones de cadena ligera y de cadena

25 pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR de Chothia, que tienen límites que se solapan con las CDR de Kabat. Se han descrito otras CDR que definen límites que se solapan con las CDR de Kabat por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Todavía otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente ninguno de los sistemas anteriores, pero no obstante se solaparán con las CDR de Kabat, aunque pueden estar acortadas o alargadas a la vista de la predicción o de hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos particulares o incluso las CDR completas no tengan un impacto significativo sobre la unión a antígeno. Los métodos usados en el presente documento pueden usar CDR definidas según cualquiera de estos sistemas, aunque realizaciones preferidas usan CDR definidas por Kabat o Chothia.

35 Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado” en el contexto de agente proteico (por ejemplo, proteínas, polipéptidos y péptidos, tales como anticuerpos) se refiere a un agente proteico que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado mediante la introducción de sustituciones, deleciones y/o adiciones de residuos de aminoácido. El término “derivado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un agente proteico que se ha modificado, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al agente proteico. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular o a otra proteína, etc. Puede producirse un derivado de un agente proteico mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de

45 tunicamicina, etc. Además, un derivado de un agente proteico puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Un derivado de un agente proteico presenta una función similar o idéntica a la del agente proteico del que se deriva.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “trastorno” y “enfermedad” se usan de manera intercambiable para un estado en un sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo donador” se refiere a un anticuerpo que proporciona una o más CDR. En una realización preferida, el anticuerpo donador es un anticuerpo de una especie diferente del anticuerpo del que se derivan las regiones de entramado. En el contexto de un anticuerpo humanizado, el término “anticuerpo donador” se refiere a un anticuerpo no humano que proporciona una o más CDR.

55 Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la gravedad y/o la duración de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, prevenir el avance de un trastorno, provocar la regresión de un trastorno, prevenir la recidiva, el desarrollo, la aparición o la progresión de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno o potenciar o mejorar el/los efecto(s) profiláctico(s) o terapéutico(s) de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).

Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopos” se refiere a fragmentos de un polipéptido o una proteína que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente en un mamífero y lo más preferiblemente en un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido 65 o una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o una proteína al que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo tal como se

determina mediante cualquier método bien conocido por un experto en la técnica, por ejemplo mediante inmunoensayos. No se necesita que los epítopos antigénicos sean necesariamente inmunogénicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido o una proteína

5 (incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos de una primera proteína o polipéptido o fragmento funcional, análogo o derivado del mismo, y una secuencia de aminoácidos de una proteína, polipéptido o péptido heterólogo (es decir, una segunda proteína o polipéptido o fragmento, análogo o derivado del mismo diferente de la primera proteína o fragmento, análogo o derivado del mismo). En una realización, una proteína de fusión comprende un agente profiláctico o terapéutico fusionado a una proteína, polipéptido o

10 péptido heterólogo. Según esta realización, la proteína, polipéptido o péptido heterólogo puede ser un tipo diferente o no de agente profiláctico o terapéutico. Por ejemplo, pueden fusionarse entre sí dos proteínas, polipéptidos o péptidos diferentes con actividad inmunomoduladora para formar una proteína de fusión. En una realización preferida, las proteínas de fusión conservan o tienen una actividad mejorada con respecto a la actividad de la proteína, polipéptido o péptido original antes de fusionarse a una proteína, polipéptido o péptido heterólogo.

15 Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento” se refiere a un péptido o polipéptido (incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, al menos

20 40 residuos de aminoácido contiguos, al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, al menos 200 residuos de aminoácido contiguos o al menos 250 residuos de

25 aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido o proteína. En una realización específica, un fragmento de una proteína o polipéptido conserva al menos una función de la proteína o polipéptido.

Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento funcional” se refiere a un péptido o polipéptido (incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo) que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 30 residuos de aminoácido contiguos, al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, al menos 100 residuos de aminoácido 35 contiguos, al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, al menos 200 residuos de aminoácido contiguos o al menos 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido o proteína diferente, en el que dicho polipéptido o proteína conserva al menos una función del segundo polipéptido o proteína diferente. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido o una proteína conserva al menos dos, tres, cuatro o

40 cinco funciones de la proteína o polipéptido. Preferiblemente, un fragmento de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno particular conserva la capacidad de unirse inmunoespecíficamente al antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, el término “región de entramado” o “secuencia de entramado” se refiere

45 a las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Dado que la definición exacta de una secuencia de CDR puede determinarse mediante diferentes sistemas, el significado de una secuencia de entramado está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR (CDR1, 2, y 3 de cadena ligera y CDR1, 2, y 3 de cadena pesada) también dividen las regiones de entramado en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las que CDR1 está situada entre FR1 y FR2, CDR2 entre

50 FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de entramado, según se denomina en otros casos, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una única cadena de inmunoglobulina que se produce de manera natural. Tal como se usa en el presente documento, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y las FR representan dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región de entramado. Como ejemplo, las tablas 1-4 indican las secuencias de línea

55 germinal de FR1, 2, 3 y 4 de la cadena ligera kappa, respectivamente. Las tablas 5-7 indican las secuencias de línea germinal de FR1, 2 y 3 de cadena pesada según la definición de Kabat, respectivamente. Las tablas 8-10 indican las secuencias de línea germinal de FR 1, 2 y 3 de cadena pesada según la definición de Chothia, respectivamente. La tabla 11 indica la secuencia de línea germinal de FR4 de la cadena pesada.

60 Tablas 1-65

El número de SEQ ID para cada secuencia descrita en las tablas 1-65 se indica en la primera columna de cada tabla.

65 Tabla 1. FR1 de cadenas ligeras 1 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 2 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 3 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 4 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 5 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTCGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 6 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCACCTGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 7 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 8 GAGATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTTGTCTATCACCCCTGGAGAGCAGGCCTCCATCTCCTGC 9 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCGCCTGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTTC 10 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATCACCTGC 11 GATGTTGTGATGACACAGTCTCCAGCTTTCCTCTCTGTGACTCCAGGGGAGAAAGTCACCATCACCTGC 12 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 13 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATCACCTGC 14 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 15 GAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGCATTCATGTCAGCGACTCCAGGAGACAAAGTCAACATCTCCTGC 16 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGT 17 GCCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 18 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 19 AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTGCCATGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGT 20 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGT 21 GAAATAGTGATGATGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC 22 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 23 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGT 24 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC 25 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC 26 GACATCCAGATGATCCAGTCTCCATCTTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAGTATCATTTGC 27 GCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 28 GTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGT 29 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 30 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGT 31 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC 32 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 33 GCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCATTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGT 34 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 35 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 36 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 37 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 38 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 39 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC 40 GAAATTGTAATGACACAGTCTCCACCCACCCTGTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGTCACCCTCTCCTGC 41 GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC

42 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC

43 GAAATTGGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC 44 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGC 45 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC 46 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCOOCCTCCATCTCCTGC

Tabla 2. FR2 de cadenas ligeras Tabla 3. FR3 de cadenas ligeras

47: TGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTAT

48: TGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTAT

49: TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT

50: TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT

51: TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTAT

52: TGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCCAAGACTCCTAATTTAT

53: TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT

54: TGGTTTCTGCAGAAAGCCAGGCCAGTCTCCACACTCCTGATCTAT

55: TGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCCAAGACTCCTAATTTAT

56: TGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAG

57: TGGTACCAGCAGAAACCAGATCAAGCCCCAAAGCTCCTCATCAAG

58: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTAT

59: TGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAG

60: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTAT

61: TGGTACCAACAGAAACCAGGAGAAGCTGCTATTTTCATTATTCAA

62: TGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTAT

63: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

64: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

65: TGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCACCTGATCTAT

66: TGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTAT

67: TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

68: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTAT

69: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

70: TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

71: TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

72: TGGTATCTGCAGAAACCAGGGAAATCCCCTAAGCTCTTCCTCTAT

73: TGGTATCAGCAAAAACCAGCAAAAGCCCCTAAGCTCTTCATCTAT

74: TGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTAT

75: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTAT

76: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

77: TGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

78: TGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

79: TGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

80: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

81: TGGTATCGGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTAT

82: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAC

83: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT

84: TGGTATCGGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTAT

85: TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAC

86: TGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGGCGCCCAGGCTCCTCATCTAT

87: TGGTACCAGCAGAAACCTGGGCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

88: TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCTGGCGCCCAGGCTCCTCATCTAT

89: TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

90: TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTAC

91: TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT

92: TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT

Tabla 4. FR4 de cadenas ligeras

139 TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA 140 TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 141 TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA 142 TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA 143 TTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

Tabla 5. FR1 de cadenas pesadas (definición de Kabat)

Tabla 6. FR2 de cadenas pesadas (definición de Kabat)

188 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGA 189 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGA 190 TGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGA 191 TGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGA 192 TGGGTGCGACAGGCCCCCGGACAAGCGCTTGAGTGGATGGGA 193 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGA 194 TGGGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGA 195 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGA 196 TGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGA 197 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCA 198 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCA 199 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCA 200 TGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCA 201 TGGGTCCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGGAGTGGGTCTCA 202 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGC 203 TGGGCCCGCAAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTATCG 204 TGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCT 205 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA 206 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA 207 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA 208 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA 209 TGGGTCCATCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTATCG 210 TGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA 211 TGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCT 212 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCA 213 TGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTAGGT 214 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA 215 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAATATGTTTCA 216 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA 217 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCC 218 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGC 219 TGGGTCCGCCAGGCTTCCGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTTGGC 220 TGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTGGGTCTCA 221 TGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCA 222 TGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGG 223 TGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGG 224 TGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGG 225 TGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGG 226 TGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGG 227 TGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGG 228 TGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGG 229 TGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGG 230 TGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGA 231 TGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGA

Tabla 7. FR3 de cadenas pesadas (definición de Kabat)

Tabla 8. FR1 de cadenas pesadas (definición de Chothia)

Tabla 9. FR2 de cadenas pesadas (definición de Chothia)

320 TATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC 321 TACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATC 322 TTATCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGTTTT 333 TATGCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGAGC 324 CGCTACCTGCACTGGGTGCGACAGGCCCCCGGACAAGCGCTTGAGTGGATGGGATGGATC 325 TACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATC 326 TCTGCTATGCAGTGGGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGATGGATC 327 TATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATC 328 TATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATG 329 ATGGGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATT 330 GTGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACTCATT 331 ATGTGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACTCATT 332 TACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATT 333 TACGACATGCACTGGGTCCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGGAGTGGGTCTCAGCTATT 334 GCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATT 335 AGTGACATGAACTGGGCCCGCAAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTATCGGGTGTT 336 TATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATT 337 TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATT 338 TATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATT 339 TATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATA 340 TATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATA 341 AGTGACATGAACTGGGTCCATCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTATCGGGTGTT 342 AATGAGATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATT 343 TATACCATGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTATT 344 TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATT 345 TATGCTATGAGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTAGGTTTCATT 346 AACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATT 347 TATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAATATGTTTCAGCTATT 348 AACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATT 349 TATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATA 350 CACTACATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTACT 351 TCTGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATT 352 TACTGGATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTGGGTCTCACGTATT 353 TATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATT 354 AACTGGTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTACATC 355 TACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATC

356 TACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATC 357 TACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATC 358 TACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTATC 359 TACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATC 360 TACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATC 361 TACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATC 362 GCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACA 363 TATGGTATGAATTGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGTTC

Tabla 10. FR3 de cadenas pesadas (definición de Chothia)

Tabla 11. FR4 de Cadena pesada

408 TGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 409 TGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA 410 TGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA 411 TGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 412 TGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 413 TGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

Tal como se usa en el presente documento, el término “gen de anticuerpo de línea germinal” o “fragmento de gen”

5 se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que conduce a reordenamiento génico y mutación para la expresión de una inmunoglobulina particular. (Véase, por ejemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Una de las ventajas proporcionadas por diversas realizaciones de la presente invención surge del reconocimiento de que los genes de anticuerpos de línea germinal tienen más probabilidades que los

10 genes de anticuerpos maduros de conservar estructuras de secuencias de aminoácidos esenciales característica de individuos en la especie, por tanto menos probabilidades de reconocerse como una fuente foránea cuando se usan terapéuticamente en esa especie.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo o una variante,

15 derivado, análogo o fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región de entramado (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente” en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana

5 (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de entramado son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera como también al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado sólo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.

15 El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitación, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la técnica.

No se necesita que las regiones de entramado y CDR de un anticuerpo humanizado correspondan de manera precisa a las secuencias originales, por ejemplo, la CDR de anticuerpo donador o la región de entramado aceptora pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción y/o deleción de al menos un residuo de aminoácido de modo que el residuo de CDR o entramado en ese sitio no corresponde al anticuerpo donador o a la región de entramado aceptora. Sin embargo, tales mutaciones no serán extensas. Habitualmente, al menos el 80%, preferiblemente al

25 menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias FR y CDR originales.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” incluye la célula sujeto particular transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico y la progenie o progenie potencial de una célula de este tipo. La progenie de una célula de este tipo puede no ser idéntica a la célula original transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a mutaciones o influencias del entorno que pueden producirse en generaciones posteriores o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula huésped.

Tal como se usa en el presente documento, el término “se une inmunoespecíficamente a un antígeno” y términos

35 análogos se refieren a péptidos, polipéptidos, proteínas (incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas de fusión y anticuerpos) o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un antígeno o un fragmento y no se unen específicamente a otros antígenos. Un péptido, polipéptido o proteína que se une inmunoespecíficamente a un antígeno puede unirse a otros antígenos con afinidad inferior tal como se determina, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno pueden tener reactividad cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no tienen reactividad cruzada con otros antígenos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” en el contexto de un agente proteico (por ejemplo,

45 un péptido, polipéptido o proteína (tal como proteína de fusión o anticuerpo)) se refiere a un agente proteico que está sustancialmente libre de material celular o proteínas, polipéptidos, péptidos y anticuerpos contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un agente proteico en las que el agente proteico está separado de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de manera recombinante. Por tanto, un agente proteico que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un agente proteico que tienen menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10% o el 5% (en peso seco) de proteína, polipéptido o péptido heterólogo (también denominados “proteína contaminante”). Cuando el agente proteico se produce de manera recombinante, preferiblemente también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el

55 20%, el 10% o el 5% del volumen de la preparación de agente proteico. Cuando el agente proteico se produce mediante síntesis química, preferiblemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, está separado de precursores químicos u otros productos químicos que participan en la síntesis del agente proteico. Por consiguiente, tales preparaciones de un agente proteico tienen menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5% (en peso seco) de compuestos o precursores químicos distintos del agente proteico de interés. En una realización específica, los agentes proteicos dados a conocer en el presente documento están aislados. En una realización preferida, un anticuerpo de la invención está aislado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” en el contexto de moléculas de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están 65 presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, preferiblemente está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de

cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En una realización específica, las moléculas de ácido nucleico están aisladas. En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo de la invención está aislada. Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente

5 libre” se refiere a la preparación del ácido nucleico “aislado” que tiene menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10% o el 5% (en peso seco) de ácidos nucleicos heterólogos, y preferiblemente otro material celular, medio de cultivo, precursores químicos u otros productos químicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “en combinación” se refiere al uso de más de una terapia (por

10 ejemplo, más de un agente profiláctico y/o agente terapéutico). El uso del término “en combinación” no limita el orden en el que se administran las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos) a un sujeto. Una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) puede administrarse antes que (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o

15 12 semanas antes), simultáneamente con o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto.

20 Tal como se usan en el presente documento, los términos “gestionar”, “que gestiona” y “gestión” se refieren a los efectos beneficiosos que puede obtener un sujeto de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico), que no da como resultado una cura de la enfermedad. En determinadas realizaciones, a un sujeto se le administran una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) para “gestionar” una enfermedad para prevenir la progresión o el empeoramiento de la enfermedad.

25 Tal como se usa en el presente documento, el término “gen de anticuerpo maduro” se refiere a una secuencia genética que codifica para una inmunoglobulina que se expresa, por ejemplo, en un linfocito tal como una célula B, en un hibridoma o en cualquier célula productora de anticuerpos que ha experimentado un proceso de maduración de modo que se expresa la inmunoglobulina particular. El término incluye ADN genómico maduro, ADNc y otras

30 secuencias de ácido nucleico que codifican para tales genes maduros, que se han aislado y/o diseñado por ingeniería recombinante para su expresión en otros tipos de células. Los genes de anticuerpos maduros han experimentado diversas mutaciones y reordenamientos que los distinguen estructuralmente de genes de anticuerpos codificados en todas las células distintas de linfocitos. Los genes de anticuerpos maduros en seres humanos, roedores y muchos otros mamíferos se forman mediante fusión de segmentos de genes V y J en el caso de cadenas

35 ligeras de anticuerpos y fusión de segmentos de genes V, D y J en el caso de cadenas pesadas de anticuerpos. Muchos genes de anticuerpos maduros adquieren mutaciones puntuales tras la fusión, algunas de las cuales aumentan la afinidad de la proteína de anticuerpo por un antígeno específico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aprobado por una

40 agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o indicada en la farmacopea de los Estados Unidos, la farmacopea europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente, en seres humanos.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención” se refieren a la 45 inhibición del desarrollo o la aparición de un trastorno o a la prevención de la recidiva, aparición o desarrollo de uno

o más síntomas de un trastorno en un sujeto que se obtiene como resultado de la administración de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) o la administración de una combinación de terapias (por ejemplo, una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos).

50 Tal como se usan en el presente documento, los términos “agente profiláctico” y “agentes profilácticos” se refieren a cualquier agente que puede usarse en la prevención de un trastorno o uno o más de los síntomas del mismo. En determinadas realizaciones, el término “agente profiláctico” se refiere a un anticuerpo de la invención. En determinadas otras realizaciones, el término “agente profiláctico” se refiere a un agente distinto de un anticuerpo de la invención. Preferiblemente, un agente profiláctico es un agente que se sabe que es útil para, o se ha usado o está

55 usándose actualmente para, prevenir o impedir la aparición, desarrollo, progresión y/o gravedad de un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, agente profiláctico) que es suficiente para dar como resultado la prevención del desarrollo,

60 recidiva o aparición de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, o para potenciar o mejorar el/los efecto(s) profiláctico(s) de otra terapia (por ejemplo, un agente profiláctico).

Tal como se usa en el presente documento, el término “protocolo” se refiere a un régimen para administrar dosis y determinar el tiempo de administración de una o más terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos) que tiene un

65 efecto terapéutico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “efectos secundarios” abarca efectos adversos y no deseados de un agente profiláctico o terapéutico. Los efectos secundarios siempre son no deseados, pero los efectos no deseados no son necesariamente adversos. Un efecto adverso de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) puede ser dañino, incómodo o peligroso.

5 Tal como se usa en el presente documento, el término “moléculas pequeñas” y términos análogos incluyen, pero no se limitan a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácido, polinucleótidos, análogos de polinucleótido, nucleótidos, análogos de nucleótido, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 10.000

10 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente

5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales agentes.

15 Tal como se usan en el presente documento, los términos “sujeto” y “paciente” se usan de manera intercambiable. Tal como se usan en el presente documento, los términos “sujeto” y “sujetos” se refieren a un animal, preferiblemente un mamífero incluyendo uno que no es un primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, tal como un mono cynomolgus, un chimpancé y un ser

20 humano), y lo más preferiblemente un ser humano. En una realización, el sujeto es un animal no humano tal como un ave (por ejemplo, una codorniz, pollo o pavo), un animal de granja (por ejemplo, una vaca, caballo, cerdo u oveja), una mascota (por ejemplo, un gato, perro o cobaya) o un animal de laboratorio (por ejemplo, un modelo de animal para un trastorno). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano (por ejemplo, un bebé, niño, adulto o anciano).

25 Tal como se usa en el presente documento, el término “sinérgico” se refiere a una combinación de terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) que es más eficaz que los efectos aditivos de dos o más terapias individuales cualesquiera (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos). Un efecto sinérgico de una combinación de terapias (por ejemplo, una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos) permite el uso de

30 dosificaciones inferiores de una o más de terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) y/o la administración menos frecuente de dichas terapias a un sujeto con un trastorno. La capacidad de usar dosificaciones inferiores de terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) y/o administrar dichas terapias con menor frecuencia reduce la toxicidad asociada con la administración de dichas terapias a un sujeto sin reducir la eficacia de dichas terapias en la prevención o el tratamiento de un trastorno. Además, un efecto sinérgico

35 puede dar como resultado una eficacia mejorada de las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) en la prevención o el tratamiento de un trastorno. Finalmente, el efecto sinérgico de una combinación de terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) puede evitar o reducir los efectos secundarios adversos o no deseados asociados con el uso de cualquier terapia individual.

40 Tal como se usan en el presente documento, los términos “agente terapéutico” y “agentes terapéuticos” se refieren a cualquier agente que puede usarse en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. En determinadas realizaciones, el término “agente terapéutico” se refiere a un anticuerpo de la invención. En determinadas otras realizaciones, el término “agente terapéutico” se refiere a un agente distinto de un anticuerpo de la invención. Preferiblemente, un agente terapéutico es un agente que se sabe que es útil para, o se

45 ha usado o está usándose actualmente para, la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, un anticuerpo de la invención), que es suficiente para reducir la gravedad de un trastorno,

50 reducir la duración de un trastorno, mejorar uno o más síntomas de un trastorno, prevenir el avance de un trastorno, provocar la regresión de un trastorno o potenciar o mejorar el/los efecto(s) terapéutico(s) de otra terapia.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “terapias” y “terapia” pueden referirse a cualquier protocolo, método y/o agente que pueden usarse en la prevención, tratamiento, gestión y/o mejora de un trastorno o

55 uno o más síntomas del mismo. En determinadas realizaciones, los términos “terapia” y “terapia” se refieren a terapia antiviral, terapia antibacteriana, terapia antifúngica, agente anticancerígeno, terapia biológica, terapia de soporte y/u otras terapias útiles en el tratamiento, gestión, prevención o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, un profesional médico tal como un médico.

60 Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y “que trata” se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno o mejora de uno o más síntomas del mismo que se obtiene como resultado de la administración de una o más terapias (incluyendo, pero sin limitarse a, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos).

65 3.2 Breve descripción de las figuras

Figura 1. Secuencias de ácido nucleico y proteína de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal de ratón anti-EphA2 humano B233. Las regiones CDR1, 2 y 3 tal como se definen por Kabat están en recuadros. Las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas variables pesada (VH) y ligera (VL) se facilitan usando el código de una letra convencional.

5 Figura 2. Vector de fago usado para el examen de las bibliotecas de intercambio de región de entramado y la expresión de los fragmentos Fab correspondientes. El ADN monocatenario, purificado por estreptavidina, de cada uno de los genes de VL y VH se hibrida con el vector mediante mutagénesis por hibridación usando homología en las regiones líder/Cκ del gen 3 y líder/Cκ1 del gen 3, respectivamente. El sitio Xba1 único en los bucles palindrómicos permite la eliminación del vector original. Entonces se expresan los genes de VH y VL en marco con el primer dominio constante de la cadena pesada κ1 humana y el dominio constante de la cadena ligera kappa (κ) humana, respectivamente.

Figura 3. Secuencias de proteína de clones humanizados, con intercambio de región de entramado, del anticuerpo

15 monoclonal anti-EphA2 humano B233 aislado tras examinar las bibliotecas A y B. Las regiones CDR1, 2 y 3 tal como se definen por Kabat están en recuadros. Las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas variables pesada (VH) y ligera (VL) se facilitan usando el código de una letra convencional.

Figura 4. Titulación mediante ELISA usando extractos de Fab sobre Fc contra EphA2 humano inmovilizado.

Figura 5. Análisis de secuencia de anticuerpos con intercambio de región de entramado. Se calculó la identidad en porcentaje a nivel de aminoácido para cada región de entramado de anticuerpo individual usando el mAb B233 como referencia.

25 Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a métodos de modificación por reingeniería o remodelación de un anticuerpo de una primera especie, en el que el anticuerpo modificado por reingeniería o remodelado no provoca una respuesta inmunitaria no deseada en una segunda especie, y el anticuerpo modificado mediante reingeniería o remodelado conserva sustancialmente la misma capacidad de unión a antígeno del anticuerpo de la primera especie. Puede construirse una biblioteca combinatoria que comprende las CDR del anticuerpo de la primera especie fusionadas en marco con regiones de entramado de un banco de regiones de entramado derivadas de una segunda especie y examinarse para seleccionar el anticuerpo modificado deseado.

35 Las células pueden comprender, contener o diseñarse por ingeniería para expresar las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. Un método de producción de una región variable de cadena pesada humanizada tal como se describe en el presente documento puede comprender expresar la secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada en una célula descrita en el presente documento. Un método de producción de una región variable de cadena ligera humanizada puede comprender expresar la secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada en una célula descrita en el presente documento. Un método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno puede comprender expresar la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) para el anticuerpo humanizado contenido en la célula descrita en el presente documento.

45 Pueden producirse anticuerpos humanizados mediante los métodos descritos en el presente documento. Una composición puede comprender un anticuerpo humanizado producido mediante los métodos descritos en el presente documento y un portador, diluyente o excipiente, tales composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas en una forma adecuada para su uso previsto.

Para claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la sección de la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones:

(i): construcción de un banco global de regiones de entramado aceptoras 55

(ii) selección de CDR

(iii) construcción de sub-bibliotecas combinatorias

(iv): construcción de bibliotecas combinatorias

(v): expresión de las bibliotecas combinatorias

(vi): selección de anticuerpos humanizados 65

(vii) producción y caracterización de anticuerpos humanizados

(viii) conjugados de anticuerpos

(ix): usos de las composiciones 5

(x): administración y formulaciones

(xi): dosificación y frecuencia de administración

10 (xii) ensayos biológicos

(xiii) kits

(xiv) artículo de fabricación 15

2.2 Construcción de un banco global de regiones de entramado aceptoras

Según la presente invención, una región de cadena ligera variable y/o región de cadena pesada variable de un anticuerpo no humano donador puede humanizarse fusionando entre sí secuencias de ácido nucleico que codifican 20 para regiones de entramado (FR1, FR2, FR3, FR4 de la cadena ligera, y FR1, FR2, FR3, FR4 de la cadena pesada) de un anticuerpo humano aceptor y secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, CDR3 de la cadena ligera, y CDR1, CDR2, CDR3 de la cadena pesada) del anticuerpo donador. Preferiblemente, la cadena ligera de anticuerpo humanizado comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Una cadena pesada de anticuerpo humanizado comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2,

25 FR3, CDR3 y FR4. Cada región de entramado humana aceptora (FR1, 2, 3, 4 de cadena ligera, y FR1, 2, 3, 4 de cadena pesada) puede generarse a partir de sub-bancos de FR para la cadena ligera y sub-bancos de FR para la cadena pesada, respectivamente. Un banco global de regiones de entramado humanas aceptoras comprende dos o más sub-bancos de FR.

30 2.2.1 Generación de sub-bancos para las regiones de entramado de cadena ligera

Se construyen los sub-bancos 1, 2, 3 y 4 de cadenas ligeras, en los que el sub-banco 1 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR1 de cadena ligera; el sub-banco 2 comprende una pluralidad de secuencias de ácido 35 nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR2 de cadena ligera; el sub-banco 3 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR3 de cadena ligera; y el subbanco 4 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR4 de cadena ligera. En algunas realizaciones, las secuencias

40 de FR se obtienen o se derivan de secuencias de anticuerpos humanos funcionales (por ejemplo, un anticuerpo conocido en la técnica y/o disponible comercialmente). En algunas realizaciones, las secuencias de FR se derivan de secuencias de cadena ligera de línea germinal humana. En una realización, las secuencias de FR del sub-banco se derivan de secuencias de cadena kappa de línea germinal humana. En otra realización, las secuencias de FR del sub-banco se derivan de secuencias de cadena lambda de línea germinal humana.

45 A modo de ejemplo pero no de limitación, lo siguiente describe un método de generación de 4 sub-bancos de FR de cadena ligera usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en el que se usan secuencias de cadena kappa de línea germinal humana como moldes. Los sub-bancos de FR de cadena ligera 1, 2 y 3 (que codifican para FR1, 2, 3 respectivamente) abarcan 46 secuencias de cadena kappa de línea germinal humana (A1, A10, A11, A14,

50 A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, 012, 014, 018, 02, 04 y 08). Véase Kawasaki et al., 2001, Eur. J. Immunol., 31:1017-1028; Schable y Zachau, 1993, Biol. Chem. Hoppe Seiler 374: 1001-1022; y Brensing-Kuppers et al., 1997, Gene 191:173-181. Las secuencias se resumen en el sitio web del NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=VK&seqType=nucleotide. El sub

55 banco de FR de cadena ligera 4 (que codifica para FR4) abarca 5 secuencias de cadena kappa de línea germinal humana (Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 yJκ5). Véase Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-1522. Las secuencias se resumen en el sitio web del: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=JK&seqType=nucleotide.

60 A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR1 de cadena ligera se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 12 y la tabla 13 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 12. Cebadores directos de FR1 de cadena ligera (para el sub-banco 1)

414 FR1L1 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC 415 FR1L2 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC 416 FR1L3 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCC 417 FR1L4 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC 418 FR1L5 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCC 419 FR1L6 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCACCTGTCACCC 420 FR1L7 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC 421 FR1L8 GAGATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTTGTCTATCACCC 422 FR1L9 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCTCGCCTGTCACCC 423 FR1L10 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTC 424 FR1L11 GATGTTGTGATGACACAGTCTCCAGCTTTCCTCTCTGTGACTC 425 FR1L12 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 426 FR1L13 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTC 427 FR1L14 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 428 FR1L15 GAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGCATTCATGTCAGCGACTC 429 FR1L16 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTG 430 FR1L17 GCCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 431 FR1L18 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTG 432 FR1L19 AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTGCCATGTCTGCATCTG 433 FR1L20 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTG 434 FR1L21 GAAATAGTGATGATGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTC 435 FR1L22 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 436 FR1L23 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTG 437 FR1L24 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTC 438 FR1L25 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTC 439 FR1L36 GACATCCAGATGATCCAGTCTCCATCTTTCCTGTCTGCATCTG 440 FR1L27 GCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATTCTCCCTGTCTGCATCTG 441 FR1L28 GTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTA 442 FR1L29 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 443 FR1L30 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTG 444 FR1L31 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTC 445 FR1L32 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTG 446 FR1L33 GCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCATTCTCTGCATCTA 447 FR1L34 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 448 FR1L35 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 449 FR1L36 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 450 FR1L37 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 451 FR1L38 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 452 FR1L39 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG 453 FR1L40 GAAATTGTAATGACACAGTCTCCACCCACCCTGTCTTTGTCTC 454 FR1L41 GAAATTGTAATGACACAGTGTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTC 455 FR1L42 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTC 456 FR1L43 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC

457 FR1L44 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTC 458 FR1L45 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC 459 4FR1L46 GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC

Tabla 13. Cebadores inversos de FR1 de cadena ligera (para el sub-banco 1)

460 FR1L1’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTGTCCAAGGGTGACGGGCAGGGAGAGTG 461 FR1L2’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTGTCCAAGGGTGACGGGCAGGGAGAGTG 462 FR1L3’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTGTCCAGGGGTGACGGACAGAGAGAGTG 463 FR1L4’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTG 464 FR1L5’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTGTCCAGGGGTGACGGACAGAGAGAGTG 465 FR1L6’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTGTCCAAGGGTGACAGGTGAGGAGAGTG 466 FR1L7’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTG 467 FR1L8’ GCAGGAGATGGAGGCCTGCTCTCCAGGGGTGATAGACAAGGAGAGTG 468 FR1L9’ GAAGGAGATGGAGGCCGGCTGTCCAAGGGTGACAGGCGAGGAGAGTG 469 FR1L10’ GCAGGTGATGGTGACTTTCTCCTTTGGAGTCACAGACTGAAAGTCTG 470 FR1L11’ GCAGGTGATGGTGACTTTCTCCCCTGGAGTCACAGAGAGGAAAGCTG 471 FR1L12’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 472 FR1L13’ GCAGGTGATGGTGACTTTCTCCTTTGGAGTCACAGACTGAAAGTCTG 473 FR1L14’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 474 FR1L15’ GCAGGAGATGTTGACTTTGTCTCCTGGAGTCGCTGACATGAATGCTG 475 FR1L16’ ACAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGTGAGGATG 476 FR1L17’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 477 FR1L18’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGTGGAAG 478 FR1L19’ ACAAGTGATGGTGACTCTGTGTCCTACAGATGCAGACATGGCAGATG 479 FR1L20’ ACAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGTGAGGATG 480 FR1L21’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACACAGACAGGGTGGCTG 481 FR1L22’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 482 FR1L23’ ACAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACACAGAAGATG 483 FR1L24’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACACAGACAGGGTGGCTG 484 FR1L25’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACAAAGACAGGGTGGCTG 485 FR1L36’ GCAAATGATACTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGAAAGATG 486 FR1L27’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGAATG 487 FR1L28’ ACAACTGATGGTGACTCTGTCTCCTGTAGATGCAGAGAGTAAGGATG 488 FR1L29’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 489 FR1L30’ ACAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACACGGAAGATG 490 FR1L31’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACAAAGACAGGGTGGCTG 491 FR1L32’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGAAGGATG 492 FR1L33’ ACAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTGTAGATGCAGAGAATGAGGATG 493 FR1L34’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 494 FR1L35’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 495 FR1L36’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 496 FR1L37’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 497 FR1L38’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG

498 FR1L39’ GCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATG 499 FR1L40’ GCAGGAGAGGGTGACTCTTTCCCCTGGAGACAAAGACAGGGTGGGTG 500 FR1L41’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACAAAGACAGGGTGGCTG 501 FR1L42’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACAAAGACAGGGTGGCTG 502 FR1L43’ GCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCCTGGAGACAAAGACAGGGTGCCTG 503 FR1L44’ GCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAGCCAGGGAGTCTG 504 FR1L45’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTG 505 FR1L46’ GCAGGAGATGGAGGCCGGCTCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTG

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (46 en total): FR1L1/FR1L1’, FR1L2/FR1L2’, FR1L3/FR1L3’, FR1L4/FR1L4’, FR1L5/FR1L5’, FR1L6/FR1L6’, FR1L7/FR1L7’, FR1L8/FR1L8’, FR1L9/FR1L9’, FR1L10/FR1L10’, FR1L11/FR1L11’, FR1L12/FR1L12’, FR1L13/FR1L13’, FR1L14/FR1L14’, 5 FR1L15/FR1L15’, FR1L16/FR1L16’, FR1L17/FR1L17’, FR1L18/FR1L18’, FR1L19/FR1L19’, FR1L20/FR1L20’, FR1L21/FR1L21’, FR1L22/FR1L22’, FR1L23/FR1L23’, FR1L24/FR1L24’, FR1L25/FR1L25’, FR1L26/FR1L26’, FR1L27/FR1L27’, FR1L28/FR1L28’, FR1L29/FR1L29’, FR1L30/FR1L30’, FR1L31/FR1L31’, FR1L32/FR1L32’, FR1L33/FR1L33’, FR1L34/FR1L34’, FR1L35/FR1L35’, FR1L36/FR1L36’, FR1L37/FR1L37’, FR1L38/FR1L38’, FR1L39/FR1L39’, FR1L40/FR1L40’, FR1L41/FR1L41’, FR1L42/FR1L42’, FR1L43/FR1L43’, FR1L44/FR1L44’,

10 FR1L45/FR1L45’ y FR1L46/FR1L46’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 1.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR2 de cadena ligera se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 14 y la tabla 15 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

15 Tabla 14. Cebadores directos de FR2 de cadena ligera (para el sub-banco 2)

506 FR2L1 TGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAA 507 FR2L2 TGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAA 508 FR2L3 TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAC 509 FR2L4 TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCAC 510 FR2L5 TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCAC 511 FR2L6 TGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCCAA 512 FR2L7 TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCAC 513 FR2L8 TGGTTTCTGCAGAAAGCCAGGCCAGTCTCCA 514 FR2L9 TGGCTTCAGCAGAGGCCAGGCCAGCCTCCAA 515 FR2L10 TGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCAA 516 FR2L11 TGGTACCAGCAGAAACCAGATCAAGCCCCAA 517 FR2L12 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTA 518 FR2L13 TGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCAA 519 FR2L14 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 520 FR2L15 TGGTACCAACAGAAACCAGGAGAAGCTGCTA 521 FR2L16 TGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 522 FR2L17 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 523 FR2L18 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 524 FR2L19 TGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTA 525 FR2L20 TGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTA 526 FR2L21 TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA 527 FR2L22 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTA 528 FR2L23 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 529 FR2L24 TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA 530 FR2L25 TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA 531 FR2L26 TGGTATCTGCAGAAACCAGGGAAATCCCCTA 532 FR2L27 TGGTATCAGCAAAAACCAGCAAAAGCCCCTA 533 FR2L28 TGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTG 534 FR2L29 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTA 535 FR2L30 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 536 FR2L31 TGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA 537 FR2L32 TGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA 538 FR2L33 TGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTA 539 FR2L34 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 540 FR2L35 TGGTATCGGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTA 541 FR2L36 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 542 FR2L37 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 543 FR2L38 TGGTATCGGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTA 544 FR2L39 TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA 545 FR2L40 TGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGGCGCCCA 546 FR2L41 TGGTACCAGCAGAAACCTGGGCAGGCTCCCA 547 FR2L42 TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCTGGCGCCCA 548 FR2L43 TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA 549 FR2L44 TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTA 550 FR2L45 TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCAC 551 FR2L46 TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCAC

Tabla 15. Cebadores inversos de FR2 de cadena ligera (para el sub-banco 2)

552 FR2L1’ ATAAATTAGGCGCCTTGGAGATTGGCCTGGCCTCT 553 FR2L2’ ATAAATTAGGCGCCTTGGAGATTGGCCTGGCCTCT 554 FR2L3’ ATAGATCAGGAGCTGTGGAGACTGGCCTGGCTTCT 555 FR2L4’ ATAGATCAGGAGCTGTGGAGACTGCCCTGGCTTCT 556 FR2L5’ ATAGATCAGGAGCTGTGGAGGCTGGCCTGGCTTCT 557 FR2L6’ ATAAATrAGGAGTCTTGGAGGCTGGCCTGGCCTCT 558 FR2L7’ ATAGATCAGGAGCTGTGGAGACTGCCCTGGCTTCT 559 FR2L8’ ATAGATCAGGAGTGTGGAGACTGGCCTGGCTTTCT 560 FR2L9’ ATAAATTAGGAGTCTTGGAGGCTGGCCTGGCCTCT 561 FR2L10’ CTTGATGAGGAGCTTTGGAGACTGATCTGGTTTCT 562 FR2L11’ CTTGATGAGGAGCTTTGGGGCTTGATCTGGTTTCT 563 FR2L12’ ATAGATCAGGAGCTTAGGAACTTTCCCTGGTTTCT 564 FR2L13’ CTTGATGAGGAGCTTTGGAGACTGATCTGGTTTCT 565 FR2L14’ ATAGATCAGGCGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 566 FR2L15’ TTGAATAATGAAAATAGCAGCTTCTCCTGGTTTCT 567 FR2L16’ ATAGATCAGGGACTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 568 FR2L17’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 569 FR2L18’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 570 FR2L19’ ATAGATCAGGTGCTTAGGGACTTTCCCTGGTTTCT

571 FR2L20’ ATAGATCAGGGACTTAGGGGCTTTCTCTGGTTTCT 572 FR2L21’ ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGGCCAGGTTTCT 573 FR2L22’ ATAGATCAGGAGCTTAGGAGCTCCCTGGTTTCT 574 FR2L23’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 575 FR2L24’ ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGGCCAGGTTTCT 576 FR2L25’ ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGGCCAGGTTTCT 577 FR2L26’ ATAGAGGAAGAGCTTAGGGGATTTCCCTGGTTTCT 578 FR2L27’ ATAGATGAAGAGCTTAGGGGCTTTTGCTGGTTTTT 579 FR2L28’ ATAGATCAGGAGCTCACGGGCTTTCCCTGGTTTTT 580 FR2L29’ ATAGATCAGGAGCTTAGGAGCTTTCCCTGGTTTCT 581 FR2L30’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 582 FR2L31’ ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGGCCAGGTTTCT 583 FR2L32’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTTT 584 FR2L33’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTTT 585 FR2L34’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 586 FR2L35’ ATAGATCAGGAGCTTAGGAACTTTCCCTGGTTTCT 587 FR2L36’ GTAGATCAGGAGCTTAGGGGCT7TCCCTGGTTTCT 588 FR2L37’ ATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 589 FR2L38’ ATAGATCAGGAGCTTAGGAACTTTCCCTGGTTTCT 590 FR2L39’ GTAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCT 591 FR2L40’ ATAGATGAGGAGCCTGGGCGCCTGGCCAGGTTTCT 592 FR2L41’ ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGCCCAGGTTTCT 593 FR2L42’ ATAGATGAGGAGCCTGGGCGCCAGGCCAGGTTTCT 594 FR2L43’ ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGGCCAGGTTTCT 595 FR2L44’ GTAAATGAGCAGCTTAGGAGGCTGTCCTGGTTTCT 596 FR2L45’ ATAGATCAGGAGCTGTGGAGACTGCCCTGGCTTCT 597 FR2L46’ ATAGATCAGGAGCTGTGGAGACTGCCCTGGCTTCT

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (46 en total): FR2L1/FR2L1’, FR2L2/FR2L2’, FR2L3/FR2L3’, FR2L4/FR2L4’, FR2L5/FR2L5’, FR2L6/FR2L6’, FR2L7/FR2L7’, FR2L8/FR2L8’, FR2L9/FR2L9’, FR2L10/FR2L10’, FR2L11/FR2L11’, FR2L12/FR2L12’, FR2L13/FR2L13”, FR2L14/FR2L14’, 5 FR2L15/FR2L15’, FR2L16/FR2L16’, FR2L17/FR2L17’, FR2L18/FR2L18’, FR2L 19/FR2L 19’, FR2L20/FR2L20’, FR2L21/FR2L21’, FR2L22/FR2L22’, FR2L23/FR2L23’, FR2L24/FR2L24’, FR2L25/FR2L25’, FR2L26/FR2L26’, FR2L27/FR2L27’, FR2L28/FR2L28’, FR2L29/FR2L29’, FR2L30/FR2L30’, FR2L31/FR2L31’, FR2L32/FR2L32’, FR2L33/FR2L33’, FR2L34/FR2L34’, FR2L35/FR2L35’, FR2L36/FR2L36’, FR2L37/FR2L37’, FR2L38/FR2L38’, FR2L39/FR2L39’, FR2L40/FR2L40’, FR2L41/FR2L41’, FR2L42/FR2L42’, FR2L43/FR2L43’, FR2L44/FR2L44’,

10 FR2L45/FR2L45’ y FR2L46/FR2L46’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 2.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR3 de cadena ligera se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 16 y la tabla 17 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

15 Tabla 16. Cebadores directos de FR3 de cadena ligera (para el sub-banco 3)

FR3L1

GGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L2

GGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L3

GGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L4

GGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAG FR3L5

GGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L6

GGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGGCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L7

GGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAG FR3L8

GGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L9

GGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGGCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L10

GGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAA FR3L11

GGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCTTTACCATCAG FR3L12

GGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L13

GGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAA FR3L14

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAG FR3L15

GGAATCCCACCTCGATTCAGTGGCAGCGGGTATGGAACAGATTTTACCCTCACAATTAA FR3L16

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L17

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L18

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAG FR3L19

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACACTCACAATCAG FR3L20

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L21

GGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAG FR3L22

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L23

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAG FR3L24

GGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAG FR3L25

GGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGCCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG FR3L26

GGGGTCTCATCGAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACGGATTTCACTCTCACCATCAT FR3L27

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGGATTACACTCTCACCATCAG FR3L28

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L29

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L30

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L31

GGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG FR3L32

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAG FR3L33

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L34

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L35

GGAGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAG FR3L36

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAG FR3L37

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L38

GGAGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAG FR3L39

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAG FR3L40

AGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG FR3L41

GGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG FR3L42

GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG FR3L43

GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG FR3L44

GGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG FR3L45

GGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAG FR3L46

GGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAG

Tabla 17. Cebadores inversos de FR3 de cadena ligera (para el sub-banco 3)

644 FR3L1’ GCAGTAATAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACCCTGCTGATTTTCAGTGTGAAA 645 FR3L2’ GCAGTAATAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACCCTGCTGATTTTCAGTGTGAAA 646 FR3L3 TCAGTAATAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACCCGGCTGATTTTCAGTGTGAAA 647 FR3L4’ GCAGTAATAAACCCCAACATCGTCAGCCTCCACTCTGCTGATTTTCAGTGTAAAA 648 FR3L5’ GCAGTAATAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACCCGGCTGATTTTCAGTGTGAAA 649 FR3L6’ GCAGTAATAAACCCCGACATCCTCAGCTTCCACCCTGCTGATTTTCAGTGTGAAA 650 FR3L7’ GCAGTAATAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACTCTGCTGATTTTCAGTGTAAAA 651 FR3L8’ GCAGTAATAAACTCCAAAATCCTCAGCCTCCACCCGGCTGATTTTCAGTGTGAAA 652 FR3L9’ GCAGTAATAAACCCCGACATCCTCAGCTTCCACCCTGCTGATTTTCAGTGTGAAA 653 FR3L10’ ACAGTAATACGTTGCAGCATCTTCAGCTTCCAGGCTATTGATGGTGAGGGTGAAA 654 FR3L11’ ACAGTAATATGTTGCAGCATCTTCAGCTTCCAGGCTACTGATGGTAAAGGTGAAA 655 FR3L12’ ACAGTAATAAGTTGCAACATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 656 FR3L13’ ACAGTAATACGTTGCAGCATCTTCAGCTTCCAGGGTATTGATGGTGAGGGTGAAA 657 FR3L14’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATTGTGAGAGTGAAT 658 FR3L15’ ACAGAAGTAATATGCAGCATCCTCAGATTCTATGTTATTAATTGTGAGGGTAAAA 659 FR3L16’ GCAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 660 FR3L17’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 661 FR3L18’ GCAGTAATAAGTTGCAAAATCATCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAT 662 FR3L19’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATTGTGAGAGTGAAT 663 FR3L20’ GCAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 664 FR3L21’ ACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGACTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAC 665 FR3L22’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 666 FR3L23’ ACAATAGTAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATAGTGAGAGTGAAA

667 FR3L24’ ACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGACTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAC 668 FR3L25’ ACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGGCTCTAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAG 669 FR3L26’ ACAGTAATAAGCTGCAAAATCTTCAGGCTTCAGGCTGATGATGGTGAGAGTGAAA 670 FR3L27’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGTAA 671 FR3L28’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGACTGCAGGCAACTGATGGTGAGAGTGAAA 672 FR3L29’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 673 FR3L30’ ACAATAGTAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 674 FR3L31’ ACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGGCTCTAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAG 675 FR3L32’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATTGTGAGAGTGAAT 676 FR3L33’ ACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGACTGCAGGCAGCTGATGGTGAGAGTGAAA 677 FR3L34’ ACAGTAGTAAGTTGCAAAATCTTCAGGTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 678 FR3L35’ ACCGTAATAAGTTGCAACATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATAGTGAGAGTGAAA 679 FR3L36’ ACAGTAATATGTTGCAATATCITCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAAAGTAAAA 680 FR3L37’ ACAGTAGTAAGTTGCAAAATCTTCAGGTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 681 FR3L38’ ACCGTAATAAGTTGCAACATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATAGTGAGAGTGAAA 682 FR3L39’ ACAGTAATATGTTGCAATATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAAAGTAAAA 683 FR3L40’ ACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAG 684 FR3L41’ ACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAG 685 FR3L42’ ACAGTAATACACTGCAAAATCTTCAGGCTCCAGTCTGCTGATGGTGAGAGTGAAG 686 FR3L43’ ACAGTAATACACTGCAAAATCTTCAGGCTCCAGTCTGCTGATGGTGAGAGTGAAG 687 FR3L44’ ACAGTAATAAACTGCCACATCTTCAGCCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAA 688 FR3L45’ GCAGTAATAAACTCCAACATCCTCAGCCTCCACCCTGCTGATTTTCAGTGTGAAA 689 FR3L46’ GCAGTAATAAACTCCAACATCCTCAGCCTCCACCCTGCTGATTTTCAGTGTGAAA

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (46 en total): FR3L1/FR3L1’, FR3L2/FR3L2’, FR3L3/FR3L3’, FR3L4/F’R3L4’, FR3L5/FR3L5’, FR3L6/FR3L6’, FR3L7/FR3L7’, FR3L8/FR3L8’, FR3L9/FR3L9’, FR3L10/FR3L10’, FR3L11/FR3L11’, FR3L12/FR3L12’, FR3L13/FR3L13’, FR3L14/FR3L14’, 5 FR3L15/FR3L15’, FR3L16/FR3L16’, FR3L17/FR3L17’, FR3L18/FR3L18’, FR3L19/FR3L19’, FR3L20/FR3L20’, FR3L21/FR3L21’, FR3L22/FR3L22’, FR3L23/FR3L23’, FR3L24/FR3L24’, FR3L25/FR3L25’, FR3L26/FR3L26’, FR3L27/FR3L27’, FR3L28/FR3L28’, FR3L29/FR3L29’, FR3L30/FR3L30’, FR3L31/FR3L31’, FR3L32/FR3L32’, FR3L33/FR3L33’, FR3L34/FR3L34’, FR3L35/FR3L35’, FR3L36/FR3L36’, FR3L37/FR3L37’, FR3L38/FR3L38’, FR3L39/FR3L39’, FR3L40/FR3L40’, FR3L41/FR3L41’, FR3L42/FR3L42’, FR3L43/FR3L43’, FR3L44/FR3L44’,

10 FR3L45/FR3L45’ y FR3L46/FR3L46’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 3.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR4 de cadena ligera se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 18 y la tabla 19 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

15 Tabla 18. Cebadores directos de FR4 de cadena ligera (para el sub-banco 4)

690 FR4L1 TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA 691 FR4L2 TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 692 FR4L3 TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA 693 FR4L4 TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA 694 FR4L5 TTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

Tabla 19. Cebadores inversos de FR4 de cadena ligera (para el sub-banco 4) 695 FR4L1’ TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAA 696 FR4L2’ TTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGGCCAAA

697 FR4L3’ TTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGCCGAA 698 FR4L4’ TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGCCGAA 699 FR4L5’ TTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGCCGAA

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (5 en total): FR4L1/FR4L1’, FR4L2/FR4L2’, FR4L3/FR4L3’, FR4L4/FR4L4’ o FR4L5/FR4L5’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 4.

2.2.2 Generación de sub-bancos para las regiones de entramado de cadena pesada

En algunas realizaciones, se construyen sub-bancos de FR de cadena pesada 5, 6, 7 y 11 en los que el sub-banco 5 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando 10 cada secuencia de nucleótidos para una FR1 de cadena pesada; el sub-banco 6 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR2 de cadena pesada; el sub-banco 7 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR3 de cadena pesada; y el sub-banco 11 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden

15 secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una FR4 de cadena pesada, respectivamente; en los que las FR1, FR2 y FR3 de cadena pesada se definen según la definición de Kabat para CDR H1 y H2. En algunas realizaciones, las secuencias de FR se derivan de secuencias de anticuerpos humanos funcionales. En otras realizaciones, las secuencias de FR se derivan de secuencias de cadena pesada de línea germinal humana.

20 A modo de ejemplo pero no de limitación, lo siguiente describe un método de generación de 4 sub-bancos de FR de cadena pesada usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en el que se usan secuencias de cadena pesada de línea germinal humana como moldes. Los sub-bancos de FR de cadena pesada 5, 6 y 7 (que codifican para FR1, 2, 3 respectivamente) abarcan 44 secuencias de cadena pesada de línea germinal humana (VH1-18,

25 VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH315, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH364, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 y VH7-81). Véase Matsuda et al., 1998, J. Exp. Med., 188:1973-1975. Las secuencias se resumen en el sitio web del NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chain

30 Type=VH&seqType=nucleotide. El sub-banco de FR de cadena pesada 11 (que codifica para FR4) abarca 6 secuencias de cadena pesada de línea germinal humana (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 y JH6). Véase Ravetch et al., 1981, Cell 27 (3 Pt 2): 583-591. Las secuencias se resumen en el sitio web del NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chain-Type=JH&seqType=nucleotide.

35 A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR1 de cadena pesada (según la definición de Kabat) se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 20 y la tabla 21 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

40 Tabla 20. Cebadores directos de FR1 de cadena pesada (definición de Kabat) (para el sub-banco 5):

FR1HK1

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT FR1HK2

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT FR1HK3

CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT FR1HK4

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT FR1HK5

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGACTGGGTCCTCAGTGAAGGT FR1HK6

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT FR1HK7

CAAATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTCAGTGAAGGT FR1HK8

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGT FR1HK9

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT FR1HK10

CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCT FR1HK11

CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCT FR1HK12

CAGGTCACCTTGAGGGAGTCTGGTCCTGCGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACACT FR1KK13

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACT FR1HK14

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK15

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGAGT FR1HK16

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK17

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK18

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK19

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK20

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT FR1HK21

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT FR1HK22

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGATCCCTGAGACT FR1HK23

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTAGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK24

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGTCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK25

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK26

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACT FR1HK27

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK28

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK29

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK30

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK31

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACT FR1HK32

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAAACT FR1HK33

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGCGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT FR1HK34

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACT FR1HK35

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCT FR1HK36

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCT FR1HK37

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT FR1HK38

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT FR1HK39

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT FR1HK40

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT FR1HK41

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCT FR1HK42

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGAT FR1HK43

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACT FR1HK44

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCCATGAGGTGAAGCAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT

Tabla 21. Cebadores inversos de FR1 de cadena pesada (definición de Kabat) (para el sub-banco 5):

744 FR1HK1’ GGTAAAGGTGTAACCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGC 745 FR1HK2’ GGTGAAGGTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGC 746 FR1HK3’ AGTGAGGGTGTATCCGGAAACCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGC 747 FR1HK4’ AGTGAAGGTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGAAACCTTCACTGAGGCCCCAGGC 748 FR1HK5’ GGTGAAGGTGTATCCGGAAGCCTTGCAGGAAACCTTCACTGAGGACCCAGTC 749 FR1HK6’ GGTGAAGGTGTATCCAGATGCCTTGCAGGAAACCTTCACTGAGGCCCCAGGC 750 FR1HK7’ AGTAAAGGTGAATCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGTCCCAGGC 751 FR1HK8’ GCTGAAGGTGCCTCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACCGAGGACCCAGGC 752 FR1HK9’ GGTGAAGGTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGC 753 FR1HK10’ GCTGAGTGAGAACCCAGAGACGGTGCAGGTCAGCGTGAGGGTCTCTGTGGGT 754 FR1HK11’ GCTGAGTGAGAACCCAGAGAAGGTGCAGGTCAGCGTGAGGGTCTGTGTGGGT 755 FR1HK12’ GCTGAGTGAGAACCCAGAGAAGGTGCAGGTCAGTGTGAGGGTCTGTGTGGGT 756 FR1HK13’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGGC 757 FR1HK14’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 758 FR1HK15’ ACTGAAAGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTAAGGGACCCCCCAGGC 759 FR1HK16’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 760 FR1HK17’ ATCAAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 761 FR1HK18’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 762 FR1HK19’ GCTAAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 763 FR1HK20’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCTCCCAGGC 764 FR1HK21’ ACTGAAGGTGAATCCAGACGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCTCCCAGGC 765 FR1HK22’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGATCCCCCAGGC 766 FR1HK23’ ACTGACGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCTAGGC 767 FR1HK24’ ATCAAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 768 FR1HK25’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 769 FR1HK26’ ACCAAAGGTGAATCCAGAAGCTGTACAGGAGAGTCTCAGGGACCGCCCTGGC 770 FR1HK27’ ACTGACGGTGAACCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 771 FR1HK28’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 772 FR1HK29’ ACTGACGGTGAACCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 773 FR1HK30’ ACTAAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 774 FR1HK31’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGGC 775 FR1HK32’ ACTGAAGGTGAACCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTTTCAGGGACCCCCCAGGC 776 FR1HK33’ ACTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGC 777 FR1HK34’ ATCAAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCTGCCAGGC 778 FR1HK35’ GCTGATGGAGTAACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAGGGTGTCCGAAGGC 779 FR1HK36’ GCTGATGGAGCCACCAGAGACAGTACAGGTGAGGGACAGGGTCTGTGAAGGC 780 FR1HK37’ ACTGAAGGACCCACCATAGACAGCGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGC 781 FR1HK38’ GCTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGC 782 FR1HK39’ ACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGC 783 FR1HK40’ ACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGC 784 FR1HK41’ GCTGACGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGC 785 FR1HK42’ GGTAAAGCTGTATCCAGAACCCTTACAGGAGATCTTCAGAGACTCCCCGGGC 786 FR1HK43’ AGAGACACTGTCCCCGGAGATGGCACAGGTGAGTGAGAGGGTCTGCGAGGGC 787 FR1HK44’ GGTGAAACTGTAACCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGC

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (44 en total): FR1HK1/FR1HK1’, FR1HK2/FR1HK2’, FR1HK3/FR1HK3’, FR1HK4/FR1HK4’, FR1HK5/FR1HK5’, FR1HK6/FR1HK6’, FR1HK7/FR1HK7’, FR1HK8/FR1HK8’, FR1HK9/FR1HK9’, FR1HK10/FR1HK10’, FR1HK11/FR1HK11’, 5 FR1HK12/FR1HK12’, FR1HK13/FR1HK13’, FR1HK14/FR1HK14’, FR1HK15/FR1HK15’, FR1HK16/FR1HK16’, FR1HK17/FR1HK17’, FR1HK18/FR1HK18’, FR1HK19/FR1HK19’, FR1HK20/FR1HK20’, FR1HK21/FR1HK21’, FR1HK22/FR1HK22’, FR1HK23/FR1HK23’, FR1HK24/FR1HK24’, FR1HK25/FR1HK25’, FR1HK26/FR1HK26’, FR1HK27/FR1HK27’, FR1HK28/FR1HK28’, FR1HK29/FR1HK29’, FR1HK30/FR1HK31’, FR1HK32/FR1HK32’, FR1HK33/FR1HK33’, FR1HK34/FR1HK34’, FR1HK35/FR1HK35’, FR1HK36/FR1HK36’, FR1HK37/FR1HK37’,

10 FR1HK38/FR1HK38’, FR1HK39/FR1HK39’, FR1HK40/FR1HK40’, FR1HK41/FR1HK41’, FR1HK42/FR1HK42’, FR1HK43/FR1HK43’ o FR1HK44/FR1HK44’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 5.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR2 de cadena pesada (según la definición de Kabat) se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por 15 solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 22 y la tabla 23 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 22. Cebadores directos de FR2 de cadena pesada (definición de Kabat) (para el sub-banco 6):

788 FR2HK1 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG 789 FR2HK2 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG 790 FR2HK3 TGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTG 791 FR2HK4 TGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTG 792 FR2HK5 TGGGTGCGACAGGCCCCCGGACAAGCGCTTG 793 FR2HK6 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG 794 FR2HK7 TGGGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCCTTG 795 FR2HK8 TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG 796 FR2HK9 TGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTTG 797 FR2HK10 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGG 798 FR2HK11 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGG 799 FR2HK12 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGG 800 FR2HK13 TGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 801 FR2HK14 TGGGTCCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGG 802 FR2HK15 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 803 FR2HK16 TGGGCCCGCAAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGG 804 FR2HK17 TGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 805 FR2HK18 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 806 FR2HK19 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 807 FR2HK20 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGG 808 FR2HK21 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGG 809 FR2HK22 TGGGTCCATCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGG 810 FR2HK23 TGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 811 FR2HK24 TGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGG 812 FR2HK25 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 813 FR2HK26 TGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 814 FR2HK27 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 815 FR2HK28 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGG 816 FR2HK29 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 817 FR2HK30 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 818 FR2HK31 TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 819 FR2HK32 TGGGTCCGCCAGGCTTCCGGGAAAGGGCTGG 820 FR2HK33 TGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGG 821 FR2HK34 TGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGG 522 FR2HK35 TGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGG 823 FR2HK36 TGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGG 824 FR2HK37 TGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGG 825 FR2HK38 TGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGG 826 FR2HK39 TGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGG 827 FR2HK40 TGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGG 828 FR2HK41 TGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGG 829 FR2HK42 TGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGG 830 FR2HK43 TGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTG 831 FR2HK44 TGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG

Tabla 23. Cebadores inversos de FR2 de cadena pesada (definición de Kabat) (para el sub-banco 6):

832 FR2HK1’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCT 833 FR2HK2’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCT 834 FR2HK3’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTTTCCAGGAGCCT 835 FR2HK4’ TCCCATCCACTCAAGCCTTTGTCCGGGGGCCT 836 FR2HK5’ TCCCATCCACTCAAGCGCTTGTCCGGGGGCCT 837 FR2HK6’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCT 838 FR2HK7’ TCCTATCCACTCAAGGCGTTGTCCACGAGCCT 839 FR2HK8’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCT 840 FR2HK9’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGTGGCCT 841 FR2HK10’ TGCAAGCCACTCCAGGGCCTTCCCTGGGGGCT 842 FR2HK11’ TGCAAGCCACTCCAGGGCCTTTCCTGGGGGCT 843 FR2HK12’ TGCAAGCCACTCCAGGGCCTTCCCTGGGGGCT 844 FR2HK13’ TGAAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 845 FR2HK14’ TGAGACCCACTCCAGACCTTTTCCTGTAGCTT 846 FR2HK15’ GCCAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 847 FR2HK16’ CGATACCCACTCCAGCCCCTTTCCTGGAGCCT 848 FR2HK17’ AGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCTT 849 FR2HK18’ TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 850 FR2HK19’ TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 851 FR2HK20’ TGCCACCCACTCCAGCCCCTTGCCTGGAGCCT 852 FR2HK21’ TGCCACCCACTCCAGCCCCTTGCCTGGAGCCT 853 FR2HK22’ CGATACCCACTCCAGCCCCTTTCCTGGAGCCT 854 FR2HK23’ TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 855 FR2HK24’ AGAGACCCACTCCAGACCCTTCCCCGGAGCTT 856 FR2HK25’ TGAAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 857 FR2HK26’ ACCTACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 858 FR2HK27’ TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 859 FR2HK28’ TGAAACATATTCCAGTCCCTTCCCTGGAGCCT 860 FR2HK29’ TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 861 FR2HK30 GGCCACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 862 FR2HK31’ GCCAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCT 863 FR2HK32’ GCCAACCCACTCCAGCCCTTTCCCGGAAGCCT 864 FR2HK33’ TGAGACCCACACCAGCCCCTTCCCTGGAGCTT 865 FR2HK34’ TGAGACCCACTCCAGGCCCTTCCCTGGAGCTT 866 FR2HK35’ CCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCTGGGGGCT 867 FR2HK36’ CCCAATCCACTCCAGGCCCTTCCCTGGGTGCT 868 FR2HK37’ CCCAATCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGGGGCT 869 FR2HK38’ CCCAATCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGGGGCT 870 FR2HK39’ CCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCGGCGGGCT 871 FR2HK40’ CCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCTGGGGGCT 872 FR2HK41’ CCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCTGGGGGCT 873 FR2HK42’ CCCCATCCACTCCAGGCCTTTCCCGGGCATCT 874 FR2HK43’ TCCCAGCCACTCAAGGCCTCTCGATGGGGACT 875 FR2HK44’ TCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCT

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (44 en total): FR2HK1/FR2HK1’, FR2HK2/FR2HK2’, FR2HK3/FR2HK3’, FR2HK4/FR2HK4’, FR2HK5/FR2HK5’, FR2HK6/FR2HK6’, FR2HK7/FR2HK7’, FR2HK8/FR2HK8’, FR2HK9/FR2HK9’, FR2HK10/FR2HK10’, FR2HK11/FR2HK11’, 5 FR2HK12/FR2HK12’, FR2HK13/FR2HK13’, FR2HK14/FR2HK14’, FR2HK15/FR2HK15’, FR2HK16/FR2HK16’, FR2HK17/FR2HK17’, FR2HK18/FR2HK18’, FR2HK19/FR2HK19’, FR2HK20/FR2HK20’, FR2HK21/FR2HK21’, FR2HK22/FR2HK22’, FR2HK23/FR2HK23’, FR2HK24/FR2HK24’, FR2HK25/FR2HK25’, FR2HK26/FR2HK26’, FR2HK27/FR2HK27’, FR2HK28/FR2HK28’, FR2HK29/FR2HK29’, FR2HK30/FR2HK31’, FR2HK32/FR2HK32’, FR2HK33/FR2HK33’, FR2HK34/FR2HK34’, FR2HK35/FR2HK35’, FR2HK36/FR2HK36’, FR2HK37/FR2HK37’,

10 FR2HK38/FR2HK38’, FR2HK39/FR2HK39’, FR2HK40/FR2HK40’, FR2HK41/FR2HK41’, FR2HK42/FR2HK42’, FR2HK43/FR2HK43’ o FR2HK44/FR2HK44’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 6.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR3 de cadena pesada (según la definición de Kabat) se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por 15 solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 24 y la tabla 25 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia)

Tabla 24. Cebadores directos de FR3 de cadena pesada (definición de Kabat) (para el sub-banco 7):

876 FR3HK1 AGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTG 877 FR3HK2 AGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTG 878 FR3HK3 AGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG 879 FR3HK4 AGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG 880 FR3HK5 AGAGTCACCATTACCAGGGACAGGTCTATGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG 881 FR3HK6 AGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG 882 FR3HK7 AGAGTCACCATTACCAGGGACATGTCCACAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCG 883 FR3HK8 AGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG 884 FR3HK9 AGAGTCACCATGACCAGGAACACCTCCATAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG 885 FR3HK10 AGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTG 886 FR3HK11 AGGCTCACCATCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTACAATGACCAACATGGACCCTG 887 FR3HK12 AGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTG 888 FR3HK13 CGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 889 FR3HK14 CGATTCACCATCTCCAGAGAAAATGCCAAGAACTCCTTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 890 FR3HK15 AGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCG 891 FR3HK16 CGATTCATCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACTCCCTGTATCTGCAAAAGAACAGACGGAGAGCCG 892 FR3HK17 CGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCG 893 FR3HK18 CGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 894 FR3HK19 CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 895 FR3HK20 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG 396 FR3HK21 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 897 FR3HK22 CGATTCATCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACACCCTGTATCTGCAAACGAATAGCCTGAGGGCCG 898 FR3HK23 AGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAACCTGAGAGCTG 899 FR3HK24 CGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAACTG 900 FR3HK25 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAGAGACG 901 FR3HK26 AGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGCATCGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCG 902 FR3HK27 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 903 FR3HK28 AGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGGGCAGCCTGAGAGCTG 904 FR3HK29 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG 905 FR3HK30 CGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG 906 FR3HK31 AGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCG 907 FR3HK32 AGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCAAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCG 908 FR3HK33 CGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCG 909 FR3HK34 CGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTG 910 FR3HK35 CGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCG 911 FR3HK36 CGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCG 912 FR3HK37 CGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCG 913 FR3HK38 CGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCG 914 FR3HK39 CGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCG 915 FR3HK40 CGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTG 916 FR3HK41 CGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTG 917 FR3HK42 CAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCT 918 FR3HK43 CGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCG 919 FR3HK44 CGGTTTGTCTTCTCCATGGACACCTCTGCCAGCACAGCATACCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTG

Tabla 25. Cebadores inversos de FR3 de cadena pesada (definición de Kabat) (para el sub-banco 7):

920 FR3HK1’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCGTCAGATCTCAGGCTCCTCAGCT 921 FR3HK2’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCGTCAGATCTCAGCCTGCTCAGCT 922 FR3HK3’ TGTTGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCT 923 FR3HK4’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCATGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCT 924 FR3HK5’ TCTTGCACAGTAATACATGGCTGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCT 925 FR3HK6’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCT 926 FR3HK7’ TGCCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGATCTCAGGCTGCTCAGCT 927 FR3HK8’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCT 928 FR3HK9’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCT 929 FR3HK10’ CCGTGCACAGTAATATGTGGCTGTGTCCACAGGGTCCATGTTGGTCATGG 930 FR3HK11’ GTGTGCACAGTAATATGTGGCTGTGTCCACAGGGTCCATGTTGGTCATTG 931 FR3HK12’ CCGTGCACAATAATACGTGGCTGTGTCCACAGGGTCCATGTTGGTCATTG 932 FR3HK13’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTT 933 FR3HK14’ TCTTGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCCCGGCTCTCAGGCTGTTCATTT 934 FR3HK15’ TGTGGTACAGTAATACACGGCTGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTT 935 FR3HK16’ TCTCACACAGTAATACACAGCCATGTCCTCGGCTCTCCGTCTGTTCTTTT 936 FR3HK17’ TCTCGCACAGTGATACAAGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGACTGTTCATTT 937 FR3HK18’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTT 938 FR3HK19’ TTTCGCACAGTAATATACGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTT 939 FR3HK20’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCAGCTCTCAGGCTGTTCATTT 940 FR3HK21’ CTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTT 941 FR3HK22’ TCTCACACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCCCTCAGGCTATTCGTTT 942 FR3HK23’ TCTGGCACAGTAATACACGGCCGTGCCCTCAGCTCTCAGGTTGTTCATTT 943 FR3HK24’ TTTTGCACAGTAATACAAGGCGGTGTCCTCAGTTCTCAGACTGTTCATTT 944 FR3HK25’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGTCTCTCAGGCTGTTCATTT 945 FR3HK26’ TCTAGTACAGTAATACACGGCTGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTT 946 FR3HK27’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGCTGTCAGGCTGTTCATTT 947 FR3HK28’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCATGTCCTCAGCTCTCAGGCTGCCCATTT 948 FR3HK29’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCAGCTCTCAGGCTGTTCATTT 949 FR3HK30’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCGTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTT 950 FR3HK31’ TCTAGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTT 951 FR3HK32’ TCTAGTACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTT 952 FR3HK33’ TCTTGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGACTGTTCATTT 953 FR3HK34’ TTTTGCACAGTAATACAAGGCCGTGTCCTCAGCTCTCAGACTGTTCATTT 954 FR3HK35’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCACGGCGGTCACAGAGCTCAGCT 955 FR3HK36’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCGGCAGTCACAGAGCTCAGCT 956 FR3HK37’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCGCGGCGGTCACAGAGCTCAGGT 957 FR3HK38’ TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCTGCGGCGGTCACAGAGCTCAGCT 958 FR3HK39’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCGGCGGTCACAGAGCTCAGCT 959 FR3HK40’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCAGCGGTCACAGAGCTCAGCT 960 FR3HK41’ TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCAGCGGTCACAGAGCTCAGCT 961 FR3HK42’ TCTCGCACAGTAATACATGGCGGTGTCCGAGGCCTTCAGGCTGCTCCACT 962 FR3HK43’ TCTTGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGGAGTCACAGAGTTCAGCT 963 FR3HK44’ TCTCGCACAGTAATACATGGCCATGTCCTCAGCCTTTAGGCTGCTGATCT

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (44 en total): FR3HK1/FR3HK1’, FR3HK2/FR3HK2’, FR3HK3/FR3HK3’, FR3HK4/FR3HK4’, FR3HK5/FR3HK5’, FR3HK6/FR3HK6’, FR3HK7/FR3HK7’, FR3HK8/FR3HK8’, FR3HK9/FR3HK9’, FR3HK10/FR3HK10’, FR3HK11/FR3HK11’, FR3HK12/FR3HK12’, FR3HK13/FR3HK13’, FR3HK14/FR3HK14’, FR3HK15/FR3HK15’, FR3HK16/FR3HK16’, FR3HK17/FR3HK17’, FR3HK18/FR3HK18’, FR3HK19/FR3HK19’, FR3HK20/FR3HK20’, FR3HK21/FR3HK21’, FR3HK22/FR3HK22’, FR3HK23/FR3HK23’, FR3HK24/FR3HK24’, FR3HK25/FR3HK25’, FR3HK26/FR3HK26’, FR3HK27/FR3HK27’, FR3HK28/FR3HK28’, FR3HK29/FR3HK29’, FR3HK30/FR3HK31’, FR3HK32/FR3HK32’,

5 FR3HK33/FR3HK33’, FR3HK34/FR3HK34’, FR3HK35/FR3HK35’, FR3HK36/FR3HK36’, FR3HK37/FR3HK37’, FR3HK38/FR3HK38’, FR3HK39/FR3HK39’, FR3HK40/FR3HK40’, FR3HK41/FR3HK41’, FR3HK42/FR3HK42’, FR3HK43/FR3HK43’ o FR3HK44/FR3HK44’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 7.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR4 de cadena pesada se lleva a cabo

10 usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 26 y la tabla 27 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 26. Cebadores directos de FR4 de cadena pesada (para el sub-banco 11):

964 FR4H1 TGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 965 FR4H2 TGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA 966 FR4H3 TGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA 967 FR4H4 TGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 968 FR4H5 TGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 969 FR4H6 TGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

Tabla 27. Cebadores inversos de FR4 de cadena pesada (para el sub-banco 11):

970 FR4H1’ TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCA 971 FR4H2’ TGAGGAGACAGTGACCAGGGTGCCACGGCCCCA 972 FR4H3’ TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCA 973 FR4H4’ TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGGCCCCA 974 FR4H5’ TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGGCCCCA 975 FR4H6’ TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGCCCCCA

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (6 en total): FR4H1/FR4H1’, FR4H2/FR4H2’, FR4H3/FR4H3’, FR4H4/FR4H4’, FR4H5/FR4H5’ o FR4H6/FR4H6’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 11.

20 En algunas realizaciones, se construyen sub-bancos de FR de cadena pesada 8, 9, 10 y 11 en los que el sub-banco 8 comprende ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica para una FR1 de cadena pesada; el sub-banco 9 comprende ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica para una FR2 de cadena pesada; el sub-banco 10 comprende ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica para una FR3 de cadena pesada; y el sub-banco 11

25 comprende ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifica para una FR4 de cadena pesada, respectivamente, y en los que FR1, FR2 y FR3 de cadena pesada se definen según la definición de Chothia para CDR H1 y H2. En algunas realizaciones, las secuencias de FR se derivan de secuencias de anticuerpos humanos funcionales. En otras realizaciones, las secuencias de FR se derivan de secuencias de cadena pesada de línea germinal humana.

30 A modo de ejemplo pero no de limitación, lo siguiente describe un método de generación de 4 sub-bancos de FR de cadena pesada usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en el que se usan secuencias de cadena pesada de línea germinal humana como moldes. Los Sub-bancos de FR de cadena pesada 7, 8 y 9 (que codifican para FR1, 2, 3, respectivamente) abarcan 44 secuencias de cadena pesada de línea germinal humana (VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3

35 15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH364, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 y VH7-81). Véase Matsuda et al., 1998, J. Exp. Med., 188:1973-1975. Las secuencias se resumen en el sitio web del NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi?organism=human&chainType=VH&seqType=nucleotide. El sub-banco 11 (codifica para FR4) es el mismo sub-banco 11 tal como se

40 describió anteriormente.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR1 de cadena pesada (según la definición de Chothia) se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 28 y la tabla 29 (mostrados todos en la orientación

45 de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 28. Cebadores directos de FR1 de cadena pesada (definición de Chothia) (para el sub-banco 8): 976 FR1HC1 CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

977 FR1HC2 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

978 FR1HC3 CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

979 FR1HC4 CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

980 FR1HC5 CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGACTGGGTCCTCA

981 FR1HC6 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

982 FR1HC7 CAAATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTCA

983 FR1HC8 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCG

984 FR1HC9 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCA

985 FR1HC10 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACC

986 FR1HC11 CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACC

987 FR1HC12 CAGGTCACCTTGAGGGAGTCTGGTCCTGCGCTGGTGAAACCCACACAGACC

988 FR1HC13 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCC

989 FR1HC14 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCC

990 FRHC15 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCC

991 FR1HC16 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGCTCC

992 FR1HC17 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCC

993 FR1HC18 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCC

994 FR1HC19 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGiGGGGGTCC

995 FR1HC20 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCC

996 FR1HC21 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCC 997 FR1HC22 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGATCC 998 FR1HC23 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTAGGGGGTCC 999 FR1HC24 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGTCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCC 1000 FR1HC25 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCC 1001 FR1HC26 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCAGGGCGGTCC 1002 FR1HC27 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCC 1003 FR1HC28 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCC 1004 FR1HC29 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCC 1005 FR1HC30 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCC 1006 FR1HC31 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGAGGGTCC 1007 FR1HC32 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCC 1008 FR1HC33 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCC 1009 FR1HC34 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCC 1010 FR1HC35 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACC 1011 FR1HC36 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACC 1012 FR1HC37 CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACC 1013 FR1HC38 CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACC 1014 FR1HC39 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACC 1015 FR1HC40 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACC 1016 FR1HC41 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACC 1017 FR1HC42 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCT

1018 FR1HC43 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACC 1019 FR1HC44 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCCATGAGGTGAAGCAGCCTGGGGCCTCA 1059 FR1HC40’ AGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAG 1060 FR21C41’ AGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAG 1061 FR1HC42’ AGAACCCTTACAGGAGATCTTCAGAGACTCCCCGGGCTTTTTCAC 1062 FR1HC43’ GGAGATGGCACAGGTGAGTGAGAGGGTCTGCGAGGGCTTCACCAG 1063 FR1HC44’ AGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTGCTTCAC

Tabla 29. Cebadores inversos de FR1 de cadena pesada (definición de Chothia) (para el sub-banco 8):

1020: FR1HC1’ AGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTTCAC

1021: FR1HC2’ AGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTTCAC

1022: FR1HC3’ GGAAACCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTTCAC

1023: FR1HC4’ AGAAGCCTTGCAGGAAACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTTCAC

1024: FR1HC5’ GGAAGCCTTGCAGGAAACCTTCACTGAGGACCCAGTCTTCTTCAC

1025: FR1HC6’ AGATGCCTTGCAGGAAACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTTCAC

1026: FR1HC7’ AGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGTCCCAGGCTTCTTCAC

1027: FR1HC8’ AGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACCGAGGACCCAGGCTTCTTCAC

1028: FR1HC9’ AGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTTCAC

1039: FR1HC10’ AGAGACGGTGCAGGTCAGCGTGAGGGTCTCTGTGGGTTTCACCAG

1030: FR1HC11’ AGAGAAGGTGCAGGTCAGCGTGAGGGTCTGTGTGGGTTTCACCAG

1031: FR1HC12’ AGAGAAGGTGCAGGTCAGTGTGAGGGTCTGTGTGGGTTTCACCAG

1032: FR1HC13’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGGCTTGACCAA

1033: FR1HC14’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGTACCAA

1034: FR1HC15’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTAAGGGACCCCCCAGGCTTTACCAA

1035: FR1HC16’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGTACCAA

1036: FR1HC17’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCCGTACCAC

1037: FR1HC18’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTTGACCAG

1038: FR1HC19’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGTACCAA

1039: FR1HC20’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCTCCCAGGCTGGACCAC

1040: FR1HC21’ AGACGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCTCCCAGGCTGGACCAC

1041: FR1HC22’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGATCCCCCAGGCTGTACCAA

1042: FR1HC23’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCTAGGCTGTACCAA

1043: FR1HC24’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGTACCAC

1044: FR1HC25’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGTACCAA

1045: FR1HC26’ AGAAGCTGTACAGGAGAGTCTCAGGGACCGCCCTGGCTGTACCAA

1046: FR1HC27’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGGATCAA

1047: FR1HC28’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGGACCAA

1048: FR1HC29’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGGATCAA

1049: FR1HC30’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGGACCAA

1050: FR1HC31’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGGCTGGACCAA

1051: FR1HC32’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTTTCAGGGACCCCCCAGGCTGGACCAA

1052: FR1HC33’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGAACTAA

1053: FR1HC34’ AGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCTGCCAGGCTGTACCAA

1054: FR1HC35’ AGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAGGGTGTCCGAAGGCTTCACCAG

1055: FR1HC36’ AGAGACAGTACAGGTGAGGGACAGGGTCTGTGAAGGCTTCACCAG

1056: FR1HC37’ ATAGACAGCGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCAACAG

1057: FR1HC38’ AGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAG

1058: FR1HC39’ AGAGACAGTGCAGGTGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAG

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (44 en total): FR1HC1/FR1HC1’, FR1HC2/FR1HC2’, FR1HC3/FR1HC3’, FR1HC4/FR1HC4’, FR1HC5/FR1HC5’, FR1HC6/FR1HC6’, FR1HC7/FR1HC7’, FR1HC8/FR1HC8’, FR1HC9/FR1HC9’, FR1HC10/FR1HC10’, FR1HC11/FR1HC11’, 5 FR1HC12/FR1HC12’, FR1HC13/FR1HC13’, FR1HC14/FR1HC14’, FR1HC15/FR1HC15’, FR1HC16/FR1HC16’, FR1HC17/FR1HC17’, FR1HC18/FR1HC18’, FR1HC19/FR1HC19’, FR1HC20/FR1HC20’, FR1HC21/FR1HC21’, FR1HC22/FRI HC22’, FR1HC23/FR1HC23’, FR I HC24/FR I HC24’, FR1HC25/FR1HC25’, FR1HC26/FR1HC26’, FR1HC27/FR1HC27’, FR1HC28/FR1HC28’, FR1HC29/FR1HC29’, FR1HC30/FR1HC30’, FR1HC31/FR1HC31’, FR1HC32/FR1HC32’, FR1HC33/FR1HC33’, FR1HC34/FR1HC34’, FR1HC35/FR1HC35’, FR1HC36/FR1HC36’,

10 FR1HC37/FR1HC37’, FR1HC38/FR1HC38’, FR1HC39/FR1HC39’, FR1HC40/FR1HC40’, FR1HC41/FR1HC41’, FR1HC42/FR1HC42’, FR1HC43/FR1HC43’ o FR1HC44/FR1HC44’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 8.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR2 de cadena pesada (según la

15 definición de Chothia) se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 30 y la tabla 31 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 30. Cebadores directos de FR2 de cadena pesada (definición de Chothia) (para el sub-banco 9):

1064 FR2HC1 TATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTT 1065 FR2HC2 TACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTT 1066 FR3HC3 TTATCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTT 1067 FR2HC4 TATGCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTT 1068 FR2HC5 CGCTACCTGCACTGGGTGCGACAGGCCCCCGGACAAGCGCTT 1069 FR2HC6 TACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTT 1070 FR2HC7 TCTGCTATGCAGTGGGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCCTT 1071 FR2HC8 TATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTT 1072 FR2HC9 TATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTT 1073 FR2HC10 ATGGGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTG 1074 FR2HC11 GTGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTG 1075 FR2HC12 ATGTGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTG 1076 FR2HC13 TACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG 1077 FR2HC14 TACGACATGCACTGGGTCCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTG 1078 FR2HC15 GCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGGTG 1079 FR2HC16 AGTGACATGAACTGGGCCCGCAAGGCTCCAGGAAAGGGGCTG 1080 FR2HC17 TATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTG 1081 FR2HC18 TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG 1082 FR2HC19 TATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG 1083 FR2HC20 TATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG 1084 FR2HC21 TATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG 1085 FR2HC22 AGTGACATGAACTGGGTCCATCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTG 1086 FR2HC23 AATGAGATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG 1087 FR2HC24 TATACCATGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTG 1088 FR2HC25 TATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1089: FR2HC26 TATGCTATGAGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1090: FR2HC27 AACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1091: FR2HC28 TATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTG

1092: FR2HC29 AACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1093: FR2HC30 TATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1094: FR2HC31 CACTACATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1095: FR2HC32 TCTGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTTCCGGGAAAGGGCTG

1096: FR2HC33 TACTGGATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTG

1097: FR2HC34 TATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTG

1098: FR2HC35 AACTGGTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTG

1099: FR2HC36 TACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTG

1100: FR2HC37 TACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTG

1101: FR2HC38 TACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTG

1102: FR2HC39 TACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTG

1103: FR2HC40 TACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTG

1104: FR2HC41 TACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTG

1105: FR2HC42 TACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTG

1106: FR2HC43 GCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTT

1107: FR2HC44 TATGGTATGAATTGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTT

Tabla 31. Cebadores inversos de FR2 de cadena pesada (definición de Chothia) (para el sub-banco 9):

1108: FR2HC1’ GATCCATCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTG

1109: FR2HC2’ GATCCATCCCATCCAGTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTG

1110: FR2HC3’ AAAACCTCCCATCCACTCAAGCCCTTTTCCAGGAGCCTG

1111: FR2HC4’ GCTCCATCCCATCCACTCAAGCCTTTGTCCGGGGGCCTG

1112: FR2HC5’ GATCCATCCCATCCACTCAAGCGCTTGTCCGGGGGCCTG

1113: FR2HC6’ GATTATTCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTG

1114: FR2HC7’ GATCCATCCTATCCACTCAAGGCGTTGTCCACGAGCCTG

1115: FR2HC8’ GATCCCTCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTG

1116: FR2HC9’ CATCCATCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGTGGCCTG

1117: FR2HC10’ AATGTGTGCAAGCCACTCCAGGGCCTTCCCTGGGGGCTG

1118: FR3HC11’ AATGAGTGCAAGCCACTCCAGGGCCTTTCCTGGGGGCTG

1119: FR2HC12’ AATGAGTGCAAGCCACTCCAGGGCCTTCCCTGGGGGCTG

1130: FR2HC13’ AATGTATGAAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG

1121: FR2HC14’ AATAGCTGAGACCCACTCCAGACCTTTTCCTGTAGCTTG

1122: FR2HC15’ AATACGGCCAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG

1123: FR2HC16’ AACACCCGATACCCACTCCAGCCCCTTTCCTGGAGCCTT

1134: FR2HC17’ AATACCAGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCTTG

1125: FR2HC18’ AATGGATGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG

1126: FR2HC19’ AATAGCTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG

1127: FR2HC20’ TATAACTGCCACCCACTCCAGCCCCTTGCCTGGAGCCTG

1128: FR2HC21’ TATAACTGCCACCCACTCCAGCCCCTTGCCTGGAGCCTG

1129: FR2HC22’ AACACCCGATACCCACTCCAGCCCCTTTCCTGGAGCCTG

1130 FR2HC23’ AATGGATGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1131 FR2HC24’ ATAAGAGAGACCCACTCCAGACCCTTCCCCGGAGCTTG 1132 FR2HC25’ AATGTATGAAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1133 FR2HC26’ AATGAAACCTACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1134 FR2HC27’ AATAACTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1135 FR2HC28’ AATAGCTGAAACATATTCCAGTCCCTTCCCTGGAGCCTG 1136 FR2HC29’ AATAACTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1137 FR2HC30’ TATGTTGGCCACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1138 FR2HC31’ AGTACGGCCAACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTG 1139 FR2HC32’ AATACGGCCAACCCACTCCAGCCCTTTCCCGGAAGCCTG 1140 FR2HC33’ AATACGTGAGACCCACACCAGCCCCTTCCCTGGAGCTTG 1141 FR2HC34’ AATACCTGAGACCCACTCCAGGCCCTTCCCTGGAGCTTG 1142 FR2HC35’ GATGTACCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCTGGGGGCTG 1143 FR2HC36’ GATGTACCCAATCCACTCCAGGCCCTTCCCTGGGTGCTG 1144 FR2HC37’ GATTTCCCCAATCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGGGGCTG 1145 FR2HC38’ GATACTCCCAATCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGGGGCTG 1146 FR2HC39’ GATACGCCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCGGCGGGCTG 1147 FR2HC40’ GATATACCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCTGGGGGCTG 1148 FR2HC41’ GATATACCCAATCCACTCCAGTCCCTTCCCTGGGGGCTG 1149 FR2HC42’ GATGATCCCCATCCACTCCAGGCCTTTCCCGGGCATCTG 1150 FR2HC43’ TGTCCTTCCCAGCCACTCAAGGCCTCTCGATGGGGACTG 1151 FR2HC44’ GAACCATCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTG

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (44 en total): FR2HC1/FR2HC1’, FR2HC2/FR2HC2’, FR2HC3/FR2HC3’, FR2HC4/FR2HC4’, FR2HC5/FR2HC5’, FR2HC6/FR2HC6’, FR2HC7/FR2HC7’, FR2HC8/FR2HC8’, FR2HC9/FR2HC9’, FR2HC10/FR2HC10’, FR2HC11/FR2HC11’, 5 FR2HC12/FR2HC12’, FR2HC13/FR2HC13’, FR2HC14/FR2HC14’, FR2HC15/FR2HC15’, FR2HC16/FR2HC16’, FR2HC17/FR2HC17’, FR2HC18/FR2HC18’, FR2HC19/FR2HC19’, FR2HC20/FR2HC20’, FR2HC21/FR2HC21’, FR2HC22/FR2HC22’, FR2HC23/FR2HC23’, FR2HC24/FR2HC24’, FR2HC25/FR2HC25’, FR2HC26/FR2HC26’, FR2HC27/FR2HC27’, FR2HC28/FR2HC28’, FR2HC29/FR2HC29’, FR2HC30/FR2HC30’, FR2HC31/FR2HC31’, FR2HC32/FR2HC32’, FR2HC33/FR2HC33’, FR2HC34/FR2HC34’, FR2HC35/FR2HC35’, FR2HC36/FR2HC36’,

10 FR2HC37/FR2HC37’, FR2HC38/FR2HC38’, FR2HC39/FR2HC39’, FR2HC40/FR2HC40’, FR2HC41/FR2HC41’, FR2HC42/FR2HC42’, FR2HC43/FR2HC43’ o FR2HC44/FR2HC44’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 9.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la construcción del sub-banco de FR3 de cadena pesada (según la

15 definición de Chothia) se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 32 y la tabla 33 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 32. Cebadores directos de FR3 de cadena pesada (definición de Chothia) (para el sub-banco 10):

FR3HC1

ACAAACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGG FR3HC2

ACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGG FR3HC3

ACAATCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGG FR3HC4

ACAAAATATTCACAGGAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGG FR3HC5

ACCAACTACGCACAGAAATTCCAGGACAGAGTCACCATTACCAGGGACAGGTCTATGAGCACAGCCTACATGG FR3HC6

ACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGG FR3HC7

ACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGAAAGAGTCACCATTACCAGGGACATGTCCACAAGCACAGCCTACATGG FR3HC8

GCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGG FR3HC9

ACAGGCTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGAACACCTCCATAAGCACAGCCTACATGG FR3HC10

AAATCCTACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTTA FR3HC11

AAGCGCTACAGCCCATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTA FR3HC12

AAATACTACAGCACATCTCTGAAGACCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTA FR3HC13

ATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC FR3HC14

ACATACTATCCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAAAATGCCAAGAACTCCTTGTATCTTC FR3HC15

ACAGACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTATCTGC FR3HC16

ACGCACTATGTGGACTCCGTGAAGCGCCGATTCATCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACTCCCTGTATCTGC FR3HC17

ACAGGTTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGC FR3HC18

ATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCACCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC FR3HC19

ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC FR3HC20

AAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC FR3HC21

AAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC

FR3HC22

ACGCACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACACCCTGTATCTGC FR3HC23

ACATACTACGCAGACTCCAGGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTC FR3HC24

ACATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGC FR3HC25

ATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGC FR3HC26

ACAGAATACGCCGCGTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGCATCGCCTATCTGC FR3HC27

ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTC FR3HC28

ACATATTATGCAGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTC FR3HC29

ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTC FR3HC30

AAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC FR3HC31

ACAGAATACGCCGCGTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAGAACTCACTGTATCTGC FR3HC32

ACAGCATATGCTGCGTCGGTGAAAGGCAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCAAAGAACACGGCGTATCTGC FR3HC33

ACAAGCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGC FR3HC34

ATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGC FR3HC35

ACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA FR3HC36

ACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGA FR3HC37

ACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA FR3HC38

ACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA FR3HC39

ACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA

FR3HC40

ACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA FR3HC41

ACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA FR3HC42

ACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGC FR3HC43

AATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGC FR3HC44

CCAACATATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCATGGACACCTCTGCCAGCACAGCATACCTGC

Tabla 33. Cebadores inversos de FR3 de cadena pesada (definición de Chothia) (para el sub-banco 10):

FR3HC1’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCGTCAGATCTCAGGCTCCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTCGTGG FR3HC2’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCGTCAGATCTCAGCCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGATGG FR3HC3’

TGTTGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGTCTGTAG FR3HC4’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCATGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTCGCGG FR3HC5’

TCTrGCACAGTAATACATGGCTGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTCATAG FR3HC6’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTOTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCACCTCCATGTAGACfGTGCTCGTGG FR3HC7’

TGCCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGATCTCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTTGTGG FR3HC8’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTCGTGG FR3HC9’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTTATGG FR3HC10’

CCGTGCACAGTAATATGTGGCTGTGTCCACAGGGTCCATGTTGGTCATGGTAAGGACCACCTGGCTTTTGG FR3HC11’

GTGTGCACAGTAATATGTGGCTGTGTCCACAGGGTCCATGTTGGTCATTGTAAGGACCACCTGGTTTTTGG FR3HC12’

CCGTGCACAATAATACGTGGCTGTGTCCACAGGGTCCATGTTGGTCATTGTAAGGACCACCTGGTTTTTGG FR3HC13’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGTGAGTTCTTGG FR3HC14’

TCTTGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCCCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGAAGATACAAGGAGTTCTTGG FR3HC15’

TGTGGTACAGTAATACACGGCTGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGCGTGTTTTTTG FR3HC16’

TCTCACACAGTAATACACAGCCATGTCCTCGGCTCTCCGTCTGTTCTTTTGCAGATACAGGGAGTTCCTGG FR3HC17’

TCTCGCACAGTGATACAAGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGACTGTTCATTTGCAGATACAGGGAGTTCTTGG FR3HC18’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGTGAGTTCTTGG FR3HC19’

TTTCGCACAGTAATATACGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC20’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCAGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC21’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC22’

TCTCACACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCCCTCAGGCTATTCGTTTGCAGATACAGGGTGTTCCTGG FR3HC23’

TCTGGCACAGTAATACACCGCCGTGCCCTCAGCTCTCAGGTTGTTCATTTGAAGATACAGCCTGTTCTTGG FR3HC24’

TTTTGCACAGTAATACAAGGCGGTGTCCTCAGTTCTCAGACTGTTCATTTGCAGATACAGGGAGTTTTTGC FR3HC25’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGTCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGTGAGTTCTTGG FR3HC26’

TCTAGTACAGTAATACACGGCTGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTTGCAGATAGGCGATGCTTTTGG FR3HC27’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGAAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC28’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCATGTCCTCAGCTCTCAGGCTGCCCATTTGAAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC29’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCAGCTCTCAGGCTGTTCATTTGAAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC30’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGTGAGTTCTTGG FR3HC31’

TCTAGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGTGAGTTCTTTG

FR3HC32’

TCTAGTACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGTTTTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACGCCGTGTTCTTTG FR3HC33’

TCTTGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGACTGTTCATTTGCAGATACAGCGTGTTCTTGG FR3HC34’

TTTTGCACAGTAATACAAGGCCGTGTCCTCAGCTCTCAGACTGTTCATTTGCAGATACAGGGAGTTCTTGG FR3HC35’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCACGGCGGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC36’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCCCGGCAGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTAG FR3HC37’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCGCGGCGGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC38’

TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCTGCGGCGGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC39’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCGGCGGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC40’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCAGCGGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC41’

TCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCGCAGCGGTCACAGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC42’

TCTCGCACAGTAATACATGGCGGTGTCCGAGGCCTTCAGGCTGCTCCACTGCAGGTAGGCGGTGCTGATGG FR3HC43’

TCTTGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGGAGTCACAGAGTTCAGCTGCAGGGAGAACTGGTTCTTGG FR3HC44’

TCTCGCACAGTAATACATGGCCATGTCCTCAGCCTTTAGGCTGCTGATCTGCAGGTATGCTGTGCTGGCAG

La PCR se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos (44 en total): FR3HC1/FR3HC1’, FR3HC2/FR3HC2’, FR3HC3/FR3HC3’, FR3HC4/FR3HC4’, FR3HC5/FR3HC5’, FR3HC6/FR3HC6’, FR3HC7/FR3HC7’, FR3HC8/FR3HC8’, FR3HC9/FR3HC9’, FR3HC10/FR3HC10’, FR3HC11/FR3HC11’, 5 FR3HC12/FR3HC12’, FR3HC13/FR3HC13’, FR3HC14/FR3HC14’, FR3HC15/FR3HC15’, FR3HC16/FR3HC16’, FR3HC17/FR3HC17’, FR3HC18/FR3HC18’, FR3HC19/FR3HC19’, FR3HC20/FR3HC20’, FR3HC21/FR3HC21’, FR3HC22/FR3HC22’, FR3HC23/FR3HC23’, FR3HC24/FR3HC24’, FR3HC25/FR3HC25’, FR3HC26/FR3HC26’, FR3HC27/FR3HC27’, FR3HC28/FR3HC28’, FR3HC29/FR3HC29’, FR3HC30/FR3HC30’, FR3HC31/FR3HC31’, FR3HC32/FR3HC32’, FR3HC33/FR3HC33’, FR3HC34/FR3HC34’, FR3HC35/FR3HC35’, FR3HC36/FR3HC36’,

10 FR3HC37/FR3HC37’, FR3HC38/FR3HC38’, FR3HC39/FR3HC39’, FR3HC40/FR3HC40’, FR3HC41/FR3HC41’, FR3HC42/FR3HC42’, FR3HC43/FR3HC43’ o FR3HC44/FR3HC44’. El agrupamiento de los productos de PCR genera el sub-banco 10.

2.3 Selección de CDR

15 Además de la síntesis de sub-bancos de regiones de entramado, pueden generarse sub-bancos de CDR y fusionarse al azar en marco con regiones de entramado de sub-bancos de regiones de entramado para producir bibliotecas combinatorias de anticuerpos (con o sin regiones constantes) que pueden examinarse para determinar su inmunoespecificidad para un antígeno de interés, así como su inmunogenicidad en un organismo de interés. La

20 metodología de biblioteca combinatoria de la invención se muestra a modo de ejemplo en el presente documento para la producción de anticuerpos humanizados para su uso en seres humanos. Sin embargo, la metodología de biblioteca combinatoria puede aplicarse fácilmente a la producción de anticuerpos para su uso en cualquier organismo de interés.

5 La presente invención proporciona un sub-banco de CDR para cada CDR de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable. Por consiguiente, la invención proporciona un sub-banco de regiones CDR para CDR1 de cadena ligera variable, CDR2 de cadena ligera variable y CDR3 de cadena ligera variable para cada especie de interés y para cada definición de una CDR (por ejemplo, Kabat y Chothia). La invención también proporciona un sub-banco de CDR para CDR1 de cadena pesada variable, CDR2 de cadena pesada variable y CDR3 de cadena pesada variable para cada especie de interés y para cada definición de una CDR (por ejemplo, Kabat y Chothia). Los sub-bancos de CDR pueden comprender CDR que se han identificado como parte de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés. Los sub-bancos de CDR pueden usarse fácilmente para sintetizar una biblioteca combinatoria de anticuerpos que puede examinarse para determinar su inmunoespecificidad para un antígeno de interés, así como su inmunogenicidad en un organismo de interés.

15 Por ejemplo, pueden construirse sub-bancos de CDR de cadena ligera 12, 13 y 14, en los que el sub-banco de CDR 12 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR1 de cadena ligera según el sistema de Kabat; el sub-banco de CDR 13 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR2 de cadena ligera según el sistema de Kabat; y el sub-banco de CDR 14 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR3 de cadena ligera según el sistema de Kabat. Pueden construirse sub-bancos de CDR de cadena ligera 15, 16 y 17, en los que el sub-banco de CDR 15 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia

25 de nucleótidos para CDR1 de cadena ligera según el sistema de Chothia; el sub-banco de CDR 16 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR2 de cadena ligera según el sistema de Chothia; y el sub-banco de CDR 17 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR3 de cadena ligera según el sistema de Chothia.

Pueden construirse sub-bancos de CDR de cadena pesada 18, 19 y 20, en los que el sub-banco de CDR 18 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR1 de cadena pesada según el sistema de Kabat; el sub-banco de CDR 19 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando

35 cada secuencia de nucleótidos para CDR2 de cadena pesada según el sistema de Kabat; y el sub-banco de CDR 20 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR3 de cadena pesada según el sistema de Kabat. Pueden construirse subbancos de CDR de cadena pesada 21, 22 y 23, en los que el sub-banco de CDR 21 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR1 de cadena pesada según el sistema de Chothia; el sub-banco de CDR 22 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR2 de cadena pesada según el sistema de Chothia; y el sub-banco de CDR 23 comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para CDR3 de cadena pesada según el sistema de Chothia.

45 En algunas realizaciones, las secuencias de CDR se derivan de secuencias de anticuerpos funcionales. En algunas realizaciones, las secuencias de CDR son secuencias al azar, que comprenden al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 secuencias de nucleótidos contiguas, sintetizadas mediante cualquier método conocido en la técnica. Los sub-bancos de CDR pueden usarse para la construcción de sub-bibliotecas combinatorias. Alternativamente, puede seleccionarse una CDR de interés particular y después usarse para la construcción de sub-bibliotecas combinatorias (véase la sección 5.3).

2.4 Construcción de sub-bibliotecas combinatorias

55 Se construyen sub-bibliotecas combinatorias fusionando en marco CDR no humanas con regiones de entramado humanas correspondientes de los sub-bancos de FR. Por ejemplo, la sub-biblioteca combinatoria 1 se construye fusionando en marco CDR no humanas con regiones de entramado humanas de cadena ligera kappa correspondientes usando los sub-bancos 1; la sub-biblioteca combinatoria 2 se construye fusionando en marco CDR no humanas con regiones de entramado humanas de cadena ligera kappa correspondientes usando los sub-bancos 2; la sub-biblioteca combinatoria 3 se construye fusionando en marco CDR no humanas con regiones de entramado humanas de cadena ligera kappa correspondientes usando los sub-bancos 3; la sub-biblioteca combinatoria 4 se construye fusionando en marco CDR no humanas con regiones de entramado humanas de cadena ligera kappa correspondientes usando los sub-bancos 4; las sub-bibliotecas combinatorias 5, 6, y 7 se construyen fusionando en marco CDR no humanas (definición de Kabat para CDR H1 y H2) con las regiones de entramado humanas de

65 cadena pesada correspondientes usando los sub-bancos 5, 6 y 7, respectivamente; las sub-bibliotecas combinatorias 8, 9 y 10 se construyen fusionando en marco CDR no humanas (definición de Chothia para CDR H1 y H2) con las regiones de entramado humanas de cadena pesada correspondientes usando los sub-bancos 8, 9 y 10, respectivamente; las sub-biblioteca combinatoria 11 se construye fusionando en marco CDR H3 no humana (definición de Kabat y de Chothia) con las regiones de entramado de cadena pesada humanas correspondientes usando el sub-banco 11. En algunas realizaciones, las CDR no humanas también pueden seleccionarse de una

5 biblioteca de CDR.

La construcción de sub-bibliotecas combinatorias puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica. A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 1 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 34 y 10 la tabla 35 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A

o C, R= A o G, S= C o G,W=A o T e Y= C o T.

Tabla 34. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR1 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 1)

1240 AL1 GATGTTGTGATGACWCAGTCT 1241 AL2 GACATCCAGATGAYCCAGTCT 1242 AL3 GCCATCCAGWTGACCCAGTCT 1243 AL4 GAAATAGTGATGAYGCAGTCT 1244 AL5 GAAATTGTGTTGACRCAGTCT 1245 AL6 GAKATTGTGATGACCCAGACT 1246 AL7 GAAATTGTRMTGACWCAGTCT 1247 AL8 GAYATYGTGATGACYCAGTCT 1248 AL9 GAAACGACACTCACGCAGTCT 1249 AL10 GACATCCAGTTGACCCAGTCT 1250 AL11 AACATCCAGATGACCCAGTCT 1251 AL12 GCCATCCGGATGACCCAGTCT 1252 AL13 GTCATCTGGATGACCCAGTCT

Tabla 35. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR1 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 1)

1253 AL1’ [70% inicial de CDR L1]-GCAGGAGATGGAGGCCGGCTS 1254 AL2’ [70% inicial de CDR L1]-GCAGGAGAGGGTGRCTCTTTC 1255 AL3’ [70% inicial de CDR L1]-ACAASTGATGGTGACTCTGTC 1356 AL4’ [70% inicial de CDR L1]-GAAGGAGATGGAGGCCGGCTG 1357 AL5’ [70% inicial de CDR L1]-GCAGGAGATGGAGGCCTGCTC 1258 AL6’ [70% inicial de CDR L1]-GCAGGAGATGTTGACTTTGTC 1259 AL7’ [70% inicial de CDR L1]-GCAGGTGATGGTGACTTTCTC 1360 AL8’ [70% inicial de CDR L1]-GCAGTTGATGGTGGCCCTCTC 1261 AL9’ [70% inicial de CDR L1]-GCAAGTGATGGTGACTCTGTC 1262 AL10’ [70% inicial de CDR L1]-GCAAATGATACTGACTCTGTC

La PCR se lleva a cabo con de AL1 a AL13 en combinación con de AL1’ a AL10’ usando el sub-banco 1 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 1 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 1.

20 A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 2 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 36 y la tabla 37 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

25 Tabla 36. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR2 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 2):

1263 BL1 [70% final de CDR L1]-TGGYTTCAGCAGAGGCCAGGC 1264 BL2 [70% final de CDR L1]-TGGTACCTGCAGAAGCCAGGS 1273 BL1’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATCAGGAGCTGTGGAGR 1274 BL2’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATCAGGAGCTTAGGRGC 1275 BL3’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATGAGGAGCCTGGGMGC 1276 BL4’ [70% inicial de CDR L2]-RTAGATCAGGMGCTTAGGGGC 1277 BL5’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATCAGGWGCTTAGGRAC 1278 BL6’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATGAAGAGCTTAGGGGC 1279 BL7’ [70% inicial de CDR L2]-ATAAATTAGGAGTCTTGGAGG 1280 BL8’ [70% inicial de CDR L2]-GTAAATGAGCAGCTTAGGAGG 1281 BL9’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATCAGGAGTGTGGAGAC 1281 BL10’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATCAGGAGCTCAGGGGC 1283 BL11’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGATCAGGGACTTAGGGGC 1284 BL12’ [70% inicial de CDR L2]-ATAGAGGAAGAGCTTAGGGGA 1285 BL13’ [70% inicial de CDR L2]-CTTGATGAGGAGCTTTGGAGA 1286 BL14’ [70% inicial de CDR L2]-ATAAATTAGGCGCCTTGGAGA 1287 BL15’ [70% inicial de CDR L2]-CTTGATGAGGAGCTTTGGGGC 1288 BL16’ [70% inicial de CDR L2]-TTGAATAATGAAAATAGCAGC

1265: BL3 [70% final de CDR L1]-TGGTATCRGCAGAAACCAGGG

1266: BL4 [70% final de CDR L1]-TGGTACCARCAGAAACCAGGA

1267: BL5 [70% final de CDR L1]-TGGTACCARCAGAAACCTGGC

1268: BL6 [70% final de CDR L1]-TGGTAYCWGCAGAAACCWGGG

1269: BL7 [70% final de CDR L1]-TGGTATCAGCARAAACCWGGS

1270: BL8 [70% final de CDR L1]-TGGTAYCAGCARAAACCAG

1271: BL9 [70% final de CDR L1]-TGGTTTCTGCAGAAAGCCAGG

1272: BL10 [70% final de CDR L1]-TGGTTTCAGCAGAAACCAGGG

Tabla 37. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR2 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 2)

La PCR se lleva a cabo con de BL1 a BL10 en combinación con de BL1’ a BL16’ usando el sub-banco 2 como 5 molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 2 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 2.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 3 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 38 y la 10 tabla 39 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 38. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR3 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 3):

1289 CL1 [70% final de CDR L2]-GGGGTCCCAGACAGATTCAGY 1290 CL2 [70% final de CDR L2]-GGGGTCCCATCAAGGTTCAGY 1291 CL3 [70% final de CDR L2]-GGYATCCCAGCCAGGTTCAGT 1292 CL4 [70% final de CDR L2]-GGRGTCCCWGACAGGTTCAGT 1293 CL5 [70% final de CDR L2]-AGCATCCCAGCCAGGTTCAGT 1294 CL6 [70% final de CDR L2]-GGGGTCCCCTCGAGGTTCAGT 1295 CL7 [70% final de CDR L2]-GGAATCCCACCTCGATTCAGT 1296 CL8 [70% final de CDR L2]-GGGGTCCCTGACCGATTCAGT 1297 CL9 [70% final de CDR L2]-GGCATCCCAGACAGGTTCAGT 1298 CL10 [70% final de CDR L2]-GGGGTCTCATCGAGGTTCAGT 1299 CL11 [70% final de CDR L2]-GGAGTCCCAGATAGGTTCAGT

Tabla 39. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR3 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 3)

1300 CL1’ [70% inicial de CDR L3]-KCAGTAATAAACCCCAACATC 1301 CL2’ [70% inicial de CDR L3]-ACAGTAATAYGTTGCAGCATC 1302 CL3’ [70% inicial de CDR L3]-ACMGTAATAAGTTGCAACATC 1303 CL4’ [70% inicial de CDR L3]-RCAGTAATAAGTTGCAAAATC 1304 CL5’ [70% inicial de CDR L3]-ACAGTAATAARCTGCAAAATC 1305 CL6’ [70% inicial de CDR L3]-ACARTAGTAAGTTGCAAAATC 1306 CL7’ [70% inicial de CDR L3]-GCAGTAATAAACTCCAAMATC 1307 CL8’ [70% inicial de CDR L3]-GCAGTAATAAACCCCGACATC 1308 CL9’ [70% inicial de CDR L3]-ACAGAAGTAATATGCAGCATC 1309 CL10’ [70% inicial de CDR L3]-ACAGTAATATGTTGCAATATC 1310 CL11’ [70% inicial de CDR L3]-ACAGTAATACACTGCAAAATC 1311 CL12’ [70% inicial de CDR L3]-ACAGTAATAAACTGCCACATC

La PCR se lleva a cabo con de CL1 a CL11 en combinación con de CL1’ a CL12’ usando el sub-banco 3 como 5 molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 3 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 3.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 4 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 40 y la 10 tabla 41 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 40. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR4 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 4):

1312 DL1 [70% final de CDR L3]-TTYGGCCARGGGACCAAGSTG 1313 DL2 [70% final de CDR L3]-TTCGGCCAAGGGACACGACTG 1314 DL3 [70% final de CDR L3]-TTCGGCCCTGGGACCAAAGTG 1315 DL4 [70% final de CDR L3]-TTCGGCGGAGGGACCAAGGTG

Tabla 41. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR4 de cadena ligera (para la sub-biblioteca 4)

1316 DL1’ TTCGATYTCCACCTTGGTCCC 1317 DL2’ TTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 1318 DL3’ TTTGATATCCACTTTGGTCCC 1319 DL4’ TTTAATCTCCAGTCGTGTCCC

La PCR se lleva a cabo con de DL1 a DL4 en combinación con de DL1’ a DL14’ usando el sub-banco 4 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 4 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 4.

20 A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 5 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 42 y la tabla 43 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

25 Tabla 42. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR1 de cadena pesada (definición de Kabat) (para la sub-biblioteca 5):

1320 AH1 CAGGTKCAGCTGGTGCAGTCT 1321 AH2 GAGGTGCAGCTGKTGGAGTCT 1322 AH3 CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCG 1323 AH4 CAGGTCACCTTGARGGAGTCT

1324: AH5 CARATGCAGCTGGTGCAGTCT

1325: AH6 GARGTGCAGCTGGTGSAGTC

1326: AH7 CAGATCACCTTGAAGGAGTCT

1327: AH8 CAGGTSCAGCTGGTRSAGTCT

1328: AH9 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCA

1329: AH10 CAGGTGCAGCTACAGCAGTGG

Tabla 43. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR1 de cadena pesada (definición de Kabat) (para la sub-biblioteca 5):

1330 AHK1’ [70% inicial de CDR H1]-RGTGAAGGTGTATCCAGAAGC 1331 AHK2’ [70% inicial de CDR H1]-GCTGAGTGAGAACCCAGAGAM 1332 AHK3’ [70% inicial de CDR H1]-ACTGAARGTGAATCCAGAGGC 1333 AHK4’ [70% inicial de CDR H1]-ACTGACGGTGAAYCCAGAGGC 1334 AHK5’ [70% inicial de CDR H1]-GGTGAYGGAGCCACCAGAGAC 1335 AHK6’ [70% inicial de CDR H1]-RGTAAAGGTGWAWCCAGAAGC 1336 AHK7’ [70% inicial de CDR H1]-ACTRAAGGTGAAYCCAGAGGC 1337 AHK8’ [70% inicial de CDR H1]-GGTRAARCTGTAWCCAGAASC 1338 AHK9’ [70% inicial de CDR H1]-AYCAAAGGTGAATCCAGARGC 1339 AHK10’ [70% inicial de CDR H1]-RCTRAAGGTGAATCCAGASGC 1340 AHK12 [70% inicial de CDR H1]-GGTGAAGGTGTATCCRGAWGC 1341 AHK13’ [70% inicial de CDR H1]-ACTGAAGGACCCACCATAGAC 1342 AHK14’ [70% inicial de CDR H1]-ACTGATGGAGCCACCAGAGAC 1343 AHK15’ [70% inicial de CDR H1]-GCTGATGGAGTAACCAGAGAC 1344 AHK16 [70% inicial de CDR H1]-AGTGAGGGTGTATCCGGAAAC 1345 AHK17’ [70% inicial de CDR H1]-GCTGAAGGTGCCTCCAGAAGC 1346 AHK18’ [70% inicial de CDR H1]-AGAGACACTGTCCCCGGAGAT

5 La PCR se lleva a cabo con de AH1 a AH10 en combinación con de AHK1’ a AHK18’ usando el sub-banco 5 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 5 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 5.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 6 se construye usando la reacción en

10 cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 44 y la tabla 45 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 44. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR2 de cadena pesada (definición de Kabat) (para la 15 sub-biblioteca 6):

1347 BHK1 [70% final de CDR H1]-TGGGTGCGACAGGCYCCTGGA 1348 BHK2 [70% final de CDR H1]-TGGGTGCGMCAGGCCCCCGGA 1349 BHK3 [70% final de CDR H1]-TGGATCCGTCAGCCCCCAGGR 1350 BHK4 [70% final de CDR H1]-TGGRTCCGCCAGGCTCCAGGG 1351 BHK5 [70% final de CDR H1]-TGGATCCGSCAGCCCCCAGGG 1352 BHK6 [70% final de CDR H1]-TGGGTCCGSCAAGCTCCAGGG 1353 BHK7 [70% final de CDR H1]-TGGGTCCRTCARGCTCCRGGR 1354 BHK8 [70% final de CDR H1]-TGGGTSCGMCARGCYACWGGA 1355 BHK9 [70% final de CDR H1]-TGGKTCCGCCAGGCTCCAGGS

1356: BHK10 [70% final de CDR H1]-TGGATCAGGCAGTCCCCATCG

1357: BHK11 [70% final de CDR H1]-TGGGCCCGCAAGGCTCCAGGA

1358: BHK12 [70% final de CDR H1]-TGGATCCGCCAGCACCCAGGG

1359: BHK13 [70% final de CDR H1]-TGGGTCCGCCAGGCTTCCGGG

1360: BHK14 [70% final de CDR H1]-TGGGTGCGCCAGATGCCCGGG

1361: BHK15 [70% final de CDR H1]-TGGGTGCGACAGGCTCGTGGA

1362: BHK16 [70% final de CDR H1]-TGGATCCGGCAGCCCGCCGGG

1363: BHK17 [70% final de CDR H1]-TGGGTGCCACAGGCCCCTGGA

Tabla 45. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR2 de cadena pesada (definición de Kabat) (para la sub-biblioteca 6):

1364 BHK1’ [70% inicial de CDR H2]-TCCCATCCACTCAAGCCYTTG 1365 BHK2’ [70% inicial de CDR H2]-TCCCATCCACTCAAGCSCTT 1366 BHK3’ [70% inicial de CDR H2]-WGAGACCCACTCCAGCCCCTT 1367 BHK4’ [70% inicial de CDR H2]-CCAATCCACTCCAGKCCCTT 1368 BHK5’ [70% inicial de CDR H2]-TGAGACCCACTCCAGRCCCTT 1369 BHK6’ [70% inicial de CDR H2]-GCCAACCCACTCCAGCCCYTT 1370 BHK7’ [70% inicial de CDR H2]-KGCCACCCACTCCAGCCCCTT 1371 BHK8’ [70% inicial de CDR H2]-TCCCAGCCACTCAAGGCCTC 1372 BHK9’ [70% inicial de CDR H2]-CCCATCCACTCCAGGCCTT 1373 BHK10’ [70% inicial de CDR H2]-TGARACCCACWCCAGCCCCTT 1374 BHK12’ [70% inicial de CDR H2]-MGAKACCCACTCCAGMCCCTT 1375 BRK13’ [70% inicial de CDR H2]-YCCMATCCACTCMAGCCCYTT 1376 BHK14’ [70% inicial de CDR H2]-TCCTATCCACTCAAGGCGTTG 1377 BHK15’ [70% inicial de CDR H2]-TGCAAGCCACTCCAGGGCCTT 1378 BHK16’ [70% inicial de CDR H2]-TGAAACATATTCCAGTCCCTT 1379 BHK17’ [70% inicial de CDR H2]-CGATACCCACTCCAGCCCCTT

5 La PCR se lleva a cabo con de BHK1 a BHK17 en combinación con de BHK1’ a BHK17’ usando el sub-banco 6 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 6 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 6.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 7 se construye usando la reacción en

10 cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 46 y la tabla 47 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 46. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR3 de cadena pesada (definición de Kabat) (para la 15 sub-biblioteca 7):

1380 CHK1 [70% final de CDR H2]-AGAGTCACCATGACCAGGRAC 1381 CHK2 [70% final de CDR H2]-AGGCTCACCATCWCCAAGGAC 1382 CHK3 [70% final de CDR H2]-CGAGTYACCATATCAGTAGAC 1383 CHK4 [70% final de CDR H2]-CGATTCACCATCTCCAGRGAC 1384 CHK5 [70% final de CDR H2]-AGATTCACCATCTCMAGAGA 1385 CHK6 [70% final de CDR H2]-MGGTTCACCATCTCCAGAGA 1386 CHK7 [70% final de CDR H2]-CGATTCAYCATCTCCAGAGA 1387 CHK8 [70% final de CDR H2]-CGAGTCACCATRTCMGTAGAC

1388: CHK9 [70% final de CDR H2]-AGRGTCACCATKACCAGGGAC

1389: CHK10 [70% final de CDR H2]-CAGGTCACCATCTCAGCCGAC

1390: CHK11 [70% final de CDR H2]-CGAATAACCATCAACCCAGAC

1391: CHK12 [70% final de CDR H2]-CGGTTTGTCTTCTCCATGGAC

1392: CHK13 [70% final de CDR H2]-AGAGTCACCATGACCGAGGAC

1393: CHK14 [70% final de CDR H2]-AGAGTCACGATTACCGCGGAC

1394: CHK15 [70% final de CDR H2]-AGAGTCACCATGACCACAGAC

Tabla 47. Anticuerpo de FR3 de cadena pesada (definición de Kabat) (para la sub-biblioteca 7)

1395 CHK1’ [70% inicial de CDR H3]-TCTAGYACAGTAATACACGGC 1396 CHK2’ [70% inicial de CDR H3]-TCTCGCACAGTAATACAYGGC 1397 CHK3’ [70% inicial de CDR H3]-TCTYGCACAGTAATACACAGC 1398 CHK4’ [70% inicial de CDR H3]-TGYYGCACAGTAATACACGGC 1399 CHK5’ [70% inicial de CDR H3]-CCGTGCACARTAATAYGTGGC 1400 CHK6’ [70% inicial de CDR H3]-TCTGGCACAGTAATACACGGC 1401 CHK7’ [70% inicial de CDR H3]-TGTGGTACAGTAATACACGGC 1402 CHK8’ [70% inicial de CDR H3]-TCTCGCACAGTGATACAAGGC 1403 CHK9’ (70% inicial de CDR H3]-TTTTGCACAGTAATACAAGGC 1404 CHK10’ [70% inicial de CDR H3]-TCTTGCACAGTAATACATGGC 1405 CHK11’ [70% inicial de CDR H3]-GTGTGCACAGTAATATGTGGC 1406 CHK12’ [70% inicial de CDR H3]-TTTCGCACAGTAATATACGGC 1407 CHK13’ [70% inicial de CDR H3]-TCTCACACAGTAATACACAGC

La PCR se lleva a cabo con de CHK1 a CHK15 en combinación con de CHK1’ a CHK13’ usando el sub-banco 7 5 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 7 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 7.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 8 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 48 y la 10 tabla 49 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 48. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR1 de cadena pesada (definición de Chothia) (para la sub-biblioteca 8):

1408 AH1 CAGGTKCAGCTGGTGCAGTCT 1409 AH2 GAGGTGCAGCTGKTGGAGTCT 1410 AH3 CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCG 1411 AH4 CAGGTCACCTTGARGGAGTCT 1412 AH5 CARATGCAGCTGGTGCAGTCT 1413 AH6 GARGTGCAGCTGGTGSAGTC 1414 AH7 CAGATCACCTTGAAGGAGTCT 1415 AH8 CAGGTSCAGCTGGTRSAGTCT 1416 AH9 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCA 1417 AH10 CAGGTGCAGCTACAGCAGTGG

Tabla 49. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR1 de cadena pesada (definición de Chothia) (para la sub-biblioteca 8)

1418 AHC1’ [70% inicial de CDR H1]-RGAARCCTTGCAGGAGACCTT 1419 AHC2’ [70% inicial de CDR H1]-RGAAGCCTTGCAGGAAACCTT 1420 AHC3’ [70% inicial de CDR H1]-AGATGCCTRGCAGGAAACCTT 1421 AHC4’ [70% inicial de CDR H1]-AGAGAMGGTGCAGGTCAGCGT 1422 AHC5’ [70% inicial de CDR H1]-AGASGCTGCACAGGAGAGTCT 1423 AHC6’ [70% inicial de CDR H1]-AGAGACAGTRCAGGTGAGGGA 1424 AHC7’ [70% inicial de CDR H1]-AKAGACAGCGCAGGTGAGGGA 1425 AHC8’ [70% inicial de CDR H1]-AGAGAAGGTGCAGGTCAGTGT 1426 AHC9’ [70% inicial de CDR H1]-AGAAGCTGTACAGGAGAGTCT 1427 AHC10’ [70% inicial de CDR H1]-AGAGGCTGCACAGGAGAGTTT 1428 AHC12’ [70% inicial de CDR H1]-AGAACCCTTACAGGAGATCTT 1429 AHC13’ [70% inicial de CDR H1]-GGAGATGGCACAGGTGAGTGA

La PCR se lleva a cabo con de AH1 a AH10 en combinación con de AHC1’ a AHC13’ usando el sub-banco 8 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 8 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 8.

5 A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 9 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 50 y la tabla 51 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

10 Tabla 50. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR2 de cadena pesada (definición de Chothia) (para la sub-biblioteca 9):

1430 BHC1 [70% final de CDR H1]-TATGGYATSAGCTGGGTGCGM 1431 BHC2 [70% final de CDR H1]-ATGKGTGTGAGCTGGATCCGT 1432 BHC3 [70% final de CDR H1]-TACTACTGGRGCTGGATCCGS 1433 BHC4 [70% final de CDR H1]-TATGCYATSAGCTGGGTSCGM 1434 BHC5 [70% final de CDR H1]-TCTGCTATGCASTGGGTSCGM 1435 BHC6 [70% final de CDR H1]-TATGCYATGCAYTGGGTSCGS 1436 BHC7 [70% final de CDR H1]-CGCTACCTGCACTGGGTGCGA 1437 BHC8 [70% final de CDR H1]-TTATCCATGCACTGGGTGCGA 1438 BHC9 [70% final de CDR H1]-GCCTGGATGAGCTGGGTCCGC 1439 BHC10 [70% final de CDR H1]-GCTGCTTGGAACTGGATCAGG 1440 BHC11 [70% final de CDR H1]-AATGAGATGAGCTGGATCCGC 1441 BHC12 [70% final de CDR H1]-AACTACATGAGCTGGGTCCGC 1442 BHC13 [70% final de CDR H1]-AACTGGTGGGGCTGGATCCGG 1443 BHC14 [70% final de CDR H1]-GTGGGTGTGGGCTGGATCCGT 1444 BHC15 [70% final de CDR H1]-CACTACATGGACTGGGTCCGC 1445 BHC16 [70% final de CDR H1]-AGTGACATGAACTGGGCCCGC 1446 BHC17 [70% final de CDR H1]-AGTGACATGAACTGGGTCCAT 1447 BHC18 [70% final de CDR H1]-TATACCATGCACTGGGTCCGT 1448 BHC19 [70% final de CDR H1]-TATGCTATGCACTGGGTCCGC 1449 BHC20 [70% final de CDR H1]-TATGCTATGAGCTGGTTCCGC 1450 BHC21 [70% final de CDR H1]-TATAGCATGAACTGGGTCCGC 1451 BHC22 [70% final de CDR H1]-TATGGCATGCACTGGGTCCGC 1452 BHC23 [70% final de CDR H1]-TATTGGATGAGCTGGGTCCGC 1460 BHC1’ [70% inicial de CDR H2]-AATASCWGAGACCCACTCCAG 1461 BHC2’ [70% inicial de CDR H2]-AATAASWGAGACCCACTCCAG 1462 BHC3’ [70% inicial de CDR H2]-GMTCCATCCCATCCACTCAAG 1463 BHC4’ [70% inicial de CDR H2]-GATACKCCCAATCCACTCCAG 1464 BHC5’ [70% inicial de CDR H2]-GATRTACCCAATCCACTCCAG 1465 BHC6’ [70% inicial de CDR H2]-AATGWGTGCAAGCCACTCCAG 1466 BHC7’ [70% inicial de CDR H2]-AAYACCYGAKACCCACTCCAG 1467 BHC8’ [70% inicial de CDR H2]-AATGKATGARACCCACTCCAG 1468 BHC9’ [70% inicial de CDR H2]-ARTACGGCCAACCCACTCCAG 1469 BHC10’ [70% inicial de CDR H2]-AAAACCTCCCATCCACTCAAG 1470 BHC12’ [70% inicial de CDR H2]-GATTATTCCCATCCACTCAAG 1471 BHC13’ [70% inicial de CDR H2]-GATCCATCCTATCCACTCAAG 1472 BHC14’ [70% inicial de CDR H2]-GAACCATCCCATCCACTCAAG 1473 BHC15’ [70% inicial de CDR H2]-GATCCCTCCCATCCACTCAAG 1474 BHC16’ [70% inicial de CDR H2]-CATCCATCCCATCCACTCAAG 1475 BHC17’ [70% inicial de CDR H2]-TGTCCTTCCCAGCCACTCAAG 1476 BHC18’ [70% inicial de CDR H2]-AATACGTGAGACCCACACCAG 1477 BHC19’ [70% inicial de CDR H2]-AATAGCTGAAACATATTCCAG 1478 BHC20’ [70% inicial de CDR H2]-GATTTCCCCAATCCACTCCAG 1479 BHC21’ [70% inicial de CDR H2]-GATGATCCCCATCCACTCCAG 1480 BHC22’ [70% inicial de CDR H2]-TATAACTGCCACCCACTCCAG 1481 BHC23’ [70% inicial de CDR H2]-AATGAAACCTACCCACTCCAG 1482 BHC24’ [70% inicial de CDR H2]-TATGTTGGCCACCCACTCCAG

1453: BHC24 [70% final de CDR H1]-TACGACATGCACTGGGTCCGC

1454: BHC25 [70% final de CDR H1]-TACTACATGAGCTGGATCCGC

1455: BHC26 [70% final de CDR H1]-TACTGGATGCACTGGGTCCGC

1456: BHC27 [70% final de CDR H1]-TACTGGATCGGCTGGGTGCGC

1457: BHC28 [70% final de CDR H1]-TACTATATGCACTGGGTGCGA

1458: BHC29 [70% final de CDR H1]-TATGATATCAACTGGGTGCGA

1459: BHC30 [70% final de CDR H1]-TATGGTATGAATTGGGTGCCA

Tabla 51. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR2 de cadena pesada (definición de Chothia) (para la sub-biblioteca 9)

5 La PCR se lleva a cabo con de BHC1 a BHC30 en combinación con de BHC1’ a BHC24’ usando el sub-banco 9 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 9 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 9.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 10 se construye usando la reacción en

10 cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 52 y la tabla 53 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 52. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR3 de cadena pesada (definición de Chothia) (para la 15 sub-biblioteca 10):

1483 CHC1 [70% final de CDR H2]-ACCAACTACAACCCSTCCCTC 1484 CHC2 [70% final de CDR H2]-ATATACTACGCAGACTCWGTG 1510 CHC1’ [70% inicial de CDR H3]-TSTYGCACAGTAATACACGGC 1511 CHC2’ [70% inicial de CDR H3]-TCTYGCACAGTAATACATGGC 1512 CHC3’ [70% inicial de CDR H3]-TCTAGYACAGTAATACACGGC 1513 CHC4’ [70% inicial de CDR H3]-CCGTGCACARTAATAYGTGGC 1514 CHC5’ [70% inicial de CDR H3]-TCTYGCACAGTAATACACAGC 1515 CHC6’ [70% inicial de CDR H3]-GTGTGCACAGTAATATGTGGC 1516 CHC7’ [70% inicial de CDR H3]-TGCCGCACAGTAATACACGGC 1517 CHC8’ [70% inicial de CDR H3]-TGTGGTACAGTAATACACGGC 1518 CHC9’ [70% inicial de CDR H3]-TCTCACACAGTAATACACAGC 1519 CHC10’ [70% inicial de CDR H3]-TCTCGCACAGTGATACAAGGC 1520 CHC11’ [70% inicial de CDR H3]-TTTCGCACAGTAATATACGGC 1521 CHC12’ [70% inicial de CDR H3]-TCTGGCACAGTAATACACGGC 1522 CHC13’ [70% inicial de CDR H3]-TTTTGCACAGTAATACAAGGC

1485: CHC3 [70% final de CDR H2]-ACATACTAYGCAGACTCYGTG

1486: CHC4 [70% final de CDR H2]-ACMAACTACGCACAGAARTTC

1487: CHC5 [70% final de CDR H2]-ACAAACTATGCACAGAAGYT

1488: CHC6 [70% final de CDR H2]-ACARGCTAYGCACAGAAGTTC

1489: CHC7 [70% final de CDR H2]-AYAGGYTATGCRGACTCTGTG

1490: CHC8 [70% final de CDR H2]-AAATMCTACAGCACATCTCTG

1491: CHC9 [70% final de CDR H2]-AAATACTATGTGGACTCTGTG

1492: CHC10 [70% final de CDR H2]-CCAACATATGCCCAGGGCTTC

1493: CHC11 [70% final de CDR H2]-GCAAACTACGCACAGAAGTTC

1494: CHC12 [70% final de CDR H2]-AAATACTATGCAGACTCCGTG

1495: CHCl3 [70% final de CDR H2]-AAGCGCTACAGCCCATCTCTG

1496: CHC14 [70% final de CDR H2]-AATGATTATGCAGTATCTGTG

1497: CHC15 [70% final de CDR H2]-ACCAGATACAGCCCGTCCTTC

1498: CHC16 [70% final de CDR H2]-ACAGAATACGCCGCGTCTGTG

1499: CHC17 [70% final de CDR H2]-ACGCACTATGCAGACTCTGTG

1500: CHC18 [70% final de CDR H2]-ACGCACTATGTGGACTCCGTG

1501: CHC19 [70% final de CDR H2]-ACAATCTACGCACAGAAGTTC

1502: CHC20 [70% final de CDR H2]-ACAAAATATTCACAGGAGTTC

1503: CHC21 [70% final de CDR H2]-ACATACTACGCAGACTCCAGG

1504: CHC22 [70% final de CDR H2]-ACAAGCTACGCGGACTCCGTG

1505: CHC23 [70% final de CDR H2]-ACATATTATGCAGACTCTGTG

1506: CHC24 [70% final de CDR H2]-ACAGACTACGCTGCACCCGTG

1507: CHC25 [70% final de CDR H2]-ACAGCATATGCTGCGTCGGTG

1508: CHC26 [70% final de CDR H2]-ACATACTATCCAGGCTCCGTG

1509: CHC27 [70% final de CDR H2]-ACCTACTACAACCCGTCCCTC

Tabla 53. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR3 de cadena pesada (definición de Chothia) (para la sub-biblioteca 10):

La PCR se lleva a cabo con de CHC1 a CHC27 en combinación con de CHC1’ a CHC13’ usando el sub-banco 10 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 10 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en la tabla 10.

A modo de ejemplo pero no de limitación, la sub-biblioteca combinatoria 11 se construye usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos en la tabla 54 y la tabla 55 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia) en los que K= G o T, M= A o C, R= A o G, S= Co G,W= A o T e Y= C o T.

Tabla 54. Cebadores directos específicos de anticuerpo de FR4 de cadena pesada (definición de Kabat y de Chothia) (para la sub-biblioteca 11):

1523 DH1 [70% final de CDR H3]-TGGGGCCARGGMACCCTGGTC 1524 DH2 [70% final de CDR H3]-TGGGGSCAAGGGACMAYGGTC 1525 DH3 [70% final de CDR H3]-TGGGGCCGTGGCACCCTGGTC

Tabla 55. Cebadores inversos específicos de anticuerpo de FR4 de cadena pesada (definición de Kabat y de Chothia) (para la sub-biblioteca 11)

1526 DH1’ TGAGGAGACRGTGACCAGGGT 1527 DH2’ TGARGAGACGGTGACCRTKGT 1528 DH3’ TGAGGAGACGGTGACCAGGGT

La PCR se lleva a cabo con de DH1 a DHC3 en combinación con de DH1’ a DH3’ usando el sub-banco 11 como molde. Esto genera la sub-biblioteca combinatoria 11 o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a

15 secuencias descritas en la tabla 11.

En algunas realizaciones, pueden construirse nueve sub-bibliotecas combinatorias usando ligación directa de CDR no humanas y las regiones de entramado humanas de los sub-bancos. Por ejemplo, las sub-bibliotecas combinatorias 1’, 2’ y 3’ se construyen por separado mediante ligación directa de las CDR no humanas L1, L2 y L3 20 (en una forma de cadena sencilla o de cadena doble) con los sub-bancos 1, 2 y 3, respectivamente. En una realización, las CDR no humanas (L1, L2 y L3) son ácidos nucleicos de cadena sencilla. En otra realización, las CDR no humanas (L1, L2 y L3) son ácidos nucleicos de cadena doble. Alternativamente, pueden obtenerse las subbibliotecas combinatorias 1’, 2’ y 3’ mediante ligación directa de las CDR no humanas (L1, L2 y L3) en una forma de cadena sencilla (+) con el ácido nucleico 1-46 indicado en la tabla 1, el ácido nucleico 47-92 indicado en la tabla 2 y

25 el ácido nucleico 93-138 indicado en la tabla 3, respectivamente.

En algunas realizaciones, se construyen las sub-bibliotecas combinatorias 5’ y 6’ por separado mediante ligación directa de las CDR no humanas H1 y H2 (en una forma de cadena sencilla o de cadena doble y según la definición de Kabat) con los sub-bancos 5 y 6, respectivamente. Alternativamente, pueden obtenerse las sub-bibliotecas 5’ y 6’

30 mediante ligación directa de las CDR no humanas H1 y H2 (según la definición de Kabat y en una forma de cadena sencilla (+)) con los ácidos nucleicos de 144 a 187 indicados en la tabla 5 y de 188 a 231 indicados en la tabla 6, respectivamente.

En algunas realizaciones, se construyen las sub-bibliotecas combinatorias 8’ y 9’ por separado mediante ligación

35 directa de las CDR no humanas H1 y H2 (en una forma de cadena sencilla o de cadena doble y según la definición de Chothia) con los sub-bancos 8 y 9, respectivamente. Alternativamente, pueden obtenerse las sub-bibliotecas 8’ y 9’ mediante ligación directa de las CDR no humanas H1 y H2 (según la definición de Chothia y en una forma de cadena sencilla (+)) con los ácidos nucleicos de 276 a 319 indicados en la tabla 8 y de 320 a 363 de la tabla 9, respectivamente.

40 Se construyen las sub-bibliotecas combinatorias 11’ y 12’ por separado mediante ligación directa de la CDR no humana H3 (en una forma de cadena sencilla o de cadena doble) con el sub-banco 7 (definición de Kabat) y 10 (definición de Chothia), respectivamente. Alternativamente, pueden obtenerse las sub-bibliotecas 11’ y 12’ mediante ligación directa de la CDR no humana H3 (en una forma de cadena sencilla (+)) con los ácidos nucleicos de 232 a

45 275 indicados en la tabla 7 y de 364 a 407 de la tabla 10, respectivamente.

La ligación directa de fragmentos de ADN puede llevarse a cabo según protocolos convencionales. Puede ir seguida por purificación/separación de los productos ligados a partir de los no ligados.

50 2.5 Construcción de bibliotecas combinatorias

Se construyen bibliotecas combinatorias ensamblando entre sí sub-bibliotecas combinatorias de región de cadena ligera variable o región de cadena pesada variable correspondientes. Por ejemplo, puede construirse la biblioteca combinatoria de regiones de entramado de línea germinal de cadena kappa humana (biblioteca combinatoria 1) 55 ensamblando entre sí las sub-bibliotecas 1, 2, 3 y 4 mediante regiones solapantes en las CDR tal como se describe a continuación; pueden construirse dos bibliotecas combinatorias de regiones de entramado de línea germinal de

cadena pesada humana (una para la definición de Kabat de las CDR, biblioteca combinatoria 2, y una para la definición de Chothia de las CDR, biblioteca combinatoria 3) ensamblando entre sí las sub-bibliotecas 5, 6, 7, 11 (definición de Kabat) o las sub-bibliotecas 8, 9, 10, 11 (definición de Chothia) mediante regiones solapantes en las CDR tal como se describe a continuación.

5 En una realización, la construcción de la biblioteca combinatoria 1 se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la tabla 56 y la tabla 57 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, el nombre del cebador seguido por la secuencia):

10 Tabla 56. Cebadores directos de cadena ligera (para la biblioteca combinatoria 1):

1529 AL1 GATGTTGTGATGACWCAGTCT 1530 AL2 GACATCCAGATGAYCCAGTCT 1531 AL3 GCCATCCAGWTGACCCAGTCT 1532 AL4 GAAATAGTGATGAYGCAGTCT 1533 AL5 GAAATTGTGTTGACRCAGTCT 1534 AL6 GAKATTGTGATGACCCAGACT 1535 AL7 GAAATTGTRMTGACWCAGTCT 1536 AL8 GAYATYGTGATGACYCAGTCT 1537 AL9 GAAACGACACTCACGCAGTCT 1538 AL10 GACATCCAGTTGACCCAGTCT 1539 AL11 AACATCCAGATGACCCAGTCT 1540 AL12 GCCATCCGGATGACCCAGTCT 1541 AL13 GTCATCTGGATGACCCAGTCT

Tabla 57. Cebadores inversos de cadena ligera (para la biblioteca combinatoria 1):

1542 DL1’ TTTGATYTCCACCTTGGTCCC 1543 DL2’ TTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 1544 DL3’ TTTGATATCCACTTTGGTCCC 1545 DL4’ TTTAATCTCCAGTCGTGTCCC

La PCR se lleva a cabo con de AL1 a AL13 en combinación con de DL1’ a DL4’ usando las sub-bibliotecas 1, 2, 3 y 15 4 juntas o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en las tablas 1, 2, 3 y 4 como molde. Esto genera la biblioteca combinatoria 1.

En una realización, la construcción de las bibliotecas combinatorias 2 y 3 se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante extensión por solapamiento usando los oligonucleótidos indicados en la 20 tabla 58 y la tabla 59 (mostrados todos en la orientación de 5’ a 3’, nombre seguido por secuencia):

Tabla 58. Cebadores directos de cadena pesada (para las bibliotecas combinatorias 2 y 3, definición de Kabat y de Chothia):

1546 AH1 CAGGTKCAGCTGGTGCAGTCT 1547 AH2 GAGGTGCAGCTGKTGGAGTCT 1548 AH3 CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCG 1549 AH4 CAGGTCACCTTGARGGAGTCT 1550 AH5 CARATGCAGCTGGTGCAGTCT 1551 AH6 GARGTGCAGCTGGTGSAGTC 1552 AH7 CAGATCACCTTGAAGGAGTCT 1553 AH8 CAGGTSCAGCTGGTRSAGTCT 1554 AH9 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCA 1555 AH10 CAGGTGCAGCTACAGCAGTGG

Tabla 59. Cebadores inversos de cadena pesada (para la biblioteca combinatoria 2 y 3, definición de Kabat y de Chothia):

1556 DH1’ TGAGGAGACRGTGACCAGGGT 1557 DH2’ TGARGAGACGGTGACCRTKGT 1558 DH3’ TGAGGAGACGGTGACCAGGGT

La PCR se lleva a cabo con de AH1 a AH10 en combinación con de DH1’ a DH3’ usando las sub-bibliotecas 5, 6, 7,

5 11 juntas, o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en las tablas 5, 6, 7 y 11, o las sub-bibliotecas 8, 9, 10, 11, o un agrupamiento de oligonucleótidos correspondiente a secuencias descritas en las tablas 8, 9, 10 y 11, juntas como molde. Esto genera la biblioteca combinatoria 2 ó 3, respectivamente.

En otra realización, se construyen bibliotecas combinatorias mediante ligación directa. Por ejemplo, se construye

10 una biblioteca combinatoria de regiones de entramado de línea germinal de cadena kappa humana (biblioteca combinatoria 1’) mediante ligación secuencial directa de las sub-bibliotecas 1’, 2’, 3’ y del sub-banco 4 (o los ácidos nucleicos de 139 a 143, véase la tabla 4) entre sí. Esto va seguido por una etapa de reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos descritos en la tabla 60 y la tabla 61. Se construyen dos bibliotecas combinatorias de regiones de entramado de línea germinal de cadena pesada humana (una para la definición de

15 Kabat de las CDR, biblioteca combinatoria 2’; y una para la definición de Chothia de las CDR, biblioteca combinatoria 3’) mediante ligación secuencial directa de las sub-bibliotecas 5’, 6’, 11’ y del sub-banco 11 (definición de Kabat) o de las sub-bibliotecas 8’, 9’, 12’ y del sub-banco 11 (definición de Chothia) entre sí. Alternativamente, puede sustituirse el sub-banco 11 por los ácidos nucleicos de 408 a 412 (véase la tabla 11) en las reacciones de ligación. Esto va seguido por una etapa de reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos

20 descritos en la tabla 62 y la tabla 63.

Tabla 60. Cebadores directos de cadena ligera (para la biblioteca combinatoria 1’):

1559 AL1 GATGTTGTGATGACWCAGTCT 1560 AL2 GACATCCAGATGAYCCAGTCT 1561 AL3 GCCATCCAGWTGACCCAGTCT 1562 AL4 GAAATAGTGATGAYGCAGTCT 1563 AL5 GAAATTGTGTTGACRCAGTCT 1564 AL6 GAKATTGTGATGACCCAGACT 1565 AL7 GAAATTGTRMTGACWCAGTCT 1566 AL8 GAYATYGTGATGACYCAGTCT 1567 AL9 GAAACGACACTCACGCAGTCT 1568 AL10 GACATCCAGTTGACCCAGTCT 1569 AL11 AACATCCAGATGACCCAGTCT 1570 AL12 GCCATCCGGATGACCCAGTCT 1571 AL13 GTCATCTGGATGACCCAGTCT

Tabla 61. Cebadores inversos de cadena ligera (para la biblioteca combinatoria 1’):

1572 DL1’ TTTGATYTCCACCTTGGTCCC 1573 DL2’ TTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 1574 DL3’ TTTGATATCCACTTTGGTCCC 1575 DL4’ TTTAATCTCCAGTCGTGTCCC

25 La PCR se lleva a cabo con de AL1 a AL 13 en combinación con de DL1’ a DL4’ usando las sub-bibliotecas 1’, 2’, 3’ y el sub-banco 4 (o los ácidos nucleicos de 139 a 143, véase la tabla 4) previamente ligados entre sí como molde. Esto genera la biblioteca combinatoria 1’.

30 Tabla 62. Cebadores directos de cadena pesada (para la biblioteca combinatoria 2’ y 3’, definición de Kabat y de Chothia):

1576 AH1 CAGGTKCAGCTGGTGCAGTCT 1577 AH2 GAGGTGCAGCTGKTGGAGTCT

1578: AH3 CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCG

1579: AH4 CAGGTCACCTTGARGGAGTCT

1580: AH5 CARATGCAGCTGGTGCAGTCT

1581: AH6 GARGTGCAGCTGGTGSAGTC

1582: AH7 CAGATCACCTTGAAGGAGTCT

1583: AH8 CAGGTSCAGCTGGTRSAGTCT

1584: AH9 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCA

1585: AH10 CAGGTGCAGCTACAGCAGTGG

Tabla 63. Cebadores inversos de cadena pesada (para la biblioteca combinatoria 2’ y 3’, definición de Kabat y de Chothia):

1586 DH1’ TGAGGAGACRGTGACCAGGGT

1587 DH2’ TGARGAGACGGTGACCRTKGT

1588 DH3’ TGAGGAGACGGTGACCAGGGT

5 La PCR se lleva a cabo con de AH1 a AH10 en combinación con de DH1’ a DH3’ usando las sub-bibliotecas 5’, 6’, 11’ y el sub-banco 11 (o los ácidos nucleicos de 408 a 412, véase la tabla 11) previamente ligados entre sí o las subbibliotecas 8’, 9’, 12’ y el sub-banco 11 (o los ácidos nucleicos de 408 a 413, véase la tabla 11) previamente ligados entre sí como molde. Esto genera la biblioteca combinatoria 2’ o 3’, respectivamente.

10 Los sub-bancos de regiones de entramado, sub-bancos de CDR, sub-bibliotecas combinatorias y bibliotecas combinatorias pueden almacenarse para un uso posterior. Los ácidos nucleicos pueden almacenarse en una disolución, como un polvo liofilizado esterilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado. En casos en los que los ácidos nucleicos no se almacenan en una disolución, los ácidos nucleicos pueden reconstituirse (por ejemplo, con agua o solución salina) hasta la concentración apropiada para un

15 uso posterior. Los sub-bancos, sub-bibliotecas combinatorias y bibliotecas combinatorias se almacenan preferiblemente a entre 2ºC y 8ºC en un recipiente que indica la cantidad y la concentración de los ácidos nucleicos.

2.6 Expresión de las bibliotecas combinatorias

20 Las bibliotecas combinatorias pueden expresarse usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, sistema de expresión bacteriano, sistema de expresión de mamífero y sistema de presentación ribosómico in vitro.

En realizaciones preferidas, la presente invención abarca el uso de vectores de fago para expresar las bibliotecas

25 combinatorias. Los vectores de fago tienen ventajas particulares de proporcionar un medio para examinar una población muy grande de proteínas presentadas expresadas y de ese modo localizar uno o más clones específicos que codifican para una actividad de unión deseada.

El uso de los vectores de presentación en fagos para expresar una gran población de moléculas de anticuerpo se

30 conoce bien en la técnica y no se revisará en detalle en el presente documento. El método implica generalmente el uso de un sistema de vector de expresión en superficie de fago filamentoso (fagémido) para clonar y expresar especies de anticuerpos de una biblioteca. Véase, por ejemplo, Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:43634366 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:7978-7982 (1991); Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3175-3179 (1992); Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:11120-11123 (1991); Barbas et al., Proc.

35 Natl. Acad. Sci., USA, 89:4457-4461 (1992); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3576-3580 (1992); Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); la solicitud PCT n.º PCT/GB91/01134; las publicaciones PCT n.os WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes

40 estadounidenses n.os 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.

Un vector de fagémido preferido es una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para, y puede expresar, un polipéptido de fusión que contiene, en el sentido de extremo amino a

45 carboxilo-terminal, (1) un dominio de señal de secreción procariota, (2) un polipéptido heterólogo que define una región variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, y (3) un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso. El vector incluye secuencias de control de la expresión de ADN para expresar el polipéptido de fusión, preferiblemente secuencias de control procariotas.

El anclaje a membrana de fago filamentoso es preferiblemente un dominio de la proteína de cubierta cpIII o cpVIII que puede asociarse con la matriz de una partícula de fago filamentoso, incorporando así el polipéptido de fusión sobre la superficie del fago.

5 Pueden obtenerse anclajes a membrana preferidos para el vector de los fagos filamentosos M13, fl, fd y fagos filamentosos equivalentes. Se encuentran dominios de anclaje a membrana preferidos en las proteínas de cubierta codificadas por el gen III y el gen VIII. (Véase Ohkawa et al., J. Biol. Chem., 256:9951-9958, 1981). El dominio de anclaje a membrana de una proteína de cubierta de fago filamentoso es una porción de la región carboxilo-terminal de la proteína de cubierta e incluye una región de residuos de aminoácido hidrófobos para abarcar una membrana de bicapa lipídica, y una región de residuos de aminoácido cargados que se encuentra normalmente en la cara citoplasmática de la membrana y que se extiende alejándose de la membrana. Para descripciones detalladas de la estructura de partículas de fago filamentoso, sus proteínas de cubierta y ensamblaje de partículas, véanse las revisiones de Rached et al., Microbiol. Rev., 50:401-427 (1986); y Model et al., en “The Bacteriophages: Vol. 2”, R.

15 Calendar, ed. Plenum Publishing Co., págs. 375-456 (1988).

La señal de secreción es un dominio peptídico líder de una proteína que dirige la proteína a la membrana periplasmática de bacterias gram negativas. Una señal de secreción preferida es una señal de secreción pelB. (Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988); Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5728-5732 (1989); y Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:8095-8099 (1990)). Las secuencias de residuos de aminoácido predichas del dominio de señal de secreción de dos variantes de producto génico de pelB de Erwinia carotova se describen en Lei et al., Nature, 331:543-546 (1988). Las secuencias de residuos de aminoácido para otros dominios polipeptídicos de señal de secreción de E. coli útiles en esta invención se describen en Oliver, Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Neidhard, F. C. (ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69

25 (1987).

Las secuencias de control de la expresión de ADN comprenden un conjunto de señales de expresión de ADN para expresar un producto génico estructural e incluyen elementos tanto en 5’ como en 3’, tal como se conoce, operativamente unidos al gen. Las secuencias de control en 5’ definen un promotor para iniciar la transcripción y un sitio de unión al ribosoma operativamente unido al extremo terminal en 5’ de la secuencia de ADN traducible en el sentido de 5’. Las secuencias de control en 3’ definen al menos un codón de terminación (parada) en marco con y operativamente unido al polipéptido de fusión heterólogo.

Preferiblemente, el vector usado incluye un origen de replicación o replicón procariota, es decir, un secuencia de

35 ADN que tiene la capacidad para dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante de manera extra-cromosómica en una célula huésped procariota, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con el mismo. Tales orígenes de replicación se conocen bien en la técnica. Los orígenes de replicación preferidos son aquellos que son eficaces en el organismo huésped. Una célula huésped preferida es

E. coli. Véase Sambrook et al., en “Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989).

Además, un replicón procariota, cuando se usa, también puede incluir un ácido nucleico cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia a fármaco, a un huésped bacteriano transformado con el mismo. Los genes de resistencia a fármaco bacterianos típicos son aquellos que confieren resistencia a ampicilina, tetraciclina,

45 neomicina/kanamicina o cloranfenicol. Normalmente los vectores también contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de secuencias de ADN traducibles.

En algunos casos, el vector puede realizar la coexpresión de dos cistrones contenidos en el mismo, tales como una secuencia de nucleótidos que codifica para una región de cadena pesada variable y una secuencia de nucleótidos que codifica para una región de cadena ligera variable. La coexpresión se ha logrado en una variedad de sistemas y por tanto no necesita limitarse a ningún diseño particular, siempre que se produzcan cantidades relativas suficientes de los dos productos génicos para permitir el ensamblaje y la expresión de un heterodímero funcional.

Un vector de expresión de ADN puede diseñarse para su manipulación conveniente en forma de una partícula de

55 fago filamentoso que encapsula un genoma. En este caso, un vector de expresión de ADN contiene además una secuencia de nucleótidos que define un origen de replicación de fago filamentoso de tal manera que el vector, tras la presentación del complemento génico apropiado, puede replicarse como un fago filamentoso en forma replicativa de cadena sencilla y empaquetarse dentro de partículas de fago filamentoso. Esta característica proporciona la capacidad de empaquetar el vector de expresión de ADN en partículas de fago para su posterior separación de la partícula, y el vector contenido en la misma, lejos de otras partículas que comprenden una población de partículas de fago.

Un origen de replicación de fago filamentoso es una región del genoma de fago, tal como se conoce, que define sitios para el inicio de la replicación, terminación de la replicación y empaquetamiento de la forma replicativa 65 producida mediante replicación (véase por ejemplo, Rasched et al., Microbiol. Rev., 50:401-427, 1986; y Horiuchi, J. Mol. Biol., 188:215-223, 1986). Un origen de replicación de fago filamentoso preferido es un origen de replicación de

fagos M13, fl o fd (Short et al., Nucl. Acids Res., 16:7583-7600, 1988).

El método para producir una molécula de inmunoglobulina heterodimérica implica generalmente (1) introducir una gran población de vectores de presentación que pueden expresar cada uno diferentes sitios de unión supuestos

5 presentados en una proteína de presentación en superficie de fagémido en una partícula de fago filamentoso, (2) expresar la proteína de presentación y el sitio de unión sobre la superficie de una partícula de fago filamentoso, y (3) aislar (seleccionar) la partícula de fago expresada en superficie usando técnicas de afinidad tales como cribado de partículas de fago frente a un antígeno preseleccionado, aislando así una o más especies de fagémidos que contienen una proteína de presentación que contiene un sitio de unión que se une a un antígeno preseleccionado.

El aislamiento de un vector particular que puede expresar un sitio de unión a anticuerpo de interés implica la introducción del vector de expresión dicistrónico que puede expresar la proteína de presentación de fagémido en una célula huésped que permite la expresión de genes de fago filamentoso y el ensamblaje de partículas de fago. Normalmente, el huésped es E. coli. Posteriormente, se introduce un genoma de fago cooperador en la célula

15 huésped que contiene el vector de expresión de fagémido para proporcionar el complemento génico necesario para permitir que se ensamblen partículas de fago.

La célula huésped resultante se cultiva para permitir que se expresen los genes de proteína de presentación y los genes de fago introducidos, y para que se ensamblen partículas de fago y se desprendan de la célula huésped. Entonces se recogen (obtienen) las partículas de fago desprendidas de los medios de cultivo de la célula huésped y se examinan para determinar propiedades de unión a anticuerpo deseables. Normalmente, se “criban” las partículas recogidas para determinar la unión con un antígeno preseleccionado. Entonces se recogen las partículas que se unen fuertemente y se aíslan por clonación especies individuales de partículas y se examinan adicionalmente para determinar la unión al antígeno. Se seleccionan los fagos que producen un sitio de unión con una especificidad de

25 unión a antígeno deseada.

Tras la selección de fagos, pueden aislarse las regiones del fago que codifican para anticuerpo y usarse para generar anticuerpos completos o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, tal como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los dados a conocer en la publicación internacional n.º WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988). Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir anticuerpos y Fv de cadena sencilla incluyen las descritas en

35 las patentes estadounidenses n.os 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

Una célula huésped puede contener un vector o una secuencia de nucleótidos de esta invención, la célula huésped puede ser E. coli.

Puede clonarse una biblioteca combinatoria en un vector de fago basado en M 13. Este vector permite la expresión de fragmentos Fab que contienen el primer dominio constante de la cadena pesada 01 humana y el dominio constante de la cadena ligera kappa (κ) humana bajo el control del promotor lacZ. Esto puede llevarse a cabo mediante mutagénesis por hibridación tal como se describe en Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233;

45 Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212; y Kunkel et al., 1987, Methods Enzymol. 154, 367-382. En resumen, se hibridan cadenas negativas purificadas correspondientes a las cadenas pesada y ligera que van a clonarse con dos regiones que contienen cada una un bucle palindrómico. Estos bucles contienen un sitio XbaI único que permite la selección de los vectores que contienen las cadenas tanto VL como VH fusionadas en marco con la región constante kappa (κ) humana y la primera región constante 01 humana, respectivamente (Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233, Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212). Entonces se somete el ADN sintetizado a electroporesis en XL1-blue para determinar la formación de placas de lisis en césped bacteriano de XL1-blue o la producción de fragmentos Fab tal como se describe en Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212.

Además de los sistemas de expresión bacterianos/en fagos, pueden usarse otros sistemas de vectores huésped

55 para expresar las bibliotecas combinatorias. Estos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de célula de mamífero transfectados con un vector o infectados con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de célula de insecto transfectados con un vector o infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura; o bacterias transformadas con ADN, ADN de plásmido o ADN de cósmido. Véase por ejemplo, Verma et al., J Immunol Methods. 216(1-2):165-81 (1998).

Los elementos de expresión de vectores varían en cuanto a sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de vector huésped usado, puede usarse uno cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados. En un aspecto preferido, cada ácido nucleico de una biblioteca combinatoria es parte de un vector de expresión que expresa la cadena pesada y/o ligera humanizada o regiones variables de cadena pesada y/o ligera 65 humanizadas en un huésped adecuado. En particular, tales ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, operativamente unidos a la región que codifica para anticuerpo, siendo dicho promotor

inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. (Véase la sección 5.7 para más detalles). En otra realización particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias que codifican para anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican

5 para anticuerpo (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

Las bibliotecas combinatorias también pueden expresarse usando sistemas in vitro, tales como los sistemas de presentación ribosómicos (véase la sección 5.6 para más detalles).

2.7 Selección de anticuerpos humanizados

Las bibliotecas combinatorias expresadas pueden examinarse para determinar unión al antígeno reconocido por el anticuerpo donador usando cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, una biblioteca de 15 presentación en fago construida y expresada tal como se describe en las secciones 5.4 y 5.6, respectivamente, se examina para determinar la unión al antígeno reconocido por el anticuerpo donador, y puede aislarse el fago que expresa dominio VH y/o VL con unión significativa al antígeno a partir de una biblioteca usando las técnicas de examen convencionales (por ejemplo tal como se describe en Harlow, E., y Lane, D., 1988, citado anteriormente Gherardi, E et al. 1990. J. Immunol. meth. 126 págs. 61-68). Las partículas de fago desprendidas de células huésped se recogen (obtienen) de los medios de cultivo de la célula huésped y se examinan para determinar propiedades de unión de anticuerpo deseables. Normalmente, se “criban” las partículas recogidas para determinar la unión con un antígeno preseleccionado. Entonces se recogen las partículas que se unen fuertemente, se aíslan por clonación especies individuales de partículas y se examinan adicionalmente para determinar la unión al antígeno. Se seleccionan los fagos que producen un sitio de unión con una especificidad de unión a antígeno deseada.

25 Preferiblemente, un anticuerpo humanizado de la invención tiene una afinidad de al menos 1x106 M-1, preferiblemente al menos 1x107 M-1, al menos 1x108 M-1 o al menos 1x109 M-1 para un antígeno de interés.

Preferiblemente, en primer lugar se examina una biblioteca de fagos usando un ensayo de hibridación en placa modificado, denominado hibridación de captura. Véase Watkins et al., 1997, Anal. Biochem., 253:37-45. En resumen, se siembran en placas bacterias infectadas por fagos en céspedes de agar sólido y posteriormente se recubren con filtros de nitrocelulosa que se han recubierto con un reactivo específico para Fab (por ejemplo, un anticuerpo anti-Fab). Tras la captura de cantidades casi uniformes de Fab expresado en fagos, se examinan los filtros con sonda con proteína de fusión antígeno-Ig deseada a una concentración sustancialmente inferior al valor de Kd del Fab.

35 Alternativamente, las bibliotecas combinatorias se expresan y se examinan usando sistemas in vitro, tales como los sistemas de presentación ribosómicos (véase, por ejemplo, Graddis et al., Curr Pharm Biotechnol. 3(4):285-97 (2002); Hanes y Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997); He, 1999, J. Immunol. Methods, 231:105; Jermutus et al. (1998) Current Opinion in Biotechnology, 9:534-548. El sistema de presentación ribosómico funciona traduciendo una biblioteca de anticuerpo o fragmento del mismo in vitro sin permitir la liberación ni del anticuerpo (o fragmento del mismo) ni del ARNm del ribosoma de traducción. Esto se hace posible eliminando el codón de parada y usando un sistema de tampón estabilizante de ribosoma. El anticuerpo traducido (o fragmento del mismo) también contiene una extensión de polipéptido unión C-terminal con el fin de facilitar que el anticuerpo recién sintetizado o fragmento del mismo emerja del túnel ribosómico y se pliegue de manera independiente. El anticuerpo plegado o fragmento del

45 mismo puede examinarse o capturarse con un antígeno análogo. Esto permite la captura del ARNm, que posteriormente se enriquece in vitro. Los sistemas de reticulocito de conejo y E. coli se usan comúnmente para la presentación ribosómica.

También pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, PROfusion™ (patente estadounidense n.º 6.281.344, Phylos Inc., Lexington, MA), presentación covalente (publicación internacional n.º WO 9837186, Actinova Ltd., Cambridge, R.U.).

Un antígeno puede unirse a soporte(s) sólido(s), que puede(n) proporcionarse mediante una placa Petri, perlas de cromatografía o perlas magnéticas. Tal como se usa en el presente documento, el término “soporte sólido” no se 55 limita a ningún tipo específico de soporte sólido. En vez de eso, hay un gran número de soportes disponibles y los conoce un experto en la técnica. Los soportes sólidos incluyen geles de sílice, resinas, películas de plástico derivatizadas, perlas de vidrio, algodón, perlas de plástico, perlas de poliestireno, geles de alúmina y polisacáridos. Un soporte sólido adecuado puede seleccionarse basándose en el uso final deseado y la idoneidad para diversos protocolos sintéticos. Por ejemplo, para la síntesis de péptidos, un soporte sólido puede ser una resina tal como resina de p-metilbenzohidrilamina (pMBHA) (Peptides International, Louisville, KY), poliestirenos (por ejemplo, resina PAM obtenida de Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.), incluyendo clorometilpoliestireno, hidroximetilpoliestireno y aminometilpoliestireno, estireno-co-divinilbenceno con injerto de poli(dimetilacrilamida) (por ejemplo, resina POLYHIPE, obtenida de Aminotech, Canada), resina de poliamida (obtenida de Peninsula Laboratories), resina de poliestireno con injerto de polietilenglicol (por ejemplo, TENTAGEL o ARGOGEL, Bayer,

65 Tubingen, Alemania) resina de polidimetilacrilamida (obtenida de Milligen/Biosearch, California) o Sepharose (Pharmacia, Suecia).

Entonces se hace pasar la biblioteca combinatoria sobre el antígeno y tras el lavado se conservan aquellos anticuerpos individuales que se unen y opcionalmente se detectan con un sistema de detección. Si se retiran muestras de población unida en condiciones cada vez más rigurosas, la afinidad de unión representada en cada

5 muestra aumentará. Las condiciones de rigurosidad aumentada pueden obtenerse, por ejemplo, aumentando el tiempo de empapado o cambiando el pH de la disolución de empapado, etc.

Alternativamente, se usa un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para examinar para seleccionar un anticuerpo con actividad de unión deseada. Los ensayos ELISA comprenden preparar un antígeno, recubrir los pocillos de una placa de microtitulación con el antígeno, eliminar mediante lavado el antígeno que no se unió a los pocillos, añadir el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina) a los pocillos e incubar durante un periodo de tiempo, eliminar mediante lavado los anticuerpos no unidos o anticuerpos no unidos específicamente, y detectar la presencia de los anticuerpos unidos específicamente al antígeno que recubre el pocillo. En los ensayos ELISA, el anticuerpo

15 de interés no necesita estar conjugado a un compuesto detectable; en vez de eso, puede añadirse al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce al anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable. Además, en vez de recubrir el pocillo con el antígeno, puede recubrirse el anticuerpo en el pocillo. En este caso, la molécula detectable puede ser el antígeno conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina). Un experto en la técnica tendrá conocimientos en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada así como otras variaciones de ensayos ELISA conocidas en la técnica. Para una discusión adicional referente a ensayos ELISA véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 11.2.1.

Puede usarse un análisis cinético BIAcore para determinar las velocidades de asociación y disociación de la unión

25 (Kd) de anticuerpos de la invención a un antígeno específico. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y la disociación de un antígeno de chips con anticuerpos inmovilizados sobre su superficie. Véase Wu et al., 1999, J. Mol. Biol., 294:151-162. En resumen, se inmoviliza proteína de fusión antígeno-Ig en un chip sensor CM5 activado por (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida) y N-hidroxi-succinimida mediante inyección de antígeno-Ig en acetato de sodio. Se inmoviliza el antígeno-Ig a una baja densidad para prevenir la nueva unión de Fab durante la fase de disociación. Para obtener la constante de la velocidad de asociación (Kon), se determina la velocidad de unión a seis concentraciones de Fab diferentes a una determinada velocidad de flujo. La constante de la velocidad de disociación (Koff) es el promedio de seis medidas obtenidas analizando la fase de disociación. Se analizan sensogramas con el programa BIAevaluation 3.0. Se calcula la Kd a partir de Kd = Koff/Kon. Se elimina el Fab residual tras cada medición mediante disociación prolongada. Preferiblemente, se escogen placas de lisis

35 positivas, vuelven a sembrarse en placa a una densidad inferior y vuelven a examinarse.

La afinidad de unión de un anticuerpo (incluyendo un scFv u otra molécula que comprende, o alternativamente consiste en, fragmentos de anticuerpo o variantes del mismo) a un antígeno y la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno pueden determinarse mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno marcado (por ejemplo, 3H o 121I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno no marcado, y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo y las velocidades de disociación de la unión pueden determinarse a partir de los datos mediante un análisis de gráfico de Scatchard. También puede determinarse la competición con un segundo anticuerpo usando radioinmunoensayos. En este caso, se incuba un

121I)

45 antígeno con un anticuerpo conjugado con un compuesto marcado (por ejemplo, 3H o en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo no marcado.

También pueden usarse otros ensayos, tales como inmunoensayos, incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos usando técnicas tales como inmunotransferencia de tipo Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo sándwich, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación a complemento, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A, para examinar y caracterizar adicionalmente la especificidad de unión de un anticuerpo humanizado. Tales ensayos son rutinarios y se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel

55 et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). A continuación se describen brevemente inmunoensayos a modo de ejemplo (que no se pretende que se interpreten a modo de limitación).

Preferiblemente, se usa un ensayo ELISA como examen secundario con sobrenadante preparado a partir de cultivo bacteriano que expresa fragmentos Fab con el fin de confirmar los clones identificados mediante el ensayo de hibridación de captura. Pueden llevarse a cabo dos ensayos ELISA: (1) Ensayo ELISA de cuantificación: esto puede llevarse a cabo esencialmente tal como se describe en Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212. En resumen, pueden determinarse las concentraciones mediante un ensayo ELISA con anticuerpo anti-Fab humano: se recubren pocillos individuales de una inmunoplaca de Maxisorp de 96 pocillos con 50 ng de un anticuerpo de cabra anti-Fab 65 humano y después se incuban con muestras (Fab expresados en sobrenadante) o patrón (Fab de IgG humana). Después sigue la incubación con un conjugado de anticuerpo de cabra anti-kappa humana con peroxidasa del

rábano (HRP). La actividad de HRP puede detectarse con un sustrato de TMB y la reacción puede extinguirse con H2SO4 0,2 M. Se leen las placas a 450 nm. Entonces se seleccionan los clones que expresan una cantidad detectable de Fab para la siguiente parte del examen secundario. (2) Ensayo ELISA funcional: en resumen, se determina una actividad de unión a antígeno particular mediante el ensayo ELISA basado en antígeno: se recubren

5 pocillos individuales de una inmunoplaca de Maxisorp de 96 pocillos con 50 ng del antígeno de interés, se bloquean con BSA al 1%/Tween 20 al 0,1% y después se incuban con muestras (Fab expresados en sobrenadante). Después sigue la incubación con un conjugado de anticuerpo de cabra anti-kappa humana con peroxidasa del rábano (HRP). La actividad de HRP se detecta con un sustrato de TMB y la reacción se extingue con H2SO4 0,2 M. Se leen las placas a 450 nm.

Generalmente los protocolos de inmunoprecipitación comprenden lisar una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (NP-40 o Triton X- 100 al 1%, desoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,2, Trasylol al 1%) complementado con inhibidores de proteína fosfatasa y/o proteasa (por ejemplo, EDTA, PMSF, 159 aprotinina, vanadato de sodio), añadir el anticuerpo de interés al lisado celular,

15 incubar durante un periodo de tiempo (por ejemplo, hasta 4 horas) a 40ºC, añadir perlas de Sepharose con proteína A y/o proteína G al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 40ºC, lavar las perlas en tampón de lisis y volver a suspender las perlas en SDS/tampón de muestra. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno particular puede evaluarse, por ejemplo, mediante análisis de inmunotransferencia tipo Western. Un experto en la técnica tendrá conocimientos en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para aumentar la unión del anticuerpo a un antígeno y disminuir el fondo (por ejemplo, aclarar previamente el lisado celular con perlas de Sepharose). Para una discusión adicional referente a protocolos de inmunoprecipitación véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en 10.16.1.

25 Generalmente el análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western comprende preparar muestras de proteína, someter a electroforesis las muestras de proteína en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, el 8%-20% de SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, bloquear la membrana en disolución de bloqueo (por ejemplo, PBS con BSA al 3% o leche desnatada), lavar la membrana en tampón de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloquear la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-ser humano) conjugado con un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radiactiva (por ejemplo, 12P o 121I) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, y detectar la presencia del antígeno. Un experto en la técnica

35 tendrá conocimientos en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada y reducir el ruido de fondo. Para una discusión adicional referente a protocolos de inmunotransferencia de tipo Western véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, GinTent Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.8.1.

Un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo modificado (por ejemplo, humanizado) o fragmento del mismo con actividad de unión a antígeno deseada puede caracterizarse mediante secuenciación, tal como secuenciación de didesoxinucleótidos usando un analizador genómico ABI300. Pueden usarse otros inmunoensayos, tales como el examen mediante ensayo ELISA secundario en dos partes descrito anteriormente, para comparar los anticuerpos modificados (por ejemplo, humanizados) entre sí y con el anticuerpo donador en cuanto a la unión a un antígeno de

45 interés particular.

2.8 Producción y caracterización de anticuerpos humanizados

Una vez seleccionados uno o más ácidos nucleicos que codifican para un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo con actividad de unión deseada, puede recuperarse el ácido nucleico mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica. Preferiblemente, se recuperan partículas de fago seleccionadas y se usan para infectar bacterias recientes antes de la recuperación de los ácidos nucleicos deseados.

Un fago que presenta una proteína que comprende una región variable humanizada con una especificidad o afinidad

55 deseada puede eluirse de una matriz de afinidad mediante cualquier método conocido en la técnica. Puede usarse un ligando con mejor afinidad por la matriz. Puede usarse el anticuerpo no humanizado correspondiente. Puede usarse un método de elución que no es específico para el complejo antígeno-anticuerpo.

El método de elución leve usa la unión de la población de anticuerpos de fago a antígeno biotinilado y la unión a perlas magnéticas con estreptavidina. Tras el lavado para eliminar el fago no unido, se eluye el anticuerpo de fago y se usa para infectar células para proporcionar una población de anticuerpos de fago seleccionada. Un enlace disulfuro entre la biotina y la molécula de antígeno permite una elución suave con ditiotreitol. En una realización, puede usarse antígeno biotinilado en exceso, pero a, o por debajo de, una concentración equivalente a la constante de disociación deseada para la unión antígeno-anticuerpo. Este método es ventajoso para la selección de 65 anticuerpos de alta afinidad (R. E. Hawkins, S. J. Russell y G. Winter J. Mol. Biol. 226 889-896, 1992). También pueden seleccionarse anticuerpos para tener velocidades de disociación más lentas para la selección de antígeno

tal como se describe en Hawkins et al, 1992, citado anteriormente. La concentración de antígeno biotinilado puede reducirse gradualmente para seleccionar anticuerpos de fago con afinidad superior. Como alternativa, el anticuerpo de fago puede estar en exceso con respecto al antígeno biotinilado con el fin de que los anticuerpos de fago compitan para la unión, de una manera análoga a la competición de fagos peptídicos por anticuerpo biotinilado

5 descrita por J. K. Scott & G. P. Smith (Science 249 386-390, 1990).

En otra realización, puede introducirse una secuencia de nucleótidos que codifica para aminoácidos que constituyen un sitio de reconocimiento para la escisión mediante una proteasa sumamente específica entre el ácido nucleico foráneo insertado, por ejemplo, entre un ácido nucleico que codifica para un fragmento de anticuerpo, y la secuencia del resto del gen III. Ejemplos no limitativos de tales proteasas sumamente específicas son factor X y trombina. Tras la unión del fago a una matriz de afinidad y la elución para eliminar el fago no unido de manera específica y el fago unido de manera débil, el fago unido de manera fuerte se retirará mediante lavado de la columna con proteasa en condiciones adecuadas para la digestión en el sitio de escisión. Esto escindirá el fragmento de anticuerpo de la partícula de fago eluyendo el fago. Se esperará que este fago no sea eficaz, ya que el único sitio de proteasa debe

15 ser el introducido específicamente. Entonces puede recuperarse el fago unido de manera fuerte infectando, por ejemplo, células TG I de E. coli.

Un procedimiento alternativo al anterior es tomar la matriz de afinidad que ha retenido el pAb unido de manera fuerte y extraer el ADN, por ejemplo sometiendo a ebullición en disolución de SDS. Entonces puede usarse el ADN extraído para transformar directamente células huésped E. coli o alternativamente pueden amplificarse las secuencias que codifican para anticuerpo, por ejemplo usando PCR con cebadores adecuados, y después insertarse en un vector para su expresión como anticuerpo soluble para un estudio adicional o un pAb para ciclos de selección adicionales.

25 Alternativamente, se une una población de fagos a una matriz de afinidad que contiene una baja cantidad de antígeno. Existe competición entre fagos, que presentan proteínas de alta afinidad y de baja afinidad, para la unión al antígeno en la matriz. El fago que presenta proteína de alta afinidad se une de manera preferente y la proteína de baja afinidad se elimina mediante lavado. Entonces se recupera la proteína de alta afinidad mediante elución con el ligando o mediante otros procedimientos que eluyen el fago de la matriz de afinidad (la publicación internacional n.º WO92/01047 demuestra este procedimiento).

El ácido nucleico recuperado que codifica para CDR donadoras y región de entramado humanizada puede usarse en sí mismo o puede usarse para construir ácido nucleico para una molécula de anticuerpo completa uniéndolos a la región constante del molde humano respectivo. Cuando se introducen los ácidos nucleicos que codifican para

35 anticuerpos en una línea de célula huésped adecuada, las células transfectadas pueden secretar anticuerpos con todas las características deseables de anticuerpos monoclonales.

Una vez obtenido un ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo (preferiblemente, que contiene la región variable de cadena pesada o ligera), puede producirse el vector para la producción de la molécula de anticuerpo mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar una proteína mediante expresión de un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo. Pueden usarse métodos que conocen bien los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican para anticuerpo y señales de control transcripcionales y de traducción 45 apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Los vectores replicables pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de anticuerpo de la invención, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, operativamente unida a un promotor La expresión de una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo,

o una CDR de cadena pesada o ligera, puede regularse mediante un promotor constitutivo. Alternativamente, la expresión de una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera se regula mediante un promotor inducible. La expresión de una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un

55 anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera puede regularse mediante un promotor específico de tejido. Tales vectores también pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, la publicación internacional n.º WO 86/05807; la publicación internacional n.º WO 89/01036; y la patente estadounidense n.º 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en un vector de este tipo para la expresión de la totalidad de la cadena pesada, la totalidad de la cadena ligera o la totalidad de las cadenas tanto pesada como la ligera.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y entonces se cultivan las células transfectadas mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo. Por tanto, las células 65 huésped pueden contener un polinucleótido que codifica para un anticuerpo o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o porción del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla, operativamente unido a un

promotor heterólogo. Preferiblemente, para la expresión de anticuerpos de cadena doble, pueden coexpresarse vectores que codifican para las cadenas tanto pesada como ligera en la célula huésped para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, tal como se detalla a continuación.

5 Preferiblemente, la línea celular que se transforma para producir el anticuerpo alterado es una línea celular de mamífero inmortalizada de origen linfoide, incluyendo, pero sin limitarse a, una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma. La línea celular también puede comprender una célula linfoide normal, tal como una célula B, que se ha inmortalizado mediante transformación con un virus, tal como el virus Epstein Barr. Lo más preferiblemente, la línea celular inmortalizada es una línea celular de mieloma o un derivado de la misma.

Se sabe que algunas líneas celulares linfoides inmortalizadas, tales como líneas celulares de mieloma, en su estado normal, secretan cadenas ligera o pesada de inmunoglobulina aisladas. Si se transforma una línea celular de este tipo con el ácido nucleico recuperado de la biblioteca de fagos, no será necesario reconstruir el fragmento recuperado con una región constante, siempre que la cadena normalmente secretada sea complementaria al

15 dominio variable de la cadena de inmunoglobulina codificada por el ácido nucleico recuperado de la biblioteca de fagos.

Aunque la línea celular usada es preferiblemente una línea celular de mamífero, alternativamente puede usarse cualquier otra línea celular adecuada. Estas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión recombinantes de ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias que codifican para anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican para anticuerpo; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias que codifican para 25 anticuerpo; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican para anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NS0 y 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). Preferiblemente, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento principal

35 del gen de promotor intermedio/temprano de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que está expresándose. Por ejemplo, cuando debe producirse una gran cantidad de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan al, vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), en el que la secuencia que codifica para anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región que codifica para lac Z de modo que se produce una proteína de fusión; y vectores pIN (Inouye

45 & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509). También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células sometidas a lisis mediante adsorción y unión a perlas de glutatión agarosa en matriz seguido por la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de trombina o factor Xa proteasa de modo que la diana clonada puede liberarse del resto GST.

En un sistema de insectos, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica para anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de poliedrina) del virus y

55 colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de poliedrina).

En células huésped de mamífero, pueden usarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia que codifica para anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartito. Entonces puede insertarse este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y que puede expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de secuencias que codifican para 65 anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar

la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

5 Además, puede elegirse una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el ácido nucleico de una manera específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea expresada. Para ello, pueden usarse células huésped eucariotas que presentan la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W 138, BT483,

15 Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murina que no produce endógenamente ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O y HsS78Bst.

Para la producción a largo plazo, con alto rendimiento, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse por ingeniería líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, pueden transformarse células huésped con ADN controlado mediante elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN foráneo, puede dejarse que las células diseñadas por ingeniería crezcan durante 1-2 días en unos medios enriquecidos y después se cambian a unos medios selectivos.

25 El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse para dar líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para diseñar por ingeniería líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo. Tales líneas celulares diseñadas por ingeniería pueden ser particularmente útiles en la selección y la evaluación de composiciones que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitarse a, los genes de timidina cinasa de virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:835 17) que pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11(5):155-2 15); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Pueden aplicarse de manera rutinaria métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY

45 (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación con vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo es amplificable, aumentar el nivel de inhibidor presente en el cultivo de célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol.

55 Cell. Biol. 3:257).

La célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión, codificando el primer vector para un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector para un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifica para, y que puede expresar, polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; y Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

65 Los anticuerpos también pueden introducirse en un animal transgénico (por ejemplo, ratón transgénico). Véanse, por

ejemplo, Bruggemann, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 49(3):203-8 (2001); Bruggemann y Neuberger, Immunol. Today 8:391-7 (1996), cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento como referencia. Pueden obtenerse constructos transgénicos o transloci, por ejemplo, mediante ensamblaje de plásmidos, clonación en cromosomas artificiales de levadura y el uso de fragmentos de cromosomas. La integración y el mantenimiento de translocus en cepas de animales transgénicos pueden lograrse mediante inyección de ADN pronuclear en ovocitos y diversos métodos de transfección usando células madre embrionarias.

Por ejemplo, pueden introducirse al azar, o mediante recombinación homóloga, ácidos nucleicos que codifican para cadena pesada y/o ligera humanizada o regiones variables de cadena pesada y/o ligera humanizada en células madre embrionarias de ratón. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de ácidos nucleicos que codifican para anticuerpos humanizados mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH evita la producción de anticuerpo endógeno. Se expanden las células madre embrionarias modificadas y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. Entonces se crían los ratones quiméricos para producir crías homocigotas que expresan anticuerpos humanizados.

Una vez producida una molécula de anticuerpo mediante expresión recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico tras proteína A, y cromatografía en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos

o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias de polipéptido heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.

2.9 Conjugados de anticuerpos

Pueden conjugarse o fusionarse anticuerpos o fragmentos de los mismos con uno o más restos, incluyendo, pero sin limitarse a, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse de manera recombinante o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, preferiblemente con un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. No se necesita necesariamente que la fusión sea directa, sino que puede producirse mediante secuencias de ligador. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares, o bien in vitro o bien in vivo, fusionando o conjugando los anticuerpos con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. También pueden usarse anticuerpos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando métodos conocidos en la técnica. Véanse por ejemplo, la publicación internacional n.º WO 93/21232; patente europea n.º EP 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; patente estadounidense n.º 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.

Las composiciones pueden comprender proteínas, péptidos o polipéptidos heterólogos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, los polipéptidos heterólogos pueden fusionarse o conjugarse con un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, un dominio VH, un dominio VL, una CDR de VH, una CDR de VL o fragmento de los mismos. En la técnica se conocen bien métodos para fusionar o conjugar polipéptidos con porciones de anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; las patentes europeas n.os EP 307.434 y EP 367.166; las publicaciones internacionales n.os WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337.

Pueden generarse proteínas de fusión adicionales mediante las técnicas de intercambio génico, intercambio de motivos, intercambio de exones y/o intercambio codones (denominadas colectivamente “intercambio de ADN”). El intercambio de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades superiores y velocidades de disociación inferiores). Véanse, generalmente, las patentes estadounidenses n.os 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Pueden alterarse anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, sometiéndolos a mutagénesis al azar mediante PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos al azar u otros métodos antes de la recombinación. Pueden recombinarse una o más porciones de un polinucleótido que codifica para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otras, muchas de las cuales están disponibles comercialmente. Tal como se describe en Gentz et al.,

5 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina “HA”, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) y la etiqueta “FLAG”.

En otras realizaciones, pueden conjugarse anticuerpos o fragmentos, análogos o derivados de los mismos con un agente de diagnóstico o detectable. Tales anticuerpos pueden ser útiles para monitorizar o pronosticar el desarrollo

o la progresión de un trastorno como parte de un procedimiento de ensayos clínicos, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Tal diagnóstico y detección puede lograrse acoplando el anticuerpo a sustancias detectables incluyendo, pero sin limitarse a, diversas enzimas, tales como, pero sin limitarse a, peroxidasa del 15 rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero sin limitarse a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero sin limitarse a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radiactivos, tales como, pero sin limitarse a, yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,) y tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 71Se, 113Sn y 117estaño; metales emisores de positrones que usan diversas tomografías de emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radiactivos y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas con

25 radioisótopos específicos.

Pueden conjugarse anticuerpos o fragmentos de los mismos con un resto terapéutico. Puede conjugarse un anticuerpo o fragmento del mismo con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocídico, un agente terapéutico o un ión metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina

o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para células. Los restos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiaminaplatino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), 35 antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), moléculas de auristatina (por ejemplo, auristatina PHE, briostatina 1 y solastatina 10; véase Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)), hormonas (por ejemplo, glucocorticoides, progestinas, andrógenos y estrógenos), inhibidores de enzimas reparadoras del ADN (por ejemplo, etopósido o topotecán), inhibidores de cinasas (por ejemplo, compuesto ST1571, mesilato de imatinib (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)), agentes citotóxicos (por ejemplo, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, procaína, tetracaína, 45 lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos) y los compuestos dados a conocer en las patentes estadounidenses n.os 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, 5.587.459), inhibidores de farnesilo transferasa (por ejemplo, R115777, BMS214662 y los dados a conocer, por ejemplo, por las patentes estadounidenses n.os: 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406.6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6.051.582, 6.051.574 y 6.040.305), inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, 55 camptotecina; irinotecán; SN-38; topotecán; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; rubitecán; pirazoloacridina; XR-5000; saintopina; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN-1518B; KT6006; KT6528; ED110; NB-506; ED-110; NB-506; y rebecamicina); bulgareína; compuestos de unión al surco menor del ADN tales como colorante Hoechst 33342 y colorante Hoechst 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; betalapacona; BC-4-1; bisfosfonatos (por ejemplo, alendronato, cimadronto, clodronato, tiludronato, etidronato, ibandronato, neridronato, olpandronato, risedronato, piridronato, pamidronato, zolendronato), inhibidores de HMG-CoA reductasa (por ejemplo, lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, Lescol, Lupitor, rosuvastatina y atorvastatina) y sales, solvatos, clatrato y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos. Véanse, por ejemplo, Rothenberg, M.L., Annals of Oncology 8:837855(1997); y Moreau, P., et al., J. Med. Chem. 41:1631-1640(1998)), oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, los

65 dados a conocer en las patentes estadounidenses n.os 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033 y 5.618.709), inmunomoduladores (por ejemplo, anticuerpos y citocinas), anticuerpos e inhibidores de adenosina desaminasa (por

ejemplo, fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina).

Además, puede conjugarse un anticuerpo o fragmento del mismo con un resto terapéutico o resto farmacológico que modifica una respuesta biológica dada. No debe interpretarse que los restos terapéuticos o restos farmacológicos 5 estén limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o un polipéptido que presenta una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón 0, interferón 0, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-0, TNF-0, AIM I (véase la publicación internacional n.º WO 97/33899), AIM II (véase la publicación internacional n.º WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574) y VEGI (véase la publicación internacional n.º WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina, endostatina o un componente de la ruta de coagulación (por ejemplo, factor tisular); o, un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL- 6”),

15 factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”) y factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”)), un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento (“GH”)) o un agente de coagulación (por ejemplo, calcio, vitamina K, factores tisulares, tales como, pero sin limitarse a, factor de Hageman (factor XII), quininógeno de alto peso molecular (HMWK), precalicreína (PK), proteínas-factores de coagulación II (protrombina), factor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolípido, fibrinopéptidos A y B de las cadenas 0 y 0 de fibrinógeno, monómero de fibrina).

Además, puede conjugarse un anticuerpo con restos terapéuticos tales como un ión metálico radiactivo, tal como emisores alfa tales como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones metálicos radiactivos, incluyendo, pero sin limitarse a, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, con polipéptidos. En determinadas realizaciones, el

25 quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N’,N”,N”’-tetraacético (DOTA) que puede fijarse al anticuerpo por medio de una molécula ligadora. Tales moléculas ligadoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.

Se conocen técnicas para conjugar restos terapéuticos con anticuerpos, véanse, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2ª ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And 35 Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos tal como se describe por Segal en la patente estadounidense n.º 4.676.980, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.

El fármaco o resto terapéutico conjugado con un anticuerpo o fragmento del mismo debe elegirse para lograr el/los efecto(s) terapéutico(s) o profiláctico(s) deseado(s) para un trastorno particular en un sujeto. Un médico u otro

45 personal médico debe tener en cuenta lo siguiente cuando decida qué fármaco o resto terapéutico conjugar con un anticuerpo o fragmento del mismo: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y el estado del sujeto.

También pueden fijarse anticuerpos a soportes sólidos, lo cual es particularmente útil para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.

2.10 Usos de los anticuerpos de la invención

55 La presente invención proporciona métodos de humanización eficaz de un anticuerpo de interés. Los anticuerpos humanizados obtenidos mediante un método de la presente invención pueden usarse solos o en combinación con otros agentes profilácticos o terapéuticos para tratar, gestionar, prevenir o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

Los métodos para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno pueden comprender administrar a un sujeto que lo necesita uno o más anticuerpos solos o en combinación con una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de un anticuerpo obtenido mediante un método de la invención. Las composiciones pueden comprender uno o más anticuerpos y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención y métodos de prevención, gestión, tratamiento o 65 mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo usando dichas composiciones. Los agentes terapéuticos o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, fármacos sintéticos, péptidos, polipéptidos,

proteínas, ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos de ADN y ARN incluyendo, pero sin limitarse a, secuencias de nucleótidos antisentido, hélices triples, iARN y secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas, polipéptidos

o péptidos biológicamente activos), anticuerpos, moléculas inorgánicas sintéticas o naturales, agentes miméticos y moléculas orgánicas sintéticas o naturales.

5 Cualquier terapia que se sabe que es útil o que se ha usado o está usándose actualmente para la prevención, gestión, tratamiento o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo puede usarse en combinación con un anticuerpo obtenido mediante un método de la invención tal como se describe en el presente documento. Véanse, por ejemplo, Gilman et al., Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10ª ed., McGraw-Hill, Nueva York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D. et al. (eds.), 17ª Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999; Cecil Textbook of Medicine, 20ª Ed., Bennett y Plum (eds.), W.B. Saunders, Filadelfia, 1996 para información referente a terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) que se han usado o están usándose actualmente para prevenir, tratar, gestionar o mejorar un trastorno

o uno o más síntomas del mismo. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes

15 inmunomoduladores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, adrenocorticoides, corticosteroides (por ejemplo, beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, hidrocortisona), glucocorticoides, esteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, diclofenac e inhibidores de COX-2), analgésicos, antagonistas de leucotrieno (por ejemplo, montelukast, metil-xantinas, zafirlukast y zileutón), agonistas beta2 (por ejemplo, albuterol, biterol, fenoterol, isoetarina, metaproterenol, pirbuterol, salbutamol, terbutalina-formoterol, salmeterol y salbutamol-terbutalina), agentes anticolinérgicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), sulfasalazina, penicilamina, dapsona, antihistamínicos, agentes contra la malaria (por ejemplo, hidroxicloroquina), agentes antivirales y antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, eritromicina, penicilina, mitramicina y antramicina (AMC)).

25 Los anticuerpos humanizados obtenidos mediante un método de la invención pueden usarse directamente contra un antígeno particular. Los anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención pueden pertenecer a una subclase o isotipo que puede mediar en la lisis de células a las que se une el anticuerpo. Los anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención pueden pertenecer a una subclase o isotipo que, tras complejarse con proteínas de superficie celular, activa el complemento del suero y/o media en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) activando células efectoras tales como linfocitos citolíticos naturales o macrófagos.

Se sabe que las actividades biológicas de anticuerpos están determinadas, en gran medida, por los dominios constantes o la región Fc de la molécula de anticuerpo (Uananue y Benacerraf, Textbook of Immunology, 2ª edición,

35 Williams & Wilkins, pág. 218 (1984)). Esto incluye su capacidad para activar el complemento y para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) tal como realizan los leucocitos. Anticuerpos de diferentes clases y subclases se diferencian en este aspecto, al igual que lo hacen los anticuerpos de la misma subclase pero diferente especie; según la presente invención, se preparan anticuerpos de las clases que tienen la actividad biológica deseada. La preparación de estos anticuerpos implica la selección de dominios constantes de anticuerpo y su incorporación en el anticuerpo humanizado mediante una técnica conocida. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de ratón de la clase IgG3 e IgG2a pueden activar el complemento del suero tras la unión a las células diana que expresan el antígeno análogo, y por tanto los anticuerpos humanizados que incorporan funciones efectoras de IgG3 e IgG2a son deseables para determinadas aplicaciones terapéuticas.

45 En general, los anticuerpos de ratón de la subclase de IgG2a e IgG3 y ocasionalmente IgG1 pueden mediar en la ADCC, y los anticuerpos de las subclases IgG3, IgG2a e IgM se unen y activan el complemento del suero. La activación del complemento requiere generalmente la unión de al menos dos moléculas de IgG en estrecha proximidad en la célula diana. Sin embargo, la unión de sólo una molécula de IgM activa el complemento del suero.

Puede someterse a ensayo la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar en la lisis de la célula diana mediante activación del complemento y/o ADCC. Se hacen crecer las células de interés y se marcan in vitro; se añade el anticuerpo al cultivo celular en combinación o bien con complemento del suero o bien con células inmunitarias que pueden activarse mediante los complejos de antígeno-anticuerpo. Se detecta la citolisis de las células diana mediante la liberación del marcador de las células lisadas. De hecho, pueden examinarse anticuerpos

55 usando el suero del propio paciente como fuente de complemento y/o células inmunitarias. Entonces puede usarse terapéuticamente en ese paciente particular el anticuerpo que puede activar el complemento o mediar en la ADCC en la prueba in vitro.

Puede preferirse el uso de anticuerpos de IgM para determinadas aplicaciones, sin embargo puede que las moléculas de IgG, al ser más pequeñas, puedan localizar determinados tipos de células infectadas mejor que las moléculas de IgM.

En algunas realizaciones, los anticuerpos obtenidos mediante un método de esta invención son útiles en la inmunización pasiva de pacientes.

65 También pueden usarse los anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención en ensayos de diagnóstico o bien in vivo o bien in vitro para la detección/identificación de la expresión de un antígeno en un sujeto o una muestra biológica (por ejemplo, células o tejidos). Se facilitan ejemplos no limitativos de uso de un anticuerpo, un fragmento del mismo o una composición que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo en un ensayo de diagnóstico en las patentes estadounidenses n.os 6.392.020; 6.156.498; 6.136.526; 6.048.528; 6.015.555; 5.833.988; 5.811.310;

5 8 5.652.114; 5.604.126; 5.484.704; 5.346.687; 5.318.892; 5.273.743; 5.182.107; 5.122.447; 5.080.883; 5.057.313; 4.910.133; 4.816.402; 4.742.000; 4.724.213; 4.724.212; 4.624.846; 4.623.627; 4.618.486; 4.176.174. Los ensayos de diagnóstico adecuados para el antígeno y sus anticuerpos dependen del anticuerpo particular usado. Ejemplos no limitativos son ensayo ELISA, ensayo de tipo sándwich y ensayos de inhibición estérica. Para ensayos de diagnóstico in vivo, pueden conjugarse los anticuerpos con un marcador que puede detectarse mediante técnicas de obtención de imágenes, tales como rayos X, tomografía axial computerizada (TAC), ecografía u obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM). Los anticuerpos también pueden usarse para la purificación por afinidad del antígeno a partir de cultivo de células recombinantes u otras fuentes naturales.

2.11 Administración y formulaciones

15 Las composiciones que comprenden anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención son adecuadas para su uso en el diagnóstico, detección o monitorización de un trastorno, en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo y/o en investigación. Una composición puede comprender uno o más anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención. Una composición puede comprender uno o más anticuerpos obtenidos mediante un método de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de tales anticuerpos. Preferiblemente, se sabe que los agentes profilácticos o terapéuticos son útiles para, o se han usado o están usándose actualmente en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. Según estas realizaciones, la composición puede comprender además un portador, diluyente o excipiente.

25 Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones de fármacos a granel útiles en la preparación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para su administración a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas farmacéuticas unitarias. Tales composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente profiláctico y/o terapéutico dado a conocer en el presente documento o una combinación de esos agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones son composiciones farmacéuticas y comprenden una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención, un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, una cantidad eficaz de otro agente profiláctico o terapéutico.

35 La composición farmacéutica puede formularse como una forma farmacéutica oral o no oral, para liberación inmediata o prolongada. La composición puede comprender componentes inactivos habitualmente usados en la preparación farmacéutica tales como diluyentes, cargas, disgregantes, edulcorantes, lubricantes y aromatizantes. La composición farmacéutica se formula preferiblemente para su administración intravenosa, o bien mediante inyección en bolo o bien mediante goteo sostenido, o para liberación a partir de una cápsula implantada. Una formulación típica para administración intravenosa usa solución salina fisiológica como diluyente.

También pueden usarse porciones Fab o Fab’ de los anticuerpos producidos mediante un método de la invención como principio activo terapéutico. La preparación de estos fragmentos de anticuerpo se conoce bien en la técnica.

45 La composición también puede incluir material impreso que describe las indicaciones clínicas para las que pueden administrarse los anticuerpos como agente terapéutico, calendarios y cantidades de dosificación y/o contraindicaciones para la administración de los anticuerpos a un paciente.

Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones de fármaco a granel útiles en la preparación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para su administración a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas farmacéuticas unitarias. Tales composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente profiláctico y/o terapéutico dado a conocer en el presente documento o una

55 combinación de esos agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones son composiciones farmacéuticas y comprenden una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos, un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, una cantidad eficaz de otro agente profiláctico o terapéutico.

El término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o indicada en la farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto)), excipiente o vehículo en el que está contenido o con el que se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de

65 semilla de soja, aceite mineral o aceite de sésamo. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua o etanol. Si se desea, la composición también puede contener cantidades minoritarias

5 de agentes humectantes o emulsionantes o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos o formulaciones de liberación sostenida.

Generalmente, los componentes de composiciones de la invención o bien se suministran por separado o bien se mezclan juntos en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición debe administrarse por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de solución salina o agua estéril para inyección de modo que pueden mezclarse

15 los componentes antes de la administración.

Las composiciones pueden formularse como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar uno o más anticuerpos o la combinación de uno o más anticuerpos y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, 25 micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos de administración de un agente profiláctico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). Además, puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las publicaciones PCT n.os WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903. Un anticuerpo de la invención, terapia de combinación o una

35 composición de la invención se administran usando la tecnología de administración pulmonar de fármacos Alquermes AIR™ (Alquermes, Inc., Cambridge, MA). Se administran agentes profilácticos o terapéuticos por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos por vía local a la zona que necesita el tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local, mediante inyección

45 o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®) o matrices de colágeno. Se administra una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos por vía local a la zona afectada a un sujeto para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra realización, se administra una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos por vía local a la zona afectada en combinación con una cantidad eficaz de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintas de un anticuerpo a un sujeto para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

El agente profiláctico o terapéutico puede administrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. En una realización, puede usarse una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase 55 Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Pueden usarse materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias (véanse por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véanse también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); patente estadounidense n.º 5.679.377; patente estadounidense n.º 5.916.597; patente estadounidense n.º 5.912.015; patente estadounidense n.º 5.989.463; patente estadounidense n.º 5.128.326; publicación PCT n.º WO 99/15154; y publicación PCT n.º WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan 65 a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicolidas (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico),

poliacrilamida, polietilenglicol, polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA) y poliortoésteres. El polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, está libre de impurezas lixiviables, es estable en almacenamiento, estéril y biodegradable. Un sistema de liberación controlada o sostenida puede situarse en proximidad de la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo así tan sólo una fracción de la dosis sistémica (véase,

5 por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)).

Se comentan sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Puede usarse cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.526.938, publicación PCT WO 91/05548, publicación PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel”, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions”, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers

15 for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery”, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.

Cuando la composición es un ácido nucleico que codifica para un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se vuelve intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente estadounidense n.º 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes

25 transfectantes, o administrándolo en unión con un péptido de tipo caja homeótica que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de célula huésped para su expresión mediante recombinación homóloga.

Una composición farmacéutica se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa y rectal. La composición se formula según procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos.

35 Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.

Si las composiciones deben administrarse por vía tópica, las composiciones pueden formularse en forma de una pomada, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, pulverización, aerosol, disolución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19ª ed., Mack Pub. Co., Easton, PA (1995). Para formas farmacéuticas tópicas no pulverizables, normalmente se emplean formas de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad

45 dinámica preferiblemente superior a la del agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, disoluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, linimentos o ungüentos, que, si se desea, están esterilizadas o mezcladas con agentes auxiliares (por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales) para influir sobre diversas propiedades, tales como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas farmacéuticas tópicas adecuadas incluyen preparaciones de aerosol pulverizables en las que el principio activo, preferiblemente en combinación con un portador inerte sólido o líquido, se envasa en una mezcla con un compuesto volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, tal como Freon) o en un frasco exprimible. También pueden añadirse agentes de humectación o humectantes a composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas si se desea. En la técnica se conocen bien ejemplos de tales componentes adicionales.

55 Si el método comprende la administración intranasal de una composición, la composición puede formularse en forma de aerosol, pulverización, niebla o en forma de gotas. En particular, pueden administrarse convenientemente agentes profilácticos o terapéuticos en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos (compuestos, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

65 Si el método comprende la administración oral, pueden formularse composiciones por vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, cachets, cápsulas de gelatina, disoluciones o suspensiones. Pueden prepararse

comprimidos o cápsulas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o 5 glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de, pero sin limitarse a, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, phidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales de tampón, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral

15 pueden formularse de manera adecuada para una liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de un(os) agente(s) profiláctico(s) o terapéutico(s).

El método puede comprender la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las publicaciones PCT n.os WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Un anticuerpo, terapia de combinación y/o composición puede administrarse usando la tecnología de administración pulmonar de fármacos Alquermes AIR™ (Alquermes, Inc., Cambridge, MA).

25 El método puede comprender la administración de una composición formulada para la administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua). Pueden presentarse formulaciones para inyección en forma farmacéutica unitaria (por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de su uso.

Los métodos pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como

35 preparaciones de depósito. Tales formulaciones de larga duración pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles (por ejemplo, como una sal moderadamente soluble).

Los métodos abarcan administración de composiciones formuladas como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

45 Generalmente, los componentes de composiciones se suministran o bien por separado o bien mezclados entre sí en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando el modo de administración es infusión, la composición puede dispensarse con un frasco de infusión que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando el modo de administración es mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de solución salina o agua para inyección estéril de modo que los componentes pueden mezclarse antes de la administración.

Uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas, pueden envasarse en un

55 recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad del agente. Uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas, pueden suministrarse como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado y pueden reconstituirse (por ejemplo, con agua o solución salina) hasta la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferiblemente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas se suministra como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente sellado a una dosificación unitaria de al menos 5 mg, más preferiblemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o las composiciones farmacéuticas deben almacenarse a entre 2ºC y 8ºC en su recipiente original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas, deben administrarse en el plazo de

65 1 semana, preferiblemente en el plazo de 5 días, en el plazo de 72 horas, en el plazo de 48 horas, en el plazo de 24 horas, en el plazo de 12 horas, en el plazo de 6 horas, en el plazo de 5 horas, en el plazo de 3 horas o en el

plazo de 1 hora tras haberse reconstituido. Alternativamente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas se suministra en forma líquida en un recipiente herméticamente sellado que indica la cantidad y concentración del agente. Preferiblemente, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente herméticamente sellado de al menos 0,25 mg/ml, más preferiblemente al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida debe almacenarse a entre 2ºC y 8ºC en su recipiente original.

Generalmente, los componentes de las composiciones se derivan de un sujeto que tiene el mismo origen de especie o reactividad de especie que el receptor de tales composiciones. Por tanto, se administran anticuerpos humanos o humanizados a un paciente humano para la terapia o profilaxis.

2.11.1 Terapia génica

Se administran secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para un anticuerpo u otro agente profiláctico o terapéutico para tratar, prevenir, gestionar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo a modo de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta terapia, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo o agente profiláctico o terapéutico codificado que media en un efecto profiláctico o terapéutico.

Puede usarse cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la técnica. Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo de 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Se describen métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

El método comprende la administración de una composición que comprende ácidos nucleicos que codifican para anticuerpos u otro agente profiláctico o terapéutico, siendo dichos ácidos nucleicos parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo, otro agente profiláctico o terapéutico, o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas pesada o ligera del mismo en un huésped adecuado. En particular, tales ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, operativamente unidos a la región que codifica para anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. Pueden usarse moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias codificantes de un anticuerpo u otro agente profiláctico o terapéutico y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican para anticuerpo (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438). El anticuerpo expresado u otro agente profiláctico o terapéutico puede ser un anticuerpo de cadena sencilla; alternativamente, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican para las cadenas tanto pesada como ligera, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo u otro agente profiláctico o terapéutico.

La administración de los ácidos nucleicos a un sujeto puede ser o bien directa, en cuyo caso se expone el sujeto directamente al ácido nucleico o a vectores que portan ácido nucleico, o bien indirecta, en cuyo caso en primer lugar se transforman células con los ácidos nucleicos in vitro, después se trasplantan en el sujeto. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

Las secuencias de ácido nucleico pueden administrarse directamente in vivo, en el que se expresan para producir el producto codificado. Esto puede lograrse mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolas como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante infección usando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (véase la patente estadounidense n.º 4.980.286), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolo unido a un péptido que se sabe que entra en el núcleo, administrándolo unido a un ligando propenso a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (que puede usarse para seleccionar como diana tipos de células que expresan específicamente los receptores). Alternativamente, pueden formarse complejos ácido nucleico-ligando en los que el ligando comprende un péptido viral fusogénico para romper endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. Aún adicionalmente, puede dirigirse el ácido nucleico in vivo para la captación y expresión específica de células, seleccionando como diana un receptor específico (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.os WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; y WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para su expresión, mediante recombinación homóloga (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

Pueden usarse vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para un anticuerpo, otro agente profiláctico o terapéutico, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (véase Miller et al., 1993, Met. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios

5 para el correcto empaquetamiento del genoma viral e la integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo u otro agente profiláctico o terapéutico que van a usarse en terapia génica se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración del gen al interior de un sujeto. Pueden encontrarse más detalles sobre vectores retrovirales en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdr1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.

15 Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de manera natural los epitelios respiratorios en los que provocan una enfermedad leve. Otras dianas para sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de poder infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 presentan una revisión de terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos Rhesus. Pueden encontrarse otros casos del uso de adenovirus en terapia génica en Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; publicación PCT W094/12649; y Wang et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783. También se

25 ha propuesto el virus adenoasociado (AAV) para su uso en terapia génica (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300; y patente estadounidense n.º 5.436.146).

Otro enfoque a la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivo tisular mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Habitualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Entonces se someten las células a selección para aislar las células que han captado y están expresando el gen transferido. Entonces se administran esas células a un sujeto.

En este método, se introduce el ácido nucleico en una célula antes de la administración in vivo de la célula

35 recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o de bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes foráneos en las células (véanse, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993, Met. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Met. Enzymol. 217:618-644; Clin. Pharma. Ther. 29:69-92 (1985)) y pueden usarse, siempre que no se alteren las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que pueda expresarse el ácido nucleico por la célula y preferiblemente pueda heredarse y expresarse por su progenie celular.

45 Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un sujeto mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células considerada para su uso depende de varios factores incluyendo, pero sin limitarse a, los efectos deseados y el estado del paciente, y puede determinarse por un experto en la técnica.

Las células en las que puede introducirse un ácido nucleico para fines de terapia génica abarcan cualquier tipo de célula deseado, disponible, e incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos,

55 macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, tal como se obtienen de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.). Preferiblemente, la célula usada para terapia génica es autóloga para el sujeto.

Cuando se usan células recombinantes en terapia génica, pueden introducirse secuencias de ácido nucleico que codifican para un anticuerpo o fragmento del mismo en las células de tal manera que pueden expresarse por las células o su progenie, y entonces se administran las células recombinantes in vivo para obtener el efecto terapéutico. Pueden usarse células madre o progenitoras. Potencialmente puede usarse cualquier célula madre y/o progenitora que pueda aislarse y mantenerse in vitro (véanse por ejemplo, la publicación PCT WO 94/08598;

65 Stemple y Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985; Rheinwald, 1980, Met. Cell Bio. 21A:229; y Pittelkow y Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771).

El ácido nucleico que va a introducirse con fines de terapia génica comprende un promotor inducible operativamente unido a la región codificante, de tal manera que puede controlarse la expresión del ácido nucleico controlando la presencia o ausencia del inductor de transcripción apropiado.

2.12 Dosificación y frecuencia de administración

La cantidad de un agente profiláctico o terapéutico o una composición que será eficaz en el tratamiento, gestión, prevención o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo puede determinarse mediante métodos clínicos convencionales. La frecuencia y dosificación variarán según factores específicos para cada paciente dependiendo de la terapia o terapias específicas (por ejemplo, el agente o los agentes terapéuticos o profilácticos específicos) administradas, la gravedad del trastorno, enfermedad o estado, la vía de administración, así como la edad, peso corporal, respuesta, el estado inmunitario del paciente y la historia clínica anterior del paciente. Por ejemplo, la dosificación de un agente profiláctico o terapéutico o una composición que será eficaz en el tratamiento,

15 prevención, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo puede determinarse administrando la composición a un modelo animal tal como, por ejemplo, los modelos animales dados a conocer en el presente documento o conocidos por los expertos en la técnica. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. Un experto en la técnica puede seleccionar regímenes adecuados considerando tales factores y siguiendo, por ejemplo, dosificaciones notificadas en la bibliografía y recomendadas en el Physician’s Desk Reference (57ª ed., 2003).

La toxicidad y/o eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50%

25 de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren terapias que muestran grandes índices terapéuticos. Aunque pueden usarse terapias que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija tales agentes al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el posible daño a células no infectadas y así reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para su uso en seres humanos. La dosificación de tales agentes se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo

35 de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración usada. Para cualquier terapia usada, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

Para péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión y anticuerpos, la dosificación administrada a un paciente es normalmente de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificación

45 administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos y humanizados tienen una semivida más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmunitaria frente a los polipéptidos foráneos. Por tanto, con frecuencia son posibles dosificaciones menores de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente.

Las dosis a modo de ejemplo de una molécula pequeña incluyen cantidades de miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de sujeto o peso de muestra (por ejemplo, de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo o de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a

55 aproximadamente 50 microgramos por kilogramo).

Las dosificaciones de agentes profilácticos o terapéuticos se describen en el Physicians’ Desk Reference (56ª ed., 2002).

2.13 Ensayos biológicos

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos producidos mediante métodos de la presente invención pueden caracterizarse de una variedad de maneras bien conocidas por un experto en la técnica. En particular, pueden someterse a ensayo tales anticuerpos o fragmentos de los mismos para determinar la capacidad para unirse 65 inmunoespecíficamente a un antígeno. Un ensayo de este tipo puede realizarse en disolución (por ejemplo, Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421), con perlas (Lam, 1991, Nature 354:82 84), con chips (Fodor, 1993,

Nature 364:555 556), con bacterias (patente estadounidense n.º 5.223.409), con esporas (patentes estadounidenses

n.os 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), con plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869) o con fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386 390; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310). Entonces pueden someterse a ensayo los anticuerpos o fragmentos de los

5 mismos que se han identificado para determinar su especificidad y afinidad.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden someterse a ensayo para determinar la unión inmunoespecífica a un antígeno específico y la reactividad cruzada con otros antígenos mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión inmunoespecífica y la reactividad cruzada 10 incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como inmunotransferencias de tipo Western, radioinmunoensayos, ensayo ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación a complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes o inmunoensayos de proteína

15 A. Tales ensayos son rutinarios y se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Se describen brevemente inmunoensayos a modo de ejemplo en la sección 5.6.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden someterse a ensayo para determinar su capacidad

20 para inhibir la unión de un antígeno a su receptor de célula huésped usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden ponerse en contacto células que expresan un receptor con un ligando para ese receptor en presencia o ausencia de un anticuerpo o fragmento del mismo que es un antagonista del ligando y puede medirse la capacidad del anticuerpo o fragmento del mismo para inhibir la unión del ligando, por ejemplo, mediante citometría de flujo o un ensayo de centelleo. Pueden marcarse el ligando o el anticuerpo o fragmento de

25 anticuerpo con un compuesto detectable tal como un marcador radiactivo (por ejemplo, 32P, 35S y 125I) o un marcador fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, alofococianina, oftaldehído y fluorescamina) para permitir la detección de una interacción entre el ligando y su receptor. Alternativamente, la capacidad de anticuerpos o fragmentos de los mismos para inhibir que un ligando se una a su receptor puede determinarse en ensayos libres de célula. Por ejemplo, puede ponerse en contacto un ligando con un

30 anticuerpo o fragmento del mismo que es un antagonista del ligando y puede determinare la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para inhibir que el ligando se una a su receptor. Preferiblemente, se inmoviliza el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que es un antagonista del ligando sobre un soporte sólido y se marca el ligando con un compuesto detectable. Alternativamente, se inmoviliza el ligando sobre un soporte sólido y se marca el anticuerpo o fragmento del mismo con un compuesto detectable. Un ligando puede estar parcial o completamente

35 purificado (por ejemplo, parcial o completamente libre de otros polipéptidos) o ser parte de un lisado celular. Alternativamente, puede biotinilarse un ligando usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, IL).

Un anticuerpo o un fragmento del mismo construido y/o identificado según la presente invención puede someterse a

40 prueba in vitro y/o in vivo para determinar su capacidad para modular la actividad biológica de células. Tal capacidad puede evaluarse, por ejemplo, detectando la expresión de antígenos y genes; detectando la proliferación de células; detectando la activación de moléculas de señalización (por ejemplo, factores de transducción de señales y cinasas); detectando la función efectora de células; o detectando la diferenciación de células. Pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la técnica para medir estas actividades. Por ejemplo, puede someterse a ensayo la

45 proliferación celular mediante ensayos de incorporación de 3H-timidina y recuentos celulares con azul trípano. Puede someterse a ensayo la expresión de antígenos, por ejemplo, mediante inmunoensayos incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como inmunotransferencias de tipo Western, inmunohistoquímica, radioinmunoensayos, ensayo ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con

50 precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación a complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y análisis FACS. La activación de moléculas de señalización puede someterse a ensayo, por ejemplo, mediante ensayos de cinasas y ensayos de desplazamiento electroforético (EMSA).

55 Preferiblemente, los anticuerpos, fragmentos de los mismos o composiciones se someten a prueba in vitro y después in vivo para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, los ensayos que pueden usarse para determinar si la administración de una composición farmacéutica específica es indicada incluyen ensayos de cultivo celular en los que se hace crecer una muestra tisular de un paciente en cultivo y se expone a, o se pone de otro modo en contacto con, una composición farmacéutica, y se

60 observa el efecto de tal composición sobre la muestra tisular. La muestra tisular puede obtenerse mediante biopsia del paciente. Esta prueba permite la identificación de la terapia terapéuticamente más eficaz (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) para cada paciente individual. En diversas realizaciones específicas, pueden llevarse a cabo ensayos in vitro con células representativas de tipos celulares implicados en un trastorno particular para determinar si una composición farmacéutica tiene un efecto deseado sobre tales tipos celulares. Por ejemplo, puede

65 llevarse a cabo un ensayo in vitro con líneas celulares.

Puede monitorizarse/evaluarse el efecto de un anticuerpo, un fragmento del mismo o una composición sobre recuentos de linfocitos de sangre periférica usando técnicas convencionales conocidas por un experto en la técnica. Pueden determinarse recuentos de linfocitos de sangre periférica en un sujeto, por ejemplo, obteniendo una muestra de sangre periférica de dicho sujeto, separando los linfocitos de otros componentes de sangre periférica tales como 5 plasma usando, por ejemplo, centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia), y contando los linfocitos usando azul trípano. Pueden determinarse recuentos de células T de sangre periférica en un sujeto, por ejemplo, separando los linfocitos de otros componentes de sangre periférica tales como plasma usando, por ejemplo, un uso de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia), marcando las células T con un anticuerpo dirigido a un antígeno de célula T que está conjugado a FITC o ficoeritrina, y midiendo el número de células T mediante FACS.

Los anticuerpos, fragmentos o composiciones usados para tratar, gestionar, prevenir o mejorar una infección viral o uno o más síntomas de la misma pueden someterse a prueba para determinar su capacidad para inhibir la replicación viral o reducir la carga viral en ensayos in vitro. Por ejemplo, puede someterse a ensayo la replicación viral mediante un ensayo de placas de lisis tal como se describe, por ejemplo, por Johnson et al., 1997, Journal of

15 Infectious Diseases 176:1215-1224 176:1215-1224. También pueden someterse a ensayo los anticuerpos o fragmentos de los mismos administrados tal como se describe en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir o regular por disminución la expresión de polipéptidos virales. Para medir la expresión de polipéptidos virales pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, análisis por inmunotransferencia de tipo Western, análisis por transferencia de tipo Northern y RT-PCR.

Los anticuerpos, fragmentos o composiciones usados para tratar, gestionar, prevenir o mejorar una infección bacteriana o uno o más síntomas de la misma pueden someterse a prueba en ensayos in vitro que se conocen bien en la técnica. También pueden usarse ensayos in vitro conocidos en la técnica para someter a prueba la existencia o el desarrollo de resistencia de bacterias a una terapia. Tales ensayos in vitro se describen en Gales et al., 2002,

25 Diag. Nicrobiol. Infect. Dis. 44(3):301-311; Hicks et al., 2002, Clin. Microbiol. Infect. 8(11): 753-757; y Nicholson et al., 2002, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 44(1): 101-107.

Los anticuerpos, fragmentos o composiciones usados para tratar, gestionar, prevenir o mejorar una infección fúngica

o uno o más síntomas de la misma pueden someterse a prueba para determinar la actividad antifúngica contra diferentes especies de hongos. Puede usarse cualquiera de los ensayos antifúngicos convencionales bien conocidos en la técnica para evaluar la actividad antifúngica de una terapia. Puede someterse a prueba el efecto antifúngico sobre diferentes especies de hongos. Pueden usarse las pruebas recomendadas por el National Committee for Clinical Laboratories (NCCLS) (véase National Committee for Clinical Laboratories Standards. 1995, Proposed Standard M27T. Villanova, Pa.) y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica (Pfaller et al., 1993,

35 Infectious Dis. Clin. N. Am. 7: 435-444) para evaluar el efecto antifúngico de una terapia. También pueden determinarse las propiedades antifúngicas de una terapia a partir de un ensayo de lisis fúngico, así como mediante otros métodos, incluyendo, entre otros, ensayos de inhibición del crecimiento, ensayos de viabilidad fúngica basados en fluorescencia, análisis de citometría de flujo y otros ensayos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, puede someterse a prueba la actividad antifúngica de una terapia usando métodos de macrodilución y/o métodos de microdilución usando protocolos bien conocidos para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Clancy et al., 1997 Journal of Clinical Microbiology, 35(11): 2878-82; Ryder et al., 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42(5): 1057-61; documentos US 5.521.153; US 5.883.120, US 5.521.169). En resumen,

45 se cultiva una cepa fúngica en unos medios líquidos apropiados y se hace crecer a una temperatura apropiada, dependiendo de la cepa fúngica particular usada durante un periodo de tiempo determinado, que también depende de la cepa fúngica particular usada. Entonces se prepara fotométricamente un inóculo y se hace corresponder la turbidez de la suspensión con la de un patrón, por ejemplo, un patrón de McFarland. El efecto de una terapia sobre la turbidez del inóculo se determina visual o espectrofotométricamente. Se determina la concentración inhibitoria mínima (“CIM”) de la terapia, que se define como la menor concentración del compuesto líder que previene el crecimiento visible de un inóculo según se mide determinando la turbidez del cultivo.

También puede determinarse la actividad antifúngica de una terapia usando ensayos colorimétricos bien conocidos por un experto en la técnica. Un ensayo colorimétrico a modo de ejemplo que puede usarse para evaluar la actividad

55 antifúngica de una terapia se describe por Pfaller et al. (1994, Journal of Clinical Microbiology, 32(8): 1993-6; véase también Tiballi et al., 1995, Journal of Clinical Microbiology, 33(4): 915-7). Este ensayo emplea un criterio de valoración colorimétrico usando un indicador de oxidación-reducción (Alamar Biosciences, Inc., Sacramento CA).

También puede determinarse la actividad antifúngica de una terapia usando ensayos fotométricos bien conocidos por un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Clancy et al., 1997 Journal of Clinical Microbiology, 35(11): 287882; Jahn et al., 1995, Journal of Clinical Microbiology, 33(3): 661-667). Este ensayo fotométrico se basa en cuantificar la respiración mitocondrial de hongos viables mediante la reducción de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) para dar formazán. Las CIM determinadas mediante este ensayo se definen como la mayor concentración de la terapia de prueba asociada con la primera disminución abrupta de la densidad

65 óptica. La terapia puede someterse a ensayo para determinar la actividad antifúngica usando ensayos de macrodilución, microdilución y MTT en paralelo.

Además, puede usarse cualquier ensayo in vitro conocido por los expertos en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de una terapia con anticuerpos dada a conocer en el presente documento para un trastorno particular o uno o más síntomas del mismo.

5 Los anticuerpos, composiciones o terapias de combinación pueden someterse a ensayo en sistemas de modelo animal adecuados antes de su uso en seres humanos. Tales sistemas de modelo animal incluyen, pero no se limitan a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Puede usare cualquier sistema animal bien conocido en la técnica. Varios aspectos del procedimiento pueden variar; dichos aspectos incluyen, pero no se limitan, al régimen temporal de administración de las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos) tanto si tales terapias se administran por separado o como una mezcla, y la frecuencia de administración de las terapias.

Pueden usarse modelos animales para evaluar la eficacia de los anticuerpos, fragmentos de los mismos o 15 composiciones para tratar, gestionar, prevenir o mejorar un trastorno particular o uno o más síntoma del mismo.

Puede someterse a prueba la administración de anticuerpos, generados según los métodos de la invención, o composiciones o terapias de combinación que comprenden tales anticuerpos, para determinar su capacidad para disminuir el transcurso en el tiempo de un trastorno particular en al menos el 25%, preferiblemente al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 75%, al menos el 85%, al menos el 95% o al menos el 99%. También pueden someterse a prueba los anticuerpos, composiciones o terapias de combinación para determinar su capacidad para aumentar el periodo de supervivencia de seres humanos que padecen un trastorno particular en al menos el 25%, preferiblemente al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 75%, al menos el 85%, al menos el 95% o al menos el 99%. Además, pueden someterse a prueba anticuerpos, composiciones o terapias de combinación para

25 determinar su capacidad para reducir el periodo de hospitalización de seres humanos que padecen infección respiratoria viral en al menos el 60%, preferiblemente al menos el 75%, al menos el 85%, al menos el 95% o al menos el 99%. Pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la técnica para analizar la función de los anticuerpos, composiciones o terapias de combinación in vivo.

Además, puede usarse cualquier ensayo in vivo conocido por los expertos en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de un anticuerpo, un fragmento del mismo, una composición, una terapia de combinación dada a conocer en el presente documento para un trastorno particular o uno o más síntomas del mismo.

Puede determinarse la toxicidad y/o eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos mediante procedimientos

35 farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren terapias que muestran índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse terapias que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija tales agentes al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el posible daño a células no infectadas y así reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para su uso en seres

45 humanos. La dosificación de tales agentes se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración usada. Para cualquier terapia usada en un método descrito en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

55 2.14 Kits

Los kits pueden comprender sub-bancos de regiones de entramado de anticuerpo de una especie de interés o pueden comprender sub-bancos de CDR de una especie de interés. Los kits pueden comprender sub-bibliotecas combinatorias que comprenden una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para una región de entramado (por ejemplo, FR1) fusionada en marco con una CDR correspondiente (por ejemplo, CDR1). Los kits pueden comprender bibliotecas combinatorias que comprenden una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos, codificando cada secuencia de nucleótidos para las regiones de entramado y CDR fusionadas en marco (por ejemplo, FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3+CDR3+FR4).

65 Los kits pueden comprender sub-bancos de regiones de entramado de inmunoglobulina humana, sub-bancos de CDR, sub-bibliotecas combinatorias y/o bibliotecas combinatorias. Un kit puede comprender un sub-banco de regiones de entramado para la región de entramado 1, 2, 3 y/o 4 de cadena ligera variable, en el que la región de entramado se define según el sistema de Kabat. Alternativamente, un kit puede comprender un sub-banco de regiones de entramado para la región de entramado 1, 2, 3 y/o 4 de cadena ligera variable, en el que la región de

5 entramado se define según el sistema de Chothia. Aún adicionalmente, un kit puede comprender un sub-banco de regiones de entramado para la región de entramado 1, 2, 3 y/o 4 de cadena pesada variable, en el que la región de entramado se define según el sistema de Kabat. Alternativamente un kit puede comprender un sub-banco de regiones de entramado para la región de entramado 1, 2, 3 y/o 4 de cadena pesada variable, en el que la región de entramado se define según el sistema de Chothia. Aún otro kit puede comprender sub-bancos de regiones de entramado tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada.

Un kit o envase farmacéutico puede comprender uno o más recipientes llenados con un anticuerpo humanizado producido mediante un método de la invención. El kit o envase farmacéutico puede comprender además uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad particular. Un kit o envase

15 farmacéutico puede comprender uno o más recipientes llenados con uno o más de los componentes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Opcionalmente asociado con tal(es) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma recomendada por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia para la fabricación, el uso o la venta para administración a seres humanos.

2.15 Artículo de fabricación

Un producto farmacéutico terminado, acondicionado y etiquetado puede ser un artículo de fabricación que incluye la forma farmacéutica unitaria apropiada en un recipiente o contenedor apropiado tal como un vial de vidrio u otro

25 recipiente que está herméticamente sellado. En el caso de formas farmacéuticas adecuadas para administración parenteral el principio activo es estéril y adecuado para la administración como disolución libre de material particulado. Se describen tanto disoluciones parenterales como polvos liofilizados, siendo cada uno estéril, y siendo estos últimos adecuados para su reconstitución antes de la inyección. Alternativamente, la forma farmacéutica unitaria puede ser un sólido adecuado para administración oral, transdérmica, tópica o mucosa.

La forma farmacéutica unitaria puede ser adecuada para administración intravenosa, intramuscular o subcutánea. Por tanto, se describen disoluciones, preferiblemente estériles, adecuadas para cada vía de administración.

Como con cualquier producto farmacéutico, el material de acondicionamiento y el recipiente están diseñados para

35 proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y el envío. Además, los productos incluyen instrucciones para su uso u otro material de información que recomiendan al médico, técnico o paciente cómo prevenir o tratar apropiadamente la enfermedad o el trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucciones que indican o sugieren un régimen de dosificación incluyendo, pero sin limitarse a, dosis reales, procedimientos de monitorización (tales como métodos para monitorizar los recuentos de linfocito absolutos medios, recuentos de célula tumorales y tamaño tumoral) y otra información de monitorización.

Más específicamente, un artículo de fabricación puede comprender material de acondicionamiento tal como una caja, frasco, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.) o envuelta; y al menos una forma farmacéutica unitaria de un agente farmacéutico contenida dentro de dicho material de acondicionamiento. Un

45 artículo de fabricación puede comprender material de acondicionamiento, tal como una caja, frasco, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.) o envuelta; y al menos una forma farmacéutica unitaria de cada agente farmacéutico contenida dentro de dicho material de acondicionamiento.

Un artículo de fabricación puede comprender material de acondicionamiento y un agente farmacéutico e instrucciones contenidas dentro de dicho material de acondicionamiento, en el que dicho agente farmacéutico es un anticuerpo humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable, y dichas instrucciones indican un régimen de dosificación para prevenir, tratar o gestionar a un sujeto con una enfermedad particular. Un artículo de fabricación puede comprender material de acondicionamiento y un agente farmacéutico e instrucciones contenidas dentro de dicho material de acondicionamiento, en el que dicho agente farmacéutico es un anticuerpo humanizado, un agente

55 profiláctico o terapéutico distinto del anticuerpo humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable, y dichas instrucciones indican un régimen de dosificación para prevenir, tratar o gestionar a un sujeto con una enfermedad particular. Un artículo de fabricación puede comprender material de acondicionamiento y dos agentes farmacéuticos e instrucciones contenidas dentro de dicho material de acondicionamiento, en el que dicho primer agente farmacéutico es un anticuerpo humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable y dicho segundo agente farmacéutico es un agente profiláctico o terapéutico distinto del anticuerpo humanizado, y dichas instrucciones indican un régimen de dosificación para prevenir, tratar o gestionar a un sujeto con una enfermedad particular.

Efectos adversos que pueden reducirse o evitarse pueden indicarse en material de información incluido en un artículo de fabricación para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de uno o más síntomas asociados con una 65 enfermedad. Los efectos adversos que pueden reducirse o evitarse incluyen, pero no se limitan a, anomalías de signos vitales (por ejemplo, fiebre, taquicardia, bradicardia, hipertensión, hipotensión), acontecimientos

hematológicos (por ejemplo, anemia, linfopenia, leucopenia, trombocitopenia), cefalea, escalofríos, mareo, náuseas, astenia, dolor de espalda, dolor torácico (por ejemplo, presión en el tórax), diarrea, mialgia, dolor, prurito, psoriasis, rinitis, sudoración, reacción en el sitio de la inyección y vasodilatación. Dado que algunas de las terapias pueden ser inmunosupresoras, la inmunosupresión prolongada puede aumentar el riesgo de infección, incluyendo infecciones

5 oportunistas. La inmunosupresión prolongada y sostenida también puede dar como resultado un aumento del riesgo de desarrollo de determinados tipos de cáncer.

Además, el material de información incluido en un artículo de fabricación puede indicar que las proteínas foráneas también pueden dar como resultado reacciones alérgicas, incluyendo anafilaxia o síndrome de liberación de 10 citosinas. El material de información debe indicar que las reacciones alérgicas pueden mostrarse sólo como exantemas pruriginosos leves o pueden ser intensas tales como eritroderma, síndrome de Stevens Johnson, vasculitis o anafilaxia. El material de información también debe indicar que las reacciones anafilácticas (anafilaxia) son reacciones de hipersensibilidad graves y en ocasiones mortales. Pueden producirse reacciones alérgicas, incluyendo anafilaxia, cuando se inyecta cualquier proteína foránea en el organismo. Puede oscilar entre

15 manifestaciones leves tales como urticaria o exantema y reacciones sistémicas mortales. Las reacciones anafilácticas se producen poco después de la exposición, habitualmente en el plazo de 10 minutos. Los pacientes pueden experimentar parestesia, hipotensión, edema laríngeo, cambios en el estado mental, angioedema facial o faríngeo, obstrucción de las vías respiratorias, broncoespasmos, urticaria y prurito, enfermedad del suero, artritis, nefritis alérgica, glomerulonefritis, artritis temporal o eosinofilia.

20 El material de información también puede indicar que el síndrome de liberación de citocinas es un síndrome clínico agudo, temporalmente asociado con la administración de determinados anticuerpos activantes anti-células T. El síndrome de liberación de citocinas se ha atribuido a la liberación de citocinas mediante linfocitos activados o monocitos. Las manifestaciones clínicas para el síndrome de liberación de citocinas han oscilado entre una

25 enfermedad “de tipo gripe”, autolimitada, leve, notificada con más frecuencia y una reacción de tipo choque, potencialmente mortal, intensa, notificada con menos frecuencia, que puede incluir manifestaciones graves cardiovasculares, pulmonares y en el sistema nervioso central. Normalmente el síndrome comienza de aproximadamente 30 a 60 minutos tras la administración (pero puede producirse más tarde) y puede persistir durante varias horas. La frecuencia e intensidad de este complejo de síntomas es habitualmente mayor con la

30 primera dosis. Con cada dosis sucesiva, tanto la incidencia como la intensidad del síndrome tienden a disminuir. Aumentar la cantidad de una dosis o reiniciar el tratamiento tras una interrupción puede dar como resultado la reaparición del síndrome. Los métodos de tratamiento y prevención descritos en el presente documento pueden evitar o reducir uno o más de los efectos adversos comentados en el presente documento.

35 5.0 Ejemplos

Reactivos

Todos los compuestos químicos fueron de calidad analítica. Se adquirieron enzimas de restricción y enzimas

40 modificadoras del ADN de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Se adquirieron oligonucleótidos y ADN polimerasa de pfu de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se expresó proteína de fusión EphA2 humano-Fc (que consistía en EphA2 humano fusionado con la porción Fc de una IgG1 humana (Carles-Kinch et al. Cancer Res. 62: 2840-2847 (2002)) en células de riñón embrionario humano (HEK) 293 y se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína G usando protocolos convencionales. Se adquirieron perlas magnéticas con estreptavidina de Dynal (Lake

45 Success, NY). Se llevó a cabo la biotinilación de EphA2 humano-Fc usando un kit de sulfo-NHS-LC-biotinilación EZ-Link según las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL).

5.1- Clonación y secuenciación del anticuerpo monoclonal original

50 MedImmune, Inc. adquirió una línea celular de hibridoma murino (B233) que secretaba un anticuerpo monoclonal (mAb) preparado contra la tirosina cinasa receptora humana EphA2 (Kinch et al. Clin. Exp. Metastasis. 20:59-68 (2003)). A este mAb de ratón se le denomina mAb B233 a continuación en el presente documento. Se llevó a cabo la clonación y secuenciación de los genes de cadena pesada (VH) y ligera (VL) variable del mAb B233 tras el aislamiento y la purificación del ARN mensajero de B233 usando un kit de purificación de ARNm Straight A’s

55 (Novagen, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc con un kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Novagen, Madison, WI) según las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo la amplificación de los genes tanto de VH como de VL usando los oligonucleótidos IgGVH e IgκVL del conjunto de cebadores de Ig de ratón (Novagen, Madison, WI) según las sugerencias del fabricante. Se clonaron fragmentos de ADN resultantes de amplificaciones productivas en pSTBlue-1 usando el kit de clonación Perfectly Blunt (Novagen, Madison, WI).

60 Entonces se secuenciaron múltiples clones de VH y VL mediante el método de terminación de cadena de didesoxilo (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5463-5467 (1977)) usando un secuenciador ABI3000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). En la figura 1 se muestran las secuencias consenso de los genes de VL (VL-233) y VH (VH-233) del mAb B233.

65 5.2- Selección de las regiones de entramado humanas

Se seleccionaron genes de región de entramado humana de agrupamientos públicamente disponibles de genes de línea germinal de anticuerpo. Más precisamente, esto incluyó 46 genes de cadena kappa de línea germinal humana (A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L 15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, 014, O18, 02, 04 y 08; K.F. 5 Schable, et al., Biol. Chem. Hoppe Seiler 374:1001-1022, (1993); J. Brensing-Kuppers, et al., Gene 191:173181(1997)) para la 1ª, 2ª y 3ª regiones de entramado y 5 secuencias J de línea germinal humana para la 4ª región de entramado (Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 y Jκ5; P.A. Hieter, et al., J. Biol. Chem. 257:1516-1522 (1982)). La porción de cadena pesada de la biblioteca incluyó 44 secuencias de cadena pesada de línea germinal humana (VH1-18, VH1-2, VH124, VH1-3, VH1-45, V1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16,

10 VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH61 y VH7-8; F. Matsuda, et al., J. Exp. Med. 188:1973-1975 (1998)) para la 1ª, 2ª y 3ª regiones de entramado y 6 secuencias J de línea germinal humana para la 4ª región de entramado (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 y JH6; J.V. Ravetch, et al., Cell 27(3 Pt 2): 583-591 (1981)).

15 5.3- Construcción de las bibliotecas con intercambio de región de entramado

5.3.1- Descripción de las bibliotecas

20 Se construyeron tres bibliotecas con intercambio de región de entramado principales (biblioteca A, B y C). La biblioteca A incluyó una sub-biblioteca con intercambio de región de entramado de cadena ligera (sub1 de VL) emparejada con la cadena pesada del mAb B233 (VH-233). La biblioteca B incluyó una sub-biblioteca con intercambio de región de entramado de cadena pesada (sub1 de VH) emparejada con las cadenas ligeras con intercambio de región de entramado fijas VL-12C8 y VL- 8G7 (véanse las secciones 5.4.1.1, 5.4.1.2 y 5.4.1.3). La

25 biblioteca C incluyó una sub-biblioteca con intercambio de región de entramado de cadena ligera (sub2 de VL) emparejada con una sub-biblioteca con intercambio de región de entramado de cadena pesada (sub2 de VH).

La construcción de las sub-bibliotecas de VH y VL con intercambio de región de entramado se llevó a cabo usando los oligonucleótidos mostrados en las tablas 1-7 y 11. Más precisamente, los oligonucleótidos descritos en las tablas 30 1-7 y 11 codifican para las secuencias completas de todos los genes de línea germinal de región de entramado humana conocidos para las cadenas ligera (κ) y pesada, definición de Kabat. Los oligonucleótidos descritos en las tablas 64 y 65 codifican para parte de las CDR del mAb B233 y son solapantes con las regiones de entramado de línea germinal humana correspondientes. Con respecto a la tabla 64, con la excepción de AL1-13 y DL1Ü-4Ü, cada oligonucleótido codifica para porciones de una CDR del mAb B233 (subrayada) y de una región de entramado de 35 cadena ligera de línea germinal humana (definición de Kabat; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, BNational Institutes of Health, Washington, DC, 1991). CDRL1, L2 y L3 se codifican por AL1Ü-10ÜBL1-10, BL1Ü-16Ü/CL1-11 y CL1Ü-12Ü/DL1-4, respectivamente. Los oligonucleótidos AL113 contienen una secuencia solapante líder del gen 3 de M13 (en negrita) y los oligonucleótidos DL1Ü-4Ü contienen una secuencia solapante de Cκ (en negrita). Con respecto a la tabla 65, con la excepción de AH1-10 y DH1Ü-3Ü,

40 cada oligonucleótido codifica para porciones de una CDR del mAb B233 (subrayada) y de una región de entramado de cadena pesada de línea germinal humana (definición de Kabat). CDRH1, H2 y H3 se codifican por AH1Ü17Ü/BH1-17, BH1Ü-16Ü/CH1-15 y CH1Ü-13Ü/DH1-3, respectivamente. Los oligonucleótidos AH1-10 contienen una secuencia solapante líder del gen 3 de M13 (en negrita) mientras que los oligonucleótidos DH1Ü-3Ü contienen una secuencia solapante de Cκ1 (en negrita). (K=G o T, M=A o C, R=A o G, S=C o G,W=A o T e Y=C o T).

45 Tabla 64. Oligonucleótidos usados para la fusión de CDR de cadena ligera de mAb B233 con regiones de entramado de cadena ligera de línea germinal humana.

1589 AL1 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGATGTTGTGATGACWCAGTCT-3’ 1590 AL2 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGACATCCAGATGAYCCAGTCT-3’ 1591 AL3 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGCCATCCAGWTGACCCAGTCT-3’ 1592 AL4 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAAATAGTGATGAYGCAGTCT-3’ 1593 AL5 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAAATTGTGTTGACRCAGTCT-3’ 1594 AL6 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAKATTGTGATGACCCAGACT-3’ 1595 AL7 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAAATTGTRMTGACWCAGTCT-3’ 1596 AL8 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAYATYGTGATGACYCAGTCT-3’ 1597 AL9 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAAACGACACTCACGCAGTCT-3’ 1598 AL10 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGACATCCAGTTGACCCAGTCT-3’ 1599 AL11 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCAACATCCAGATGACCCAGTCT-3’ 1600 AL12 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGCCATCCGGATGACCCAGTCT-3’

1601: AL13 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGTCATCTGGATGACCCAGTCT-3’

1602: AL1Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC-3’

1603: AL2Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGGAGAGGGTGRCTCTTTC-3’

1604: AL3Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTACAASTGATGGTGACTCTGTC-3’

1605: AL4Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGAAGGAGATGGAGGCCGGCTG-3’

1606: AL5Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGGAGATGGAGGCCTGCTC-3’

1607: AL6Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGGAGATGTTGACTTTGTC-3’

1608: AL7Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGGTGATGGTGACTTTCTC-3’

1609: AL8Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTC-3’

1610: AL9Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAAGTGATGGTGACTCTGTC-3’

1611: AL10Ü 5’-TAATACTTTGGCTGGCCCTGCAAATGATACTGACTCTGTC-3’

1612: BL1 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGYTTCAGCAGAGGCCAGGC-3’

1613: BL2 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGS-3’

1614: BL3 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCRGCAGAAACCAGGG-3’

1615: BL4 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTACCARCAGAAACCAGGA-3’

1616: BL5 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTACCARCAGAAACCTGGC-3’

1617: BL6 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTACCARCAGAAACCTGGC-3’

1618: BL7 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAGCARAAACCWGGS-3’

1619: BL8 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTAYCAGCARAAACCAG-3’

1620: BL9 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTTTCTGCAGAAAGCCAGG-3’

1621: BL10 5’-CCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTTTCAGCAGAAACCAGGG-3’

1622: BL1Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATCAGGAGCTGTGGAG-3’

1623: BL20 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATCAGGAGCTTAGGRGC-3’

1624: BL3Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATGAGGAGCCTGGGMGC-3’

1625: BL4Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATARTAGATCAGGMGCTTAGGGGC-3’

1626: BL5Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATCAGGWGCTTAGGRAC-3’

1627: BL6Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATGAAGAGCTTAGGGGC-3’

1628: BL7Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAAATTAGGAGTCTTGGAGG-3’

1629: BL8Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAGTAAATGAGCAGCTTAGGAGG-3’

1630: BL9Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATCAGGAGTGTGGAGAC-3’

1631: BL10Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATCAGGAGCTCAGGGGC-3’

1632: BL11Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGATCAGGGACTTAGGGGC-3’

1633: BL12Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAGAGGAAGAGCTTAGGGGA-3’

1634: BL13Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATACTTGATGAGGAGCTTTGGAGA-3’

1635: BL14Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATAATAAATTAGGCGCCTTGGAGA-3’

1636: BL15Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATACTTGATGAGGAGCTTTGGGGC-3’

1637: BL16Ü 5’-GATGGACTGGAAAACATATTGAATAATGAAAATAGCAGC-3’

1638: CL1 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGY-3’

1639: CL2 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGY-3’

1744: CL3 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGYATCCCAGCCAGGTTCAGT-3’

1745: CL4 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGRGTCCCWGACAGGTTCAGT-3’

1746: CL5 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTAGCATCCCAGCCAGGTTCAGT-3’

1747: CL6 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGGGTCCCCTCGAGGTTCAGT-3’

1748: CL7 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGAATCCCACCTCGATTCAGT-3’

1749: CL8 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGGGTCCCTGACCGATTCAGT-3’

1750: CL9 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT-3’

1751: CL10 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGGGTCTCATCGAGGTTCAGT-3’

1752: CL11 5’-GTTTTCCAGTCCATCTCTGGAGTGCCAGATAGGTTCAGT-3’

1753: CL1Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGKCAGTAATAAACCCCAACATC-3’

1754: CL2Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACAGTAATAYGTTGCAGCATC-3’

1755: CL3Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACMGTAATAAGTTGCAACATC-3’

1756: CL4Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGRCAGTAATAAGTTGCAAAATC-3’

1757: CL5Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACAGTAATAARCTGCAAAATC-3’

1758: CL6Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACARTAGTAAGTTGCAAAATC-3’

1759: CL7Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGGCAGTAATAAACTCCAAMATC-3’

1760: CL8Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGGCAGTAATAAACCCCGACATC-3’

1761: CL9Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACAGAAGTAATATGCAGCATC-3’

1762: CL210Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACAGTAATATGTTGCAATATC-3’

1763: CL11Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACAGTAATACACTGCAAAATC-3’

1764: CL12Ü 5’-CCAGCTGTTACTCTGTTGACAGTAATAAACTGCCACATC-3’

1765: DL1 5’-CAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTYGGCCARGGGACCAAGSTG-3’

1766: DL2 5’-CAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGCCAAGGGACACGACTG-3’

1767: DL3 5’-CAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGCCCTGGGACCAAAGTG-3’

1768: DL4 5’-CAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG-3’

1769: DL1Ü 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATYTCCACCTTGG-3’

1770: DL2Ü 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGG-3’

1771: DL3Ü 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATATCCACTTTGG-3’

1772: DL4Ü 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTAATCTCCAGTCGTG-3’

Tabla 65. Oligonucleótidos usados para la fusión de CDR de cadena pesada de mAb B233 con regiones de entramado de cadena pesada de línea germinal humana.

1640: AH1 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGGTKCAGCTGGTGCAGTCT-3’

1641: AH2 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCT-3’

1642: AH3 5’-GTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGSTGCAGCTGCAGGAGTCG-3’

1643: AH4 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGGTCACCTTGARGGAGTCT-3’

1644: AH5 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCARATGCAGCTGGTGCAGTCT-3’

1645: AH6 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCGARGTGCAGCTGGTGSAGTC-3’

1646: AH7 5’-GCPGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGATCACCTTGAAGGAGTCT-3’

1647: AH8 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGGTSCAGCTGGTRSAGTCT-3’

1648: AH9 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCT-3’

1649: AH10 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG-3’

1650: AH1Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCRGTGAAGGTGTATCCAGAAGC-3’

1651: AH2Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCGCTGAGTGAGAACCCAGAGAM-3’

1652: AH3Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCACTGAARGTGAATCCAGAGGC-3’

1653: AH4Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCACTGACGGTGAAYCCAGAGGC-3’

1654: AH50 5’-GTTCATGGAGTAATCGCTGAYGGAGCCACCAGAGAC-3’

1655: AH6Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCRGTAAAGGTGWAWCCAGAAGC-3’

1656: AH7Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCACTRAAGGTGAAYCCAGAGGC-3’

1657: AH8Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCGGTRAARCTGTAWCCAGAASC-3’

1658: AH90 5’-GTTCATGGAGTAATCAYCAAAGGTGAATCCAGARGC-3’

1659: AH10Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCRCTRAAGGTGAATCCAGASGC-3’

1660: AH11Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCGGTGAAGGTGTATCCRGAWGC-3’

1661: AH12Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCACTGAAGGACCCACCATAGAC-3’

1662: AH13Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCACTGATGGAGCCACCAGAGAC-3’

1663: AH14Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCGCTGATGGAGTAACCAGAGAC-3’

1664: AH15Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCAGTGAGGGTGTATCCGGAAAC-3’

1665: AH16Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCGCTGAAGGTGCCTCCAGAAGC-3’

1666: AH17Ü 5’-GTTCATGGAGTAATCAGAGACACTGTCCCCGGAGAT-3’

1667: BH1 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTGCGACAGGCYCCTGGA-3’

1668: BH2 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTGCGMCAGGCCCCCGGA-3’

1669: BH3 5’-GATTACTCCATGAACTGGATCCGTCAGCCCCCAGGR-3’

1670: BH4 5’-GATTACTCCATGAACTGGRTCCGCCAGGCTCCAGGG-3’

1671: BH5 5’-GATTACTCCATGAACTGGATCCGSCAGCCCCCAGGG-3’

1672: BH6 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTCCGSCAAGCTCCAGGG-3’

1673: BH7 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTCCRTCARGCTCCRGGR-3’

1674: BH8 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTSCGMCARGCYACWGGA-3’

1675: BH9 5’-GATTACTCCATGAACTGGKTCCGCCAGGCTCCAGGS-3’

1676: BH10 5’-GATTACTCCATGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCG-3’

1677: BH11 5’-GATTACTCCATGAACTGGGCCCGCAAGGCTCCAGGA-3’

1678: BH12 5’-GATTACTCCATGAACTGGATCCGCCAGCACCCAGGG-3’

1679: BH13 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTTCCGGG-3’

1680: BH14 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTGCGCCAGATGCCCGGG-3’

1681: BH15 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTGCGACAGGCTCGTGGA-3’

1682: BH16 5’-GATTACTCCATGAACTGGATCCGGCAGCCCGCCGGG-3’

1683: BH17 5’-GATTACTCCATGAACTGGGTGCCACAGGCCCCTGGA-3’

1684: BH1Ü 5’-TGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATCCCATCCACTCAAGCCYTTG-3’

1685: BH2Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATCCCATCCACTCAAGCSCTT-3’

1686: BH3Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAWGAGACCCACTCCAGCCCCTT-3’

1687: BH4Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAACCCAATCCACTCCAGKCCCTT-3’

1688: BH5Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATGAGACCCACTCCAGRCCCTT-3’

1689: BH6Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAGCCAACCCACTCCAGCCCYTT-3’

1690: BH7Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAKGCCACCCACTCCAGCCCCTT-3’

1691: BH8Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATCCCAGCCACTCAAGGCCTC-3’

1692: BH9Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAACCCCATCCACTCCAGGCCTT-3’

1693: BH10Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATGARACCCACWCCAGCCCCTT-3’

1694: BH11Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAMGAKACCCACTCCAGMCCCTT-3’

1695: B12Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAYCCMATCCACTCMAGCCCYTT-3’

1696 1BH13Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATCCTATCCACTCAAGGCGTTG-3’

1697: BH14Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATGCAAGCCACTCCAGGGCCTT-3’

1698: BH15Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAATGAAACATATTCCAGTCCCTT-3’

1699: BH16Ü 5’-TGTTGTGTAATCATTAGCTTTGTTTCTAATAAACGATACCCACTCCAGCCCCTT-3’

5’

1700: CH1 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGAGTCACCATGACCAGGRAC

3’

5’

1701: CH2 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGGCTCACCATCWCCAAGGAC

3’

1702: CH3 5’-GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGAGTYACCATATCAGTAGAC-3’

5’

1703: CH4 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGRGAC

3’

1704: CH5 5’-GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGATTCACCATCTCMAGAGA3’

1705: CH6 5’-GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTMGGTTCACCATCTCCAGAGA3’

1706: CH7 5’-GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGATTCAYCATCTCCAGAGA3’

5’

1707: CH8 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGAGTCACCATRTCMGTAGAC

3’

5’

1708: CH9 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGRGTCACCATKACCAGGGAC

3’

5’

1709: CH10 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCAGGTCACCATCTCAGCCGAC

3’

1710: CH11 5-GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGAATAACCATCAACCCAGAC-3

1711: CH12 5’-CTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTTGTCTTCTCCATGGAC3’

5’

1712: CH13 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGAGTCACCATGACCGAGGAC

3’

5’

1713: CH14 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGAGTCACGATTACCGCGGAC

3’

5’

1714: CH15 GCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTAGAGTCACCATGACCACAGAC

3’

1715: CH1Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTAGYACAGTAATACACGGC-3’

1716: CH2Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTCGCACAGTAATACAYGGC-3’

1717: CH3Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTYGCACAGTAATACACAGC-3’

1718: CH4Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATGYYGCACAGTAATACACGGC-3’

1719: CH5Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTACCGTGCACARTAATAYGTGGC-3’

1720: CH6Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTGGCACAGTAATACACGGC-3’

1721: CH7Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATGTGGTACAGTAATACACGGC-3’

1722: CH8Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTCGCACAGTGATACAAGGC-3’

1723 CH9Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATTTTGCACAGTAATACAAGGC-3’ 1724 CH10Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTTGCACAGTAATACATGGC-3’ 1725 CH11Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTAGTGTGCACAGTAATATGTGGC-3’ 1726 CH12Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATTTCGCACAGTAATATACGGC-3’ 1727 CH13Ü 5’-GTCCATAGCATGATACCTAGGGTATCTCACACAGTAATACACAGC-3’ 1728 DH1 5’-CCTAGGTATCATGCTATGGACTCCTGGGGCCARGGMACCCTGGTC-3’ 1729 DH2 5’-CCTAGGTATCATGCTATGGACTCCTGGGGSCAAGGGACMAYGGTC-3’ 1730 DH3 5’-CCTAGGTATCATGCTATGGACTCCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTC-3’ 1731 DH1Ü 5’-GGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACRGTGACCAGGGT-3’ 1732 DH2Ü 5’-GGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACRGTGACCRTKGT-3’ 1733 H3Ü 5’-GGAAGACCGATGGGCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’

5.3.2- Construcción de las sub-bibliotecas de VH y VL

Se ensambló secuencialmente la sub-biblioteca sub1 de VL usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

5 mediante extensión por solapamiento. Ho et al., Gene 77:51-59 (1989). Más precisamente, se llevaron a cabo las denominadas PCR “intermedias” para sintetizar cada región de entramado de línea germinal humana individual fusionada en marco con una porción de las CDR donadoras correspondientes usando las siguientes combinaciones de oligonucleótidos: AL1-13/AL1Ü-10Ü/1-46, BL1-10/BL1Ü-16Ü/47-92, CL1-11/CL1Ü-12Ü/93-138 y DL1-4/DL1Ü4Ü/139-143 para la 1ª, 2ª, 3ª y 4ª regiones de entramado, respectivamente. Esto se llevó a cabo usando ADN

10 polimerasa de pfu (PCR SuperMix, Invitrogen) en un volumen de 100 μl y aproximadamente 5 pmol de oligonucleótidos AL1-13, AL1Ü- 10Ü, BL1-10, BL1Ü-16Ü, CL1-11, CL1Ü-12Ü, DL1-4 y DL1Ü-4Ü y aproximadamente 100 pmol de oligonucleótidos 1-143. El programa de PCR consistió en 5 min. a 95ºC; 1 min. a 94ºC, 1 min. a 45ºC, 1 min. a 72ºC durante 30 ciclos y después 8 min. a 72ºC. Entonces se llevó a cabo una segunda PCR (“PCR de ensamblaje”) usando ADN polimerasa de pfu (PCR SuperMix, Invitrogen), 0,5-2 μl de cada una de las PCR

15 “intermedias”, 25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos DL1Ü, DL2Ü, DL3Ü, DL4Ü (véase la tabla 64) y 100 pmol del oligonucleótido biotinilado 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCAC-3’ (SEQ ID NO. 1734) en un volumen de reacción de 100 μl. El programa de PCR de ensamblaje consistió en 5 min. a 95ºC; 30 s a 94ºC, 30 s a 50ºC, 45 s a 72ºC durante 30 ciclos y después 8 min. a 72ºC.

20 También se sintetizaron las sub-bibliotecas con intercambio de región de entramado sub1 de VH, sub2 de VH y sub2 de VL usando la PCR mediante extensión por solapamiento. Ho et al., Gene 77:51-59 (1989). Esta síntesis in vitro total de los genes de VH y VL con intercambio de región de entramado se realizó esencialmente tal como se describe en H.Wu et al., Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003). En resumen, se llevó a cabo una primera PCR denominada “de fusión” usando ADN polimerasa de pfu (PCR SuperMix, Invitrogen). Se llevó a cabo la construcción de sub1 de

25 V11 usando aproximadamente 3-10 pmol de cada uno de los oligonucleótidos descritos en las tablas 5, 6, 7, 11 y 65 en un volumen de reacción de 100 μl. Se llevó a cabo la construcción de sub2 de VH usando aproximadamente 0,5 pmol de cada uno de los oligonucleótidos descritos en las tablas 5, 6, 7, 11 y 65 en un volumen de reacción de 100 μl. Se llevó a cabo la construcción de sub2 de VL usando aproximadamente 0,5 pmol de cada uno de los oligonucleótidos descritos en las tablas 1, 2, 3, 4, y 64 en un volumen de reacción de 100 μl. Para cada sub

30 biblioteca sub1 de VH, sub2 de VH y sub2 de VL, el programa de PCR de fusión consistió en 1 min. a 95ºC; 20 s a 94ºC, 30 s a 50ºC, 30 s a 72ºC durante 5 ciclos; 20 s a 94ºC, 30 s a 55ºC, 30 s a 72ºC durante 25 ciclos y después 7 min. a 72ºC. Entonces siguió una segunda PCR denominada “de síntesis”. Más precisamente, se sintetizaron las sub-bibliotecas sub1 de VH y sub2 de VH usando ADN polimerasa de pfu (PCR SuperMix, Invitrogen), 2-3 μl de la “PCR de fusión” correspondiente, 30 pmol de cada uno de los oligonucleótidos DH1Ü, DH2Ü, DH3Ü (véase la tabla

35 65) y 100 pmol del oligonucleótido biotinilado 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCC- 3’ (SEQ ID NO. 1735) en un volumen de reacción de 100 μl. Se sintetizó la sub-biblioteca sub2 de VL usando ADN polimerasa de pfu (PCR SuperMix, Invitrogen), 3 μl de la “PCR de fusión” correspondiente, 25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos DL1Ü, DL2Ü, DL3Ü, DL4Ü (véase la tabla 64) y 100 pmol del oligonucleótido biotinilado 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCAC-3’ (SEQ ID NO. 1734) en un volumen de reacción de 100 μl. Para cada sub

40 biblioteca sub1 de VH, sub2 de VH y sub2 de VL, el programa de PCR de síntesis consistió en 5 min. a 94ºC; 1 min. a 94ºC, 1 min. a 45ºC, 1 min. a 72ºC durante 30 ciclos y después 8 min. a 72ºC.

5.3.3- Síntesis de los genes VL-12C8 y VL-8G7

45 Se sintetizaron los genes de cadena ligera VL-12C8 y VL-8G7, usados en el contexto de biblioteca B (VL-12C8+VL8G7+ sub1 de VH), mediante PCR a partir del vector de fago M13 que codifica para la región V correspondiente (véanse las secciones 5.4.1.1, 5.4.1.2, 5.4.1.3) usando las combinaciones de oligonucleótidos 12C8for/12C8back y 8G7for/8G7back, respectivamente (véase a continuación).

12C8for 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGCCATCCAGTTGACTCAGTCTCC-3’(biotinilado) (SEQ ID NO. 1736)

5 12C8back 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCTCC-3’ (SEQ ID NO. 1737)

8G7for 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG-3’ (biotinilado) (SEQ ID NO. 1738)

8G7back 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCTC-3’ (SEQ ID NO. 1739).

Los oligonucleótidos 12C8for y 8G7for contienen una secuencia solapante líder del gen 3 de M13 (en negrita). Los 15 oligonucleótidos 8G7back y 12C8back contienen una secuencia solapante de Cκ (subrayada).

5.3.4- Síntesis de los genes VH-233 y VL-233

Se sintetizaron los genes de cadena pesada y ligera VH-233 y VL-233, usados en el contexto de un control positivo de Fab quimérico (VH-233+VL-233) o de la biblioteca A (sub1 de VL+VH-233), mediante PCR a partir del vector pSTBlue-1 correspondiente (véase la sección 5.1) usando las combinaciones de oligonucleótidos 233Hfor/233Hback y 233Lfor/233Lback, respectivamente (véase a continuación).

233Hfor 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAG-3’ (biotinilado) 25 (SEQ ID NO. 1740)

233Hback 5’-GGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3’ (SEQ ID NO. 1741)

233Lfor 5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTG -3’ (biotinilado) (SEQ ID NO. 1742)

233Lback 5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCG AACG-3’ (SEQ ID NO. 1743)

35 Los oligonucleótidos 233Hfor y 233Lfor contienen una secuencia solapante líder del gen 3 de M13 (en negrita). El oligonucleótido 233Hback contiene una secuencia solapante de Cκ1 (subrayada). El oligonucleótido 233Lback contiene una secuencia solapante de Cκ (subrayada).

5.3.5- Clonación de las diversas regiones V en un vector de expresión de fago

Se clonaron las bibliotecas A, B y C así como la versión de Fab quimérico de mAb B233 en un vector de expresión de fago basado en M13. Este vector permite la expresión de fragmentos Fab que contienen el primer dominio constante de una cadena pesada 01 humana y el dominio constante de una cadena ligera kappa (κ) humana bajo el 45 control del promotor lacZ (figura 2). Se llevó a cabo la clonación mediante mutagénesis por hibridación, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987), tal como describieron Wu et al., Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003). En resumen, se purificó ADN monocatenario negativo correspondiente a las diversas regiones V de interés (véanse las secciones 5.3.2, 5.3.3 y 5.3.4) a partir de los productos de PCDR finales mediante precipitación en etanol tras la disociación del producto de PCR bicatenario usando hidróxido de sodio y eliminación de la cadena biotinilada mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina tal como se describe (H. Wu, et al., Methods Mol. Biol.

207: 213-233(2003); H. Wu, Methods Mol. Biol. 207: 197-212 (2003)). Se mezclaron cantidades equimolares de diferentes cadenas negativas de la siguiente manera: VH-233/sub1 de VL, sub1 de VH/VL-8G7/VL-12C8, sub2 de VH/sub2 de VL y VH-233 NL-233 para construir la biblioteca A, biblioteca B, biblioteca C y Fab 233 quimérico, respectivamente. Entonces se hibridaron individualmente estas mezclas diferentes con dos regiones del vector que

55 contenían cada una un bucle palindrómico. Estos bucles contenían un sitio XbaI único que permite la selección de los vectores que contienen cadenas tanto VL como VH fusionadas en marco con la región constante kappa (κ) humana y la primera región constante 0 humana, respectivamente. Entonces se sometió el ADN sintetizado a electroporación en XL1-Blue para determinar la formación de placas de lisis en césped bacteriano de XL1-Blue o la producción de fragmentos Fab tal como describieron Wu et al., Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003).

5.4- Examen de las bibliotecas

5.4.1- Examen primario

65 5.4.1.1- Descripción El examen primario consistió en un ensayo ELISA de un único punto (SPE) que se llevó a cabo usando extractos periplásmicos preparados a partir de 1 ml de cultivo bacteriano que se hizo crecer en placas de 96 pocillos profundos y se infectó con clones de M13 recombinantes individuales (véase la sección 5.3.5) esencialmente tal

5 como se describe en Wu et al., Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003). En resumen, se recubrieron pocillos individuales de una inmunoplaca de Maxisorp de 96 pocillos con 20-500 ng de un anticuerpo de cabra anti-Fab humano, se bloquearon con BSA al 3%/PBS durante 2 h a 37ºC y se incubaron con muestras (Fab expresados en periplasma) durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces se añadieron 300 ng/pocillo de EphA2 humano-Fc biotinilado durante 1 h a temperatura ambiente. Esto fue seguido por la incubación con conjugado de NeutrAvidinperoxidasa del rábano (HRP) durante 40 min. a temperatura ambiente. Se detectó la actividad de HRP con sustrato de tetrametil-bencidina (TMB) y se extinguió la reacción con H2SO4 0,2 M. Se leyeron las placas a 450 nm.

5.4.1.2- Resultados del examen primario

15 De los ~500 clones de la biblioteca A que se examinaron usando 100 ng del reactivo de captura anticuerpo de cabra anti-Fab humano, 14 mostraron una señal significativa (DO450 que oscilaba entre 0,2-0,6). Esto correspondió normalmente a una señal al menos 1,3 veces superior a la señal de fondo correspondiente (DO450 que oscilaba entre 0,1-0,4) de un anticuerpo irrelevante (MEDI-493; S. Johnson et al., J. Infect. Dis. 176: 1215-1224 (1997)). En estas condiciones, Fab 233 mostró una DO450 que oscilaba entre 0,4-0,6.

De los ~200 clones de la biblioteca A que se examinaron usando 20 ng del reactivo de captura anticuerpo de cabra anti-Fab humano, 4 mostraron una señal significativa (DO450 que oscilaba entre 0,2-0,4). Esto correspondió normalmente a una señal al menos 2 veces superior a la señal de fondo correspondiente de un anticuerpo irrelevante (DO450 de 0,1). En estas condiciones, Fab 233 mostró una DO450 que oscilaba entre 0,2-0,3.

25 De los ~750 clones de la biblioteca A que se examinaron usando 500 ng del reactivo de captura anticuerpo de cabra anti-Fab humano, 16 mostraron una señal significativa (DO450 que oscilaba entre 0,1-0,7). Esto correspondió normalmente a una señal al menos 1,3 veces superior a la señal de fondo correspondiente de un anticuerpo irrelevante (DO450 que oscilaba entre 0,06-0,2). En estas condiciones, Fab 233 mostró una DO450 que oscilaba entre 0,1-0,6. Se aislaron los clones VH-233/VL-12C8 y VH-233NL-8G7 de esta ronda de examen y ambos mostraron una DO450 de 0,4 (los valores de DO450 de fondo de la misma placa fueron de 0,1 y 0,2, respectivamente; los valores de DO450 de Fab 233 de la misma placa fueron de 0,2 y 0,5, respectivamente).

De los ~750 clones de la biblioteca B que se examinaron usando 500 ng del reactivo de captura anticuerpo de cabra

35 anti-Fab humano, 27 mostraron una señal significativa (DO450 que oscilaba entre 0,3-2,8). Esto correspondió normalmente a una señal al menos 1,3 veces superior a la señal de fondo correspondiente de un anticuerpo irrelevante (DO450 que oscilaba entre 0,2-0,3). En estas condiciones, tanto VH-233/VL-12C8 como VH-233/VL-8G7 mostraron valores de DO450 que oscilaban entre 0,2-0,4. Se aislaron los clones VH-2G6/VL-12C8, VH-6H11/VL-8G7 y VH-7E8/VL-8G7 de esta ronda de examen y mostraron una DO450 de 2,8, 2,5 y 1,6, respectivamente (los valores de DO450 de fondo de la misma placa fueron de 0,3, 0,2 y 0,2, respectivamente, los valores de DO450 de VH-233/VL12C8 de la misma placa fueron de 0,4, 0,3 y 0,3, respectivamente; los valores de DO450 de VH-233/VL-8G7 de la misma placa fueron de 0,4, 0,3 y 0,3, respectivamente).

De los ~1150 clones de la biblioteca C que se examinaron usando 500 ng del reactivo de captura anticuerpo de

45 cabra anti-Fab humano, 36 mostraron una señal significativa (DO450 que oscilaba entre 0,1-0,3). Esto correspondió normalmente a una señal al menos 1,3 veces superior a la señal de fondo correspondiente de un anticuerpo irrelevante (DO450 que oscilaba entre 0,07-0,1). En estas condiciones, Fab 233 mostró una DO450 que oscilaba entre 0,1-0,2.

5.4.1.3- Validación de los clones positivos

En conjunto, volvieron a confirmarse 9 clones de la biblioteca A, 7 clones de la biblioteca B y 0 clones de la biblioteca C en un segundo ensayo ELISA de un único punto, independiente, usando extractos periplásmicos preparados a partir de 15 ml de cultivo bacteriano y 500 ng del reactivo de captura anticuerpo de cabra anti-Fab 55 humano. Específicamente, se caracterizaron adicionalmente dos clones de la biblioteca A (VH-233NL-12C8 y VH233/VL-8G7) que se mostraron entre las mayores razones de [DO450 específica/DO450 de fondo] (que oscilaba entre aproximadamente 15-50) mediante secuenciación de didesoxinucleótidos usando un analizador genómico ABI3000. El análisis de secuencia de ADN del clon VH-233/VL-12C8 reveló que su cadena pesada contenía una única sustitución de base en la base 104 dando como resultado una sustitución (de N a S) en la posición H35 (numeración de Kabat). Se corrigió esta mutación usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. El clon VH-233/VL-12C8 corregido mostró una razón de [DO450 específica/DO450 de fondo] de hasta aproximadamente 50 (similar a VH-233/VL-12C8 mutado) lo que indicó la conservación de la unión a EphA2-Fc. Entonces se seleccionaron los clones VH-233/VL-12C8 y VH-233/VL- 8G7 parcialmente humanizados para su caracterización adicional mediante un examen secundario (véase la sección 65 5.4.2). En la figura 3 se indican las secuencias de VL-12C8 y VL-8G7. Tal como se mencionó anteriormente, entonces se incluyeron estas dos cadenas ligeras humanizadas en el diseño de la biblioteca B. Se caracterizaron

adicionalmente tres clones de esta biblioteca que mostraron entre las mayores razones de [DO450 específica/DO450 de fondo] (aproximadamente 40) mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. Esto condujo a la identificación de tres cadenas pesadas humanizadas diferentes (VH-2G6, VH-6H11 y VH-7E8; véase la figura 3). Se encontró que VH2G6, VH-6H11 y VH-7E8 se emparejaban con VL-12C8, VL-8G7 y VL-8G7, respectivamente. Entonces se

5 seleccionaron estos tres clones completamente humanizados para su caracterización adicional mediante un examen secundario (véase la sección 5.4.2).

5.4.2- Examen secundario

5.4.2.1- Descripción

Con el fin de caracterizar adicionalmente los clones humanizados anteriormente identificados (véase la sección 5.4.1.3), se llevó a cabo un examen secundario usando fragmentos Fab expresados en extractos periplásmicos preparados a partir de 15 ml de cultivo bacteriano. Más precisamente, se usaron dos ensayos ELISA: (i) un ensayo 15 ELISA funcional en el que se recubrieron pocillos individuales de una inmunoplaca de Maxisorp de 96 pocillos con 500 ng de EphA2 humano-Fc y se bloquearon con BSA al 3%/PBS durante 2 h a 37ºC. Entonces se añadieron muestras diluidas en serie 2 veces y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces siguió la incubación con un conjugado de anticuerpo de cabra anti-kappa humana-peroxidasa del rábano (HRP). Se detectó la actividad de HRP con sustrato de TMB y se extinguió la reacción con H2SO4 0,2 M. Se leyeron las placas a 450 nm; (ii) un ensayo ELISA de cuantificación de anticuerpo anti-Fab humano que se llevó a cabo esencialmente tal como se describió. Wu et al., Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003). En resumen, se recubrieron pocillos individuales de una inmunoplaca Immulon de 96 pocillos con 100 ng de anticuerpo de cabra anti-Fab humano y después se incubaron con muestras diluidas en serie 2 veces (comenzando a una dilución de 1/25) o patrón (Fab de IgG humana, 500-3,91 ng/ml). Entonces siguió la incubación con un conjugado de anticuerpo de cabra anti-kappa

25 humana-peroxidasa del rábano (HRP). Se detectó la actividad de HRP con sustrato de TMB y se extinguió la reacción con H2SO4 0,2 M. Se leyeron las placas a 450 nm.

5.4.2.2- Resultados del examen secundario

El examen mediante ensayo ELISA secundario en dos partes permitió comparar clones de Fab VH-233/VL-12C8, VH-233NL-8G7, VH-2G6/VL-12C8, VH-6H11/VL-8G7 y VH-7E8/VL-8G7 entre sí y con el Fab quimérico de mAb B233 (VH-233/VL-233) en cuanto a la unión a EphA2 humano. Tal como se muestra en la figura 4, todos los Fab con intercambio de región de entramado conservan la unión a EphA2 humano en comparación con el Fab quimérico de mAb B233. Resulta interesante que algunos clones cuyas cadenas pesada y ligera están ambas humanizadas (VH

35 2G6/VL-12C8 y VH-7E8/VL-8G7) muestran una mejor unión aparente a EphA2 humano-Fc que clones en los que sólo las mismas cadenas ligeras están humanizadas (VH-233/VL-12C8 y VH-233/VL-8G7). Esto indica la existencia de un proceso mediante el cual se seleccionan específicamente las cadenas pesadas humanizadas para una unión óptima al antígeno en el contexto de una cadena ligera humanizada dada. Con el fin de caracterizar adicionalmente las diferentes moléculas completamente humanizadas, entonces se clonaron los clones VH-2G6/VL-12C8, VH-6H11/VL8G7 y VH-7E8/VL-8G7 así como la forma quimérica de mAb B233 (VH-233/VL-233) y se expresaron como IgG1 humana de longitud completa (véase la sección 5.5).

5.5 Clonación, expresión y purificación de las diversas versiones humanizadas de mAb B233 en un formato de IgG1 humana

45 Se amplificaron mediante PCR las regiones variables de clones con intercambio de región de entramado VH-2G6, VH-6H11, VH-7E8, VL-12C8 y VL-8G7 y de VH-233 y VL-233 a partir de los vectores de fago de M13 que codificaban para la región V correspondiente usando ADN polimerasa de pfu. Entonces se clonaron individualmente en vectores de expresión de mamífero que codificaban para una región no traducida en 5’, promotor y potenciador temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (hCMVie). M. Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985). En este sistema, se secreta una cadena 0 humana junto con una cadena κ humana. S. Johnson, et al., Infect. Dis. 176: 1215-1224 (1997). Se expresaron transitoriamente los diferentes constructos en células de riñón embrionario humano (HEK) 293 y se recogieron 72 horas tras la transfección. Se purificaron las IgG1 humanas solubles, secretadas, a partir de los medios condicionados directamente en columnas de proteína A o proteína G HiTrap de 1

55 ml según las instrucciones del fabricante (APBiotech, Inc., Piscataway, NJ). Se recuperaron IgG1 humanas purificadas (normalmente homogeneidad >95%, según se evalúa mediante SDS-PAGE) en rendimientos que variaron entre 2-13 μg/ml de medios condicionados, se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS), se congelaron súbitamente y se almacenaron a -70ºC.

5.6 Análisis BIAcore de la unión de IgG de mAb B233 y quiméricas, con intercambio de región de entramado, a EphA2-Fc

Se monitorizó la interacción de IgG solubles de VH-2G6/VL-12C8, VH-6H11/VL-8G7, VH-7E8/VL-8G7 y VH-233/VL-233 así como de mAb B233 con EphA2-Fc inmovilizada mediante la detección de resonancia del plasmón superficial 65 usando un instrumento BIAcore 3000 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suecia). Se acopló EphA2-Fc a la matriz de dextrano de un chip sensor CM5 (Pharmacia Biosensor) usando un kit de acoplamiento de amina tal como se describió (B. Johnsson et al., Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991)) a una densidad en superficie de entre 105 y 160 UR. Se diluyeron las IgG en HEPES 0,01 M pH 7,4 que contenía NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y P2O al 0,005%. Se realizaron todas las diluciones posteriores en el mismo tampón. Se realizaron todos los experimentos de unión a 25ºC con concentraciones de IgG que oscilaron normalmente entre 100 nM y 0,2 nM a una velocidad de flujo de 5 75 μl/min.; se recogieron datos durante aproximadamente 25 min. y se usó un pulso de 1 min. de NaCl 1 M, NaOH 50 mM para regenerar las superficies. También se hicieron fluir las IgG sobre una célula no recubierta y se restaron los sensogramas de estas ejecuciones en blanco de los obtenidos con chips acoplados a EphA2-Fc. Se ajustaron los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1. Este algoritmo calcula tanto la kon como la koff, a partir de lo cual se deduce la constante de disociación en equilibrio aparente, KD, como la razón de las dos constantes de velocidad

10 (koff/kon). En la tabla 66 se indican los valores obtenidos.

Tabla 66. Mediciones de afinidad para la unión de diferentes IgG a EphA2 humano-Fca

Constante de anticuerpo (KD)c: Velocidad de asociación (kon)b (M-1 .s -1) Velocidad de disociación (koff)b (s-1) Disociación (nM)

B233 (murino): 2,8 x 105 1,1 x 10-4 0,4

VHB233NL-B233 (quimérico): 2,4 x 105 8,0 x 10-5 0,3

VH-2G6/VL-12C8 (humanizado): 6,4 x 104 1,9 x 10-4 3,0

VH-6H11/VL-8G7 (humanizado): 9,6 x 104 1,8 x 104 1,9

VH-7E8/VL-8G7 (humanizado): 9,3 x 103 4,5 x 10-4 48

3 Se llevaron a cabo mediciones de afinidad mediante análisis BIAcore tal como se indicó en la descripción del método. bLos parámetros cinéticos representan el promedio de 5-18 medidas individuales. cLa KD se calculó como

15 razón de las constantes de velocidad (koff/kon).

5.7- Análisis de las variantes con intercambio de región de entramado

5.7.1- Análisis de secuencias

20 En conjunto, se encontró que dos cadenas ligeras humanizadas únicas (VL-12C8 y VL-8G7) y tres cadenas pesadas humanizadas únicas (VH-2G6, VH-6H11 y VH-7E8) soportaban una unión eficaz a EphA2 humano-Fc. La naturaleza promiscua de la cadena ligera humanizada VL-8G7 se destaca por su capacidad para mediar en la unión productiva en el contexto de dos cadenas pesadas diferentes (VH-7E8 y VH-6H11). Todas estas variantes humanizadas

25 mostraron un alto nivel de identidad de aminoácidos global con respecto a mAb B233 en las regiones de entramado correspondientes, que oscilaba entre el 76-83% para las cadenas pesadas y entre el 64-69% para las cadenas ligeras (figura 5). Esto puede explicarse por el hecho de que es más probable que las regiones de entramado humanas de alta homología conserven residuos clave originales. El análisis de regiones de entramado individuales reveló un intervalo más amplio de diferencias, que osciló entre el 48% para la primera región de entramado de VL

30 12C8 y el 91% para la cuarta región de entramado de VH-2G6, VH-6H11 y VH-7E8.

Resulta interesante que la cadena pesada humanizada VH-7E8 consistía exclusivamente en regiones de entramado humanas que eran una correspondencia perfecta con secuencias de línea germinal de región de entramado humana (figura 5). Las cadenas pesadas humanizadas VH-6H11 y VH-2G6 contenían una y dos regiones de entramado 35 humanas, respectivamente, que mostraron una correspondencia casi perfecta con las secuencias de línea germinal de región de entramado humana más relacionadas (figura 5). Las diferencias representaron un máximo de tres residuos por cadena (VH-2G6) y dos residuos por región de entramado (primera región de entramado de VH-2G6). En ningún caso codificaron estas diferencias para aminoácidos que no se encontraran en otras secuencias de línea germinal de región de entramado humana más distantes. Por tanto, puede decirse que estos clones también pueden 40 denominarse “completamente humanizados”. Las cadenas ligeras humanizadas VL-12C8 y VL-8G7 contenían una y tres regiones de entramado humanas, respectivamente, que mostraron una correspondencia casi perfecta con las secuencias de línea germinal de región de entramado humana más relacionadas (figura 5). El número de diferencias representó un máximo de tres residuos por cadena (VL-8G7) y un residuo por región de entramado (primera, segunda y cuarta región de entramado de VL-8G7; cuarta región de entramado de VL-12C8). Sin embargo, una vez

45 más, los residuos en estas posiciones también se encontraron en otras secuencias de entramado humanas menos homólogas; por tanto estas variantes también pueden denominarse completamente humanizadas. Dado que estas diferencias no se incorporaron dentro de las presentes bibliotecas, se atribuye su origen a una combinación de factores tales como fidelidad de PCR y/o calidad de oligonucleótidos.

50 5.7.2- Análisis de unión Merece la pena observar que sólo un procedimiento de humanización en dos etapas en el que se humanizaron sucesivamente las cadenas ligera y pesada de mAb B233 (biblioteca A y B) permitió aislar clones humanizados que conservaban la unión a EphA2 humano-Fc. De hecho, el examen de una biblioteca en la que se humanizaron

5 simultáneamente las cadenas tanto ligera como pesada (biblioteca C) no permitió recuperar moléculas que mostraran una unión detectable a este antígeno. Esto refleja probablemente factores tales como calidad de biblioteca inferior a la óptima, toma de muestras de biblioteca incompleta y/o expresión procariota ineficaz de una porción de la biblioteca. Se anticipa que el examen de un número mayor de clones habría dado como resultado la identificación de fragmentos de anticuerpo humanizado que conservaran unión a EphA2 humano.

10 Tal como se espera a la vista de sus regiones variables de cadenas pesada y ligera idénticas, mAb B233 original y su versión de IgG quimérica mostraron una constante de disociación prácticamente idéntica (KD = 0,4 y 0,3 nM, respectivamente; tabla 66). Los clones humanizados VH-6H11/VL-8G7 y VH-2G6/VL-12C8, cuando se presentaron en formato de IgG1 humana, mostraron avideces hacia EphA2 humano que fueron similares a la versión original y

15 quimérica de mAb B233 (KD = 1,9 y 3,0 nM, respectivamente; tabla 66). Esto correspondió a una pequeña disminución de la avidez de 6 y 10 veces, respectivamente, en comparación con mAb B233 original. El clon humanizado VH-7E8/VL-8G7 mostró la menor avidez (KD = 48 nM), que correspondió a una mayor disminución de 160 veces en comparación con mAb B233 original. Merece la pena observar que, en cuanto a la fuerza de unión a EphA2-Fc, la clasificación basada en análisis BIAcore de clones de IgG humanizados VH-6H11NL-8G7, VH-2G6/VL

20 12C8 y VH-7E8/VL-8G7 (tabla 66) fue diferente de la clasificación basada en ensayo ELISA que usó sus equivalentes de Fab (figura 4). Esto es particularmente llamativo en el caso del clon VH-7E8/VL-8G7 que mostró la menor avidez (tabla 66), pero mostró sistemáticamente la mayor señal mediante valoración ELISA (figura 4). No se sabe lo que explica esta diferencia, pero se piensa que puede atribuirse probablemente al formato de los ensayos y/o a la imprecisión del ensayo ELISA de cuantificación. Alternativamente, es posible que esta discrepancia refleje

25 correlaciones únicas, específicas de clones, entre afinidad (según se mide en la figura 4) y avidez (según se mide en la tabla 66). De hecho, las mediciones de unión bivalentes individuales dependen de diversos factores tales como las disposiciones espaciales particulares de los sitios de unión a antígeno correspondientes o de la distribución en superficie del antígeno local (D.M. Crothers, et al. Immunochemistry 9: 341-357(1972); K.M. Müller, et al., Anal. Biochem. 261: 49-158(1998)).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de 5 dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena

15 pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.
2. Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas, produciéndose cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena ligera humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de

25 cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.
3. Método de generación de una biblioteca combinatoria que comprende: (i) un primer conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas, produciéndose cada una de 35 dicho primer conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada humanizadas fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, y (ii) un segundo conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas, produciéndose cada una de dicho segundo conjunto de secuencias de nucleótidos que codifican para regiones variables de cadena ligera humanizadas fusionando entre sí una secuencia 45 de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR de región variable de cadena pesada se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano, las CDR de región variable de cadena ligera se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano, cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena pesada humana es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican

55 para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales y cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado de cadena ligera humana es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales.
4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende además introducir la biblioteca combinatoria de secuencias de nucleótidos en una población de células.

65 5. Método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de secuencias de polinucleótido que comprenden cada

una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena 5 pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia 10 de ácido nucleico de región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (b) introducir las secuencias de polinucleótido en una población de células que contienen cada una una secuencia de polinucleótido que codifica para una región variable de cadena ligera; y (c) expresar las

15 secuencias de polinucleótido que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.
6. Método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de secuencias de polinucleótido que comprenden cada 20 una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de 25 ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de

30 secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (b) introducir las secuencias de polinucleótido en una población de células que contienen cada una una secuencia de polinucleótido que codifica para una región variable de cadena pesada y (c) expresar las secuencias de polinucleótido que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.
7. Método de producción de un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno, comprendiendo dicho método: (a) sintetizar una pluralidad de primeras secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico 40 que codifica para una región de entramado 1 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 2 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena pesada, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena pesada humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico 45 que codifica para una región de entramado 4 de cadena pesada humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena pesada de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena pesada es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena pesada de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de 50 anticuerpos humanos funcionales; (b) sintetizar una pluralidad de segundas secuencias de polinucleótido que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena ligera humanizada, produciéndose dicha secuencia de nucleótidos fusionando entre sí una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 1 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR1 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de 55 entramado 2 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR2 de cadena ligera, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 3 de cadena ligera humana, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDR3 de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de entramado 4 de cadena ligera humana, en el que las CDR se derivan de una región variable de cadena ligera de anticuerpo donador no humano que se une inmunoespecíficamente a dicho antígeno y 60 cada secuencia de ácido nucleico de región de entramado de cadena ligera es de un sub-banco que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican para dicha región de entramado de cadena ligera humana de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales; (c) introducir las secuencias de ácido nucleico generadas en las etapas (a) y (b) en una población de células; y (d) expresar las secuencias de nucleótidos que codifican para la región variable de cadena

65 pesada y la región variable de cadena ligera.
8. Método según la reivindicación 5, 6 ó 7, que comprende además, tras la etapa de expresar las secuencias de nucleótidos, la etapa de examinar para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno.
9. Método según la reivindicación 5, 6, 7 u 8, que comprende además, antes de la etapa (a), la etapa de generar los 5 sub-bancos de secuencias de región de entramado.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el/los sub-banco(s) de región de entramado humana comprende(n) regiones de entramado de secuencias de entramado de línea germinal humana y/o regiones de entramado de secuencias de anticuerpos humanos funcionales en las que se han introducido una o

10 mutaciones.