ES2486815T3

ES2486815T3 - Marcadores de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos

Info

Publication number: ES2486815T3
Application number: ES02013902.8T
Authority: ES
Inventors: Anand Natrajan; David Sharpe; Qingping Jiang
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2014-08-19
Anticipated expiration: 2022-06-21
Also published as: AU782559B2; CA2387466A1; US6664043B2; JP4467869B2; US20030045716A1; EP1273917A3; JP4913195B2; JP2003050204A; JP2010019854A; EP1273917A2; AU4573602A; EP1273917B1

Abstract

Un marcador quimioluminiscente de éster de acridinio detectable que tiene la estructura genérica A-B-C, y que comprende un éster de acridinio con un modificador hidrófilo, dónde A es un analito diana, dónde B es el modificador hidrófilo que consta de un espaciador poliiónico seleccionado del grupo que contiene de disulfonato de espermina poliiónico y dicarboxilato de espermina poliiónico, y dónde C es el marcador quimioluminiscente de éster de acridinio.

Description

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DESCRIPCIÓN

Marcadores de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos

Campo de la Invención

La presente invención es útil en aplicaciones bioanalíticas y por lo general se dirige a los marcadores detectables

5 quimioluminiscentes de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos; a las composiciones, los complejos y/o los conjugados que incluyen tales marcadores; y a los procesos para llevar a cabo ensayos bioanalíticos para analitos diana que utilizan tales marcadores.

Antecedentes de la Invención

Los ésteres de acridinio son marcadores quimioluminiscente enormemente útiles que han sido utilizados

10 ampliamente en el campo de inmunoensayos así como ensayos de ácido nucleico. Cada uno de los siguientes documentos de patentes se dirige a diferentes aspectos de aplicaciones bioanalíticas de compuestos de éster de acridinio. EP0263657; US4745181;EP0353971; EP0361817; US4918192; US5110932; US5227489; US5241070; EP0617288; WO9421823; US5395752; EP0661270; US5449556; WO9527702; US5538901; US5595875; EP0754178; US5656426; US5656500; US5663074; US5702887; WO9854574; US5879894; WO9911813;

15 WO0009487; EP0982298; WO 0031543; WO 98 545 74; US 6 242 188; EP0988551; WO0031543; EP1009852; US6080591; EP1049933; US6165800; WO0109372 & EP1104405.

Ciertos marcadores detectables quimioluminiscentes de éster de acridinio particulares que carecen de modificadores hidrófilos son bien conocidos en la técnica -por ejemplo, 2’,6’-dimetil-4’-[N-succinimidiloxicarbonil]fenil-10-metil-9acridina carboxilato y 2’,6’-dimetil-4’-[N-succinimidiloxicarbonil]fenil-10-sulfopropil-9-acridina carboxilato {siendo cada

20 marcador de ahora en adelante denominado como, respectivamente, "DMAE-NHS" y "NSP-DMAE-NHS"} -y están siendo comercializados para sistemas instrumentales de inmunoensayo disponibles de Bayer Corporation, Business Group Diagnostics, 511 Benedict Avenue, Tarrytown, New York 10591-5097. Para la conveniencia del lector, la estructura de cada uno de estos compuestos se describe a continuación.

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25 Descripción Detallada de la Invención

Como se ha indicado previamente, la presente invención se dirige a los marcadores detectables quimioluminiscentes de éster de acridinio que tienen modificadores hidrófilos de acuerdo con la reivindicación 1 y el proceso de acuerdo con la reivindicación 6. En varias modalidades preferidas de los marcadores de la invención, hemos incorporado dos

(2) tipos de elementos estructurales en NSP-DMAE y hemos encontrado que estas modificaciones permiten la

30 preparación de trazadores de haptenos únicos que muestran el rendimiento mejorado en inmunoensayos. Mediante el empleo de tres (3) diferentes analitos relevantes clínicamente -a saber-(la vitamina folato, el fármaco para el asma teofilina, y el antibiótico de aminoglucósidos, tobramicina) hemos demostrado la generalidad de nuestros hallazgos.

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Antes de examinar en profundidad los presentes marcadores de la invención, se presenta a continuación una breve descripción de los formatos de ensayo. Los inmunoensayos competitivos comúnmente: (a) emplean un formato 5 dónde se utiliza un conjugado de un marcador fluorescente o quimioluminiscente con un analito de interés, como un trazador en el ensayo; y (b) utilizan un soporte sólido. Una arquitectura típica para dicho ensayo competitivo consiste de tres componentes -a saber-un trazador, una muestra que contiene el analito de interés, y un método para la separación del analito unido y sin unir. (Se debe observar que en los inmunoensayos homogéneos, sin embargo, no se realiza ninguna separación). Por ejemplo, la inmovilización de la proteína de enlace del ácido fólico sobre un

10 soporte sólido tal como partículas paramagnéticas (de ahora en adelante denominado como "PMP") provee un medio para lograr dicha separación (magnética) del analito libre y unido (analito que en este caso sería el ácido fólico). Cuando el trazador se incluye en el ensayo, compite con el analito de la muestra para el enlace con la proteína inmovilizada. El aumento de los niveles del analito en el ensayo da lugar a que menos trazador se una con la proteína inmovilizada.

15 Como se describe a continuación en detalle (y como se ejemplifica más adelante) los espaciadores que son particularmente útiles para la preparación de trazadores de hapteno se han desarrollado -disulfonato de espermina poliiónica y dicarboxilato de espermina poliiónica -.

También se revela que el polietilenglicol (de ahora en adelante denominado como "PEG") es un polímero bien conocido. Es biocompatible, soluble tanto en solventes acuosos como orgánicos, no tóxico, y no inmunogénico. En 20 la técnica anterior, se ha utilizado ampliamente como un modificador de una variedad de moléculas que van desde fármacos de peso molecular pequeño a proteínas grandes así como también agregados grandes tales como liposomas. Los conjugados de PEG de fármacos muestran una solubilidad mejorada y tienen una vida mayor en el flujo sanguíneo. La modificación de PEG de las proteínas y los péptidos mejora la solubilidad, confiere resistencia a la proteólisis, y reduce la inmunogenicidad. La modificación de PEG de los oligonucleótidos aumenta la solubilidad y 25 confiere estabilidad a la nucleasa. La modificación de PEG de lípidos permite la preparación de liposomas injertados con PEG que están estabilizados estéricamente y muestran tiempos de circulación en sangre mejorados. Una excelente revisión de la técnica anterior en los usos de PEG se describe por S. Zalipsky in Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, 150-165 (que se incorpora en este documento por referencia en su totalidad). El uso de PEG para modificar las propiedades de colorantes fluorescentes también se describe en la técnica anterior. Se ha demostrado que los 30 colorantes fluorescentes porfirina y ftalocianina modificados con PEG muestran una disminución del comportamiento de agregación en solución acuosa así como un enlace no-específico disminuido con los componentes del suero humano tales como HSA (Albúmina de Suero Humano). Estos conjugados también muestran tiempos de decaimiento de fluorescencia ampliados (PCT/US91/03424 y PCT/US91/03426). Las aplicaciones de tales conjugados en inmunoensayos de fluorescencia e imágenes in vivo y terapia de tumores in vivo fueron propuestas

35 por los mismos autores.

No obstante de los usos anteriores de PEG, la modificación de ésteres de acridinio con polietilenglicol no se ha descrito previamente. Del mismo modo, también se han reportado los espaciadores poliiónicos ideados utilizando la poliamina espermina como un andamio de introducción de grupos funcionales iónicos. Encontramos que estas últimas moléculas también son enormemente útiles para modificar los ésteres de acridinio. La síntesis y las

40 aplicaciones de estos ésteres de acridinio modificados siguen.

Como se menciona anteriormente, la vitamina ácido fólico es un analito importante clínicamente que se mide comúnmente utilizando técnicas de inmunoensayo. Como un compuesto estrechamente relacionado, el ácido pteroico es una variante estructural, específica del ácido fólico que carece de la fracción de glutamato normalmente encontrada en el ácido fólico. Preparamos dos (2) diferentes conjugados NSP-DMAE de ácido pteroico, uno que 45 contiene un espaciador alifático hidrófobo (hexametileno) mientras que el otro contiene un espaciador del glicol hidrófilo hexaetileno (véase las Figuras 1 & 2). La síntesis del primer trazador se llevó a cabo por medio de la reacción de NSPDMAE-NHS con 1,6-hexanodiamina (de ahora en adelante, denominada como "HD"). A continuación, el derivado del éster de acridinio resultante (de ahora en adelante denominado como "NSP-DMAE-HD") se condensó con el ácido N10-trifluoroacetil pteroico seguido por la eliminación del grupo protector trifluoroacetil 50 a partir del conjugado. Para preparar un trazador análogo con un espaciador de PEG, un diaminohexaetilenglicol corto se sintetizó a partir del hexaetilenglicol disponible comercialmente. Los dos grupos hidroxilo en el hexaetilenglicol se convierten a ésteres de metano sulfonato, que se desplazan posteriormente con azida. La reducción del diazidohexaetilenglicol proporcionó el diaminohexaetilenglicol que luego se condensó con NSPDMAE-NHS. El derivado de éster de acridinio resultante (de ahora en adelante denominado como "NSP-DMAE-HEG") se

55 acopló con el ácido pteroico como se plantea anteriormente.

El rendimiento del ensayo de estos dos (2) diferentes conjugados NSP-DMAE-pteroato luego se evaluó en un inmunoensayo de folato (Ejemplo 5, las Tablas 1-3 & Figura 3). En este formato de ensayo, la proteína de enlace folato se inmoviliza sobre PMP y los dos (2) trazadores compiten con el analito ácido fólico. Las curvas dosisrespuesta se muestran en la Figura 3. La metodología utilizada para la generación de los datos de ensayo y las

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definiciones de varios parámetros de ensayo se explica en el Ejemplo 5. Las Tablas 1-3 resumen los datos relativos a la precisión del ensayo, exactitud del ensayo, y la sensibilidad del ensayo. La incorporación del espaciador hexaetilenglicol entre las fracciones de éster de acridinio y pteroato aumentó el enlace del trazador más de dosveces; por lo tanto la fracción del trazador unido definido como B/T aumentó de 0.53% a 1.15% para el trazador con 5 el espaciador de PEG (Tabla 3). Claramente, el espaciador de polietilenglicol alivia cualquier interferencia estérica para el enlace en el trazador que contiene PEG. A continuación se sintetizó un conjugado NSP-DMAE-folato que también contiene el espaciador hexaetilenglicol (Figura 4). Puesto que se sabe de la técnica anterior que el alfacarboxilato en ácido fólico debe permanecer libre para un buen enlace con las proteínas de enlace folato (Wang, S. et al. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 56-62), primero se sintetiza un trazador específico folato gamma ligado. 10 Específicamente, esto se llevó a cabo mediante la condensación del alfa-tertbutil éster del ácido N-tert-butoxicarbonil glutámico con NSP-DMAE-HEG (Figura 4). La eliminación de los grupos protectores a partir del conjugado resultante, el acoplamiento con ácido N10-trifluoroacetil pteroico seguido por la eliminación del grupo trifluoroacetil proporcionó el trazador folato-NSP-DMAE gamma-ligado incorporando el espaciador de polietilenglicol corto. La evaluación de este trazador en el inmunoensayo de folato, de hecho mostró incluso un mejor enlace (B/T 1.88%) 15 que el trazador de pteroato como sería esperado. También preparamos un trazador específico folato alfa-ligado iniciando con gamma-tert-butil éster del ácido N-tert-butoxicarbonil glutámico y siguiendo la misma secuencia de las reacciones descritas anteriormente (Figura 5). El resultante trazador folato alfa-ligado cuando se evaluó en el inmunoensayo de folato mostró un enlace disminuido debido a la falta de un grupo alfa-carboxilo libre. Si bien no hubo diferencias discernibles en la precisión del ensayo o la exactitud del ensayo entre los diferentes trazadores, el 20 trazadores que contienen HEG mostraron un enlace no específico inferior (Tabla 3). Por lo tanto, NSP-DMAE-HDpteroato, que no tiene un modificador hidrófilo, tenía el enlace no-específico más alto. El trazador que contiene HEG análogo, que tiene un espaciador hidrófilo, fue >2-veces menor en enlace no-específico. Los dos (2) trazadores folato debido a que tiene el espaciador HEG hidrófilo tuvieron también un enlace no específico inferior. El enlace aumentado combinado con el enlace no específico inferior de los trazadores que contienen HEG, también aumentó

25 el rango dinámico del ensayo folato y la mejora de la sensibilidad del ensayo (Tabla 3).

En un inmunoensayo para el antibiótico de aminoglucósidos tobramicina, se comparó el rendimiento del ensayo de dos trazadores tobramicina-NSP-DMAE, uno de los cuales contenía el espaciador (hidrófilo) hexaetilenglicol mientras que el otro no. Previamente se han descrito los procedimientos para la generación de anticuerpos de la tobramicina así como para la modificación específica del sitio de tobramicina con otras moléculas pequeñas (Singh, 30 P. et al. Can. J. Chem., 1984, 62, 2471-2477). En la tobramicina, la 6’-amina es la más reactiva (Figura 6). Por lo tanto, el tratamiento del aminoglucósido con un equivalente de NSP-DMAE-NHS provee un trazador tobramicina-NSP-DMAE 1:1. El segundo trazador se preparó mediante la conversión de NSPDMAE-HEG en el derivado glutarato mediante la condensación con anhídrido glutárico. A continuación, el ácido carboxílico en el aducto resultante (de ahora en adelante denominado como "NSP-DMAE-HEG-glutarato") se convirtió al éster NHS seguido por el

35 acoplamiento con una tobramicina equivalente para suministrar el trazador.

El examen de los dos (2) trazadores en un inmunoensayo para la tobramicina reveló que, si bien todo el enlace de los dos trazadores con un anticuerpo de tobramicina en PMP fue similar, el enlace no específico del trazador que contiene PEG hidrófilo fue más de 2.5-veces menor que el trazador convencional (Tablas 4-6, Figura 7 en el Ejemplo 8). Dado que el aumento del enlace no específico a menudo se relaciona con la hidrofobicidad, es notable que

40 incluso para un analito altamente soluble en agua tal como tobramicina, la introducción del modificador del polietilenglicol en el trazador es muy beneficioso. Si bien la precisión del ensayo y la exactitud del ensayo fueron similares para los dos (2) trazadores, la sensibilidad del ensayo de tobramicina fue significantemente mejor (1.7x inferior, Tabla 6) para el trazador que contiene HEG.

En el caso del fármaco de la asma el analito teofilina, además de dos (2) trazadores de NSP-DMAE-teofilina que

45 incorporan un espaciador de seis carbonos y el espaciador hexaetilenglicol (Figuras 8 & 9) se preparan dos (2) nuevos trazadores que contienen espaciadores poliiónicos. Los primeros dos (2) trazadores se prepararon simplemente mediante la condensación del éster NHS de 8-carboxipropilteofilina ya sea con NSP-DMAE-HD o NSPDMAE-HEG. Los espaciadores poliiónicos se derivan de la poliamina, espermina y se prepararon primero mediante la conversión de las dos aminas primarias con los grupos ftalimido. El compuesto resultante, bis(ftalimido)espermina

50 fue sometido o bien, a alquilación en las dos aminas secundarias por medio del calentamiento en 1,3-propano sultona pura o a acilación con anhídrido succínico (Figura 8). La eliminación de los grupos protectores ftalamido con hidrazina proporcionó el disulfonato de espermina (de ahora en adelante denominado como "SPDS") y el dicarboxilato de espermina (de ahora en adelante denominado como "SPDC"). Estos nuevos espaciadores se acoplaron a NSP-DMAE-NHS y los derivados NSP-DMAE resultantes se acoplaron a la 8-carboxiteofilina (Figura 9).

55 A continuación, los cuatro (4) trazadores de teofilina se evaluaron en un inmunoensayo de teofilina (Ejemplo 13, Tablas 7-9, Figura 10). El trazador de teofilina que contiene el espaciador de PEG hidrófilo mostró un enlace no específico inferior (2-veces) cuando se compara con el trazador con el espaciador no-hidrófilo de seis carbonos. Los trazadores que contienen el espaciador SPDS y el espaciador SPDC tuvieron incluso un enlace no específico inferior

(3.7 y 3.1-veces inferior que el espaciador de HD hidrófilo respectivamente). Mientras que el enlace, la precisión del

60 ensayo, y la exactitud del ensayo fueron similares para los cuatro (4) trazadores, el trazador que contiene el espaciador policarboxilato SPDC aumentó la sensibilidad del ensayo >3-veces. Los otros espaciadores hidrófilos no mostraron tal mejora en este ensayo específico incluso a pesar de que ambos trazadores mostraron un enlace no específico inferior.

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El conjunto de los resultados anteriores demostró claramente la utilidad de los espaciadores hidrófilos en conjugados de éster de acridinio-hapteno. Ningún espaciador es beneficioso en todos los ensayos, pero por medio de la 5 selección, se identifica fácilmente un espaciador hidrófilo que confiere beneficios máximos sobre el trazador en términos de rendimiento del ensayo. Hemos revelado dos tipos de espaciadores (no iónicos y poliiónicos) que son útiles en este aspecto. También es evidente que a partir de la metodología proporcionada por la actual invención, alguien con experiencia común en la técnica podría aplicar la misma metodología para la preparación de una variedad de trazadores utilizando diferentes analitos y diferentes marcadores. Este documento por lo tanto revela

10 trazadores de las siguientes estructuras genéricas

A-B-C

dónde A es un analito de interés tal como ácido pteroico, ácido fólico, esteroides, fármacos terapéuticos tales como teofilina, fentoína, digoxina, aminoglucósidos tales como tobramicina fenobarbital etc.; y

dónde B es cualquiera (a) polietilenglicol de peso molecular 150-5000 o (b) es un espaciador poliiónico derivado de

15 espermina o cualquier poliamina dónde las aminas internas, pero no necesariamente todas han sido modificadas por moléculas hidrófilas tales como sultonas, anhídridos etc.; y

dónde C es un marcador quimioluminiscente o fluorescente.

Los conjugados de éster de acridinio de modificadores hidrófilos preferidos incluyen los compuestos de la siguiente fórmula:

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En donde

R1 es un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, sulfoetilo, sulfopropilo, sulfobutilo, o aralquilo que tiene hasta 24 carbonos y hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre; y

R2, R3, R5, R7 son hidrógeno, amino, hidroxilo, haluro, nitro, -CN, -SO3H, -SCN, -OR, NHCOR, -COR, -COOR, o 25 CONHR en donde R es un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, que tiene hasta 24 carbonos y hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre; y

R4 y R8 son alquilo, alquenilo, alquinilo, aralquilo o alcoxilo que tienen hasta 8 carbonos sin ramificaciones en donde los grupos de cadena lateral tienen más de 2 carbonos;

R6 representa las siguientes sustituciones: R6 = R-L-S-R10 dónde R opcionalmente es un alquilo, alquenilo, alquinilo, 30 arilo, aralquilo, que tiene hasta 24 carbonos y hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, L es uno de los siguientes enlaces: éter, tioeter, amida, éster o carbamato;

S es polietilenglicol de peso molecular 300 a 5000; o las siguientes estructuras R6 se puede anexar, alternativamente, a una posición del anillo fenoxi, que está en la posición meta, al enlace éster (en este caso R5 o R7 se unen en la posición para, al enlace éster); y

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R10 es un electrófilo, un grupo saliente, o un nucleófilo.

Las modalidades preferidas de un trazador de pteroato y un trazador de folato se ilustran por medio de las siguientes estructuras.

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dónde M es un derivado de éster de acridinio o benzacridinio como se define anteriormente, excepto que R6 10 opcionalmente es un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, que tiene hasta 24 carbonos y hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre; y

dónde L es un enlace amida, éter, tioeter, éster o carbamato; y

dónde S es un espaciador como se define anteriormente.

Las modalidades preferidas de trazadores de tobramicina y de teofilina se ilustran por medio de las siguientes 15 estructuras.

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dónde S, L y M son como se definen anteriormente.

Los siguientes ejemplos representativos, no limitantes se presentan solamente con fines de ilustración y no tienen la intención de limitar el alcance de la protección de la patente a la cual la presente invención tiene derecho y a la 5 protección que se define solo por las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1

La síntesis de NSP-DMAE-HD se llevó a cabo de la siguiente manera (Figura 1). El 1,6-Diaminohexano (49 mg, 0.42 mmol) en DMF (1 mL) y carbonato 0.1 M pH 9 (1 mL) se trató con NSP-DMAE-NHS (25 mg, 0.042 mmol) en DMF (1 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas y a continuación, se purificó directamente por

10 HPLC preparativa utilizando una columna C18 (20 x 250 mm) y un gradiente de 10 → 60% MeCN/agua conteniendo cada uno ácido trifluoroacético (TFA) al 0.05%, en 40 min.. El producto eluye a ∼21 minutos. La fracción de HPLC que contiene el producto se concentró bajo presión reducida y a continuación se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. Rendimiento = 25 mg (cuant.), MALDI-TOF MS 591 obs., (591.73 calc.).

A continuación, la síntesis de NSP-DMAE-HD-pteroato se llevó a cabo de la siguiente manera (Figura 1).

15 Seguidamente, el ácido N10-trifluoroacetilpteroico (2.5 mg, 6.13 µmoles) en DMF (400 µL) se trató con cloroformiato de etilo (3 µL, 5 equivalentes) y diisopropiletil amina (5.4 µL, 5 equivalentes). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 1 hora. Luego se retiró el solvente bajo presión reducida y el residuo se trató con NSP-DMAE-HD

(1.4 mg, 2.37 µmoles) y diisopropiletilamina (2 µL, 11.3 µmoles). La reacción resultante se agitó a temperatura ambiente, durante 4 horas y luego se concentró. El residuo se disolvió en metanol y se filtró. El filtrado se purificó por

20 HPLC sobre una columna C18 (7.8 mm x 25 cm) utilizando un gradiente de 0 → 60% MeCN/agua conteniendo cada uno TFA al 0.05 %, en 40 min.; Rt (producto) = ∼27 minutos. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. Rendimiento = 0.6 mg (26%); MALDI-TOF MS

983.47 obs. (982.01 calc.).

El material anterior se agitó en piperidina 0.1 M (500 µL) a temperatura ambiente, durante 4 horas y a continuación

25 el producto se purificó directamente por HPLC como se describe anteriormente; Rt (producto) = ∼26 minutos. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó para producir un sólido de color amarillo. Rendimiento = ∼0.2 mg, MALDI-TOF MS 889.48 obs., (886 calc.).

Ejemplo 2

La síntesis del hexaetilenglicol dimetanosulfonato se llevó a cabo de la siguiente manera. Una solución de

30 hexaetilenglicol (1g, 3.54 mmol) en cloroformo (10 mL) se enfrió en un baño de hielo bajo nitrógeno y se trató con metanosulfonil cloruro (603 µL, 2.2 equivalentes) y diisopropiletilamina (1.56 mL, 2.5 equivalentes). La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó con nitrógeno. Después de 2 horas, se adicionó más metanosulfonil cloruro (274 µL, 1.0 equivalente) y disopropiletilamina (749 µL, 1.2 equivalentes). Después de otras dos horas a temperatura ambiente, la reacción se diluyó con cloroformo y la solución resultante se lavó dos veces con cloruro de

35 amonio acuoso seguido por salmuera. La solución de cloroformo luego se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró bajo presión reducida. Se obtuvo un aceite de color amarillo claro. Rendimiento = 1.38 g (89%). TLC (10% metanol, 90% de cloroformo) Rf (producto) = 0.64; Rf (material inicial) = 0.42.

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A continuación, la síntesis de diazido hexaetilenglicol se llevó a cabo de la siguiente manera. Una solución de hexaetilenglicol dimetanosulfonato (0.5 g, 1.14 mmol) en DMF (5 mL) se trató con azida de sodio (0.31 g, 4.76 mmol). La reacción se calentó en un baño de aceite a 110°C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 8 horas. La reacción luego se enfrió a temperatura ambiente y se agitó por otras 16 horas. A continuación la DMF se retiró bajo 5 presión reducida y el residuo se sometió a partición entre cloroformo y salmuera. La capa de cloroformo se separó, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró bajo presión reducida para suministrar un aceite. Rendimiento = 0.442 g (cuant.); TLC (5% de metanol, 95% de cloroformo) Rf (producto) = 0.59, Rf (material inicial) =

0.35.

A continuación, la síntesis de diamino hexaetilenglicol (de ahora en adelante denominado como "diaminoHEG") se

10 llevó a cabo de la siguiente manera (Figura 2). A continuación, una solución de diazido hexaetilenglicol (0.44 g1.32 mmol) en acetato de etilo (15 mL) se trató con 10% de Pd sobre carbón activado (95 mg) y la mezcla de reacción de color negro se hidrogenó a temperatura ambiente. Después de 16 horas a temperatura ambiente, la reacción se filtró y el filtrado se concentró bajo presión reducida para suministrar un aceite. Rendimiento = 0.26 g (70%), MALDI-TOF MS 280 obs. 280 calc., TLC (45% de metanol, 50% de cloroformo, 5% de hidróxido de amonio) Rf = 0.29.

15 A continuación, se llevó a cabo la síntesis de NSP-DMAE-HEG de la siguiente manera (Figura 2). A continuación, una solución de diaminoHEG (33 mg, 0.12 mmol) en 2 mL de 1:1, DMF y carbonato 0.1 M pH 9 se trató con NSPDMAE-NHS (10 mg, 17 µmoles). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. El producto se purificó directamente por HPLC preparativa sobre una columna C18 (20 mm x 300 cm) utilizando un gradiente de 0

→ 60% MeCN/agua conteniendo cada uno TFA al 0.05 %, en 40 min.; Rt (producto) =∼21 minutos. La fracción de 20 HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. Rendimiento =

10. 6 mg (83%), MALDI-TOF MS 757.39 obs., (755.89 calc.).

A continuación, se llevó a cabo la síntesis de NSP-DMAE-HEG-pteroato de la siguiente manera (véase la etapa (III) de la Figura 2). Seguidamente, el ácido N10-trifluoroacetilpteroico (5.4 mg, 13.2 µmoles) en DMF (0.5 mL) se trató con NHS (7.6 mg, 5 equivalentes) y DCC (13.6 mg, 5 equivalentes). La reacción se agitó a temperatura ambiente 25 bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de 2 horas, la reacción se trató con una solución de NSP-DMAE-PEG

(3.5 mg, 4.6 µmoles) en DMF (400 µL) junto con diisopropiletil amina (2 µL, 11.3 µmoles). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno, durante 16 horas. A continuación, la mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC preparativa sobre una columna C18 (7.8 mm x 300 cm) como se describe anteriormente; Rt (producto) = -24 minutos; MALDI-TOF MS 1148.71.92 obs., (1146.17 calc.).

30 A continuación, se agitó el conjugado anterior en 400 µL de piperidina 0.1 M a temperatura ambiente, durante 1 hora. Luego la reacción se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. HPLC Rt = -21 minutos, MALDI-TOF MS 1051.92 obs., (1050.16 calc.).

Ejemplo 3

La síntesis del conjugado NSP-DMAE-HEG-gamma-folato se llevó a cabo de la siguiente manera. Se disolvió alfa35 tert-butil éster del ácido N-tert-butoxicarbonil-L-glutámico (25 mg, 0.082 mmol) en MeCN (2 mL) y se trató con NHS

(14.2 mg, 1.5 equivalentes) y DCC (25.5 mg, 1.5 equivalentes). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 1.5 horas. Esta solución (0.54 mL) se adicionó a una solución de NSP-DMAE-PEG (14 mg, 18.54 µmol) en DMF (500 µL) que contiene diisopropiletilamina (5 µl, 1.5 equivalentes). Después de otras 2-3 horas, se adicionó diisopropiletilamina (2.5 µl) junto con otros 540 µL de la anterior solución activa de éster. La reacción resultante se 40 agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. Luego se retiró el solvente bajo presión reducida y el residuo se disolvió en 2 mL de MeCN. Este se filtró a través de lana de vidrio y el filtrado se concentró bajo presión reducida. El producto crudo se desbloqueó por la agitación en 1 mL de HBr al 30% en ácido acético, durante 2 horas. El producto se precipitó con la adición de éter (10 mL). El éter se decantó y el residuo se purificó directamente por HPLC utilizando el mismo sistema de solvente descrito anteriormente, Rt (producto) = -20.5 minutos. La fracción de HPLC

45 que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar 2.8 mg (20%) del producto como un sólido de color amarillo. MALDI-TOF MS 888.67 obs. (885.0 calc.).

A continuación, la síntesis de NSP-DMAE-HEG-gamma-folato se llevó a cabo de la siguiente manera. El ácido N10trifluoroacetilpteroico (5 mg, 12.25 µmoles) en DMF (1 mL) se trató con isobutilcloroformiato (4.7 µL, 3 equivalentes) y diisopropiletilamina (8 µL, 4 equivalentes). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 1 hora y luego se 50 concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en DMF (0.5 mL) y se adicionaron 170 µL de esta solución al NSPDMAE-PEG-gamma-glutamato (1.8 mg, 2.03 µmoles) junto con diisopropiletilamina (1 µL). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas y luego se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en DMF (1 mL) y se purificó por HPLC utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente, Rt (producto) = ∼25.5 minutos. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color

55 amarillo. MALDI-TOF MS 1276.34 obs., (1275.28 calc.).

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A continuación, el grupo trifluoroacetilo en el conjugado se retiró por medio de la agitación en una mezcla de piperidina 0.1 M (400 µL) en agua y DMF (200 µL) a temperatura ambiente. Después de 6 horas, el producto se purificó directamente por HPLC utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente, Rt (producto) = ∼22.5 minutos. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó para proveer un sólido de color amarillo. MALDI

5 TOF MS 1182.95 obs. (1179.27).

Ejemplo 4

La síntesis del conjugado NSP-DMAE-HEG-alfa-folato se llevó a cabo de la siguiente manera. Se disolvió el gammatert-butil éster del ácido N-tert-butoxicarbonil-L-glutámico (20 mg, 0.065 mmol) en MeCN (∼2 mL) y se enfrió en hielo bajo una atmósfera de nitrógeno. Se adicionaron N-hidroxisuccinimida (11.4 mg, 1.5 equivalentes) y10 diciclohexilcarbodiimida (20.3 mg, 0.0985 mmol) y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó por una hora. El NSP-DMAE-HEG (14 mg, 0.0185 mmol) en DMF (0.5 mL) se trató con diisopropiletilamina (7 µL, ∼ 2 equivalentes) seguido por 1.2 mL de la anterior solución de MeCN. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno, durante 24 horas. La reacción luego se concentró bajo presión reducida. El residuo se trató con 2 mL de HBr al 30% en ácido acético. Después de agitar, durante 3 horas a temperatura ambiente, se adicionó

15 éter para precipitar el producto que se recolectó por filtración, se enjuagó con más éter y se secó con aire. El producto crudo (28 mg) se sometió a HPLC preparativa como se describe anteriormente. La fracción de HPLC que contiene el producto (Rt = ∼18 min.) se liofilizó a sequedad. Rendimiento = 4.7 mg (29%). MALDI-TOF MS 910.14 (M + Na+) obs. (885 calc.).

A continuación, se llevó a cabo la síntesis de NSP-DMAE-HEG-alfa-folato de la siguiente manera. Seguidamente, el

20 ácido N10-trifluoroacetilpteroico (5 mg, 12.25 µmol) en DMF (1 mL) se trató con isobutilcloroformiato (4.7 µL, 3 equivalentes) y diisopropiletilamina (8 µL, 4 equivalentes). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 1 hora y luego se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en DMF (0.5 mL) y de nuevo se evaporó a sequedad. El compuesto recuperado de esta manera, se disolvió en DMF (0.5 mL) y una porción (0.2 mL) de esta solución se mezcló con NSP-DMAE-HEG-alfa-glutamato (2 mg, 0.0023 mmol). La reacción se agitó a temperatura

25 ambiente, durante 16 horas y a continuación, se purificó directamente por HPLC preparativa como se describe anteriormente (Rt = ∼26 min.). La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. MALDI-TOF MS 1277.47 obs. (1275.28 calc.).

Seguidamente, el compuesto purificado por HPLC se disolvió en DMF (0.1 mL) y se trató con piperidina 0.1 M en agua (0.2 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 3 horas y a continuación, se purificó

30 directamente por HPLC como se describe antes (Rt = ∼22 min.). La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar el conjugado. MALDI-TOF MS 1181.42 obs. (1179.27 calc.).

Ejemplo 5

Varios parámetros de ensayo competitivos se analizaron para la evaluación comparativa de la funcionalidad del enlace del conjugado (trazador). Específicamente, estas mediciones incluyen la precisión del ensayo, la exactitud del

35 ensayo, la sensibilidad del ensayo, el enlace no específico fraccional, la afinidad de enlace y la forma de la curva estándar.

A continuación, se calcularon las medias aritméticas, de tres replicas para RLUs (Unidades Relativas de Luz, definidas más adelante) resultantes de una concentración específica del analito, representada en este documento como µ. Los reactivos del ensayo no-trazador también contribuyen con un número pequeño, aunque algunas veces 40 significante de RLUs. Por lo tanto, una reacción control, que contiene todos los reactivos de ensayo excepto el trazador, se realiza en paralelo para determinar el fondo del reactivo no-trazador, representado en este documento como n. La media de RLUs, µ, se corrigieron para representar las RLUs obtenidas a partir del trazador solo, representada en este documento como B, dónde B = µ -n. Dónde la concentración del analito fue 0.00, el valor de RLU media aritmética corregida se designó como B0. Existe una relación inversa, no lineal entre la concentración de

45 analito presente en el estándar y las RLUs detectadas. Por consiguiente, la misma correlación antitética, también se refiere a la concentración del analito con el % B/B0 resultante y se puede representar empíricamente como

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dónde x es la concentración del analito, y y es la señal observada generada ya sea como % B/B0 o RLUs {[Rodbard, David; Ligand Analysis; (1981); Langon, J.; Clapp, J. (Eds.); Masson Publishing, Inc., New York; pp 45 -101], [Nix,

50 Barry; The Immunoassay Handbook; (1994); Wild, David (Ed.); Stockton Press, Inc., New York; pp. 117 -123], [Peterman, Jeffrey H.; Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay; (1991); Butler, J. (Ed.); CRC Press, Inc., Boca Raton; pp. 47 -65]}.

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Cuatro (4) parámetros, a saber la constante de regresión, b, el coeficiente de regresión, m, el enlace no específico (NSB) asintótico, proyectado a una dosis infinita (concentración de analito), y∞, y la respuesta de la dosis cero asintótica en la ausencia del analito, y0, se calcularon directamente utilizando el iterativo, no ponderado, análisis logístico de cuatro parámetros (4PL) función del programa DOSECALC.EXE Rev.1.73 (Bayer Diagnostics Corp.,

5 Walpole, MA).

PRECISIÓN DEL ENSAYO La precisión se determinó a partir de la desviación estándar, sigma(n-1), como el porcentaje de coeficiente de variación, % C.V., dónde el % C.V. = 100 X sigma(n-1)/µ. Son deseables los valores menores del 10 % (Feldkamp, Carolyn S.; Smith, Stuart W.; Immunoassay: A Practical Guide; (1987); Chan, Daniel W.; Perlstein, Marie T. (Eds.); Academic Press, Inc., San Diego, California; p 49 -95.)

10 EXACTITUD DEL ENSAYO La exactitud, se representa como el error del porcentaje (% S) en relación con modelo 4PL, se calculó como % S = 100 X (B -y)/y. Son aceptables los valores entre ± el 5 % (Feldkamp, Carolyn S.; Smith, Stuart W.; Immunoassay: A Practical Guide; (1987); Chan, Daniel W.; Perlstein, Marie T. (Eds.); Academic Press, Inc., San Diego, California; p 49 -95).

SENSIBILIDAD DEL ENSAYO La concentración de analito detectable mínima proyectada, para este documento se

15 denomina como sensibilidad, se determinó como la concentración del analito pronosticada a dos desviaciones estándar a partir de la respuesta de la dosis cero.

ENLACE NO ESPECÍFICO FRACCIONAL El enlace no específico fraccional (fNSB) en ensayo competitivo se calcula como el cociente del límite inferior asintótico proyectado de y a una dosis infinita, y∞, y la entrada de señal quimioluminiscente total T. El NSB fraccional es una medida de la interacción del enlace del conjugado para la fase 20 sólida que no implica la asociación del enlace preferido específicamente entre el conjugado y la proteína de enlace o anticuerpo sobre la fase sólida. El fNSB elevado no es deseable y puede resultar de uno o más de un número de diferentes factores; interacción hidrofóbica, exacerbado por la hidrofobicidad excesiva de un conjugado; las interacciones iónicas o polares promovidas a través de la densidad de carga o la polaridad del conjugado; y/o una interacción del enlace biológica específica pero indeseable. Si la precisión del ensayo permanece sin afectarse

25 mientras que hay un aumento significante en NSB, la pendiente aparente de la curva dosis respuesta disminuirá más rápidamente ya que el B0 excede el límite de linealidad del detector.

AFINIDAD DEL ENLACE CONJUGADO El ensayo competitivo % B0/T se analizó por una evaluación comparativa de la funcionalidad del enlace conjugado. La comparación de los cocientes resultantes es indicativo de la afinidad de enlace relativa que cada conjugado tiene para el anticuerpo o la proteína de enlace-analito.

30 ENSAYO FOLATO -EVALUACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DEL ENLACE DEL CONJUGADO ACRIDINIO ÉSTER-FOLATO Y -PTEROATO EN UN ENSAYO DE ENLACE FOLATO En este ensayo los conjugados éster de acridinio-folato (de hora en adelante denominados como trazadores) y el folato de los estándares que contienen folato (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) compiten por una cantidad limitada de proteína de enlace -folato de bovino, acoplado covalentemente a una fase sólida de partícula paramagnética. Los estándares de folato contenían

35 folato en concentraciones de 0.00, 2.66, 6.52, 12.8, 24.7, 52.7 µM. Una mezcla de reacción, que contiene 150 µl de estándar de folato, 50 µl de Reactivo de DTT y 75 µl de Agente de Liberación, se incubó, durante 2.5 min., a 37°C. A cada reacción se le adicionaron 200 µl de la fase sólida y se incubó, durante 2.5 min., a 37°C. Finalmente, se adicionaron 100 µl (280 fmoles) del trazador y se incubaron, durante 2.5 min., a 37°C. La fase sólida se recolectó sobre una disposición de magnetos permanentes y se lavó con agua desionizada para eliminar el trazador sin unir.

40 La reacción quimioluminiscente se inició, como se describe previamente. Los datos de quimioluminiscencia se recolectaron como fotones detectados por el ACS:180 y se expresaron en unidades de luz relativa (RLUs).

PRECISIÓN DEL ENSAYO DE FOLATO La precisión intra experimental fue satisfactoria para todos los conjugados de folato, con %s de C.V. que son menores de 10 % sobre la curva dosis respuesta total. No hubo una diferencia significante en la precisión total entre los conjugados.

45

Tabla 1 Precisión del Ensayo de Folato % C.V.

[Folato] en nM: A1 A2 A3 A4

0.00: 1.79 1.86 0.66 0.28

2.66: 2.32 1.12 4.16 1.67

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6.51: 1.03 1.69 1.11 1.56

12.8: 3.41 0.95 4.30 1.94

24.7: 1.56 2.08 4.32 2.55

52.7: 1.34 1.11 3.57 1.02

A1 = NSP-DMAE-HD-pteroato A2 = NSP-DMAE-HEG-pteroato A3 = NSP-DMAE-alfa-folato A4 = NSP-DMAE-gamma-folato

EXACTITUD DEL ENSAYO DE FOLATO La exactitud representada como el error del porcentaje (% S) con los valores de 4PL pronosticados fue aceptable para los cuatro conjugados de folato, que están dentro de ± 5 % sobre la curva dosis respuesta total. No hubo diferencia en la exactitud total entre estos conjugados.

Tabla 2 Ensayo de Exactitud de Folato % S

[Folato] en nM: A1 A2 A3 A4

0.00: 0.10 -0.18 -0.32 -0.07

2.66: -0.46 0.59 1.31 0.26

6.51: 0.87 -0.28 -2.01 -0.25

12.8: 0.72 -1.66 0.82 -0.28

24.7: 0.16 3.61 1.72 0.82

52.7: 0.09 -2.36 -1.96 -0.59

SENSIBILIDAD DEL ENSAYO DE FOLATO La mejor sensibilidad del ensayo de folato se llevó a cabo con el conjugado NSP-DMAE-HEG-gamma-folato. La concentración del analito mínima detectable proyectada fue determinada a partir de la concentración de folato a dos desviaciones estándar de la dosis-respuesta de 0.00 nM de 10 folato, B0-2sigma(n-1). El conjugado NSP-DMAE-HEG-gamma-folato emitió la concentración más baja de folato detectable, la cual fue seguida por los conjugados NSP-DMAE-HEG-alfa folato y NSP-DMAE-HEG-pteroato en ese orden. El trazador de NSP-DMAE-HD-pteroato fue el conjugado menos sensible como resultado de la B0 relativamente baja, el rango dinámico reducido y un NSB fraccional elevado (fNSB). Las diferencias estructurales del trazador pueden ser clasificadas de la siguiente manera de acuerdo con su grado de influencia sobre la sensibilidad.

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La sustitución del folato por pteroato en la estructura del trazador resulta en un aumento en la sensibilidad del ensayo de al menos 2.7-veces cuando los resultados del trazador de NSP-DMAE-HEG-alfa-folato se compararon con los del trazador de NSP-DMAE-HEG-pteroato. Esto refleja la importancia relativa de la similitud estructural del trazador y el analito con respecto a la sensibilidad del ensayo de folato. El enlace NSP-DMAE-HEG-amina con el folato a través del glutamato de gamma-carboxilato fue preferible para la conjugación a través del alfa-carboxilato, ya que la unión del gamma-carboxilato confiere un aumento en la sensibilidad del ensayo de 2.2-veces en relación con el isómero alfa-carboxilato. Del mismo modo, la sustitución del brazo espaciador-HEG hidrófilo por el brazo espaciador-HD hidrófilo en el trazador de pteroato mejoró la sensibilidad del ensayo de folato por 1.4-veces.

Tabla 3 Sensibilidad del Ensayo de Folato & Datos de Enlace

A1: A2 A3 A4

dosis mínima detectable a B0-2sigma(n-1) en nM: 0.900 0.641 0.240 0.110

Unidades Relativas de Luz

[folato] en nM: A1 A2 A3 A4

0.00: 64,815 151,551 253,776 483,273

2.66: 57,652 127,445 213,252 413,729

6.51: 47,744 102,239 173,866 336,448

12.8: 38,470 76,349 121,856 252,297

24.7: 28,321 47,877 77,193 167,239

52.7: 19,703 28,391 42,840 94,811

rango dinámico: 45,112 123,160 210,936 388,463

fNSB: 8.6 X 10-4 3.2 X 10-4 3.9 X 10-4 3.9 X 10-4

% B0/T: 0.53 1.15 1.50 1.88

10

ENLACE NO ESPECÍFICO FRACCIONAL DEL CONJUGADO DE NSP-DMAE-FOLATO O PTEROATO El NSB fraccional (de ahora en adelante denominado como "fNSB") se redujo significantemente con la incorporación del espaciador-HEG hidrófilo en la estructura del conjugado. El fNSB del conjugado NSP-DMAE-HD-pteroato fue al menos 2.2-veces mayor que el de los otros conjugados basados en pteroato o folato. El espaciador de HD hidrófilo

15 aumentó la interacción hidrófila no específica del conjugado NSP-DMAE-HD-pteroato con la fase sólida. La introducción del espaciador-HEG hidrófilo en la estructura del conjugado redujo el fNSB como se muestra con el NSPDMAE-HEG-pteroato, NSPDMAE-HEG-alfa-folato y NSPDMAE-HEG-gamma-folato. El ligero aumento en el fNSB de los últimos dos conjugados a base de folato puede reflejar un ligero aumento en la hidrofobicidad ya que se introduce con la fracción de glutamato.

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AFINIDAD DEL ENLACE CONJUGADO PARA LOS CONJUGADOS BASADOS EN PTEROATO Y FOLATO El espaciador-HEG hidrófilo y la orientación correcta de la fracción folato total son importantes propiedades estructurales para aumentar el % B0/T. El % B0/T para el conjugado NSPDMAE-HEG-gamma-folato fue 3.5-veces superior que el del conjugado NSPDMAE-HD-pteroato, lo que indica que tanto la incorporación del espaciador-HEG

5 hidrófilo como el enlace vía el gamma-carboxilo del glutamato se necesitan para valores de enlace mayores. Una comparación de los valores de enlace NSPDMAE-HD-pteroato y NSPDMAEHEG-pteroato indicó que el espaciador-HEG otorgó 2.2-veces del aumento 3.5-veces total en relación con el espaciador-HD. Un aumento adicional de 1.6 veces en el enlace resultó de la incorporación del folato ligado con el gamma-carboxilo del glutamato. Un pequeño aumento adicional de 1.2-veces se observó para la sustitución del enlace de alfa-carboxilo del glutamato con el enlace de gamma-carboxilo del glutamato.

FORMA DE LA CURVA DOSIS RESPUESTA DE FOLATO Las curvas dosis-respuesta de % B/B0 vs. la concentración de folato indican que el aumento de la hidrofobicidad del espaciador-HEG es importante en la mejora de la sensibilidad del ensayo por el aumento de la pendiente inicial de la respuesta curva dosis. La respuesta de dosis de gama alta también se mejora por la misma razón, ya que el % B/B0 de gama alta del conjugado NSPDMAE

15 HD-pteroato es al menos 10 puntos porcentuales superior que los otros conjugados separados.

Ejemplo 6

La síntesis del conjugado NSP-DMAE-tobramicina se llevó a cabo de la siguiente manera. Se disolvió la tobramicina

(1.45 mg, 3.3 µmoles) en 1:1, DMF/carbonato 0.1 M pH 9 (1 mL) y se trató con una solución de NSP-DMAE-éster NHS (2 mg, 3.3 µmoles) en DMF (0.2 mL) adicionados periódicamente a intervalos de cinco minutos. La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 2 horas y luego a 4ºC por otras 24-36 horas. El producto se purificó por HPLC preparativa utilizando una columna C18 (7.8 mm x 30 cm) y un gradiente de 10 → 60% MeCN/TEAA 0.1 M pH 5, en 40 min., a una velocidad de flujo de 2.3 mL/min., y detección UV a 260 nm. El conjugado eluye a 17-18 minutos. La fracción de HPLC que contiene el conjugado se liofilizó a sequedad para suministrar a sólido amorfo de color blanco. ES MS 943.7 obs. (943 calc.)

25 Ejemplo 7

La síntesis de NSP-DMAE-HEG glutarato éster NHS se llevó a cabo de la siguiente manera. El NSP-DMAE-HEG (20 mg, 23 µmoles) en DMF (1-2 mL) se trató con anhídrido glutárico (4.2 mg, 1.5 equivalentes) y diisopropiletilamina (12 µL, 3 equivalentes). La reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de otras ∼6 horas, se adicionó anhídrido glutárico (3.2 mg) y la reacción se continuó durante la noche. El producto se purificó por HPLC preparativa sobre una columna C18 (20 x 250 mm) y un gradiente de 10 → 60% MeCN/agua conteniendo cada uno TFA al 0.05 %, en 40 min., a una velocidad de flujo de 16 mL/min y detección UV a 260 nm. La fracción de HPLC que contiene el producto (Rt =∼20-21 min.) se liofilizó a sequedad para producir un sólido de color amarillo. Rendimiento = 7.3 mg (32%). MALDI-TOF MS 873.5 obs. (870 calc.).

Este compuesto (7.3 mg, 8.4 µmoles) en DMF (1 mL) se trató con N-hidroxisuccinimida (4.8 mg, 5 eq.) y

35 diciclohexilcarbodiimida (8.7 mg, 5 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Después de ∼16 horas, la reacción se filtró a través de lana de vidrio y el producto se aisló por HPLC como se describe anteriormente (Rt = ∼23-24 min.). La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para proveer un sólido de color amarillo. Rendimiento = 2.3 mg (28%). MALDI-TOF MS 970.82 obs. (967.1 calc.).

A continuación, la síntesis del conjugado NSP-DMAE-HEG-glutarato-tobramicina se llevó a cabo de la siguiente manera. La tobramicina (1 mg, 2.14 µmoles) en carbonato 0.1 M pH 8.5 (0.3 mL) se trató con NSP-DMAE-HEGglutarato-éster NHS (0.5 mg, 0.52 µmol) en DMF (0.15 mL), adicionado en alícuotas de 25 µL cada minuto. La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas y a continuación, se purificó directamente por HPLC (Rt = ∼18 min.) como se describe previamente para el conjugado NSP-DMAE-tobramicina. Rendimiento = ∼0.1 mg. MALDI-TOF MS 1323.38 obs. (1320.49 calc.).

45 Ejemplo 8

ENSAYO DE TOBRAMICINA -EVALUACIÓN DE FUNCIONALIDAD DEL ENLACE DEL CONJUGADO ACRIDINIO ÉSTER-TOBRAMICINA EN UN ENSAYO DE ENLACE DE TOBRAMICINA En este ensayo los conjugados de éster de acridinio-tobramicina (de hora en adelante denominados como trazadores) y la tobramicina de los estándares que contienen tobramicina (Bayer Diagnostics, Walpole, MA) compiten por una cantidad limitada de IgG de murina, anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente a una fase sólida paramagnética. Los estándares de tobramicina contenían tobramicina a concentraciones de 0.00, 1.07, 2.14, 4.28, 8.56, 17.1, 25.7 y 34.2 µM. La reacción se inicia por medio de la mezcla de 50 µl de estándar de tobramicina, 400 µl de fase sólida y 100 µl del trazador. La mezcla de reacción se incubó, durante 7.5 minutos a 37°C. La fase sólida se recolectó sobre una disposición de magnetos permanentes y se lavó con agua desionizada para eliminar cualquier trazador sin unir. La reacción 55 quimioluminiscente se inició, como se describe previamente. Los datos se recolectaron como fotones detectados por

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el ACS:180 y expresados como RLU. Existe una relación inversa no lineal entre la concentración de tobramicina presente en el estándar y las RLUs detectadas por el ACS:180. Los datos adquiridos se procesaron como se describe previamente para el tratamiento de los datos de ensayo de folato.

PRECISIÓN DEL ENSAYO DE TOBRAMICINA La precisión intra experimental fue excelente para ambos trazadores de tobramicina, con %s del C.V. que están muy por debajo del 10 % sobre la curva estándar total. No hubo diferencia en la precisión total entre los dos conjugados.

Tabla 4 Precisión del Ensayo de Tobramicina % C.V.

[tobramicina] en microM: A1 A2

0.00: 0.39 0.46

1.07: 0.71 1.17

2.14: 1.81 2.34

4.28: 1.67 0.79

8.56: 2.98 3.18

17.1: 1.31 2.51

25.7: 2.19 3.26

34.2: 1.60 2.93

A1 = conjugado NSP-DMAE-tobramicina A2 = conjugado NSP-DMAE-HEG-glutarato-tobramicina

EXACTITUD DEL ENSAYO DE TOBRAMICINA La exactitud evidenciada como porcentaje de error con los valores 10 de 4PL pronosticados fue aceptable para ambos trazadores de tobramicina, estando en su mayor parte dentro del ± 5 % sobre la curva estándar total. No hubo diferencia en la exactitud total para estos conjugados.

Tabla 5 Exactitud del Ensayo de Tobramicina % S

[tobramicina] en microM: A1 A2

0.00: 0.01
0.00

1.07: -0.11 -0.43

2.14: 0.05 1.91

4.28: 1.21 -1.89

8.56: -2.69 -2.61

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17.1: -0.74 -0.74

25.7: 0.80 2.54

34.2: 2.90 5.54

SENSIBILIDAD DEL ENSAYO DE TOBRAMICINA La mejor sensibilidad del ensayo de tobramicina se llevó a cabo utilizando el conjugado NSPDMAE-HEG-glut-tobramicina. La sensibilidad pronosticada de los resultados del ensayo utilizando el conjugado NSP-DMAE-HEG-glut-tobramicina fue 1.7-veces inferior que la obtenida con el conjugado NSP-DMAE-tobramicina. Por lo tanto, llegamos a la conclusión, que el espaciador HEG-glut hidrófilo se debe integrar en la estructura del conjugado de tobramicina con el fin de obtener una mejora en la sensibilidad del ensayo de tobramicina. El aumento en la sensibilidad resulta de la inclinación pronunciada de la pendiente cuando se incorporó el espaciador HEG-glut en el conjugado.

Tabla 6 Sensibilidad del Ensayo Tobramicina & Datos de Enlace

dosis mínima detectable a B0-2sigma(n-1) en microM: A1 A2

10.19: 5.98

[tobramicina] en microM: Unidades Relativas de Luz

0.00: 1,442,713 1,152,351

1.070: 738,611 408,291

2.14: 495,195 248,234

4.28: 302,218 140,911

8.56: 175,943 78,004

17.1: 103,452 44,041

25.7: 77,712 32,297

34.2: 64,766 26,443

rango dinámico: 1,377,947 1,125,908

fNSB: 1.15 X 10-2 4.31 X 10-3

% B0/T: 65.1 56.6

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ENLACE NO ESPECÍFICO FRACCIONAL DEL CONJUGADO NSP-DMAE-TOBRAMICINA El NSB fraccional se redujo significantemente con la incorporación del espaciador HEG-glut hidrófilo en la estructura del conjugado. El NSB fraccional del conjugado NSP-DMAE-HEG-glut-tobramicina fue 2.7-veces inferior que el del conjugado NSPDMAE-tobramicina.

5 AFINIDAD DEL ENLACE CONJUGADO PARA CONJUGADOS BASADOS EN LA TOBRAMICINA La incorporación del espaciador HEG-glut hidrófilo bajó el % B0/T del conjugado de tobramicina en 8.9 puntos porcentuales.

FORMA DE LA CURVA DOSIS RESPUESTA DE LA TOBRAMICINA Las curvas dosis-respuesta de % B/B0 vs. la concentración de tobramicina indican que el aumento de la hidrofilicidad del espaciador HEG-glut empinó la pendiente inicial de la curva respuesta dosis, aumentando así la sensibilidad del ensayo.

10 Ejemplo 9

La síntesis del conjugado NSP-DMAE-HD-teofilina se llevó a cabo de la siguiente manera. La 8-carboxipropilteofilina (10 mg, 0.038 mmol) en DMF (3 mL) se trató con N-hidroxisuccinimida (21.6 mg, 0.188 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (38.8 mg, 0.188 mmol). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. El análisis de HPLC sobre una columna C18 (4.6 mm x 300 mm) utilizando un gradiente de 10 → 60% 15 MeCN/agua (conteniendo cada uno TFA al 0.05 %), durante 40 minutos a un flujo de 1 mL/min. y detección UV a 260 nm mostró ∼50% de conversión; Rt (material inicial) = 10 min., Rt (producto) = 14 min. Este material se utilizó como tal, sin purificación para las reacciones de acoplamiento posteriores. A continuación, el NSP-DMAE-HD (3.3 mg, 0.00564 mmol) en metanol (0.2 mL) se trató con disopropiletilamina (2.95 µL, 0.0169 mmol) y 0.9 mL de la anterior solución de DMF de 8-carboxipropilteofilina éster NHS (1.5 mg, 1 eq.). La reacción se agitó a temperatura 20 ambiente, durante 16 horas y a continuación, se purificó por HPLC sobre una columna C18 (20 x 300 mm) utilizando un gradiente de 10 → 60% MeCN/agua (conteniendo cada uno TFA al 0.05 %), en 40 min., a una velocidad de flujo de 16 mL/min. y detección UV a 260 nm. Rt (conjugado) = ∼23 min. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. Rendimiento = 4.3 mg (91%); MALDI-TOF MS

840.39 obs. (839.97 calc.).

25 Ejemplo 10

La síntesis del conjugado NSP-DMAE-SPDS-teofilina se llevó a cabo de la siguiente manera. NSP-DMAE-HEG (6.5 mg, 0.0086 mmol) se disolvió en metanol (0.2 mL) y se trató con diisopropiletilamina (3.93 µL, 3 eq.) seguido por el éster NHS de carboxiteofilina (2 mg, 1 eq.) en DMF (1.2 mL). La reacción resultante se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. A continuación, la reacción se filtró a través de lana de vidrio y se purificó directamente

30 por HPLC como se describe previamente (Rt = 22 min.). La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. Rendimiento = 3.6 mg (42%); MALDI-TOF MS 1004.36 obs. (1002.11 calc.).

Ejemplo 11

La síntesis de bis(ftalimido)espermina se llevó a cabo de la siguiente manera. La espermina (275 mg, 0.00138 mol)

35 en cloroformo (5 mL) se trató con N-carboetoxiftalimida (0.608 g, 0.00278 mol). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 40 minutos momento en el cual el análisis por TLC (5% de hidróxido de amonio, 95% de metanol) mostró una conversión completa (Rf = 0.42). La mezcla de reacción luego se evaporó a sequedad y el material crudo se utilizó como tal para la siguiente reacción. MALDI-TOF MS 463.8 obs. (462.55 calc.)

A continuación, se llevó a cabo la síntesis de bis(ftalimido)disulfonato de espermina. La bis(ftalimido)espermina (0.4

40 g) se mezcló con 1,3-propano sultona (4 g) en un tubo sellado y la mezcla se calentó en un baño de aceite a 140ºC, durante 16 horas. Luego la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el residuo se sometió a partición entre agua y acetato de etilo. La capa acuosa turbia se separó y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo se descartaron. La capa acuosa se concentró bajo presión reducida para suministrar un sólido pegajoso. Rendimiento = 0.53 g (87%). MALDI-TOF MS 708.61 obs. (706.84 calc.).

45 A continuación, se llevó a cabo la síntesis de disulfonato de espermina (SPDS) de la siguiente manera. Bis(ftalimido)disulfonato de espermina (0.53 g) se disolvió en metanol (15-20 mL) y se trató con hidrazina (0.5 mL). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente, durante 24 horas y luego se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en ∼5 mL de 20% de hidróxido de amonio, 80% de metanol y se evaporó a sequedad. Este proceso se repitió una vez. Finalmente, el residuo se disolvió en una mezcla de metanol (1 mL),

50 agua (1.5 mL) y trietilamina (1.5 mL) y la solución se evaporó otra vez a sequedad. El producto crudo obtenido después de esto se purificó por TLC preparativa sobre silica gel utilizando 10% de hidróxido de amonio y 90% de metanol como eluente. El compuesto se extrajo a partir de las placas de TLC utilizando 25-30% de hidróxido de amonio en metanol y se evaporó a sequedad. El residuo se evaporó a sequedad una vez más a partir de una solución de metanol (5), agua (5) y trietilamina (1). Este proceso se repitió dos veces. En el final, se obtuvo un sólido de color blanco. Rendimiento = 0.2 g (57%). MALDI-TOF MS 470.36 (M + Na+) obs. (446.63).

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A continuación, se llevó a cabo la síntesis de NSP-DMAE-SPDS de la siguiente manera. La espermina disulfonato (25 mg, 0.056 mmol) se disolvió en 2.0 mL de agua/bicarbonato de sodio 0.2 M pH 8.5 (1:4) y se trató con NSP5 DMAE-NHS (4.7 mg, 1/7 eq.) seguido por 0.5 mL de DMF. La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. El análisis de HPLC utilizando una columna C18 (3.9 x 300 mm) y un gradiente de 10 → 60% MeCN/agua (conteniendo cada uno 0.05% TFA), en 40 min., a una velocidad de flujo de 1 mL/min., y la detección UV a 260 nm mostró un producto a Rt = 14.5 min. Este se aisló por HPLC preparativa utilizando una columna 25 x 300 mm y el mismo gradiente. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de

10 color amarillo. Rendimiento = 2.4 mg (33%). MALDI-TOF MS 926.9 obs. (924.17 calc.).

A continuación, se llevó a cabo la síntesis del conjugado NSP-DMAE-SPDS-teofilina de la siguiente manera. Se disolvió NSP-DMAESPDS (5.2 mg, 0.00564 mmol) en una mezcla de DMF (0.16 mL) y fosfato 0.1 M pH 8 (40 µL) y se trató con una solución de 8-carboxipropilteofilina éster NHS (1.5 mg, 1 eq.) en DMF (0.9 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. El conjugado se aisló por HPLC preparativa sobre una columna C18

15 como se describe anteriormente; Rt(conjugado) = 15 min. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad. Rendimiento = 5.6 mg (85%); MALDI-TOF MS 1171.89 obs. (1172.41 calc.).

Ejemplo 12

Se llevó a cabo la síntesis de dicarboxilato de espermina de la siguiente manera. La espermina (296 mg, 0.00146 mol) en cloroformo (10 mL) se trató con N-carbotoxiftalimida (658 mg, 2.05 eq.). La reacción se agitó a temperatura 20 ambiente bajo nitrógeno. Después de 1.5 horas, se adicionó anhídrido succínico (0.440 g, 2 eq.) junto con piridina (353 µL, 3 eq.) y diisopropiletilamina (774 µL, 3 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. El análisis por TLC (90% de cloroformo, 9% de metanol, 1% de ácido acético) mostró una conversión limpia para un producto principal (Rf = 0.43). A continuación, la mezcla de reacción se trató con hidrazina (0.45 mL, ∼10 eq.) y metanol (10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 1-2 horas, un precipitado cristalino

25 apareció en la mezcla de reacción. Después de 3-4 horas, el tiempo de reacción total, la reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se suspendió en acetona y se filtró. El precipitado se enjuagó con acetona y se disolvió en agua (50 mL) con trietilamina (1.5 mL). Esta se concentró bajo presión reducida para suministrar un polvo de color blanco. MALDI-TOF MS 403.7 obs. (402.49).

A continuación, se llevó a cabo la síntesis de NSP-DMAE-SPDC, de la siguiente manera. La espermina dicarboxilato

30 (45 mg, 0.112 mmol) se disolvió en 2 mL de carbonato 0.1 M pH 9 (se ajustó con NaOH 5N) y se trató con una solución de NSPDMAE-NHS éster (10.5 mg, 0.0178 mmol) en DMF (2 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas. El producto se aisló por HPLC preparativa sobre una columna C18 (20 x 300 mm) utilizando un gradiente de 0 → 40% MeCN/agua (conteniendo cada uno TFA al 0.05 %), en 40 min., a una velocidad de flujo de 16 mL/min. y la detección UV a 260 nm; Rt (producto) = 18 min. La fracción de HPLC que contiene el

35 producto se liofilizó a sequedad para suministrar un sólido de color amarillo. Rendimiento = 6.7 mg (43%); MALDI-TOF MS 877.53 obs. (878.01 calc.).

A continuación, la síntesis del conjugado NSP-DMAE-SPDC-teofilina se llevó a cabo de la siguiente manera. NSP-DMAESPDC (1 mg, 0.00114 mmol) se disolvió en 0.1 mL de DMF y 8-carboxipropilteofilina (1 mg, 0.00262 mmol) se adicionó junto con diisopropiletilamina (2 µL, 2 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 16 horas y

40 a continuación, se purificó directamente por HPLC sobre una columna C18 (20 x 300 mm) utilizando un gradiente de 10 → 60% de MeCN/agua (conteniendo cada uno TFA al 0.05 %), durante 40 min. A una velocidad de flujo de 16 mL/min., y detección UV a 260 nm; Rt (conjugado) = 18 min. La fracción de HPLC que contiene el producto se liofilizó a sequedad. Rendimiento = 1.9 mg (cuant.); MALDI-TOF MS 1127.24 obs. (1126.25 calc.)

Ejemplo 13

45 En este ensayo los conjugados de éster de acridinio-teofilina (de hora en adelante denominados como trazadores) y teofilina a partir de estándares que contienen teofilina (Bayer Diagnostics, Walpole, MA) compiten por una cantidad limitada de IgG de murina, anticuerpo anti-teofilina monoclonal que se acopló covalentemente a una fase sólida de partícula paramagnética. Una mezcla de reacción que contiene 20 µL de teofilina estándar, 450 µL de fase sólida y 100 µL (59 fmoles) del trazador se incubó a 37°C, durante 7.5 min. Los estándares de teofilina contenían teofilina en

50 concentraciones de 0.00, 6.94, 13.9, 27.7, 55.5, 111 y 222 µM. La fase sólida se recolectó sobre una disposición de magnetos permanentes y se lavó dos veces con agua desionizada para eliminar el trazador sin unir. La reacción quimioluminiscente se inició, como se describe previamente. Los datos se recolectaron como fotones detectados por el ACS:180 y expresados como RLU. Existe una relación inversa no lineal entre la concentración de teofilina presente en el estándar y las RLUs detectadas por el ACS:180. Los datos adquiridos se procesaron como se

55 describe previamente para el tratamiento de los datos de ensayo de folato.

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PRECISIÓN DEL ENSAYO DE TEOFILINA La precisión intra experimental fue satisfactoria para todos los trazadores de teofilina, con %s del C.V. que son menores del 10 % sobre la curva estándar total.

Tabla 7 Precisión del Ensayo de Teofilina % C.V.

[teofilina] en microM: A1 A2 A3 A4

0.00: 0.67 1.83 1.70 0.79

6.94: 2.57 2.00 2.94 2.52

13.9: 1.86 5.00 1.64 0.33

27.8: 1.19 0.36 2.13 5.82

55.5: 5.81 2.01 2.33 3.51

111: 0.97 2.04 1.59 1.59

222: 2.94 1.37 4.34 7.44

A1 = NSP-DMAE-HD-teofilina A2 = NSP-DMAE-PEG-teofilina A3 = NSP-DMAE-SPDS-teofilina A4 = NSP-DMAE-SPDC-teofilina

EXACTITUD EN EL ENSAYO DE TEOFILINA Exactitud descrita como el porcentaje de error con los valores de 4PL pronosticados fue satisfactoria para todos los conjugados de teofilina, estando convenientemente dentro del ± 5 % sobre la curva estándar total. No hubo diferencia en la exactitud total entre estos conjugados.

Tabla 8 Exactitud del Ensayo de Teofilina % Error

[teofilina] en microM: A1 A2 A3 A4

0.00: -0.04 0.00 0.01 -0.01

6.94: 0.49 0.09 -0.26 0.22

13.9: -1.20 -0.43 1.10 -0.58

27.8: 1.18 0.79 -2.07 -0.08

55.5: 0.17 -0.02 1.74 2.08

111: -1.21 -2.26 0.73 -0.95

222: 0.54 2.52 -1.51 -1.71

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A1 = NSP-DMAE-HD-teofilina A2 = NSP-DMAE-PEG-teofilina A3 = NSP-DMAE-SPDS-teofilina A4 = NSP-DMAE-SPDC-teofilina

SENSIBILIDAD DEL ENSAYO DE TEOFILINA La mejor sensibilidad del ensayo de teofilina se realizó utilizando el conjugado NSP-DMAE-SPDC-teofilina. NSP-DMAE-HEG-teofilina y NSP-DMAE-SPDS-teofilina dieron dosis detectables mínimas que fueron superiores que las del NSP-DMAE-HD-teofilina. La disminución de la sensibilidad en el caso de NSP-DMAE-HEG-teofilina y NSP-DMAE-SPDS-teofilina puede resultar de la imprecisión ligeramente elevada para la dosis cero.

Tabla 9 Sensibilidad del Ensayo de Teofilina & Datos de Enlace

dosis mínima detectable a B0-2sigma(n-1) en microM: A1 A2 A3 A4

0.272: 0.497 0.311 0.089

[teofilina] en microM: Unidades Relativas de Luz

0.0: 715,394 539,268 769,617 648,559

6.94: 511,553 351,686 442,911 317,389

13.0: 392,914 261,193 313,980 214,678

27.7: 268,471 173,922 201,019 133,152

55.5: 165,325 105,453 118,487 77,581

111: 96,836 60,938 66,996 44,253

222: 57,387 35,158 37,668 25586

rango dinámico: 658,007 504,110 731,949 622,973

fNSB: 1.27 X 10-2 6.40 X 10-3 3.47 X 10-3 4.04 X 10-3

% B0/T: 56.8 52.0 54.7 56.9

ENLACE NO ESPECÍFICO FRACCIONAL DEL CONJUGADO NSP-DMAE-TEOFILINA. El NSB fraccional se redujo significantemente con la incorporación de los espaciadores hidrófilos en las estructuras del conjugado. El fNSB del NSPDMAE-SPDS-teofilina fue el total más bajo siendo 3.7-veces inferior que el del conjugado NSP-DMAE-HD10 teofilina. Los conjugados NSP-DMAE-SPDC-teofilina y NSP-DMAE-HEG-teofilina tuvieron fNSBs que fueron 3.1-y

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2.0-veces inferiores, respectivamente. Los espaciadores cargados o más altamente polares confirieron fNSBs inferiores en sus respectivos conjugados.

AFINIDAD DEL ENLACE DEL CONJUGADO PARA LOS CONJUGADOS A BASE DE TEOFILINA No se pudo observar una diferencia apreciable en los %s de B0/T de los diferentes conjugados.

5 FORMA DE LA CURVA DOSIS RESPUESTA DE TEOFILINA Las curvas dosis-respuesta de % B/B0 vs. la concentración de Teofilina indican que el aumento de la hidrofilicidad del espaciador aumenta la pendiente inicial de la curva respuesta dosis, aumentando así la sensibilidad del ensayo suponiendo una equivalencia en la precisión. El conjugado NSP-DMAE-SPDC-teofilina provocó la mayor caída en la pendiente inicial seguido primero por NSPDMAE-SPDS-teofilina; segundo por NSP-DMAE-HEG-teofilina; & tercero por NSP-DMAE-HD-teofilina (en ese

10 orden).

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un marcador quimioluminiscente de éster de acridinio detectable que tiene la estructura genérica A-B-C, y que comprende un éster de acridinio con un modificador hidrófilo, dónde A es un analito diana, 5 dónde B es el modificador hidrófilo que consta de un espaciador poliiónico seleccionado del grupo que contiene de disulfonato de espermina poliiónico y dicarboxilato de espermina poliiónico,

y dónde C es el marcador quimioluminiscente de éster de acridinio.
2. Un marcador quimioluminiscente detectable de acridinio de acuerdo con la reivindicación 1, adaptado para y 10 capaz de realizar ensayos de folato.
3.

Un marcador quimioluminiscente detectable de acridinio de acuerdo con la reivindicación 1, adaptado para y capaz de realizar ensayos de teofilina.
4.

Un marcador quimioluminiscente detectable de acridinio de acuerdo con la reivindicación 1, adaptado para y capaz de realizar ensayos de tobramicina.

15 5. Un complejo, que comprende:

(a)

un marcador como se define en la reivindicación 1;

(b)

un socio de enlace del analito diana; y

(c)

en donde el analito diana dentro del marcador se une al socio de enlace.
6. Un proceso para llevar a cabo un ensayo que comprende,

(b) determinación el nivel en el cual el marcador evita y/o se desplaza competitivamente por el analito diana de la muestra, para formar una interacción de enlace con el socio de enlace correspondiente;

(c)

correlación de la determinación realizada en la anterior etapa (b) con la presencia o cantidad de analito diana de 25 la muestra.

20 (a) exposición de una muestra sospechosa de contener un analito diana a un marcador como se define en la reivindicación 1 y a un socio de enlace correspondiente para el analito diana;

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